CA1171723A - Procede d'extraction de lactoferrine et d'immunoglobulines du lait - Google Patents
Procede d'extraction de lactoferrine et d'immunoglobulines du laitInfo
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Abstract
PROCEDE D'EXTRACTION DE LACTOFERRINE ET D'IMMUNOGLOBULINES DU LAIT A partir d'un milieu aqueux, provenant du lait, substantiellement exempt de caséines, on extrait des protéines, en particulier lactoferrine et immunoglobulines par adsorption sur un support solide. Le milieu aqueux est faiblement basique, tandis que l'élution est effectuée au moyen d'une solution acide.
Description
:~ 7~ 3 ..
La presente inven-tion a pour objet un procédé
perfectionné pour l'extraction de certaines protéines de produits lai~iers ; elle vise plus spécialement l'ob-tention des protéines fixant le fer, transferrine et lactoferrine, ainsi que des immunoglobulines.
L'intér~t des différentes proteines9 autres que la caséinep que l'on trouve dans ~e lait des mammifères, a attiré l'attention de nom~reux industriels et chercheurs.
Aussi des travaux ont éte effectués en vue de la s~para-10 tion de ces dif~erentes proteines, plus particulièrementde celles qui se retrouvent dans le petit lait, c'est-~-dire dans le lacto-serum, après la séparation des cas~i-nes. Parmi les substances fort intéressantes, appartenant à ce*te catégorie, se trouvent les a-lactalbumine, txans-15 ferrine~ lactoferrine, lysozyme, serum-albumine, immuno-globulines, etc. La lactoferrine présente non seulemen~
un intérat nutritionnelJ mais également pharmacologique on sait en ef~et, à présent, que cette prot~ine qui fixe le fer est non seulement d'une gxande u~ilité alimentaire 20 pour le nourrisson, mais constitue ~galement un v~ritable protecteur contre différentes infections bact~riennesO Ce dernier rôle est'expliqué justement par l'action chélatan-te de cette protéine vis-à-vis du fer, qui soustrait cet élément au milieu, emp~chant ainsi le développement des 25 bacteries auxquelles cet élément est absolument nécessaire.
Cette propriété bactériostatique présente ~videmment un ' avantage important. En ce qui concerne les immunoglobuli-nes IgA~ IgM, IgG, leur importance augmente chaque jour avec le développement prodigieux de 17 immunologie.'On con-30 nait d'autre part l'utilité et les applications des lac-talbumines, de la sérum-albumine~ du lysozyme'et de certai-nes autres protéines et également des prot~ines fixant la vitamine B12 ou la céruloplasmine qui a la propriété d~ se combiner au cuivre. On comprend donc que des travaux aient 35 été menés en vue de la séparation de ces différentes pro-' .
' , . .
: ~ , - . . , , ~ -téines ~ partir des produits laitiers et surtout ~ partir du petit lait qui les contient à l'état dissous e~ qui gé-néralement constitue un résidu dans llindustrie laitière.
La plupart des proc~dés utilisés sont basés sur l~applica-tion des échangeurs d'ions ou sur la chromatographie sur Sephadex*,à des pH ne dépassant pas 7 et, le plus souvent, inf~érieurs ~ 6,30 Telle est par exemple ~a méthode préco-nisée dans les brevets U.S. n~ 3 234 ~99 ou 3 969 337. On . .
a également eu recours ~ lectroph~r~se ou ~ la pr~cîpi-10 tation par des sels et centrifugation, cette dernière mé-thode etant décrite par ~ontreuil et Mullet C.R. 250, 1736-7 (1960). Plus récemment des travaux sur la sépa~a-tion des protéines du lait ont été décrits dans les publi-cations de brevets français n 2 390 go6 et 2 399 ~14 o~
15 les protéines, autres que la cas~ine, sont d'abord extrai- ;
tes avec une résine ~changeuse d~ani~ns et ensuite avec de la silice, ou inversement ; l'extraction a lieu à des pH compris entre 4 et 7,S.
Si les dif~érents procédés de la technique con-20 nue conviennent bien 3 la séparation de protéines telles que les lactalbumines ou la sérum-albumine9 aucune d~elles ne permet l'obtention efficace et pratique des protéines fixant le fer, c'est-~-dire des ~ransferrines et lacto-ferrines. Bien que le lacto serum soit une matière peu co~-25 teuse, il ne contient qu'environ 6,5 g de protéines parlitre, dont une faible proportion est constituée par les lactoferrines : on est donc amené à traiter dlassez gxands volum~s de cette matière première pour extraire un faible poids de prot~ines intéressantesO Il est par conséquent 30 important de disposer d'un proc~é permettant de réaliser cette extraction avec dlaussi bons rendements que possiblè.
Ctest ce but qui est atteint par la présente inventionO En effet, le nouveau procédé suivant l'invention convient tout particulièrement à l'obtention des protéines ferro chéla-35 tantes, notamment lactoferrine et transferrine et, d~autre * Marque de commerce.
. ' ` . ' . ' ., ~ ~ ~ .
part, des immunoglobulines, a. partir du serum de lait res-tant apres la separation des caséines.
Dans la suite de la présente description, par mesure de simplification, on ne parle que de la lactofer-rine, mais il est bien entendu que ce terme comprend aussila transferrine et éventuellement d'autres protéines ferro chélatantes du même type qui peuvent exister dans les laits des différents mammifères.
Le procédé suivant l'invention résulte de la constatation que - contrairement a la technique antérieu-re - la séparation par l'adsorption des protéines sus-in-fiquées se fait le mieux en milieu lé~èrement basique.
La présente invention propose un procédé d'extrac-tion de protéines du lait comprenant.celles qui sont capables de fixer le fer, a partir d'un milieu aqueux substantlelle-ment exempt de caséine.s, par adsorption sur un support solide et ensuite élution des protéines adsorbées, au moyen d'une solution acide caractérisé en ce que l'adsorp-tion a lieu en milieu faiblement basique, de pH supérieur `
~0 a 7,5.
Selon un aspect particulier, le procede suivant l'invention consiste à soumettre le milieu renfermant la lactoferrine a la fixation sur un adsorbant approprie, en milieu faiblement basique., à savoir dans un liquide de p~
supérieur à 7,5. De preference, le p~I du milieu est compris entre 7,7 et 8,8 et mieux encore entre 7,9 et 8,5.
Le milieu a traiter suivant l'invention peut être constitue par tout liquide aqueux renfermant les dif-férentes proteines du lait, debarrassé au moins de la ma-jeure partie des caséines; la source la plus pratique estle petit lait, éventuellement concentré ou dejà traite pour l'extraction de protéines autres que la lactoferrine.
Apr~s l'adsorption. en milieu faiblement basique, et.élimination du~ uide surnageant, les proteines fixees sur l'adsorbant sont eluees par abaissement du pH au-des-sous de 7 et, de preference, environ 4; un mode operatoire ., , . . , . ~ - . . .
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, 1:17~7~3 prefere consiste ~ utiliser un.éluant acide dont la force ionique a ete augmentee par adjonction d'un sel.soluble.
En tant qu'adsorbant, on peut employer avantageu-sement une silice de surface specifique d'environ 5 a 150 m2/g, presentant un diam~tre poreux de 25 ~ 250 nm (250 a
La presente inven-tion a pour objet un procédé
perfectionné pour l'extraction de certaines protéines de produits lai~iers ; elle vise plus spécialement l'ob-tention des protéines fixant le fer, transferrine et lactoferrine, ainsi que des immunoglobulines.
L'intér~t des différentes proteines9 autres que la caséinep que l'on trouve dans ~e lait des mammifères, a attiré l'attention de nom~reux industriels et chercheurs.
Aussi des travaux ont éte effectués en vue de la s~para-10 tion de ces dif~erentes proteines, plus particulièrementde celles qui se retrouvent dans le petit lait, c'est-~-dire dans le lacto-serum, après la séparation des cas~i-nes. Parmi les substances fort intéressantes, appartenant à ce*te catégorie, se trouvent les a-lactalbumine, txans-15 ferrine~ lactoferrine, lysozyme, serum-albumine, immuno-globulines, etc. La lactoferrine présente non seulemen~
un intérat nutritionnelJ mais également pharmacologique on sait en ef~et, à présent, que cette prot~ine qui fixe le fer est non seulement d'une gxande u~ilité alimentaire 20 pour le nourrisson, mais constitue ~galement un v~ritable protecteur contre différentes infections bact~riennesO Ce dernier rôle est'expliqué justement par l'action chélatan-te de cette protéine vis-à-vis du fer, qui soustrait cet élément au milieu, emp~chant ainsi le développement des 25 bacteries auxquelles cet élément est absolument nécessaire.
Cette propriété bactériostatique présente ~videmment un ' avantage important. En ce qui concerne les immunoglobuli-nes IgA~ IgM, IgG, leur importance augmente chaque jour avec le développement prodigieux de 17 immunologie.'On con-30 nait d'autre part l'utilité et les applications des lac-talbumines, de la sérum-albumine~ du lysozyme'et de certai-nes autres protéines et également des prot~ines fixant la vitamine B12 ou la céruloplasmine qui a la propriété d~ se combiner au cuivre. On comprend donc que des travaux aient 35 été menés en vue de la séparation de ces différentes pro-' .
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: ~ , - . . , , ~ -téines ~ partir des produits laitiers et surtout ~ partir du petit lait qui les contient à l'état dissous e~ qui gé-néralement constitue un résidu dans llindustrie laitière.
La plupart des proc~dés utilisés sont basés sur l~applica-tion des échangeurs d'ions ou sur la chromatographie sur Sephadex*,à des pH ne dépassant pas 7 et, le plus souvent, inf~érieurs ~ 6,30 Telle est par exemple ~a méthode préco-nisée dans les brevets U.S. n~ 3 234 ~99 ou 3 969 337. On . .
a également eu recours ~ lectroph~r~se ou ~ la pr~cîpi-10 tation par des sels et centrifugation, cette dernière mé-thode etant décrite par ~ontreuil et Mullet C.R. 250, 1736-7 (1960). Plus récemment des travaux sur la sépa~a-tion des protéines du lait ont été décrits dans les publi-cations de brevets français n 2 390 go6 et 2 399 ~14 o~
15 les protéines, autres que la cas~ine, sont d'abord extrai- ;
tes avec une résine ~changeuse d~ani~ns et ensuite avec de la silice, ou inversement ; l'extraction a lieu à des pH compris entre 4 et 7,S.
Si les dif~érents procédés de la technique con-20 nue conviennent bien 3 la séparation de protéines telles que les lactalbumines ou la sérum-albumine9 aucune d~elles ne permet l'obtention efficace et pratique des protéines fixant le fer, c'est-~-dire des ~ransferrines et lacto-ferrines. Bien que le lacto serum soit une matière peu co~-25 teuse, il ne contient qu'environ 6,5 g de protéines parlitre, dont une faible proportion est constituée par les lactoferrines : on est donc amené à traiter dlassez gxands volum~s de cette matière première pour extraire un faible poids de prot~ines intéressantesO Il est par conséquent 30 important de disposer d'un proc~é permettant de réaliser cette extraction avec dlaussi bons rendements que possiblè.
Ctest ce but qui est atteint par la présente inventionO En effet, le nouveau procédé suivant l'invention convient tout particulièrement à l'obtention des protéines ferro chéla-35 tantes, notamment lactoferrine et transferrine et, d~autre * Marque de commerce.
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part, des immunoglobulines, a. partir du serum de lait res-tant apres la separation des caséines.
Dans la suite de la présente description, par mesure de simplification, on ne parle que de la lactofer-rine, mais il est bien entendu que ce terme comprend aussila transferrine et éventuellement d'autres protéines ferro chélatantes du même type qui peuvent exister dans les laits des différents mammifères.
Le procédé suivant l'invention résulte de la constatation que - contrairement a la technique antérieu-re - la séparation par l'adsorption des protéines sus-in-fiquées se fait le mieux en milieu lé~èrement basique.
La présente invention propose un procédé d'extrac-tion de protéines du lait comprenant.celles qui sont capables de fixer le fer, a partir d'un milieu aqueux substantlelle-ment exempt de caséine.s, par adsorption sur un support solide et ensuite élution des protéines adsorbées, au moyen d'une solution acide caractérisé en ce que l'adsorp-tion a lieu en milieu faiblement basique, de pH supérieur `
~0 a 7,5.
Selon un aspect particulier, le procede suivant l'invention consiste à soumettre le milieu renfermant la lactoferrine a la fixation sur un adsorbant approprie, en milieu faiblement basique., à savoir dans un liquide de p~
supérieur à 7,5. De preference, le p~I du milieu est compris entre 7,7 et 8,8 et mieux encore entre 7,9 et 8,5.
Le milieu a traiter suivant l'invention peut être constitue par tout liquide aqueux renfermant les dif-férentes proteines du lait, debarrassé au moins de la ma-jeure partie des caséines; la source la plus pratique estle petit lait, éventuellement concentré ou dejà traite pour l'extraction de protéines autres que la lactoferrine.
Apr~s l'adsorption. en milieu faiblement basique, et.élimination du~ uide surnageant, les proteines fixees sur l'adsorbant sont eluees par abaissement du pH au-des-sous de 7 et, de preference, environ 4; un mode operatoire ., , . . , . ~ - . . .
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En tant qu'adsorbant, on peut employer avantageu-sement une silice de surface specifique d'environ 5 a 150 m2/g, presentant un diam~tre poreux de 25 ~ 250 nm (250 a
2 500 A~. Un adsorbant , tel que par exemple la silice , peut être employe sous une forme pul-, .
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~ 7 ~ ~
vérulente, de granulom~trie assez large, par exemple de 5 ~m à 5 mm. Pour l'utilisation en colonne, il est pré-férable de se servir de billes sphéxiques de diamèt~es de llordre de 10 ~ 500 ~m.
Bien que la silice cons-titue un excellent sup-po~t pour la fixation préférentielle de la lacto~errine, d'autres supports peuvent 8tre employés, notamment dif-.f~rents silicates naturels ou artificiels~ tels que pierre ponce, terres diatomées, bentonite~ etcO, .ainsi que des 10`alumines activées.
La fixation en milieu faiblement basique présen-te llavantage d'une grande sélectivi~é vis-~-vis de la lac--toferrine qui n'e.st accompagnée que d'une partie d'immuno-globulines. Les au-tres protéines, notamment lactalbumines~
15 lactoglobulin~s, serum albumine et le reste des immuno-~lobulines demeurent en solution dans le liquide surnagean~
Apr~s la récuperation de la lactoEerrine et des immunoglobulines, le support - en particulier la silice -est remis en contact avec une solution legèrement basique, 20 par exemple de pH 8 à 9, ce qui le rend apte à servir ~
une nouvelle extraction à partir d'un produit laitier. On voit que le procédé suivant l'inve~tion est beaucoup:plus simple que ceux de llart anterieur ; ainsi, par rapport aux brevets fran~ais cités plus haut, il su~fit d9un seul 25 support minéral au lieu de deux supports dont un est un échangeur d~ions~n outre9 la fixation a lieu en milieu ba-sique au~lieu d'etre effectuée à des pH inférieurs à.7,5 e.t surtout inférieurs à 7, comme c'est le cas de toute la technique antérieure.
Dans une variante de l'invention, après l~élu-tion du support par une solution acide, on lave ce support avec une solution basique, ce qui permet d'extraire la frac-tion des immunoglobulines qui n'a pas ~té éluée en milieu acide ; dans ceJcas, la solution basique peut permettre aus-35 si la récupération d'un reste de lactoferrine~ Le lavage, .
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7 ~
suivant cette variante 9 peut etre effectué avec un p~ de 8 à 10 par exemple. Cependant, la capacité d'un support de silice, vis-à-vis de la lactoferrine, n'est pas influ-encée par un tel lav~ge , ce dernier peut donc 8tre amis lorsqu'on cherche à extraire seulement la lactoferrineO
Le procédé, suivant l'invention, slapplique au lactoserum quel que soit le mode dl~limination de la ca~
s~ine qui a conduit à ce lacto-serum : autrenent dit, que la caséine ait été précipitée par acidification du lait ~0 initial ou bien par l'action d'une enzyme", Le proc~dé con- -vient au petit lait tel que, ainsi qulà des liquides ob- -tenus par la remise en solution des solides du lacto-sé-- rum9 obtenus par tout moyen connu, par exemple ultra fil-tration ou dessiccation.
L'invention peut ~txe utilisée pour l'extrac-tion de la lactoferrine de di~férentes sortes de laits~
en particulier de ceux des ovins ou bovins, comme du lait humain. Comme les premiers contiennent be~aucoup moins de lactoferxine que le second, leur traitement est moins e~-20 ficace par les techniques connues et c'est l~ que l'utili té de l'invention se ~ait particuli~xement sentir.
L'invention peut ~tre réalisée dans les condi~
tions prevues par Gordon, Ziegler ~ Basch, Biochim.BiophysO
Acta 60, 410-411 (1-962) : dans cette variante, la fixation 25 sur un support adsorbant en milieu faiblement basique por-te sur un liquide ~enfermant la lacto~errine~ auquel on a préalablement ajouté un composé du fer, de façon ~ sature~
de fer la totalité de la lactoferrine présente.
Le taux diextrac-tion de la lactoferxine,pa~ le 30 procédé suivant l'invention, est élevé, En ce qui concerne la composition des protéines obtenues par ce procédé, ~ la suite de l'élution du support adsorbant par une solution acide, elle comprend plus de 50% de lactoferrine, le reste ~tant constitué principalement d'immunoglobulines. La pure~
35 té de la lacto~errine, utilisée essentiellement comme agent '~
...... ~. . ~ ........................... : .
: . . .
~-~l7~'7~,3 bactériostatique, est tou-t à fait suffisante~ et il n~est pas necessaire de la séparer d'avec les immunoglobulines ;
en effet il a été démontré, in vitro, que le pouvoir d'in hibition de la croissance des bactéries pathogenes dû à
la lactoferrine, était exalt~ par la présence d'immunoglo-bulinesO
Dans le cas~ industrielle~ent trbs avantageux, où le support est constitué par de la silice, on tro we une capacit~ de celle-c~, vis-~-vis de la lacto~errine, de 10 plus de 20 mg par gramme de silice, ce qui justifie plei-nement l'application industrielle du procédé suivant lSin-ventionO
Dans les conditions opératoires de l~invention, les immunoglohulines, qui accompagnent la lactoferrir?e, ne 1$ subissent aucune dénaturation, e~euvent, par conséquent, êtxe utilisées dans les industries alîmentaires, pharmaceu-tiques et vet~rinaires, puisqu'elLes conservent toutes leurs propriétés.
Les di~-férentes protéines, pouvant ~tre s~parées 20 par le proc~dé de l'invention 9 sont identi~iables par les methodes classiques et~ en particulier, par celles qui ont ét~ décrites par J~ Garnier dans Ann~-Biol. anim~ Bioch.
Biophys~ 19649 4 ~) 163-187. Les exemples qui suivent il-lustrent5 non limitativement, la pr~sente invention.
25 EX~MPLE 1 Dans une col~nne de 1 cm de diamètre intérieur sont placés 5 g de grains de silice, d'une granulométrie de 100-200 ~m ; cette silice présente une surface spéci~ique de 20 m~/g et un diamètre poreux de 80 nmO
30 La silice est lav~e avec une solution de phosphate disodi-que Na2HP04 0,005 M~
Dans 1 litre de cette mame solution de phosphate, on dis-sout 10 g d'une poudre obtenue par séchage des solides re-cueillis (rétentat) dans l'ultrafiltration d'un lactosérum;
35 cette poudre contient 6,5 g de protéines. Le pH de la solu-, , . .
, , l~ t7~,3 .:
tion obtenue est ajusté à 8920On fait ensuite passer la solution 3 travers la charge de silice dans la colonne susindiquée, ~ un débit de 60 ml/h;
cette charge est ensuite la~ee avec une solution 0,005 M
de phospha-te disodique, de pH 892~ de ~açon à chasser tou-tes les protéines non fixées sur la silice.
La lactoferrine ~ixée est alors éluée ~ l~aide d'une solu-tion d~acide acétique 0,1 N additionnée de NaCl à la con-~centration de 0,5 ~0 On obtient ainsi une fraction de 25 10 ml de liquide coloré en rose, contenant 40 mg de protéi-nes constituees;de 66~ de lactoferrine5 le reste étant des immunoglobulines. Après un lavage de la charge de si-lice, par passage d'une solution de phosphate disodique 0,005 ~, la colonne est pr~te pour un nouveau cycle d~ -15 adsorption.
Dans une opération similaire à celle de lgexem~
ple 1~ la charge de la colonne est lav~e a~ec un tampOn txis-HCl~ pH ~, additionnée de 0,5 ~ NaCl, apres l'élu-20 tion ~ l'acide acétique et recupération de la fraction delactoferrine. Cela ~ournit une nouvelle ~raction de ~0 ml contenant 30 mg de protéines constituées essentiellement d'immunoglobulines, de lactoperoxydase et d'une très fai- -ble quantité de lacto~errine.
25 Après un lavage de la silice, dans la colonne9 par une so~
lution de phosphate disodique 0~005 M, la colonne est nouveau pr8te à l'emploi.
Le mode opératoire de l'exemple 1 est repete9 30 mais la source de lactoferrine est constituée par 1 litre de petit lait, directement issu de la ~abrication de fro-mage, sans concentration, ce liquide étant additionné de 0,005 M de phosphate disodique par li-tre.
Les résultats sont les m~mes que dans llexemple 10 ~ ~ .
.
.... :.......... .
-, 1. 7 ~ 7~
EXE~ PLE 4 Le lavage alcalin de l'exemple 2 est appliqué
à un mode operatoire utilisant le petit lait, selon lie-xemple 3. Cela conduit à des résultats identiques ~ ceux de l'exemple 2.
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Bien que la silice cons-titue un excellent sup-po~t pour la fixation préférentielle de la lacto~errine, d'autres supports peuvent 8tre employés, notamment dif-.f~rents silicates naturels ou artificiels~ tels que pierre ponce, terres diatomées, bentonite~ etcO, .ainsi que des 10`alumines activées.
La fixation en milieu faiblement basique présen-te llavantage d'une grande sélectivi~é vis-~-vis de la lac--toferrine qui n'e.st accompagnée que d'une partie d'immuno-globulines. Les au-tres protéines, notamment lactalbumines~
15 lactoglobulin~s, serum albumine et le reste des immuno-~lobulines demeurent en solution dans le liquide surnagean~
Apr~s la récuperation de la lactoEerrine et des immunoglobulines, le support - en particulier la silice -est remis en contact avec une solution legèrement basique, 20 par exemple de pH 8 à 9, ce qui le rend apte à servir ~
une nouvelle extraction à partir d'un produit laitier. On voit que le procédé suivant l'inve~tion est beaucoup:plus simple que ceux de llart anterieur ; ainsi, par rapport aux brevets fran~ais cités plus haut, il su~fit d9un seul 25 support minéral au lieu de deux supports dont un est un échangeur d~ions~n outre9 la fixation a lieu en milieu ba-sique au~lieu d'etre effectuée à des pH inférieurs à.7,5 e.t surtout inférieurs à 7, comme c'est le cas de toute la technique antérieure.
Dans une variante de l'invention, après l~élu-tion du support par une solution acide, on lave ce support avec une solution basique, ce qui permet d'extraire la frac-tion des immunoglobulines qui n'a pas ~té éluée en milieu acide ; dans ceJcas, la solution basique peut permettre aus-35 si la récupération d'un reste de lactoferrine~ Le lavage, .
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7 ~
suivant cette variante 9 peut etre effectué avec un p~ de 8 à 10 par exemple. Cependant, la capacité d'un support de silice, vis-à-vis de la lactoferrine, n'est pas influ-encée par un tel lav~ge , ce dernier peut donc 8tre amis lorsqu'on cherche à extraire seulement la lactoferrineO
Le procédé, suivant l'invention, slapplique au lactoserum quel que soit le mode dl~limination de la ca~
s~ine qui a conduit à ce lacto-serum : autrenent dit, que la caséine ait été précipitée par acidification du lait ~0 initial ou bien par l'action d'une enzyme", Le proc~dé con- -vient au petit lait tel que, ainsi qulà des liquides ob- -tenus par la remise en solution des solides du lacto-sé-- rum9 obtenus par tout moyen connu, par exemple ultra fil-tration ou dessiccation.
L'invention peut ~txe utilisée pour l'extrac-tion de la lactoferrine de di~férentes sortes de laits~
en particulier de ceux des ovins ou bovins, comme du lait humain. Comme les premiers contiennent be~aucoup moins de lactoferxine que le second, leur traitement est moins e~-20 ficace par les techniques connues et c'est l~ que l'utili té de l'invention se ~ait particuli~xement sentir.
L'invention peut ~tre réalisée dans les condi~
tions prevues par Gordon, Ziegler ~ Basch, Biochim.BiophysO
Acta 60, 410-411 (1-962) : dans cette variante, la fixation 25 sur un support adsorbant en milieu faiblement basique por-te sur un liquide ~enfermant la lacto~errine~ auquel on a préalablement ajouté un composé du fer, de façon ~ sature~
de fer la totalité de la lactoferrine présente.
Le taux diextrac-tion de la lactoferxine,pa~ le 30 procédé suivant l'invention, est élevé, En ce qui concerne la composition des protéines obtenues par ce procédé, ~ la suite de l'élution du support adsorbant par une solution acide, elle comprend plus de 50% de lactoferrine, le reste ~tant constitué principalement d'immunoglobulines. La pure~
35 té de la lacto~errine, utilisée essentiellement comme agent '~
...... ~. . ~ ........................... : .
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~-~l7~'7~,3 bactériostatique, est tou-t à fait suffisante~ et il n~est pas necessaire de la séparer d'avec les immunoglobulines ;
en effet il a été démontré, in vitro, que le pouvoir d'in hibition de la croissance des bactéries pathogenes dû à
la lactoferrine, était exalt~ par la présence d'immunoglo-bulinesO
Dans le cas~ industrielle~ent trbs avantageux, où le support est constitué par de la silice, on tro we une capacit~ de celle-c~, vis-~-vis de la lacto~errine, de 10 plus de 20 mg par gramme de silice, ce qui justifie plei-nement l'application industrielle du procédé suivant lSin-ventionO
Dans les conditions opératoires de l~invention, les immunoglohulines, qui accompagnent la lactoferrir?e, ne 1$ subissent aucune dénaturation, e~euvent, par conséquent, êtxe utilisées dans les industries alîmentaires, pharmaceu-tiques et vet~rinaires, puisqu'elLes conservent toutes leurs propriétés.
Les di~-férentes protéines, pouvant ~tre s~parées 20 par le proc~dé de l'invention 9 sont identi~iables par les methodes classiques et~ en particulier, par celles qui ont ét~ décrites par J~ Garnier dans Ann~-Biol. anim~ Bioch.
Biophys~ 19649 4 ~) 163-187. Les exemples qui suivent il-lustrent5 non limitativement, la pr~sente invention.
25 EX~MPLE 1 Dans une col~nne de 1 cm de diamètre intérieur sont placés 5 g de grains de silice, d'une granulométrie de 100-200 ~m ; cette silice présente une surface spéci~ique de 20 m~/g et un diamètre poreux de 80 nmO
30 La silice est lav~e avec une solution de phosphate disodi-que Na2HP04 0,005 M~
Dans 1 litre de cette mame solution de phosphate, on dis-sout 10 g d'une poudre obtenue par séchage des solides re-cueillis (rétentat) dans l'ultrafiltration d'un lactosérum;
35 cette poudre contient 6,5 g de protéines. Le pH de la solu-, , . .
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tion obtenue est ajusté à 8920On fait ensuite passer la solution 3 travers la charge de silice dans la colonne susindiquée, ~ un débit de 60 ml/h;
cette charge est ensuite la~ee avec une solution 0,005 M
de phospha-te disodique, de pH 892~ de ~açon à chasser tou-tes les protéines non fixées sur la silice.
La lactoferrine ~ixée est alors éluée ~ l~aide d'une solu-tion d~acide acétique 0,1 N additionnée de NaCl à la con-~centration de 0,5 ~0 On obtient ainsi une fraction de 25 10 ml de liquide coloré en rose, contenant 40 mg de protéi-nes constituees;de 66~ de lactoferrine5 le reste étant des immunoglobulines. Après un lavage de la charge de si-lice, par passage d'une solution de phosphate disodique 0,005 ~, la colonne est pr~te pour un nouveau cycle d~ -15 adsorption.
Dans une opération similaire à celle de lgexem~
ple 1~ la charge de la colonne est lav~e a~ec un tampOn txis-HCl~ pH ~, additionnée de 0,5 ~ NaCl, apres l'élu-20 tion ~ l'acide acétique et recupération de la fraction delactoferrine. Cela ~ournit une nouvelle ~raction de ~0 ml contenant 30 mg de protéines constituées essentiellement d'immunoglobulines, de lactoperoxydase et d'une très fai- -ble quantité de lacto~errine.
25 Après un lavage de la silice, dans la colonne9 par une so~
lution de phosphate disodique 0~005 M, la colonne est nouveau pr8te à l'emploi.
Le mode opératoire de l'exemple 1 est repete9 30 mais la source de lactoferrine est constituée par 1 litre de petit lait, directement issu de la ~abrication de fro-mage, sans concentration, ce liquide étant additionné de 0,005 M de phosphate disodique par li-tre.
Les résultats sont les m~mes que dans llexemple 10 ~ ~ .
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EXE~ PLE 4 Le lavage alcalin de l'exemple 2 est appliqué
à un mode operatoire utilisant le petit lait, selon lie-xemple 3. Cela conduit à des résultats identiques ~ ceux de l'exemple 2.
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Claims (17)
1. Procédé d'extraction de protéines du lait comprenant celles qui sont capables de fixer le fer, à
partir d'un milieu aqueux substantiellement exempt de caséines, par adsorption sur un support solide et ensuite élution des protéines adsorbées, au moyen d'une solution acide caractérise en ce que l'adsorption à lieu en milieu faiblement basique, de pH supérieur à 7,5.
partir d'un milieu aqueux substantiellement exempt de caséines, par adsorption sur un support solide et ensuite élution des protéines adsorbées, au moyen d'une solution acide caractérise en ce que l'adsorption à lieu en milieu faiblement basique, de pH supérieur à 7,5.
2. Procédé suivant la revendication 1, caracté-risé en ce que le pH du milieu soumis à l'adsorption est compris entre 7,7 et 8,8.
3. Procédé suivant la revendication 1, appliqué
au cas où l'élution a lieu à un pH inférieur à environ 4, l'éluant contenant , si désire , un sel soluble augmentant sa force ionique.
au cas où l'élution a lieu à un pH inférieur à environ 4, l'éluant contenant , si désire , un sel soluble augmentant sa force ionique.
4. Procédé suivant la revendication 2, appliqué
au cas où l'élution a lieu à un pH inférieur à environ 4, l'éluant contenant , si désire , un sel soluble augmentant sa force ionique.
au cas où l'élution a lieu à un pH inférieur à environ 4, l'éluant contenant , si désire , un sel soluble augmentant sa force ionique.
5. Procédé suivant une quelconque des revendi-cations 1 à 3, applique à celui dans lequel l'adsorbant est constitué par de la silice, dont la surface spécifique est d'environ 5 à 150 m2/g et le diamètre poreux de 25 à 250 nm.
6. Procédé suivant la revendication 4, appliqué
à celui dans lequel l'adsorbant est constitué par de la silice, dont la surface spécifique est d'environ 5 à
150 m2/g et le diamètre poreux de 25 à 250 nm.
à celui dans lequel l'adsorbant est constitué par de la silice, dont la surface spécifique est d'environ 5 à
150 m2/g et le diamètre poreux de 25 à 250 nm.
7. Procédé suivant une quelconque des revendi-cations 1 à 3, applique à celui dans lequel l'adsorbant étant sous une forme pulvérulente, sa granulométrie est de 5µm à
5 mm.
5 mm.
8. Procédé suivant la revendication 6, appliqué
à celui dans lequel la silice étant sous une forme pulvé-rulente, sa granulométrie est de 5µm à 5 mm.
à celui dans lequel la silice étant sous une forme pulvé-rulente, sa granulométrie est de 5µm à 5 mm.
9. Procédé suivant une quelconque des revendica-tions 1 à 3, appliqué à celui dans lequel l'adsorbant est constitue par un silicate naturel ou artificiel ou/et par une alumine activée.
10. Procédé suivant une quelconque des revendica-tions 1 à 3, dans lequel l'élution est opérée en milieu acide, caractérisé en ce qu'elle est suivie d'un traitement par une solution basique et de la récupération des immuno-globulines et de la lactoferrine ainsi libérées.
11. Procédé suivant la revendication 1, caracté-risé en ce que la protéine du lait soumise à l'extraction est de la lactoferrine d'un liquide dérivé du lait, ou d'un tel liquide concentre avant l'extraction.
12. Procédé suivant la revendication 11, caracté-risé en ce que le liquide de dérivé du lait est du lacto-sérum ou du lactosérum concentré avant l'extraction.
13. Procédé suivant la revendication 11, caracté-risé en ce que des immunoglobulines et/ou d'autres protéines sont récupérées du liquide restant après adsorption de la lactoferrine.
14. Procédé suivant une quelconque des revendica-tions 2, 4 et 6, caractérisé en ce que le pH du milieu soumis à l'adsorption est compris entre 7,9 et 8,5.
15. Procédé suivant la revendication 8, caracté-risé en ce que le pH du milieu soumis à l'adsorption est compris entre 7,9 et 8,5.
16. Procédé suivant une quelconque des revendi-cations 1 à 3, appliqué à celui dans lequel l'adsorbant étant sous une forme pulvérulente, sa granulométrie est de 10 à
500µm.
500µm.
17. Procédé suivant la revendication 15, appliqué
à celui dans lequel la silice étant sous une forme pulvéru-lente, sa granulométrie est de 10 a 50µm.
à celui dans lequel la silice étant sous une forme pulvéru-lente, sa granulométrie est de 10 a 50µm.
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