CN100443064C - 用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到制备用于心血管系统组织修复或重建的生物带瓣管道的方法，特别是取材来源于异种生物组织的方法。本发明提供的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，包括如下步骤：1)获取牛颈静脉，并漂洗，消毒；2)采用染料介导的光氧化反应使牛颈静脉基质交联；3)消毒并保存；其特征在于在第2步之前先用去细胞剂处理第1步获得的牛颈静脉。本发明提供的生物带瓣管道的制备方法，能获得具有良好的生物物理性能，抗钙化性能强，免疫原性低，无细胞毒性，有利于宿主细胞生长的生物带瓣管道。

Description

用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道及制备方法

技术领域

本发明涉及到制备用于心血管系统组织修复或重建的生物带瓣管道的方法，特别是取材来源于异种生物组织的方法。

技术背景

在右室与肺动脉连接发育不良的复杂先天性心脏病如共同动脉干，肺动脉闭锁，右室双出口，矫正性大动脉转位等的外科治疗需要应用生物带瓣管道。没有带瓣管道，这类疾病治疗效果极差。上世纪60年代以来，国内外采用同种带瓣主动脉或肺动脉管道，并取得了良好效果。但同种带瓣管道来源困难，尤其适合于婴幼儿手术的更少，并且，存在远期钙化，耐久性不佳等问题。80年代国外研制出猪肺动脉或主动脉带瓣管道，但临床应用效果欠佳，远期钙化严重，失功衰败，耐久性差。上世纪90年始国外开展牛颈静脉带瓣管道研究并应用于临床。牛颈静脉带瓣管道具有取材方便，天然具有的瓣膜类似于人的肺动脉瓣结构，抗反流性能强，血管直径跨度范围大，更适合于临床婴幼儿病例。目前国际上，唯一牛颈静脉带瓣管道产品为Medtronic公司生产的商品名为‘Congtegra’。该产品系采用常规生物组织交联剂戊二醛固定制备而成。该产品在欧美等国应用，近期和中期临床效果报道结果不一。效果不佳的原因主要为组织钙化、吻合口狭窄及血栓形成等。而这些原因主要与制备技术相关。戊二醛交联处理生物组织存在下列缺陷：1)细胞毒性作用，交联后的组织中长期残留的戊二醛对细胞有毒性作用，宿主细胞不能在组织中生长。2)醛基的存在等原因导致交联后组织易钙化，钙化是带瓣管道衰败的重要原因之一。3)免疫原性消除不完全，是钙化的原因之一，也是导致炎症反应机制之一。4)残留的细胞及碎屑是组织钙化的主要位点之一，也是免疫原性的重要来源。图1是用传统戊二醛方法处理获得的带瓣管道的样品图(A)，以及及植入犬体内一年后改变(B)；图2戊二醛处理的牛颈静脉瓣膜(A)及植入犬体内一年后改变(B)。

改进处理制备技术是提高牛颈静脉带瓣管道性能的重要环节。

染料介导的光氧化是异种生物组织交联的一种非掺入性技术。是通过光化学反应使得组织胶原交联，无细胞毒性。对于不同的组织，光氧化固定方法在一些细节上有差异，但是大体方法一致，即把要固定的材料浸入溶有染料的溶液中，进行光辐射。所用的染料有如下几种：亚甲蓝、亚甲绿、孟加拉玫瑰红、核黄素、原黄素、荧光素、五磷酸吡哆醛、伊红等。其中应用最多的是亚甲蓝，染料的使用浓度为0.01％～0.1％。使用的溶液可以是低离子强度缓冲液、高离子强度缓冲液、磷酸缓冲盐溶液或组织缓冲液。溶液的pH值6.8～8.6，渗透压为300mmol/kg左右，溶液温度0℃～25℃，最佳是10℃左右，可以避免温度过高引起组织蛋白的变性。根据所固定的材料的不同，光辐射的强度和时间不一样，一般是用1～2只150～500W的灯泡，放置在离样本2～12cm高度；光照的时间从几分钟到160h，光照的强度和时间有一个综合的指标-流明小时，一般100～20000流明小时。

按现有技术中公开的染料介导的光氧化交联技术没有用来处理牛颈静脉带瓣管道的方法。本申请人用该技术来处理牛颈静脉带瓣管道，其结果仍然是不理想。

另一方面，去细胞技术在组织工程学领域已广泛应用。去细胞后保留的细胞外基质，是一种天然的有利于宿主细胞附着、生长和迁移的支架结构。细胞成分的充分去除，降低了免疫原性，也消除了细胞残核这个可能的钙化位点，提高了抗钙化性能。文献报道去细胞的方法有两种：(1)去垢剂脱细胞：去垢剂是一类可溶于水的脂类，它有亲水部分和疏水部分，因此能裂解脂膜，溶解抗原，清除免疫复合物。去垢剂分为：①离子型：带电荷头部(+或-)，如十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠、脱氧胆酸钠等。其缺点是使蛋白质高度变性，并使蛋白质以单体形式分离。②非离子型：带非极性头部，如Triton X-100、Triton-X114、辛葡糖苷、Tween20等。其对蛋白质和蛋白质间的相互作用干扰较弱，对蛋白质变性的作用亦较弱。③两性型：带有+和-电荷头部，如CHAPS、Zwitterget等。(2)消化酶脱细胞：采用胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶作为脱细胞剂。这两种脱细胞液，根据不同组织和临床应用情况可自由选择。一般采用联合使用方法。

发明内容

本发明为提供用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道，采用去细胞技术与染料介导的光氧化交联技术处理牛颈静脉带瓣管道。

本发明提供的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，包括如下步骤：1)获取牛颈静脉，并漂洗，消毒；2)采用染料介导的光氧化反应使牛颈静脉基质交联；3)消毒并保存；其特征在于在第2步之前先用去细胞剂处理第1步获得的牛颈静脉。

本发明的关键在于选择合适的去细胞方法并且采用非戊二醛的蛋白质交联方法。

采用去细胞技术与染料介导的光氧化交联技术联合处理牛颈静脉带瓣管道，可以利用两者的优点，使制备的带瓣管道达到很好的性能。作为去细胞技术，它的作用是将牛颈静脉组织细胞中的细胞成分如细胞核等充分去除，从而达到消除钙化位点，降低免疫原性的目的。而染料介导的光氧化技术的应用是使组织中的蛋白质充分交联，提供一个稳定的骨架结构。

牛颈静脉采自本地黄牛及青海牦牛，体重为100～600公斤，健康，检疫合格。牛颈静脉通常拥有多组瓣膜，每组瓣膜通常为三叶或两叶，少部分为四叶。瓣叶发育程度不等，约有20-30％的牛颈静脉具有发育及抗反流性能良好的瓣膜。瓣叶菲薄，类似于人肺动脉。瓣窦处血管壁薄，修剪时易损伤。同一牛颈静脉瓣膜组间距离统计结果为6.4±2.6cm。牛颈静脉通常有多支小血管分支开口，制备时需结扎。牛颈静脉外膜纤维结缔组织丰富，与中膜分界不清。不同牛系之间颈静脉的瓣膜发育无明显区别。血管直径为8～22mm，在无菌条件下去除筋膜组织，检测瓣膜发育状态及抗反流性能。瓣膜发育及抗反流性能良好的血管浸入0.1％新洁尔灭30min，PBS漂洗。

根据现有技术，用于去细胞的去污剂有多种，包括离子型、非离子型以及两性型。本发明选用非离子型去污剂，例如曲那通100。

本发明在去细胞的步骤中，采用多步骤的手段。除采用非离子型去污剂外，还联合采用消化酶或/和核酸酶，所用的消化酶为胰蛋白酶，核酸酶为脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶。

因此，本发明进一步提供去细胞处理的方法是联合采用非离子型的去污剂和消化酶或/和核酸酶处理的方法；去污剂的浓度为0.25-1％，消化酶为胰蛋白酶；核酸酶为脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，当消化酶为胰蛋白酶时浓度为0.025～0.05％胰蛋白酶；当消化酶为脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶时，其浓度分别为10-40unit/ml及0.1-0.4mg/ml。

按现有技术中公开的方法，在用胰蛋白酶去细胞时，溶液中还有一定浓度的EDTA。

上述各种去细胞剂的处理时间也是一个很重要的参数。本发明中优选去污剂处理时间为24--48小时，胰蛋白酶处理时间为30--120分钟，脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶混合后处理时间为24-72小时。

最优选曲那通100浓度为0.5％，处理时间为48小时，消化酶为胰蛋白酶，其浓度为0.025-0.125％，处理时间为30--60分钟；以及脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，其浓度分别为20unit/ml及0.2mg/ml，处理时间为24小时。

对于光氧化反应，本发明中具体选用了亚甲基蓝，并在pH：7.6；Osm：320mosm条件下，150～500W白炽灯悬空照射20～48h。

优选在亚甲基蓝溶液中，PBS(pH：7.6；Osm：320mosm)条件下浸泡2-4小时。

在进行光氧化反应时，生物带瓣管道处于不高于25℃温度条件下。例如可以用水浴的方法控制被处理的生物带瓣管道的温度不高于25℃。

本发明提供的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，能获得具有良好的生物物理性能，抗钙化性能强，免疫原性低，无细胞毒性，有利于宿主细胞生长的生物带瓣管道。

附图说明

图1是戊二醛处理的牛颈静脉带瓣管道(A)及植入犬体内一年后改变(B)；

图2是戊二醛处理的牛颈静脉瓣膜(A)及植入犬体内一年后改变(B)；其中箭头指示瓣膜结构；

图3用本发明的方法处理后，牛颈静脉血管(A)及瓣膜(B)组织形态变化(HE染色X20)；

图4用本发明的方法处理后，牛颈静脉带瓣管道(A)及植入犬体内一年后改变(B)，其中箭头指示瓣膜位置；

图5用本发明的方法处理后，牛颈静脉瓣膜(A)及植入犬体内一年后改变(B)，其中箭头指示瓣膜位置；

图6用本发明的方法处理后，牛颈静脉植入犬体内一年后血管组织内皮样细胞再生图(HE染色(X 100)箭头示内皮样细胞)；

图7不同技术处理制备的牛颈静脉组织蛋白提取试验结果，其中F：新鲜组织，P：光氧化处理组织，GA：戊二醛处理组织，DE：单纯去细胞组织，DP：去细胞结合光氧化处理组织，DGA：去细胞结合戊二醛处理组织，M：marker。12，24，36及48为光氧化处理时间；

图8利用Western blotting技术检测不同方法处理制备的BJVC的免疫原性结果，其中F：新鲜组，GA：戊二醛组，P：光氧化组，DP：去细胞结合光氧化组；

图9人脐静脉内皮细胞在去细胞结合光氧化技术制备的牛颈静脉血管片上种植后电镜结果(SEM_x 1200.箭头示人脐静脉内皮细胞)。

具体实施例

实施例1

1)自屠宰场获取牛颈静脉，牛种属可为本地黄牛，体重为100～600公斤，健康，检疫合格。血管直径为8～22mm，在无菌条件下去除筋膜组织，

检测瓣膜发育状态及抗反流性能。瓣膜发育及抗反流性能良好的血管浸入0.1％新洁尔灭30min，PBS漂洗。

2)去细胞处理：

按照表1随机分十组。采用不同浓度、不同作用时间、不同去细胞剂按下列方法组合处理血管组织。观察不同脱细胞方法处理后的牛颈静脉血管片的大体形态、脱细胞的完整程度、胶原弹力纤维保存的完整性、热皱缩温度的变化和最大抗张强度下降的程度。

①采用去垢剂曲那通(Triton)X-100的PBS液，浓度小于1％，合适浓度为0.25～0.5％，37。℃下处理24～48小时，PBS漂洗；②0.025～0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA的PBS在37℃下处理30～120min，PBS漂洗，30～60min更为合适；③加入20u/ml DNase-I及0.2mg/ml RNase-A的PBS在37℃下处理24-48小时，PBS漂洗，置于PBS中。

3)管道置于高渗PBS液(pH：7.6；600～680mosm)中浸泡2-4h，再置于含0.01～0.1％亚甲基蓝PBS(pH：7.6；Osm：320mosm)中平衡2～4h后，150～500W白炽灯悬空照射20～48h。反应体系置于0～25℃恒温水浴内，照射过程中连续搅拌，吹入空气，并控制pH值。处理完后充分漂洗脱色。

4)置于复合碘剂中浸泡3天灭菌处理或0.1％新洁尔灭中30～60min，再置于50～60％酒精中保存。复合碘剂配方及处理方法参照1995年美国专利(专利号为5437287)进行。第4步处理完毕后，组织采用涤纶无菌袋包装，保存液为DMEM液，10％DMSO及10％FBS。组织逐步降温至-80℃，在冷冻状态下，采用γ射线消毒(剂量为25～40kGy)，消毒后，组织低温或常温保存。

表1，

*0.025％(0.05％或0.125％)胰蛋白酶溶液中含有0.02％EDTA

**核酸酶混合溶液中20u/mlDNase-I、0.2mg/ml RNase-A

结果：所有脱细胞处理后的各组牛颈静脉血管片中除了III组的瓣膜结构有破坏外，其他组的血管壁和瓣膜结构完好，和新鲜组相似；各组的热皱缩温度和新鲜对照组比较无显著性差异。过高浓度的胰蛋白酶(0.125％)或过长的胰蛋白酶消化时间(24h)可破坏瓣膜结构和牛颈静脉血管中胶原弹力纤维，使得最大抗张强度比新鲜对照组下降20％以上；单纯的曲那通X-100(0.25％)加低浓度的胰蛋白酶(0.025％)脱细胞处理的牛颈静脉血管片残留部分细胞结构；温和的多步骤去垢剂-酶消化法(0.25％或0.5％曲那通X-100，0.025％或0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA，20u/mlDNase-I和0.2mg/ml RNase-A)脱细胞处理后的带瓣牛颈静脉血管片比较理想：血管壁和瓣膜大体形态和处理前相似，光镜和电镜观察显示细胞成分去除完全，胶原弹力纤维保存完整见图3。

结论：多步骤去垢剂-酶消化法(曲那通X-100，胰蛋白酶和核酸酶)脱细胞处理后的带瓣牛颈静脉脱细胞基质是比较理想的组织工程血管支架。

实施例2

去细胞光氧化处理的牛颈静脉血管抗张强度研究。

方法：采集本地牛颈静脉20根，每根血管分成五段，随机分成新鲜组、去细胞组、光氧化组、去细胞光氧化组、GA组。每组n＝20。戊二醛组采用0.625％戊二醛固定6小时，0.3％戊二醛保存；光氧化组采用0.1％亚甲基蓝作为介导剂，光照时间为48小时，光照强度为4000流明小时，介导剂温度为12-18℃，复合碘剂消毒，60％酒精保存；去细胞结合光氧化组采用0.5％曲那通X-100处理48小时，0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA，30min及20u/mlDNase-I和0.2mg/ml RNase-A，24h。各步间PBS液漂洗多次

(即表1中VII组方案)。采用与光氧化组相同技术进一步染料介导光氧化处理，复合碘剂消毒，60％酒精保存。新鲜组血管采用60％酒精保存。自所有实验用牛颈静脉距离瓣窦1cm以上处横行裁剪长4cm，宽0.5cm的血管条。采用STRON生物拉力仪测定牛颈静脉血管条的生物力学性能。

结果：各组的最大应力如下表2。去细胞光氧化处理组的最大应力显著强于新鲜组。去细胞处理对应力无明显影响。但去细胞光氧化处理的血管应力显著低于戊二醛交联组。

表2，不同技术处理的牛颈静脉血管片的最大应力比较

结论：去细胞结合光氧化处理制备牛颈静脉提高了组织的抗张强度，但不及戊二醛处理的材料的抗张强度大。

实施例3

不同技术处理制备的牛颈静脉组织蛋白提取试验

方法：采集本地牛颈静脉，采用戊二醛交联、光氧化交联及去细胞光氧化交联制备牛颈静脉(方法同实施例2)。不同技术制备的牛颈静脉及新鲜的牛颈静脉和去细胞处理的牛颈静脉捣碎，加入组织提取液，取20μl提取液作聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白分析。

结果：见图7，与新鲜管道相比，戊二醛处理组和光氧化反应组处理的管道组织蛋白提取量都明显减少，这说明光氧化反应与戊二醛一样对牛颈静脉起到固定作用，组织稳定性显著增加，且随着光氧化反应作用时间的增加，组织蛋白提取量进行性减少。去细胞处理对组织稳定性无明显影响。

实施例4

不同交联技术制备的牛颈静脉免疫原性比较研究

方法：采集本地牛颈静脉，采用戊二醛交联、光氧化交联及去细胞光氧化交联制备牛颈静脉(具体方案同实施例2)。不同技术制备的牛颈静脉及新鲜的牛颈静脉分别匀浆提取抗原，再与完全弗氏佐剂混合制成复合乳剂抗原后免疫新西兰大白兔，双向免疫扩散法测定兔血清抗体滴度。取新鲜牛颈静脉免疫抗血清，采用免疫印迹法(Western blotting)体外检测交联后的牛颈静脉带瓣管道免疫原性。Western blotting方法：(1)SDS-PAGE：取浓缩胶浓度为4.0％，分离胶浓度为10％的垂直平板电泳，每板依次加入新鲜牛颈静脉、PC、PH、GA交联处理的牛颈静脉织抗原。组织抗原在加样前均与样品缓冲液以1∶1对比稀释并加热处理(100℃，4min)。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝染色或进行电转膜。(2)电转膜：将蛋白条带从凝胶转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，转移电压为恒压45V，转移时间为3h，电转移后的凝胶用考马斯亮蓝染色以观察蛋白转移效率。(3)免疫印迹反应：用含1％BSA的Tween 80/Tris盐缓冲液(Tween 80，TBS)封闭NC膜，然后将NC膜先后与1∶40血清及1∶12000AP羊抗兔IgG反应，最后以BCIP/NBT作为底物进行显色反应，条带出现而背景较淡时以蒸馏水冲洗终止反应。

结果：抗体稀释至1∶1000后，新鲜牛颈静脉组织抗血清仍有明显条带显示，说明抗体的效价至少可达1∶1000，完全能满足实验的需要。新鲜牛颈静脉组织有特异性重复出现的条带，至少包括6个不同分子量的抗原，说明新鲜牛颈静脉组织有抗原性且抗原分布有特异性，经光氧化及去细胞结合光氧化处理的牛颈静脉基本未出现明显条带，5组经GA交联处理的牛颈静脉有1组出现条带，但无特异性重复出现的条带，说明光氧化处理的牛颈静脉组织抗原性显著降低，经去细胞结合光氧化处理的牛颈静脉的抗原性更低(见图8)。

实施例5

去细胞光氧化处理的牛颈静脉血管抗钙化性能研究

方法：采集本地牛颈静脉，采用戊二醛交联、光氧化交联及去细胞光氧化交联处理牛颈静脉(具体方案同实施例2)。裁剪成1×1.5cm2带瓣叶的试片。选择离乳的雄性SD大白鼠(由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供，均符合国家实验动物规定)，皮下包埋，喂养60天，获取标本，原子吸收分光光度仪测定组织钙含量。

结果：管壁及瓣膜钙含量结果分别为253±37.6，170.6±29.5，121.7±21.8μg/mg；25.6±3.8，21.7±2.9，12.8±2.6μg/mg。组间比较三组之间均有显著性差异。

结论：去细胞结合染料介导光氧化处理制备的牛颈静脉显著提高了抗钙化性能。

实施例6

去细胞结合光氧化处理的牛颈静脉管道重建犬肺动脉与右室连接

方法：采集牛颈静脉带瓣管道，去细胞处理结合光氧化技术制备。应用带瓣管道作本地家犬右室流出道重建，结扎自身肺动脉，重建前后直接测定肺动脉压、右室压及体循环压，术后七天内超声检测，术后一年超声及心导管检测血流动力学。

结果：六只犬重建后均长期存活。重建右室流出道后，管道内瓣膜远端血压为22/14～37/10mm Hg。与重建前肺动脉压比较(包括收缩压、舒张压及平均压)差异无显著性(P＞0.05)，但管道内舒张压显著高于右室舒张压(p＜0.01)。重建后右室血压为26/5～41/0mm Hg，与重建前比较，右室舒张压无明显变化(p＞0.05)。但收缩压增加有显著性(p＜0.05)，术后超声检测管道内瓣膜纤细，瓣膜启闭良好，多无返流或极轻度返流。跨瓣压差小。术后一年及一年半后处杀动物获取牛颈静脉标本检测，牛颈静脉管道通畅，管壁仍具有较好弹性，外形完整(图4)瓣叶无明显增厚，活动好(图5)，管壁及瓣叶内膜有一层内皮样细胞生长(图6)。

结论：从近期和远期血流动力学观察看，自制牛颈静脉带瓣管道可以作为右室流出道重建的良好材料。

实施例7

人脐静脉内皮细胞在去细胞结合光氧化处理的牛颈静脉片上的种植

方法：采集牛颈静脉，去细胞处理结合染料介导光氧化技术处理牛颈静脉。γ射线低温灭菌处理。获取人脐静脉内皮细胞，传代培养，在血管内皮细胞生长因子等诱导下培养成内皮细胞。在牛颈静脉片上种植培养。

结果：内皮细胞在牛颈静脉片上种植生长并长期存活(图9)，细胞密集生长，排列有序，贴壁牢靠。

结论：去细胞结合光氧化处理的牛颈静脉适合人内皮细胞生长。

Claims (9)

1、用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，包括如下步骤：1)获取牛颈静脉，并漂洗，消毒；2)采用染料介导的光氧化反应使颈静脉基质交联；3)消毒并保存；其特征在于在第2步之前先用去细胞剂处理第1步获得的牛颈静脉；所采用的去细胞剂是采用非离子型的去污剂，还联合采用消化酶或/和核酸酶；消化酶为胰蛋白酶；核酸酶为脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶。

2、根据权利要求1所述的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，其特征在于所用的去污剂为曲那通100。

3、根据权利要求2所述的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，其特征在于去污剂的浓度为0.25-1％；当消化酶为胰蛋白酶时浓度为0.025～0.05％胰蛋白酶；当核酸酶为脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶时，其浓度分别为10-40unit/ml及0.1-0.4mg/ml。

4、根据权利要求3所述的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，其特征在于所用的去污剂处理时间为24--48小时，胰蛋白酶处理时间为30--120分钟，脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶混合后处理时间为24-72小时。

5、根据权利要求4所述的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，其特征在于曲那通100浓度为0.5％，处理时间为48小时，消化酶为胰蛋白酶，其浓度为0.05％，处理时间为30分钟；以及脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，其浓度分别为20u/ml及0.2mg/ml，处理时间为24小时。

6、根据权利要求1至5之一所述的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，其特征在于光氧化反应中采用亚甲基蓝，并在pH：7.6；Osm：320mosm条件下，150～500W白炽灯悬空照射20～48小时。

7、根据权利要求6所述的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，其特征在于在亚甲基蓝溶液中，pH：7.6；Osm：320mosm条件下浸泡2-4小时。

8、根据权利要求6所述的用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道的制备方法，其特征在于在进行光氧化反应时，生物带瓣管道处于不高于25℃温度条件下。

9、一种用于肺动脉血管修复或重建的生物带瓣管道，其特征在于它是根据权利要求1-8之一的方法制备的。

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