CN101349644B - 一种白细胞分类试剂和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含式I荧光染料的白细胞分类试剂，其中R1、R2、R3、R4、Y-和n如说明书中定义。本发明还提供了包含该白细胞分类试剂的试剂盒，以及使用该白细胞分类试剂将白细胞分类的方法。
Figure D071D9172720070806A000011

Description

一种白细胞分类试剂和其使用方法
技术领域
本发明涉及白细胞分类试剂和其使用方法，具体地说涉及通过适宜的电子仪器自动区分血液中白细胞各亚群的试剂和方法。
背景技术
正常外周血中的白细胞通常可分为五类，即淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。由血液样本分析白细胞群体可为众多疾病的临床诊断提供许多有用的信息。例如，在出现疾病时血液中的各类白细胞的比例和数量可能发生变化，同时还可能出现异常淋巴细胞和幼稚粒细胞等异常白细胞。因此，分类并测定不同类型的正常和异常白细胞可获得有关疾病潜伏、起始和发展阶段等方面的信息。
传统血液样本分析主要是将血液样本涂片，用特异染料进行细胞内部结构的着色，并于显微镜下观察，计数白细胞各亚群的种类和数目。这种方法费时，而且操作人员的个体识别差异产生不同的结果，因此发展了利用流式技术进行白细胞计数来自动分析白细胞亚群的方法。
目前的对血液样本中白细胞进行分类的方法有很多，包括采用射频、高角散射、低角散射、阻抗、侧向散射等分别组合的方法，或采用几步的方法实现对白细胞的分类。目前仪器分析主要采用溶血剂将血液样本中的红细胞系溶解，使白细胞产生不同的皱缩而形成大小或散射光强度的差异。
美国专利4751179公开了一种试剂体系和自动细胞计数装置，其可确定白细胞的四种亚群，即淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞。但该体系需要将样本混合物在60-75℃下加热，由此增加了设备的复杂性和成本，并且不能识别异常淋巴细胞和幼稚粒细胞。
中国专利CN1084473C、CN1113241C公开了白细胞4分类试剂和嗜碱粒细胞的测量试剂，以及使用它们将白细胞5分类的方法。该专利的方法采用狭角散射光测定细胞大小信息，并通过广角散射光测定细胞形态信息而实现白细胞的4分类，而由嗜碱试剂单测嗜碱细胞，从而组成白细胞5分类识别，其独特之处是采用有机酸类化合物调整白细胞的形态信息。然而该方法无法检测异常白细胞。
美国专利US6004816公开了采用荧光染料标记细胞内RNA的方法，从而通过侧向散射光和荧光强度来分类和计数白细胞，同时识别和计数异常淋巴细胞、未成熟粒细胞等。但是，该专利中使用的荧光染料光稳定性不足，容易造成实验误差。
因此，需要新的试剂和方法来区分和计数血液中的正常白细胞，同时识别血液中的异常白细胞，该方法应具有良好的准确度和精密度，并且成本低廉。
发明内容
本发明的一个目标是提供能够区分和计数血液中的正常白细胞，同时识别血液中的异常白细胞(如异常淋巴细胞和未成熟粒细胞)的试剂，所述试剂包含具有以下结构的荧光染料：
Figure G071D9172720070806D000021
其中R1、R2、R3、R4独立选自氢、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n为1-3的整数，Y-为负离子。
优选所述荧光染料具有如式II所示的分子结构：
Figure G071D9172720070806D000031
优选所述试剂还包含红细胞溶解剂，所述红细胞溶解剂可包含阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、缓冲剂或它们的任何组合，还可任选包含醇。
在另一个方面，本发明提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒包含本文中所述的白细胞分类试剂。
在再另一个方面，本发明提供了一种将血液中白细胞分类的方法，所述方法包括
1)将血液样品与适量的红细胞溶解剂溶液混合；
2)将式I的荧光染料溶液加入步骤1)的混合物中
其中R1、R2、R3、R4独立选自氢、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n为1-3的整数，Y-为负离子；
3)测定步骤2)中所得混合物的至少一种散射光特性和至少一种荧光特性；
4)根据散射光特性和荧光特性将白细胞分类和/或计数。
或者，本发明提供一种将血液中白细胞分类的替代方法，其中将红细胞溶解剂溶液和荧光染料溶液同时加入样品中。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
附图说明
图1为使用实施例1的组合物对正常血液样本(1号血液样本)的分析结果二维示意图。
图2为使用实施例1的组合物对异常血液样本(2号血液样本)的分析结果二维示意图。
图3为使用实施例1的组合物对异常血液样本(3号血液样本)的分析结果二维示意图。
具体实施方式
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“血液”或“血液样品”是指包含血细胞的体液样品，例如外周血、骨髓液等。
本文中使用的术语“异常细胞”是指通常不出现在血液中的细胞，包括不成熟细胞和异常成熟细胞，例如不成熟淋巴细胞、不成熟髓细胞(在本文中也称为Blast)、异常成熟淋巴细胞、异常成熟髓细胞、有核红细胞等。
本文使用的术语“烷基”指有1-20个碳原子的直链或支链烃基；所述烷基可任选带有一个或多个取代基，例如卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、巯基、烷氧基、芳基、芳烷基、杂环基、卤代烷基、卤代芳基、卤代芳烷基等，只要所述取代可形成化学上稳定的化合物，并且不影响本发明荧光染料的荧光性质。
本文使用的术语“烯基”指有2-20个碳原子并具有至少一个碳碳双键的直链或支链烃基；所述烯基可任选带有一个或多个取代基，例如卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、巯基、烷氧基、芳基、芳烷基、杂环基、卤代烷基、卤代芳基、卤代芳烷基等，只要所述取代可形成化学上稳定的化合物，并且不影响本发明荧光染料的荧光性质。
本文使用的术语“炔基”指有2-20个碳原子并具有至少一个碳碳三键的直链或支链烃基；所述炔基可任选带有一个或多个取代基，例如卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、巯基、烷氧基、芳基、芳烷基、杂环基、卤代烷基、卤代芳基、卤代芳烷基等，只要所述取代可形成化学上稳定的化合物，并且不影响本发明荧光染料的荧光性质。
荧光染料
本发明的荧光染料能够特异性结合细胞内核酸(RNA、DNA)。优选所述染料为红色激发荧光染料，能够被红色半导体激光器等提供红色区域激光的器件发出的红色激光所激发，这样本发明试剂可用于采用半导体激光器等廉价设备作为光源的血液分析仪或流式细胞仪等。在一个实施方案中，荧光染料具有式I所示的结构
Figure G071D9172720070806D000051
其中R1、R2、R3、R4独立选自氢、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n为1-3的整数，Y-为负离子。
优选本发明的荧光染料具有下式II的结构：
Figure G071D9172720070806D000061
本发明的荧光染料可以溶解在乙醇、二甲亚砜、乙二醇中并作为储存液保存，也可以溶解在其它非水溶剂中。本发明优选使用乙二醇作为溶剂，并任选含有5-10％的甲醇作为稀释液的成分。此外，为了防止荧光染料聚集，本发明还可任选包含非离子表面活性剂作为分散剂，使荧光染料保持一定的溶解度，不产生聚集。这种非离子表面活性剂例如为聚氧乙烯乙二醇(POE)、聚丙烯乙二醇(POP)、聚氧乙烯乙二醇-聚丙烯乙二醇(POE-POP)、Brij系列非离子表面活性剂。本发明优选使用Brij 35、Brij56等作为荧光染料的分散剂，浓度为0.02-2％。
或者，本发明的荧光染料可与红细胞溶解剂配制在一起，形成单组分试剂。
红细胞溶解剂
本发明使用的红细胞溶解剂可包含阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、缓冲剂或它们的任何组合。
本发明采用阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂作为溶解红细胞的试剂，它们的组合可溶解血液样本中红细胞，并且适当破坏各亚群白细胞的膜结构，使血液中白细胞的各亚群收缩成适当的大小，促进白细胞内部结构产生不同的凝聚，造成散射光特性的差别。阳离子表面活性剂可以为溴化辛基三甲基铵(OTAB)、溴化癸基三甲基铵(DTAB)、氯化十二烷基三甲基铵(LTAC)、十四烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十四烷基三甲基氯化铵(CTAC)等，优选为LTAC，使用浓度为300-800mg/L。非离子表面活性剂可采用聚氧乙烯型非离子表面活性剂，如长链脂肪醇聚氧乙烯、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪胺聚氧乙烯醚等，本发明优选非离子表面活性剂为聚氧乙烯-2，3-十二烷基醚(Brij35)，使用浓度为1-5g/L。
本发明的试剂中可含有保持pH并对血液样本进行适当稀释的缓冲液。缓冲液使pH保持在恒定范围内，由此可稳定各亚群白细胞的染色效果，缓冲剂的使用浓度在0.01-200mM范围内。对缓冲液的种类并没有特别限定，只要它们可适用于本发明的目的，例如适当浓度的羧酸盐类、磷酸盐类、柠檬酸盐类、Tris-HCl、MOPS以及其它有机缓冲剂等。本发明试剂中的合适pH因所选择的具体荧光染料不同而有所不同，一般在pH 7.0-8.0范围内，优选的pH是7.0。本发明优选Tris-HCl或MOPS缓冲体系。
本发明的红细胞溶解剂中还可任选包含适当比例的醇，如甲醇，以促进白细胞内部结构的凝聚。
检测试剂盒
在另一个方面，本发明还提供用于能够区分和计数血液中的正常白细胞，同时识别血液中的异常白细胞如异常淋巴细胞和未成熟粒细胞的试剂盒，所述试剂盒包含白细胞分类试剂，所述白细胞分类试剂包含具有以下结构的荧光染料：
Figure G071D9172720070806D000071
其中R1、R2、R3、R4独立选自氢、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n为1-3的整数，Y-为负离子。
优选所述荧光染料具有以下结构：
Figure G071D9172720070806D000081
优选所述白细胞分类试剂还包含本文上述的红细胞溶解剂。
在一个实施方案中，所述荧光染料作为储存液形式存在，保存在单独的容器中。
在另一个实施方案中，所述荧光染料与上述红细胞溶解剂一起配制为单成分溶液。
此试剂盒优选包含适于密封保持在至少一个容器中的分区存放的荧光染料。所述试剂盒还可包含将血液中白细胞分类所需的其它白细胞分类试剂以及测定白细胞的方法的说明。所述试剂盒还可包含可测定并与测试样品对比的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的各组分可封装在单个容器中，不同容器连同说明一起全部在单独包装中，所述试剂盒用于分类和/或计数血液中的各类白细胞。
使用方法
在另一个方面，本发明还提供分类和/或计数血液中白细胞的方法。简单地说，在本发明的方法中，通过将血液样本与本发明的试剂混合，随后测定样品的至少一种散射光特性和至少一种荧光特性，并根据散射光特性和荧光特性将样品分类和/或计数。
本发明方法中使用的血液样本可以是全血，也可以是成分血。可使血液样品首先与红细胞溶解剂和缓冲剂混合，使得红细胞被溶解，各亚群的白细胞产生不同程度的皱缩。该步骤同时在待测定白细胞的细胞膜上形成小孔，这种小孔足以允许荧光染料分子通过细胞膜。
随后加入荧光染料储存液，使得白细胞被荧光标记。在血液样本与试剂混合时，血液样本与本发明试剂的总体积应保证足够的细胞浓度通过仪器的测量池。本发明的试剂组合物将血液样本稀释至1∶10、1∶50或1∶100或以上任何范围中的任何值，只要该稀释符合实际使用的要求。这种调整在本领域技术人员的范围内。
样品混合物可在孵育池中进行温育，温育时间不超过40秒，优选24秒；温育温度可为任何合适的温度，例如42℃。随后稀释并染色的血液样品导入流动室中，通过血液分析仪或类似的流式细胞仪的检测通道，检测和分析白细胞的至少一种散射光特性和至少一种荧光特性。
本发明中的散射光是指可由市售血液分析仪或类似的流式细胞仪检测的散射光。这种散射光包括但不限于侧向散射光、正向低角度散射光(接受光角度为约0-5度)和正向高角度散射光(接受光角度为约5-20度)。具有这种角度的散射光反映了白细胞大小或内部结构的信息，因此用作本发明的散射光。优选侧向散射光。
与细胞中核酸如DNA和RNA结合的荧光染料发射荧光。荧光特性是反映血液样本中细胞内荧光染料量的参数。由于不同亚群的细胞内代谢活动不同，而造成核酸含量的差异，因此不同亚群的白细胞的荧光特性在某些方面具有差异。取决于所使用的具体染料选择合适的激发光波长，并监测相应波长的发射光。本发明优选采用红色半导体激光器发射的红色波长区域激光为检测的光源。对所述红色波长的光源没有特殊的限制，只要能够发出所选择荧光染料的激发波长附近的红色光，例如约波长600-680nm的光。例如可以使用He-Ne激光器、红色区域的半导体激光器等。优选使用半导体激光器，因为它相对于其它激光器成本较低，并且体积较小，这样可降低设备的成本和体积。
利用散射光特性和荧光特性识别各亚群白细胞，以及可能的异淋、幼稚粒细胞等异常信息，并对各聚类散点进行相关的分类计数，计算各亚群白细胞的百分比。散射光反映细胞内部颗粒程度，细胞内部的颗粒程度大致为：嗜酸细胞内部有两分叶核并且内部有很多酸性染料染色的脆质微粒；中性粒细胞核(分叶或杆状)且内部颗粒较多；单核细胞为单大核内部颗粒较少；LYM细胞单大核基本没有颗粒。所以相同条件下各类白细胞的散射光强度特性顺序为EO(嗜酸细胞)＞NEUT(中性粒细胞)＞MONO(单核细胞)＞LYM(淋巴细胞)。
实施例1
染料的合成
示例性的荧光染料通过以下方式合成，其中所述染料具有以下结构：
Figure G071D9172720070806D000101
将20mmol 2-甲基苯并噻唑和22mmol溴化苄加入到50ml含20ml甲苯的圆底烧瓶中，氩气保护。反应加热回流持续反应24小时后停止。混合物冷却后过滤沉淀并用乙醚洗涤滤饼。干燥后得到淡粉色的固体粉末，为中间体1-苄基-2-甲基苯并噻唑季铵盐，收率58％。
将10mmol 1-苄基-2-甲基苯并噻唑季铵盐与30mmol N，N’-二苯基甲脒在60ml醋酸中，于90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应得到的红色油状物用石油醚悬浊洗涤3次，除去醋酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将此粗产品通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3，收集黄色组分，收率42％。向其中加入4mmol 1-苄基-4-甲基喹啉季铵盐及10ml吡啶，90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应液倒入乙醚中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用二氯甲烷∶甲醇＝100∶5洗脱液洗脱，收集蓝色组分，收率70％。
1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)5.49(s，2H)，5.71(s，2H)，6.44(d，1H)，6.98(d，1H)，7.18-7.80(m，18H)，8.23(t，1H)，8.31(d，1H)，8.36(d，1H)。MS(EI)C33H27BrN2S m/z：483.2[M-Br]+。
实施例2
试剂的配制
配制如下组成的试剂体系。
A：荧光染料储存液：
荧光染料                    30mg
乙二醇                      900ml
甲醇                        100ml
B：红细胞溶解剂溶液：
LTAC                        550mg
Brij35                      1.5g
三羟甲基氨基甲烷(Tris)      13g
HCl(13N)                    5.8ml
精制水                      1L
最后将溶液调整pH为7。
实施例3
各种血液样品的测定和结果
将1ml红细胞溶解剂与经过抗凝剂处理的20微升血液混匀，并立即加入20微升荧光染料储存液，在42℃下的孵育池中混匀孵育24秒，形成测定用试样。测定测定用试样的侧向散射光强度和侧向荧光强度。对正常血液样本1号样本的测试结果如图1所示，表明本发明可以实现白细胞五个亚群的分类识别。对异常血液样本2号样本(如图2所示)的测试表明，本发明可有效的区分嗜酸细胞，而且能够有效的识别异常白细胞，包括幼稚粒细胞、异常淋巴细胞等。对异常血液样本3号样本(如图3所示)的测试表明，本发明不仅能够实现白细胞各亚群的有效分类，而且能够有效的识别异常淋巴类细胞。
本文中的所有数据、图像、仪器、试剂和步骤应理解为说明性而非限制性的。虽然已结合上述具体实施方案描述了本发明，许多修改和其它变化对于本领域技术人员是显而易见的。所有这种修改和其它变化也落入本发明的精神和范围内。

Claims (16)

1.一种白细胞分类试剂，所述试剂包含具有式I的荧光染料：
Figure FSB00000628336500011
其中R1、R2、R3、R4独立选自氢，n为1-3的整数，Y-为负离子。
2.根据权利要求1所述的白细胞分类试剂，其中所述荧光染料为具有下式的化合物
Figure FSB00000628336500012
3.根据权利要求1或2所述的白细胞分类试剂，其中所述荧光染料的浓度为1-1000mg/L。
4.根据权利要求1或2所述的白细胞分类试剂，所述试剂还包含红细胞溶解剂。
5.根据权利要求1或2所述的白细胞分类试剂，其中所述荧光染料为单独的荧光染料储存液。
6.根据权利要求4所述的白细胞分类试剂，其中所述红细胞溶解剂包含阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、缓冲剂或它们的任何组合，所述阳离子表面活性剂选自溴化辛基三甲基铵、溴化癸基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵和它们的混合物，浓度范围为300-800mg/L；所述非离子表面活性剂选自长链脂肪醇聚氧乙烯、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪胺聚氧乙烯醚和它们的混合物，浓度范围为1-5g/L；所述缓冲剂选自羧酸盐类、磷酸盐类、柠檬酸盐类、Tris-HCl、3-吗啉代丙磺酸和它们的混合物，它们将测定体系的pH保持在7.0-8.0。
7.根据权利要求1或2所述的白细胞分类试剂，其中所述荧光染料的浓度为2-100mg/L。
8.根据权利要求1或2所述的白细胞分类试剂，其中所述荧光染料的浓度为5-50mg/L。
9.根据权利要求1或2所述的白细胞分类试剂，其中所述荧光染料的浓度为10-20mg/L。
10.根据权利要求6所述的白细胞分类试剂，其中所述阳离子表面活性剂为氯化十二烷基三甲基铵，所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯-2，3-十二烷基醚，所述缓冲剂为Tris-HCl或3-吗啉代丙磺酸。
11.根据权利要求6所述的白细胞分类试剂，其中还包含适当比例的醇。
12.根据权利要求6所述的白细胞分类试剂，其中还包含适当比例的甲醇。
13.一种检测试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-12中任一项所述的白细胞分类试剂。
14.一种将血液中白细胞分类的方法，所述方法包括
1)将血液样品与适量的红细胞溶解剂溶液混合；
2)将式I的荧光染料溶液加入步骤1)的混合物中
Figure FSB00000628336500021
其中R1、R2、R3、R4、Y-和n如权利要求1中定义；
3)测定步骤2)中所得混合物的至少一种散射光特性和至少一种荧光特性；
4)根据散射光特性和荧光特性将白细胞分类和/或计数。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述式I的荧光染料为
Figure FSB00000628336500031
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中将红细胞溶解剂溶液和荧光染料溶液同时加入样品中。
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