CN101470108B - 一种对白细胞进行分类的试剂和方法 - Google Patents

一种对白细胞进行分类的试剂和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对白细胞进行分类的试剂，包括a、至少两种阳离子表面活性剂；b、至少一种带疏水基团及阴离子基团的有机化合物；c、能够将pH值调整在2～8范围内的缓冲剂。本发明还公开了采用上述试剂对白细胞进行分类的方法。利用本发明的试剂及方法可快速溶解红细胞，实现在同一个通道中将白细胞进行五分类，反应可以在10～40℃的温度条件下进行并且只需检测两个角度的散射光信号即可对白细胞进行五分类检测。

Description

一种对白细胞进行分类的试剂和方法
技术领域
本发明涉及一种细胞分类试剂及对细胞进行分类的方法，特别是涉及一种用于对血液中白细胞进行分类的试剂以及利用该试剂对血液中白细胞进行分类检测的方法。
背景技术
用患者的全血对白细胞进行分类计数，为临床诊断和治疗提供依据，具有十分重要的意义。
迄今为止，有关对白细胞进行分类的装置和方法发表了许多。这些装置是将血液用溶血剂或染色剂处理，基于处理后的细胞的物理学、电学或光学特性来对白细胞进行分类计数。
例如，有的分类方法采用染色剂对白细胞进行染色，检测染色后白细胞发出的荧光来对白细胞进行分类；有的分类方法采用溶血剂对白细胞进行特殊处理，检测其电信号或光散射信号，从而对白细胞进行分类。
现有技术一公开了使用白细胞四分类测定用试剂和嗜碱细胞测定用试剂，将白细胞五分类的方法。白细胞四分类测定用试剂包括至少一种离子表面活性剂、至少一种带负电的有机化合物、一种非离子表面活性剂和缓冲剂，其与第一份血样作用，将血细胞分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞和嗜碱细胞加中性粒细胞四个类群；嗜碱细胞测定用试剂，与第二份血样作用，将血细胞分成嗜碱细胞和其他细胞类群。综合两种结果将白细胞五分类。检测方法为两角度激光散射法。
现有技术二提出了通过两角度光散射使用白细胞四分类试剂和嗜碱细胞测定试剂将白细胞五分类和计数的方法，四分类试剂包括至少一种离子表面活性剂用以溶解红细胞和损伤白细胞膜，至少一种带负电的有机化合物用以与白细胞中带正电荷的物质结合使白细胞形态发生变化，一种非离子表面活性剂和用以调pH的缓冲液。嗜碱细胞测定试剂包括至少一种聚合度3-10的聚氧乙烯类非离子表面活性剂，至少一种阳离子表面活性剂，一种缓冲液调pH至2.5-4.0。在第一份血样中加入第一试剂将白细胞分成四个群：淋巴细胞群、单核细胞群、嗜酸细胞群、中性粒和嗜碱细胞群；在第二份血样中加入第二试剂，根据细胞的形态和大小，用来区分白细胞中的嗜碱细胞，从而获得白细胞五分类结果。
现有技术三是关于对白细胞四分类的试剂，这种试剂包括至少一种离子表面活性剂，可以是阳离子或两性表面活性剂中一种，用来溶解红细胞同时部分损伤白细胞膜；至少含一种带阴离子的有机化合物，通过与白细胞上带正电荷的组分结合使各类白细胞形态差异显现；一种非离子表面活性剂和用来调整pH值的缓冲剂。检测方法可为两角度激光散射法。
现有技术四提出使用含至少一种阴离子或两性表面活性剂短时间内溶解红细胞，同时维持白细胞在一定时间内保持或接近原始状态，通过收集前角光散射和侧向光散射信号对白细胞进行四分类。
现有技术五提出了一种从全血样本中快速分离、分析白细胞的方法和试剂系统。该溶血剂系统由第一试剂选自甲酸、乙酸及两者的混合物和第二试剂抑制剂组成。试剂使红细胞溶解并使白细胞发生微小改变以使可通过仪器对细胞进行五分类。其优点和独特性在于其惊人的溶血速度并能对白细胞进行进一步修饰。溶血后加入抑制剂，防止进一步的溶血及白细胞明显的变化。血样经过处理后能保持细胞的免疫化学特性。检测方法可为两角度光散射法，或直流阻抗和射频阻抗法，或直流阻抗和光散射法。
现有技术六公开了一种对白细胞进行五分类的溶血剂和方法。溶血剂包括芳香族氧乙醇、pK值接近8.5的有机缓冲剂、非离子去垢剂。首先，血样与稀释液混合，加入所述溶血剂溶解红细胞，在至少30秒内不影响白细胞的光散射特性，通过收集四个角度光散射信号，从而对白细胞进行五分类。
现有技术七是通过一种pH 2.6-4的酸性溶解剂对红细胞快速溶解和白细胞保持完整后加入抑制剂可以对白细胞进行五分类的方法，其检测系统可以使用光散射也可以使用射频/直流阻抗法。
但是，以上现有技术中还存在许多不足。
比如，现有技术三、四都是通过两角度光散射法将白细胞进行分成淋巴细胞，单核细胞，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞四个类群，但不能将嗜碱性粒细胞分离出来。
现有技术一、二中公开的分类方法都是通过两种试剂分别与两份血样作用，在两个通道进行分类，综合对白细胞进行五分类；现有技术六可以在一个通道中对白细胞进行五分类，但要检测四个角度的散射光信号，仪器的构成变得复杂，仪器的成本较高。
现有技术五、七提到的分类技术，可在一个通道中对白细胞进行五分类，却只能在常温下反应，但随着气温的变化环境温度是有差异的，很难保证处于25度恒温状态，测量结果随着温度变化会产生波动，降低了结果的准确性。假如在此方法基础上消除温度对反应的影响，需要增加恒温装置，不仅需要加热装置，同时需要配备制冷装置，大大提高了仪器成本。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够在较宽温度范围内、在一个通道中准确地将白细胞进行五分类的试剂系统和方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种对白细胞进行分类的试剂，所述试剂包括：
a、可以溶解红细胞，且使白细胞的细胞膜部分损伤的至少两种阳离子表面活性剂；
b、可与白细胞内阳离子结合，使白细胞之间产生形态差异的至少一种带疏水基团及阴离子基团的有机化合物；
c、能够将pH值调整在2～8范围内的缓冲剂。
所述对白细胞进行分类是指将白细胞分为与淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞分别对应的五个集团。
优选的，所述阳离子表面活性剂为季铵盐型阳离子表面活性剂。
在本发明具体实施方式中，所述阳离子表面活性剂进一步优选为具有下式所示结构的季铵盐型阳离子表面活性剂，
其中，R1为C原子数6～16的烷基或链烯基，
R2及R3为C原子数1～4的烷基或链烯基，
R4为C原子数1～4的烷基或链烯基或苄基，
X为卤素原子。
所述有机化合物的疏水基团优选自芳香族组成的基团、C原子数6以上的烃基形成的基团或者C原子数大于6的杂环，所述有机化合物的阴离子基团优选为羧基或磺酸基。
在本发明优选的实施方式中，所述有机化合物为酸性色素。
所述试剂可以进一步包括醇类，并且所述醇类占所述试剂的体积百分比浓度为0.1～10％。
所述醇类优选为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或2-苯氧乙醇。
本发明还公开了一种对白细胞进行分类的方法，所述方法包括将上述的白细胞分类试剂与血样混合后测定细胞的大小和形态信息。
具体地，所述方法包括在10～40℃的温度条件下，将所述白细胞分类试剂与血样按10～100∶1的比例混合12～30s后，通过低角度和高角度两种散射光分别测定细胞的大小和形态信息，所述低角度散射光的测定角度为1～5度，高角度散射光的测定角度为6～20度。
由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
利用本发明的试剂及方法进行白细胞分类检测，可以在快速将红细胞溶解的同时，实现在同一个通道中将白细胞进行五分类，分为与淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞分别对应的五个集团；并且，利用本发明的试剂及方法对白细胞进行分类检测时，不仅可以在常温下进行，也可以在10～40℃的温度条件下进行，一方面扩展了温度适用范围，另一方面在高于室温的条件下反应有利于消除环境温度对反应的影响，增加结果的可靠性和稳定性，还可以避免使用制冷装置，仪器成本较低；此外，利用本发明的试剂和方法可以实现只需检测两个角度的散射光信号即可对白细胞进行五分类，从而降低了仪器成本。
附图说明
图1、2、3是利用本发明的一种白细胞分类试剂分别对三份血样进行白细胞五分类的结果图；
图4是利用本发明的另一种白细胞分类试剂对白细胞进行五分类的结果图；
图5是利用本发明的又一种白细胞分类试剂对白细胞进行五分类的结果图；
图中0表示碎片，1表示淋巴细胞，2表示单核细胞，3表示中性粒细胞，4表示嗜酸性粒细胞，5表示嗜碱性粒细胞。
具体实施方式
本发明的白细胞分类试剂，主要包括：
a、可以溶解红细胞，且使白细胞的细胞膜部分损伤的至少两种阳离子表面活性剂；
b、可与白细胞内阳离子结合，使白细胞之间产生形态差异的足量的至少一种带疏水基团及阴离子基团的有机化合物；
c、能够将pH值调整在2～8范围内的缓冲剂。
将上述组成的白细胞五分类用试剂加入到全血样本中，通过测定细胞大小和形态信息，能够将白细胞中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞相对应五个集团进行分类计数。
所述的阳离子表面活性剂为季铵盐型阳离子表面活性剂，其结构式如下所示：
Figure S2007101254630D00051
其中R1为C原子数6～16的烷基或链烯基；R2及R3为原子数1～4的烷基或链烯基；R4为C原子数为1～4的烷基或链烯基或苄基；X为卤素原子。
所述阳离子表面活性剂，其用量应足以溶解红细胞，并造成白细胞的细胞膜部分损失。具体用量为100～10000mg/L，优选200～6000mg/L，最优选500～5000mg/L，也可以根据使用的表面活性剂的种类作适当调整。下表1中举例列出了可用于本发明的各表面活性剂及其最适用量。同时，这些表面活性剂可以只使用两种或两种以上任意组合使用。
表1表面活性剂的最适用量
表面活性剂名称     最适用量
辛基三甲基氯化铵(OTAC，PTI)     500-5000mg/L
辛基三甲基溴化铵(OTAB，PTI)     500-4500mg/L
癸基三甲基氯化铵(DTAC，PTI)     200-4000mg/L
癸基三甲基溴化铵(DTAB，PTI)     200-3000mg/L
十二烷基三甲基氯化铵(LTAC，PTI)     100-2000mg/L
十二烷基二甲基苄基氯化铵(DDBAC，PTI)     100-2000mg/L
十二烷基三甲基溴化铵(LTAB，PTI)     100-2000mg/L
十二烷基二甲基乙基溴化铵(EDDAB，PTI)     100-2000mg/L
十二烷基三乙基溴化铵(DTEAB，PTI)     100-2000mg/L
十四烷基三甲基氯化铵(MTAC，PTI)     50-1000mg/L
十四烷基三甲基溴化铵(MTAB，PTI)     50-1000mg/L
十六烷基三甲基氯化铵(CTAC，PTI)     50-500mg/L
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，PTI)     50-500mg/L
无论使用哪种表面活性剂组合，其对白细胞的溶解力，只要能使白细胞膜开孔到胞质可以部分溢出，与阳离子结合的有机化合物能够进入的程度即可，最好使用远远少于使细胞完全裸核时的用量。表面活性剂的溶血效果和R1的链长是成正比的，C原子数越多，溶血能力越强。
本发明中，除表面活性剂外，还有一种化合物可以和细胞内阳离子结合导致细胞类群间形态差异显现。这种化合物，带有疏水基团(如由芳香族组成的基团、由C原子数6个以上的烃基形成的基团以及C原子数大于6的杂环等)及阴离子基团(如羧基、磺酸基等)，在水中带负电荷，能与白细胞结合使白细胞形态发生改变。几乎所有酸性色素如：酸性蓝系列、直接蓝、酸性绿、酸性黄、甲基红、甲基橙、苯胺蓝、茜素黄等都可以满足要求。使用量为10～1000mg/L，优选20～500mg/L。
本发明中，还含有调整pH用的缓冲剂。对于缓冲剂没有特定的要求，可以为常用缓冲体系如甲酸、邻苯二甲酸、乙酸、磷酸、TRIS、硼酸、碳酸等。本发明试剂中pH调整到2～8范围内。缓冲剂的使用量通常为5～100mM。
此外，本发明中还可以含有一定量的醇类作为助溶剂。醇类作为助溶剂对种类没有特别要求，甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、2-苯氧乙醇等均可用于本发明。作为助溶剂的醇类，其用量占本发明的试剂的体积百分比浓度通常为0.1～10％左右。
利用本发明的方法对白细胞进行分类的具体过程包括，将本发明的上述试剂加入全血中混合一定时间后，检测细胞的形态和大小信息，根据细胞形态与大小的不同将细胞分成与淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞相对应五个集团，检测系统同时对五类细胞进行分类计数。
血样与本发明试剂的混合比例没有特别的限制，但通常按照血样与本发明试剂的体积比为1∶10～100的比例混合。通常在两者混合12～30秒后就可以进行检测。
用本发明的试剂及方法进行白细胞分类时，在10～40℃温度范围内均可以进行。对每一个具体的反应，只要将反应温度固定在10～40℃范围的任一温度下，就都能够保证分类结果的稳定。本发明优选的温度为35℃。选用该温度的原因是由于该温度高于室温，因此在实际应用中只需加热装置就可以实现恒温，而不必增加制冷装置，大大节约了仪器成本。
使用本发明可以在一个通道中对白细胞进行五分类，检测细胞的形态和大小信息的方法优选使用激光检测法。该方法可以利用公知的装置，采用测定角度为1～5度的低角度散射光来测定细胞的大小信息，并采用测定角度为6～20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。该装置可以选用如中国专利95115317.X中所描述的装置，也可以选用本领域技术人员所公知的其他装置。而散射光的检测可以通过常用的光电二极管传感器完成。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
一种用于白细胞五分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
邻苯二甲酸          1g
2-苯氧乙醇          2.5g
癸基三甲基氯化铵    3.5g
辛基三甲基溴化铵    1.75g
甲苯胺蓝            0.025g
补水到              1L
pH                  4.6
按上述配方配制的试剂将pH调整到4.6。
在温度保持35度的条件下，在10μl血中加入1ml上述试剂。混合15秒后开始用激光检测法检测白细胞。采用测定角度为1～5度的低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为6～20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。用上述配制的试剂测试了三个血样，结果如图1、图2、图3所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞五个类群。
实施例2
一种用于白细胞五分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
磷酸二氢钠              0.6g
磷酸氢二钠              4.77g
甲醇                    8g
十二烷基三甲基氯化铵    0.5g
辛基三甲基溴化铵        3g
酸性蓝                  0.05g
补水到                  1L
pH                      7.5
按上述配方配制的试剂将pH调整到7.5。
在温度保持35度的条件下，在10μl血中加入1ml上述试剂。混合15秒后开始用激光检测法检测白细胞。采用测定角度为1～5度的低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为6～20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。结果如图4所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞五个类群。
实施例3
一种用于白细胞五分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
甲酸    1.5g
甘氨酸                    1g
异丙醇                    10g
十二烷基二甲基苄基氯化铵  0.2g
辛基三甲基氯化铵          3g
甲基红                    0.05g
补水到                    1L
pH                        2.8
按上述配方配制的试剂将pH调整到2.8。
在温度保持35度的条件下，在10μl血中加入1ml上述试剂。混合15秒后开始用激光检测法检测白细胞。采用测定角度为1～5度的低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为6～20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。结果如图5所示，白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞五个类群。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述试剂包括
a、可以溶解红细胞，且使白细胞的细胞膜部分损伤的两种阳离子表面活性剂；
b、可与白细胞内阳离子结合，使白细胞之间产生形态差异的至少一种带疏水基团及阴离子基团的有机化合物；
c、能够将pH值调整在2～8范围内的缓冲剂；
所述试剂将白细胞分为与淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞分别对应的五个集团。
2.根据权利要求1所述的一种对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述阳离子表面活性剂为季铵盐型阳离子表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的一种对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述阳离子表面活性剂为具有下式所示结构的季铵盐型阳离子表面活性剂，
Figure FDA00003591137700011
其中，R1为C原子数6～16的烷基或链烯基，
R2及R3为C原子数1～4的烷基或链烯基，
R4为C原子数1～4的烷基或链烯基或苄基，
X为卤素原子。
4.根据权利要求1所述的一种对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述有机化合物的疏水基团选自芳香族组成的基团、C原子数6以上的烃基形成的基团或者C原子数大于6的杂环，所述有机化合物的阴离子基团为羧基或磺酸基。
5.根据权利要求1所述的一种对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述有机化合物为酸性色素。
6.根据权利要求1所述的一种对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述试剂包括醇类，并且所述醇类占所述试剂的体积百分比浓度为0.1～10%。
7.根据权利要求6所述的一种对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述醇类为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或2-苯氧乙醇。
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