CN101602762A - 不对称菁类化合物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供式I所示的一类不对称菁类化合物,其中X、n、R1、R2、R3、R4和Y-如说明书中的定义。该类化合物最大吸收峰位置在640nm附近,且不随环境温度的变化而变化,与核酸结合后染料/核酸复合物荧光强度迅速增加,在流式细胞分析仪中作为核酸染色剂使用,光谱在近红外区可以有效降低背景荧光的干扰,提高检测的精度。同时,本发明提供的化合物可以作为血液中网织红细胞的染色剂使用。
Description
技术领域
本发明涉及不对称菁类化合物及其用于生物样品染色的用途。
背景技术
网织红细胞是骨髓中晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红细胞之间的过渡型细胞,网织红细胞从骨髓释放到外周血后,随着其不断成熟,细胞内的RNA含量也逐渐减少,直至完全消失。因此,细胞内RNA的含量表示了网织红细胞的成熟程度。网织红细胞是血液学诊断中评估红细胞生成能力的基础性试验,是贫血诊断、分型和疗效检测的基础,能够确认骨髓的化疗和移植疗效,检测EPO(促红细胞生成素)的疗效等。
早期检测网织红细胞主要是采用手工法镜检,但存在调制试样步骤烦杂,人为影响因素较多,导致操作者间的变异达到25%~50%。随着流式细胞分析仪的发展,自动化的仪器提高了网织红细胞测定的准确度和精确度,同时提供了关于网织红细胞成熟度的可靠指标。荧光染料的开发是发展荧光分析技术的具有决定性作用的因素。
发展初期应用的染料包括新亚甲蓝(NMB)、亮甲苯蓝(BCB)、派诺宁Y、溴乙锭等。它们通过嵌入或静电吸引与核酸分子形成复合物,从而可以在显微镜下观察增强后的荧光。但是这些染料自身也可以形成染料复合物,不能明显区别于染料与核酸形成的复合物,造成高的荧光背景干扰。同时,这些染料的荧光量子效率较低,降低了荧光增强的程度,影响检测结果的准确性。
吖啶橙也应用在荧光分析中,可以和核酸形成复合物,使荧光增强。这类染料分子相互之间在能量传递的过程中可能会导致光淬灭,使得染料核酸复合物没有荧光发出,影响检测结果真实性。同时在流式细胞分析仪中,吖啶橙和塑料管路有较强的作用,会增加背景荧光强度。为了清除测试后残留的染料和保证测试结果的准确性,需要仪器进行长时间的管路清洗,这就降低了仪器的分析效率。
已有人提出了一类噻唑蓝染料用于检测核酸和血液中的网织红细胞。该类染料使用的激发波长在488nm,需要使用价格高昂的激光器做光源,增加了仪器的使用成本。同时,这类染料需要较长的孵育时间,才能和核酸较好的结合。
还公开了一种用于血液中网织红细胞染色的染料,它需要在35℃以上的反应条件下才能得到良好的检测结果,对仪器的使用条件提出了较高的要求。
目前使用的红色半导体激光器只有在环境温度10℃左右可以发出633nm波长的光,在工作过程中由于环境温度的逐渐升高其波长会随之变化。在仪器稳定运行过程中,环境温度会达到40℃,此时激光器的波长也会相应增加到640nm左右,而不能和荧光染料的最大吸收峰很好的匹配,降低了检测结果的准确性。在此基础上,如果为了消除温度对检测结果的影响,需要增加恒温装置,则大大增加了仪器的成本。
因此,需要开发新的适合用作荧光染料的化合物,该化合物优选具有以下性质:无核酸时自身几乎没有荧光,与核酸形成复合物后荧光强度迅速增加并且光谱在近红外区,避免背景荧光的干扰;可以在640nm附近被激发且其波长在40℃可以保持稳定,与使用的半导体激光器工作波长相匹配;对RNA有一定的特异性结合。
发明内容
本发明的上述种种目的通过提供本发明化合物而得以实现。因此,本发明一方面提供了一类具有以下通式I结构的化合物:
其中
n为1、2或3;
X为C(CH3)2、O、S或Se;
R1和R2各自独立选自H、卤素、C1-8烷基磺酸基,且R1和R2不同时为H;
R3、R4各自独立选自C1-18烷基、C1-8烷基OR5;且R2为卤素时R3和R4不同时为烷基;
R5为氢原子、酰基或者低级烷基;
Y-为负离子。
本发明还一方面提供一种缀合物,所述缀合物包含上述式I化合物。
本发明另一个方面还提供用于生物样品染色的组合物,所述组合物包含上述式I化合物或其缀合物。
本发明再一方面还提供了本发明式I化合物或其缀合物在对生物样品进行染色中的用途。
本发明还一方面提供一种分析网织红细胞的方法,所述方法包括将血液样品用本发明化合物、其缀合物或其组合物染色,随后在流式细胞分析仪上进行分析,测试网织红细胞。
本发明再一方面提供一种分析网织红细胞的试剂盒,所述试剂盒包括本发明化合物、其缀合物或其组合物。
本发明的化合物对生物样品如核酸、有核红细胞、网织红细胞等具有良好的染色作用,其形成的复合物发射波长在近红外区,避免了生物自身的荧光背景干扰,有助于提高检测结果的精确度,同时可在流式细胞分析仪上用作各种生物样品的染色剂。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
附图说明
图1是Dye-1在不同环境温度下放置48小时后的吸收光谱。
图2是Dye-1与含不同浓度鲑鱼精DNA结合后在磷酸盐缓冲液(PBS)中的荧光发射光谱。
图3是Dye-1在PBS中与鲑鱼精DNA结合前后的荧光发射光谱。
图4是Dye-1与含不同浓度甲鱼肝RNA结合后在磷酸盐缓冲液(PBS)中的荧光发射光谱。
图5是Dye-1在PBS中与甲鱼肝RNA结合前后的荧光发射光谱。
图6是Dye-3与含不同浓度鲑鱼精DNA结合后在磷酸盐缓冲液(PBS)中的荧光发射光谱。
图7是Dye-3与含不同浓度甲鱼肝RNA结合后在磷酸盐缓冲液(PBS)中的荧光发射光谱。
图8是Dye-3在PBS中与鲑鱼精DNA结合前后的荧光发射光谱。
图9是Dye-3在PBS中与甲鱼肝RNA结合前后的荧光发射光谱。
图10是用Dye-1荧光染料作为网织红细胞测定试剂,测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。
图11是用Dye-2荧光染料作为网织红细胞测定试剂,测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。
图12是用Dye-3荧光染料作为网织红细胞测定试剂,测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。
图13是用Dye-6荧光染料作为网织红细胞测定试剂,测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。
具体实施方式
定义
除另有说明外,本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”,无论是单独使用还是与其他基团结合使用,指包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子的直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“正丙基”,则只特指直链烷基,如提及单个支链烷基如“异丙基”,则只特指支链烷基。例如,“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本发明所用术语“低级烷基”具有本领域所使用的常规含义,通常指C1-6烷基。
本文中使用的术语“酰基”是指与基团-CO-结合的上述定义的“烷基”,其中所述“烷基”包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子,例如甲酰基、乙酰基、丙酰基等。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本文中使用的术语“生物样品”包括但不限于核酸、血液中的有核红细胞、网织红细胞等。
本发明的化合物
本发明提供了一种具有以下通式I结构的化合物:
其中
n为1、2或3;
X为C(CH3)2、O、S或Se;
R1和R2各自独立选自H、卤素、C1-18烷基磺酸基,且R1和R2不同时为H;
R3、R4各自独立选自C1-8烷基、C1-18烷基OR5;且R2为卤素时R3和R4不同时为烷基;
R5为氢原子、酰基或者低级烷基;
Y-为负离子。
优选R1和R2各自独立选自H、卤素、C1-6烷基磺酸基,且R1和R2不同时为H。
优选R3为C1-6烷基、C1-6烷基OR5。
优选R4为C1-6烷基、C1-6烷基OR5。
优选R5为H、C1-3烷基CO或C1-6烷基。
优选X为C(CH3)2、O或S。
优选n为1或2。
优选Y为卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子。
本发明优选的化合物为:
或
本发明化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的染色。或者,在一个实施方案中,本发明化合物可作为式I化合物的衍生物的形式使用,所述衍生物包括但不限于缀合物。
典型地,缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明化合物通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明化合物缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子,包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常,测试样品与荧光缀合物温育一段时间,使得该荧光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合,该荧光缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次,或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后,样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析,其中激发光源激发缀合物中的本发明荧光染料,而测定装置测定由激发的荧光染料产生的发射光。
或者,在另一个实施方案中,该荧光缀合物还可用于固相免疫测试,例如夹心型免疫测试。固相免疫测试的技术是本领域公知的,可由标准教科书获得。本发明的荧光缀合物可用作固相免疫测试中的各种合适成分。
本发明的化合物的制备方法
本发明化合物可通过本领域熟知的通用方法合成得到,参见例如同属于本申请人的同时待审的中国专利申请CN200710137258.6。所述专利申请通过引用结合到本文中来。具体地讲,本发明的不对称菁类化合物一般通过以下流程合成:首先由未取代或取代的2-甲基苯并噻唑、2-甲基苯并噁唑或2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉等原料开始,使其与式R3X(X为F、Cl、Br或I)的卤化物反应,两者的摩尔比为1∶1-2,在甲苯中回流12-36小时,可制得季铵盐中间体II:
其中X、R1、R3和Y-如式I化合物中所述定义;
然后,将制得的季铵盐中间体II与连接分子缩合,可得到式III化合物:
其中X、n、R1、R3和Y-如式I化合物中所述定义,连接分子可为N,N’-二苯基甲脒或其高级同系物;
通过与制备式II化合物类似的方法得到取代或未取代的4-甲基喹啉季铵盐中间体,最后将其与式III化合物在吡啶或醋酐的作用下回流,即可得到包含本发明的不对称菁类化合物的组分。所得组分可通过本领域公知的分离和纯化技术回收,以达到需要的纯度。
本发明中使用的各种原料均可市售获得,或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。
包含式I化合物的本发明荧光缀合物可通过任何本领域已知的常规方法合成。
本发明的组合物
本发明还提供包含上述式I化合物或其缀合物的组合物,所述组合物用于生物样品的染色。
本发明的组合物除包含式I化合物或其缀合物外,还可包含生物样品染色所需要的其它组分,例如溶剂、渗透压调节剂、pH调节剂、表面活性剂等。本发明的组合物可作为水溶液形式存在,或者可作为临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
本发明化合物或组合物的应用
本发明还提供使用上述式I化合物或包含式I化合物的组合物以染色生物样品的方法,该方法包括使上述式I化合物或其缀合物或包含式I化合物的组合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
本发明还提供一种分析网织红细胞的方法,所述方法包括将血液样品用本发明化合物、其缀合物或其组合物染色,随后在流式细胞分析仪上进行分析,测试网织红细胞。
本发明还提供一种分析网织红细胞的试剂盒,所述试剂盒包括本发明化合物、其缀合物或其组合物。
特点
由以上描述以及本领域技术人员公知的常识,可了解本发明荧光染料的各种优点,包括但不限于以下:
(1)本发明提供的化合物最大激发波长在640nm左右,且不随着温度变化而变化,与使用的红色半导体激光器的波长相匹配;
(2)本发明染料/核酸复合物发射波长在600nm-900nm的近红外区,避免了生物自身的荧光背景干扰,有助于提高检测结果的精确度。
(3)本发明提供的化合物对RNA有一定的特异性染色;
(4)本发明提供的化合物可在流式细胞分析仪上用做血液中网织红细胞染色剂。
实施例
以下通过具体实施例对本发明作出详细说明,但本领域技术人员会理解,本发明不限于此。
实施例1
4-甲基-7-氯喹啉的合成
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器、温度计和恒压滴液漏斗的500mL三口烧瓶中加入32.8g(0.2mol)3-氯苯胺盐酸盐,81g六水合三氯化铁(0.3mol),3.0g重新干燥的无水氯化锌和150mL95%乙醇,搅拌并加热到60℃。由恒压滴液漏斗缓慢加入12.6g(0.18mol)甲基乙烯基甲酮,温度保持在60~70℃,加完后升温至体系回流,保持回流状态2h。冷却后向其中加入25%氢氧化钠水溶液至碱性,减压蒸馏出溶剂至干,将固体取出反复用无水乙醚提取。合并提取液用无水碳酸钾干燥,过滤,除去溶剂后以己烷/乙酸乙酯(3∶1)作流动相过硅胶柱层析进行纯化,得到产品11.38g。
实施例2
4-甲基-7-溴喹啉的合成
采用与4-甲基-7-氯喹啉的类似合成方法,以3-溴苯胺为原料得到题述化合物。
实施例3
Dye-1的合成
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中,将10mmol 5-氯-3-(2-羟乙基)-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmol N,N’-二苯基甲脒于65℃油浴上加热搅拌6小时。反应结束后减压蒸除溶剂,然后加入一定量的乙醚搅拌析出橙红色固体粉末,过滤,干燥。将粗产物用乙酸乙酯-己烷重结晶,得到橘红色固体产物,收率41%。取4.0mmol该反应产物,向其中加入1-(2-羟乙基)-4-甲基喹啉溴季铵盐4.2mmol及吡啶10ml,90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中,析出暗紫红色固体物,过滤,干燥。染料通过硅胶柱分离,用洗脱液二氯甲烷∶甲醇=100∶0→100∶15梯度洗脱,收集蓝色组分,旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时,得到标题化合物,收率49%。
最大吸收峰:638nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C23H22BrClN2O2S m/z:425.9[M-Br]+。
实施例4
Dye-2的合成
在60ml醋酸酐中,将10mmol 3-(2-羟乙基)-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmol N,N’-二苯基甲脒于90℃油浴上加热搅拌4小时。冷却至室温后将反应得到的红色油状物用1.5L石油醚悬浊洗涤3次,彻底除去醋酸酐。然后加入一定量的乙醚析出橙色固体粉末,过滤,干燥。将粗产物用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷;甲醇=100∶5),得到橘红色固体产物,收率58%。取4.0mmol该反应产物,向其中加入7-氯-1-乙基-4-甲基喹啉溴季铵盐4.2mmol及醋酸酐10ml,90℃油浴上加热搅拌1.5小时。将反应液倒入乙醚中,析出暗紫色小颗粒,过滤,干燥。染料通过硅胶柱分离,用洗脱液二氯甲烷∶甲醇=100∶0→100∶9梯度洗脱,收集蓝色组分,旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时,得到标题化合物,收率53%。
最大吸收峰:639nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C25H24BrClN2O2S m/z:451.9[M-Br]+。
实施例5
Dye-3的制备
在50mL醋酸溶液中,将10mmol 5-氯-3-乙基-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmol N,N’-二苯基甲脒于65℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应得到的红色油状物用1.5L石油醚悬浊洗涤3次,彻底除去醋酸,然后加入一定量的乙醚搅拌析出橙色固体粉末,过滤,干燥。将粗产物用乙酸乙酯-己烷重结晶,得到橘红色固体产物,收率47%。取4.0mmol该反应产物,向其中加入1-(2-羟乙基)-4-甲基喹啉溴季铵盐4.2mmol及吡啶10ml,90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中,析出紫红色固体物,过滤,干燥。染料通过硅胶柱分离,用洗脱液二氯甲烷∶甲醇=100∶0→100∶10,收集蓝色组分,旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时,得到标题化合物,收率40%。
吸收峰:640nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C23H22BrClN2OS m/z:409.9[M-Br]+。
实施例6
Dye-4的制备
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中,将10mmol 3-(2-羟乙基)-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmol N,N’-二苯基甲脒于65℃油浴上加热搅拌6小时。反应结束后减压蒸除溶剂,然后加入一定量的乙醚搅拌析出橙色固体粉末,过滤,干燥。将粗产物用乙酸乙酯-己烷重结晶,得到橘红色固体产物,收率44%。取4.0mmol该反应产物,向其中加入7-氯-1-乙基-4-甲基喹啉溴季铵盐4.2mmol及吡啶10ml,90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中,析出暗紫红色固体物,过滤,干燥。染料通过硅胶柱分离,用洗脱液二氯甲烷∶甲醇=100∶0→100∶8梯度洗脱,收集蓝色组分,旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时,得到标题化合物,收率58%。
吸收峰:639nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C23H22BrClN2OS m/z:409.9[M-Br]+。
实施例7
Dye-5的制备
在50mL醋酸溶液中,将10mmol 5-溴-3-乙基-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmol N,N’-二苯基甲脒于65℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应得到的红色油状物用1.5L石油醚悬浊洗涤3次,彻底除去醋酸,然后加入一定量的乙醚搅拌析出橙色固体粉末,过滤,干燥。将粗产物用乙酸乙酯-己烷重结晶,得到橘红色固体产物,收率50%。取4.0mmol该反应产物,向其中加入1-(2-羟乙基)-4-甲基喹啉溴季铵盐4.2mmol及吡啶10ml,90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中,析出紫红色固体物,过滤,干燥。染料通过硅胶柱分离,用洗脱液二氯甲烷∶甲醇=100∶0→100∶15,收集蓝色组分,旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时,得到标题化合物,收率46%。
吸收峰:640nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C23H22Br2N2OS m/z:454.4[M-Br]+。
实施例8
Dye-6的制备
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中,将10mmol 3-(2-羟乙基)-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmol N,N’-二苯基甲脒于65℃油浴上加热搅拌6小时。反应结束后减压蒸除溶剂,然后加入一定量的乙醚搅拌析出橙红色固体粉末,过滤,干燥。将粗产物用乙酸乙酯-己烷重结晶,得到橘红色固体产物,收率41%。取4.0mmol该反应产物,向其中加入7-溴-1-(2-羟乙基)-4-甲基喹啉溴季铵盐4.2mmol及吡啶10ml,90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中,析出暗紫红色固体物,过滤,干燥。染料通过硅胶柱分离纯化,用洗脱液二氯甲烷∶甲醇=100∶0→100∶20梯度洗脱,收集蓝色组分,旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时,得到标题化合物,收率49%。
吸收峰:638nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C30H22Br2N2O2S m/z:470.4[M-Br]+。
实施例9
荧光染料吸收峰测定
精确称取一定量的荧光染料充分溶解在2.5mL甲醇/乙二醇(体积比例50∶50)中,配制成浓度为5mM的染料溶液,取5μL该荧光染料溶液稀释在2mL甲醇/乙二醇溶液中,遮光密闭条件下分别放置在0℃、20℃和40℃和60℃环境中48小时,然后在紫外-可见光分光光度计上测定其最大吸收峰位置。Dye-3染料在不同温度下放置后的吸收峰如附图1所示。从图中可以得知,其最大吸收峰位置不随温度的变化而发生漂移,从而可以很好的与激光器的激发波长相匹配。
表1给出dye-1~dye-6在不同温度下放置48小时后的最大吸收峰变化。
表1
对比表中的数据得知,本发明中的荧光染料在不同的温度下放置48小时后最大吸收峰不发生变化。
实施例10
Dye-1在含不同浓度DNA的磷酸盐缓冲液(PBS)中荧光强度的测定:
精确称取一定量的Dye-1充分溶解在2.5mL甲醇/乙二醇(体积比例50∶50)中,配制成浓度为5mM的染料溶液,过滤后使用。分别称取一定量的鲑鱼精DNA,溶解在PBS缓冲液中,得到3mg/mL、1mg/mL、0.3mg/mL、0.1mg/mL的DNA PBS缓冲液。准确量取2μL已经配制好的5mM染料,称取不同浓度的DNA PBS缓冲液1μL分别加入到1mL PBS缓冲液中进行结合,反应一定时间后,选定激发波长测定该复合物的发射光谱。测试温度为室温;所用仪器为荧光分光光度计,型号:FL-4500。结果如附图2所示。从图中可以看出,随着DNA浓度的增加,染料/DNA复合物的荧光发射强度迅速增加。
附图3为Dye-1在PBS中与DNA结合前后的荧光增强幅度对比。从图中可以看出,Dye-1的PBS溶液几乎没有荧光产生,和DNA形成复合物后荧光强度迅速增强,最大激发峰在660nm左右,有较大的斯托克位移,有利于消除背景荧光的干扰,提高检测信号的精确度。
实施例11
Dye-1在含不同浓度RNA的PBS中荧光强度的测定:
精确称取一定量的Dye-1充分溶解在2.5mL甲醇/乙二醇(体积比例50∶50)中,配制成浓度为5mM的染料溶液,过滤后使用。分别称取一定量的新鲜提取的甲鱼肝RNA,溶解在PBS缓冲液中,得到100μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、3μg/mL的RNA PBS缓冲液。准确量取2μL已经配制好的5mM染料,称取不同浓度的RNA PBS缓冲液1μL分别加入到1mL PBS缓冲液中进行结合,反应一定时间后,选定激发波长测定该复合物的发射光谱。测试温度为室温;所用仪器为荧光分光光度计,型号:FL-4500。结果如附图4所示。从图中可以看出,染料/RNA复合物的荧光发射强度随着RNA浓度的增加而迅速增强。
图5为Dye-1在PBS中与RNA结合前后的荧光强度增加对比。从图中也可以看出,Dye-1和RNA形成复合物后荧光强度迅速增强,并且产生了一定程度的红移,最大激发峰在660nm左右,处于近红外区,在仪器检测中可避免生物自身的荧光背景干扰,因此可以提高检测的精确度。
实施例12
Dye-3在含不同浓度DNA/RNA的PBS中荧光强度的测定:
测定方法与实施例10和11同。Dye-3与不同浓度DNA/RNA形成复合物的荧光光谱为附图6和7。Dye-3与DNA/RNA在PBS中结合前后的荧光对比分别如附图8和9所示。从图中可以看出,荧光染料自身几乎不产生荧光,而随着核酸的加入,荧光强度迅速增加,最大激发峰都超过了655nm,处于近红外区。
表2比较了Dye-1和Dye-3与鲑鱼精DNA在PBS中结合前后的荧光增强比例。
表2
表3比较了Dye-1和Dye-3与甲鱼肝RNA在PBS中结合前后的荧光增强比例。
表3
实施例13
Dye-1荧光染料作为网织红测试试剂
在2mL含Dye-1的网织红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液,调制成测试样品,吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司),测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别红细胞和网织红细胞并分类计数,算出它们的细胞比率。图10显示了网织红细胞荧光与总红细胞荧光的对比,其中网织红细胞在总红细胞中所占的比例为0.26%。按照国际血液学标准委员会(ICSH)推荐的网织红细胞活体染色显微镜计数法对同一抗凝血液样本进行检测,结果显示网织红细胞在总红细胞中占的比例为0.25%。
实施例14
Dye-2荧光染料作为网织红测试试剂
在2mL含Dye-2的网织红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液,调制成测试样品,吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司),测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别红细胞和网织红细胞并分类计数,算出它们的细胞比率。图11显示了网织红细胞荧光与总红细胞荧光的对比,其中网织红细胞在总红细胞中所占的比例为1.91%。按照国际血液学标准委员会(ICSH)推荐的网织红细胞活体染色显微镜计数法对同一抗凝血液样本进行检测,结果显示网织红细胞在总红细胞中占的比例为1.89%。
实施例15
Dye-3荧光染料作为网织红测试试剂
在2mL含Dye-3的网织红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液,调制成测试样品,吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司),测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别红细胞和网织红细胞并分类计数,算出它们的细胞比率。图12显示了网织红细胞荧光与总红细胞荧光的对比,其中网织红细胞在总红细胞中所占的比例为3.0%。按照国际血液学标准委员会(ICSH)推荐的网织红细胞活体染色显微镜计数法对同一抗凝血液样本进行检测,结果显示网织红细胞在总红细胞中占的比例为3.05%。
实施例16
Dye-6荧光染料作为网织红测试试剂
在2mL含Dye-6的网织红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液,调制成测试样品,吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司),测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别红细胞和网织红细胞并分类计数,算出它们的细胞比率。图13显示了网织红细胞荧光与总红细胞荧光的对比,其中网织红细胞在总红细胞中所占的比例为2.83%。按照国际血液学标准委员会(ICSH)推荐的网织红细胞活体染色显微镜计数法对同一抗凝血液样本进行检测,结果显示网织红细胞在总红细胞中占的比例为2.88%。
已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明,但本领域技术人员会理解,在不偏离本发明宗旨和范围的情况下,可对本发明作出各种修改、变更和替换。
Claims (15)
2.权利要求1的化合物,R1和R2各自独立选自H、卤素、C1-6烷基磺酸基,且R1和R2不同时为H。
3.权利要求1-2中任一项的化合物,其中R3为C1-6烷基、C1-6烷基OR5。
4.权利要求1-3中任一项的化合物,其中R4为C1-6烷基、C1-6烷基OR5。
5.权利要求1-4中任一项的化合物,其中R5为H、C1-3烷基CO或C1-6烷基。
6.权利要求1-5中任一项的化合物,其中X为C(CH3)2、O或S。
7.权利要求1-6中任一项的化合物,其中n为1或2。
8.权利要求1-7中任一项的化合物,其中Y-为卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子。
10.一种缀合物,所述缀合物包含权利要求1-9中任一项的化合物。
11.一种用于生物样品染色的组合物,其中所述组合物包含权利要求1-9中任一项的化合物或权利要求10的缀合物。
12.权利要求11的组合物,其中所述生物样品选自核酸、血液中的有核红细胞和网织红细胞。
13.权利要求1-9中任一项的化合物、权利要求10的缀合物或权利要求11的组合物在对生物样品进行染色中的用途。
14.权利要求13的用途,其中所述生物样品选自核酸、血液中的有核红细胞和网织红细胞。
15.一种分析网织红细胞的方法,该方法包括:
1)将待测血液样品用权利要求1-9中任一项的化合物、权利要求10的缀合物或权利要求11的组合物染色;
2)在流式细胞分析仪上分析染色后血液样品中的网织红细胞。
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