CN101802175A - 人椎间盘组织 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分离的椎间盘干细胞群、组合物以及获得并使其生长的方法。此外，本发明提供了分离的discosphere、组合物以及获得并使其生长的方法。本发明提供含有本发明细胞的人工椎间盘以及生产其的方法。本发明也提供了利用本发明的细胞和方法治疗患有椎间盘脱出的对象的方法。

Description

人椎间盘组织
发明领域
本发明提供了髓核干细胞以及获得且使其生长的方法。
发明背景
由于退行性椎间盘病症(degenerative disc disease)导致的背痛是发病(morbidity)、失能(disability)以及丧失生产力的主要原因。背痛是45岁以下人群活动受限的最常见因素，是医生出诊的第二位常见因素，是住院治疗的第五位因素，以及是实施手术的第三位最常见原因。因此，有15-45％的人每年发生一般性和虚弱型慢性背痛，70-85％的人在其一生中的一些时候发生慢性背痛。仅在美国，有关保健成本和社会工作小时数损失方面的财政影响每年就在200亿到500亿美元之间。
尽管对于继发于退行性椎间盘病症的下背痛患者在非手术和手术治疗方法中有持续改进，但是还没有作为“魔术弹”的治疗模式以消除或持续改善这种病症。然而，目前由于生物医学工程学和分子科学的融合获得了一些新的且令人兴奋的机会改进治疗模式。目前我们比以往任何时候都更接近于产生新的治疗模式和装置，用以治疗退行性椎间盘病症。近来生物科学中的进展及对临床脊柱疾病的作用的实例包括开发融合蛋白、全部椎间盘成形术(total disc arthroplasty)，以及更近期的髓核成形术(nucleusarthroplasty)。融合蛋白，如重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)，是遗传产生的蛋白质，其具有刺激新骨生长的能力，使得在手术重建的情况中脊椎更可靠及迅速地融合。
第一例全部椎间盘成形术由Fernstorm在二十世纪五十年代后期进行。尽管最初有短期症状缓解，但是由于继发植入体在脊椎内下沉而最终失败。尽管在欧洲自从二十世纪八十年代已经进行腰椎的全部椎间盘成形术，但是在美国直至2000年3月才开始使用SB Charite III(DePuy Spine，Raynham，MA).10，11导入。一些其他腰椎假体(prostheses)已经导入体内，包括Maverick(Medtronic Sofamor Danek，Memphis，TN)、ProDisc-L(SpineSolutions/Synthes，Paoli，PA)和FlexiCore(Stryker Spine，Allendale，NJ)。这些修补物在支撑面、与骨的固定、关节数目、材料、约束(constraint)以及旋转中心的活动性等方面的设计均有所不同。除了腰椎椎间盘成形术之外，近年来在美国已经开始颈椎椎间盘成形术实验。颈椎成形术的模型包括BryanCervical Disk(Medtronic Sofamor Danek)、Prestige ST(Medtronic SofamorDanek)、Porous Coated Motion artificial cervical disk(Cervitech，Rockaway，NJ)以及ProDisc-C(Spine Solutions/Synthes)。
针对椎骨退行性疾病的髓核成形术(Nucleus arthroplasty)或者髓核置换装置如
Figure GPA00001049780300021
Prosthetic Disc Nucleus与TDA相似，已经获得成功结果。
Figure GPA00001049780300022
装置由包在聚乙烯套中的水凝胶核心组成，其在正常负荷及无负荷期间缩短和膨胀，允许椎间盘间隙高度恢复，因此模拟健康人椎间盘。
尽管全部椎间盘成形术和椎间盘等离子射频消融髓核成形术(nucleoplasty)可以替代体内椎体间脊柱融合术，但是这种方法也具有并发症。主要的并发症包括相邻椎骨疾病、下沉以及facetjoint arthrosis。此外，近来的临床实验研究证实感染、椎体破裂、植入体位置不正、下沉、机械故障以及椎旁异位骨化等迹象。已经报道了更严重的并发症，包括植入体前脱位。此外，全部椎间盘成形术(TDA)的磨损颗粒问题及对于脊髓的潜在作用仍未知。因此，尽管全椎间盘成形术是椎间盘退行性疾病的治疗进展，但是最后的目标应是用新的生物椎间盘置换退行性椎间盘，其不具有与机械部件相关的并发症。
在美国每年进行一百万例以上的脊柱手术。此外，估计脊柱手术市场的腰椎融合节段每年收益超过十亿美元。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了分离的椎间盘干细胞群。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离椎间盘干细胞的方法，包括将椎间盘干细胞铺板于无血清培养基中，产生包含髓核细胞的discosphere，从而分离椎间盘干细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含椎间盘干细胞的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的discosphere。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含discosphere的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含髓核细胞的人工椎间盘。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生人工椎间盘的方法，包括使discosphere在椎间盘支架中生长，从而产生脊柱椎间盘置换装置。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有椎间盘脱出症的对象的方法，包括给予所述对象包含髓核细胞的人工椎间盘，从而治疗患有椎间盘脱出症的对象。
附图简述
说明书在权利要求书部分具体指出了要求保护的本发明的主题。但就结构和操作方法及其目的、特征和优势而言，参照说明书的详细介绍以及附图可获得对本发明的最佳理解。
图1示出在体外将人椎间盘干细胞移植进具有骨终板(bony end plate)的抽空的兔髓核中之后，对于3个月椎间盘培养物的各个组织染色的显微镜下组织形态学评估。1组示出显微照片A、C和E(对照组)中兔椎间盘组织以及显微照片B、D和F中培养的椎间盘的苏木精-伊红染色的显微照片。放大率：1.25×(A和B)、10×(C和D)以及20×(E和F)。显微照片C和D示出髓核内与髓核外的过渡带。显微照片E和F示出髓核的内部区域与各个髓核细胞。2组示出显微照片G、I和K(对照组)中兔椎间盘组织以及显微照片H、J和L中培养的椎间盘的safranin染色的显微照片。放大率：1.25×(G和H)、10×(I和J)以及20×(K和L)。显微照片I和J证实髓核内与髓核外的过渡带。显微照片K和L示出髓核的内部区域与各个髓核细胞。3组示出显微照片M、O和Q(对照组)中兔椎间盘组织以及显微照片H、J和L中培养的椎间盘的Von Kossa染色的显微照片。放大率：1.25×(M和N)、10×(O和P)以及20×(Q和R)。显微照片O和P示出髓核内与髓核外的过渡带。显微照片Q和R示出髓核的内部区域与各个髓核细胞。
图2示出在体外将人椎间盘干细胞移植进具有骨终板的抽空的兔髓核中之后，对于3个月椎间盘培养物中II型胶原表达的显微镜下组织形态学评估。对照组(兔椎间盘组织)(A、C、E)和培养的椎间盘(制备的纤维环基质，其中已经通过化学方法除去髓核，且导入了人椎间盘干细胞制备物)(B、D、F)的II型胶原免疫染色显微照片。放大率：1.25倍(A和B)，10倍(C和D)以及20倍(E和F)。显微照片C和D证实髓核内与髓核外之间的过渡区。显微照片E和F证实髓核的内部区域和各个髓核细胞。
图3示出在体外将人椎间盘干细胞移植进具有骨终板的抽空的兔髓核中之后，对于3个月椎间盘培养物中I型胶原表达的显微镜下组织形态学评估。对照组(兔椎间盘组织)(A、C、E)和培养的椎间盘(制备的纤维环基质，其中已经通过化学方法除去髓核，且导入了人椎间盘干细胞制备物)(B、D、F)的I型胶原免疫染色显微照片。放大率：1.25倍(A和B)，10倍(C和D)以及20倍(E和F)。显微照片C和D证实髓核内与髓核外之间的过渡区。显微照片E和F证实髓核的内部区域和各个髓核细胞。
图4示出了在体外将人椎间盘干细胞植入具有骨终板的抽空的兔髓核中之后，在3个月的椎间盘培养物中Ki-67表达的显微镜下组织形态学评价。对照组(兔椎间盘组织)(A、C、E)和培养的椎间盘(制备的纤维环基质，其中已经通过化学方法除去髓核，且导入了人椎间盘干细胞制备物)(B、D、F)的Ki-67免疫染色显微照片。放大率：1.25倍(A和B)，10倍(C和D)以及20倍(E和F)。显微照片C和D证实髓核内与髓核外之间的过渡区。显微照片E和F证实髓核的内部区域和各个髓核细胞。
图5示出了具有骨终板的椎间盘培养系统的示意图。A：单细胞培养物在促进discosphere(椎间盘干细胞群)生长的培养基和条件下制备。然后制备discosphere并注射进从其椎间盘中除去所有细胞和髓核组织的健康兔的纤维环中。B：将具有骨终板的椎间盘纤维环置于具有培养基和生长因子的培养容器中。在3个月结束时，椎间盘干细胞用椎间盘样结构填充先前空的纤维环。
发明详述
在一个实施方案中，本发明提供了分离的椎间盘干细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了可以形成discosphere的椎间盘干细胞富集的细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了可以产生椎间盘祖细胞的椎间盘干细胞富集的细胞群。在另一个实施方案中，本发明的分离的椎间盘干细胞群包含人椎间盘干细胞群。在另一个实施方案中，本发明的分离的椎间盘干细胞群包含非人椎间盘干细胞群。在另一个实施方案中，本发明的分离的椎间盘干细胞群包含哺乳动物椎间盘干细胞群。在另一个实施方案中，本发明的分离的椎间盘干细胞得自对象的髓核。在另一个实施方案中，髓核细胞包含椎间盘干细胞。
在另一个实施方案中，本发明的干细胞富集的细胞群包含人椎间盘干细胞群。在另一个实施方案中，本发明的干细胞富集的细胞群包含非人椎间盘干细胞群。在另一个实施方案中，本发明的干细胞富集的细胞群包含哺乳动物椎间盘干细胞群。在另一个实施方案中，本发明的干细胞富集的细胞群得自对象的髓核。在另一个实施方案中，髓核细胞包含椎间盘干细胞。
在另一个实施方案中，髓核是在椎间盘中心的胶状物。在另一个实施方案中，髓核包含软骨细胞、胶原纤维和蛋白聚糖aggrecan，其具有吸水的透明质酸长链。
在另一个实施方案中，本发明的髓核细胞包含自体移植的髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明的髓核细胞包含同种异体移植的髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明的髓核细胞包含异种移植的髓核细胞。
在另一个实施方案中，本发明的髓核细胞包含椎间盘干细胞。在另一个实施方案中，本发明的髓核细胞包含椎间盘祖细胞。在另一个实施方案中，本发明的髓核细胞包含成熟的椎间盘细胞。在另一个实施方案中，本发明的髓核细胞包含终末分化的椎间盘细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离椎间盘干细胞的方法，包括产生discosphere培养物的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供了分离椎间盘干细胞的方法，包括将髓核细胞铺板于无血清培养基中的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供了产生包含髓核细胞的球体的方法，包括使髓核细胞在无血清培养基中的培养物生长的步骤，从而产生discosphere。在另一个实施方案中，本发明提供了包含髓核细胞的discosphere是通过髓核干细胞在体外产生的自由浮动(free-floating)结构。在另一个实施方案中，本发明提供了discosphere是由髓核祖细胞在体外产生的自由浮动结构。在另一个实施方案中，本发明提供了discosphere是由髓核干细胞和祖细胞在体外产生的自由浮动结构。
在另一个实施方案中，本发明的椎间盘干细胞由其discosphere形成的能力(ability或capacity)而定义。在另一个实施方案中，贴壁培养生长的这些椎间盘干细胞在合适的分化条件下具有分化为成熟或者完全分化的能力。在另一个实施方案中，完全分化的髓核细胞分泌额外的细胞基质成分。在另一个实施方案中，术语“分化”是指细胞从非特化或低特化的前体细胞发育为具有特定结构和功能的细胞，包括细胞从前体细胞发育为具有髓核细胞的结构和功能的细胞。在另一个实施方案中，术语“分化”是指细胞从椎间盘干细胞发育为具有特定结构和功能的细胞。在另一个实施方案中，术语“分化”是指细胞从椎间盘祖细胞发育为具有特定结构和功能的细胞。在另一个实施方案中，合适的分化条件包括包含血清的培养基。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了得自对象髓核的椎间盘材料。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了椎间盘材料，其通过手术获得且在实验室中处理产生髓核细胞的单细胞悬浮液(实施例1)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了人椎间盘材料，其通过手术获得且在实验室中处理产生髓核细胞的单一悬浮液。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了人髓核，其通过手术获得且在实验室中处理产生髓核细胞的单细胞悬浮液。
在另一个实施方案中，异种(heterogeneous)髓核细胞群是通过刮取对象的髓核而获得。在另一个实施方案中，异种髓核细胞群包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞以及分化的髓核细胞。在另一个实施方案中，异种髓核细胞群是通过刮取人对象的髓核而获得。在另一个实施方案中，本发明提供了将异种髓核细胞群以较低细胞密度铺板于无血清培养基中，使得髓核干细胞存活。在另一个实施方案中，术语“髓核干细胞存活”是指在包括无血清细胞培养基的条件下髓核干细胞保持生存力的能力。在另一实施方案中，本发明提供了髓核细胞(组织中的大多数细胞)由于不能耐受无血清条件而逐渐消逝，但是椎间盘干细胞(或者髓核干细胞，组织中少数细胞)在这些条件下生长为discosphere。
在另一个实施方案中，本发明提供了将异种髓核细胞群以较低细胞密度铺板于无血清培养基中，得以分离髓核干细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了将异种髓核细胞群以较低密度铺板于无血清培养基中，得以针对椎间盘干细胞富集髓核细胞群。在另一个实施方案中，本发明提供了将异种髓核细胞群以较低细胞密度铺板于包含干扰细胞附着的物质的无血清培养基中，使得髓核干细胞存活。在另一个实施方案中，本发明提供了将异种髓核细胞群以较低细胞密度铺板于包含干扰细胞附着的甲基纤维素的无血清培养基中，使得髓核干细胞存活。
在另一个实施方案中，异种髓核细胞群得自切成片状的髓核活检组织样品。在另一个实施方案中，所述切片大小为0.5-10mm。在另一个实施方案中，所述切片大小为0.5-20mm。在另一个实施方案中，所述切片大小为0.5-3mm。在另一个实施方案中，所述切片大小为3-6mm。在另一个实施方案中，所述切片大小为6-12mm。在另一个实施方案中，所述切片大小为12-20mm。在另一个实施方案中，所述切片大小为1-6mm。在另一个实施方案中，所述切片大小为3-5mm。在另一个实施方案中，所述切片大小为3-4mm(实施例1)。
在另一个实施方案中，异种髓核细胞群得自用胶原酶II溶液处理的髓核活检组织样品(实施例1)。在另一个实施方案中，异种髓核细胞群得自用0.1％-1％梭菌胶原酶(Worthington CLS II，140u/mg)处理的髓核活检组织样品。在另一个实施方案中，异种髓核细胞群得自髓核活检组织样品，用胶原酶II溶液处理及随后将该样品置于摇瓶中，由此获得异种髓核细胞群。
在另一个实施方案中，异种髓核细胞群得自从患者椎间盘抽出的髓核活检组织样品。在另一个实施方案中，异种髓核细胞群得自从供体动物椎间盘抽出的髓核活检组织样品。在另一个实施方案中，异种髓核细胞群得自从供体哺乳动物椎间盘抽出的髓核活检组织样品。在另一个实施方案中，异种髓核细胞群得自从患者的正常椎间盘抽出的髓核活检组织样品。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生discosphere的方法，包括使髓核细胞培养物在无血清培养基中生长，从而产生discosphere。在另一个实施方案中，本发明提供了使髓核细胞的原代培养物在无血清培养基中生长，从而选择髓核干细胞。在另一个实施方案中，存活的分离的髓核干细胞培养物产生本发明的discosphere。在另一个实施方案中，存活的椎间盘干细胞富集的髓核干细胞培养物产生本发明的discosphere。
在另一个实施方案中，本发明的补加的无血清培养基仅使得髓核干细胞生长。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了富集的髓核干细胞群是当在补加生长因子的本发明的无血清培养基中生长而产生的。在另一个实施方案中，本发明的方法提供的富集的髓核干细胞群包含至少60％的髓核干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法提供的富集的髓核干细胞群包含至少70％的髓核干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法提供的富集的髓核干细胞群包含至少80％的髓核干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法提供的富集的髓核干细胞群包含至少85％的髓核干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法提供的富集的髓核干细胞群包含至少90％的髓核干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法提供的富集的髓核干细胞群包含至少95％的髓核干细胞。
在另一个实施方案中，discosphere得自单一髓核干细胞。在另一个实施方案中，当将髓核细胞铺板于无血清培养基中时，仅椎间盘干细胞生长。在另一个实施方案中，当将髓核细胞以低细胞密度铺板时，仅椎间盘干细胞生长。在另一个实施方案中，当将髓核细胞以低细胞密度铺板于无血清培养基中时，仅椎间盘干细胞生长。在另一个实施方案中，仅髓核干细胞作为自由浮动的孤立细胞可以生长。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含抑制细胞成熟的化合物的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含抑制细胞成熟的FGF的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含维持细胞不成熟状态的化合物的无血清培养基中生长。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含TGF-β超家族成员的培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含BMP的培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明提供了BMP抑制分化(Id)基因。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含IL6细胞因子家族成员的培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘干细胞在包含白血病抑制因子(LIF)的培养基中生长。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含促进细胞增殖的化合物的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含促进细胞增殖的EGF的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含白细胞介素-2(IL-2)的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含白细胞介素-6(IL-6)的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含干细胞因子(SCF)的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含白血病抑制因子(LIF)的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含转化生长因子-β(TGF-β)的无血清培养基中生长。在另一个实施方案中，本发明进一步提供了椎间盘干细胞在包含抑制细胞分化的化合物的无血清培养基中生长(实施例1及材料与方法章节)。
在另一个实施方案中，本发明的椎间盘干细胞增殖并产生另外的干细胞。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘干细胞增殖并产生椎间盘祖细胞。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘干细胞增殖，因此形成discosphere。在另一个实施方案中，本发明的discosphere包含排列成圆球形结构的髓核干细胞和髓核祖细胞。在另一个实施方案中，discosphere是个球体，其中单一的椎间盘细胞产生其自身克隆(对称分裂)及祖细胞。在另一个实施方案中，本发明的discosphere包含自由浮动的排列成圆球形的髓核干细胞和髓核祖细胞。在另一个实施方案中，包含discosphere的髓核细胞彼此附着在一起。
在另一个实施方案中，术语“髓核干细胞”和“椎间盘干细胞”可互换使用。在另一个实施方案中，术语“髓核祖细胞”和“椎间盘祖细胞”可互换使用。
在另一个实施方案中，术语“discosphere”包含这样的细胞球体，其中单个的椎间盘干细胞产生自身克隆(对称分裂)和祖细胞。在另一个实施方案中，术语“祖细胞”是指未成熟的具有可塑潜力和高增殖速度的干细胞样细胞，其可以产生大多数终末分化的组织细胞，但是不被定义为椎间盘干细胞。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了制备单细胞悬浮液以通过产生一定的环境条件而分离椎间盘干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了制备单细胞悬浮液以通过产生一定的环境条件而产生discosphere。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在湿化培养箱中在37℃保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在湿化培养箱中在35℃保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在湿化培养箱中在36℃保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在湿化培养箱中在38℃保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在湿化培养箱中在39℃保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在湿化培养箱中在40℃保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在湿化培养箱中在41℃保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在湿化培养箱中在42℃保温。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持3-8％CO2条件的培养箱中保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持4％CO2条件的培养箱中保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持5％CO2条件的培养箱中保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持6％CO2条件的培养箱中保温。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持60-100％湿度条件的培养箱中保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持70-100％湿度条件的培养箱中保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持80-100％湿度条件的培养箱中保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持90-100％湿度条件的培养箱中保温。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液在进一步保持95-100％湿度条件的培养箱中保温。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液以低于1×106个细胞/ml的终密度铺板。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液以低于5×105个细胞/ml的终密度铺板。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液以低于1×105个细胞/ml的终密度铺板。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液以低于8×104个细胞/ml的终密度铺板。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了将单细胞悬浮液以低于6×104个细胞/ml的终密度铺板(实施例1)。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含椎间盘干细胞的组合物。在另一个实施方案中，本发明包含具有富集的髓核干细胞的髓核细胞群的组合物。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含合适环境，如本文所述那些环境，其中椎间盘干细胞可以被诱导增殖并产生椎间盘干细胞后代。在另一个实施方案中，术语其中放置椎间盘干细胞后代的环境是指外部或外在物理和/或化学条件的组合，其影响和改变椎间盘干细胞的生长和发育。在另一个实施方案中，所述环境可以是离体或体内环境。在另一个实施方案中，椎间盘支架可以作为体内环境，诱导椎间盘干细胞产生后代。在另一个实施方案中，所述环境是离体环境，包括椎间盘干细胞置于培养箱中的细胞培养基中(实施例1)。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含椎间盘干细胞和培养基的组合物。在另一个实施方案中，所述培养基是无血清培养基。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的表皮生长因子(EGF)。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-10ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的20-50ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的50-100ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-15ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的8-12ng/ml EGF。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的FGF。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的成纤维细胞生长因子2(FGF2)。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/mlFGF2。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的20-50ng/ml FGF2。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的50-100ng/ml FGF2。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-15ng/ml FGF2。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的8-12ng/ml FGF2。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的胰岛素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100μg/ml胰岛素(实施例1)。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的20-50μg/ml胰岛素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的50-100μg/ml胰岛素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-15μg/ml胰岛素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的8-12μg/ml胰岛素。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的孕酮(实施例1)。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-200ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的20-200ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的50-150ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的10-100ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的20-80ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的30-50ng/ml孕酮。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的腐胺(实施例1)。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-800ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的100-300ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的300-500ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的500-800ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的150-250ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的180-220ng/ml腐胺。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的运铁蛋白(实施例1)。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-400ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的100-200ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的200-400ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的20-150ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的80-200ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的80-120ng/ml运铁蛋白。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的亚硒酸钠(实施例1)。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-400ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的100-200ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的200-400ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的20-150ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的40-180ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的40-80ng/ml亚硒酸钠。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的甲基纤维素(实施例1)。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-10％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-3％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的3-5％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-8％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的7-10％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-2.5％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-2.5％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1.5-2.5％甲基纤维素。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的抗生素(实施例1)。在另一个实施方案中，补加到培养基中的的抗生素是青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1000-10000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1000-3000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的3000-6000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的6000-10000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的3000-8000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的4000-6000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5000U/ml青霉素-链霉素.
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的敲除(KO)血清替代品。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-30％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-30％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的3-5％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-15％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的15-30％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的10-20％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的15-25％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的20％KO血清替代品。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.1-10％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.1-1％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1-5％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-10％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的15-30％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-1％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.8-1.2％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1％非必需氨基酸。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.1-10mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.1-5mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-10mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的5-8mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-2.5mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的1.5-3mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-1.5mML-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.8-1.2mM L-谷氨酰胺。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的β-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.01-1mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.01-0.5mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-1mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-0.8mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的00.5-0.25mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.15-0.3mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.05-0.15mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含补加到培养基中的0.08-0.12mMβ-巯基乙醇。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含具有Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)的培养基。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含具有DMEM/F12的培养基。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含具有Hamm′s培养基的培养基。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含具有Hamm′s/F12培养基的培养基。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含具有ESGRO CompleteTM AccutaseTM的培养基。在另一个实施方案中，ESGRO CompleteTM AccutaseTM是用于使得在用ESGROCompleteTM克隆级别培养基在无血清培养条件下培养的干细胞脱离(detachment)的蛋白酶解和溶胶原酶的细胞脱离溶液。在另一个实施方案中，在Dulbecco′s PBS中的1×AccutaseTM酶包含0.5mM EDTA·4Na和3mg/L苯酚。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物进一步包含具有HEScGRO hES细胞培养基(Chemicon Temecula，CA)的培养基。
在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物用于将椎间盘干细胞铺板于超低附着板中。在另一个实施方案中，包含椎间盘干细胞的组合物用于将椎间盘干细胞铺板于用抗粘合物质预包被的超低附着板中。在另一个实施方案中，所述抗粘合物质是甲基丙烯酸-2-羟乙酯。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的discosphere。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘干细胞产生分离的discosphere。在另一个实施方案中，本发明的discosphere是干细胞增殖的结果，其产生额外的干细胞和祖细胞。在另一个实施方案中，discosphere是由于干细胞增殖的结果而形成。
在另一个实施方案中，本发明的分离的discosphere包含排列成圆球状结构的髓核干细胞和髓核祖细胞。在另一个实施方案中，分离的discosphere的这样的细胞球状物，其中单个椎间盘干细胞产生自身克隆(对称分裂)和祖细胞。在另一个实施方案中，本发明的discosphere是排列成圆球状结构的髓核干细胞和髓核祖细胞的自由浮动聚集体。在另一个实施方案中，本发明的discosphere培养物包含孤立的自由浮动discosphere。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了分离本发明的discosphere可易于由本领域技术人员在光学显微镜下进行。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了通过将椎间盘干细胞铺板于无血清培养基中及保温制备单细胞悬浮液以分离椎间盘干细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了通过将椎间盘干细胞铺板于无血清培养基中及保温制备单细胞悬浮液以产生discosphere。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生discosphere的方法，包括在无血清培养基中使髓核细胞培养物生长的步骤，从而产生discosphere。在另一个实施方案中，本发明提供了使无血清培养基中髓核细胞原代培养物生长，从而选择髓核干细胞。在另一个实施方案中，剩余的分离的髓核干细胞培养物产生本发明的discosphere。在另一个实施方案中，剩余的富集的髓核干细胞培养物产生本发明的discosphere。在另一个实施方案中，根据本发明的方法产生的discosphere在本发明的组合物中生长。在另一个实施方案中，根据本发明的方法产生的discosphere在补加的本发明培养基中生长。在另一个实施方案中，根据本发明的方法产生的discosphere在不允许细胞-基质附着的条件下生长。在另一个实施方案中，不允许细胞-基质附着的条件包括例如向本发明的细胞培养基中加入大约0.2-2％甲基纤维素。
在另一个实施方案中，本发明提供包含discosphere的组合物。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含一个discosphere。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少1×102个discosphere。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少1×103个discosphere。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少1×104个discosphere。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少1×105个discosphere。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含至少1×106个discosphere。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包含discosphere和培养基。在另一个实施方案中，所述培养基是无血清培养基。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的EGF。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-10ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20-50ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的50-100ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-15ng/ml EGF。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的8-12ng/ml EGF。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的FGF。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的FGF2。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml FGF2。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20-50ng/mlFGF2。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的50-100ng/ml FGF2。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-15ng/ml FGF2。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的8-12ng/mlFGF2。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的胰岛素(实施例2及材料与方法章节)。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100μg/ml胰岛素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20-50μg/ml胰岛素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的50-100μg/ml胰岛素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-15μg/ml胰岛素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的3-7μg/ml胰岛素。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的孕酮。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-200ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20-200ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的50-150ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的10-100ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20-80ng/ml孕酮。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的15-25ng/ml孕酮。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的腐胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-800ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的100-300ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的300-500ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的500-800ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的150-250ng/ml腐胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的140-160ng/ml腐胺。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-400ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的100-200ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的200-400ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20-150ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的80-200ng/ml运铁蛋白。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的30-70ng/ml运铁蛋白。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-400ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-100ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的100-200ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的200-400ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20-150ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的40-180ng/ml亚硒酸钠。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20-40ng/ml亚硒酸钠。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-10％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-3％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的3-5％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-8％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的7-10％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-2.5％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-2.5％甲基纤维素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.6-1％甲基纤维素。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的抗生素。在另一个实施方案中，补加到培养基中的的抗生素是青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1000-10000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1000-3000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的3000-6000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的6000-10000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的3000-8000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的4000-6000U/ml青霉素-链霉素。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5000U/ml青霉素-链霉素。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-30％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-30％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的3-5％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-15％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的15-30％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的10-20％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的15-25％KO血清替代品。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的20％KO血清替代品。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.1-10％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.1-1％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1-5％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-10％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的15-30％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-1％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.8-1.2％非必需氨基酸。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1％非必需氨基酸。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.1-10mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.1-5mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-10mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的5-8mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-2.5mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的1.5-3mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-1.5mM L-谷氨酰胺。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.8-1.2mM L-谷氨酰胺。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的β-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.01-1mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.01-0.5mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-1mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.5-0.8mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的00.5-0.25mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.15-0.3mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.05-0.15mMβ-巯基乙醇。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含补加到培养基中的0.08-0.12mMβ-巯基乙醇。
在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含具有Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)的培养基。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物包含进一步包含DMEM/F12的培养基。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物包含进一步包含ESGRO CompleteTMAccutaseTM的培养基。在另一个实施方案中，ESGRO CompleteTM AccutaseTM是用于使得在用ESGRO CompleteTM克隆级别培养基在无血清培养条件下培养的干细胞脱离(detachment)的蛋白酶解和溶胶原酶的细胞脱离溶液。在另一个实施方案中，在Dulbecco′s PBS中的1×AccutaseTM酶包含0.5mMEDTA·4Na和3mg/L苯酚。在另一个实施方案中，包含discosphere的组合物进一步包含具有HEScGRO hES细胞培养基(Chemicon Temecula，CA)的培养基。
在另一个实施方案中，本发明提供了进一步扩增通过本发明的方法获得的discosphere。在另一个实施方案中，本发明提供了通过在补加胶原酶的DMEM/F12培养基中在37℃保温解离discosphere。在另一个实施方案中，本发明提供了解离的细胞通过将其再置于基于甲基纤维素培养基中扩增。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当椎间盘组织生长时，在培养基中补加8-20％胎牛血清(FBS)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当椎间盘组织在支架中生长时，在培养基中补加8-20％胎牛血清(FBS)。在另一个实施方案中，所述培养基包含30-70％得自原代人包皮成纤维细胞培养物的培养基，或者其组合物。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其组合细胞生长时，培养基中不含血清。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其组合细胞生长时，培养基中不含血清替代品。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当椎间盘干细胞生长时，培养基中不含FBS。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当髓核干细胞生长时，培养基中不含FBS。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当祖细胞生长时，培养基中不含FBS。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当髓核祖细胞生长时，培养基中不含FBS。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当分离椎间盘干细胞或者椎间盘祖细胞时，培养基中不含血清或者血清替代品。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当针对椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其组合富集异种细胞群时，培养基中不含血清或者血清替代品。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其组合的discosphere生长时，培养基中不含血清或者血清替代品。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当扩增包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其组合的培养物时，培养基中不含血清或者血清替代品。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了当扩增富集椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其组合时，培养基中不含血清或者血清替代品。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含髓核细胞的椎间盘置换装置。在另一个实施方案中，本发明提供了包含髓核细胞的人工椎间盘。在另一个实施方案中，所述椎间盘置换装置是椎骨间椎间盘置换装置。在另一个实施方案中，椎骨间椎间盘位于相邻的椎体终板的凹面关节面之间。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘置换装置允许如屈、伸、侧屈和旋转等运动。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘置换装置用于修复和/或置换受伤或损坏的椎间盘。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘置换装置提供了修复的椎间盘，其组合支持患者脊柱高负荷的稳定性以及为患者提供足够的运动性和正确脊柱负荷分布的灵活性。
在另一个实施方案中，所述椎间盘置换装置包含椎间盘支架。在另一个实施方案中，所述支架包含形状记忆合金。在另一个实施方案中，形状记忆合金可以在其马氏体相(martensite phase)期间变形，但是当其在高于一定温度如奥氏体相(austenite phase)温度加热时恢复期原始形状。在另一个实施方案中，本发明的形状记忆合金呈现出超弹性性质，从而能承受较大变形而不破坏其结构。
在另一个实施方案中，所述椎间盘置换装置包含刚性部分，从椎骨接触面伸出的凸起充填于脊椎之间，并伸入椎体中。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含椎间盘关节成形术装置以置换椎间盘。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含球窝使得可以旋转。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含中间层，使得上下关节之间可以运动。
在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含两个终板，其锚定椎骨的上下表面。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含两个金属终板，其锚定椎骨的上下表面。在另一个实施方案中，所述金属是钴-铬合金。在另一个实施方案中，所述终板用髓核粘附分子包被。在另一个实施方案中，所述终板用促进髓核生长的分子包被。
在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含陶瓷。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含可注射液体。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含水凝胶。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含在柔性的、无弹性的机织聚乙烯护套中的水凝胶核心。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含聚乙烯醇材料。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含可膨胀物。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含弹性线圈(elasticcoil)。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含拉长的弹性记忆盘绕螺旋(memory-coiling spiral)。在另一个实施方案中，拉长的弹性记忆盘绕螺旋由聚碳酸酯聚氨酯制成。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含连体的凸起表面的陶瓷或金属植入体，其作为半关节成形术锚定下位椎体。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含由聚氨酯制成的气囊样植入体。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含蛋白质水凝胶。在另一个实施方案中，椎间盘置换装置包含热聚合物。
在另一个实施方案中，椎间盘支架包含ECM成分。在另一个实施方案中，所述ECM成分是结构蛋白。在另一个实施方案中，椎间盘支架包含胶原。在另一个实施方案中，所述结构蛋白是弹性蛋白。在一些实施方案中，所述ECM成分是特化蛋白质。在另一个实施方案中，所述特化蛋白质是微纤维蛋白。在另一个实施方案中，所述特化蛋白质是纤连蛋白。在另一个实施方案中，所述特化蛋白质是层粘蛋白(laminin)。在一些实施方案中，所述ECM成分是蛋白聚糖。在一个实施方案中，蛋白聚糖由蛋白质核心及与其附着的称作糖胺聚糖(GAG)的长链重复二糖单位组成，形成极复杂的高分子量成分。
在另一个实施方案中，胶原是I型胶原。在另一个实施方案中，I型胶原包含[a1(I)]2[a(I)]链。在另一个实施方案中，I型胶原得自皮肤、肌腱或者骨。
在另一个实施方案中，胶原是II型胶原。在另一个实施方案中，II型胶原包含[a1(II)]3链。在另一个实施方案中，II型胶原得自软骨或者玻璃体液。在另一个实施方案中，II型胶原原纤维在基质中通过IX型胶原与蛋白聚糖交联。
在另一个实施方案中，胶原是III型胶原。在另一个实施方案中，III型胶原包含[a1(III)]3链。在另一个实施方案中，III型胶原得自皮肤或肌肉，通常与I型胶原一起被发现。
在另一个实施方案中，胶原是IV型胶原。在另一个实施方案中，IV型胶原包含[a1(IV)2[a2(IV)]链。在另一个实施方案中，IV型胶原得自基膜。
在另一个实施方案中，胶原是V型胶原。在另一个实施方案中，V型胶原包含[a1(V)][a2(V)][a3(V)]链。在另一个实施方案中，V型胶原得自与I型胶原相关的间质组织。
在另一个实施方案中，胶原是VI型胶原。在另一个实施方案中，VI型胶原包含[a1(VI)][a2(VI)][a3(VI)]链。在另一个实施方案中，VI型胶原得自与I型胶原相关的间质组织。在另一个实施方案中，VI型胶原由长度为大约60nm的相对短的三螺旋区域组成，由长度为大约40nm的球状区域间隔。在一些实施方案中，纯VI型胶原的原纤维形成与串珠相似结构。
在一个实施方案中，胶原是VII型胶原。在一个实施方案中，VII型胶原包含[a1(VII)]3链。在另一个实施方案中，VII型胶原得自上皮。
在另一个实施方案中，胶原是VIII型胶原。在另一个实施方案中，VIII型胶原包含[a1(VIII)]3链。在另一个实施方案中，VIII型胶原得自内皮细胞。
在另一个实施方案中，胶原是IX型胶原。在另一个实施方案中，IX型胶原包含[a1(IX)][a2(IX)][a3(IX)]链。在另一个实施方案中，IX型胶原得自与II型胶原相关的软骨。
在另一个实施方案中，胶原是X型胶原。在另一个实施方案中，X型胶原包含[a1(X)]3链。在另一个实施方案中，X型胶原得自肥厚性软骨(hypertrophic cartilage)和矿化软骨(mineralizing cartilage)。
在另一个实施方案中，胶原是XI型胶原。在另一个实施方案中，XI型胶原包含[a1(XI)][a2(XI)][a3(XI)]链。在另一个实施方案中，XI型胶原得自软骨。
在另一个实施方案中，胶原是XII型胶原。在另一个实施方案中，XII型胶原包含a1(XII)链。在另一个实施方案中，XII型胶原得自I型和III型胶原存在的部位。
在另一个实施方案中，I型胶原分子并排包在一起，形成直径为50-200nm的原纤维。在一些实施方案中，原纤维，相邻胶原分子互相置换67nm，大约为它们的长度的四分之一。在一些实施方案中，I、II、III和V型胶原通过并行相互作用形成杆状三螺旋。
在另一个实施方案中，本发明的胶原得自牛。在另一个实施方案中，本发明的胶原得自患者自体脂肪或者透明质酸。
在另一个实施方案中，胶原是已经修饰的胶原样物质，通过将胶原溶解于水中并且修饰该溶解的胶原使其表面电荷与修饰前相比更加阳性。在另一个实施方案中，这种材料为本领域熟知，在例如美国专利No.4,238,480中揭示。在另一个实施方案中，冻干修饰的胶原以形成固体凝胶。在一些实施方案中，固体凝胶可以是杆状、条带、薄膜或者薄片形状。
在另一个实施方案中，适用于本发明中的其它形式的胶原包括SemedF，这是在天然纤维形式中不经任何化学或酶修饰生产的胶原制备物，以及Semed S，这是从新鲜牛皮中提取的冻干的胶原粉末。在另一个实施方案中，SemedF材料是I型胶原(高于95％)，而Semed S是I型胶原与III型胶原的混合物，其中原胶原的形状和尺寸以其自然螺旋方向保留。
在另一个实施方案中，待冻干的液体中胶原的浓度可以是0.5-10％，要选1-5％，浓度越低则形成较低密度或不连续的固体。在另一个实施方案中，在0.5-1％的较低浓度，Semed F形成近似蜘蛛网密度的结构。
在另一个实施方案中，也可以单独或者掺入可塑剂一起使用天然胶原薄膜，其中薄膜强度得以保持，且胶原聚合物的三螺旋结构得以完整保持。
在另一个实施方案中，利用凝胶或者其它水溶形式胶原。在另一个实施方案中，可溶形式胶原在体温易于聚合形成稳定的皮下凝胶。在另一个实施方案中，当将可溶形式的胶原植入机体中时，聚合材料迅速群聚植入其中的髓核细胞并形成成纤维细胞。在一些实施方案中，该材料血管化且可以保持组织学稳定性。在另一个实施方案中，该材料血管化且可以保持组织学稳定性至少4个月。在另一个实施方案中，该材料血管化且可以保持组织学稳定性至少6个月。在另一个实施方案中，该材料血管化且可以保持组织学稳定性至少8个月。在另一个实施方案中，该材料血管化且可以保持组织学稳定性至少10个月。在另一个实施方案中，该材料血管化且可以保持组织学稳定性至少12个月。在另一个实施方案中，该材料血管化且可以保持组织学稳定性至少15个月。在另一个实施方案中，该材料血管化且可以保持组织学稳定性至少18个月。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明各种类型胶原的混合物，以获得每个级别最希望的特征。
在另一个实施方案中，纤连蛋白是2个相似肽的二聚物。在另一个实施方案中，纤连蛋白的每个链的长度为60-70nm，厚度为2-3nm。在另一个实施方案中，纤连蛋白含有至少6个紧密折叠的结构域，每个结构域对于不同底物具有高亲和性，所述底物如硫酸类肝素、胶原(I、II和III型胶原的单独结构域)以及纤维蛋白和细胞表面受体。
在另一个实施方案中，层粘蛋白(laminin)分子是由α、β和γ链装配的异源三聚体。在一些实施方案中，层粘蛋白形成单独的网，且通过entactin核perlecan与IV型胶原网关联。在一些实施方案中，层粘蛋白有助于细胞生存力、附着和分化、细胞形状和运动、维持组织表型以及促进组织存活。
在另一个实施方案中，蛋白聚糖包含硫酸软骨素和硫酸皮肤素链。在另一个实施方案中，蛋白聚糖包含硫酸肝素和硫酸类肝素链。在另一个实施方案中，蛋白聚糖包含硫酸角质素链。在另一个实施方案中，蛋白聚糖是aggrecan，是软骨中的主要蛋白聚糖。在另一个实施方案中，蛋白聚糖是versican，存在于许多成人组织包括血管和皮肤中。在另一个实施方案中，蛋白聚糖是小型富含亮氨酸重复蛋白多糖(SLRP)。在另一个实施方案中，SLRP包括核心蛋白多糖、双糖链蛋白多糖、纤调蛋白和基膜聚糖。
在另一个实施方案中，胞外基质成分是分碎的(morselized)。在另一个实施方案中，分碎的胞外基质蛋白增加髓核细胞附着的表面积。在另一个实施方案中，分碎的胞外基质蛋白增加discosphere附着的表面积。在另一个实施方案中，分碎的胞外基质蛋白增加椎间盘干细胞附着的表面积。在另一个实施方案中，分碎的胞外基质蛋白增加椎间盘祖细胞附着的表面积。在另一个实施方案中，分碎的胞外基质蛋白增加表面积，因此有助于营养物质和废物从一个移植体扩散至另一个移植体。在另一个实施方案中，分碎的胞外基质蛋白使得髓核细胞可以通过针头或者小套管导入椎间盘支架中。在另一个实施方案中，分碎的胞外基质蛋白使得discosphere可以通过针头或者小套管导入椎间盘支架中。在另一个实施方案中，可以做一小切口以插入椎间盘支架中进行细胞附着。
在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘支架得自动物或人。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘支架是椎骨终板保持完整的椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘支架是椎骨终板保持完整的兔椎间盘(实施例3)。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘支架是椎骨终板保持完整的狗椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘支架是椎骨终板保持完整的马椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘支架是椎骨终板保持完整的猴椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘支架是椎骨终板保持完整的猪椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘支架是椎骨终板保持完整的牛椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了包含胶原的椎间盘支架进一步包含额外的材料如陶瓷或金属。
在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘置换装置包含髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘置换装置包含人髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘置换装置包含髓核干细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘置换装置包含髓核祖细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了椎间盘置换装置包含本发明的discosphere。
在另一个实施方案中，椎间盘置换装置进一步包含培养基。在另一个实施方案中，所述培养基包含本发明的细胞培养基(实施例3)。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生人工椎间盘的方法，包括discosphere在椎间盘支架中生长的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括discosphere在椎间盘支架中生长的步骤。在另一个实施方案中，将discosphere给予在椎间盘支架上。在另一个实施方案中，将discosphere给予在椎间盘支架中包含胶原的层中。在另一个实施方案中，将discosphere给予在椎间盘支架中包含胶原的层上。在另一个实施方案中，将discosphere注射进椎间盘支架中(实施例4)。在另一个实施方案中，将discosphere注射在椎间盘支架上。在另一个实施方案中，将discosphere注射进椎间盘支架中包含胶原的层中。在另一个实施方案中，将discosphere注射在椎间盘支架中包含胶原的层上。在另一个实施方案中，将本发明的discosphere与本发明的组合物一起应用于或者注射进椎间盘支架中或其上。在另一个实施方案中，将本发明的discosphere与补加10％FCS的DMEM/F1培养基一起应用于或者注射进椎间盘支架中或其上。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括髓核细胞在椎间盘支架中生长的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括discosphere在椎间盘支架中生长的步骤，从而产生椎间盘组织。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘组织包含本发明的椎间盘支架。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘组织包含本发明的髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘组织包含本发明的椎间盘支架。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘组织包含在本发明的椎间盘支架上生长的本发明的髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘组织包含本发明的椎间盘支架。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘组织包含得自附着于本发明椎间盘支架的本发明discosphere的成熟髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘组织包含得自附着于本发明椎间盘支架的本发明椎间盘干细胞的成熟髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘组织包含成纤维细胞和得自附着于本发明椎间盘支架的本发明discosphere的成熟髓核细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架用髓核细胞生长因子包被。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架用髓核细胞粘附因子包被。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架用髓核细胞分化因子包被。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架置于包含髓核细胞生长因子、粘附因子和分化因子的培养基中。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架置于包含髓核细胞生长因子、粘附因子和分化因子的细胞培养基中。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架置于包含DMEM/F12培养基的培养基中。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架置于包含具有DMEM/F12培养基和10％胎牛血清(FCS)的培养基中(实施例3)。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在35-42℃保温。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在36-38℃保温。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在37℃保温。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在保持4-10％CO2的条件下保温。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在保持4-8％CO2的条件下保温。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在保持5％CO2的条件下保温。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在培养箱中保温2-12个小时。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在培养箱中保温3-10个小时。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在培养箱中保温6-10小时。在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括将本发明的椎间盘支架在本发明的培养基中在培养箱中保温8小时。
在另一个实施方案中，本发明提供了将本发明的椎间盘支架在培养箱中本发明的培养基中保温，包括在将髓核细胞应用于椎间盘支架中或其上之前制备椎间盘支架的步骤。在另一个实施方案中，本发明提供了将本发明的椎间盘支架在培养箱中的本发明的培养基中保温，使得本发明的髓核细胞在椎间盘支架上贴壁、生长和分化。在另一个实施方案中，本发明提供了将本发明的椎间盘支架在培养箱中的本发明的培养基中保温，使得本发明的discosphere髓核细胞在椎间盘支架上贴壁、生长和分化。在另一个实施方案中，本发明提供了将本发明的椎间盘祖细胞在培养箱中的本发明的培养基中保温，使得本发明的髓核细胞在椎间盘支架上贴壁、生长和分化。在另一个实施方案中，本发明提供了将本发明的椎间盘支架在培养箱中的本发明的培养基中保温，使得本发明的椎间盘干细胞在椎间盘支架上贴壁、生长和分化。在另一个实施方案中，本发明提供了将本发明的椎间盘支架在培养箱中的本发明的培养基中保温，使得本发明的髓核细胞、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞、discosphere或者其任何组合在椎间盘支架上贴壁、生长和分化。
在另一个实施方案中，本发明提供了收获自体移植的髓核细胞、培养并注射进椎间盘支架中心(实施例4)。在另一个实施方案中，本发明提供了收获同种异体移植(allograft)的髓核细胞、培养并注射进椎间盘支架中。在另一个实施方案中，本发明提供了收获异种移植的髓核细胞、培养并注射进椎间盘支架中心。
在另一个实施方案中，本发明提供了将髓核干细胞、髓核祖细胞、discosphere或者其组合物植入椎间盘支架中形成活的髓核。在另一个实施方案中，将得自细胞培养物的髓核干细胞、髓核祖细胞、discosphere或者其组合物植入椎间盘支架中形成活的髓核。
在另一个实施方案中，将椎间盘干细胞给予椎间盘支架上。在另一个实施方案中，将椎间盘干细胞给予椎间盘支架中包含胶原的层中。在另一个实施方案中，将椎间盘干细胞给予椎间盘支架中包含胶原的层上。在另一个实施方案中，将椎间盘干细胞注射进椎间盘支架中。在另一个实施方案中，将椎间盘干细胞注射进椎间盘支架上。在另一个实施方案中，将椎间盘干细胞注射进椎间盘支架中包含胶原的层中。在另一个实施方案中，将椎间盘干细胞注射进椎间盘支架中包含胶原的层上。在另一个实施方案中，将本发明的椎间盘干细胞与本发明的组合物一起应用于或者注射进椎间盘支架中或其上。在另一个实施方案中，将本发明的椎间盘干细胞与具有10％FCS的DMEM/F12培养基一起注射进椎间盘支架中或其上。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括使髓核原代细胞在椎间盘支架中生长。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞给予椎间盘支架上。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞给予椎间盘支架中包含胶原的层中。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞给予椎间盘支架中包含胶原的层上。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞注射进椎间盘支架中。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞注射进椎间盘支架上。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞注射进椎间盘支架中包含胶原的层中。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞注射进椎间盘支架中包含胶原的层上。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞与本发明的组合物一起应用于或者注射进椎间盘支架中或其上。在另一个实施方案中，将椎间盘原代细胞与具有10％FCS的DMEM/F12培养基一起应用于或者注射进椎间盘支架中或其上。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生椎间盘置换装置的方法，包括通过本领域技术人员已知的方法从本发明的细胞培养基中收集discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物，并且将该细胞置于DMEM/F12中。在另一个实施方案中，本发明提供了首先洗涤discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物，除去细胞-基质粘附抑制因子。在另一个实施方案中，本发明提供了首先洗涤discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物，除去甲基纤维素。
在另一个实施方案中，本发明提供了将洗涤后基本无细胞-基质粘附抑制因子的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物置于细胞培养基中。在另一个实施方案中，本发明提供了将洗涤后基本无细胞-基质粘附抑制因子的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物置于DMEM中。在另一个实施方案中，本发明提供了将洗涤后基本无细胞-基质粘附抑制因子的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物置于DMEM/F12中。在另一个实施方案中，本发明提供了将洗涤后基本无细胞-基质粘附抑制因子的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物置于包含血清的DMEM/F12中。
在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在本发明细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含重组产生的形态发生蛋白的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含PDGF的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含TGF-β的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含EGF/TGF-α的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含IGF-I的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含β-FGF的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含水凝胶的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含可吸收的或者不可再吸收的合成或天然聚合物的细胞培养基中的椎间盘支架中，所述聚合物例如但不限于胶原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸或者聚四氟乙烯。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含抗生素的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含抗炎药物的细胞培养基中的椎间盘支架中。在另一个实施方案中，discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物被导入在包含免疫抑制药物的细胞培养基中的椎间盘支架中。
在另一个实施方案中，本发明提供了纤维环的胶原纤维排列成5-50层或片。在另一个实施方案中，本发明提供了纤维环的胶原纤维排列成10-40层或片。在另一个实施方案中，本发明提供了纤维环的胶原纤维排列成20-30层或片。
在另一个实施方案中，本发明提供了纤维环的纤维在层间交替改变方向。在另一个实施方案中，本发明提供了可以加压使钝端针头或者套管通过纤维环。在另一个实施方案中，本发明提供了在注射移植的髓核细胞或discosphere之后撤回针头时，纤维环的分开的纤维恢复至其正常位置，封闭纤维环。在另一个实施方案中，本发明提供了针头可以插入椎间盘支架的前面或侧面。在另一个实施方案中，本发明提供了本领域技术人员意识到可以在透视指导(fluourscopic guidance)下将针头经皮插入椎间盘侧面以及经腹腔镜将针头插入椎间盘前面。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的髓核细胞的接受者是提供者。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明髓核细胞的接受者至少部分与提供者至少部分相关。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的髓核细胞的提供者是一个提供者。在另一个实施方案中，本发明提供了多个提供者为一个接受者提供本发明的髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了多个提供者为多个接受者提供本发明的髓核细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了使用胎儿来源。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的髓核细胞的提供者优选与接受者具有家族关系，以使得免疫抑制最小化或者不存在。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的髓核细胞的提供者优选与接受者具有家族关系，以使得免疫抑制物质的需要最小化或者不需要。在另一个实施方案中，本发明提供了组织获得的指导，包括切除手术技术、提供者死亡与组织获得之间的时间，以及检测提供者的感染性疾病等指导，这些为本领域技术人员熟知。
在另一个实施方案中，本发明提供了注射进椎间盘支架中或其上的髓核细胞沉积胞外基质成分。在另一个实施方案中，本发明提供了注射进椎间盘支架中或其上的discosphere沉积椎间盘胞外基质成分。在另一个实施方案中，本发明提供了这些胞外基质成分形成适合椎间盘随后的生理学功能的形状。在另一个实施方案中，本发明提供了这些胞外基质成分形成适合椎间盘随后生物机械学功能的形状。在另一个实施方案中，本发明提供了通过第2周保温，证实椎间盘组织对压力具有抗性。在另一个实施方案中，本发明提供了通过第3周保温，证实椎间盘组织对压力具有抗性。在另一个实施方案中，本发明提供了对于压力具有抗性表明该椎间盘成熟。在另一个实施方案中，本发明提供了对于压力具有抗性表明该椎间盘获得拉伸性质。在另一个实施方案中，本发明提供了在第8周证实椎间盘组织最大厚度和压力抗性。在另一个实施方案中，本发明提供了在第9周证实椎间盘组织最大厚度和压力抗性。在另一个实施方案中，本发明提供了在第10周证实椎间盘组织最大厚度和压力抗性。
在另一个实施方案中，本发明提供了全部椎间盘置换方法。在另一个实施方案中，本发明提供了部分椎间盘置换方法。在另一个实施方案中，部分椎间盘置换方法包括置换髓核。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过10-25mm椎旁切口以最小微创方式除去破裂的椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了通过10-20mm椎旁切口以最小微创方式除去破裂的椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了通过15-18mm椎旁切口以最小微创方式除去破裂的椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了通过16-20mm椎旁切口以最小微创方式除去破裂的椎间盘。
在另一个实施方案中，本发明提供了将预先制备的支架插入椎间盘间隙中。在另一个实施方案中，本发明提供了将预先制备的包含胶原的支架插入椎间盘间隙中。在另一个实施方案中，本发明提供了将预先制备的支架插入椎间盘间隙中且膨胀充填该间隙。
在另一实施方案中，接受者接受本发明的椎间盘置换装置。在另一实施方案中，接受者接受本发明的髓核细胞。在另一实施方案中，接受者接受局部麻醉。在另一实施方案中，接受者接受全身麻醉。在另一实施方案中，精确的麻醉方案由本领域技术人员确定。
在另一实施方案中，损坏的椎间盘通过本领域技术人员已知的方法从接受者体内除去。在另一个实施方案中，本发明的椎间盘置换装置代替损坏的椎间盘。在另一个实施方案中，预处理的本发明的椎间盘支架代替损坏的椎间盘。在另一个实施方案中，包含胶原的预处理的本发明的椎间盘支架代替损坏的椎间盘。在另一个实施方案中，包含本发明各型胶原的预处理的本发明的椎间盘支架代替损坏的椎间盘。在另一个实施方案中，包含各种ECM成分的预处理的本发明的椎间盘支架代替损坏的椎间盘。
在另一个实施方案中，在将本发明的椎间盘支架通过手术置于受体中之后，将髓核细胞给予该椎间盘支架。在另一个实施方案中，术语“髓核细胞”包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其组合。在另一个实施方案中，通过钝端针头给予髓核细胞。在另一个实施方案中，通过套管给予髓核细胞。在另一个实施方案中，压迫髓核细胞通过纤维环。在另一个实施方案中，髓核细胞通过插入椎间盘前面或后面的针头给予。在另一个实施方案中，本领域技术人员认识到可以在透视指导(fluourscopic guidance)下将针头经皮插入椎间盘侧面以及经腹腔镜插入椎间盘前面。
在另一个实施方案中，本发明的髓核细胞加入患者的髓核中。在另一个实施方案中，使用标准技术除去患者的椎间盘。在另一个实施方案中，可以使用标准酶促技术除去患者的椎间盘。在另一个实施方案中，可以使用木瓜凝乳蛋白酶除去患者的椎间盘。在另一个实施方案中，可以借助于激光除去患者的椎间盘。在另一个实施方案中，可以借助于抽吸装置除去患者的椎间盘。在另一个实施方案中，可以借助于剃刀除去患者的椎间盘。在另一个实施方案中，可以借助于任何其它可用的手术器械除去患者的椎间盘。在另一个实施方案中，如果除去髓核，纤维环开口必须较小，且紧邻切口端。
在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的治疗物质。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的治疗物质。在另一个实施方案中，在移植的本发明的椎间盘置换装置中加入额外的治疗物质。
在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的可再吸收的培养基。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的组织生长或因子。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的组织分化因子。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的重组产生的形态发生蛋白。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的PDGF。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的TGF-β。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的EGF/TGF-α。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的IGF-I。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的FGF。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的水凝胶。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的不可再吸收的合成或天然聚合物。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的胶原。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的纤维蛋白。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的聚乙醇酸。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的聚四氟乙烯。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的抗生素。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的抗炎药物。在另一个实施方案中，在移植的髓核中加入额外的免疫抑制药物。
在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的可再吸收的培养基。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的组织生长或因子。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的组织分化因子。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的重组产生的形态发生蛋白。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的PDGF。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的TGF-β。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的EGF/TGF-α。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的IGF-I。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的FGF。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的水凝胶。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的不可再吸收的合成或天然聚合物。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的胶原。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的纤维蛋白。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的聚乙醇酸。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的聚四氟乙烯。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的抗生素。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的抗炎药物。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘支架中加入额外的免疫抑制药物。
在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的可再吸收的培养基。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的组织生长因子。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的组织分化因子。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的重组产生的形态发生蛋白。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的PDGF。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的TGF-β。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的EGF/TGF-α。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的IGF-I。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的FGF。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的水凝胶。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的不可再吸收的合成或天然聚合物。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的胶原。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的纤维蛋白。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的聚乙醇酸。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的聚四氟乙烯。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的抗生素。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的抗炎药物。在另一个实施方案中，在移植的椎间盘置换装置中加入额外的免疫抑制药物。
在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的可再吸收的培养基。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的组织生长因子。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的组织分化因子。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的重组产生的形态发生蛋白。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的PDGF。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的TGF-β。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的EGF/TGF-α。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的IGF-I。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的FGF。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的水凝胶。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的不可再吸收的合成或天然聚合物。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的胶原。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的纤维蛋白。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的聚乙醇酸。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的聚四氟乙烯。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的抗生素。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的抗炎药物。在另一个实施方案中，在本发明的移植的discosphere、椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或者其混合物中加入额外的免疫抑制药物。
在另一个实施方案中，将具有关键营养素的基质配制的椎间盘干细胞制备物(matrix formulated disc stem cell preparation)注射进椎间盘间隙中，使其经过一段时间后生长为椎间盘组织结构，从而恢复损坏的椎间盘(实施例4)。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含可再吸收的培养基。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含组织生长因子。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含组织分化因子。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含重组产生的形态发生蛋白。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含PDGF。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含TGF-β。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含EGF/TGF-α。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含IGF-I。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含FGF。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含水凝胶。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含不可再吸收的合成或天然聚合物。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含胶原。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含纤维蛋白。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含聚乙醇酸。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含聚四氟乙烯。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含抗炎药物。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含抗生素。在另一个实施方案中，基质配制的椎间盘干细胞制备物进一步包含免疫抑制药物。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有椎间盘脱出症的对象的方法，包括给予对象包含髓核细胞的人工椎间盘。在另一个实施方案中，所述对象是人。在另一个实施方案中，所述对象是家畜。在另一个实施方案中，所述动物是宠物。
在另一个实施方案中，本发明提供了给予对象人工椎间盘，包括为对象移植人工椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了包含来自一个供体的经处理的生物学组织的置换装置。在另一个实施方案中，本发明提供了包含来自是需要人工椎间盘的患者的一个供体的经处理的生物学组织的置换装置。在另一个实施方案中，本发明提供了包含经处理的生物学组织组合人工材料的置换装置。在另一个实施方案中，本发明提供了包含经处理的生物学组织组合基于塑料材料的置换装置。在另一个实施方案中，本发明提供了包含经处理的生物学组织组合陶瓷的置换装置。在另一个实施方案中，本发明提供了包含经处理的生物学组织组合金属的置换装置。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有椎间盘脱出症的对象的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有椎间盘退行性疾病(DDD)的对象的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗在一个腰椎(L3-S1)具有DDD的对象的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗不超过1度脊椎前移的对象的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗超过1度脊椎前移的对象的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗不超过1度脊椎前移的对象的方法，该患者在非手术治疗至少6该月后具有不缓解的疼痛。
在另一个实施方案中，本发明提供了给予对象恢复椎间盘高度的人工椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了给予对象可以减轻疼痛的人工椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了给予对象在植入之处恢复运动水平的人工椎间盘。在另一个实施方案中，本发明提供了在椎间盘切除术后进行后外侧部分纤维环切除术(annulotomy)。
实验详述部分
材料和方法
用于扩增椎间盘干细胞/祖细胞形成discosphere的基于甲基纤维素的培养基
扩增包含椎间盘干细胞/祖细胞的discosphere的基于甲基纤维素的培养基含有基本的DMEM/F12培养基，补加了2％甲基纤维素、10μg/ml胰岛素、40nM孕酮、200μM腐胺、100μg/ml运铁蛋白、60nM亚硒酸钠、10ng/ml重组FGK，以及10ng/ml重组EGF。
用于扩增包含椎间盘干细胞/祖细胞的discosphere的基于甲基纤维素的培养 基
用于扩增包含椎间盘干细胞/祖细胞discosphere的基于甲基纤维素的培养基含有基本的DMEM/F12培养基，补加了0.8％甲基纤维素、5μg/ml胰岛素、20nM孕酮、100μM腐胺、50μg/ml运铁蛋白和30nM亚硒酸钠。每3天加入10ng/ml FGF2和10ng/ml EGFb。
组织化学
苏木精-伊红染色
如下所述对得自通过实施例3所述方法产生的椎间盘的活检组织进行苏木精-伊红染色：将福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片(5μm)相继去石蜡及再水合。然后将玻片用Harris′苏木精染色10分钟、并在流动的自来水中洗涤及蓝化1分钟，在酸性乙醇(1％盐酸于70％乙醇中)中分化10秒钟，在流动的自来水中洗涤及蓝化5分钟，用伊红染色4分钟，最后在自来水中洗涤，通过梯度乙醇脱水及用二甲苯中透明。
von Kossa染色
如下所述对得自通过实施例3所述方法产生的椎间盘的活检组织进行von Kossa染色：将福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片(5μm)相继去石蜡及再水合。将切片与1％硝酸银溶液在置于紫外光下的透明玻璃科普林缸(coplin jar)中保温20分钟。然后将切片在蒸馏水中漂洗几次，随后用5％硫代硫酸钠处理5分钟以除去未反应的银。然后将切片在蒸馏水中漂洗几次，用核固红(nuclear fast red)复染5分钟。最后，将切片在蒸馏水中漂洗几次，通过梯度乙醇脱水及用二甲苯透明。
组织中I型胶原、II型胶原或者Ki67的免疫组织化学鉴别
如下所述在得自实施例3的椎间盘活检组织上进行I型胶原、II型胶原或者Ki67免疫组织化学染色。对福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片(5μm)相继脱蜡、再水合以及封闭内源过氧化物酶活性，之后在Trilogy unmaskingsolution(Cell Marque，Hot Springs AR)中在95℃抗原提取25分钟。将玻片用生物素封闭、血清封闭及使用山羊ABC Elite试剂盒(Vector Labs，Burlingame，CA)免疫染色。I型胶原的抗体(cat.#：63170，MP Biomedicals，Solon，OH)、II型胶原的抗体(cat.#：MAB 1330，Chemicon，Billerica，MA)或者Ki67的抗体(cat.#：MAB4062，Chemicon，Billerica，MA)以1∶100稀释度在室温使用1小时。阳性染色使用DAB(3，3′-Diaminobenzidene)检测。使用Bio-Rad共聚焦显微镜观测免疫反应性，并且将图像收集在计算机上以进行后续分析。
对软骨的Safranin O染色
这种方法用于检测福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片上的软骨。软骨被染成橙色至红色，核被染成黑色。背景被染成绿色。从两个原液中制备Weigert′s铁苏木精溶液。原液A：1g苏木精，100ml 95％乙醇。原液B：4ml 29％于水中氯化铁，95ml蒸馏水，1ml盐酸。混合等份原液获得Weigert′s铁苏木精溶液。
混合0.1g Safranin O，C.I.50240与100ml蒸馏水制备0.1％Safranin O溶液。然后将玻片脱蜡及与蒸馏水水合，随后用Weigert′s铁苏木精工作溶液染色10分钟。随后将玻片用流动的自来水漂洗10分钟，及用快绿(FCF)溶液染色5分钟，用1％乙酸溶液迅速漂洗10秒钟，以及在0.1％Safranin O溶液中染色5分钟。然后将玻片用95％乙醇、无水乙醇和二甲苯脱水及透明，每种试剂更换2次，每次2分钟。最后用树脂封固玻片。
实施例1：生长DISCOSPHERE的方法
将人髓核活检组织样品切成大小为大约2-3mm的碎片，移至50mlfalcon管中，该管中含有30ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，补加标准抗生素和抗真菌剂(标准青霉素/链霉素溶液(GIBCO BRL)，浓度1∶100)。
抽取PBS并将30ml Dulbecco′s改良的Eagle培养基与含有300U/ml胶原酶II溶液的F12(DMEM/F12)培养基加入该50ml试管中。
将该试管以水平位置置于摇床中，在37℃以100RPM保温2-3小时直至片段完全解离。
将该细胞悬浮液通过尼龙网过滤进50ml falcon管中，用fire-polished巴斯德移液管粉碎以形成单细胞悬浮液。在该点进行细胞计数仪确定细胞浓度。
然后将细胞悬浮液在室温以400g离心4分钟，随后通过抽吸除去上清。
将细胞重悬于DMEM/F12培养基中，该培养基中补加了胰岛素(10μg/ml)、孕酮(40nM)、腐胺(200μM)、运铁蛋白(100μg/ml)、亚硒酸钠(60nM)，终密度为120,000个细胞/ml。
向细胞悬浮液中加入等于先前获得的最终体积的在DMEM/F12培养基中的2％甲基纤维素溶液，并涡旋混合。
加入生长因子EGF和FGF2至终浓度为10ng/ml，再次混合。
最后，将细胞/培养基悬浮液以大约2ml/孔加入6孔平板中，每孔包含大约120,000个细胞，在37℃在5％CO2条件下保温。每个孔预先用抗粘附物质(例如聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯(#P-3932 Sigma)抗粘附涂层)根据厂商建议进行包被。
每3天加入一次生长因子。
大约2周后，在培养物中形成discosphere。
实施例2：扩增DISCOSPHERE细胞培养物的方法
将通过实施例1所述方法获得的discosphere通过在补加胶原酶II(300U/ml)的DMEM/F12培养基中在37℃保温进行解离。
将解离的细胞在6孔平板中扩增，通过使用如实施例1所述相同铺板和培养技术传代细胞进行。
实施例3：获得椎间盘胶原支架(纤维环)的方法
通过解剖取出死尸(兔尸体)椎间盘，椎骨终板保持完整。将该椎间盘样品在室温浸于4M异硫氰酸胍中24小时以除去椎间盘内生物材料。24小时后，椎间盘内生物材料液化。
抽吸该液体，将剩余的椎间盘支架用室温PBS洗涤3次。
在此阶段，椎间盘支架可以贮存在4℃PBS中直至一年。
实施例4：获得人工椎间盘的方法
将通过实施例3所述方法获得的椎间盘支架置于组织培养皿中，用具有10％FCS的DMEM/F12培养基洗涤3次，并在37℃在5％CO2条件下保温8小时。
从培养物中集合discosphere并收集在DMEM/F12中。然后用DMEM/F12洗涤该discosphere至没有甲基纤维素，将其悬浮于200μlDMEM/F12培养基中。
将悬浮的discosphere注射进在37℃、5％CO2条件下保温8小时的支架中心。
然后将该椎间盘组织培养容器填充DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2条件下保温。每3天更换一次培养基。
结果
从患者供体收集髓核细胞，如实施例1所述制备单细胞悬浮液。大约2周后，收集discosphere并准备注射进预处理的兔纤维环中。然后将这个含有椎间盘干细胞的椎间盘支架置于组织培养容器中培养3个月。每3天更换一次培养基。每天在每个椎间盘组织中施加向下压力以诱导生物力学调节的分化程序。
生物力学性质
椎间盘细胞使椎间盘的胞外基质成分下沉(laid down)，其转而形成适合椎间盘随后的生理学和生物力学功能的形状。在第3周，椎间盘组织开始证实对于压力的抗性，表明其成熟及获得可拉伸性质。在第10周，椎间盘组织证实最大厚度和压力抗性。
比较组织学
在培养3个月后，从培养物中取出椎间盘组织，用低温恒温器切片。使用选择的组织染色和免疫组织化学方法完成基本的组织学分析。
如图1示出(1组)，苏木精-伊红染色表明从椎间盘干细胞中生长的人椎间盘组织的大体结构和细胞形态学与得自健康兔椎间盘组织的椎间盘组织的结构和形态相似。此外，safranin染色(图1，2组)证实丰富的硫酸蛋白聚糖软骨基质由椎间盘干细胞分泌进胞外基质中，并且与分析时健康兔椎间盘组织相似。Von Kossa染色(图1，3组)证实在这个培养系统中体外椎间盘干细胞无任何成骨性分化。最后，用II型胶原(图2)和I型胶原(图3)进行的免疫组织化学染色证实分别为高和低表达，表明该椎间盘组织的成熟，且再次发现与健康对照组相似。
组织中缺乏增殖的证实
为了进一步表明该椎间盘组织是成熟的且因此不含有任何不成熟和/或增殖细胞，对该组织进行Ki67(增殖标记物)免疫染色。如图4所示，在对照组织或者在从人椎间盘干细胞中生长的椎间盘组织中均无增殖细胞。

Claims (55)

1.分离的椎间盘干细胞群。
2.权利要求1的分离的椎间盘干细胞群，其中所述椎间盘干细胞群是人椎间盘干细胞群。
3.权利要求1的分离的椎间盘干细胞群，其中所述椎间盘干细胞群得自对象的髓核。
4.分离椎间盘干细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将髓核细胞铺板于无血清培养基中；
(b)产生包含髓核细胞的discosphere；
从而分离椎间盘干细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述discosphere包含人髓核细胞。
6.权利要求4的方法，其中产生所述discosphere的步骤包括使髓核细胞在无血清培养基中的培养物生长的步骤。
7.权利要求6的方法，其中所述培养基进一步包含FGF2、EGF、SCF、IL-6、IL-2、TGF-β、LIF，或者其组合。
8.权利要求6的方法，其中使所述髓核细胞培养物生长的步骤包括将髓核细胞以低于1×106个细胞/ml的密度铺板。
9.权利要求6的方法，其中使所述髓核培养物生长的步骤包括使未附着的髓核细胞生长的步骤。
10.包含富集的椎间盘干细胞群的组合物。
11.权利要求10的组合物，其中所述椎间盘干细胞是人椎间盘干细胞。
12.权利要求10的组合物，其中所述椎间盘干细胞得自对象的髓核。
13.权利要求10的组合物，其中所述组合物进一步包含椎间盘祖细胞。
14.权利要求10的组合物，其中所述组合物进一步包含培养基。
15.权利要求14的组合物，其中所述培养基是无血清培养基。
16.权利要求15的组合物，其中所述培养基进一步包含FGF2、EGF、SCF、IL-6、IL-2、TGF-β、LIF，或者其组合。
17.分离的discosphere。
18.权利要求17的分离的discosphere，其中所述discosphere包含椎间盘干细胞。
19.权利要求17的分离的discosphere，其中所述discosphere包含椎间盘祖细胞。
20.权利要求17的分离的discosphere，其中所述discosphere是人discosphere。
21.产生discosphere的方法，包括使髓核细胞在无血清培养基中的培养物生长的步骤，从而产生discosphere。
22.权利要求21的组合物，其中所述髓核细胞是人髓核细胞。
23.权利要求21的组合物，其中所述discosphere包含源自单一椎间盘干细胞的细胞。
24.权利要求21的组合物，其中所述discosphere包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞，或者其混合物。
25.权利要求21的方法，其中所述培养基进一步包含FGF2、EGF、SCF、IL-6、IL-2、TGF-β、LIF，或者其组合。
26.权利要求21的方法，其中使所述髓核细胞的培养物生长的步骤包括将所述髓核细胞以低于1×106个细胞/ml的密度铺板的步骤。
27.权利要求24的方法，其中使所述髓核细胞的培养物生长的步骤包括使未附着的髓核细胞生长。
28.包含discosphere的组合物。
29.权利要求28的组合物，其中所述discosphere包含髓核细胞。
30.权利要求28的组合物，其中所述髓核细胞是人髓核细胞。
31.权利要求28的组合物，其中所述discosphere包含源自单一椎间盘干细胞的细胞。
32.权利要求28的组合物，其中所述discosphere包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞，或者其混合物。
33.权利要求28的组合物，其中所述组合物进一步包含培养基。
34.权利要求33的组合物，其中所述培养基是无血清培养基。
35.权利要求34的组合物，其中所述培养基进一步包含FGF2、EGF、SCF、IL-6、IL-2、TGF-β、LIF，或者其组合。
36.人工椎间盘，其包含髓核细胞。
37.权利要求36的人工椎间盘，其中所述椎间盘置换装置进一步包含椎间盘支架。
38.权利要求43的如人工椎间盘，其中所述椎间盘支架是位于椎骨间的椎间盘支架。
39.权利要求37的人工椎间盘，其中所述椎间盘支架包含胶原。
40.权利要求36的人工椎间盘，其中所述髓核细胞是人髓核细胞。
41.权利要求36的人工椎间盘，其中所述髓核细胞包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞，或者其混合物。
42.权利要求36的人工椎间盘，其中所述椎间盘置换装置进一步包含培养基。
43.产生人工椎间盘的方法，包括使discosphere在椎间盘支架中生长的步骤，从而产生脊椎椎间盘置换装置。
44.权利要求43的方法，其中使所述discosphere在所述椎间盘支架中生长的步骤包括将所述discosphere注射进所述椎间盘支架中的步骤。
45.权利要求44的方法，其中所述注射是注射至所述椎间盘支架的中心。
46.权利要求43的方法，其中所述椎间盘支架是椎间盘支架。
47.权利要求43的方法，其中所述椎间盘支架包含胶原。
48.权利要求43的方法，其中所述discosphere包含得自对象的髓核细胞。
49.权利要求43的方法，其中所述discosphere包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞，或者其混合物。
50.治疗患有椎间盘脱出症对象的方法，包括给予所述对象包含髓核细胞的人工椎间盘，从而治疗患有椎间盘脱出症的对象。
51.权利要求50的方法，其中所述椎间盘置换装置包含椎间盘支架。
52.权利要求50的方法，其中所述椎间盘支架是椎间盘支架。
53.权利要求50的方法，其中所述椎间盘支架包含胶原。
54.权利要求50的方法，其中所述髓核细胞是人髓核细胞。
55.权利要求50的方法，其中所述髓核细胞包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞，或者其组合物。
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