CN102037008A - 蛋白酶稳定化的、酰化胰岛素类似物 - Google Patents
蛋白酶稳定化的、酰化胰岛素类似物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102037008A CN102037008A CN2009801184847A CN200980118484A CN102037008A CN 102037008 A CN102037008 A CN 102037008A CN 2009801184847 A CN2009801184847 A CN 2009801184847A CN 200980118484 A CN200980118484 A CN 200980118484A CN 102037008 A CN102037008 A CN 102037008A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glu
- acyls
- actrapid monotard
- oeg
- desb30 actrapid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 0 CC(CC[C@@](C(OC(C)(C)*)=O)NC(CCC=CCCCCC*CCCCCCCCC(OC1(CI)*C1)=O)=O)N(C(CC1)=O)C1=O Chemical compound CC(CC[C@@](C(OC(C)(C)*)=O)NC(CCC=CCCCCC*CCCCCCCCC(OC1(CI)*C1)=O)=O)N(C(CC1)=O)C1=O 0.000 description 8
- KXNUEUIAIZGKNB-VXXSRDBJSA-N C=C([C@H](CCC(NCCOCCOCC(NCCOCCOCC(NCCCC[C@@H](C1(NC1)O)NP)=O)=O)=O)NCCCCCCCC(O)=O)O Chemical compound C=C([C@H](CCC(NCCOCCOCC(NCCOCCOCC(NCCCC[C@@H](C1(NC1)O)NP)=O)=O)=O)NCCCCCCCC(O)=O)O KXNUEUIAIZGKNB-VXXSRDBJSA-N 0.000 description 1
- YQZVQKYXWPIKIX-UHFFFAOYSA-N NCCOCCOCC(NCCOCCOCC(O)=O)=O Chemical compound NCCOCCOCC(NCCOCCOCC(O)=O)=O YQZVQKYXWPIKIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
对蛋白酶表现出抗性的新型酰化胰岛素类似物可有效地通过肺部或口服给药。该胰岛素类似物包含B25H和A14E或A14H。
Description
发明领域
本发明涉及对蛋白酶显示抗性的新型酰化胰岛素类似物,制备这样的胰岛素类似物的方法,包含本发明的胰岛素类似物的胰岛素制剂,和使用这些胰岛素类似物来治疗糖尿病的方法。
发明背景
糖尿病是代谢病,在这种病中,使用葡萄糖的能力部分或完全丧失。在所有人中大约5%的人患有糖尿病,并且这种疾病接近流行比例。自从在1920年代引入胰岛素以来,人们为了改进糖尿病的治疗而进行了不断的努力。由于患有糖尿病的人需要在几十年内进行长期治疗,安全、方便和生活质量得到改进的胰岛素制剂是主要需要。
到目前为止,口服途径是最广泛使用的给药途径,并且通常能够被患者很好地接受,尤其是长期治疗的患者。然而,由于一些障碍,例如,在胃肠(GI)道和肠粘膜中的酶降解、药物射流泵、从肠粘膜中吸收不充分和发生变化、以及在肝中的首过代谢,治疗肽或蛋白的给药常常局限于肠胃外途径,而不是优选的口服途径。
通常,胰岛素制剂是通过皮下注射给药的。然而,由于患者的依从性、安全性和便利性,通过其它途径例如口服或肺部给药是有利的。一些可商购的胰岛素制剂的特点在于快速起作用,其它制剂起效相对缓慢,但具有或多或少的延长作用。对于糖尿病患者非常重要的是,市场上存在大量的具有不同作用时限(作用特征)的胰岛素。简而言之,胰岛素可分为短效、中效或长效。
WO 2008/034881涉及某些胰岛素类似物,其中至少两个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代,所述胰岛素类似物不是酰化的。
EP 2008/060733和EP 2008/060733涉及某些酰化胰岛素类似物,其中所述胰岛素类似物包含一延长部分,其一氨基酸或肽残基的C末端与A21氨基酸相连。
EP 2008/060734涉及某些酰化胰岛素,其中酰基部分与母体胰岛素相连接且其中所述酰基部分包括含亚烷基二醇重复单元的氨基酸。
发明方面
本发明的一个方面涉及提供胰岛素类似物,当口服给药时,其可以得到令人满意的血糖水平控制。
本发明的另一个方面涉及提供胰岛素类似物,当口服给药时,其可以延迟降低葡萄糖水平。
本发明的另一个方面涉及提供基本胰岛素类似物,当口服给药时,其可以延迟降低葡萄糖水平。
本发明的另一个方面涉及提供基本胰岛素类似物,当口服给药时,其在每日三次给药后可以得到令人满意的血糖水平控制。
本发明的另一个方面涉及提供基本胰岛素类似物,当口服给药时,其在每日两次给药后可以得到令人满意的血糖水平控制。
本发明的另一个方面涉及提供基本胰岛素类似物,当口服给药时,其在每日一次给药后可以得到令人满意的血糖水平控制。
本发明的另一个方面涉及提供基本胰岛素类似物,其为亲水的。
本发明的另一个方面涉及提供基本胰岛素类似物,其比人胰岛素更亲水。
本发明的另一个方面涉及提供基本胰岛素类似物,正如通过本文中描述的相对疏水性(k’rel)测定的,其不如人胰岛素疏水。
本发明的另一方面涉及基本胰岛素类似物的提供,正如通过本文中所述的相对疏水性(k’rel)所测定的,所述基本胰岛素类似物不如用相同酰基部分酰化的相似的非蛋白酶稳定化的母体胰岛素疏水。
本发明基本胰岛素类似物的K’rel优选少于5,更优选少于3,更优选少于2,更优选少于1,更优选少于0.8,更优选少于0.6,更优选少于0.5,更优选少于0.4,更优选少于0.3,更优选少于0.2,更优选少于0.1。
本发明的另一方面涉及提供基本胰岛素类似物,当口服给药时,其具有令人满意的生物利用度。与相同剂量的没有蛋白酶稳定化突变的相似的酰化胰岛素的生物利用度相比,本发明优选化合物的生物利用度比所述非蛋白酶稳定化的比较物至少高10%,优选高20%,优选高25%,优选高30%,优选高35%,优选高40%,优选高45%,优选高50%,优选高55%,优选高60%,优选高65%,优选高70%,优选高80%,优选高90%,优选高100%,优选高超过100%。
本发明的另一方面涉及提供基本胰岛素类似物,当口服给药时,其具有令人满意的生物利用度。本发明优选化合物的生物利用度(相对静脉给药)为至少0.3%,优选>0.5%,优选>1%,优选>1.5%,优选>2%,优选>2.5%,优选>3%,优选>3.5%,优选>4%,优选>5%,优选>6%,优选>7%,优选>8%,优选>9%,优选>10%。
本发明的另一方面涉及提供基本胰岛素类似物,当通过静脉输液给药时,其具有令人满意的功效。与人胰岛素的功效相比,本发明优选的蛋白酶稳定化的胰岛素类似物的功效优选>5%,优选>10%,优选>20%,优选>30%,优选>40%,优选>50%,优选>75%和优选>100%。
本发明的另一方面涉及提供胰岛素类似物,当通过肺部给药时,其可得到令人满意的血糖水平控制。
本发明的另一方面涉及提供胰岛素类似物,当通过肺部给药时,其可得到令人满意的血糖水平控制,同时起效相对缓慢,和/或具有或多或少的延长作用。
本发明的另一方面涉及提供胰岛素类似物,其在肺部给药后具有令人满意的长效作用。与相同剂量的没有蛋白酶稳定化突变的相似的酰化胰岛素相比,本发明优选化合物的作用时间比比较物长至少10%,优选长20%,优选长25%,优选长30%,优选长35%,优选长40%,优选长45%,优选长50%,优选长55%,优选长60%,优选长65%,优选长70%,优选长80%,优选长90%,优选长100%,优选长超过100%。作用时间可通过抑制血糖的时间,或通过测定相关药物动力学特性,例如t1/2或MRT(平均停留时间)来测定。
本发明的另一方面涉及提供胰岛素类似物,其具有令人满意的肺部生物利用度。与人胰岛素的生物利用度相比,或与相同剂量的没有蛋白酶稳定化突变的相似酰化胰岛素相比,本发明优选化合物的生物利用度比比较物高至少10%,优选高20%,优选高25%,优选高30%,优选高35%,优选高40%,优选高45%,优选高50%,优选高55%,优选高60%,优选高65%,优选高70%,优选高80%,优选高90%,优选高100%,优选高超过100%。
本发明的另一方面涉及提供胰岛素类似物,其具有提高的表观体内功效。
本发明的另一方面涉及提供具有口服生物利用度的长效胰岛素。
本发明的另一方面涉及提供胰岛素类似物,与人胰岛素的稳定性相比,其具有提高的蛋白水解稳定性。与人胰岛素相比,本发明优选化合物的蛋白水解稳定性比比较物至少2倍地更稳定,优选3倍地更稳定,优选4倍地更稳定,优选5倍地更稳定,优选6倍地更稳定,优选7倍地更稳定,优选8倍地更稳定,优选9倍地更稳定,优选10倍地更稳定,优选12倍地更稳定,优选14倍地更稳定,优选16倍地更稳定,优选18倍地更稳定,优选20倍地更稳定,优选25倍地更稳定,优选超过25倍地更稳定。蛋白水解稳定性可通过将所述胰岛素暴露于蛋白水解酶(的混合物),例如,本文中所述肠道酶提取物来测定。
本发明的目的是克服或或改善现有技术的至少一个缺点,或提供有用的替代品。
定义
本文中,术语胰岛素包括天然存在的胰岛素,例如人胰岛素,以及其胰岛素类似物。人胰岛素由两个多肽链组成,所述两个多肽链被称为A和B链,其分别包含21个和30个氨基酸残基且其通过两个胱氨酸二硫键连接。
本文中,术语氨基酸残基包括从氨基上除去氢原子和/或从羧基上除去羟基和/或从巯基上除去氢原子的氨基酸。不严密地说,氨基酸残基可以被称为氨基酸。
本文中,疏水性的氨基酸应理解为天然存在的氨基酸色氨酸(Trp,W),苯丙氨酸(Phe,F),缬氨酸(Val,V),异亮氨酸(Ile,I),亮氨酸(Leu,L)和酪氨酸(Tyr,Y)(在括号中是三个字母和一个字母缩写)。
本文中,亲水性的氨基酸应理解为天然氨基酸,其不是按照上面定义的疏水性氨基酸。在一个实施方案中,本发明的亲水性氨基酸选自:谷氨酸(Glu,E),天冬氨酸(Asp,D),组氨酸(His,H),谷氨酰胺(Gln,Q),天冬酰胺(Asn,N),丝氨酸(Ser,S),苏氨酸(Thr,T),脯氨酸(Pro,P),甘氨酸(Gly,g),赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R)。在另一实施方案中,本发明的亲水性氨基酸选自:谷氨酸(Glu,E),天冬氨酸(Asp,D),组氨酸(His,H),谷氨酰胺(Gln,Q),天冬酰胺(Asn,N),赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R)。
本文中,术语胰岛素类似物包括多肽,其通过去除和/或取代(置换)天然胰岛素中存在的一个或多个氨基酸残基和/或通过添加一个或多个氨基酸残基,具有形式上可以源自于天然存在胰岛素例如人胰岛素结构的分子结构。添加和/或取代的氨基酸残基可以是可编码的氨基酸残基或其它天然存在的氨基酸残基或纯粹合成的氨基酸残基。在优选的实施方案中,与人胰岛素相比,所述胰岛素类似物具有两个或更多个突变。
本文中,术语蛋白酶稳定化的胰岛素是指没有附加酰基部分的胰岛素。所述蛋白酶稳定化的胰岛素对抗蛋白酶的降解作用具有改善的稳定性。
本文中,术语母体胰岛素是指没有附加酰基部分和没有突变来改善针对蛋白酶降解作用的稳定性的胰岛素。相对于人胰岛素,所述母体胰岛素任选具有突变。由此,母体胰岛素还是上面定义的胰岛素类似物。本文中,术语母体胰岛素和非蛋白酶稳定化的胰岛素包括相同化合物。
本文中,术语突变包括氨基酸序列的任何变化(用可编码的氨基酸进行取代和插入,以及缺失)。
本文中,术语人胰岛素的A链的类似物和B链的类似物分别包括人胰岛素的A和B链,其分别相对于人胰岛素的A和B链,分别具有A和B氨基酸链的一个或多个取代、缺失和/或延长(添加)。
本文中,术语例如A1、A2、A3等等分别表明胰岛素A链中的位置1、2和3(从N端计算)。类似地,术语例如B1、B2、B3等等分别表明胰岛素B链中的位置1、2和3(从N端计算)。使用氨基酸的一个字母代码,术语例如A21A、A21G和A21Q表示在A21位的氨基酸分别是A、G和Q。使用氨基酸的三个字母代码,相应的表达分别是AlaA21、GlyA21和GlnA21。
本文中,术语A(0)或B(0)表示分别在A或B链中分别与A1或B1位相邻的N-末端位置。术语A(-1)或B(-1)分别表示第一个氨基酸N-末端相对于A(0)或B(0)的位置。因此,A(-2)和B(-2)分别表示相对于A(-1)和B(-1)的N-末端位置,A(-3)和B(-3)分别表示相对于A(-2)和B(-2)的N-末端位置,等等。
本文中,术语例如desB29和desB30分别表示缺乏B29或B30氨基酸残基的胰岛素类似物。
本文中,术语“快速起作用的胰岛素”包括比正常或普通的人胰岛素起效更快的胰岛素。
本文中,术语“长效胰岛素”或术语“基本胰岛素”包括具有比正常或普通的人胰岛素更长的作用时间的胰岛素。优选地,时间-作用超过5或8小时,特别地为至少9小时。优选地,基本胰岛素具有至少10小时的时间-作用。因此,基本胰岛素可以具有范围为大约8至24小时,优选在大约9至大约15小时的时间-作用。
对胰岛素类似物、胰岛素和A和B链中的位置加以编号,以使母体化合物是具有用于它的编号的人胰岛素。
本文中,术语“酰化的胰岛素”包括通过连接基将一个或多个酰基部分与蛋白酶稳定化的胰岛素连接的胰岛素的改型。
具有胰岛素活性的酰化的胰岛素是指:适当给药之后(例如,静脉内或皮下给药),具有降低哺乳动物血糖的能力,其在合适的动物模型中测定,动物模型可以是例如大鼠、兔子或猪模型,或具有胰岛素受体结合亲和性的酰化的胰岛素。
本文中,术语烷基包括饱和、支链或直链烃基。
本文中,术语烷氧基包括自由基“烷基-O-”。代表性的实例是甲氧基,乙氧基,丙氧基(例如,1-丙氧基和2-丙氧基),丁氧基(例如,1-丁氧基,2-丁氧基和2-甲基-2-丙氧基),戊氧基(1-戊氧基和2-戊氧基),己氧基(1-己氧基和3-己氧基),等等。
本文中,术语亚烷基包括具有1至12个碳原子的饱和、支链或直链二价烃基。代表性的实例包括但不局限于:亚甲基;1,2-亚乙基;1,3-亚丙基;1,2-亚丙基;1,3-亚丁基;1,4-亚丁基;1,4-亚戊基;1,5-亚戊基;1,5-亚己基;1,6-亚己基;等等。
本文中,术语“中性直链氨基酸”包括。中性直链氨基酸的非限定性实例为。
本文中,术语“环状氨基酸”包括。环状氨基酸的非限定性实例为。
本文中,术语“酸性氨基酸”包括。酸性氨基酸的非限定性实例为。
本文中,术语“脂肪酸”包括直链或支链脂族羧酸,其具有至少两个碳原子并为饱和或不饱和的。脂肪酸的非限定实例为肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。
本文中,术语“脂肪族二酸”包括直链或支链脂族二羧酸,其具有至少两个碳原子并为饱和或不饱和的。脂肪族二酸的非限定实例为琥珀酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。
本文中,胰岛素的命名按照以下原则进行:根据相对人胰岛素的突变和修饰(酰化)给予名称。就酰基部分的命名而言,按照IUPAC命名法进行命名,其它情况下按照肽命名法。例如,命名以下酰基部分:
可例如为“十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG”或“17-羧基十七烷酰-γGlu-OEG-OEG”,其中:
OEG是氨基酸NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H的简化符号,
γGlu是氨基酸γ谷氨酸的简化符号。
氨基酸的其它简化符号有,例如:
PEG3是NH2((CH2)2O)4CH2CH2CO2H
PEG7是NH2((CH2)2O)8CH2CH2CO2H
例如,实施例9的胰岛素(具有下面给出的序列/结构)命名为“A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素”,以指出:人胰岛素中的A14位的氨基酸Y已突变成E,人胰岛素中B25的氨基酸F已突变成H,人胰岛素中B29位的氨基酸K通过在B29的赖氨酸残基中的ε氮(表示为Nε)上被十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG残基酰化而被修饰,和人胰岛素中B30位的氨基酸T缺失。下式中的星号表示与人胰岛素相比,提到的残基是不同的(即经过突变)。本申请中,给出了本发明优选胰岛素的式和名称。
本文中,术语“化学稳定性”和“高度化学稳定性”是指,从化学上,本发明的胰岛素在所需制剂中足够稳定。也就是,仅形成不损害最终药物产物的保质期的量的化学降解产物。化学降解产物包括脱酰胺产物、异天冬氨酸酯形成、二聚体形成、外消旋化产物、从脱水过程等产生的产物。化学稳定性可通过老化样品或制剂的HPLC分析测定。
本文中,术语“高度物理稳定性”包括原纤化倾向小于人胰岛素原纤化倾向的50%。原纤化可以通过在给定条件下原纤维开始形成之前的滞后时间来描述。
具有胰岛素受体和IGF-1受体亲和性的多肽是在合适结合测定中能够与胰岛素受体和人IGF-1受体相互作用的多肽。这种受体测定在本领域是众所周知的,并且进一步在实施例中描述。本发明的酰化胰岛素不会与IGF-1受体结合,或与所述受体具有相当低的亲和性。更确切地说,本发明的酰化胰岛素对IGF-1受体的亲和性基本上与人胰岛素的亲和性相同或更小。
本文中所用的术语“药学上可接受的”是指适合于正常药物应用,即不会在患者体内产生严重的不利事件。
本文使用的术语治疗和医冶是指为了抵御疾病、障碍或病症而对患者进行的处理和护理。该术语意在包括:延迟疾病、障碍或病症的进展,减轻或缓和症状和并发症,和/或治愈或消除疾病、障碍或病症。待治疗的患者优选哺乳动物,尤其是人。
本文使用的术语治疗疾病是指处理和护理已经形成疾病、障碍或病症的患者。治疗的目的是抵御疾病、病症或障碍。治疗包括给予活性化合物,以消除或控制疾病、病症或障碍,以及减轻与疾病、病症或障碍有关的症状或并发症。
本文使用的术语疾病的预防定义为:在疾病的临床发作之前,处理和护理处于形成疾病危险之中的个体。预防的目的是抵御疾病、病症或障碍的进展,并且包括给予活性化合物,以预防或延迟症状或并发症的发作,和预防或延迟相关疾病、病症或障碍的进展。
本文使用的术语有效量是指:与不治疗相比较,有效治疗患者的充足剂量。
POT是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)磷酸丙糖异构酶基因,TPI1是酿酒酵母(S.cerevisiae)磷酸丙糖异构酶基因。
前导序列是指由前肽原(pre-peptide)(信号肽)和前肽(pro-peptide)组成的氨基酸序列。
术语信号肽应理解为是指在蛋白的前体物形式上以N端序列存在的前肽。信号肽的功能是使异源蛋白质便于迁移到内质网中。在该过程期间,信号肽通常被剪切掉。信号肽可以是与制备蛋白的酵母有机体异源或同源的。可以与本发明的DNA构建体一起使用的许多信号肽包括:酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽或任何功能性的类似物(Egel-Mitani等人(1990)YEAST 6:127-137和US 5,726,038)和MFα1基因的α-因子信号(Thorner(1981),The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母的分子生物学),Strathern等人编辑,pp 143-180,Cold Spring Harbor Laboratory,NY和US 4,870,00)。
本文中,术语“前肽(pro-peptide)”包括多肽序列,其功能是使表达的多肽从内质网中直接进到高尔基体中,并且进一步进入分泌小泡中,以分泌到培养基中(即,多肽穿过细胞壁或至少通过细胞膜输出到酵母细胞的周质间隙中)。前肽可以是酵母α-因子前肽,参阅US 4,546,082和4,870,008。或者,前肽可以是合成前肽,也就是说,在自然界中未发现的前肽。合适的合成前肽是在US5,395,922、5,795,746、5,162,498和WO 98/32867中公开的那些前肽。前肽优选包含在C端的肽链内切酶加工位点,例如Lys-Arg序列,或其任何功能性的类似物。
除非明确表示,否则本文提到的氨基酸是L-氨基酸。进一步的,肽的氨基酸序列的左和右端分别是N-和C-端,除非另作说明。
发明概述
已经发现,对蛋白降解作用稳定(通过具体突变)和在B29-赖氨酸处酰化的胰岛素是有效的和作用延长的,并且作为可以通过肺部或口服给药的延长的胰岛素具有很高的潜力。酰化使得结合到血清白蛋白,进而延长。此外,与对蛋白降解作用不稳定的类似的酰化胰岛素相比,本发明的酰化胰岛素显示了大大降低的胰岛素受体亲和性。本发明白蛋白结合胰岛素的胰岛素受体亲和力降低归功于循环中酰化胰岛素的延长,因为胰岛素内化并在受体激活后降解。因此,本发明胰岛素的清除率降低。胰岛素受体亲和力的降低或许不会导致功效损失,例如,如在本文中描述的高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验中所测试的。因此,高白蛋白结合亲和力和低胰岛素受体亲和力的结合有利于获得长的胰岛素(基本胰岛素)作用时间。此外,口服之后,这些酰化胰岛素具有比类似的已知酰化胰岛素(其对蛋白降解作用不稳定)更高程度的生物利用度。因此,这些酰化胰岛素类似物对于口服给药具有价值。类似地,肺部给药之后,这些酰化蛋白酶稳定化的胰岛素显示了比类似的已知酰化胰岛素(其对蛋白降解作用不稳定)更高的表观功效和/或生物利用度。此外,当通过肺部给予哺乳动物时,这些酰化蛋白酶稳定化的胰岛素显示了延长的时间-作用特性。因此,这些酰化的胰岛素类似物对于肺部给药具有价值。
对蛋白降解作用稳定的上述胰岛素在本文中称为蛋白酶稳定化的胰岛素。
正如说明书详述部分所解释的,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素分子的有限量的天然氨基酸残基被其它氨基酸残基取代。
在一个实施方案中,本发明涉及酰化的胰岛素,其中蛋白酶稳定化的胰岛素类似物在一个或多个下列的缺失或取代方面与人胰岛素不同:Q在A18位,A、G或Q在A21位,G或Q在B1位或在B1位没有氨基酸残基,Q、S或T在B3位或在B3位没有氨基酸残基,Q在B13位,在B27位没有氨基酸残基,D、E或R在B28位,以及在B30位没有氨基酸。
另一方面,本发明涉及包含本发明的酰化胰岛素和合适佐剂和添加剂的药物制剂,佐剂和添加剂例如一或多种适合于稳定、保藏或等渗压的试剂,例如,锌离子、苯酚、甲酚、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、甘油或甘露糖醇。存在于制剂中的锌含量可以是每6个胰岛素分子0-大约6个锌原子。药物制剂的pH值可以在大约4和大约8.5之间,在大约4和大约5之间,或在大约6.5和大约7.5之间。
在另一实施方案中,本发明涉及酰化胰岛素作为药物用于降低哺乳动物血糖水平,特别用于治疗糖尿病的用途。
另一方面,本发明涉及酰化胰岛素用于制备药物制剂的用途,该药物制剂用于降低哺乳动物血糖水平,特别用于治疗糖尿病。
另一方面,本发明涉及降低哺乳动物血糖水平的方法,其通过给予需要这种治疗的患者治疗活性剂量的本发明的酰化胰岛素。
在本发明的另一方面,酰化的胰岛素与一种或多种其它活性物质以任何合适比例联合给药。这种其它活性剂可以选自人胰岛素,快速作用的胰岛素类似物,抗糖尿病药,抗高血脂药,抗肥胖剂,抗高血压药和用于治疗源于糖尿病或与其有关的并发症的药剂。
在一个实施方案中,所述两种活性组分以混合药物制剂形式给予。在另一个实施方案中,所述两种组分可以同时或依次地单独给药。
在一个实施方案中,本发明的酰化胰岛素可以与快速作用的人胰岛素或人胰岛素类似物一起给药。这种快速作用的胰岛素类似物可以是如下这种:其中在B28位的氨基酸残基是Asp、Lys、Leu、Val或Ala,和在B29位的氨基酸残基是Lys或Pro,des(B28-B30)人胰岛素,des(B27)人胰岛素或des(B30)人胰岛素,和其中在B3位的氨基酸残基是Lys和在B29位的氨基酸残基是Glu或Asp的类似物。本发明的酰化胰岛素和快速起作用的人胰岛素或人胰岛素类似物可以下列比例混合:大约90%的酰化胰岛素与大约10%的快速起作用的人胰岛素或人胰岛素类似物;优选大约70%的酰化胰岛素与大约30%的快速起作用的人胰岛素或人胰岛素类似物,且更优选大约50%的酰化胰岛素与大约50%的快速起作用的人胰岛素或人胰岛素类似物(%是重量百分数)。
本发明的酰化胰岛素还可以与抗糖尿病药一起用于联合治疗。
抗糖尿病药包括:胰岛素,在WO 98/08871、WO 99/43706、US 5424286 WO00/09666、WO2006/097537、PCT/EP2008/061755和PCT/EP2008/061830中描述的GLP-1(1-37)(胰高血糖素样肽-1),GLP-2,exendin-4(1-39),其促胰岛素分泌片段,其促胰岛素分泌类似物和其促胰岛素分泌衍生物。GLP-1(1-37)的促胰岛素分泌片段是促胰岛素分泌肽,其整个序列可以在GLP-1(1-37)的序列中得到,并且缺失至少一个端部氨基酸。
本发明的酰化胰岛素也可以与口服抗糖尿病药例如噻唑烷二酮、二甲双胍及其它用于口服治疗的II型糖尿病药物制剂一起用于联合治疗。
此外,本发明的酰化胰岛素可以与一种或多种抗肥胖药剂或食欲调节剂联合给药。
在一个实施方案中,本发明涉及包含本发明的酰化胰岛素和合适佐剂和添加剂的肺部给药的药物制剂,所述佐剂和添加剂例如一种或多种适合于稳定化、保藏或等渗压的试剂,例如,锌离子、苯酚、甲酚、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇或甘露糖醇。
应该理解,认为酰化胰岛素与饮食和/或锻炼、一种或多种上述化合物和任选一种或多种其它活性物质的任何合适组合在本发明范围之内。
优选实施方案的说明
胰岛素的稳定性和溶解性是现行胰岛素疗法的重要的基础方面。通过提供稳定的、酰化的胰岛素类似物,本发明致力于解决这些问题,其中酰化可以降低分子柔性,并同时降低原纤化倾向和限度或改变pH沉淀区域。
本发明的酰化胰岛素尤其可用于肺部或口服给药,这是由于它们与例如人胰岛素和酰化的人胰岛素相比具有比较高的生物利用率。此外,酰化的胰岛素具有延长的胰岛素活性。
如上所述,对蛋白降解作用稳定的胰岛素在本文中称为蛋白酶稳定化的胰岛素。本发明的酰化胰岛素是本文所描述的已酰化的所述蛋白酶稳定化的胰岛素。
所述蛋白酶稳定化的胰岛素源自于本文中称为母体胰岛素或非蛋白酶稳定化的胰岛素的胰岛素化合物。
在一个实施方案中,母体胰岛素选自:a)人胰岛素;b)人胰岛素的胰岛素类似物,其中在B28位的氨基酸残基是Pro、Asp、Lys、Leu、Val或Ala,在B29位的氨基酸残基是Lys或Pro,和任选地,在B30位的氨基酸残基缺失;c)胰岛素类似物,其是des(B28-B30)人胰岛素,des(B27)人胰岛素或des(B30)人胰岛素;d)人胰岛素的胰岛素类似物,其中在B3位的氨基酸残基是Lys,和在B29位的氨基酸残基是Glu或Asp;e)人胰岛素的胰岛素类似物,其中在A21位的氨基酸残基是Gly,且其中胰岛素类似物在B链的C端进一步用两个精氨酸残基延长;f)胰岛素衍生物,其中B30位的氨基酸残基被苏氨酸甲酯取代;和g)胰岛素衍生物,其中des(B30)人胰岛素的B29位的赖氨酸的Nε位上连接有十四烷酰基链。这些中的每一个是具体实施方案。
在另一个实施方案中,母体胰岛素选自:人胰岛素;desB30人胰岛素;AspB28人胰岛素;AspB28,DesB30人胰岛素;LysB3,GluB29人胰岛素;LysB28,ProB29人胰岛素;GlyA21,ArgB31,ArgB32人胰岛素;和desB30,ArgB31,ArgB32人胰岛素。
更具体而言,蛋白酶稳定化的胰岛素是相对于母体胰岛素A和/或B链具有两个或更多个突变的胰岛素分子。已经令人惊奇地发现,在胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点内或其紧密相邻处用亲水性的氨基酸取代两个或多个疏水性的氨基酸,可以获得比母体胰岛素蛋白水解更稳定的胰岛素类似物(即,蛋白酶稳定化的胰岛素)。在一个宽范围的方面,蛋白酶稳定化的胰岛素是相对于母体胰岛素其中至少两个疏水性的氨基酸已经被亲水性的氨基酸取代的胰岛素类似物,其中取代在母体胰岛素的两个或更多个蛋白酶裂解位点内或其紧密相邻处,且其中这种胰岛素类似物任选还包含一个或多个其它突变。
在另一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素是胰岛素类似物,其中:
●在A12位的氨基酸是Glu或Asp,和/或在A13位的氨基酸是His、Asn、Glu或Asp,和/或在A14位的氨基酸是Asn、Gln、Glu、Arg、Asp、Gly或His,和/或在A15位的氨基酸是Glu或Asp;和
●在B24位的氨基酸是His,和/或在B25位的氨基酸是His,和/或在B26位的氨基酸是His、Gly、Asp或Thr,和/或在B27位的氨基酸是His、Glu、Lys、Gly或Arg,和/或在B28位的氨基酸是His、Gly或Asp;和
其任选还包含一个或多个其它突变。
在另一实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素是类似物,其包含与B27中的突变结合的B25H或B25N突变,任选与其它突变结合。
在另一实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素是类似物,其包含与B27中的突变结合的B25H或B25N突变,任选与其它突变结合。所述B27中的突变可为,例如Glu或Asp。
这些包含B25和B27突变的蛋白酶稳定化的酰化胰岛素类似物包含具有有利特性。
在另一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素是胰岛素类似物,其包含式1的A链氨基酸序列:
XaaA(-2)-XaaA(-1)-XaaA0-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21
式(1)(SEQ ID No:1)
和式2的B链氨基酸序列:
XaaB(-2)-XaaB(-1)-XaaB0-XaaB1-XaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB2 8-XaaB29-XaaB30-XaaB31-XaaB32
式(2)(SEQ ID No:2)
其中
XaaA(-2)不存在,或是Gly;
XaaA(-1)不存在,或是Pro;
XaaA0不存在,或是Pro;
XaaA8独立地选自Thr和His;
XaaA12独立地选自Ser、Asp和Glu;
XaaA13独立地选自Leu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;
XaaA14独立地选自Tyr、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;
XaaA15独立地选自Gln、Asp和Glu;
XaaA18独立地选自Asn、Lys和Gln;
XaaA21独立地选自Asn和Gln;
XaaB(-2)不存在,或是Gly;
XaaB(-1)不存在,或是Pro;
XaaB0不存在,或是Pro;
XaaB1不存在,或独立地选自Phe和Glu;
XaaB2不存在,或是Val;
XaaB3不存在,或独立地选自Asn和Gln;
XaaB4独立地选自Gln和Glu;
XaaB10独立地选自His、Asp、Pro和Glu;
XaaB16独立地选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;
XaaB24独立地选自Phe和His;
XaaB25独立地选自Asn、Phe和His;
XaaB26不存在,或独立地选自Tyr、His、Thr、Gly和Asp;
XaaB27不存在,或独立地选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;
XaaB28不存在,或独立地选自Pro、His、Gly和Asp;
XaaB29不存在,或独立地选自Lys、Arg和Gln;且优选,XaaB29不存在,或独立地选自Lys和Gln;
XaaB30不存在,或是Thr;
XaaB31不存在,或是Leu;
XaaB32不存在,或是Glu;
C端可以任选衍生酰胺;
其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列在A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间通过二硫键连接,且其中A链的6位和11位的半胱氨酸通过二硫键连接;
在另一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素是胰岛素类似物,其包含式3的A链氨基酸序列:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21
式(3)(SEQ ID No:3)
和式4的B链氨基酸序列:
XaaB1-Val-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-His-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB30
式(4)(SEQ ID No:4)
其中
XaaA8独立地选自Thr和His;
XaaA12独立地选自Ser、Asp和Glu;
XaaA13独立地选自Leu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;
XaaA14独立地选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;
XaaA15独立地选自Gln、Asp和Glu;
XaaA18独立地选自Asn、Lys和Gln;
XaaA21独立地选自Asn和Gln;
XaaB1独立地选自Phe和Glu;
XaaB3独立地选自Asn和Gln;
XaaB4独立地选自Gln和Glu;
XaaB10独立地选自His、Asp、Pro和Glu;
XaaB16独立地选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;
XaaB24独立地选自Phe和His;
XaaB26不存在,或独立地选自Tyr、His、Thr、Gly和Asp;
XaaB27不存在,或独立地选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;
XaaB28不存在,或独立地选自Pro、His、Gly和Asp;
XaaB29不存在,或独立地选自Lys、Arg和Gln;且优选地,XaaB29不存在,或独立地选自Lys和Gln;
XaaB30不存在,或是Thr;
C端可以任选衍生为酰胺;
其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列在A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间通过二硫键连接,且其中A链的6位和11位的半胱氨酸通过二硫键连接。
在另一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素是胰岛素类似物,其中:
XaaA8独立地选自Thr和His;
XaaA12独立地选自Ser和Glu;
XaaA13独立地选自Leu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu;
XaaA14独立地选自Asp、His和Glu;
XaaA15独立地选自Gln和Glu;
XaaA18独立地选自Asn、Lys和Gln;
XaaA21独立地选自Asn和Gln;
XaaB1独立地选自Phe和Glu;
XaaB3独立地选自Asn和Gln;
XaaB4独立地选自Gln和Glu;
XaaB10独立地选自His、Asp、Pro和Glu;
XaaB16独立地选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu;
XaaB24独立地选自Phe和His;
XaaB25独立地选自Phe、Asn和His;
XaaB26独立地选自Tyr、Thr、Gly和Asp;
XaaB27独立地选自Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Gly、Arg和Glu;
XaaB28独立地选自Pro、Gly和Asp;
XaaB29独立地选自Lys和Gln;
XaaB30不存在,或是Thr;
C端可以任选衍生为酰胺;
其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列在A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间通过二硫键连接,且其中A链的6位和11位的半胱氨酸通过二硫键连接。
下面讨论蛋白酶稳定化的胰岛素的其它实施方案。
“蛋白酶(protease)”或“蛋白酶(protease enzyme)”是消化酶,其可以使蛋白和肽降解,并且可以在人体的各种组织中发现它,例如胃(胃蛋白酶),肠腔(糜蛋白酶,胰蛋白酶,弹性酶,羧肽酶,等等)或胃肠道的粘膜表面(氨肽酶,羧肽酶,肠肽酶,二肽基肽酶,内肽酶,等等),肝(胰岛素降解酶,组织蛋白酶D等等),和在其它组织中。
蛋白水解稳定的胰岛素类似物(也称为蛋白酶稳定化的胰岛素)在本文中被理解为相对于人胰岛素而被一种或多种蛋白酶降解较慢的胰岛素类似物。在一个实施方案中,相对于母体胰岛素,一种或多种蛋白酶对蛋白酶稳定化的胰岛素的降解较慢。在另一实施方案中,使蛋白酶稳定化的胰岛素对一种或多种选自如下的酶的降解作用保持稳定:胃蛋白酶(例如,同种型胃蛋白酶A,胃蛋白酶B,胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F),糜蛋白酶(例如,同种型糜蛋白酶A,糜蛋白酶B和/或糜蛋白酶C),胰蛋白酶,胰岛素-降解酶(IDE),弹性酶(例如,同种型胰腺弹性酶I和/或II),羧肽酶(例如,同种型羧基肽酶A,羧肽酶A2和/或羧肽酶B),氨肽酶,组织蛋白酶D及存在于来自大鼠、猪或人的肠内提取物中的其它酶。
在一个实施方案中,使蛋白酶稳定化的胰岛素对一种或多种选自下列如下的酶的降解作用保持稳定:糜蛋白酶,胰蛋白酶,胰岛素-降解酶(IDE),弹性酶,羧肽酶,氨肽酶和组织蛋白酶D。在另一实施方案中,使蛋白酶稳定化的胰岛素对一种或多种选自如下的酶的降解作用保持稳定:糜蛋白酶,羧肽酶和IDE。在另一实施方案中,使蛋白酶稳定化的胰岛素对一种或多种选自下列的酶的降解作用保持稳定:糜蛋白酶和羧肽酶。
T1/2可以按照实施例中描述的方法来测定,其作为蛋白酶稳定化的胰岛素对蛋白酶例如糜蛋白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A的蛋白降解稳定性的量度。在本发明的一个实施方案中,相对于人胰岛素,T1/2得到提高。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,T1/2得到提高。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,T1/2提高了至少2倍。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,T1/2提高了至少3倍。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,T1/2提高了至少4倍。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,T1/2提高了至少5倍。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,T1/2提高了至少10倍。
测定蛋白酶解稳定性的一种替代方式为测定相对于比较物例如人胰岛素的相对稳定性。相对稳定性定义为T1/2/T1/2(比较物),其中T1/2和T1/2(对比物)分别是降解分析中所述类似物与比较物的半衰期。在实施例部分中,给出了本发明选定胰岛素针对从大鼠的十二指肠提取的酶混合物的相对稳定性(相对于人胰岛素及相对于未酰化的蛋白酶耐受胰岛素)。
蛋白酶裂解位点(本文也称为蛋白酶位点)应该被理解为通过蛋白酶辨别的氨基酸残基和/或通过蛋白酶将其肽键裂解的氨基酸残基。蛋白酶裂解位点可以通过HPLC、MS或LC-MS分析测定裂解“热点”来测定,和/或通过基于待测定蛋白酶裂解位点的蛋白酶的酶特异性的预测来测定。本领域技术人员知道如何测定蛋白酶裂解位点,例如,基于例如Handbook of Proteolytical Enzymes(蛋白酶手册),第二版,Barrett,A.J.,Rawlings,N.D.,Woesner,J.F.编辑,Elsevier Academic Press 2004中描述的酶特异性。例如,可以预计糜蛋白酶将肽键C端裂解为芳香残基(Trp,Tyr,Phe或Leu),其后面不是Pro。类似地,可以预计胰蛋白酶将肽键C端裂解为碱性残基Lys或Arg,其后面不是Pro,预计弹性酶将残基C端裂解为Ala、Val、Gly或Ser,以及羧基肽酶A可以除去任何C端氨基酸,但不是Arg、Lys或Pro。预计胰岛素降解酶(IDE)可以裂解人胰岛素的下列位置:B9-10,B10-11,B13-14,B14-15,B24-25,B25-26,A13-14和A14-15。
术语在蛋白酶裂解位点“内部或其紧密相邻处”的取代氨基酸在本文用于表示在母体胰岛素的位置内部或其紧密相邻处的氨基酸的取代,其中已经确定该位置是蛋白酶裂解位点。在一个实施方案中,在胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点内部或其紧密相邻处的两个或更多个疏水性氨基酸被取代,其中所述疏水性的氨基酸被亲水性的氨基酸取代。在另一实施方案中,在胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点内的两个或更多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸取代。在另一实施方案中,与胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点相邻的两个或更多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸取代。在另一实施方案中,位于离胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点两个氨基酸处的两个或更多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸取代。在另一实施方案中,位于离胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点三个氨基酸处的两个或更多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸取代。在另一实施方案中,位于离胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点多达四个氨基酸处的两个或多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸取代。在另一实施方案中,位于离胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点或在该两个或更多个蛋白酶位点之内的一个、两个或三个氨基酸处的两个或更多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸取代。在另一实施方案中,位于离胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点或在该两个或更多个蛋白酶位点之内的一个或两个氨基酸处的两个或更多个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在另一实施方案中,在胰岛素上的两个或更多个蛋白酶位点相邻处或在该两个或更多个蛋白酶位点之内的两个或更多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸取代。
蛋白酶稳定化的胰岛素可以具有净电荷,该净电荷不同于母体胰岛素的净电荷。在一个实施方案中,所述蛋白酶稳定化的胰岛素的净电荷比母体胰岛素的净电荷更具正电性。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的净电荷比母体胰岛素的净电荷更具负电性。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均正净电荷在0.5和5之间(在水溶液中测定)。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均正净电荷在1和5之间。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均正净电荷在1和4之间。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均正净电荷在1和3之间。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均正净电荷在2和3之间。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均负净电荷在-0.5和-5之间(在水溶液中测定)。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均负净电荷在-1和-5之间。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均负净电荷在-1和-4之间。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均负净电荷在-1和-3之间。在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素的平均负净电荷在-2和-3之间。
在一个实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素可以具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为3-9时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为4-8.5时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为4-8时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为4.5-8时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为5-8时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为5.5-8时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为6-8时具有提高的溶解性。
在一个实施方案中,相对于人胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为2-4时具有提高的溶解性。
在一个实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素可以具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为3-9时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为4-8.5时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为4-8时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为4.5-8时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为5-8时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为5.5-8时具有提高的溶解性。在另一实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH值为6-8时具有提高的溶解性。
在一个实施方案中,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素在pH 2-4时具有提高的溶解性。
“在给定pH值下具有提高的溶解性”是指相对于母体胰岛素,在溶液的pH值下,更大浓度的蛋白酶稳定化的胰岛素溶于水溶液或缓冲溶液中。测定包含在溶液中的胰岛素是否溶解的方法在本领域是已知的。
在一个实施方案中,可以将溶液在30,000g下离心20分钟,然后可以通过RP-HPLC测定上清液中的胰岛素浓度。如果该浓度在实验误差范围内等于制备组合物最初所使用的胰岛素浓度,那么该胰岛素在本发明的组合物中是完全溶解的。在另一个实施方案中,在本发明组合物中的胰岛素的溶解性可以简单地通过眼睛检验容器来确定,其中组合物容纳于该容器中。如果用眼睛观察时溶液是澄清的并且没有颗粒物质悬浮或沉淀在容器的侧面/底部,那么胰岛素是可溶的。
当依据测定进行比较时,相对于母体胰岛素,蛋白酶稳定化的胰岛素可以具有提高的表观功效和/或生物利用率。
测定胰岛素体外功效或生物利用率的标准试验对本领域技术人员而言是已知的,并且尤其包括:(1)胰岛素放射性受体测定,其中胰岛素的相对功效定义为:置换50%125I-胰岛素所要求的胰岛素与胰岛素类似物的比例,其中125I-胰岛素特异性地与细胞膜例如大鼠肝脏质膜片段上存在的胰岛素受体结合;(2)脂肪形成试验,例如用大鼠脂肪细胞进行,其中相对胰岛素功效定义为:获得[3-3H]葡萄糖转化为有机-可萃取物质(即脂质)的最大转化的50%所要求的胰岛素与胰岛素类似物的比例;(3)分离脂肪细胞中的葡萄糖氧化试验,其中胰岛素类似物的相对功效定义为:获得葡萄糖-1-[14C]转化为[14CO2]的最大转化的50%的胰岛素与胰岛素类似物的比例;(4)胰岛素放射免疫测定,通过测定胰岛素或胰岛素类似物与125I-胰岛素竞争与特异性抗胰岛素抗体结合的效果,其可以测定胰岛素类似物的免疫原性;和(5)其它试验,其测定胰岛素或胰岛素类似物与动物血浆样品中的抗体的结合,例如,具有特异性胰岛素抗体的ELISA试验。
提高的表观体内功效可通过比较被讨论的胰岛素与相似剂量的无蛋白酶稳定化突变的相似胰岛素的血糖与时间曲线来估计/评价。相对于比较物,本发明胰岛素会具有提高的血糖降低作用。
测定胰岛素生物利用度的标准检验对本领域中技术人员而言是已知的并尤其包括测定相同物种中肺部或口服和静脉(i.v.)给药被讨论的胰岛素的浓度曲线下的相对面积(AUC)等等。血液(血浆)样品中胰岛素浓度的定量可采用例如抗体检测(ELISA)或质谱分析来进行。肺部给药可通过几种方式进行。例如,胰岛素可通过点滴给予大鼠,或通过干粉喷射给予猪。
可以任选分析蛋白酶稳定化的胰岛素的其它蛋白酶位点,该位点可以进行一个或多个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸的进一步取代。蛋白酶稳定化的胰岛素可以是胰岛素类似物,与母体胰岛素(第一个改性胰岛素)相比,其在蛋白酶位点具有至少两个亲水性酸,并且在第一个改性胰岛素的新蛋白酶位点其还具有至少一个氨基酸取代,其中至少一个疏水性氨基酸已经被至少一个亲水性氨基酸取代。
为了便利性起见,下面是编码的天然氨基酸名称,用常见的在括号中的三个字母代码和一个字母代码:甘氨酸(Gly & G),脯氨酸(Pro & P),丙氨酸(Ala & A),缬氨酸(Val & V),亮氨酸(Leu & L),异亮氨酸(Ile & I),甲硫氨酸(Met & M),半胱氨酸(Cys & C),苯丙氨酸(Phe & F),酪氨酸(Tyr & Y),色氨酸(Trp & W),组氨酸(His & H),赖氨酸(Lys & K),精氨酸(Arg & R),谷氨酰胺(Gln & Q),天冬酰胺(Asn & N),谷氨酸(Glu & E),天冬氨酸(Asp & D),丝氨酸(Ser & S)和苏氨酸(Thr & T)。如果由于打字错误而与通常使用的编码不符合,则采用通常使用的编码。优选地,存在于本发明的胰岛素中的氨基酸为可以通过核酸编码的氨基酸。在一个实施方案中,胰岛素或胰岛素类似物用下列取代:Gly,Glu,Asp,His,Gln,Asn,Ser,Thr,Lys,Arg和/或Pro,和/或Gly,Glu,Asp,His,Gln,Asn,Ser,Thr,Lys,Arg,和/或Pro加到胰岛素或胰岛素类似物中。在一个实施方案中,胰岛素或胰岛素类似物用下列取代:Glu,Asp,His,Gln,Asn,Lys和/或Arg,和/或Glu,Asp,His,Gln,Asn,Lys和/或Arg加到胰岛素或胰岛素类似物中。
在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素选自下列化合物:A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B28D,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B16E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A8H,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A8H,A14E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A8H,A14E,B1E,B25H,desB30人胰岛素;A8H,A14E,B1E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A8H,A14E,B1E,B16E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A8H,A14E,B16E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26D,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B28D,desB30人胰岛素;A14E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,desB30人胰岛素;A14D,B25H,desB30人胰岛素;B25N,B27E,desB30人胰岛素;A8H,B25N,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B27E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B28E,desB30人胰岛素;B25H,B27E,desB30人胰岛素;B1E,B25H,B27E,desb30人胰岛素;A8H,B1E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A8H,B25H,B27E,desB30人胰岛素;B25N,B27D,desB30人胰岛素;A8H,B25N,B27D,desB30人胰岛素;B25H,B27D,desB309人胰岛素;A8H,B25H,B27D,desB30人胰岛素;A(-1)P,A(0)P,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B(-1)P,B(0)P,B25H,desB30人胰岛素;A(-1)P,A(0)P,A14E,B(-1)P,B(0)P,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B30T,B31L,B32E人胰岛素;A14E,B25H人胰岛素;A14E,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B10P,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B10E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B4E,B25H,desB30人胰岛素;A14H,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14H,B10E,B25H,desB30人胰岛素;A13H,A14E,B10E,B25H,desB30人胰岛素;A13H,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A18Q,B3Q,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B24H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素;A14E,A18Q,A21Q,B3Q,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A18Q,A21Q,B3Q,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A14E,A18Q,B3Q,B25H,desB30人胰岛素;A13H,A14E,B1E,B25H,desB30人胰岛素;A13N,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13N,A14E,B1E,B25H,desB30人胰岛素;A(-2)G,A(-1)P,A(0)P,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B(-2)G,B(-1)P,B(0)P,B25H,desB30人胰岛素;A(-2)G,A(-1)P,A(0)P,A14E,B(-2)G,B(-1)P,B(0)P,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B27R,B28D,B29K,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27R,B28D,B29K,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26T,B27R,B28D,B29K,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27R,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27H,desB30人胰岛素;A14E,A18Q,B3Q,B25H,desB30人胰岛素;A13E,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A12E,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A15E,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13E,B25H,desB30人胰岛素;A12E,B25H,desB30人胰岛素;A15E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26D,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27R,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27N,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27D,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27Q,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27G,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27K,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27P,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27S,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27T,desB30人胰岛素;A13R,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13N,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13D,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13Q,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13E,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13G,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13H,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13K,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13P,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13S,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A13T,A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16R,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16D,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16Q,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14R,B25H,desB30人胰岛素;A14N,B25H,desB30人胰岛素;A14D,B25H,desB30人胰岛素;A14Q,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14G,B25H,desB30人胰岛素;A14H,B25H,desB30人胰岛素;A8H,B10D,B25H人胰岛素;和A8H,A14E,B10E,B25H,desB30人胰岛素且该实施方案可任选包括A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素;B25H,desB30人胰岛素;和B25N,desB30人胰岛素。
在优选的实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素选自以下化合物:A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;B25H,desB30人胰岛素和A14E,B25H,desB27,desB30人胰岛素。
在优选的实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素选自任一还包含desB27突变的上述组。
在优选的实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素选自以下化合物:A14E,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B 16E,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29R,desB30人胰岛素和B25H,desB27,desB30人胰岛素。
在一个实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素选自任一还包含在A21和/或B3位的以下突变以提高化学稳定性的上述组:A21G,desA21,B3Q或B3G。
在优选的实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素选自以下的蛋白酶稳定化的胰岛素:A14E,A21G,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B16E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素;A21G,B25H,desB30人胰岛素和A21G,B25N,desB30人胰岛素;且优选地,其选自以下的蛋白酶稳定化的胰岛素:A14E,A21G,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B16E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A21G,B25H,desB30人胰岛素和A21G,B25N,desB30人胰岛素。
在优选的实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素在B29位中的B29K的ε氮位酰化。
在优选的实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素在A1位中的A1的α氮位酰化。
在优选的实施方案中,蛋白酶稳定化的胰岛素在A1位中A1的α氮位酰化且所述蛋白酶稳定化的胰岛素包含B29R突变。
利用例如在美国专利US 6,500,645中公开的众所周知的技术,在合适宿主细胞中,通过表达编码所述讨论的胰岛素的DNA序列来制备蛋白酶稳定化的胰岛素。该蛋白酶稳定化的胰岛素既可以直接表达、也可以以B链上具有N端延长的前体分子的形式表达。这种N端延长可以具有提高直接表达产物的产率的功能,并且可具有高达15个氨基酸残基长度。从培养肉汤中分离之后,N端延长被体外裂解,并因此具有紧邻B1的裂解位点。本发明中的合适类型的N端延长在美国专利US 5,395,922和欧洲专利765,395A中公开。
编码蛋白酶稳定化的胰岛素的多核苷酸序列可以利用已建立的标准方法来合成产生,例如,Beaucage等人(1981)Tetrahedron Letters 22:1859-1869所描述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法,或Matthes等人(1984)EMBO Journal 3:801-805所描述的方法。按照亚磷酰胺(phosphoamidite)方法合成寡核苷酸,例如在DNA自动合成仪中合成,纯化,形成双螺旋和连接,以形成合成DNA构建体。制备DNA构建体的目前优选方式是聚合酶链式反应(PCR)。
多核苷酸序列也可以为混合基因组、cDNA和合成源。例如,编码前导肽的基因组或cDNA序列可以与编码A和B链的基因组或cDNA连接,而后,按照众所周知的方法,通过插入编码同源重组的所需氨基酸序列的合成寡核苷酸,可以在位点处修饰DNA序列,或优选使用合适寡核苷酸,通过PCR产生所需序列。
重组方法一般使用载体,其能够在所选择的微生物或宿主细胞中复制,并且其带有编码蛋白酶稳定化的胰岛素的多核苷酸序列。重组载体可以是自主复制载体,即,以额外染色体实体形态存在的载体,其中的复制与染色体的复制无关,例如质粒、额外的染色体单元、极微染色体或人工染色体。载体可以包括保证自我复制的任何手段。或者,载体可以是当被引入到宿主细胞中时可以整合到基因组中、并且与它所整合入的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单一载体或质粒或两种或更多种载体或质粒,它们一起包含被引入到宿主细胞的基因组中的全部DNA,或使用转位子。载体可以是线型或闭合环形的质粒,并且优选包含可使载体稳定整合到宿主细胞的基因组中或可使载体在独立于基因组的细胞中自发复制的元件。
重组表达载体能够在酵母中复制。能够使载体在酵母中复制的序列的实例是酵母质粒2μm复制基因REP1-3和复制起点。
载体可以包含一个或多个容易选择转化细胞的选择性标记。选择性标记是基因,其产物可提供杀菌或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型,等等。细菌选择性标记的实例是来源于枯草杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或可赋予抗菌素耐药性的标记,例如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素耐药性。用于细丝状霉菌宿主细胞的选择性标记包括:amdS(乙酰胺酶),argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶),pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸盐脱羧酶)和trpC(邻氨基苯甲酸酯合酶)。酵母宿主细胞的合适标记是ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1和URA3。对于酵母,较好匹配的选择性标记是裂殖酵母(Schizosaccharomyces pompe)TPI基因(Russell(1985)Gene 40:125-130)。
在载体中,多核苷酸序列操作性地与合适启动子序列连接。该启动子可以是任何核酸序列,其在选择的宿主细胞中显示转录活性,包括突变、截短和杂合启动子,并且可以从编码胞外或胞内多肽的基因获得,该多肽对于宿主细胞既可以是同源的也可以是异源的。
在细菌宿主细胞中引导转录的合适启动子的实例是从下列中获得的启动子:大肠杆菌乳糖操纵子,天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA),枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB),地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL),嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM),解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶基因(amyQ),和地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)。在细丝状霉菌宿主细胞中引导转录的合适启动子的实例是从下列的基因获得的启动子:米曲霉TAKA淀粉酶,米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶,黑曲霉中性α-淀粉酶,和黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶。在酵母宿主中,有用的启动子是酿酒酵母Mal,TPI,ADH或PGK启动子。
编码蛋白酶稳定化的胰岛素的多核苷酸序列一般也会操作性地与合适终止子连接。在酵母中,合适终止子是TPI终止子(Alber等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)。
用于连接分别编码蛋白酶稳定化的胰岛素、启动子和终止子的多核苷酸序列的方法、和将它们插入到合适载体(其包含在所选择宿主中进行复制所必需的信息)中的方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。可以理解,可以如下构建载体:首先制备包含编码本发明胰岛素的完整DNA序列的DNA构建体,随后将该片段插入到合适表达载体中,或依次插入包含个体元件(例如信号,肽原,连接肽,A和B链)的遗传信息的DNA片段,而后进行连接。
将包含编码蛋白酶稳定化的胰岛素的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中,以使载体作为染色体整合体或自我复制的染色体外载体保持。术语“宿主细胞”包括母细胞的任何子代,由于在复制期间存在突变,其与母细胞不相同。宿主细胞可以是单细胞微生物,例如原核生物,或非单细胞微生物,例如真核生物。有用的单细胞细胞是细菌细胞,例如革兰氏阳性细菌,包括但不限于:杆菌细胞,链霉菌属细胞,或革兰氏阴性细菌细胞,例如,大肠杆菌和假单胞菌属。真核生物细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是酵母细胞。酵母有机体可以是任何合适的酵母有机体,其在培育时产生大量的本发明的单链胰岛素。合适酵母有机体的实例是选自下列酵母种属的菌株:酿酒酵母,克鲁维酵母菌,粟酒裂殖酵母,葡萄汁酵母,乳酸克鲁维酵母,汉逊酵母,巴斯德毕赤氏酵母,甲醇毕赤酵母,克鲁维毕赤酵母,解脂耶氏酵母,假丝酵母,产朊假丝酵母,可可假丝酵母,地霉菌,和发酵地霉。
酵母细胞的转化可以例如通过原生质体形成实现,而后以本身已知的方式进行转化。用于培育细胞的培养基可以是适合于培育酵母有机体的任何常规培养基。利用常规方法,包括从培养基中离心分离酵母细胞,通过离子交换基质或通过反相吸收基质将胰岛素前体物过滤或获得,将上清液的蛋白组份沉淀,或利用盐例如硫酸铵进行过滤,而后利用各种色谱方法进行纯化,例如,离子交换色谱、亲和色谱等等,可以恰当加工的形式从培养基中回收分泌的胰岛素(显著比例存在于培养基中)。
优选地,本发明的酰化胰岛素是单取代的,在所述蛋白酶稳定化的胰岛素分子中仅有一个酰化基团与赖氨酸氨基酸残基连接。
在一个实施方案中,与所述蛋白酶稳定化的胰岛素相连的酰基部分具有以下通式:
Acy-AA1n-AA2m-AA3p- (I),
其中n为0或1-3的整数;m为0或1-10的整数;p为0或1-10的整数;Acy为包含大约8个至大约24个碳原子的脂肪酸或脂肪族二酸;AA1为中性线型或环状氨基酸残基;AA2为酸性氨基酸残基;AA3为中性的、含亚烷基二醇的氨基酸残基;所述式中AA1、AA2和AA3出现的顺序可独立地相互交换;AA2可沿着所述式出现几次(例如Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2可沿着所述式独立地(不同)出现几次(例如Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接基为酰胺(肽)键,其形式上可通过除去Acy,AA1,AA2和AA3各自的氢原子或羟基(水)来获得;且与蛋白酶稳定化的胰岛素连接可以从式(I)酰基部分的AA1,AA2或AA3残基的C-末端或从式(I)部分存在的AA2残基的一个侧链开始进行。
另一实施方案中,与所述蛋白酶稳定化的胰岛素相连的酰基部分具有通式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-(I),其中AA1选自Gly、D-或L-Ala、βAla、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、D-或L-Glu-α-酰胺、D-或L-Glu-γ-酰胺、D-或L-Asp-α-酰胺、D-或L-Asp-β-酰胺或下式之一的基团:
其氢原子和/或羟基被除去且其中q为0、1、2、3或4,并且在此实施方案中,AA1可任选为7-氨基庚酸或8-氨基辛酸。
另一实施方案中,与所述蛋白酶稳定化的胰岛素相连的酰基部分具有通式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-(I),其中AA1如上所定义而AA2选自L-或D-Glu、L-或D-Asp、L-或D-homoGlu或下面中的任一个:
其氢原子和/或羟基被除去而其中箭头表示与AA1、AA2、AA3的氨基或所述蛋白酶稳定化的胰岛素的氨基的连接点。
在一个方面,命名为AA1的中性的环状氨基酸残基是一氨基酸,其包含饱和的6元碳环,任选包含氮杂原子,且优选所述环为环己烷环或哌啶环。优选,所述中性的环状氨基酸的分子量为约100-约200Da。
命名为AA2的酸性氨基酸残基是分子量至多达约200Da的氨基酸,其包含两个羧酸基团和一个伯或仲氨基。或者,命名为AA2的酸性氨基酸残基是分子量至多达约250Da的氨基酸,其包含一个羧酸基团和一个伯或仲磺氨基。
命名为AA3的中性的、含亚烷基二醇的氨基酸残基是亚烷基二醇部分,任选低聚亚烷基二醇或聚亚烷基二醇,其包含在一端的羧酸官能团和在另一端的氨基官能团。
本文中,术语亚烷基二醇部分包括单亚烷基二醇部分及低聚亚烷基二醇部分。单-和低聚亚烷基二醇包括单-和低聚乙二醇基、单-和低聚丙二醇基和单-和低聚丁二醇基链,即基于重复单元-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-或-CH2CH2CH2CH2O-的链。所述亚烷基二醇部分是单分散的(具有明确的长度/分子量)。单亚烷基二醇部分包括-OCH2CH2O-、-OCH2CH2CH2O-或-OCH2CH2CH2CH2O-,各末端包含不同基团。
如本文中所述,式(I)(Acy-AA1n-AA2m-AA3p-)的酰基部分中AA1、AA2和AA3出现的顺序可独立地相互交换。从而,式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-同样包括例如式Acy-AA2m-AA1n-AA3p-、式Acy-AA2-AA3n-AA2-和式Acy-AA3p-AA2m-AA1n-等部分,其中Acy,AA1,AA2,AA3,n,m和p如本文中所定义。
如本文中所述,Acy,AA1,AA2和/或AA3部分之间的连接基形式上可通过除去母体化合物的水而形成酰胺键(肽键)(-CONH-)来获得,所述母体化合物形式上由它们构成。这意味着为了获得式(I)(Acy-AA1n-AA2m-AA3p-,其中Acy,AA1,AA2,AA3,n,m和p如本文中所定义)的酰基部分的完整式,技术人员必须形式上采用术语Acy,AA1,AA2和AA3的化合物并除去它们的氢和/或羟基,并且形式上必须在如此获得的自由端连接如此获得的构成单元。
可存在于本发明的酰化胰岛素类似物中的式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-的酰基部分的非限定性具体实例如下:
式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-的酰基部分的以上非限定性具体实例中的任一个可连接到胰岛素类似物的以上非限定性具体实例中的任一个中存在的赖氨酸残基的ε氨基上,从而得到本发明的酰化胰岛素类似物的其它具体实例。
式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-的酰基部分的以上非限定性具体实例中的任一个可连接到胰岛素类似物的以上非限定性实例中的任一个中存在的A1残基的α氨基上,从而得到本发明的酰化胰岛素类似物的其它具体实例。
所述蛋白酶稳定化的胰岛素可通过在胰岛素类似物的赖氨酸残基中或N-末端位置中引入式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-的所需基团来转化成本发明的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-的所需基团可通过任何方便方法和现有技术中针对这种反应所公开的许多方法来引入。更多细节在本文中实施例中公开。
在一个实施方案中,本发明不涉及EP 07114387.9中描述的化合物,即酰化胰岛素,其中酰基部分与所述母体胰岛素相连且其中所述酰基部分包括含亚烷基二醇重复单元的氨基酸且其中所述母体胰岛素中仅存在一个赖氨酸残基(K & Lys)。
药物组合物
本发明的酰化胰岛素可以皮下、鼻部、口服或肺部给药。
对于皮下给药,以类似于已知胰岛素制剂的方式来配制本发明的酰化胰岛素。此外,对于皮下给药,可以用与给予已知胰岛素给药的类似方式来给予本发明的酰化胰岛素,并且,通常医生熟悉该方法。
本发明的酰化胰岛素可以以有效提高循环胰岛素水平和/或降低循环葡萄糖水平的剂量通过吸入给药。这种给药可以有效治疗病症,例如糖尿病或高血糖症。获得胰岛素的有效剂量需要吸入给予超过大约0.5μg/kg至大约50μg/kg本发明的酰化胰岛素的剂量。治疗有效量可以由知识丰富的医师确定,医师将考虑许多因素,包括胰岛素水平,血糖水平,患者的身体条件,患者的肺部状态,等等。
本发明的酰化胰岛素可以通过吸入来输送,从而获得缓慢的吸收和/或降低其系统清除率。当比较肺沉积的相似颗粒大小和相似水平时,不同的吸入装置一般提供类似的药物动力学。
本发明的酰化胰岛素可以通过本领域已知的、用于通过吸入方式给予治疗剂的任何种类的吸入装置来递送。这些装置包括定量吸入器、雾化器、干燥粉末发生器、喷雾器,等等。优选地,本发明的酰化胰岛素可以通过干粉吸入器或喷雾器输送。对于给予本发明的酰化胰岛素的吸入装置,有一些所需特征。例如,通过吸入装置输送有利地是可靠的、可再现的和精确的。为了良好的呼吸性能,吸入装置应该输送小颗粒或气雾剂,例如小于大约10μm,例如大约1-5μm。适合于本发明实践的可商购的吸入装置的一些具体实例是TurbohalerTM(Astra),Rotahaler(Glaxo),Diskus(Glaxo),SpirosTM吸入器(Dura),由Inhale Therapeutics销售的装置,AERxTM(Aradigm),Ultravent雾化器(Mallinckrodt),Acorn II雾化器(Marquest Medical Products),Ventolin定量吸入器(Glaxo),Spinhaler粉剂吸入器(Fisons),等等。
本领域技术人员将认识到,本发明的酰化胰岛素的制剂、输送制剂的数量和单一剂量给药的持续时间取决于所使用的吸入装置的类型。对于一些气雾剂输送系统,例如雾化器,给药频率和系统开动的持续时间主要取决于气雾剂中的酰化胰岛素的浓度。例如,在高浓度的酰化胰岛素(在雾化器溶液中)的条件下,可以使用较短周期的给药。装置例如定量吸入器可以产生较高气溶胶浓度,并且可以较短的周期操作,以输送所需量的酰化胰岛素。用装置例如粉剂吸入器来输送活性剂,直到药剂的给定装载量从装置中排出为止。在这类吸入器中,本发明的酰化胰岛素的量(在给定数量的粉剂中)确定在单一给药中的输送剂量。
考虑到胰岛素进入肺中,优选进入下呼吸道或肺泡中的能力,在通过吸入装置递送的制剂中本发明的酰化胰岛素的粒径是关键性的。优选地,将本发明的酰化胰岛素进行配制,以使至少大约10%,优选大约10至大约20%或更多的所递送的酰化胰岛素沉积在肺中。众所周知,对于用口呼吸的人,肺部沉积的最高效率是用大约2μm至大约3μm的粒径获得的。当粒径超过大约5μm时,肺部沉积将显著地降低。粒径低于大约1μm可导致肺部沉积降低,并且变得难以输送足以产生治疗效果的量的颗粒。因此,通过吸入递送的酰化胰岛素的颗粒优选具有小于大约10μm的粒径,更优选在大约1μm至大约5μm范围内。选择酰化胰岛素的制剂,从而在所选择的吸入装置中产生所需粒径。
有利的是,对于例如干粉给药,将本发明的酰化胰岛素制备成具有小于大约10μm,优选大约1至大约5μm粒径的微粒形式。优选的粒径可有效输送至患者肺的肺泡中。优选地,干粉大部分由制备的颗粒组成,以使大部分颗粒具有所需范围的粒径。有利的是,至少大约50%的干粉由具有小于大约10μm直径的颗粒组成。这种制剂可以如下获得:将包含本发明的酰化胰岛素及其它所需组分的溶液喷雾干燥,碾磨,或进行临界点凝聚。适合于产生本发明中所使用颗粒的其它方法在本领域是已知的。
在容器中,颗粒通常与干粉制剂分离,而后通过载体气流输送到患者的肺中。通常,在现行的干粉吸入器中,破碎固体的力仅仅通过患者的吸入所提供。在另一个类型的吸入器中,通过患者吸入产生的气流启动叶轮马达,其可以使颗粒解聚。
用干粉吸入器给药的本发明的酰化胰岛素的制剂通常包括含有衍生物的细分散干粉,但粉末还可以包括填充剂、载体、赋形剂、另一种添加剂,等等。添加剂可以包括在酰化胰岛素的干粉制剂中,从而例如,根据具体粉末吸入器的输送需要来稀释粉末,便于制剂的加工,提供制剂有利的粉末特性,便于分散从吸入装置中出来的粉末,使制剂稳定(例如,抗氧化剂或缓冲剂),提供制剂味道,等等。有利的是,添加剂不会不利地影响患者的呼吸道。可以在分子水平将酰化的胰岛素与添加剂混合,或固体制剂可以包括酰化胰岛素的颗粒,其中酰化的胰岛素与添加剂的颗粒混合,或涂渍在添加剂的颗粒上。通常的添加剂包括:单、二和多糖;糖醇及其它多元醇,例如,乳糖,葡萄糖,棉子糖,松三糖,乳糖醇,麦芽糖醇,海藻糖,蔗糖,甘露糖醇,淀粉,或其组合;表面活性剂,例如山梨糖醇,二磷脂酰胆碱,或卵磷脂;等等。通常,添加剂,例如填充剂,以有效用于上述目的的数量提供,常常是制剂重量的大约50%至大约90%重量。对于蛋白制剂,例如胰岛素类似物蛋白的制剂,本领域已知的其它试剂也可以包括在制剂中。
包含本发明酰化胰岛素的喷雾剂可以在压力下迫使该酰化的胰岛素的悬浮液或溶液通过喷嘴来产生。可以选择喷嘴尺寸和构造、施加的压力和液体进料速度,以获得所需输出和粒径。可以产生电喷雾,例如,通过电场与毛细管或喷嘴进料结合。有利的是,通过喷雾器输送的胰岛素缀合物的颗粒具有小于大约10μm的粒径,优选在大约1μm至大约5μm的范围内。
适合使用喷雾器的本发明的酰化胰岛素的制剂通常包含在水溶液中的酰化的胰岛素,其浓度为每ml溶液大约1mg至大约500mg酰化的胰岛素。根据所选择的酰化胰岛素及医学顾问已知的其它因素,上限可以较低,例如,每ml溶液含有450、400、350、300、250、200、150、120、100或50mg的酰化胰岛素。该制剂可以包含试剂,例如赋形剂、缓冲剂、等渗试剂、防腐剂、表面活性剂,和优选锌。该制剂还可以包含赋形剂或稳定酰化胰岛素的试剂,例如缓冲剂、还原剂、原液蛋白(bulk protein)或碳水化合物。用于配制胰岛素缀合物的原液蛋白包括白蛋白、精蛋白等等。用于配制酰化胰岛素的典型碳水化合物包括蔗糖,甘露糖醇,乳糖,海藻糖,葡萄糖,等等。酰化胰岛素制剂还可以包括表面活性剂,其可以降低或预防由生成气溶胶时溶液的雾化所引起的表面诱导的胰岛素缀合物的聚集。可以使用各种常规表面活性剂,例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇,和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。数量通常介于制剂的大约0.001和大约4%重量的范围中间。
包含本发明的酰化胰岛素的药物组合物还可以肠胃外给予需要这种治疗的患者。肠胃外给药可以借助于注射器,任选笔类注射器通过皮下、肌肉注射或静脉注射进行。或者,肠胃外给药可以借助于输液泵进行。
本发明的酰化胰岛素的注射组合物可以使用制药工业的传统方法制备,该方法包括将适合的组分溶解和混合,得到所需终产物。因此,按照一个方法,将酰化的胰岛素溶于适量的水中,水的体积稍微少于所制备组合物的终体积。根据需要,加入锌、等渗试剂、防腐剂和/或缓冲剂,和如果需要的话,使用酸例如盐酸或碱例如氢氧化钠水溶液(按照需要)调节溶液的pH值。最后,用水调节溶液的体积,得到该组分的所需浓度。
在本发明的另一实施方案中,缓冲剂选自乙酸钠,碳酸钠,柠檬酸盐,双甘氨肽,组氨酸,甘氨酸,赖氨酸,精氨酸,磷酸二氢钠,磷酸氢二钠,磷酸钠,和三(羟甲基)-甲胺,N-二羟乙基甘氨酸,麦黄酮(tricine),苹果酸,琥珀酸盐,马来酸,富马酸,酒石酸,天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂的每个构成本发明的替代实施方案。
在本发明的另一实施方案中,制剂还包含药学上可接受的防腐剂,所述防腐剂可以选自苯酚,邻甲酚,间甲酚,对甲酚,对羟基苯甲酸甲酯,对羟基苯甲酸丙酯,2-苯氧乙醇,对羟基苯甲酸丁酯,2-苯基乙醇,苯甲醇,氯丁醇,和硫柳汞(thiomerosal),溴硝丙二醇,苯甲酸,咪唑啉基脲(imidurea),双氯苯双胍己烷,脱氢醋酸钠,氯甲酚,对羟苯甲酸乙酯,苄索氯铵,氯酚醚(chlorphenesine)(3-(4-氯苯氧基)-1,2-丙二醇)或其混合物。在本发明的另一实施方案中,防腐剂存在的浓度是大约0.1mg/ml至20mg/ml。在本发明的另一实施方案中,防腐剂存在的浓度是大约0.1mg/ml至5mg/ml。在本发明的另一实施方案中,防腐剂存在的浓度是大约5mg/ml至10mg/ml。在本发明的另一实施方案中,防腐剂存在的浓度是大约10mg/ml至20mg/ml。这些具体防腐剂的每个构成本发明的替代实施方案。防腐剂在药物组合物中的应用对于技术人员是众所周知的。为方便起见,参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。
在本发明的另一实施方案中,制剂还包含等渗剂,其可以选自:盐(例如,氯化钠),糖或糖醇,氨基酸(例如,L-甘氨酸,L-组氨酸,精氨酸,赖氨酸,异亮氨酸,天冬氨酸,色氨酸或苏氨酸),糖醇(例如丙三醇(甘油),1,2-丙二醇(丙二醇),1,3-丙二醇或1,3-丁二醇,聚乙二醇(例如,PEG400)或其混合物。可以使用任何糖,例如单、二或多糖,或水溶性的葡聚糖,包括例如果糖,葡萄糖,甘露糖,山梨糖,木糖,麦芽糖,乳糖,蔗糖,海藻糖,葡聚糖,支链淀粉,糊精,环糊精,可溶性淀粉,羟乙基淀粉和羧甲纤维素钠。在一个实施方案中,所述糖添加剂是蔗糖。将糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃,并且包括,例如,甘露糖醇,山梨糖醇,肌醇,半乳糖醇(galactitol),卫矛醇(dulcitol),木糖醇和阿糖醇。在一个实施方案中,所述糖醇添加剂是甘露糖醇。上述的糖或糖醇可以单独或组合使用。对使用数量没有固定限制,只要糖或糖醇可溶于液体药剂并且不会不利地影响使用本发明方法所获得的稳定效果即可。在一个实施方案中,糖或糖醇浓度在大约1mg/ml和大约150mg/ml之间。在本发明的另一实施方案中,等渗剂存在的浓度是大约1mg/ml至50mg/ml。在本发明的另一实施方案中,等渗剂存在的浓度是大约1mg/ml至7mg/ml。在本发明的另一实施方案中,等渗剂存在的浓度是大约8mg/ml至24mg/ml。在本发明的另一实施方案中,等渗剂存在的浓度是大约25mg/ml至50mg/ml。这些具体等渗剂的每个构成本发明的替代实施方案。等渗试剂在药物组合物中的应用对于技术人员是众所周知的。为方便起见,参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。
典型的等渗剂是氯化钠、甘露糖醇、二甲砜和丙三醇,以及典型的防腐剂是苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和苯甲醇。
合适缓冲剂的实例是乙酸钠、双甘氨肽(甘氨酰甘氨酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和磷酸钠。
用于鼻部给予本发明酰化胰岛素的组合物可以例如按照欧洲专利272,097中描述的方法制备。
包含本发明酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的口服制剂可以本身已知的方法制备。制备可方便地口服给药的包含本发明酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的制剂的一种方法是通过采用与WO 2008/145728中描述的方法类似的方法。
制备包含本发明酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的口服制剂的另一种方法是制备包含如下物质的无水液体或半固体药物组合物:本发明酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素(a),所述酰化的蛋白酶稳定化的胰岛素的至少一种极性有机溶剂(b),至少一种亲脂组分(c),和任选表面活性剂(d)和/或至少一种固体亲水组分(e)。这可以为油状溶液。或者,所述至少一种固体亲水组分(d)为至少一种固体亲水聚合物。或者,包含至少一种固体亲水组分的药物组合物不含表面活性剂,其中所述表面活性剂的HLB值为至少8,即所述组合物中不存在HLB值为至少8的表面活性剂。
例如,包含酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的药物组合物可为无水油状溶液和/或SEDDS或SMEDDS药物组合物。
或者,所述药物组合物是自乳化药物输送系统(本文中称SEDDS)。
据信酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素在药物组合物的极性有机溶剂中的高溶解度(导致所述药物组合物中所需的极性有机溶剂的总量较低)可改善所述药物组合物与胶囊材料的相容性。
所述药物组合物可包含载体,所述载体包含亲脂性组分、表面活性剂和极性有机溶剂和任选固体亲水组分(e)。如果存在固体亲水组分,则选自亲脂组分和表面活性剂的组分中的至少一种是液体或半固体。如果存在液体亲水性组分(e),亲脂性组分和表面活性剂都可为固体。例如,所述表面活性剂为液体或半固体。在一个方面,存在固体亲水组分。
本文中所用的术语“载体”是指将治疗活性的水溶性多肽输送通过生物膜或在生物液中输送的药学上可接受的载体。所述载体包含亲脂组分和极性有机溶剂,和任选固体亲水组分和/或表面活性剂。所述载体当与含水介质例如水、含水液体或哺乳动物的体内介质如胃肠道的胃液接触、被其分散或稀释时,能自发产生乳液或胶体结构。所述胶体结构可为固体或液体颗粒,包括畴(domains)、液滴、微胶束、混合的微胶束、囊和纳米颗粒。
例如,当所述药物组合物与含水介质接触时,自发形成乳液如微乳液。具体而言,当输送系统被口服消化时,在哺乳动物的消化道内形成乳液或微乳液。除了上述组分外,可自发分散的预浓缩物还可任选包含其它赋形剂,如缓冲剂、pH值调节剂、稳定剂和本领域中技术人员认为适合于这种药物用途的其它佐剂。
本文中所用的术语“无水”是指在制备所述药物组合物的过程中没有向组合物中加入水。在制备药物组合物之前,所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素和/或所述药物组合物中的一种或多种赋形剂可能有少量水结合到其上。例如,无水药物组合物包含少于10%w/w水,例如少于5%w/w水,例如少于4%w/w水,例如少于3%w/w水,例如少于2%w/w水,例如少于1%w/w水。
本文中所用的术语“微乳液预浓缩物”是指一组合物,其在含水介质例如水中或口服后在胃肠道液体中自发形成微乳液,例如水包油乳液。所述溶液在含水介质中稀释例如稀释1∶5,1∶10,1∶50,1∶100或更高时自乳化。
由于所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的高溶解性,SEDDS中极性有机溶剂的总量可保持很低,这在一方面改善了所述制剂与胶囊材料的相容性,而在另一方面给予所述组合物更多的设计空间。
所述药物组合物包含亲脂组分和有机极性组分。所述药物输送系统的组分可以任何相对量存在。例如,所述药物输送系统可包含所述载体组分的高达40%重量,例如少于30%,20%,15%或10%的极性有机组分。在另一方面中,所述药物输送系统包含所述载体总组分的5%-40%重量的极性有机组分。在另一方面,所述药物输送系统包含所述载体总组分的10%-30%重量的极性有机组分。
所述药物组合物可为非粉末组合物形式,即为半固体或液体形式。
本文中所用的术语“液体”是指在室温下(“RT”)下为液态并具有例如低于20℃的熔点的组分或组合物。本文中所用的室温(RT)是指大约20-25℃。
本文中所用的术语“半固体”是指在室温下不是液体,例如具有室温至大约40℃之间的熔点的组分或组合物。半固体可具有物质固态和液态两者的性质和/或特征。本文中所用的术语“固化”是指成为固体或半固体。
半固体或液体组合物的实例为例如油类、溶液、液体或半固体SMEDDS和液体或半固体SEDDS形式的药物组合物。
“SMEDDS”(自微乳化药物输送系统的缩写)在本文中定义为亲水性组分、表面活性剂、任选助表面活性剂和药物的各向同性混合物,当其在GI管道中会遇到的温和搅拌或消化运动条件下暴露于含水介质时迅速形成水包油微乳液。
“SEDDS”(自乳化药物输送系统)在本文中定义为亲水组分、表面活性剂、任选助表面活性剂和药物的混合物,当其在GI管道中会遇到的温和搅拌或消化运动条件下暴露于含水介质时自发形成水包油细乳液。
本文中所用的术语“微乳液”是指当其组分与含水介质接触时自发或实质上自发形成的透明或半透明、稍微不透明、乳白色、透明或实质透明的胶态分散体。
本文中所用的术语“乳液”是指当其组分与含水介质接触时自发或实质上自发形成的稍微不透明、乳白色或不透明的胶态分散体。
微乳液是热力学稳定的并包含均匀分散的例如固态或液态的颗粒或畴(例如液态脂质颗粒或液滴),通过标准光散射技术例如采用MALVERN ZETASIZER Nano ZS测得的平均粒径少于约500nm,例如少于约400nm或少于300nm,少于200nm,少于100nm,并且大于约2-4nm。本文中所用的术语“畴大小”是指重复散射单元且可通过例如小角X-射线测定。在一个方面,所述畴大小小于400nm,在另一方面,小于300nm,在又一方面,小于200nm。
当提及预浓缩物时本文中所用的术语“可自发分散的”是指组合物,当所述组合物的组分与含水介质接触而被含水介质稀释时,例如用手简单摇晃一段短时间,例如10秒钟,其能产生胶状结构如微乳液、乳液和其它胶体体系。在一个方面,本发明的可自发分散浓缩物是SEDDS或SMEDDS。
本文中所用的术语“亲脂组分”是指与油比与水更相容的物质、材料或成分。具有亲脂性的材料不溶或几乎不溶于水,但容易溶于油或其它非极性溶剂。术语“亲脂组分”可包含一种或多种亲脂性物质。多种亲脂组分可组成可自发分散的预浓缩物的亲脂相并在例如水包油乳液或微乳液中形成油相(oil aspect)。室温下,所述可自发分散的亲脂组分和亲脂相可为固体、半固体或液体。例如,固体亲脂组分可以糊状、粒状、粉状或片状存在。如果超过一种赋形剂包含亲脂组分,所述亲脂组分可为液体混合物、固体混合物或两者的混合物。
在一个方面,所述亲脂组分在所述药物组合物中的存在量为至少20%w/w。在另一方面,所述亲脂组分的存在量为至少30%,至少50%,至少80%或至少90%w/w。例如,所述亲脂组分可以所述组合物重量的约5%至约90%,例如约15%至约60%,例如约20%至约40%存在。固体亲脂组分即在室温下为固体或半固体的亲脂组分的实例包括但不限于如下:
1.单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯的混合物,如氢化椰油酸甘油酯(熔点(m.p.)为约33.5℃至约37℃],可从Sasol Germany(Witten,Germany)商购的WITEPSOL HI5;脂肪酸三甘油酯的实例,例如C10-C22脂肪酸三甘油酯包括天然和氢化油,如植物油;
2.酯,如丙二醇(PG)硬脂酸酯,可从Gattefosse Corp.(Paramus,NJ)商购的MONOSTEOL(m.p为约33℃至约36℃);二甘醇棕榈酸硬脂酸酯,可从Gattefosse Corp.商购的HYDRINE(m.p.为约44.5℃至约48.5℃);
3.多糖基化的(polyglycosylated)饱和甘油酯,如氢化棕榈油/棕榈仁油PEG-6酯(m.p.为约30.5℃至约38℃),可从Gattefosse Corp.商购的LABRAFIL M2130 CS,或Gelucire 33/01;
4.脂肪醇,如十四烷醇(m.p.为约39℃),可从Cognis Corp.(Cincinnati,OH)商购的LANETTE 14;带脂肪醇的脂肪酸的酯,例如鲸蜡醇棕榈酸酯(m.p.为约50℃);异山梨醇单月桂酸酯,例如,可从Uniqema(New Castle,Delaware)以商品名ARLAMOL ISML商购的,例如具有约43℃的熔点;
5.PEG-脂肪醇醚,包括聚氧乙烯(2)十六烷基醚,例如可从Uniqema商购BRlJ 52,具有约33℃的熔点,或聚氧乙烯(2)硬脂醚,例如具有约43℃的熔点、可从Uniqema商购的BRIJ 72;
6.脱水山梨糖醇酯,例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯,例如脱水山梨糖醇单棕榈酸酯或脱水山梨糖醇单硬脂酸酯,例如,可从Uniqema商购且熔点分别为约43℃至48℃或约53℃至约57℃和41℃至54℃的SPAN 40或SPAN 60;和
7.甘油单C6-C14脂肪酸酯。这些通过用植物油酯化甘油然后分子蒸馏获得。单酸甘油酯包括但不局限于对称(即β-单酸甘油酯)及不对称单酸甘油酯(α-单酸甘油酯)。它们还包括均匀甘油酸酯(即其中脂肪酸构成部分主要由单一脂肪酸组成)及混合的甘油酸酯(即其中脂肪酸构成部分由不同脂肪酸组成)。该脂肪酸构成部分可包括链长为例如C8-C14的饱和和不饱和脂肪酸。特别合适的有甘油单月桂酸酯,例如可从Sasol North America(Houston,TX)商购的IMWITOR 312(m.p.为约56℃-60℃);甘油单二椰油酸酯,可从Sasol商购的IMWITOR 928(m.p.为约33℃-37℃);柠檬酸单甘油酯,可商购的IMWITOR 370(m.p.为约59至约63℃);或甘油单硬脂酸酯,例如可从Sasol商购的IMWITOR 900(m.p.为约56℃-61℃);或自乳化甘油单硬脂酸酯,例如可从Sasol商购的IMWITOR 960(m.p.为约56℃-61℃)。
液体亲脂组分即室温下为液体的亲脂组分的实例包括但不局限于如下:
1.单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯的混合物,如中链单酸甘油酯和二酸甘油酯,甘油辛酸酯/癸酸酯,可从Abitec Corp.(Columbus,OH)商购的CAPMUL MCM;
2.甘油单或二脂肪酸酯,例如C6-C18,例如C6-C16,例如C8-C10,例如C8脂肪酸及其乙酰化衍生物,例如出自Eastman Chemicals(Kingsport,TN)的MYVACET 9-45或9-08或出自Sasol的IMWITOR 308或312;
3.丙二醇单或二脂肪酸酯,例如C8-C20,例如C8-C12脂肪酸的丙二醇单或二脂肪酸酯,例如出自Abitec Corp.的LAUROGLYCOL 90,SEFSOL 218或CAPRYOL 90或CAPMUL PG-8(与丙二醇辛酸酯相同);
4.油类,如红花油、芝麻油、杏仁油、花生油、棕榈油、麦芽油、玉米油、蓖麻油、椰子油、棉籽油、大豆油、橄榄油和矿物油;
5.脂肪酸或醇,例如C8-C20、饱和的或单或二不饱和的,例如油酸、油醇、亚油酸、癸酸、辛酸、己酸、十四醇、十二醇、癸醇;
6.中链脂肪酸三甘油酯,例如C8-C12,例如MIGLYOL 812,或长链脂肪酸三甘油酯,例如植物油;
7.酯交换的、乙氧基化的植物油,例如可从Gattefosse Corp商购的LABRAFIL M2125 CS;
8.脂肪酸和伯醇的酯化化合物,例如C8-C20脂肪酸和C2-C3醇,例如亚油酸乙酯,例如可从Nikko Chemicals(Tokyo,Japan)商购的NIKKOL VF-E,丁酸乙酯,辛酸亚油酸乙酯(ethyl caprylate oleic acid),油酸乙酯,肉豆蔻酸异丙酯和辛酸乙酯;
9.精油,或给予植物特征气味的挥发油类中的任何一种,例如绿薄荷油,丁香油,柠檬油和椒样薄荷油;
10.精油的馏分或组分,如薄荷醇,香芹酚和麝香草酚;
11.合成油,如三醋精,三丁精;
12.柠檬酸三乙酯,柠檬酸乙酰基三乙酯,柠檬酸三丁酯,柠檬酸乙酰基三丁酯;
13.聚甘油脂肪酸酯,例如单油酸二甘油酯,例如出自Nikko Chemicals的DGMO-C,DGMO-90,DGDO;和
14.脱水山梨醇酯,例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯,例如脱水山梨糖醇单月桂酸酯,例如可从Uniqema商购的SPAN 20。
15.磷脂,例如烷基-O-磷脂,二酰基磷脂酸,二酰基磷脂酰胆碱,二酰基磷脂酰乙醇胺,二酰基磷脂酰甘油,二-O-烷基磷脂酸,L-α-溶血磷脂酰胆碱(LPC),L-α-溶血磷脂酰乙醇胺(LPE),L-α-溶血磷脂酰甘油(LPG),L-α-溶血磷脂酰肌醇(LPI),L-α-磷脂酸(PA),L-α-磷脂酰胆碱(PC),L-α-磷脂酰乙醇胺(PE),L-α-磷脂酰甘油(PG),双磷脂酰甘油(CL),L-α-磷脂酰肌醇(PI),L-α-磷脂酰丝氨酸(PS),溶血磷脂酰胆碱,溶血磷脂酰甘油,可从LARODAN商购的半合成甘油磷酰胆碱,或可从Lipoid GmbH商购的大豆磷脂(Lipoid S100)。
例如,所述亲脂组分为选自单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯中的一种或多种。在一个方面,所述亲脂组分为选自单酸甘油酯和二酸甘油酯中的一种或多种。在另一方面,所述亲脂组分为Capmul MCM或Capmul PG-8。在另一方面,所述亲脂组分为Capmul PG-8。
术语“极性有机溶剂”在本文中一方面是指“极性质子有机溶剂”,其为包含O-H或N-H键的亲水的、水可混溶性含碳溶剂或其混合物。所述极性反映在溶剂的介电常数或偶极距上。溶剂的极性决定了它能溶解何种化合物和它与何种其它溶剂或液体化合物混溶。通常,极性有机溶剂最好地溶解极性化合物而非极性溶剂最好地溶解非极性化合物:“相似相溶”。强极性化合物如无机盐(例如氯化钠)仅溶解于非常极性溶剂中。
极性有机溶剂可选自其中所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素在所述极性有机溶剂中显示了比在其它溶剂中更好的溶解性的溶剂。
因此,乙酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素可高度溶解于无水的药物学上可接受的极性有机溶剂如丙二醇、甘油和PEG200中。例如,至少20%(w/w)的乙酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素溶解于无水的药物学上可接受的极性有机溶剂中,即当将20%w/w的乙酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素加入极性有机溶剂中时,获得清澈溶液。在另一方面,至少25%、30%、40%或50%(w/w)的乙酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素溶解于无水的、药学上可接受的极性有机溶剂中。
因此,所述极性有机溶剂可指包含O-H或N-H键的亲水的、水可混溶性含碳溶剂或其混合物。所述极性反映在溶剂的介电常数或偶极距上。溶剂的极性决定了它能溶解何种化合物和它与何种其它溶剂或液体化合物混溶。通常,极性有机溶剂最好地溶解极性化合物而非极性溶剂最好地溶解非极性化合物:“相似相溶”。强极性化合物如无机盐(例如氯化钠)仅溶解于非常极性溶剂中。
例如,所述极性有机溶剂为介电常数在20以上,优选在20-50范围内的溶剂。不同极性有机溶剂的实例与作为对照的水一起列于表1中。
表1.选定的极性有机溶剂和作为对照的水的介电常数(静电介电常数)(Handbook of Chemistry and Physics,CMC Press,介电常数在静电场或较低频率下测定,其中不发生松弛)
在本文上下文中,1,2-丙二醇和丙二醇可相互替代使用。在本文上下文中,丙三醇和甘油可相互替代使用。在本文上下文中,乙二醇和乙撑二醇可相互替代使用。
例如,所述极性有机溶剂选自多元醇。本文中所用的术语“多元醇”是指包含多个羟基的化合物。
在一个方面,所述极性有机溶剂选自二元醇和三元醇。本文中所用的术语“二元醇”是指包含两个羟基的化合物。本文中所用的术语“三元醇”是指包含三个羟基的化合物。
例如,所述极性有机溶剂选自甘油(丙三醇)、乙二醇(乙撑二醇)、1,3-丙二醇、甲醇、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、丙二醇(1,2-丙二醇)、乙醇和异丙醇或其混合物。一个替代方案中,所述极性有机溶剂选自丙二醇和甘油。甘油即使在高剂量下也是生物相容的并对酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素具有高的溶解能力。或者,所述极性有机溶剂选自丙二醇和乙二醇。这些极性有机溶剂具有低的粘度,在中等剂量具有生物相容性并对酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素具有非常高的极性有机溶剂能力。
所述极性有机溶剂应优选为高纯度的,其具有低含量的例如醛、酮和其它还原杂质以使例如Maillard反应引起的已溶解多肽的化学变质最小化。可将清除剂分子如甘氨酰甘氨酸(二甘肽)和乙二胺加入包含极性有机溶剂如多元醇的制剂中以减少多肽的变质,但可加入抗氧剂来降低其它还原杂质的形成速率。
在本发明一方面,所述极性有机溶剂在所述药物组合物中的存在量为1-50%w/w,例如5-40%w/w,例如5-30%w/w。或者,所述有机极性溶剂的存在量为10-30%w/w,例如10-25%w/w,例如约20%w/w或约15%w/w。
例如,所述极性有机极性溶剂为丙二醇且在所述药物组合物中的存在量为1-50%w/w,例如5-40%w/w,例如10-30%w/w,例如10-25%w/w,例如10-20%w/w,例如约20%w/w或约15%w/w。
例如,所述极性有机溶剂选自甘油、丙二醇及其混合物。
可将固体亲水性组分加入所述药物组合物中以使或帮助使所述药物组合物在室温下为固体或半固体。所述亲水性组分可包含一种以上赋形剂。如果一种以上赋形剂包含所述亲水性组分,所述亲水性组分可为液体混合物、固体混合物或者两者的混合物。
当固体亲水性组分存在时,所述药物组合物可包含约1%至约25%重量的固体亲水性组分,例如,约2%至约20%,例如约3%至约15%,例如约4%至约10%。
亲水性组分的一个实例为PEG,其为环氧乙烷的聚合物,大致符合式H(OCH2CH2)nOH,其中n与该聚合物的平均分子量对应。
用于制备药物组合物的PEG种类可根据其物态来分类,即所述物质在室温和室压下是否以固体或液体状态存在。本文中所用的术语“固体PEG”是指具有一分子量使得所述物质在室温和室压下为固态的PEG。例如,分子量为1,000和10,000之间的PEG为固体PEG。这种PEG包括但不局限于PEG 1000,PEG 1550,PEG 2000,PEG 3000,PEG 3350,PEG 4000或PEG 8000。特别有用的固体PEG是分子量在1,450和8,000之间的那些。特别可用作固体PEG是PEG 1450,PEG 3350,PEG 4000,PEG 8000,其衍生物及其混合物。不同分子量的PEG可为可从Dow Chemicals(Danbury,CT)商购的CARBOWAX SENTRY系列。此外,固体PEG具有晶体结构或聚合基体,与PEG具有相同结构但链长和末端基不同的聚环氧乙烷(“PEO”)也是合适的。不同等级的PEO可从Dow Chemicals.以POLYOX商购。PEO,例如具有约100,000至7,000,000的分子量。所述亲水性组分可包含PEG,PEO和上述的任何组合。
所述亲水性组分可任选包含低级烷醇,例如乙醇。当不必须使用乙醇时,它能改善所述多肽在所述载体中的溶解性能,改善储存性能和/或减少药物沉淀风险。
在一替代示例性方面,所述载体的亲水性组分由单一亲水性组分组成,例如固体PEG,例如PEG 1450,PEG 3350,PEG 4000和PEG 8000。在该示例性方面中,所述微乳液组分的亲水相由单一亲水性物质组成。例如,如果所述载体包含PEG 3350,则所述载体不包含其它亲水性物质,例如低级烷醇(为C1-C4的低级烷基),例如乙醇,或水。
在另一替代示例性方面,所述载体的亲水性组分由固体PEG的混合物组成。例如,所述亲水性组分包含PEG 1450,PEG 3350,PEG 4000,PEG 8000,其衍生物及其任何组合和混合物。
在一个方面,所述载体包含一种或多种表面活性剂,即任选表面活性剂的混合物;或表面活性剂,其减小了界面张力。所述表面活性剂为,例如非离子的、离子的或两性的。表面活性剂可为包含其制备过程中涉及的副产物或未反应原料的复杂混合物,例如,通过环氧乙烷加成作用制备的表面活性剂可包含另一副产物,例如PEG。所述表面活性剂具有亲水-亲油平衡(HLB)值,其为至少8。例如,所述表面活性剂可具有8-30,例如12-30,12-20或13-15的平均HLB值。所述表面活性剂可本质上为液体、半固体或固体。
本文中所用的术语“表面活性剂”是指任何物质,尤其是可在表面和界面如液体-气体、液体-液体、液体-容器或液体-任何固体的界面处吸附的清洁剂。所述表面活性剂可选自清洁剂,如乙氧基化的蓖麻油、聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolyzed glyceride)、乙酰基化的单酸甘油酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨糖醇酯,如聚山梨糖醇酯-20、泊洛沙姆(poloxamer),如泊洛沙姆188和泊洛沙姆407,聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯,聚环氧乙烷衍生物如烷基化的和烷氧基化的衍生物(吐温(tween),例如Tween-20或Tween-80),单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物,二酸甘油酯或其聚环氧乙烷衍生物,甘油,胆汁酸或其衍生物,卵磷脂,醇和磷脂,甘油磷脂(卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸),甘油糖脂(半乳糖吡喃糖苷),鞘磷脂(神经鞘磷脂),和鞘糖脂(神经酰胺、神经节苷脂),DSS(多库酯钠,CAS登记号[577-11-7]),多库酯钙,CAS登记号[128-49-4]),多库酯钾,CAS登记号[7491-09-0]),SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠),二棕榈酰磷脂酸,辛酸钠,胆汁酸及其盐和甘油酸或牛磺酸缀合物,乌索脱氧胆酸,胆酸钠,脱氧胆酸钠,牛磺胆酸钠,甘氨胆酸钠,N-十六烷基-N,N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸酯,阴离子(烷芳基-磺酸酯)单价表面活性剂,棕榈酰基溶血磷脂酰-L-丝氨酸,溶血磷脂(例如乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯),溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物,例如溶血磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物,二棕榈酰磷脂酰胆碱和极性头基的改性物,即胆碱,乙醇胺,磷脂酸,丝氨酸,苏氨酸,甘油,肌醇和带正电荷的DODAC,DOTMA,DCP,BISHOP,溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸,两性表面活性剂(例如N-烷基-N,N-二甲氨-1-丙磺酸酯,3-胆氨基-1-丙基二甲基氨-1-丙磺酸酯,十二烷基磷酸胆碱,肉豆蔻酰溶血磷脂酰胆碱,鸡蛋溶血卵磷脂),阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如十六烷基三甲基溴化铵,十六烷基氯化吡啶),非离子表面活性剂(例如,烷基糖苷如十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷,十二烷基β-D-麦芽糖苷,十四烷基β-D-吡喃葡萄糖苷,癸基β-D-麦芽糖苷,十二烷基β-D-麦芽糖苷,十四烷基β-D-麦芽糖苷,十六烷基β-D-麦芽糖苷,癸基β-D-麦芽三糖苷,十二烷基β-D-麦芽三糖苷,十四烷基β-D-麦芽三糖苷,十六烷基β-D-麦芽三糖苷,正十二烷基蔗糖,正癸基蔗糖,脂肪醇乙氧基化物(例如,聚氧乙烯烷基醚如八聚乙二醇单十三烷基醚,八聚乙二醇单十二烷基醚,八聚乙二醇单十四烷基醚),嵌段共聚物如聚环氧乙烷/聚环氧丙烷嵌段共聚物(Pluronics/Tetronics,Triton X-100),乙氧基化的山梨糖醇链烷酸酯表面活性剂(例如Tween-40,Tween-80,Brij-35),夫西地酸衍生物(例如牛磺二氢夫西地酸钠等),长链脂肪酸及其C8-C20盐(例如油酸和辛酸),酰肉碱及衍生物,赖氨酸、精氨酸或组氨酸的N-酰化衍生物,或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物,包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任意组合的二肽的N-酰化衍生物,包含中性氨基酸和两种带电荷的氨基酸的任意组合的三肽的N-酰化衍生物,或所述表面活性剂可选自咪唑啉衍生物或其混合物。
固体表面活性剂的实例包括但不局限于,
1.天然或氢化蓖麻油和环氧乙烷的反应产物。所述天然或氢化蓖麻油可与环氧乙烷以约1∶35至约1∶60的摩尔比反应,任选除去所得产物中的PEG组分。各种这种表面活性剂可商购,例如,出自BASF Corp.(Mt.Olive,NJ)的CREMOPHOR系列,如CREMOPHOR RH 40,其为PEG40氢化蓖麻油,其皂化值为约50至60,酸值少于约1,水含量即Fischer,少于约2%,nD 60为约1.453-1.457,而HLB为约14-16;
2.聚氧乙烯脂肪酸酯,包括聚氧乙烯硬脂酸酯,如出自Uniqema的MYRJ系列,如m.p.为大约47℃的MYRJ 53。
MYRJ系列中的具体化合物为,例如m.p.为约47℃的MYRJ 53和可作为MYRJ 52获得的PEG-40-硬脂酸酯;
3.脱水山梨糖醇衍生物,包含出自Uniqema的TWEEN系列,例如TWEEN 60;
4.聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和嵌段共聚物或泊洛沙姆,例如出自BASF的Pluronic F127,Pluronic F68;
5.聚氧乙烯烷基醚,例如C12-C18醇的聚氧亚乙基二醇醚,例如聚氧乙烯10-或20-十六烷基醚或聚氧乙烯23-月桂基醚或20-油基醚,或聚氧乙烯10-,20-或100-硬脂基醚,如已知并可从Uniqema商购的BRlJ系列。BRIJ系列的特别有用产品是BRIJ 58;BRIJ 76;BRIJ 78;BRIJ 35,即聚氧乙烯23月桂基醚;和BRIJ 98,即聚氧乙烯20油基醚。这些产物的m.p.在约32℃至约43℃;
6.可从Eastman Chemical Co.获得的、m.p.为约36℃的水溶性生育酚PEG琥珀酸酯,例如TPGS,例如维生素E TPGS。
7.具有5-35个[CH2-CH,-O]单元,例如20-30个单元的PEG固醇醚,例如出自Chemron(Paso Robles,CA)的SOLULAN C24(Choleth-24和Cetheth-24);还可以使用的类似产物为已知并可从Nikko Chemicals作为NIKKOL BPS-30(聚氧乙基30植物甾醇)和NIKKOL BPSH-25(聚氧乙基25植物甾烷醇)商购的那些;
8.具有4-10个甘油单元,或4、6或10个甘油单元的聚甘油脂肪酸酯。例如,特别合适的是十-/六-/四甘油单硬脂酸酯,例如出自Nikko Chemicals的DECAGLYN,HEXAGLYN和TETRAGLYN;
9.亚烷基多元醇醚或酯,例如月桂酰聚乙二醇-32甘油酯和/或硬脂酰聚乙二醇-32甘油酯,其分别为GELUCIRE 44/14和GELUCIRE 50/13;
10.饱和C10-C22如C18取代的例如羟基脂肪酸的聚氧乙烯单酯;例如12-羟基硬脂酸PEG酯,例如约例如600-900例如660道尔顿MW的PEG,例如出自BASF(Ludwigshafen,20Germany)的SOLUTOL HS 15。按照BASF技术小册子MEF 151E(1986),SOLUTOL HS 15包含约70%重量聚乙氧基化12-羟基硬脂酸酯和约30%重量未酯化的聚乙二醇组分。其氢化值为90-110,皂化值为53-63,酸值最大为1而最大水含量为0.5%重量;
11.聚氧乙烯-聚氧丙烯烷基醚,例如C12-C18醇的聚氧乙烯-聚氧丙烯醚,例如聚氧乙烯-20-聚氧丙烯-4-鲸蜡醚,其可从Nikko Chemicals作为NIKKOL PBC 34商购到;
12.聚氧乙基化二硬脂酸酯,例如可从Uniqema以商品名ATLAS G 1821购得的和出自Nikko Chemicals的NIKKOCDS-6000P;
13.卵磷脂,例如大豆磷脂,例如从Lipoid GmbH(Ludwigshafen,Germany)可商购的LIPOID S75,或蛋磷脂,可从Nattermann Phospholipid(Cologne,Germany)商购的PHOSPHOLIPON 90。
液体表面活性剂的实例包括但不局限于脱水山梨糖醇衍生物如TWEEN 20,TWEEN 40和TWEEN 80,SYNPERONIC L44,和聚氧乙烯10-油醚,都出自Uniqema,和含聚氧乙烯的表面活性剂,例如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯(例如出自Gattefosse的Labrasol)。
本发明的组合物可包含约0%至约95%重量的表面活性剂,例如约5%至约80%重量,例如约10%至约70%重量,例如约20%至约60%重量,例如约30%至约50%。
在一方面,所述表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和嵌段共聚物或泊洛沙姆,例如出自BASF的Pluronic F127,Pluronic F68。
在一方面,所述表面活性剂为泊洛沙姆。在另一方面,所述表面活性剂选自泊洛沙姆188,泊洛沙姆407和泊洛沙姆407与泊洛沙姆188的混合物。
在一方面,所述表面活性剂为含聚氧乙烯的表面活性剂,例如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯(例如,出自Gattefosse的Labrasol)。
在一方面,所述表面活性剂为月桂酰聚氧甘油酯(例如出自Gattefosse的Gelucire 44/14)。
在一方面,所述表面活性剂为出自BASF的Cremophor RH40。
在某些方面,所述药物组合物可包含通常在药物组合物中发现的其它赋形剂,这种赋形剂的实例包括但不局限于抗氧化剂、抗微生物剂、酶抑制剂、稳定剂、防腐剂、调味剂、甜味剂和Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册),Rowe等人编辑,第4版,Pharmaceutical Press(2003)(其通过引用结合于本文中)中描述的其它组分。
这些其它赋形剂的存在量可为整个药物组合物的约0.05-5%重量。抗氧化剂、抗微生物剂、酶抑制剂、稳定剂或防腐剂通常占整个药物组合物的多达约0.05-1%重量。甜味剂或调味剂通常可占整个药物组合物的多达约2.5%或5%重量。
抗氧剂的实例包括但不局限于抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、丁基羟基茴香醚和丁基羟基甲苯。
在一方面,所述组合物包含缓冲剂。本文中所用的术语“缓冲剂”是指药物组合物中的一化合物,它能降低所述组合物的pH值随时间变化的倾向,否则pH值会由于化学反应而随时间变化。缓冲剂包括磷酸钠、TRIS、甘氨酸和柠檬酸钠等化学品。
本文中所用的术语“防腐剂”是指一化合物,将其加入药物组合物来预防或延迟微生物活性(生长和新陈代谢)。药物上可接受的防腐剂的实例有苯酚、间苯酚及苯酚与间苯酚的混合物。
本文中所用的术语“稳定剂”是指加到含肽的药物组合物中以使所述肽稳定,即提高这些组合物的保存期和/或使用时间的化合物。用于药物制剂中的稳定剂的实例有L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、甘氨酰甘氨酸(双甘肽)、乙二胺、柠檬酸盐、EDTA、锌、氯化钠、聚乙二醇、羧甲基纤维素和表面活性剂和抗氧化剂如α-生育酚和1-抗坏血酸。
在另一方面,制备包含酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的药物组合物的方法,包括使所述药物与包含极性有机溶剂、亲脂组分和任选表面活性剂和/或亲水组分的载体成为紧密混合物的步骤。例如,所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素和所述载体可通过加热到约20℃至约80℃液化,然后通过冷却到室温以固化。
所述载体可在使包含极性有机溶剂、亲脂组分和任选表面活性剂和/或亲水组分的载体与衍生的胰岛素肽成为紧密混合物之前单独制备。或者,所述载体的一种、两种或更多种组分可与所述肽一起混和。
可将所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素溶解于极性有机溶剂中,然后与脂质组分并任选与表面活性剂混和。
或者,制备包含酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的药物组合物如SEDDS或SMEDDS(其可填充到胶囊,例如肠溶胶囊、软胶囊、肠溶软胶囊)的方法包括如下步骤:
(a)将所述衍生的胰岛素肽溶解于所述极性有机溶剂和
(b)与所述亲脂组分、表面活性剂和任选亲水组分混合。
例如,制备所述药物组合物的方法在低温下(例如室温或低于室温)进行。
当制备所述药物组合物时,可采用以下方法将所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素例如溶解于所述极性有机溶剂中:
a)提供所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的水溶液,任选包含赋形剂,
b)将pH值调节到目标pH值,其在所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的pI以上或以下1单位,或者2单位和或者2.5pH单位,
c)通过常规干燥技术如冷冻干燥和喷雾干燥除去所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的水(脱水),和
d)使所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素与所述极性无水溶剂混合并溶解于其中,例如通过搅拌、鼓转或其它混合方法,
e)任选过滤或离心分离所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的无水溶液以除去未溶解的无机盐,
f)任选通过例如加入固体干燥剂或真空干燥除去残余水。
例如,通过以下方法将所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素溶解于所述极性有机溶剂中:
a)提供酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的水溶液,任选包含稳定剂如锌和甘氨酰甘氨酸,
b)将pH值调节到所述肽的pI以上或以下1单位,或者2单位和或者2.5pH单位,例如通过将不挥发性碱或酸,如盐酸或氢氧化钠加入所得溶液中,
c)通过常规干燥技术如冷冻干燥和喷雾干燥除去所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的水(脱水),
d)使所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素与所述极性无水溶剂混合并溶解于其中,例如通过搅拌、鼓转或其它混合方法,
e)任选过滤或离心分离所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的无水溶液以除去未溶解的无机盐,
f)任选通过例如加入固体干燥剂或真空干燥除去残余水。
“挥发性碱”是指一种碱,其在加热和/或低压下会一定程度地蒸发,例如,室温下蒸汽压超过65Pa的碱或包含室温下蒸汽压超过65Pa的碱的含水共沸混合物。挥发性碱的实例有氢氧化铵、氢氧化四烷基铵、仲胺、叔胺、芳基胺、脂肪胺或碳酸氢铵或其组合。例如所述挥发性碱可为碳酸氢盐、碳酸盐、氨水、肼或有机碱如低级脂肪胺,例如三甲胺、三乙胺、二乙醇胺、三乙醇胺及其盐。此外,所述挥发性碱可为氢氧化铵、乙胺或甲胺或其组合。
“挥发性酸”是指一种酸,其在加热和/或低压下会一定程度地蒸发,例如,室温下蒸汽压超过65Pa的酸或包含室温下蒸汽压超过65Pa的酸的含水共沸混合物。挥发性酸的实例有碳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸。
本文中提到的“不挥发性碱”是指一种碱,其在加热时不会蒸发或仅部分蒸发,例如,室温下蒸汽压低于65Pa的碱。所述不挥发性碱可选自碱金属盐、碱金属氢氧化物、碱土金属盐、碱土金属氢氧化物和氨基酸或其组合。不挥发性碱的实例有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和氧化钙。
本文中提到的“不挥发性酸”是指一种酸,其在加热时不会蒸发或仅部分蒸发,例如,室温下蒸汽压低于65Pa的碱。不挥发性酸的实例有盐酸、磷酸和硫酸。
所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的存在量可高达所述组合物的约40%,如可高达约20%重量,或从约0.01%如从约0.1%,或者从所述组合物的约0.01%至约20%,或者,从约1%至20%或从约1%至10%重量。然而,希望按照药物领域中熟知的因素选择具体的多肽水平,包括所述肽在所用的极性有机溶剂或任选亲水组分或表面活性剂或其混合物中的溶解性,给药方式和患者的尺寸和状况。
例如,所述药物制剂包含浓度为0.1%w/w至30%w/w的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。
各单位剂量将合适地包含0.1mg至300mg酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素多肽,例如约0.1mg,1mg,5mg,10mg,15mg,25mg,50mg,100mg,200mg,250mg,300mg,例如5mg-300mg酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。例如,各单位剂量包含10mg-300mg,例如10mg-100mg或20mg-300mg,例如20mg-100mg酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。根据具体的治疗目的,这种单位剂型适合于每日给药1-5次。
在溶解于所述极性有机溶剂之前,所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素经过pH最优化以改善在所述极性有机溶剂中的溶解性。
当使用术语“pH最优化”时,它在本文中是指所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素已在目标pH下脱水,所述目标pH与所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素在水溶液中的pI相差至少1个pH单位。因此,所述目标pH超过所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素的等电点1个pH单位以上。或者,所述目标pH低于所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素等电点1个pH单位以下。因此,所述目标pH可高于或低于所述pI 1.5个pH单位以上,例如高于或低于所述pI2.0个pH单位或以上,例如高于或低于所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素的pI2.5个pH单位或以上。
术语“脱水的”在本文中与酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素一起使用时是指已从水溶液中干燥的衍生的酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素。本文中所用术语“目标pH值”是指含水pH值,其会在所述脱水的、酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素在纯水中再水合至约40mg/ml或更高的浓度时建立。所述目标pH值将通常等于所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素水溶液的pH值,所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素通过干燥从所述水溶液中回收。然而,如果所述溶液包含挥发性酸或碱,所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素溶液的pH值将不等于目标pH值。已发现所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素的pH值历史将对所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素的量起决定作用,所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素可溶于极性有机溶剂中。
本文中所用的术语“多肽的pI值”是指多肽的等电点。
本文中所用的术语“等电点”是指一pH值,在此pH值下,大分子如肽的总净电荷为零。肽中可能存在几个带电基团,在等电点,所有这些电荷的总和等于零。在等电点以上的pH值下,所述肽的总净电荷将为负值,而在等电点以下的pH值下,所述肽的总净电荷将为正值。
蛋白的pI值可通过电泳技术如电聚焦来试验地确定:
在防对流介质(anticonvective)如聚丙烯酰胺凝胶中建立pH梯度。当将蛋白引入所述体系中时,它会在所施加的电场影响下移动穿过所述凝胶。正电荷蛋白会移动到阴极。最终,移动的蛋白到达所述pH梯度中的一个点,在此其净电荷为零并认为被聚焦。这是所述蛋白的等电pH(pI)值。然后将所述蛋白固定在所述凝胶上并染色。接着通过比较相对于PI值已知的标记分子所述蛋白在凝胶上的位置确定所述蛋白的pI值。
蛋白在给定pH值下的净电荷可由本领域技术人员通过常规方法来从理论上估计。本质上,蛋白的净电荷等于所述蛋白中以下带电氨基酸的部分电荷的总和:天冬氨酸(β-羧基),谷氨酸(δ-羧基),半胱氨酸(硫醇基),酪氨酸(苯酚基),组氨酸(咪唑侧链),赖氨酸(ε-铵基)和精氨酸(胍基)。此外,还应该考虑蛋白末端基(α-NH2和α-COOH)的电荷。所述离子化基团的部分电荷可从内在pKa值计算出来。
所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素的干燥即脱水可通过任何常规干燥方法例如通过喷雾、冷冻、真空、风干和接触干燥等进行。例如,将所述酰化的、蛋白酶稳定的胰岛素溶液喷干以使得水含量低于约10%,例如低于约8%,低于约6%,低于约5%,低于约4%,低于约3%,低于约2%或低于约1%,如实验部分中所述通过干燥测试失重(重量分析)来计算/测定。
例如,所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素经过喷雾干燥或冷冻干燥。
包含本发明的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的组合物可以用于治疗对胰岛素敏感的状态。因此,它们可以用于治疗I型、II型糖尿病和高血糖症,例如在受到严重伤害的人和进行大手术的人中有时所看到的症状。对于任何患者,最佳剂量水平取决于各种因素,包括所使用的具体胰岛素衍生物的效果,患者的年龄、体重、身体活动和饮食,取决于与其它药物的可能组合,和取决于所治疗状况的严重程度。推荐的是,对于每个个体患者,由本领域技术人员按照与已知胰岛素组合物类似的方法来确定本发明的酰化胰岛素的日剂量。
本发明的优选特征
本发明的特征如下:
1、酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素形式上由非蛋白酶稳定化的胰岛素(母体胰岛素)组成,其中至少一个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代,且其中所述取代在所述非蛋白酶稳定化的胰岛素(母体胰岛素)的一个或多个蛋白酶裂解位点内部或其紧密相邻处,其中这种蛋白酶稳定化的胰岛素任选还包含一个或多个其它突变,条件是所述稳定化的胰岛素内仅存在一个赖氨酸残基,并且其中所述酰基部分与所述蛋白酶稳定化的胰岛素的赖氨酸残基或N-末端位置相连接。
2、酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素形式上由非蛋白酶稳定化的胰岛素(母体胰岛素)组成,其中至少两个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代,且其中所述取代在所述非蛋白酶稳定化的胰岛素(母体胰岛素)的两个或更多个蛋白酶裂解位点内部或其紧密相邻处,其中这种蛋白酶稳定化的胰岛素任选还包含一个或多个其它突变,条件是所述稳定化的胰岛素内仅存在一个赖氨酸残基,并且其中所述酰基部分与所述蛋白酶稳定化的胰岛素的赖氨酸残基相连接。
3、酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素形式上非蛋白酶稳定化的胰岛素(母体胰岛素)组成,其中至少两个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代,且其中所述取代在所述非蛋白酶稳定化的胰岛素(母体胰岛素)的两个或更多个蛋白酶裂解位点内部或其紧密相邻处,其中这种蛋白酶稳定化的胰岛素任选还包含一个或多个其它突变,条件是所述稳定化的胰岛素内仅存在一个赖氨酸残基,并且其中所述酰基部分与所述蛋白酶稳定化的胰岛素的赖氨酸残基或N-末端位置相连接。
4、按照前述条款的酰化胰岛素,其中相对于酰化的母体胰岛素,所述蛋白酶稳定化的胰岛素具有提高的溶解性。
5、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化胰岛素,其中相对于母体胰岛素,所述胰岛素的B链包含至少一个突变。
6、按照前一条款(至可能的程度)的酰化胰岛素,其中相对于母体胰岛素,所述胰岛素的B链包含一个、两个或三个但不是更多的突变。
7、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素的A链与人胰岛素的A链相同。
8、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化胰岛素,其中相对于母体胰岛素,所述胰岛素的A链包含至少一个突变且所述胰岛素的B链包含至少一个突变。
9、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化胰岛素,其中相对于母体胰岛素,所述胰岛素的A-链包含至少两个突变且所述胰岛素的B-链包含至少一个突变。
10、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化胰岛素,其中所述胰岛素在第一个被修饰的蛋白酶稳定化的胰岛素的蛋白酶位置还包括至少一个氨基酸取代,其中所述至少一个氨基酸取代使得至少一个疏水性氨基酸被至少一个亲水性氨基酸取代。
11、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A12位的氨基酸为Glu或Asp;和/或A13位的氨基酸为His,Asn,Glu或Asp;和/或A14位的氨基酸为Tyr,Asn,Gln,Glu,Arg,Asp,Gly或His;和/或A15位的氨基酸为Glu或Asp;和B24位的氨基酸为His;和/或B25位的氨基酸为His或Asn;和/或B26位的氨基酸为His,Gly,Asp或Thr;和/或B27位的氨基酸为His,Glu,Asp,Gly或Arg;和/或B28位的氨基酸为His,Gly,Glu或Asp;且所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素任选还包含一个或多个其它突变。
12、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A12位的氨基酸为Glu或Asp;和/或A13位的氨基酸为His,Asn,Glu或Asp;和/或A14位的氨基酸为Tyr,Asn,Gln,Glu,Arg,Asp,Gly或His;和/或A15位的氨基酸为Glu或Asp;和/或B16位的氨基酸为Tyr,His或Glu;和/或B24位的氨基酸为His;和/或B25位的氨基酸为His或Asn;和/或B26位的氨基酸为His,Gly,Asp或Thr;和/或B27位的氨基酸为His,Glu,Asp,Gly,Lys,Arg或缺失;和/或B28位的氨基酸为His,Gly,Glu,Asp或不存在(缺失);和/或B29位的氨基酸为Lys,Arg或不存在(缺失);且所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素任选还包含一个或多个其它突变,且优选酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A12位的氨基酸为Glu或Asp;和/或A13位的氨基酸为His,Asn,Glu或Asp;和/或A14位的氨基酸为Tyr,Asn,Gln,Glu,Arg,Asp,Gly或His;和/或A15位的氨基酸为Glu或Asp;和B24位的氨基酸为His;和/或B25位的氨基酸为His或Asn;和/或B26位的氨基酸为His,Gly,Asp或Thr;和/或B27位的氨基酸为His,Glu,Asp,Gly或Arg;和/或B28位的氨基酸为His,Gly,Glu或Asp;且所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素任选还包含一个或多个其它突变。
13、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A14位的氨基酸为Glu,Asp或His,B25位的氨基酸为His为Asn且所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素任选还包含一个或多个其它突变。
14、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A14位的氨基酸为Glu,Asp或His,B25位的氨基酸为His或Asn且B30位的氨基酸缺失。
15、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A14位的氨基酸为Glu,Asp或His,B16位的氨基酸为His或Glu,B25位的氨基酸为His且B30位的氨基酸缺失。
16、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A14位的氨基酸为Glu,Asp或His和B25位的氨基酸为His且B30位的氨基酸缺失。
17、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A14位的氨基酸为Glu或Asp和B28位的氨基酸为Glu或Asp,且任选B30位没有氨基酸残基。
18、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述一个或多个其它突变选自:A8His,A18Gln,A21Gln,A21Gly,B1Glu,B1Gln,B3Gln,B10Pro,B14Thr,B16Glu,B17Ser,B26Asp,B27Glu,B27Asp,B28Asp,B28Glu和desB30。
19、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述其它突变为desB30。
20、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中A14为Glu。
21、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中B25为Asn。
22、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中B25为His。
23、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中B25为Asn且B27为Glu或Asp。
24、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中B25为Asn且B27为Glu。
25、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,相对于母体蛋白,其针对一种或多种蛋白酶的稳定性提高。
26、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,相对于母体蛋白,其针对两种或更多种蛋白酶的稳定性提高。
27、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述母体胰岛素选自:a)人胰岛素;b)人胰岛素的胰岛素类似物,其中B28位的氨基酸残基为Pro,Asp,Lys,Leu,Val或Ala,B29位的氨基酸残基为Lys或Pro,且任选B30位的氨基酸残基缺失;c)des(B26-B30)人胰岛素,des(B27-B30)人胰岛素,des(B28-B30)人胰岛素,des(B29-B30)人胰岛素,des(B27)人胰岛素或des(B30)人胰岛素;d)人胰岛的胰岛素类似物,其中B3位的氨基酸残基为Lys,B29位的氨基酸残基为Glu或Asp;e)人胰岛素的胰岛素类似物,其中A21位的氨基酸残基为Gly,和其中所述胰岛素类似物在C端进一步用两个Arg残基延长;f)胰岛素衍生物,其中B30位的氨基酸残基被苏氨酸甲酯取代;和g)胰岛素衍生物,其中des(B30)人胰岛素的B29位的赖氨酸的Nε位与一个十四酰基链相连。
28、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中选择一个或多个其它突变来增强胰岛素的化学稳定性。
29、按照前一条款(至可能的程度)的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述一个或多个其它突变选自A18Gln,A21Gln,A21Gly和B3Gln。
30、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其包含式1的A-链氨基酸序列,即:
XaaA(-2)-XaaA(-1)-XaaA0-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21(SEQ ID No:1),和式2的B链氨基酸序列,即:
XaaB(-2)-XaaB(-1)-XaaB0-XaaB1-XaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB30-XaaB31-XaaB32(SEQ ID No:2),其中XaaA(-2)不存在,或是Gly;XaaA(-1)不存在,或是Pro;XaaA0不存在,或是Pro;XaaA8独立地选自Thr和His;XaaA12独立地选自Ser,Asp和Glu;XaaA13独立地选自Leu,Thr,Asn,Asp,Gln,His,Lys,Gly,Arg,Pro,Ser和Glu;XaaA14独立地选自Tyr,Thr,Asn,Asp,Gln,His,Lys,Gly,Arg,Pro,Ser和Glu;XaaA15独立地选自Gln,Asp和Glu;XaaA18独立地选自Asn,Lys和Gln;XaaA21独立地选自Asn和Gln;XaaB(-2)不存在,或是Gly;XaaB(-1)不存在,或是Pro;XaaB0不存在,或是Pro;XaaB1不存在,或独立地选自Phe和Glu;XaaB2不存在,或是Val;XaaB3不存在,或独立地选自Asn和Gln;XaaB4独立地选自Gln和Glu;XaaB10独立地选自His,Asp,Pro和Glu;XaaB16独立地选自Tyr,Asp,Gln,His,Arg和Glu;XaaB24独立地选自Phe和His;XaaB25独立地选自Phe,Asn和His;XaaB26不存在,或独立地选自Tyr,His,Thr,Gly和Asp;XaaB27不存在,或独立地选自Thr,Asn,Asp,Gln,His,Gly,Arg,Pro,Ser和Glu;XaaB28不存在,或独立地选自Pro,His,Gly和Asp;XaaB29不存在,或独立地选自Lys和Gln;XaaB30不存在,或是Thr;XaaB31不存在,或是Leu;XaaB32不存在,或是Glu;C末端可以任选衍生为酰胺;其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列通过A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间的二硫键连接,和其中A链的6位和11位的半胱氨酸通过二硫键连接。其中任选N末端A链氨基酸序列通过包含3-7个氨基酸的氨基酸序列与C末端B链氨基酸序列连接,以形成单链胰岛素分子,其中任选B链的N末端延长1-10个氨基酸;其中,如果XaaA8是Thr和XaaA12是Ser和XaaA13是Leu和XaaA14是Tyr,那么XaaA15是Glu或Asp;且其中,如果XaaB24是Phe和XaaB25是Phe和XaaB26是Tyr和XaaB27是Thr和XaaB28是Pro,那么XaaB29是Gln。
31、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,包含式3的A链氨基酸序列,即:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21(SEQ ID No:3),和式4的B链氨基酸序列,即:XaaB1-Val-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-His-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB30(SEQ ID No:4),其中XaaA8独立地选自Thr和His;XaaA12独立地选自Ser,Asp和Glu;XaaA13独立地选自Leu,Thr,Asn,Asp,Gln,His,Lys,Gly,Arg,Pro,Ser和Glu;XaaA14独立地选自Tyr,Thr,Asn,Asp,Gln,His,Lys,Gly,Arg,Pro,Ser和Glu;XaaA15独立地选自Gln,Asp和Glu;XaaA18独立地选自Asn,Lys和Gln;XaaA21独立地选自Asn和Gln;XaaB1独立地选自Phe和Glu;XaaB3独立地选自Asn和Gln;XaaB4独立地选自Gln和Glu;XaaB10独立地选自His,Asp,Pro和Glu;XaaB16独立地选自Tyr,Asp,Gln,His,Arg和Glu;XaaB24独立地选自Phe和His;XaaB25独立地选自Phe,Asn和His;XaaB26不存在,或独立地选自Tyr,His,Thr,Gly和Asp;XaaB27不存在,或独立地选自Thr,Asn,Asp,Gln,His,Gly,Arg,Pro,Ser和Glu;XaaB28不存在,或独立地选自Pro,His,Gly和Asp;XaaB29不存在,或独立地选自Lys和Gln;XaaB30不存在,或是Thr;C末端可以任选衍生为酰胺;其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列通过A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间的二硫键连接,其中A链的6位和11位的半胱氨酸通过二硫键连接。
32、按照前一条款(至可能的程度)的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中XaaA8独立地选自Thr和His;XaaA12独立地选自Ser和Glu;XaaA13独立地选自Leu,Thr,Asn,Asp,Gln,His,Lys,Gly,Arg,Pro,Ser和Glu;XaaA14独立地选自Tyr,Asp,His和Glu;XaaA15独立地选自Gln和Glu;XaaA18独立地选自Asn,Lys和Gln;XaaA21独立地选自Asn和Gln;XaaB1独立地选自Phe和Glu;XaaB3独立地选自Asn和Gln;XaaB4独立地选自Gln和Glu;XaaB10独立地选自His,Asp,Pro和Glu;XaaB16独立地选自Tyr,Asp,Gln,His,Arg和Glu;XaaB24独立地选自Phe和His;XaaB25独立地选自Phe,Asn和His;XaaB26独立地选自Tyr,Thr,Gly和Asp;XaaB27独立地选自Thr,Asn,Asp,Gln,His,Lys,Gly,Arg和Glu;XaaB28独立地选自Pro,Gly和Asp;XaaB29独立地选自Lys和Gln;XaaB30不存在,或是Thr;C末端可以任选衍生为酰胺;其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列通过在A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间的二硫键连接,且其中A链的6位和11位的半胱氨酸通过二硫键连接。
33、酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中,所述蛋白酶稳定化的胰岛素中,A14位的氨基酸为Glu或His(按照一个字母代码,即E和H),B25位的氨基酸为His,以及其任选还包含一个或多个其它突变,且其中所述酰基部分与B29位的赖氨酸残基的ε氨基相连接。
34、酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中,所述蛋白酶稳定化的胰岛素中,B25位的氨基酸为His或Asn,B27位的氨基酸为Glu或Asp,且其任选还包含一个或多个以下其它突变:A8H,A14E/D,B1E/D,B28E/D和desB30,并且其中所述酰基部分与B29位的赖氨酸残基的ε氨基相连接。
35、酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中,所述蛋白酶稳定化的胰岛素中,A14位的氨基酸为Tyr,Glu或His(按照一个字母代码,即Y,E或H),B25位的氨基酸为Asn,B27位的氨基酸为Glu或Asp,且其任选还包含一个或多个其它突变,并且其中所述酰基部分与B29位的赖氨酸残基中的ε氨基相连接。
36、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素包含A14E突变。
37、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中,所述蛋白酶稳定化的胰岛素中,除了B25位的突变以外,仅在前述条款中提及的A14位存在突变。
38、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素包含A14H突变。
39、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素类似物包含desB30突变。
40、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素内的一个或多个其它突变选自:A(-1)P,A(0)P,A8H,A21G,B(-1)P,B(0)P,B1E,B1Q,B16E,B26D,B27E,B28D,desB30,B31L和B32E。
41、按照前一条款(至可能的程度)的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素,除了A14和B25位的突变以外,仅具有前述条款中提及的一个突变。
42、按照前述条款(至可能的程度)中任一项但除了最后一项(即除了条款41外)的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素,除了A14和B25位的突变以外,恰好具有前述倒数第二条款提及的突变中的两个(即条款40中提及的)。
43、按照前述条款(至可能的程度)中任一项但除了最后两项(即除了条款41和42外)的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素,除了A14位和B25位的突变以外,恰好具有前述倒数第二条款提及的突变中的三个突变(即条款40中提到的)。
44、按照前述条款(至可能的程度)中任一项但除了最后两项(即除了条款41和42外)的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中,除了A14位和B25位的突变以外,唯一的其它突变为desB30。
45、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素的A链中的C末端氨基酸残基为A21氨基酸残基。
46、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素选自A8H,B25N,B27E,desB30人胰岛素;A14E,A18L,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素;A14E,B28D,desB30人胰岛素;A14E,B28E,desB30人胰岛素;B25N,B27E,desB30人胰岛素;B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B16H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27K,desB28,desB29,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,desB30人胰岛素和A21G,B25H,desB30人胰岛素。
47、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述与蛋白酶稳定化的胰岛素相连接的酰基部分具有通式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-(I),其中Acy,AA1,AA2,AA3,n,m和p如上所定义。
48、按照前一条款(至可能的程度)的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中Acy为脂肪酸,优选肉豆蔻酸或硬脂酸,更优选肉豆蔻酸。
49、按照前述条款(至可能的程度)中任一项但除了最后一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中Acy为脂肪族二酸,优选脂肪族(α,ω)二酸,更优选十七烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、十九烷二酸、二十二烷二酸、二十烷二酸。
50、按照前述条款(至可能的程度)中任一项但除了最后一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中Acy为ω-(四唑-5-基)脂肪酸,优选15-(1H-四唑-5-基)十五烷酸、16-(1H-四唑-5-基)十六烷酸、17-(1H-四唑-5-基)十七烷酸、18-(1H-四唑-5-基)十八烷酸或19-(1H-四唑-5-基)十九烷酸。
51、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中AA1为凝血酸或甘氨酸。
52、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中AA1为凝血酸。
53、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中n为0或1。
54、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中n为0。
55、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中n为1。
56、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中AA2为γGlu,αGlu,βAsp,αAsp,γ-D-Glu,α-D-Glu,β-D-Asp,α-D-Asp,或下式的氨基酸:
其中箭头表示与AA1,AA2,AA3的氨基或B29赖氨酸残基的ε-氨基或蛋白酶稳定化的胰岛素的N-末端位置的连接点。
57、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中AA2为γGlu,βAsp,γ-D-Glu,β-D-Asp,或下式的氨基酸:
其中箭头表示与AA1,AA2,AA3的氨基或B29赖氨酸残基的ε-氨基或蛋白酶稳定化的胰岛素的N-末端位置的连接点。
58、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中AA2为γGlu,γ-D-Glu,或下式的氨基酸:
其中箭头表示与AA1,AA2,AA3的氨基或B29赖氨酸残基的ε-氨基或蛋白酶稳定化的胰岛素的N-末端位置的连接点。
59、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中m为0、1、2、3、4、5或6。
60、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中m为0、1、2、3或4。
61、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中m为4。
62、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中m为3。
63、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中m为2。
64、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中m为1。
65、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中m为0。
66、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中AA3选自以下的任一个:
其中r为1、2、3、5、7、11、23或27。
67、按照前一条款的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中r为1、3、5或7。
68、按照前一条款的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中r为1。
69、按照前述倒数第二条款的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中r为3。
70、按照前述倒数第三条款的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中r为5。
71、按照前述倒数第四条款的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中r为7。
72、按照前述条款(至可能的程度)中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中p为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
73、按照前述条款中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中p为0、1、2、3或4。
74、按照前述条款中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中p为0、1或2。
75、按照前述条款中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中p为0或2。
76、按照前述条款中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中p为0。
77、按照前述条款中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中p为1。
78、按照前述条款中任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中p为2。
79、按照前述产物条款中任一项的化合物,其是在本说明书例如在具体实施例中具体提到的任一项化合物,尤其是下面实施例1以及以下等等的任一项化合物。
80、按照前述产物条款中任一项的化合物,其为连接到本说明书中具体提及的蛋白酶稳定化的胰岛素中的任一种的、本说明书中具体提及的酰基部分的具体实施例中的任一个。
81、按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途,该药物组合物用于治疗糖尿病。
82、按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途,该药物组合物可以通过肺部给药以治疗糖尿病。
83、按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途,该药物组合物可以通过肺部给药以治疗糖尿病,并且其具有长效效果。
84、按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备粉剂药物组合物的用途,该粉剂药物组合物可以通过肺部给药以治疗糖尿病。
85、按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备液体药物组合物的用途,该液体药物组合物可以通过肺部给药以治疗糖尿病。
86、按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途,该药物组合物可以通过口服给药以治疗糖尿病。
87、治疗糖尿病的方法,该方法包括:给予需要其的对象治疗有效量的按照前述产物条款的任一项的化合物。
88、一种组合物,其包含人胰岛素以及按照前述条款的任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。
89、一种组合物,其包含阿速帕胰岛素(insulin aspart)以及按照前述条款的任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。
90、一种组合物,其包含赖脯胰岛素(insulin lispro)以及按照前述条款的任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。
91、一种组合物,其包含格鲁辛胰岛素(insulin Glulisine)以及按照前述条款的任一项的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。
92、药物组合物,其包含生物学活性数量的按照上述与胰岛素类似物有关的条款的任一项的蛋白酶稳定化的胰岛素和药学上可接受的载体。
93、治疗、预防或减轻对象的高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量削弱、I型糖尿病、肥胖症、X综合征或血脂异常的方法,包括给予对象按照上述与胰岛素类似物有关条款的任一项的蛋白酶稳定化的胰岛素或按照上述条款的任一项的药物组合物。
94、治疗有效量的按照上述与胰岛素类似物有关条款的任一项的蛋白酶稳定化的胰岛素用于制备药物制剂的用途,该药物制剂用于治疗或预防高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量削弱、I型糖尿病、肥胖症、X综合征或血脂异常。
95、治疗糖尿病的方法,该方法包括:给予需要其的对象治疗有效量的按照前述产物条款的任一项的酰化胰岛素。
一项或多项本文所描述条款的组合,任选还与一个或多个下面的权利要求组合,产生其它条款,并且本发明涉及所述条款和权利要求的所有合适的组合。
将本文中引用的所有参考文献,包括出版物,专利申请和专利,以其整体引入本文作为参考,其程度与每个参考文献是单独和具体地注明引入作为参考相同,并且本文以其整体列出(法律所允许的最大程度)。
本文使用所有标题和副标题,仅仅为方便起见,并且不应该将其理解为以任何方式对本发明进行限制。
本文提供的任何和所有实施例或示范性术语(例如,“例如”)仅仅是为了更好地说明本发明,不造成对本发明范围的限制,除非另外要求。在说明书中没有文辞将被视为指示任何未要求保护的要素对本发明的实践是必需的。
本文引用和引入的专利文件仅仅为方便起见,并不反映这种专利文件的有效性、专利性和/或可实施性的任何观点。本文提到的参考文献不承认它们构成现有技术。
本文中,单词“包括”广泛地是指“包括”、“包含”或“涵盖”(EPO指南C 4.13)。
本发明包括本文所附加权利要求中所记载主题的所有变型和等同内容,其是为适用的法律所允许的。
实施例
提供下列实施例来进行说明,而非限定。
本文中所用的缩写如下:βAla为β-丙氨酰,Aoc为8-氨基辛酸,tBu为叔丁基,DCM为二氯甲烷,DIC为二异丙基碳二亚胺,DIPEA=DIEA,为N,N-二异丙基乙胺,DMF为N,N-二甲基甲酰胺,DMSO为二甲基亚砜,EtOAc为乙酸乙酯,Fmoc为9-芴基甲氧羰基,γGlu为γL-谷氨酰,HCl为盐酸,HOBt为1-羟基苯并三唑,NMP为N-甲基吡咯烷酮,MeCN为乙腈,OEG为[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基羰基,Su为琥珀酰亚胺-1-基=2,5-二氧-吡咯烷-1-基,OSu为琥珀酰亚胺-1-基氧基=2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基,RPC为反相色谱法,RT为室温,TFA为三氟乙酸,THF为四氢呋喃,TNBS为2,4,6-三硝基苯磺酸,TRIS为三(羟甲基)氨基甲烷而TSTU为O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟鹏酸酯。
以下实示例和通用方法针对说明书和合成方案中确定的中间化合物和最终产物。采用以下实施例对本发明化合物的制备进行详细描述,但描述的化学反应根据它们对本发明化合物制备的一般适用性来公开。有时,所述反应可能不能适用于如所述的本发明范围内的每种化合物。本领域技术人员容易识别会发生这种情况的化合物。在这些情况下,所述反应可成功地通过本领域技术人员已知的常规改进进行,也就是说,通过合适保护干扰基团,通过改变为其它常规试剂,或通过反应条件的常规改进。或者,本文中公开的其它反应或常规的将适合于制备本发明的相应化合物。在所有制备方法中,所有原料都是已知的或能容易地采用已知原料制备。所有温度都以摄氏度给出,除非另外明确指出,当提到产率时,所有份和百分比都以重量计,当提到溶剂和洗脱液时,所有份都以体积计。
本发明化合物可通过采用本领域中常用的以下方法中的一种或多种来纯化。如果需要,可对这些方法针对梯度、pH值、盐、浓度、流速、柱子等等进行改进。根据杂质特征、考虑的胰岛素溶解性等等因素,本领域技术人员容易认识和进行这些改进。
酸性HPLC或脱盐后,通过冷冻干燥纯馏分来分离所述化合物。
中性HPLC或阴离子交换色谱后,使所述化合物脱盐、在等电pH值下沉淀或通过酸性HPLC纯化。
通常纯化方法:
HPLC系统为由以下组成的Gilson系统:215型液体处理系统,322-H2型泵和155型UV检测仪。通常在210nm和280nm下进行检测。
Purifier FPLC系统(Amersham Biosciences)由如下组成:P-900型泵,UV-900型UV检测仪,pH/C-900型pH和电导率检测仪,Frac-950型馏分收集器。通常在214nm、254nm和276nm下进行UV检测。
酸性HPLC:
柱子:Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4
流速:8ml/min
缓冲剂A:溶于乙腈的0.1%TFA
缓冲剂B:溶于水的0.1%TF
梯度:0.0-5.0min:10%A
5.00-30.0min:10%A-90%A
30.0-35.0min:90%A
35.0-40.0min:100%A
中性HPLC:
柱子:Phenomenex,Jupiter,C4 5μm 250x10.00mm,
流速:6ml/min
缓冲剂A:5mM TRIS,7.5mM(NH4)2SO4,pH=7.3,20%CH3CN
缓冲剂B:60%CH3CN,40%水
梯度:0-5min:10%B
5-35min:10-60%B
35-39min:60%B
39-40min:70%B
40-43.5min:70%B
阴离子交换色谱法:
柱子:RessourceQ,1ml
流速:6ml/min
缓冲剂A:0.09%NH4HCO3,0.25%NH4OAc,42.5%乙醇pH 8.4
缓冲剂B:0.09%NH4HCO3,2.5%NH4OAc,42.5%乙醇pH 8.4
梯度:在30倍柱容积中从100%A至100%B
脱盐:
柱子:HiPrep 26/10
流速:10ml/min,6倍柱容积
缓冲剂:10mM NH4HCO3
固相合成通式(II)的酰化剂的通用方法:
(II):Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Act,
其中Acy,AA1,AA2,AA3,n,m和p如上所定义且Act为活性酯的离去基团,如N-羟基琥珀酰亚胺(OSu)或1-羟基苯并三唑,和
其中酰基部分的Acy和AA2部分内的羧酸作为叔丁酯受到保护。
本发明通式(II)的化合物可采用固相肽合成领域中技术人员熟知的方法在固体载体上合成。该方法包括将Fmoc保护的氨基酸与聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂相连接。该连接可例如在叔胺如三乙胺或N,N-二异丙基乙胺存在下采用游离的N-保护的氨基酸来完成(参见下面参考文献)。该氨基酸的C-末端(其与树脂相连)在与本发明母体胰岛素偶联的合成序列的末端。Fmoc氨基酸与所述树脂相连后,采用,例如仲胺如哌啶或二乙胺使Fmoc基团脱保护,接着连接另一(或相同)Fmoc保护的氨基酸和脱保护。该合成序列通过单叔丁基保护的脂肪族(α,ω)二酸如十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸单叔丁基酯的偶联而终止。将所述化合物从所述树脂裂解是采用稀释的酸如0.5-5%TFA/DCM(溶于二氯甲烷的三氟乙酸)、乙酸(例如10%,溶于DCM或HOAc/三氟乙醇/DCM 1∶1∶8)或溶于DCM的六氟异丙醇来完成的(参见例如“Organic Synthesis on Solid Phase(固相有机合成)”,F.Z.Wiley-VCH,2000.ISBN 3-527-29950-5,“Peptides:Chemistry and Biology(肽:化学和生物学)”,N.Sewald & H.-D.Jakubke,Wiley-VCH,2002,ISBN 3-527-30405-3或“The Combinatorial Cheemistry Catalog(组合化学目录)”1999,Novabiochem AG,及其中引用的文献)。这确保了化合物中作为羧酸保护基团的叔丁基酯没有被脱保护。最后,C-末端羧基(从所述树脂释放的)被激活,例如作为N-羟基琥珀酰亚胺酯(OSu)并直接或纯化后用作与本发明母体胰岛素连接中的偶联剂。这种方法在实施例9中说明。
或者,以上通式(II)的酰化剂可通过下面描述的液相合成来制备。
单叔丁基保护的脂肪族二酸如十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸单叔丁基酯被激活,例如作为下面描述的OSu-酯或本领域技术人员已知的任何其它活化酯,例如HOBt-或HOAt-酯。在合适溶剂如THF、DMF、NMP(或溶剂混合物)中,在合适碱如DIPEA或三乙胺存在下这种活性酯与氨基酸AA1、单叔丁基保护的AA2或AA3中的一种偶联。通过萃取方法或通过色谱法分离中间体。再将所得中间体活化(如上所述)并如上所述使之与氨基酸AA1、单叔丁基保护的AA2或AA3中的一种偶联。重复该方法直到获得所需的受保护中间体Acy-AA1n-AA2m-AA3p-OH。这反过来被激化以提供通式(II)Acy-AA1n-AA2m-AA3p-Act的酰化剂。该方法在实施例21中说明。
通过任一以上方法制备的酰化剂可在作为OSu酯激活后脱(叔丁基)保护。这可通过TFA处理OSu-激活的叔丁基保护的酰化剂进行。任何蛋白酶稳定化的胰岛素酰化后,获得本发明未保护的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。这在例如下面实施例16中说明。
如果通过任一以上方法制备的试剂在作为OSu酯酰化后不经过脱(叔丁基)保护,任何蛋白酶稳定化的胰岛素的酰化提供相应的本发明叔丁基保护的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。为了获得本发明的未保护的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,所述保护的胰岛素将被脱保护。这可通过TFA处理来进行,以获得本发明的未保护的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素。这在下面例如实施例1和2中说明。
如果希望胰岛素的赖氨酸残基(在ε位)酰化,则在碱性pH值(例如pH 10,10.5或11)下进行酰化。这在下面例如实施例1和2中说明。
如果希望胰岛素的A链N-末端(A1)酰化,则在中性pH值(例如pH 7,7.5,8或8.5)下酰化。这在下面例如实施例38和44中说明。
制备本发明酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素的通用方法(A)
在第一个实施例中说明通用方法(A)。
实施例1,通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε-十六烷二酰),desB30人胰岛素
将A14E,B25H,desB30人胰岛素(500mg)溶解于100mM Na2CO3水溶液(5mL)中,并用1N NaOH将pH值调节至10.5。将十六烷二酸叔丁酯正羟基琥珀酰亚胺酯溶解于乙腈(10W/V%)中,加入所得胰岛素溶液中并在温的自来水下缓慢加热,以免沉淀,在室温下保持30分钟。冻干所得混合物。将所得固体溶解于冰冷的95%三氟乙酸(包含5%水)并在冰上保持30分钟。真空浓缩所得混合物并从二氯甲烷中再蒸发出来。将残余物溶解于水中并将pH值调节到中性(6-7)并冻干混合物。
所得胰岛素通过离子交换色谱法在Source 15Q 21ml柱上进行纯化,几次运行,用溶于15mM Tris,50v/v%乙醇,pH 7.5(乙酸)的15-300mM的醋酸铵梯度洗脱。纯馏分的最后脱盐在RPC 3mL柱(用0.1v/v%TFA,50v/v%乙醇等度洗脱)上进行。将所得纯胰岛素冻干。
LC-MS(电喷雾):m/z=1483.2(M+4)/4。计算值:1483.5
实施例2,通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
将A14E,B25H,desB30人胰岛素(2g)溶解于100mM Na2CO3水溶液(10mL)中,并加入DMSO(4mL)。用1N NaOH将pH值调节至10.5。叔丁基十八烷二酰-L-Glu(OSu)-OtBu(如WO 2005/012347中所述制备)。再加入100mM Na2CO3水溶液(20mL),然后加入THF(20mL)。1.5h后,加入几滴甲胺,随后用乙酸将所得混合物酸化。所得混合物通过制备的HPLC纯化并冻干,得到为二叔丁酯的标题胰岛素。将其溶解于二氯甲烷和三氟乙酸1∶1(50mL)中。静置所得混合物2小时并真空浓缩。加入少量水和乙腈后,通过制备的HPLC纯化该混合物。将纯馏分冻干。这样得到313mg标题胰岛素。
MALDI-TOF MS:m/z=6089(M+1)。计算值:6089。
实施例3:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
如上所述二十烷二酸开始,经由二十烷二酸单叔丁酯和叔丁基二十烷二酰-L-Glu(OSu)-OtBu类似地制备此胰岛素。
MALDI-TOF MS:m/z=6120(M+1)。计算值:6117。
实施例4:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε3-羧基-5-十八烷二酰氨基苯甲酰),desB30人胰岛素
如上所述由5-(17-叔丁氧基羰基十七烷酰氨基)间苯二甲酸单-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(如WO 2006/082204中所述制备的)开始类似地制备此胰岛素。
LC-MS:1531(M+4),Mw 6124(去褶合的)。Calc.:1531(M+4),6122。
实施例5:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε-N-十八烷二酰-N-(2-羧乙基)谷氨酰),desB30人胰岛素
如上所述由叔丁基十八烷二酰-N-(2-叔丁氧羰基乙基)-Gly-OSu(如WO 2005/012347中所述制备的)开始类似地制备此胰岛素。
LC-MS(电喷雾):m/z:1522.52(M+4)。计算值.:1523。
实施例6:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε(N-十八烷二酰-N-羧甲基)-β-丙氨酰),desB30人胰岛素
如上所述由叔丁基十八烷二酰-N-(叔丁氧羰基甲基)-βAla-OSu(如WO 2005/012347中所述制备的)开始类似地制备此胰岛素。
MALDI-TOF MS:m/z=6088(M+1)。计算值:6089。
实施例7:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε4-([4-({19-羧基十九烷酰氨基}甲基)反式环己烷羰基]-γGlu),desB30人胰岛素
如上所述由2-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷甲酰基}氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯开始类似地制备此胰岛素。
LC-MS(电喷雾):m/z:6260。计算值.:6255。
2-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷甲酰基}氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯的制备:
1.叔丁基二十烷二酸的OSu激活
将叔丁基二十烷二酸(5.0g)溶解于THF(50ml)和DMF(30ml)中。加入TSTU(4.53g)和DIPEA(2.65ml)。搅拌混合物3天,然后真空浓缩。使固体残余物从乙腈中重结晶出来,得到白色晶体化合物二十烷二酸叔丁酯N-羟基琥珀酰亚胺酯(5.52g,89%)。
LC-MS(电喷雾):m/z:440[M-56(=tert-Bu)]
2.凝血酸的偶联
向二十烷二酸叔丁酯N-羟基琥珀酰亚胺酯(5.52g)在THF(100ml)中的溶液中加入凝血酸(1.75g)。获得沉淀物。通过加入DMF(75ml)、水(25ml)和DMSO(50ml)及几滴DIPEA来获得溶液的尝试没有成功。搅拌所得悬浮液过夜。将混合物真空浓缩。将THF加到固体残余物中,过滤除去沉淀物。将滤出液浓缩并使固体残余物在乙腈中重结晶,得到白色晶体化合物4-[(19-叔丁氧基羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷羧酸(5.56g,93%)。
LC-MS(电喷雾):m/z:538(M+1)。
3.4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷羧酸的OSu激活
向4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷羧酸(5.56g)在THF(100ml)中的溶液中加入TSTU(3.42g)在乙腈(25ml)中的溶液。将所得混合物搅拌过夜后真空浓缩。使固体残余物从乙腈中重结晶,得到4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷羧酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5.76g,88%)。
LC-MS(电喷雾):m/z:635(M+1)。
4.H-Glu-OtBu偶联与OSu激活
向4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷羧酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯在THF(150ml)中的溶液中加入H-Glu-OtBu(1.84g)在水(25ml)中的溶液和几滴DIPEA。将混合物搅拌过夜,然后真空浓缩。将残余物溶解于热(60℃)THF中并过滤。向冷的滤出液中加入THF多达150ml并加入溶解于乙腈(25ml)中的TSTU(2.98g)。搅拌20分钟后,将所得混合物浓缩。使残余物从乙腈中重结晶,得到白色固体2-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷羰基}氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(6.8g,92%)。
LC-MS(电喷雾):m/z:820(M+1)。
实施例8:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十七烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
如上所述从十七烷二酸经由十七烷二酸单叔丁酯和叔丁基十七烷二酰-L-Glu(OSu)-OtBu(如WO 2006/082204中所述制备的)开始类似地制备此胰岛素。
LC-MS(电喷雾):m/z:1519(M+4)。计算值.:1519。
实施例9:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
该化合物在整夜禁食的雄性Wistar大鼠上的口服效果在下面图2a和图2b中给出。
如上所述从17-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷二酸叔丁酯(别名:叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OSu)-OtBU)开始类似地制备此胰岛素。
LC-MS(电喷雾):m/z:1596(M+4)。计算值.:1596。
如下所述制备用于制备此胰岛素的构造单元:
原料树脂:2-氯三苯甲基树脂,1.60mmol/g
使1.0g该树脂在DCM(10ml)中溶胀30min。
1.用Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸酰化:
将0.39g(0.63eq,1.0mmol)Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(Fmoc-OEG-OH)溶解于DCM(15ml)中并加到所述树脂上。逐滴加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.44ml,2.5mmol)。使反应混合物涡旋搅动30min,然后加入甲醇(2ml),让混合物涡旋搅动另外15min。过滤树脂并用NMP(2x8ml)和DCM(8x8ml)洗涤。
加入20%哌啶/NMP(8ml),静置10min。重复一次。过滤并用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。阳性TNBS检测得到红色树脂。
2.用Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸酰化:
将0.78g(2eq,2.0mmol)Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸溶解于NMP/DCM 1∶1(10ml)中。加入0.28g(2.2eq,2.4mmol)HOSu,接着加入0.37ml(2.2eq,2.4mmol)DIC。让反应混合物静置1小时,然后加到所述树脂上,最后加入0.407ml(2.2eq)DIEA。使混合物涡旋搅动16小时,过滤并用NMP(2x8ml),DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。阳性TNBS检测得到无色树脂。
加入20%哌啶/NMP(10ml),静置10min。重复一次。过滤并用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。阳性TNBS检测得到红色树脂。
用Fmoc-Glu-OtBu酰化:
将0.86g(2eq,2.0mmol)Fmoc-Glu-OtBu溶解于NMP/DCM 1∶1(10ml)中。加入0.32g(2.2eq,2.4mmol)HOBT,接着加入0.37ml(2.2eq,2.4mmol)DIC。让反应混合物静置20min,然后转移到所述树脂上,最后加入0.407ml(2.2eq)DIEA。使混合物涡旋搅动16小时,过滤并用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。阳性TNBS检测得到无色树脂。
加入20%哌啶/NMP(10ml),静置10min。重复一次。过滤并用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。阳性TNBS检测得到红色树脂。
用十八烷二酸单叔丁酯酰化:
将0.75g(2eq,2.0mmol)十八烷二酸单叔丁酯溶解于NMP/DCM 1∶1(10ml)中。加入0.32g(2.2eq,2.4mmol)HOBT,接着加入0.37ml(2.2eq,2.4mmol)DIC。让反应混合物静置20min,然后转移到所述树脂上,最后加入0.41ml(2.2eq)DIEA。使混合物涡旋搅动16小时,过滤并用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。
用TFA裂解:
将8ml 5%TFA/DCM加到所述树脂,使反应混合物涡旋搅动2小时,过滤并收集滤出液。将另外5%TFA/DCM(8ml)加到所述树脂,使混合物涡旋搅动10min,过滤并用DCM(2x10ml)洗涤树脂。用约800ulDIEA将合并的滤出液和洗液的pH值调节到碱性。真空蒸发混合物,得到油状物(3.5g)。加入二乙醚(30ml),然后通过滗析分离未溶解的油并真空蒸发。这样得到1.1g油状17-{(S)-1-叔丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氨甲酰基]丙基氨基甲酰基}十七烷二酸叔丁酯(别名:叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU)。
LC-MS(Sciex100 API):m/z=846.6(M+1)+。
OSu-激活:
将以上叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OH)-OtBU(0.63g)溶解于THF(35ml)中。加入DIEA(0.255ml,2eq.),然后加入TSTU(0.45g,2eq.),在室温下搅拌混合物16小时。所述混合物在乙酸乙酯(250ml)和NaHSO4水溶液(3x100ml)之间分层。有机相经过干燥(MgSO4)并真空浓缩,得到0.65g油状17-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷二酸叔丁酯(别名:叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-O Su)-OtBu)。
LC-MS:m/z=943.4(M+1)。
实施例10:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十四烷基),desB30人胰岛素
如上所述从1-十四烷酰-吡咯烷-2,5-二酮开始类似地制备此胰岛素。
MALDI-TOF MS:m/z=5873.6。计算值:5872.9。
实施例11:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
如上所述从(S)-2-[4-叔丁氧羰基-4-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)丁酰氨基]戊二酸5-叔丁酯1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯开始类似地制备此胰岛素。
MALDI-TOF MS:m/z=6242.5。计算值:6245.2。
(S)-2-[4-叔丁氧羰基-4-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)丁酰氨基]戊二酸5-叔丁基酯1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯的制备。
1.(S)-2-[4-叔丁氧羰基-4-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)丁酰氨基]戊二酸1-叔丁酯
向(S)-2-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(如WO 2005/012347中所述类似地制备)(4.1g)在THF(100ml)中的溶液中加入H-Glu-OtBu(1.47g)在水(20ml)中的溶液。用DIPEA将pH调节至8。将混合物搅拌1.5h后浓缩。使残余物从DCM中重结晶,得到白色固体状标题化合物(2.81g,61%)。
LC-MS:m/z=769(M+1)。
(S)-2-[4-叔丁氧羰基-4-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)丁酰氨基]戊二酸5-叔丁酯1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
向(S)-2-[4-叔丁氧羰基-4-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)丁酰氨基]戊二酸1-叔丁酯(2.81g)在乙腈(80ml)中的溶液中加入TSTU(1.32g)在乙腈(20ml)中的溶液。用DIPEA将pH调节至8。将混合物搅拌1.5h后浓缩。使残余物从乙腈中重结晶,得到标题化合物(1.7g,54%)。
LC-MS:m/z=866.4(M+1)。
实施例12:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε4-([4-({19-羧基十九烷酰氨基}甲基)反式环己烷羰基]-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
如上所述从2-[4-叔丁氧羰基-4-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷甲酰基}氨基)丁酰氨基]戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯开始类似地制备此胰岛素。
LC-MS(电喷雾):m/z:6386(M+1)。计算值.:6384。
2-[4-叔丁氧羰基-4-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰氨基]戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯的制备。
1.2-[4-叔丁氧羰基-4-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷甲酰基}氨基)丁酰氨基]戊二酸1-叔丁酯
向2-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷甲酰基}氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(5.0g)在THF(100ml)中的溶液中加入H-Glu-OtBu(1.36g)在水(25ml)中的溶液。搅拌过夜后,将混合物真空浓缩。残余物从水中沉淀并被过滤出来,真空干燥得到标题化合物(4.63g,84%)。
LC-MS:m/z=740(M-3x56,失去3xt-Bu)。
2-[4-叔丁氧羰基-4-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷甲酰基}氨基)丁酰氨基]戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
向2-[4-叔丁氧羰基-4-({4-[(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)甲基]环己烷甲酰基}氨基)丁酰氨基]戊二酸1-叔丁酯(4.6g)在THF(150ml)中的溶液中加入TSTU(1.68g)。加入DIPEA(0.97ml)。搅拌过夜后,将混合物真空浓缩。使残余物从乙腈中结晶出来,得到固体状的标题化合物(4.4g,87%)。
LC-MS:m/z=837(M-3x56,失去3xt-Bu)。
实施例13:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
此化合物对禁食过夜的雄性Wistar大鼠的口服效果在下面图7中给出。
LC-MS:m/z=1555(M+4)/4。
实施例14:通用方法(A):
A14E,B28D,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6118
实施例15:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-PEG7),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6510
实施例16:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
此化合物对禁食过夜的雄性Wistar大鼠的口服效果在下面图3中给出。
MALDI-TOF MS:m/z=6407
如下所述制备此实施例的中间体酰化剂:
步骤1:19-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙氨基甲酰基]-甲氧基}-乙氧基)-乙氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰}-十九烷酸叔丁酯
向2-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(2.50g,(如WO 2005/012347中所述类似地制备的)和[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酸(1.47g,别名:8-氨基-3,6-二氧杂辛酸二聚体,IRIS Biotech GmbH,Cat.No.PEG1221)在乙醇(40ml)中的溶液中加入DIPEA(1.26ml)。室温下搅拌混合物过夜,然后真空浓缩。向残余物添加0.1N HCl(150ml)溶液和乙酸乙酯(200ml)。将各层分离并用乙酸乙酯(100ml)萃取含水层。合并的有机层用水和盐水洗涤,经过干燥(硫酸镁)并真空浓缩,得到油状物,其静置后结晶。产率96%(3.1g)。LC-MS(电喷雾):m/z=874.49。
步骤2:19-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]乙氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁酯:
向19-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)乙氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十九烷酸叔丁酯(3.1g)在乙腈(50ml)中的溶液中加入TSTU(1.39g)和DIPEA(0.91ml)。室温下搅拌混合物过夜,然后真空浓缩。向残余物添加0.1N HCl(100ml)溶液和乙酸乙酯(200ml)。将各层分离并用乙酸乙酯(50ml)萃取含水层。合并的有机层用水和盐水洗涤,经过干燥(硫酸镁)并真空浓缩,得到油状物。产率99%(3.4g)。LC-MS(电喷雾):m/z:971.8。
步骤3:19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸:
将19-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁酯(3.4g)在TFA(75ml)中搅拌45min,然后真空浓缩。残余物用甲苯浓缩3次,得到固体。使残余物在2-丙醇中结晶,过滤得到白色晶体化合物。产率80%(2.4g)。LC-MS(电喷雾):m/z:859.44。
可类似地制备带有十八烷二酸片段的类似酰化剂(例如实施例26和其它实施例中所用的)。
实施例17:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1626(M+4)
实施例18:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6348
实施例19:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6062
实施例20:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十七烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1592(M+4)
实施例21:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1620(M+4)
如下所述制备中间体酰化剂十八烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-OSu(叔丁酯作为保护基团仍在羧酸上):
十八烷二酸叔丁酯2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
将十八烷二酸单叔丁酯(4.2g,0.011mol)溶解于THF(20mL)中,加入在乙腈(20mL)中的TSTU(4g,0.013mol),然后通过逐滴加入DIPEA将溶液的pH调节至8。RT下搅拌混合物4h,然后用HCl(2M)酸化到pH值为3并真空蒸发。残余油随后在乙酸乙酯和HCl(0.1M)之间分层。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空蒸发至干。这样得到5.2g油状十八烷二酸叔丁酯2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯,其可不经进一步纯化而用于下一步骤。LC-MS(电喷雾):m/z=468(M+1)和412(M+1-tBu)。
(S)-2-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)-戊二酸1-叔丁酯
将十八烷二酸叔丁酯2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(7g,0.015mol)溶解于THF(80mL)中并加入H-Glu-OtBu(3.7g,0.0165mol)在Na2CO3(0.1M,40mL)中的溶液中。RT下搅拌混合物过夜,然后用HCl(2M)酸化到pH值为3并真空蒸发。残余油在乙酸乙酯和HCl(0.1M)之间分层。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空蒸发至干。加入乙腈(30mL)引起白色沉淀物的形成,通过过滤将其分离并干燥,得到3.75g(S)-2-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯。LC-MS(电喷雾):m/z=556(M+1)。
蒸发乙腈滤出液进一步分离出2.6g产物。
(S)-2-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯
烷-1-基)酯
将(S)-2-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯(3g,0.005mol)溶解于THF(100mL)并加入TSTU(1.78g,0.006mol)在乙腈(30mL)中的溶液中。通过逐滴加入DIPEA将溶液的pH调节至8。RT下搅拌混合物1h,然后用HCl(2M)酸化到pH值为3并真空蒸发。残余油随后在乙酸乙酯和HCl(0.1M)之间分层。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空蒸发至干。这样得到白色固体(2.75g)(S)-2-(17-叔丁氧羰基-十七烷酰氨基)-戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯。LCMS(电喷雾):m/z=653(M+1)。
(S)-2-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]-戊二
酸1-叔丁酯
将(S)-2-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧-吡咯烷-1-基)酯(0.5g,0.766mmol)溶解于乙腈(20mL)。将该溶液加入H-Glu-OtBu(0.171g,0.84mmol)在水(30mL)中的溶液中。用DIPEA将pH值调节至10。RT下搅拌混合物15min,然后用HCl(2M)酸化到pH值为7并真空蒸发。残余物在乙酸乙酯和HCl(0.1M)之间分层。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空蒸发至干。这样得到油状(S)-2-[(S)-4-叔丁氧基羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]戊二酸1-叔丁酯。LC-MS(电喷雾):m/z=741(M+1)。
(S)-2-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]-戊二
酸5-叔丁酯1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
将(S)-2-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]-戊二酸1-叔丁酯(8g,10.79mmol)溶解于乙腈(40mL)中并加入TSTU(3.89g,12.95mmol)在乙腈(40mL)中的溶液。通过逐滴加入DIPEA将溶液的pH调节至8。RT下搅拌混合物1h,然后用HCl(2M)酸化到pH值为3并真空蒸发。这样得到油状物,其随后在乙酸乙酯和HCl(0.1M)之间分层。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空蒸发至干。这样得到8.2g固体状(S)-2-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)-丁酰氨基]戊二酸5-叔丁酯1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯。
(S)-2-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基-十七烷
酰氨基)丁酰氨基]丁酰氨基}戊二酸1-叔丁酯
将(S)-2-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]-戊二酸5-叔丁酯1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(4g,4.77mmol)溶解于乙腈(30mL)中并加入H-Glu-OtBu(1.07g,5.25mmol)在Na2CO3(0.1M,20mL)中的溶液中。RT下搅拌混合物1h,然后用HCl(2M)中和到pH值为7并真空蒸发。残余油随后在乙酸乙酯和HCl(0.1M)之间分层。有机层经过干燥(MgSO4)、过滤并真空蒸发至干。将残余物(4g)溶解于乙腈中并用活性炭处理。过滤并蒸发至干,然后真空干燥过夜之后,获得2,8g结晶固体(S)-2-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁 氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]丁酰氨基}戊二酸1-叔丁酯。LC-MS(电喷雾):m/z=927(M+1)。
(S)-2-((S)-4-叔丁氧羰基-4-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-
叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]丁酰氨基}丁酰氨基)-戊二酸1-叔丁
酯
采用与上述相同的方法用TSTU(1,0g,3.325mmol)将(S)-2-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]丁酰氨基}戊二酸1-叔丁酯(2.8g,3.02mmol)活化,得到粗的(S)-2-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)-丁酰氨基]丁酰氨基}-戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯。LC-MS(电喷雾):m/z=1024(M+1)。
将1.3g该化合物溶解于乙腈(40mL)中并加入H-Glu-OtBu(0.28g,1.39mmol)在水(30mL)中的溶液中,用DIPEA将pH调节至9.3。RT下搅拌混合物2h,然后用HCl(2M)中和至pH值为7并真空蒸发至几乎全干。用水处理残余物,得到白色沉淀物,将其过滤出来。真空干燥过夜后,分离出1.1g(S)-2-((S)-4-叔丁氧羰基-4-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]丁酰氨基}丁酰氨基)戊二酸1-叔丁酯,包含少量原料。LC-MS(电喷雾):m/z=1111.9(M+1)。
(S)-2-((S)-4-叔丁氧羰基-4-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-
叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]丁酰氨基}丁酰氨基)-戊二酸1-叔丁
酯-5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
RT下在乙腈溶液中采用与上述相同的激活和反应方法用TSTU(29.8mg,0.099mmol)激活(S)-2-((S)-4-叔丁氧羰基-4-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(17-叔丁氧羰基十七烷酰氨基)丁酰氨基]丁酰氨基}丁酰氨基)戊二酸1-叔丁酯(0.1g,0.09mmol)1h。这样得到100mg粗的活化产物,其可原样用于胰岛素酰化而无需进一步纯化。LC-MS(电喷雾):m/z=1208(M+1)。
实施例22:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6373
实施例23:通用方法(A):
A14E,B25H,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6407
实施例24:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
该化合物对禁食过夜的雄性Wistar大鼠的口服效果在下面图中6给出。
MALDI-TOF MS:m/z=6188
实施例25:通用方法(A):
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
该化合物对禁食过夜的雄性Wistar大鼠的口服效果在下面图4中给出。
MALDI-TOF MS:m/z=6352
实施例26:通用方法(A):
A14E,B16E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6345
实施例27:通用方法(A):
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
该化合物对禁食过夜的雄性Wistar大鼠的口服效果在下面图5中给出。
MALDI-TOF MS:m/z=6041
实施例28:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1598(M+4)
实施例29:通用方法(A):
A14E,B16E,B25H,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6028
实施例30:通用方法(A):
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1581(M+4)
实施例31:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1484(M+4)
实施例32:通用方法(A):
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1548(M+4)
实施例33:通用方法(A):
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1596(M+4)
实施例34:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-OEG-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1592(M+4)
实施例35:通用方法(A):
A14E,A18L,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6405
实施例36:通用方法(A):
A14E,A18L,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6377
实施例37:通用方法(A):
A14E,B25H,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6433
实施例38:通用方法(A):
A1G(Nα十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素
将A14E,B25H,B29R,desB30胰岛素(500mg,88μmol)溶解于0.1MNaHCO3,pH 8(5mL)中。将ω-羧基十六烷酰-γ-L-谷氨酰-OEG-OEG-OSu(65mg,88μmol)溶解于THF/MeCN 1∶1(5mL)中并加到所得胰岛素溶液中。30分钟后,通过加入2M甲胺水溶液(0.5mL)使反应淬灭。真空蒸发溶剂并将固体再溶解于最少量的水/MeCN中。通过采用RP-HPLC在C 18柱(缓冲剂A:溶于水的0.1%TFA,缓冲剂B:溶于MeCN的0.1%TFA,梯度30-55%缓冲剂B,45min内)上分离出主产物峰。将产物馏分部分真空蒸发并冻干,得到59mg产物(10%)。LC-MS分析:M4+=1602.7,计算值1602.6。两步标准氨基酸序列分析显示出F-V,证实了在A1位的酰化。
实施例39:通用方法(A):
A14E,B1F(Nα十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),B25H,B29R,desB30人胰岛素
将该化合物作为上一实施例(实施例38)的副产物分离。LCMS分析:M4+=1602.5,计算值:1602.6。两步标准氨基酸序列分析显示出G-I,证实了B1位的酰化。
实施例40:通用方法(A):
A1G(Nα十六烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1523(M+4)
采用ω-羧基十五烷酰-γ-L-谷氨酰(OSu)作为酰化剂,类似于上述A1-酰化(实施例38)制备该化合物。该化合物显示出LCMS:M4+=1523.2,计算值:1523.0。两步标准氨基酸序列分析显示出F-V,证实了A1位的酰化。
实施例41:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-Abu-Abu-Abu-Abu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1286(M+5)
类似于实施例9中制备的试剂制备本实施例的酰化剂,先将Fmoc保护的4-氨基丁酸与2-氯三苯甲基树脂相连,然后脱保护,依次连接3个Fmoc保护的4-氨基丁酸和如实施例9中所述的Fmoc-Glu-OtBu和十八烷二酸单叔丁酯的3个以上单元。
实施例42:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nα二十烷二酰),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=5987
实施例43:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nα4-[16-(1H-四唑-5-基)十六烷酰氨磺酰]丁酰),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1530(M+4)
中间体酰化剂的制备:
将4-[16-(1H-四唑-5-基)十六烷酰氨磺酰]丁酸(500mg,如WO 2006/005667中所述制备)溶解于乙醇(20ml),加入TSTU(381mg)和DIPEA(542μl),室温下搅拌所得混合物16小时。真空浓缩混合物,将残余物与0.25M HCl一起搅拌。通过过滤分离所得固体,用水洗涤并真空干燥,得到580mg(91%)所述酰化剂。
酰化反应:
将A14E,B25H,desB30人胰岛素(500mg)溶解于0.1M碳酸钠水溶液(10mL)和乙醇(4mL)中。用1N NaOH将pH值调节至10.8。将以上酰化剂(101mg)溶解于THF(2mL)中并以10分钟间隔将乙醇(2mL)分两份加入。缓慢搅拌所得混合物1小时并用水(50mL)稀释。通过加入1N HCl直到pH 5.5使得所得胰岛素沉淀。通过离心分离沉淀物并通过HPLC纯化。将纯馏分合并并冻干。
实施例44:通用方法(A):
A1G(Nα十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),A14E,A21G,B25H,desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6321
实施例45:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6130
实施例46:通用方法(A):
A14E,B25H,B27K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB28,desB29,desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6181
实施例47:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε(5-二十烷二酰氨基间苯二酸)),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6150
实施例48:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=5959
实施例49:通用方法(A):
A14E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1598(M+4)
实施例50:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6216
实施例51:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1559(M+4)
实施例52:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6278
实施例53:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-Aoc),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6126
实施例54:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=6055(去褶合的)
实施例55:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=6220(去褶合的)
实施例56:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6101
实施例57:通用方法(A):
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
MALDI-TOF-MS:m/z=6277
实施例58:通用方法(A):
A14E,B25H,B16H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1516(M+4)
实施例59:通用方法(A):
A1G(Nα十八烷二酰),A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1498(M+4)
实施例60:通用方法(A):
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1523(M+4)
实施例61:通用方法(A):
A14E,B25H,B27K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB28,desB29,desB30人胰岛素
MALDI-TOF MS:m/z=6208
实施例62:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
ES-MS:m/z=1587(M+4)
可类似地制备以下实施例中的本发明酰化胰岛素:
实施例63:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例64:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例65:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素
实施例66:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素
实施例67:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十二烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例68:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十二烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
实施例69:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG-γGlu),desB30人胰岛素
实施例70:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG-γGlu),desB30人胰岛素
实施例71:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε(N-二十烷二酰-N-羧甲基)-βAla),desB30人胰岛素
实施例72:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε3-[2-(2-{2-[2-(17-羧基十七烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例73:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε3-[2-(2-{2-[2-(19-羧基十九烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例74:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰),desB30人胰岛素
实施例75:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例76:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰),desB30人胰岛素
实施例77:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε4-([4-({17-羧基十九烷酰氨基}甲基)反式环己烷甲酰基]-γGlu),desB30人胰岛素
实施例78:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε4-([4-({17-羧基十七烷酰氨基}甲基)反式环己烷甲酰基]-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素
实施例79:通用方法(A):
A14E,B28D,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例80:通用方法(A):
A14E,B28D,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例81:通用方法(A):
A14E,B28D,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例82:通用方法(A):
A14E,B28D,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例83:通用方法(A):
A14E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例84:通用方法(A):
A14E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例85:通用方法(A):
A14E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例86:通用方法(A):
A14E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例87:通用方法(A):
A14E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例88:通用方法(A):
A14E,B1E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例89:通用方法(A):
A14E,B1E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例90:通用方法(A):
A14E,B1E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例91:通用方法(A):
A14E,B1E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例92:通用方法(A):
A14E,B1E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例93:通用方法(A):
A14E,B1E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例94:通用方法(A):
A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例95:通用方法(A):
A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例96:通用方法(A):
A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例97:通用方法(A):
A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例98:通用方法(A):
A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例99:通用方法(A):
A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例100:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例101:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例102:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例103:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例104:通用方法(A):
A14E,B 1E,B25H,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例105:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例106:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例107:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例108:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例109:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例110:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例111:通用方法(A):
A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例112:通用方法(A):
A14E,B28D,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例113:通用方法(A):
A14E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例114:通用方法(A):
B25N,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例115:通用方法(A):
B25N,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例116:通用方法(A):
B25N,B27E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例117:通用方法(A):
B25N,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例118:通用方法(A):
B25N,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例119:通用方法(A):
B25N,B27E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例120:通用方法(A):
A8H,B25N,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例121:通用方法(A):
A8H,B25N,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例122:通用方法(A):
A8H,B25N,B27E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例123:通用方法(A):
A8H,B25N,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例124:通用方法(A):
A8H,B25N,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例125:通用方法(A):
A8H,B25N,B27E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例126:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε(N-二十烷二酰-N-羧甲基)-βAla-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例127:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε(N-十八烷二酰-N-羧甲基)-βAla-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例128:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε(N-十六烷二酰-N-羧甲基)-βAla-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例129:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε 十八烷二酰-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧 基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酰基),desB30人胰岛素
[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酸可如所述制备(Eur.J.Med.Chem.2007,42,114)并与ω-(叔丁基-羧基-十七烷酰-γ-L-谷氨酰(OSu)-OtBu反应。所得产物可采用TSTU激活并在0.1M Na2CO3中在pH值为10.5下与A14E,B25H,desB30人胰岛素偶联,得到该产物。
实施例130:通用方法(A):
A14E,B25H,B29K(Nε 二十烷二酰-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧 基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酰基),desB30人胰岛素
[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酸可如所述制备(Eur.J.Med.Chem.2007,42,114)并与ω-(叔丁基-羧基-十九烷酰-γ-L-谷氨酰(OSu)-OtBu反应。所得产物可采用TSTU激活并在0.1M Na2CO3中在pH值为10.5下与A14E,B25H,desB30人胰岛素偶联,得到该产物。
实施例131:通用方法(A):
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε 十八烷二酰-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧 基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酰基),desB30人胰岛素
[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酸可如所述制备(Eur.J.Med.Chem.2007,42,114)并与ω-(叔丁基-羧基-十七烷酰-γ-L-谷氨酰(OSu)-OtBu反应。所得产物可采用TSTU激活并在0.1M Na2CO3中在pH值为10.5下与A14E,B16H,B25H,desB30人胰岛素偶联,得到该产物。
实施例132:通用方法(A):
A14E,B16H,B25H,B29K(Nε 二十烷二酰-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧 基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酰基),desB30人胰岛素
[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酸可如所述制备(Eur.J.Med.Chem.2007,42,114)并与ω-(叔丁基-羧基-十九烷酰-γ-L-谷氨酰(OSu)-OtBu反应。所得产物可采用TSTU激活并在0.1M Na2CO3中在pH值为10.5下与A14E,B16H,B25H,desB30人胰岛素偶联,得到该产物。
实施例133:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例134:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例135:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例136:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例137:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素
实施例138:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素
实施例139:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例140:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例141:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例142:通用方法(A):
B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例143:通用方法(A):
A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素
实施例144:通用方法(A):
A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素
实施例145:通用方法(A):
A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例146:通用方法(A):
A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例147:通用方法(A):
A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例148:通用方法(A):
A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例149:通用方法(A):
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素
实施例150:通用方法(A):
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素
实施例151:通用方法(A):
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例152:通用方法(A):
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例153:通用方法(A):
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例154:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素
实施例155:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素
实施例156:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例157:通用方法(A):
A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例158:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例159:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例160:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例161:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素
实施例162:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例163:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素
实施例164:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例165:通用方法(A):
A14E,A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素
实施例166:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例167:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素
实施例168:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素
实施例169:通用方法(A):
A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素
实施例170:通用方法(A):
A1G(Nα十八烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素
实施例171:通用方法(A):
A1G(Nα二十烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素
实施例172:通用方法(A):
A1G(Nα十八烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素
实施例173:通用方法(A):
A1G(Nα二十烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素
实施例174:通用方法(A):
A1G(Nα十八烷二酰),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素
实施例175:通用方法(A):
A1G(Nα二十烷二酰),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素
实施例176:通用方法(A):
A1G(Nα十八烷二酰),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素
实施例177:通用方法(A):
A1G(Nα二十烷二酰),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素
实施例178:选定的本发明胰岛素衍生物的胰岛素受体亲和性
用SPA测定(闪烁近似测定法)微量滴定板抗体捕获测定,测定本发明的胰岛素衍生物与人胰岛素受体的亲和性。将SPA-PVT抗体-结合珠、抗小鼠试剂(Amersham Biosciences,Cat No.PRNQ0017)与25ml结合缓冲剂(100mM HEPES,pH7.8;100mM氯化钠,10mM MgSO4,0.025%Tween-20)混合。单一Packard Optiplate(Packard No.6005190)的试剂混合物由下列组成:2.4μl的1∶5000稀释的纯化的重组体人胰岛素受体(有或者没有外显子11),一定量的A14Tyr[125I]-人胰岛素的储备溶液(对应于每100μl试剂混合物5000cpm),12μl的1∶1000稀释的F12抗体,3ml的SPA-珠和结合缓冲剂加至12ml。然后在Packard Optiplate中,将总共100μl试剂混合物加入到每个孔中,在Optiplate中采用合适的样品制备胰岛素衍生物的稀释系列。然后将样品培养16小时,同时轻轻地晃动。然后离心分离各相1分钟,并在Topcounter中对平板计数。在GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software,San Diego,CA)中,使用非线性回归算法来拟合结合数据并将亲和性表达成相对人胰岛素的亲和性(以百分比(%))。
也可采用相关测定,其中结合缓冲剂也包含4.5%HSA以模拟生理学条件。
选定的本发明胰岛素的胰岛素受体亲和性:
实施例179:本发明胰岛素衍生物的疏水性:
通过在等强度条件下运行的反相HPLC研究胰岛素衍生物的疏水性。在相同条件下比较所述胰岛素衍生物与人胰岛素(本文中称为HI)或具有已知疏水性的另一衍生物的洗脱时间。疏水性k’rel按照如下计算:k’rel衍生物=((t衍生物-t0)/(t对照-t0))*k’rel对照。采用HI作为对照:k’rel对照=k’relHI=1。通过注入5ul 0.1mM NaNO3确定HPLC系统的无效时间t0。运行条件:
柱子:Lichrosorb RP-C18,5μm,4x250mm
缓冲剂A:0.1M磷酸钠pH 7.3,10vol%CH3CN
缓冲剂B:50vol%CH3CN
注射容积:5μl
运行时间:至多60分钟
运行起始梯度后,选择运行衍生物和参照物(例如HI)的等强度水平,在以上方程中在等强度条件下所述衍生物和参照物的洗脱时间来计算k’rel衍生 物。
实施例180:给大鼠肺部输送胰岛素衍生物:
实验方案:
通过滴注方法,将测试物质通过肺部给药。简单而言,用大约60ml芬太尼/脱氢苯哌利多(dehydrobenzperidol)/-多美康将雄性Wistar大鼠(大约250g)麻醉,以6.6ml/kg sc作为初次剂量,而后以30min为间隔给予3.3ml/kg sc的3个维持剂量。诱导麻醉十分钟之后,从尾静脉获得基本样品(t=-20min),而后在给予测试物质之前立即获得基本样品(t=0)。在t=0时,将测试物质通过气管内给予到一侧肺中。将带有圆头的特殊导管装配在注射器上,注射器含有200μl空气和测试物质(1ml/kg)。通过管口,将导管引入气管中,并向前进入到一个主支气管中-刚好通过分岔。在插入期间,从外部摸触颈部,以保证气管定位。注入注射器中的内含物,而后暂停2秒。而后,慢慢地收回管。在测试期间,使大鼠保持麻醉(采血样至多4或8小时),并在实验之后将大鼠安乐死。
图8和9分别显示了本发明胰岛素(实施例9)与现有技术的类似但非抗蛋白酶的胰岛素(实施例183)从气管内滴注的血糖降低效果和血浆胰岛素浓度。
实施例181:给小型猪肺部输送胰岛素衍生物:
试验方案:
给猪植入中心静脉导管以进行静脉注射和血液取样。在肺部实验之前给猪禁食,即给药前一天,在喂食一小时之后将下午喂食后的剩余物移走,并且在给药的当天,不给猪喂食。在实验之前用加10IU/ml肝素的盐水检查该导管的功效。
肺部给药后,应为静脉注射备好的葡萄糖溶液以防低血糖,即将4-5个注射器(20ml)装满无菌的20%葡萄糖,备用。根据临床症状和在血糖仪(Glucocard X-meter)上的血糖测定来诊断低血糖。治疗包括缓慢静脉注射50-100ml 20%葡萄糖(10-20g葡萄糖)。在5-10分种内按份给予葡萄糖直到起效。
在实验的第一部分(直到24h)给猪禁食,但让其自由饮水。获得16h血液样品后,用5000IU/ml肝素封闭导管,放入袋内并放开猪。获得24h血液样品后,用2倍的食物和苹果喂养猪。从24h至48h不给猪禁食。
化合物和肺部给药
肺部给药的粉剂
在实验之前一天将胰岛素粉称重放入干粉设备(PennCenturyTM DP-4型,定做的猪用装置)的8个分开的粉剂室。将所有药室放在温度和湿度受控实验室内的周围有铝箔的容器内的干燥材料上来使它们免受光和湿度影响,直至给药。
根据最新的个体动物重量,由于预计了一定的粉剂保留,给输送装置预负载25nmol/kg。
负载剂量=(粉重+(装置与粉的重量-装置重量))/2。
麻醉
之后立即缓慢地静脉注射Rapinovet Vet.注射剂(异丙酚,10mg/ml)直到达到足够麻醉深度。通常,2-3ml/10kg是足够的,但可能必需每次补充1-2ml直到可能插管。插管之前以0.5ml/只猪的量肌内注射Atropin(1mg/ml)并让其起作用最少5分钟。
为了进行插管,将猪以腹位稍微向前提高放置,将局部麻醉剂Xylocaine kutanspray(利多卡因,10mg/dosis)喷雾到会厌上,采用喉镜和尺寸为8.0mm(ID)的一次性管对猪进行插管。将所述管的两部分牢固地压在一起。
肺部给药过程中的装置位置
给药过程中PennCenturyTM装置的位置应该正好在气管插管的末端外面并应在插管之前在该装置上测定(记住在测量这个时连接L-部件)。给药过程中,PennCenturyTM装置的末端应放在恰在通向右叶的支气管下面的气管中,这用气管镜确认。
人工呼吸
呼吸频率设定在10/min而呼吸深度设定在250ml/次呼吸。呼吸器上装有“婴儿”袋以使给药时间最佳化。麻醉仪与过滤器相连,所述过滤器通过L-部件与气管插管相连。将PennCenturyTM装置引导通过该L-部件,它能控制给药过程中的呼吸深度和呼吸频率。
给药技术
应如上所述放置PennCenturyTM装置。在吸入过程中用PennCenturyTM装置通过手动给药对猪给药(每次一只),采用可调节PennCentury空气泵(AP-1型)。在8次连续呼吸器强制吸入过程中每只猪给予8次空气喷雾(空气泵设定在4mL)以确保给予全部剂量。喷雾之间轻拍药室以免粉末粘到装置上。每只猪用一支新的输送管。吸入时机非常重要,应在吸入一开始就进行空气喷雾(目标为50mL吸入开始)。
为了抵消Domitor的影响,在给药之后立即注射注射剂(阿替美唑5mg/ml)作为肌内注射剂(0.4ml/只猪),将猪带到它们的围栏中,让它们从麻醉中苏醒。
保留分析
放出的药剂应该为药室的全部容纳物,给药后,将设备与所有残余粉一起再称重,保留的粉用9ml 0.01N HCl med 0.05%(w/v)Tween 80萃取缓冲剂萃取并送去分析。
血液取样
给药后,在以下时间点从中心静脉导管采取血液样品:
-10,0,10,20,40,60,90,120,150,180,240(4h),300(5h),360(6h),8h,10h,12h,14h,16h,24h,32h和48h。
采用3-通阀进行取样;将废血注射回到该动物体内。样品尺寸为:收集在用EDTA包覆的管内的0.8ml血液。每次采取血样后,用5ml含有10IU/ml肝素的无菌的0.9%NaCl清洗该插管。将插管轻轻地倾斜最少8次以确保血液与抗凝血剂(EDTA)充分混合,一分钟后将其放在湿冰上。取样后1小时内在4℃下使该插管以3000rpm旋转10min。在移液前,将样品储存在湿冰上。
实验后封闭该插管
用溶解于无菌盐水(1g氨苄青霉素/10ml=100mg/ml)中的氨苄青霉素(10mg/kg=0.1ml/kg的100mg/ml溶液)进行的单一静脉处理通过已经用于血液取样的插管进行。两插管都用加肝素至10IU/ml浓度的4-5ml无菌的0.9%NaCl清洗。用带有乳胶注射膜的新进液口(luer-lock)封闭该插管。通过该膜注射4-5ml无菌的0.9%NaCl。最后通过所述插管注射0.8ml肝素(5000IU/ml),作为塞子。需要无菌技术以免插管内细菌生长从而凝血风险提高。
血液样品分析
将10μl血浆移液到500μl EBIO缓冲剂溶液中以在Biosen自动分析仪中测量葡萄糖在血浆中的浓度。
还通过免疫测定化验血浆样品的外生胰岛素以计算PK参数。按照以上实验方案将实施例9的胰岛素肺部给药到小型猪:
图10和11显示了与相同胰岛素但没有蛋白酶稳定的A14E和B25H突变的胰岛素(现有技术的胰岛素)相比的实施例9胰岛素的药物动力学特征。该数据来自于相同实验,图10显示了最早250分钟的数据,图11显示了整个24小时(1440分钟)时程。
与相同胰岛素但没有蛋白酶稳定的A14E和B25H突变的胰岛素(现有技术的胰岛素)相比,实施例9的胰岛素的药物动力学数据。该数据来自相同实验,相对静脉给药的半衰期(T1/2)和生物利用度(Fit):
实施例182:采用十二指肠腔酶使胰岛素类似物降解:
采用来自SPD大鼠的十二指肠腔酶(通过过滤十二指肠腔内容物制备)使胰岛素类似物降解。该测定由机器人在96孔板(2ml)中进行,其中16孔用于胰岛素类似物和标准物。37℃下在100mM Hepes,pH=7.4中用十二指肠酶孵育胰岛素类似物~15μM,在1,15,30,60,120和240min后取样并通过加入TFA使反应淬灭。通过RP-HPLC确定各时间点的完整胰岛素。在各试验中通过数据的指数拟合确定降解半衰期并归一到对照胰岛素,A14E,B25H,desB30人胰岛素或人胰岛素的确定半衰期。为了降解而加入的酶的量使得对照胰岛素的降解半衰期为60min至180min。按照胰岛素类似物在大鼠十二指肠中的降解半衰期除以相同试验中对照胰岛素的降解半衰期给出结果(相对降解速率)。
大鼠药物动力学:
静脉大鼠PK:
以不同剂量静脉给予麻醉大鼠胰岛素类似物并在给药后以4小时或更长的特定间隔采用免疫测定或质谱测定所用化合物的血浆浓度。随后采用WinNonLin Professional(Pharsight Inc.,Mountain View,CA,USA)计算药物动力学参数。
使用称重为约200克的未禁食雄性Wistar大鼠(Taconic)。
测量体重并随后用Hypnorm/多美康(各化合物分别在无菌水中以1∶1稀释,然后混合;在实验的当日新鲜制备)麻醉大鼠。使用2ml/kg Hypnorm/多美康混合物sc开始麻醉,然后以30min间隔给予两次1ml/kg sc维持剂量和以45min间隔给予两次1ml/kg sc维持剂量。如果需要,为了保持大鼠始终轻微麻醉,提供1-2ml/kg sc的另一剂量。在大鼠容纳室进行称重和起始麻醉以免将动物从一个房间移到另一房间使它们紧张。
经口大鼠PK:
管饲法:
口服给予神志清醒的大鼠胰岛素类似物。给药后以4-6小时的特定间隔测定所用化合物的血浆浓度及血糖变化。随后用WinNonLin Professional(Pharsight Inc.,Mountain View,CA,USA)计算药物动力学参数。
将称重为250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic)禁食~18h并口服给予测试化合物或载体。
用于口服管饲给药的制剂的组分如下(以重量%):
45%丙二醇 (Merck)
33%Capmul MCM C10 (Abitec)
11%泊洛沙姆407 (BASF)
11%聚乙二醇3350Ultra (Fluka)
从Capmul MCM C10,泊洛沙姆407和PEG 3350均等地减去加入的胰岛素的量,但不从丙二醇减去以保持丙二醇的量独立于药物负载,恒定为45%。
RT下将中性胰岛素(在pH 7.4冻干)缓慢搅拌溶解于丙二醇中。根据胰岛素及胰岛素的量,能花几个小时来溶解于丙二醇中。所得溶液应该是清澈的。58℃下将其它添加剂Capmul、泊洛沙姆和PEG3350一起混合并熔融,也应得到透明的淡黄色溶液。
然后将胰岛素的丙二醇溶液升温到35℃并在磁力搅拌下逐份加入熔融的添加剂。所得混合物在35℃下应该是清澈、均匀的,并且在冰箱里储存后得到半固体。制备后,让SEDDS组合物冷却到5℃以固化。
为了确定全血血糖浓度,通过将尾尖的毛细血管进行穿刺,将血样收集在肝素化的10μl毛细管。在500μl分析缓冲剂中稀释之后,通过葡萄糖氧化酶方法,采用Biosen自动分析仪(EKF Diagnostic Gmbh,Germany)测定血糖浓度。对于每个化合物,得到平均血糖浓度进程(平均值±SEM)。
收集样品以确定血浆胰岛素浓度。将100μl血液样品吸入含有EDTA的冷冻管内。将样品保持在冰上直到离心分离(7000rpm,4℃,5min),将血浆移液到Micronic管中并在20℃冷冻直到分析。在Assay and Technology dept.采用认为对各类似物合适或有效的免疫测定来测定胰岛素类似物的血浆浓度。
在t=-10(仅对血糖),t=-1(就在给药前)和给药后4-6小时的特定间隔收集血液样品。
肠内注射:
肠内(到空肠)给予麻醉的大鼠胰岛素类似物。给药后以4小时或更长的特定间隔测定所用化合物的血浆浓度及血糖变化。随后用WinNonLin Professional(Pharsight Inc.,Mountain View,CA,USA)计算药物动力学参数。
使用Hypnorm-多美康s.c.(0.079mg/ml枸橼酸芬太尼,2.5mg/ml氟阿尼酮,和1.25mg/ml咪达唑仑)将雄性Sprague-Dawley(SPRD)大鼠(250-350g,禁食18小时)麻醉,2ml/kg作为初次剂量(给予测试物质之前的时间点-60min),20min之后给予1ml/kg,而后每40min给予1ml/kg。
在肠内注射模型中待测试的胰岛素按照以上管饲模型所配制的配制。
将麻醉的大鼠放置在恒温的垫子上(稳定在37℃)。使装有1ml注射器的20cm聚乙烯导管充满胰岛素制剂或载体。在腹壁开一个4-5cm中线切口。通过穿过肠壁将导管从盲肠轻轻插入空肠~50cm处。如果肠内有内容物,将施用部位移动±10cm。将导管尖头放置在肠段的腔内大约2cm处并将其固定(不用带子)。将肠小心地再放入腹腔内并在各层中用自动夹封闭腹壁和皮肤。在0时间时,通过导管给予大鼠0.4ml/kg测试化合物或载体。
为了确定全血血糖浓度,通过将尾尖的毛细血管进行穿刺,将血样收集在肝素化的10μl毛细管。在500μl分析缓冲剂中稀释之后,通过葡萄糖氧化酶方法,采用Biosen自动分析仪(EKF Diagnostic Gmbh,Germany),测定血糖浓度。对于每个化合物,得到平均血糖浓度进程(平均值±SEM)。
收集样品以确定血浆胰岛素浓度。将100μl血液样品吸入含有EDTA的冷冻管内。将样品保持在冰上直到离心分离(7000rpm,4℃,5min),将血浆移液到Micronic管中并在20℃冷冻直到分析。在认为对各类似物合适或有效的免疫测定中测定胰岛素类似物的血浆浓度。
在t=-10(仅对血糖),t=-1(就在给药前)和给药后特定的4小时或更长间隔收集血液样品。
大鼠药物动力学:
口服给药选定的本发明酰化胰岛素(如上所述)后的血糖-时间特征显示于下:
实施例183
现有技术的胰岛素(即以下化合物)对禁食过夜的雄性Wistar大鼠的口服效果:
B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素在下图1中给出。
实施例184
相对于人胰岛素,本发明的酰化的胰岛素类似物的功效
将重量为238-383g的Sprague Dawley雄性大鼠在实验的当天用于夹钳实验。在可控的环境条件下,使大鼠自由接触饲料,并且禁食过夜(从3pm),之后进行夹钳实验。
实验方案:
在进行外科手术之前,使大鼠在动物装置中适应至少1周。在夹钳实验之前大约1周,在氟烷麻醉下,将Tygon导管插入到颈静脉(用于输注)和颈动脉(用于采血)中,并且外置,在颈部背后固定。手术后给予大鼠Streptocilin vet.(Boehringer Ingelheim;0.15ml/大鼠,i.m.),并在恢复期间放入动物护理单元(25℃)中。为了镇痛,在麻醉期间给予Anorphin(0.06mg/大鼠,s.c),从麻醉中完全恢复(2-3小时)之后,给予Rimadyl(1.5mg/kg,s.c.),每日给予一次,给予2天。
在实验当天的7am,将禁食过夜(从前一天的3pm开始)的大鼠称重,并与取样注射器和输液系统(Harvard 22Basic泵,Harvard,和Perfectum Hypodermic玻璃注射器,Aldrich)连接,然后放入独立的夹钳笼中,在其中,使它们休息大约45min,而后开始实验。在整个实验期间,大鼠能够自由地在其常见的寝具上移动,并且可以自由地接触饮用水。30min基本时间(在此期间,以10min间隔测量血浆葡萄糖水平)之后,将待测的胰岛素衍生物和人胰岛素(每个大鼠一个剂量水平,每剂量水平n=6-7)以恒速灌输(i.v.)300min。为了达到血浆的快速稳态水平,任选给予待测胰岛素衍生物的初次大剂量输注。药物动力学领域的技术人员可基于从i.v.大剂量药物动力学所获得的清除率数据计算初次大剂量输注的剂量。为了保持血糖正常(euglyceamia),以10min间隔全程测量血浆葡萄糖水平,并且相应地调节20%葡萄糖水溶液的输注。汇集每个大鼠中再悬浮的红细胞样品,并且通过颈动脉导管送还大约1/2ml体积。
在每个实验的当天,在夹钳实验之前和最后,获取待测试的各胰岛素衍生物溶液和人胰岛素溶液的样品,并通过HPLC确认肽的浓度。在该研究之前和最后的相应时间点,测量大鼠胰岛素和C-肽以及待测试的胰岛素衍生物和人胰岛素的血浆浓度。在实验的最后,使用过度剂量的戊巴比妥将大鼠杀死。
序列表
SEQ ID No.5-11是以上具体实施例中显示的本发明化合物中存在的A链的序列而SEQ ID No.12-29是以上具体实施例中显示的本发明化合物中存在的B链的序列。
Claims (12)
1.酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中,所述蛋白酶稳定化的胰岛素形式上由非蛋白酶稳定化的胰岛素(母体胰岛素)组成,其中至少一个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代,且其中所述取代是在所述非蛋白酶稳定化的胰岛素(母体胰岛素)的一个或多个蛋白酶裂解位点内部或与其紧密相邻处,和其中这种蛋白酶稳定化的胰岛素任选还包含一个或多个其它突变,条件是所述稳定化的胰岛素仅有一个赖氨酸残基,且其中酰基部分与所述蛋白酶稳定化的胰岛素的赖氨酸残基或N-末端位置相连接。
2.根据前述权利要求所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述非蛋白酶稳定化的胰岛素中的至少两个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述酰基部分与所述蛋白酶稳定化的胰岛素的赖氨酸残基相连接。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述酰基部分与所述蛋白酶稳定化的胰岛素的A链N-末端残基的氨基相连接。
5.根据前述、可能的权利要求中的任一项所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中所述蛋白酶稳定化的胰岛素选自:A8H,B25N,B27E,desB30人胰岛素;A14E,A18L,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27E,desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素;A14E,B28D,desB30人胰岛素;A14E,B28E,desB30人胰岛素;B25N,B27E,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B16H,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;B25H,desB30人胰岛素;A21G,B25H,desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB30人胰岛素和A14E,A21G,B25H,desB27,desB30人胰岛素。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,其中与所述蛋白酶稳定化的胰岛素相连接的酰基部分的通式为Acy-AA1n-AA2m-AA3p-(I),其中n为0或1-3的整数;m为0或1-10的整数;p为0或1-10的整数;Acy是包含约8-约24个碳原子的脂肪酸或脂肪族二酸;AA1是中性的线形或环状氨基酸残基;AA2是酸性的氨基酸残基;AA3是中性的、含亚烷基二醇的氨基酸残基;AA1、AA2和AA3在所述式中出现的顺序可独立地相互交换;AA2可沿着所述式出现几次(例如Acy-AA2-AA32-AA2-);AA2可沿着所述式独立(不同的)出现几次(例如Acy-AA2-AA32-AA2-);Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接基为酰胺(肽)键,其形式上可通过除去Acy、AA1、AA2和AA3各自的氢原子或羟基(水)获得;且与蛋白酶稳定化的胰岛素连接可从式(I)的酰基部分的AA1、AA2或AA3残基的C-末端或式(I)部分存在的AA2残基的侧链之一开始。
7.根据前述、可能的权利要求中的任一项所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素是以上说明书中明确提到的化合物中的任何一种。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,所述酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素选自:A14E,B25H,B29K(Nε-十六烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε3-羧基-5-十八烷二酰氨基苯甲酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε-N-十八烷二酰-N-(2-羧乙基)甘氨酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε(N-十八烷二酰-N-羧甲基)-β-丙氨酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε4-([4-({19-羧基十九烷二酰氨基}甲基)反式环己烷甲酰基]-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十七烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十四烷基),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε4-([4-({19-羧基十九烷酰氨基}甲基)反式环己烷甲酰基]-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B28D,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-PEG7),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十七烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B16E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B16E,B25H,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-OEG-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A 14E,A18L,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,A18L,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A1G(Nα十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素;A14E,B1F(Nα十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),B25H,B29R,desB30人胰岛素;A1G(Nα十六烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-Abu-Abu-Abu-Abu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nα二十烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nα4-[16-(1H-四唑-5-基)十六烷酰氨磺酰基]丁酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十二烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十二烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε(N-二十烷二酰-N-羧甲基)-βAla),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε3-[2-(2-{2-[2-(17-羧基十七烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε3-[2-(2-{2-[2-(19-羧基十九烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε4-([4-({17-羧基十九烷酰氨基}甲基)反式环己烷甲酰基]-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε4-([4-({17-羧基十七烷酰氨基}甲基)反式环己烷甲酰基]-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B28D,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B28D,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B28D,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B28D,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B27E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B1E,B25H,B27E,B28E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B28D,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B28E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25N,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25N,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25N,B27E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25N,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;B25N,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;B25N,B27E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A8H,B25N,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A8H,B25N,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A8H,B25N,B27E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A8H,B25N,B27E,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A8H,B25N,B27E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A8H,B25N,B27E,B29K(Nε十六烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε(N-二十烷二酰-N-羧甲基)-βAla-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε(N-十八烷二酰-N-羧甲基)-βAla-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε(N-十六烷二酰-N-羧甲基)-βAla-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰)甲氧基]乙酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酰基),desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酰基),desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基]乙酰基),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A1G(Nα十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),A14E,A21G,B25H,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB28,desB29,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε(5-二十烷二酰氨基间苯二甲酸)),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-Aoc),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,desB27,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B16H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A1G(Nα十八烷二酰),A14E,B25H,B29R,desB30人胰岛素;A14E,B16H,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B27K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB28,desB29,desB30人胰岛素;A14E,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-γGlu-γGlu),desB30人胰岛素;A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,desB27,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu-OEG-OEG),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,A21G,B25H,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε十八烷二酰),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰-γGlu),desB30人胰岛素;A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29K(Nε二十烷二酰),desB30人胰岛素;A1G(Nα十八烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A1G(Nα二十烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A1G(Nα十八烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素;A1G(Nα二十烷二酰-γGlu),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素;A1G(Nα十八烷二酰),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A1G(Nα二十烷二酰),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,desB30人胰岛素;A1G(Nα十八烷二酰),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素和A1G(Nα二十烷二酰),A14E,B25H,B26G,B27G,B28G,B29R,desB30人胰岛素。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,用作药物。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的酰化的、蛋白酶稳定化的胰岛素,用于治疗或预防高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量削弱、I型糖尿病、肥胖症、X综合征或血脂异常。
11.治疗有效量的前述权利要求中的任一项所述的蛋白酶稳定化的胰岛素用于制备药物制剂的用途,所述药物制剂用于治疗或预防高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量削弱、I型糖尿病、肥胖症、X综合征或血脂异常。
12.本文中描述的任何新特征或特征的组合。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP08102708 | 2008-03-18 | ||
EP08102708.8 | 2008-03-18 | ||
EP08170231 | 2008-11-28 | ||
EP08170231.8 | 2008-11-28 | ||
PCT/EP2009/053017 WO2009115469A1 (en) | 2008-03-18 | 2009-03-13 | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102037008A true CN102037008A (zh) | 2011-04-27 |
CN102037008B CN102037008B (zh) | 2016-08-31 |
Family
ID=40673840
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200980118484.7A Active CN102037008B (zh) | 2008-03-18 | 2009-03-13 | 蛋白酶稳定化的、酰化胰岛素类似物 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8691759B2 (zh) |
EP (4) | EP2910569B1 (zh) |
JP (4) | JP5749155B2 (zh) |
KR (3) | KR101755529B1 (zh) |
CN (1) | CN102037008B (zh) |
AU (1) | AU2009226910B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0910348B1 (zh) |
CA (1) | CA2718738C (zh) |
DK (2) | DK2910570T3 (zh) |
ES (2) | ES2609288T3 (zh) |
HU (2) | HUE032284T2 (zh) |
IL (3) | IL207748A0 (zh) |
MX (1) | MX2010009850A (zh) |
PL (2) | PL2254906T3 (zh) |
PT (2) | PT2910570T (zh) |
RU (1) | RU2571857C2 (zh) |
WO (1) | WO2009115469A1 (zh) |
ZA (1) | ZA201006126B (zh) |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103897053A (zh) * | 2012-12-25 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 化学修饰的胸腺肽α1及其合成方法 |
CN105636979A (zh) * | 2013-10-07 | 2016-06-01 | 诺和诺德股份有限公司 | 胰岛素类似物的新衍生物 |
CN107206059A (zh) * | 2015-01-29 | 2017-09-26 | 诺和诺德股份有限公司 | 包含片芯和聚乙烯醇包衣的用于口服胰岛素给药的药物组合物 |
CN107531806A (zh) * | 2015-05-07 | 2018-01-02 | 伊莱利利公司 | 融合蛋白 |
CN108026157A (zh) * | 2015-08-25 | 2018-05-11 | 诺和诺德股份有限公司 | 新型胰岛素衍生物及其医学用途 |
CN110041219A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-07-23 | 南京工业大学 | 一种索马鲁肽侧链的液相合成方法 |
CN112679701A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-20 | 重庆宸安生物制药有限公司 | 一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途 |
WO2021136296A1 (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-08 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
WO2021136303A1 (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-08 | 甘李药业股份有限公司 | 长效glp-1化合物 |
WO2023143458A1 (zh) * | 2022-01-28 | 2023-08-03 | 甘李药业股份有限公司 | 酰化胰岛素 |
WO2023174370A1 (zh) * | 2022-03-16 | 2023-09-21 | 北京拓界生物医药科技有限公司 | 人胰岛素类似物、其融合蛋白及医药用途 |
WO2024051787A1 (zh) * | 2022-09-09 | 2024-03-14 | 北京惠之衡生物科技有限公司 | 一种长效酰化胰岛素衍生物及其应用 |
CN114901682B (zh) * | 2019-12-30 | 2024-04-16 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
Families Citing this family (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK1969004T3 (da) | 2005-12-28 | 2011-11-28 | Novo Nordisk As | Insulinsammensætninger og metode til at lave en sammensætning |
KR101729986B1 (ko) * | 2006-09-22 | 2017-04-25 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 프로테아제 내성 인슐린 유사체 |
WO2008132224A2 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-06 | Novo Nordisk A/S | Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein |
WO2008145728A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-04 | Novo Nordisk A/S | Spontaneously dispersible preconcentrates including a peptide drug in a solid or semisolid carrier |
ES2618073T3 (es) * | 2008-03-14 | 2017-06-20 | Novo Nordisk A/S | Análogos de insulina estabilizados frente a proteasas |
US8691759B2 (en) | 2008-03-18 | 2014-04-08 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
JP2012511506A (ja) * | 2008-12-09 | 2012-05-24 | ノヴォ・ノルディスク・アー/エス | 新規インスリンアナログ |
CN102481343A (zh) | 2009-09-16 | 2012-05-30 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 稳定的含胰岛素的非水液体药物组合物 |
US20130058999A1 (en) * | 2010-01-12 | 2013-03-07 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical compositions for oral administration of insulin peptides |
EP2536752B1 (en) | 2010-02-16 | 2015-04-08 | Novo Nordisk A/S | Modified recombinant Factor VIII |
AU2011269000C1 (en) | 2010-06-23 | 2015-10-08 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives containing additional disulfide bonds |
WO2012049307A2 (en) | 2010-10-15 | 2012-04-19 | Novo Nordisk A/S | Novel n-terminally modified insulin derivatives |
DK2632478T3 (da) | 2010-10-27 | 2019-10-07 | Novo Nordisk As | Behandling af diabetes melitus under anvendelse af insulinindsprøjtninger indgivet med varierende indsprøjtningsintervaller |
US20140011728A1 (en) * | 2011-02-15 | 2014-01-09 | Novo Nordisk A/S | Long-acting il-1 receptor antagonists |
WO2012140155A1 (en) | 2011-04-14 | 2012-10-18 | Novo Nordisk A/S | Fatty acid acylated amino acids for oral peptide delivery |
US9260503B2 (en) * | 2011-06-15 | 2016-02-16 | Novo Nordisk A/S | Multi-substituted insulins |
JP2015502971A (ja) | 2011-12-21 | 2015-01-29 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | N末端修飾インスリン誘導体 |
CN104364260B (zh) * | 2012-04-11 | 2017-02-22 | 诺和诺德股份有限公司 | 胰岛素制剂 |
US20150111820A1 (en) * | 2012-07-09 | 2015-04-23 | Novo Nordisk A/S | Novel use of insulin derivatives |
EP2908846A1 (en) | 2012-10-17 | 2015-08-26 | Novo Nordisk A/S | Fatty acid acylated d-amino acids for oral peptide delivery |
WO2014077575A1 (ko) * | 2012-11-13 | 2014-05-22 | 다인바이오 주식회사 | 덱에이 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물 |
US10137172B2 (en) | 2013-04-30 | 2018-11-27 | Novo Nordisk A/S | Administration regime |
CN105246459A (zh) * | 2013-05-30 | 2016-01-13 | 诺和诺德股份有限公司 | 治疗糖尿病的新的口服药用组合物 |
GB201315335D0 (en) * | 2013-08-29 | 2013-10-09 | Of Singapore | Amino diacids containing peptide modifiers |
US10253082B2 (en) * | 2014-01-20 | 2019-04-09 | Hanmi Pharm. Co., Ltd | Long-acting insulin and use thereof |
AR099569A1 (es) * | 2014-02-28 | 2016-08-03 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina y los usos médicos de estos |
CN108026156A (zh) * | 2015-08-25 | 2018-05-11 | 诺和诺德股份有限公司 | 新型胰岛素衍生物及其医学用途 |
US20180244743A1 (en) | 2015-08-25 | 2018-08-30 | Novo Nordisk A/S | Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof |
UY36870A (es) | 2015-08-28 | 2017-03-31 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Análogos de insulina novedosos |
GB201607918D0 (en) | 2016-05-06 | 2016-06-22 | Arecor Ltd | Novel formulations |
EP3495384A4 (en) * | 2016-08-02 | 2020-02-26 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | ACYLATED DERIVATIVE OF HUMAN INSULIN OR ANALOGUE OF IT |
CN110546161B (zh) * | 2016-09-23 | 2024-01-26 | 韩美药品股份有限公司 | 对胰岛素受体具有降低的结合力的胰岛素类似物及其用途 |
US10914728B2 (en) * | 2016-10-24 | 2021-02-09 | Novo Nordisk A/S | Bioassay for insulin formulations |
MA46780A (fr) | 2016-11-07 | 2019-09-11 | Novo Nordisk As | Esters à dchbs actif de composés peg et leur utilisation |
ES2930149T3 (es) * | 2016-12-16 | 2022-12-07 | Novo Nordisk As | Composiciones farmacéuticas que contienen insulina |
TWI798209B (zh) | 2017-03-23 | 2023-04-11 | 南韓商韓美藥品股份有限公司 | 對胰島素受體有降低親和性之胰島素類似物之接合物及其用途 |
CN108929383B (zh) * | 2017-05-26 | 2021-10-15 | 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 | 重组Slit2D2(C386S)-HSA融合蛋白及其在预防和/或治疗肺部炎症中的应用 |
JOP20190273A1 (ar) * | 2017-05-26 | 2019-11-24 | Lilly Co Eli | مركب إنسولين معالج بأسيل |
AU2018317810A1 (en) * | 2017-08-17 | 2020-03-19 | Novo Nordisk A/S | Novel acylated insulin analogues and uses thereof |
US10335464B1 (en) | 2018-06-26 | 2019-07-02 | Novo Nordisk A/S | Device for titrating basal insulin |
KR20200017078A (ko) | 2018-08-08 | 2020-02-18 | 주식회사 대웅제약 | 지속형 인슐린 아날로그 및 그 복합체 |
AR116605A1 (es) | 2018-10-05 | 2021-05-26 | Novo Nordisk As | Compuestos bifuncionales que comprenden péptidos de insulina y péptidos de egf(a) |
SG11202106166TA (en) * | 2018-12-11 | 2021-07-29 | Sanofi Sa | Peptide binder |
CN111574585B (zh) * | 2019-01-30 | 2021-10-01 | 浙江省医学科学院 | 一种鳕鱼皮寡肽及其分离纯化方法和应用 |
WO2021041770A1 (en) | 2019-08-30 | 2021-03-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Pcsk9 antagonist compounds |
MX2022007034A (es) | 2019-12-10 | 2022-06-23 | Sanofi Sa | Un metodo para formar un conjugado de una sulfonamida y un polipeptido. |
BR112022009510A2 (pt) | 2019-12-11 | 2022-08-16 | Novo Nordisk As | Análogo de insulina, composição farmacêutica, e, método de tratamento, prevenção ou alívio de uma doença ou distúrbio ou condição |
JP2023519516A (ja) | 2020-03-06 | 2023-05-11 | サノフイ | 選択的gip受容体アゴニストとしてのペプチド |
IL300464A (en) | 2020-08-19 | 2023-04-01 | Sanofi Sa | CRF2 receptor agonists and their use in therapy |
WO2022090448A1 (en) | 2020-10-30 | 2022-05-05 | Novo Nordisk A/S | Novel acylating reagents |
GB2616223A (en) * | 2020-11-27 | 2023-08-30 | D&D Pharmatech Inc | Oral formulation of biologically active material conjugate having biotin moiety, fatty acid moiety, or combination thereof coupled thereto |
AU2021386899A1 (en) * | 2020-11-27 | 2023-06-22 | D&D Pharmatech Inc. | Biologically active material conjugate having biotin moiety, fatty acid moiety, or combination thereof coupled thereto |
CN115385843A (zh) * | 2021-05-24 | 2022-11-25 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种新型的酰化胰岛素类似物 |
WO2023012263A1 (en) | 2021-08-04 | 2023-02-09 | Novo Nordisk A/S | Solid oral peptide formulations |
CA3227734A1 (en) * | 2021-08-23 | 2023-03-02 | Eli Lilly And Company | Compounds and methods for liquid phase synthesis |
WO2023031455A1 (en) | 2021-09-06 | 2023-03-09 | Sanofi Sa | New peptides as potent and selective gip receptor agonists |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990001038A1 (en) * | 1988-07-20 | 1990-02-08 | Nordisk Gentofte A/S | Human insulin analogs and preparations containing them |
WO2007096431A1 (en) * | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
Family Cites Families (229)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US487000A (en) | 1892-11-29 | Shirt | ||
US2832685A (en) | 1952-05-24 | 1958-04-29 | Crest Foods Co Inc | Solubilization of milk proteins |
GB894095A (en) | 1960-02-08 | 1962-04-18 | Tanaka Shoichi | A therapeutic device for personal wear |
US3528960A (en) | 1968-10-07 | 1970-09-15 | Lilly Co Eli | N-carboxyaroyl insulins |
US3719655A (en) | 1969-12-05 | 1973-03-06 | Lilly Co Eli | Process for the crystallization of the ammonium and alkali metal salts in insulin |
US3950517A (en) | 1970-05-08 | 1976-04-13 | National Research Development Corporation | Insulin derivatives |
US3869437A (en) | 1970-05-08 | 1975-03-04 | Nat Res Dev | Mono-, di, and N{HD A1{B , N{HU B1{B , N{HU B29{B -tri-acylated insulin |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4033941A (en) | 1975-12-17 | 1977-07-05 | Eli Lilly And Company | Process for purifying glucagon |
GB1492997A (en) | 1976-07-21 | 1977-11-23 | Nat Res Dev | Insulin derivatives |
JPS6030650B2 (ja) | 1979-10-26 | 1985-07-17 | 日本油脂株式会社 | 座薬基剤組成物 |
JPS5767548A (en) | 1980-10-14 | 1982-04-24 | Shionogi & Co Ltd | Insulin analog and its preparation |
NL193099C (nl) | 1981-10-30 | 1998-11-03 | Novo Industri As | Gestabiliseerde insuline-oplossing. |
US4546082A (en) | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
US4870008A (en) | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
US4839341A (en) | 1984-05-29 | 1989-06-13 | Eli Lilly And Company | Stabilized insulin formulations |
DK347086D0 (da) | 1986-07-21 | 1986-07-21 | Novo Industri As | Novel peptides |
PH25772A (en) | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
US4849227A (en) | 1986-03-21 | 1989-07-18 | Eurasiam Laboratories, Inc. | Pharmaceutical compositions |
PH23446A (en) | 1986-10-20 | 1989-08-07 | Novo Industri As | Peptide preparations |
NZ222907A (en) | 1986-12-16 | 1990-08-28 | Novo Industri As | Preparation for intranasal administration containing a phospholipid absorption enhancing system |
DK463887D0 (da) | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
US5266310A (en) | 1987-09-17 | 1993-11-30 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Stabilization of therapeutically active proteins in pharmaceutical preparations |
JPH01254699A (ja) | 1988-04-05 | 1989-10-11 | Kodama Kk | インスリン誘導体及びその用途 |
DK257988D0 (da) | 1988-05-11 | 1988-05-11 | Novo Industri As | Nye peptider |
GB2222770B (en) | 1988-09-16 | 1992-07-29 | Sandoz Ltd | Pharmaceutical compositions containing cyclosporins |
US5225323A (en) | 1988-11-21 | 1993-07-06 | Baylor College Of Medicine | Human high-affinity neurotransmitter uptake system |
US5716927A (en) | 1988-12-23 | 1998-02-10 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogs having a modified B-chain |
WO1990007522A1 (en) | 1988-12-23 | 1990-07-12 | Novo Nordisk A/S | Human insulin analogues |
DE3844211A1 (de) | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
DK105489D0 (da) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
US5514646A (en) | 1989-02-09 | 1996-05-07 | Chance; Ronald E. | Insulin analogs modified at position 29 of the B chain |
JPH04504858A (ja) | 1989-04-20 | 1992-08-27 | マウント シナイ スクール オブ メディスン オブ ザ シティー ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 肝臓特異性インシュリン類似体 |
CA1340994C (en) | 1989-09-21 | 2000-05-16 | Rudolf Edgar Dr. Falk | Treatment of conditions and disease |
WO1991003935A1 (en) | 1989-09-22 | 1991-04-04 | Tsi-Mason Research Institute | Method and compositions for one-step cryopreservation of embryos |
AU628674B2 (en) | 1989-10-19 | 1992-09-17 | Nippon Oil And Fats Company, Limited | Polymer complexes of a sugar response type |
US5179189A (en) | 1990-01-19 | 1993-01-12 | Nova Pharmaceutical Corporation | Fatty acid terminated polyanhydrides |
DK45590D0 (zh) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | Novo Nordisk As | |
DK155690D0 (da) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
DK158390D0 (da) | 1990-07-02 | 1990-07-02 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
AU8091091A (en) | 1990-07-26 | 1992-02-18 | University Of Iowa Research Foundation, The | Novel drug delivery systems for proteins and peptides using albumin as a carrier molecule |
WO1992004893A1 (en) | 1990-09-13 | 1992-04-02 | Smithkline Beecham Corporation | Non-aqueous liquid oral suspensions |
DK10191D0 (da) | 1991-01-22 | 1991-01-22 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte peptider |
US5336782A (en) | 1991-04-24 | 1994-08-09 | Kuraray Co., Ltd. | Long chain carboxylic acid imide ester |
CA2268476A1 (en) | 1991-07-03 | 1998-04-30 | Hyal Pharmaceutical Corporation | Use of hyaluronan in gene therapy |
JPH06509796A (ja) | 1991-07-26 | 1994-11-02 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | W/oミクロエマルジョン |
US5268453A (en) | 1991-08-08 | 1993-12-07 | Scios Inc. | Tissue-selective insulin analogs |
US5206219A (en) | 1991-11-25 | 1993-04-27 | Applied Analytical Industries, Inc. | Oral compositions of proteinaceous medicaments |
ZA928916B (en) | 1991-11-26 | 1994-05-18 | Lilly Co Eli | Tri-arginine insulins |
DK0547544T3 (da) | 1991-12-18 | 1997-09-08 | Hoechst Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af insulinholdige opløsninger. |
AU5171293A (en) | 1992-10-14 | 1994-05-09 | Regents Of The University Of Colorado, The | Ion-pairing of drugs for improved efficacy and delivery |
WO1994008603A1 (en) | 1992-10-16 | 1994-04-28 | Smithkline Beecham Corporation | Compositions |
WO1994008605A1 (en) | 1992-10-16 | 1994-04-28 | Smithkline Beecham Corporation | Therapeutic microemulsions |
EP0684833A4 (en) | 1993-02-17 | 1996-09-11 | Smithkline Beecham Corp | MICRO-EMULSIONS COMPRISING THERAPEUTIC PEPTIDES. |
EP0684834A4 (en) | 1993-02-17 | 1996-09-25 | Smithkline Beecham Corp | MICROEMULSIONS CONTAINING THERAPEUTIC PEPTIDES. |
DK0686045T3 (da) | 1993-02-23 | 2001-03-05 | Genentech Inc | Stabilisering af med organisk opløsningsmiddel behandlede polypeptider med et hjælpestof |
US5359030A (en) | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
US5424286A (en) | 1993-05-24 | 1995-06-13 | Eng; John | Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same |
US5506203C1 (en) | 1993-06-24 | 2001-02-06 | Astra Ab | Systemic administration of a therapeutic preparation |
DK82893D0 (da) | 1993-07-08 | 1993-07-08 | Novo Nordisk As | Peptid |
KR100310122B1 (ko) | 1993-09-17 | 2002-04-24 | 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 | 아실화된인슐린 |
US6869930B1 (en) * | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
GB9323588D0 (en) | 1993-11-16 | 1994-01-05 | Cortecs Ltd | Hydrophobic preparation |
DE69535897D1 (de) | 1994-03-07 | 2009-01-22 | Nektar Therapeutics | Verfahren und Zusammensetzung für die pulmonale Darreichung von Insulin |
US5639642A (en) | 1994-06-16 | 1997-06-17 | Novo Nordisk A/S | Synthetic leader peptide sequences |
US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
IL114160A (en) | 1994-06-17 | 2006-12-31 | Novo Nordisk As | Dna constructs encoding heterologous proteins and processes for the heterologous protein production in yeast |
US5646242A (en) | 1994-11-17 | 1997-07-08 | Eli Lilly And Company | Selective acylation of epsilon-amino groups |
US5693609A (en) | 1994-11-17 | 1997-12-02 | Eli Lilly And Company | Acylated insulin analogs |
US6251856B1 (en) | 1995-03-17 | 2001-06-26 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
BR9607647A (pt) | 1995-03-17 | 1999-04-06 | Novo Nordisk As | Derivado de insulina e composição farmacêutica e processo para o tratamento de diabetes em um paciente em necessidade deste tratamento |
US5824638A (en) | 1995-05-22 | 1998-10-20 | Shire Laboratories, Inc. | Oral insulin delivery |
US20010041786A1 (en) | 1995-06-07 | 2001-11-15 | Mark L. Brader | Stabilized acylated insulin formulations |
ATE252913T1 (de) | 1995-06-30 | 2003-11-15 | Novo Nordisk As | Vorbeugung einer krankheit mit diabetes charakter |
US20030104981A1 (en) | 1995-11-03 | 2003-06-05 | Jelena Mandic | Human insulin analogues |
US6451970B1 (en) | 1996-02-21 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Peptide derivatives |
WO1998001473A1 (en) | 1996-07-05 | 1998-01-15 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of precursors of insulin, precursors of insulin analogues, and insulin like peptides |
DE69731105T2 (de) | 1996-07-11 | 2005-11-17 | Novo Nordisk A/S | Verfahren zur selektiven acetylierung |
US5981489A (en) | 1996-07-18 | 1999-11-09 | Alza Corporation | Non-aqueous protic peptide formulations |
DE59711533D1 (de) | 1996-07-26 | 2004-05-27 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivate mit erhöhter Zinkbindung |
IL119029A0 (en) | 1996-08-07 | 1996-11-14 | Yeda Res & Dev | Long-acting drugs and pharamaceutical compositions comprising them |
ATE356830T1 (de) | 1996-08-30 | 2007-04-15 | Novo Nordisk As | Glp-1 derivate |
WO1998032867A1 (en) | 1997-01-24 | 1998-07-30 | Novo Nordisk A/S | Synthetic leader peptide sequences |
WO1998033512A1 (en) | 1997-01-30 | 1998-08-06 | Novartis Ag | Oil-free pharmaceutical compositions containing cyclosporin a |
US5898067A (en) | 1997-02-07 | 1999-04-27 | Novo Nordisk A/S | Crystallization of proteins |
US6310038B1 (en) | 1997-03-20 | 2001-10-30 | Novo Nordisk A/S | Pulmonary insulin crystals |
ZA984697B (en) | 1997-06-13 | 1999-12-01 | Lilly Co Eli | Stable insulin formulations. |
DK1025125T3 (da) | 1997-10-24 | 2003-10-06 | Novo Nordisk As | Aggregater for humane insulinderivater |
AU1111799A (en) | 1997-10-24 | 1999-05-17 | Eli Lilly And Company | Fatty acid-acylated insulin analogs |
ZA989744B (en) | 1997-10-31 | 2000-04-26 | Lilly Co Eli | Method for administering acylated insulin. |
DE69826705T2 (de) | 1997-11-12 | 2006-02-23 | Alza Corp., Palo Alto | Verfahren zur dermalen verabreichung von polypeptiden |
CO4970787A1 (es) | 1997-12-23 | 2000-11-07 | Lilly Co Eli | Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea |
AU2610699A (en) | 1998-02-27 | 1999-09-15 | Novo Nordisk A/S | Derivatives of glp-1 analogs |
CA2334859A1 (en) | 1998-06-12 | 1999-12-23 | Kings College London | Insulin analogue |
GB9814172D0 (en) | 1998-06-30 | 1998-08-26 | Andaris Ltd | Formulation for inhalation |
ES2335066T3 (es) | 1998-08-10 | 2010-03-18 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Diferenciacion de celulas no productoras de insulina en celulas productoras de insulina glp-1 o exendina-4 y utilizaciones de las mismas. |
ATE365547T1 (de) | 1998-08-25 | 2007-07-15 | Advanced Inhalation Res Inc | Sprühgetrocknete proteinformulierungen |
TW570805B (en) | 1998-09-01 | 2004-01-11 | Hoffmann La Roche | Water-soluble pharmaceutical composition in an ionic complex |
US7030083B2 (en) | 1998-09-09 | 2006-04-18 | University Of Washington | Treatment of eclampsia and preeclampsia |
KR100617286B1 (ko) | 1998-10-16 | 2006-08-30 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 폐 송달을 위한 안정한 농축 인슐린 조제물 |
US6660715B2 (en) | 1998-11-19 | 2003-12-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Nonaqueous solutions and suspensions of macromolecules for pulmonary delivery |
US7425541B2 (en) | 1998-12-11 | 2008-09-16 | Medarex, Inc. | Enzyme-cleavable prodrug compounds |
ES2180511T3 (es) | 1999-01-26 | 2003-02-16 | Lilly Co Eli | Formulaciones monodispersas de analogos de insulina acilados hexamericos. |
WO2000047203A1 (en) | 1999-02-12 | 2000-08-17 | Mqs, Inc. | Formulation and system for intra-oral delivery of pharmaceutical agents |
US6267985B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-07-31 | Lipocine Inc. | Clear oil-containing pharmaceutical compositions |
WO2000061178A1 (en) | 1999-04-13 | 2000-10-19 | Inhale Therapeutics Systems, Inc. | Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility |
CA2370302A1 (en) | 1999-04-27 | 2000-11-02 | Benjamin Lee Hughes | Insulin crystals for pulmonary administration |
CA2372393A1 (en) | 1999-05-19 | 2000-11-23 | Bassil I. Dahiyat | Novel proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes |
US6746853B1 (en) | 1999-05-19 | 2004-06-08 | Xencor, Inc. | Proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes |
US6309633B1 (en) | 1999-06-19 | 2001-10-30 | Nobex Corporation | Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same |
WO2001000674A1 (en) | 1999-06-29 | 2001-01-04 | Eli Lilly And Company | Insulin crystals for pulmonary administration |
IL150129A0 (en) | 1999-12-16 | 2002-12-01 | Lilly Co Eli | Polypeptide compositions with improved stability |
WO2001052937A1 (en) | 2000-01-24 | 2001-07-26 | Medtronic Minimed, Inc. | Mixed buffer system for stabilizing polypeptide formulations |
ES2266187T3 (es) | 2000-03-24 | 2007-03-01 | Genentech, Inc. | Uso de la insulina para el tratamiento de trastornos del cartilago. |
AU2001263775A1 (en) | 2000-06-02 | 2001-12-11 | Novo-Nordisk A/S | Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives |
CN1141974C (zh) | 2000-06-07 | 2004-03-17 | 张昊 | 结肠定位释放的口服生物制剂 |
US6459965B1 (en) | 2000-11-22 | 2002-10-01 | Ge-Harris Railway Electronics, Llc | Method for advanced communication-based vehicle control |
KR100508695B1 (ko) | 2001-02-13 | 2005-08-17 | 한국과학기술연구원 | 인슐린의 경구투여용 제형과 그의 제조방법 |
US6867183B2 (en) | 2001-02-15 | 2005-03-15 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US7060675B2 (en) | 2001-02-15 | 2006-06-13 | Nobex Corporation | Methods of treating diabetes mellitus |
US6852694B2 (en) | 2001-02-21 | 2005-02-08 | Medtronic Minimed, Inc. | Stabilized insulin formulations |
CN1160122C (zh) | 2001-04-20 | 2004-08-04 | 清华大学 | 一种制备口服胰岛素油相制剂的方法 |
AP1763A (en) | 2001-05-21 | 2007-08-02 | Nektar Therapeutics | Pulmonary administration of chemically modified insulin |
US6828297B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6858580B2 (en) | 2001-06-04 | 2005-02-22 | Nobex Corporation | Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
JP2004537580A (ja) | 2001-08-10 | 2004-12-16 | エピックス メディカル, インコーポレイテッド | 延長された循環半減期を有するポリペプチド結合体 |
US7312192B2 (en) | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US7030082B2 (en) | 2001-09-07 | 2006-04-18 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith |
PE20030536A1 (es) | 2001-09-07 | 2003-07-03 | Biocon Ltd | Metodos para sintetizar conjugados polipeptido de insulina-oligomero, y conjugados polipeptido de proinsulina-oligomero y metodos de sintetizar dichos conjugados |
US6770625B2 (en) | 2001-09-07 | 2004-08-03 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US7317000B2 (en) | 2001-12-02 | 2008-01-08 | Novo Nordisk A/S | Glucose-dependent insulins |
JP2005526009A (ja) | 2001-12-02 | 2005-09-02 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 新規グルコース依存性インスリン |
JP2005515197A (ja) | 2001-12-03 | 2005-05-26 | ドー バイオファーマ インコーポレイテッド | 安定化された逆ミセル組成物およびその使用 |
WO2003050276A1 (en) | 2001-12-05 | 2003-06-19 | Dow Global Technologies Inc. | Method for immobilizing a biologic in a polyurethane-hydrogel composition, a composition prepared from the method, and biomedical applications |
AU2002346491A1 (en) | 2001-12-19 | 2003-07-09 | Eli Lilly And Company | Crystalline compositions for controlling blood glucose |
HUP0700126A2 (en) | 2001-12-20 | 2007-06-28 | Lilly Co Eli | Insulin molecule having protracted time action |
UA46669C2 (uk) | 2001-12-29 | 2005-12-15 | Товариство З Обмеженою Відповідальністю "Мако" | Спосіб приготування готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії |
AU2003208316A1 (en) | 2002-03-13 | 2003-09-22 | Novo Nordisk A/S | Minimising body weight gain in insulin treatment |
ATE496064T1 (de) | 2002-05-07 | 2011-02-15 | Novo Nordisk As | Lösliche formulierungen, die monomeres insulin und acyliertes insulin enthalten |
EP1506003A1 (en) | 2002-05-07 | 2005-02-16 | Novo Nordisk A/S | Soluble formulations comprising insulin aspart and insulin detemir |
AU2003236521A1 (en) | 2002-06-13 | 2003-12-31 | Nobex Corporation | Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus |
CN1165549C (zh) | 2002-06-15 | 2004-09-08 | 江苏万邦生化医药股份有限公司 | 胰岛素的纯化方法 |
US7563807B2 (en) | 2002-09-17 | 2009-07-21 | Merck & Co. Inc. | Removal of aldehyde impurity by reactive polystyrene resini |
US20040185068A1 (en) | 2003-03-18 | 2004-09-23 | Zhi-Jian Yu | Self-emulsifying compositions, methods of use and preparation |
ES2375056T3 (es) | 2003-06-03 | 2012-02-24 | Novo Nordisk A/S | Composiciones pept�?dicas farmacéuticas estabilizadas. |
EP1633391B1 (en) | 2003-06-03 | 2011-10-19 | Novo Nordisk A/S | Stabilized pharmaceutical peptide compositions |
BRPI0411479A (pt) | 2003-06-17 | 2006-07-25 | Sembiosys Genetics Inc | métodos para a produção de insulina em plantas |
US20050054818A1 (en) | 2003-07-02 | 2005-03-10 | Brader Mark Laurence | Crystalline compositions for controlling blood glucose |
EP1644411A2 (en) | 2003-07-11 | 2006-04-12 | Novo Nordisk A/S | Stabilised insulin compositions |
EP2085406A1 (en) | 2003-07-25 | 2009-08-05 | ConjuChem Biotechnologies Inc. | Long lasting insulin derivatives and methods thereof |
MXPA06001283A (es) | 2003-08-05 | 2006-04-11 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina novedosos. |
US20060198819A1 (en) | 2003-08-08 | 2006-09-07 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest |
WO2005016312A1 (en) | 2003-08-13 | 2005-02-24 | Nobex Corporation | Micro-particle fatty acid salt solid dosage formulations for therapeutic agents |
US20070203058A1 (en) | 2003-09-19 | 2007-08-30 | Novo Nordisk A/S | Novel Glp-1 Derivatives |
US20050118206A1 (en) | 2003-11-14 | 2005-06-02 | Luk Andrew S. | Surfactant-based gel as an injectable, sustained drug delivery vehicle |
EP1687428A1 (en) * | 2003-11-14 | 2006-08-09 | Novo Nordisk A/S | Processes for making acylated insulin |
SI1687019T1 (en) | 2003-11-20 | 2018-04-30 | Novo Nordisk A/S | PROPILED GLIKO-CONTAINING PEPTIDAL FORMULATIONS OPTIMAL FOR MANUFACTURING AND FOR USE IN INJECTION DEVICES |
WO2005058961A2 (en) | 2003-12-12 | 2005-06-30 | Amgen Inc. | Antibodies specific for human galanin, and uses thereof |
DE10358387A1 (de) | 2003-12-13 | 2005-07-07 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Pulver enthaltend niedermolekulares Dextran und Verfahren zu deren Herstellung |
EP1734938B1 (en) | 2004-03-26 | 2012-06-20 | Universita' Degli Studi Di Parma | Insulin highly respirable microparticles |
WO2006097793A2 (en) | 2004-04-15 | 2006-09-21 | Chiasma, Ltd. | Compositions capable of facilitating penetration across a biological barrier |
AU2005247369A1 (en) | 2004-05-10 | 2005-12-08 | Mdrna, Inc. | Compositions and methods for enhanced mucosal delivery of parathyroid hormone |
JP2008507477A (ja) | 2004-07-08 | 2008-03-13 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | ポリペプチド延長タグ |
EP1768694A1 (en) | 2004-07-09 | 2007-04-04 | Novo Nordisk A/S | Phamaceutical preparations comprising insulin |
CA2910494C (en) | 2004-07-19 | 2018-10-23 | Biocon Limited | Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof |
MX2007001589A (es) | 2004-08-09 | 2007-08-02 | Alios Biopharma Inc | Variantes de polipeptido resistentes a proteasa, hiperglicosiladas sinteticas, formulaciones orales y metodos para utilizar las mismas. |
PL2322180T3 (pl) | 2004-08-23 | 2015-10-30 | Mannkind Corp | Sole diketopiperazyny do dostarczania leków |
WO2006035418A2 (en) | 2004-09-27 | 2006-04-06 | Sigmoid Biotechnologies Limited | Microcapsules comprising a methylxanthine and a corticosteroid |
JP5921052B2 (ja) | 2004-12-03 | 2016-05-24 | ロード アイランド ホスピタル | アルツハイマー病の検査 |
WO2006079641A2 (en) | 2005-01-27 | 2006-08-03 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives conjugated with structurally well defined branched polymers |
EP2256130B1 (en) | 2005-02-02 | 2013-09-25 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin derivatives |
US20080171695A1 (en) | 2005-02-02 | 2008-07-17 | Novo Nordisk A/S | Insulin Derivatives |
US20090123563A1 (en) | 2005-02-07 | 2009-05-14 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical Preparations Comprising Insulin, Zinc Ions and Zinc-Binding Ligand |
EP2242489A1 (en) | 2005-02-15 | 2010-10-27 | Jallal Messadek | Combination therapeutic compositions and method of use |
WO2006097521A1 (en) | 2005-03-18 | 2006-09-21 | Novo Nordisk A/S | Pegylated single-chain insulin |
TWI362392B (en) | 2005-03-18 | 2012-04-21 | Novo Nordisk As | Acylated glp-1 compounds |
WO2006103657A2 (en) | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Dexcel Pharma Technologies Ltd. | A solid composition for intra-oral delivery of insulin |
ATE509634T1 (de) | 2005-04-08 | 2011-06-15 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Pharmazeutische formulierungen mit incretin- peptid und aprotisch-polarem lösungsmittel |
EP1888118B1 (en) | 2005-05-25 | 2016-08-17 | Novo Nordisk A/S | Polypeptide formulations stabilized with ethylenediamine |
WO2007006320A1 (en) | 2005-07-12 | 2007-01-18 | Sherine Hassan Abbas Helmy | Drinkable oral insulin liquid and capsules |
WO2007041481A1 (en) | 2005-09-29 | 2007-04-12 | Biodel, Inc. | Rapid acting and prolonged acting insulin preparations |
JP4710533B2 (ja) | 2005-10-07 | 2011-06-29 | 株式会社豊田自動織機 | 牽引車両のドローバー装置 |
WO2007047948A2 (en) | 2005-10-20 | 2007-04-26 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Intranasal administration of rapid acting insulin |
DK1969004T3 (da) | 2005-12-28 | 2011-11-28 | Novo Nordisk As | Insulinsammensætninger og metode til at lave en sammensætning |
US8343914B2 (en) | 2006-01-06 | 2013-01-01 | Case Western Reserve University | Fibrillation resistant proteins |
US20090069216A1 (en) | 2006-02-21 | 2009-03-12 | Novo Nordisk A/S | Single-Chain Insulin Analogues and Pharmaceutical Formulations Thereof |
US20090069215A1 (en) | 2006-03-13 | 2009-03-12 | Novo Nordisk A/S | Acylated Single Chain Insulin |
WO2007104738A2 (en) | 2006-03-13 | 2007-09-20 | Novo Nordisk A/S | Acylated single chain insulin |
ES2548393T3 (es) | 2006-05-09 | 2015-10-16 | Novo Nordisk A/S | Derivado de insulina |
ES2553154T3 (es) | 2006-05-09 | 2015-12-04 | Novo Nordisk A/S | Derivado de la insulina |
US20090306337A1 (en) * | 2006-07-31 | 2009-12-10 | Novo Nordisk A/S | Pegylated, Extended Insulins |
KR101729986B1 (ko) | 2006-09-22 | 2017-04-25 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 프로테아제 내성 인슐린 유사체 |
EP2074140B8 (en) | 2006-10-04 | 2015-10-28 | Case Western Reserve University | Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues |
US20100120660A1 (en) | 2007-04-30 | 2010-05-13 | Per Balschmidt | Highly concentrated insulin solutions and compositions |
WO2008132224A2 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-06 | Novo Nordisk A/S | Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein |
JP5675347B2 (ja) | 2007-06-01 | 2015-02-25 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | 安定した非水性薬学的組成物 |
WO2008145728A1 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-04 | Novo Nordisk A/S | Spontaneously dispersible preconcentrates including a peptide drug in a solid or semisolid carrier |
ES2744384T3 (es) | 2007-06-13 | 2020-02-24 | Novo Nordisk As | Formulación farmacéutica que comprende un derivado de insulina |
CN101743252A (zh) | 2007-07-16 | 2010-06-16 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 蛋白酶稳定化的、peg化的胰岛素类似物 |
ES2558930T3 (es) | 2007-08-13 | 2016-02-09 | Novo Nordisk A/S | Análogos de la insulina de acción rápida |
US9150633B2 (en) * | 2007-08-15 | 2015-10-06 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues with an acyl and alkylene glycol moiety |
JP5721432B2 (ja) * | 2007-08-15 | 2015-05-20 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | アミノ酸含有アルキレングリコール反復単位を含むアシル部を有するインスリン |
US20090087484A1 (en) | 2007-09-28 | 2009-04-02 | Alza Corporation | Formulation and dosage form for increasing oral bioavailability of hydrophilic macromolecules |
CN107412742B (zh) | 2007-11-16 | 2022-03-15 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 包含glp-1肽或毒蜥外泌肽-4和基础胰岛素肽的药物组合物 |
ES2618073T3 (es) | 2008-03-14 | 2017-06-20 | Novo Nordisk A/S | Análogos de insulina estabilizados frente a proteasas |
US8691759B2 (en) | 2008-03-18 | 2014-04-08 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
WO2009129250A2 (en) | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Case Western Reserve University | Meal-time insulin analogues of enhanced stability |
TWI451876B (zh) | 2008-06-13 | 2014-09-11 | Lilly Co Eli | 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物 |
EP2352513B1 (en) | 2008-10-30 | 2016-09-14 | Novo Nordisk A/S | Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency |
EP2370059A1 (en) | 2008-11-28 | 2011-10-05 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical compositions suitable for oral administration of derivatized insulin peptides |
JP2012511506A (ja) | 2008-12-09 | 2012-05-24 | ノヴォ・ノルディスク・アー/エス | 新規インスリンアナログ |
CN102481343A (zh) | 2009-09-16 | 2012-05-30 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 稳定的含胰岛素的非水液体药物组合物 |
US8865647B2 (en) | 2009-11-02 | 2014-10-21 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical solution of non covalently bound albumin and acylated insulin |
CN102770469B (zh) | 2009-11-23 | 2015-04-15 | 巴斯夫欧洲公司 | 制备具有改善的色彩稳定性的吸水性聚合物颗粒的方法 |
US20130058999A1 (en) | 2010-01-12 | 2013-03-07 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical compositions for oral administration of insulin peptides |
AU2011269000C1 (en) | 2010-06-23 | 2015-10-08 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives containing additional disulfide bonds |
US8815798B2 (en) | 2010-06-23 | 2014-08-26 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues containing additional disulfide bonds |
WO2012049307A2 (en) | 2010-10-15 | 2012-04-19 | Novo Nordisk A/S | Novel n-terminally modified insulin derivatives |
US20130331320A1 (en) | 2010-12-14 | 2013-12-12 | Novo Nordisk A/S | Fast-acting insulin in combination with long-acting insulin |
US9260503B2 (en) | 2011-06-15 | 2016-02-16 | Novo Nordisk A/S | Multi-substituted insulins |
CN104364260B (zh) | 2012-04-11 | 2017-02-22 | 诺和诺德股份有限公司 | 胰岛素制剂 |
US20150111820A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-04-23 | Novo Nordisk A/S | Novel use of insulin derivatives |
US10137172B2 (en) | 2013-04-30 | 2018-11-27 | Novo Nordisk A/S | Administration regime |
AU2014333979B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-02-15 | Novo Nordisk A/S | Novel derivative of an insulin analogue |
FR3013049B1 (fr) | 2013-11-14 | 2015-11-13 | You-Ping Chan | Analogue de l'insuline glargine |
WO2015131902A1 (en) | 2014-03-07 | 2015-09-11 | Jørgensen Klavs Holger | Novel fast acting insulin preparations |
TWI685348B (zh) | 2014-05-08 | 2020-02-21 | 美國禮來大藥廠 | 速效胰島素組合物 |
TW201630622A (zh) | 2014-12-16 | 2016-09-01 | 美國禮來大藥廠 | 速效胰島素組合物 |
ES2930149T3 (es) | 2016-12-16 | 2022-12-07 | Novo Nordisk As | Composiciones farmacéuticas que contienen insulina |
-
2009
- 2009-03-13 US US12/922,117 patent/US8691759B2/en active Active
- 2009-03-13 EP EP14198511.9A patent/EP2910569B1/en not_active Not-in-force
- 2009-03-13 ES ES09722934.8T patent/ES2609288T3/es active Active
- 2009-03-13 EP EP14198513.5A patent/EP2910570B1/en active Active
- 2009-03-13 HU HUE14198513A patent/HUE032284T2/en unknown
- 2009-03-13 KR KR1020167029489A patent/KR101755529B1/ko active IP Right Grant
- 2009-03-13 ES ES14198513.5T patent/ES2611007T3/es active Active
- 2009-03-13 PT PT141985135T patent/PT2910570T/pt unknown
- 2009-03-13 RU RU2010141481/10A patent/RU2571857C2/ru active
- 2009-03-13 PL PL09722934T patent/PL2254906T3/pl unknown
- 2009-03-13 EP EP14198514.3A patent/EP2910571B1/en not_active Not-in-force
- 2009-03-13 HU HUE09722934A patent/HUE032287T2/en unknown
- 2009-03-13 PT PT97229348T patent/PT2254906T/pt unknown
- 2009-03-13 CA CA2718738A patent/CA2718738C/en active Active
- 2009-03-13 EP EP09722934.8A patent/EP2254906B1/en active Active
- 2009-03-13 PL PL14198513T patent/PL2910570T3/pl unknown
- 2009-03-13 KR KR1020167015848A patent/KR101755434B1/ko active IP Right Grant
- 2009-03-13 MX MX2010009850A patent/MX2010009850A/es active IP Right Grant
- 2009-03-13 CN CN200980118484.7A patent/CN102037008B/zh active Active
- 2009-03-13 BR BRPI0910348-1A patent/BRPI0910348B1/pt active IP Right Grant
- 2009-03-13 DK DK14198513.5T patent/DK2910570T3/en active
- 2009-03-13 KR KR1020107020828A patent/KR20110004366A/ko not_active IP Right Cessation
- 2009-03-13 DK DK09722934.8T patent/DK2254906T3/en active
- 2009-03-13 JP JP2011500166A patent/JP5749155B2/ja active Active
- 2009-03-13 AU AU2009226910A patent/AU2009226910B2/en not_active Ceased
- 2009-03-13 WO PCT/EP2009/053017 patent/WO2009115469A1/en active Application Filing
-
2010
- 2010-08-23 IL IL207748A patent/IL207748A0/en unknown
- 2010-08-27 ZA ZA2010/06126A patent/ZA201006126B/en unknown
-
2013
- 2013-08-22 US US13/973,183 patent/US9045560B2/en active Active
-
2015
- 2015-03-20 JP JP2015057775A patent/JP2015147781A/ja not_active Withdrawn
- 2015-03-20 JP JP2015057776A patent/JP2015147782A/ja not_active Withdrawn
- 2015-03-20 JP JP2015057777A patent/JP2015155421A/ja not_active Withdrawn
- 2015-04-13 US US14/684,863 patent/US9688737B2/en active Active
- 2015-04-14 US US14/686,176 patent/US10259856B2/en active Active
-
2017
- 2017-02-12 IL IL250548A patent/IL250548B/en active IP Right Grant
- 2017-02-12 IL IL250549A patent/IL250549B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-12-14 US US16/220,414 patent/US20190112348A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990001038A1 (en) * | 1988-07-20 | 1990-02-08 | Nordisk Gentofte A/S | Human insulin analogs and preparations containing them |
WO2007096431A1 (en) * | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
SVEND HAVELUND, ET AL: "The mechanism of protraction of insulin detemir, a long-acting, acylated analog of human insulin", 《PHARMACEUTICAL RESEARCH》 * |
YING-CHI CHU ET AL: "The A14 position of insulin tolerates considerable structural alteration with modest effects on the biological behavior of the hormone", 《JOURNAL OF PROTEIN CHEMISTRY》 * |
黄 涛等: "亚油酸酰化胰岛素的制备及飞行质谱分析", 《化学研究与应用》 * |
Cited By (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103897053A (zh) * | 2012-12-25 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 化学修饰的胸腺肽α1及其合成方法 |
CN103897053B (zh) * | 2012-12-25 | 2019-01-15 | 深圳先进技术研究院 | 化学修饰的胸腺肽α1及其合成方法 |
CN105636979A (zh) * | 2013-10-07 | 2016-06-01 | 诺和诺德股份有限公司 | 胰岛素类似物的新衍生物 |
CN105636979B (zh) * | 2013-10-07 | 2020-01-10 | 诺和诺德股份有限公司 | 胰岛素类似物的新衍生物 |
CN107206059A (zh) * | 2015-01-29 | 2017-09-26 | 诺和诺德股份有限公司 | 包含片芯和聚乙烯醇包衣的用于口服胰岛素给药的药物组合物 |
CN107531806A (zh) * | 2015-05-07 | 2018-01-02 | 伊莱利利公司 | 融合蛋白 |
CN107531806B (zh) * | 2015-05-07 | 2022-06-07 | 伊莱利利公司 | 融合蛋白 |
CN108026157A (zh) * | 2015-08-25 | 2018-05-11 | 诺和诺德股份有限公司 | 新型胰岛素衍生物及其医学用途 |
CN110041219A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-07-23 | 南京工业大学 | 一种索马鲁肽侧链的液相合成方法 |
CN110041219B (zh) * | 2019-05-09 | 2020-09-25 | 南京工业大学 | 一种索马鲁肽侧链的液相合成方法 |
WO2021136296A1 (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-08 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
WO2021136293A1 (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-08 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
WO2021136303A1 (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-08 | 甘李药业股份有限公司 | 长效glp-1化合物 |
WO2021136302A1 (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-08 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
CN114901680A (zh) * | 2019-12-30 | 2022-08-12 | 甘李药业股份有限公司 | 长效glp-1化合物 |
CN114901682A (zh) * | 2019-12-30 | 2022-08-12 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
CN114901681A (zh) * | 2019-12-30 | 2022-08-12 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
CN114901681B (zh) * | 2019-12-30 | 2024-04-09 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
CN114901682B (zh) * | 2019-12-30 | 2024-04-16 | 甘李药业股份有限公司 | 胰岛素衍生物 |
CN112679701A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-20 | 重庆宸安生物制药有限公司 | 一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途 |
WO2023143458A1 (zh) * | 2022-01-28 | 2023-08-03 | 甘李药业股份有限公司 | 酰化胰岛素 |
WO2023174370A1 (zh) * | 2022-03-16 | 2023-09-21 | 北京拓界生物医药科技有限公司 | 人胰岛素类似物、其融合蛋白及医药用途 |
WO2024051787A1 (zh) * | 2022-09-09 | 2024-03-14 | 北京惠之衡生物科技有限公司 | 一种长效酰化胰岛素衍生物及其应用 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102037008B (zh) | 蛋白酶稳定化的、酰化胰岛素类似物 | |
AU2013205273B2 (en) | Protease stabilized, acylated insulin analogues | |
TW201307381A (zh) | 新穎的n-端經修飾胰島素衍生物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |