CN103069266B - 等渗缓冲组合物与能够细胞计数的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开多功能计量流体/洗涤试剂，用于采用液体体积计量的自动细胞分析仪中。组合物包括螯合剂、离子化盐、可选的稳定离子、缓冲剂、非溶血性表面活性剂、以及可选的抗菌剂。有利的是，该组合物在一年中产生少于百万分之一的甲醛。还描述了组合物的使用方法。

Description

等渗缓冲组合物与能够细胞计数的方法
交叉引用
根据《专利合作条约》第8（1）条，本专利申请要求2010年8月9日提交的第12/853,046号美国非临时专利申请的优先权，整体以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于采用液体容量计量的自动化细胞分析仪的计量流体组合物。本发明亦涉及在采用液体容量计量的自动化细胞分析仪上控制启动和终止计数事件的方法。
背景技术
自动化细胞分析仪，如血液分析仪，能够对细胞样品中的细胞进行计数和表征。当细胞通过小孔时，这些仪器中特定的仪器检测出电导变化。细胞导电与环境中的流体不同。因此，它们通过小孔时改变了其有效横截面、以及因此的导电性。这些仪器精确的细胞计数和表征要求具有在计数事件期间准确测量分析样品容量的能力。完成该操作的一种方法是利用液体容量计量，其中流体通过毛细管时的具体容量的流动可控制计数事件的启动和终止。
采用液体容量计量法的自动化细胞分析仪的计量系统可包括计量管、启动传感器、和终止传感器。启动传感器和终止传感器位于计量管的相反两端。两个传感器可以是光学传感器，经校准从而检测当计量流体的弯液面通过时所发生的光强度变化。液体计量流体流通过计量管时，首先通过启动传感器，然后通过终止传感器，触发计数事件的启动和终止。
目前，采用液体容量计量的自动化细胞分析仪有计量管和垂直定向的传感器，从而使得启动传感器位于计量管的顶部、而终止传感器位于计量管的底部。计量流体从顶部向下流，首先触发启动传感器，然后是终止传感器。沿该方向，可能发生液体“侧流”的问题。由于进行液体计量的流体的重力作用，一些流体可以较快地沿计量管内壁一侧流过，改变了弯液面的角度，从而使其不能被启动或终止传感器所检测。在这种情况下，无法计量。为克服这一问题，计量流体被设计成具有相对高的表面张力，从而减少测流的可能性。但是，即使使用表面张力相对高的计量流体，如果细胞碎片沉积于计量管，测流也可能发生。
最近，已设计出具有能够消除测流问题的液体容量计量系统的自动化细胞分析仪。这些仪器使用垂直定向的计量管，但是计量液体从下至上流动。启动传感器位于计量管的底部，而终止传感器位于计量管的顶部。因此，由于计量流体的重力作用不再相关，完全消除了测流现象。由于现有试剂不适用于这些新系统，所以这些仪器的发展迫切需要开发新的计量试剂。
自动化细胞分析仪通常安装成使得孔的一侧是可接收分析前悬浮于等渗稀释剂中的细胞样品的样品浴。孔的另一侧是细胞计数结束后可用来将细胞从孔上冲刷下来的洗涤试剂。洗涤试剂呈流体形式与样品浴连通，这样一来，一些洗涤试剂进入样品浴并且与细胞样品接触时可能发生回流。仪器不使用时尤其如此。传统上，用于悬浮细胞样品的等渗稀释剂也用作洗涤试剂。因此，传统上孔的每一侧的流体都是相同的。
用于自动化细胞分析仪的许多市售计量流体和洗涤试剂所产生的甲醛量超过约400ppm。甲醛已被世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）列为已知的人类致癌物，也是有毒和引起过敏症的。越来越多的州，如加利福尼亚州和马萨诸塞州的管理机构，已在工业和医疗废物中限制所允许的甲醛量。根据这些规定，废弃物中甲醛浓度等于或小于1ppm认为是无甲醛的。因此，用于自动化细胞分析仪并且在其保质期内产生小于1ppm甲醛的稀释剂、计量流体和洗涤试剂是非常理想的。
本发明通过公开用于自动化细胞分析仪的经优化的稳定的计量流体，从而改进了当前可用的计量流体，此自动化细胞分析仪使用自下而上的计量管排列。本发明的计量流体具有相对低的表面张力和洗涤能力，有助于防止细胞碎片在仪器内表面上的沉积，简化了细胞分析仪的清洗和维护。本发明的计量流体亦是等渗和非溶血性的，因而适于用作洗涤试剂。与传统上用作洗涤试剂的稀释剂相比，本发明组合物具有洗涤能力。因此，当用作洗涤试剂时，本发明的计量流体有助于防止细胞碎片沉积于孔的内部和周围。
本发明的计量流体亦用于计数事件之间冲刷细胞分析仪，从而将仪器内表面细胞碎片除去。优选本发明的计量流体组合物亦有广泛的杀菌活性，是等渗的、非溶血性的，并且产生的弯液面角度能够适当触发启动和终止传感器，开始和结束计数时间间隔。有利的是，本发明的计量流体组合物在其保质期内亦产生少于约1ppm的甲醛。
发明内容
本发明旨在提供一种非溶血性组合物，其用于采用液体容量计量的自动化细胞分析仪中。在某些实施方式中，组合物包含螯合剂、离子化盐（ionizingsalt）和非溶血性表面活性剂。在某些实施方式中，该组合物用作计量流体和/或洗涤试剂。
在某些实施方式中，用于采用液体容量计量的自动化分析仪的组合物包括：a）螯合剂，b）离子化盐，和c）非溶血性表面活性剂，其中组合物是非溶血性的，pH约6.5～约7.5，组合物的表面张力处于约40达因/厘米至约66达因/厘米之间。
在某些实施方式中，用于采用液体容量计量的自动化分析仪的组合物包括：a）螯合剂，b）离子化盐，和c）非溶血性表面活性剂，其中组合物是非溶血性的，pH约6.5～约7.5，当流过计量管时，组合物会产生约30°至约60°之间的角度的弯液面。
在某些实施方式中，用于采用液体容量计量的自动化分析仪的组合物包括：a）浓度为约0.05g/L～约6.0g/L的螯合剂，b）浓度为约0.1g/L～约5g/L的离子化盐，和c）浓度为约0.1g/L～约3.0g/L的非溶血性表面活性剂，其中组合物是非溶血性的，pH约6.5～约7.5，当流过计量管时，组合物会产生约30°至约60°之间的角度的弯液面。
在某些实施方式中，用于采用液体容量计量的自动化分析仪的组合物包括：a）螯合剂，b）离子化盐，和c）非溶血性表面活性剂，其中组合物是非溶血性的，pH约6.5～约7.5，组合物在内径2.7毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管中产生约30°至约60°之间的角度的弯液面。
在某些实施方式中，组合物以流体形式与自动化细胞分析仪相连通。因此，例如本发明计量流体可存储于一个大体积容器中，该容器通过螺旋盖连接器可流动地与自动化分析仪连接。该容器可构造成使其能够与自动化细胞分析仪直接连接。
本发明也旨在提供用于控制采用液体容量计量的自动化分析仪启动和终止计数事件的方法。
在某些实施方式中，在采用液体容量计量的自动化分析仪上控制启动和终止计数事件的方法包括：向计量管供给计量流体组合物，该组合物包括：螯合剂、离子化盐，和非溶血性表面活性剂，使计量流体组合物流过计量管，其中计量流体的弯液面首先触发启动传感器开始计数事件，然后触发终止传感器终止计数事件。在某些实施方式中，在采用液体容量计量的自动化分析仪上控制启动和终止计数事件的方法进一步包括将计量流体组合物设置成以流体形式与样品浴相连通的步骤。
附图说明
附图被并入本文并形成说明书一部分，用于阐明本发明，并与说明书一起进一步解释本发明的原理，使相关领域的技术人员能够制造和使用本发明。
图1是采用液体容量计量的自动化分析仪组件的示意图。
具体实施方式
定义
如此处和本说明书中所用短语“低甲醛”指的是一种至少1年时间内含有或产生小于约百万分之一（ppm）甲醛的溶液。在一个实施方式中，低甲醛描述一种至少1年时间内含有或产生小于约0.70ppm甲醛的溶液。在另一个实施方式中，低甲醛描述一种至少1年时间内含有或产生小于约0.10ppm甲醛的溶液。在优选的实施方式中，低甲醛描述一种至少1年时间内含有或产生小于约0.01ppm甲醛的溶液。在其他实施例中，低甲醛描述一种至少1年时间内含有或产生小于约0.001ppm甲醛的溶液。
可使用EPA方法8315A测定甲醛。该方法必需用2,4-二硝基苯肼衍生样品，从而将醛中的羰基转化为腙。样品中的每个羰基化合物形成各自的腙衍生物，使用有机溶剂将这些独立的衍生物从溶液中萃取出来。这些独立的腙衍生物使用HPLC（高效液相色谱法）进行分离和定量。EPA方法8315A的细节可以从EPA网站获得。
本文所用术语“表面张力”是指将液体分子吸引在一起的内聚力，比如范德瓦尔斯力。大部分液体中，每个液体分子受到临近液体分子各个方向上对等的拉力，导致净力为零。任何液体的表面都是该液体与其他介质的交界面。在液体表面，液体分子与其他液体分子和临近介质（另一种液体、气体、或固体介质）的表面接触。因此，表面的所有分子都受到吸引其靠近其他液体分子的内聚力，以及吸引或排斥其远离其他临近介质分子的粘附力。液体将在界面呈现平衡这些力的几何形状。
溶质对液体的表面张力有一定影响。例如，无机盐倾向于增大其表面张力，表面活性剂和醇类倾向于降低表面张力。
表面张力以每单位长度所受到的力来计量，如达因每厘米（达因/厘米）或牛顿每米（N/m）。(1达因/厘米=0.001N/m)。有许多已知的方法用于确定液体的表面张力。这些包括毛细管弯液面测量法（J.E.Lane,J.Colloid.InterfaceSci.,42,145-149(1973)）、推进或后退浸没Wilhelmy吊片接触角测量法（R.H.Dettre,R.E.Johnson,J.Colloid.InterfaceSci.,21,367(1966)）、白金环法（W.D.Harkins,H.F.Jordan,J.Amer.Chem.Soc.,52,1751(1930)）、悬垂液滴形状分析法（K.Hansen,G.Rodsrun,J.Colloid.InterfaceSci.,141,1-12(1991)）。测量表面张力的常用技术是毛细管升高法。毛细管升高法涉及将毛细管的末端浸没至所测溶液中。溶液在毛细管中上升的高度通过方程Y=1/2phrg与表面张力相关，其中y是液体表面张力，p是液体密度，h是毛细管中液面上升的高度，r是毛细管半径，g是重力加速度。本文所讨论的表面张力单位，除另有说明外，均通过毛细管升高法测的。
如本文所述，术语“弯液面”是指液体表面的曲线，是液体分子间内聚力和液体表面/固体表面界面液体分子和固体表面间粘附力平衡的结果。弯液面可以是凹的、凸的、或平的。当液体分子彼此间的吸引力强于液体分子与固体表面间吸引力时，产生凸状弯液面。相反，当液体分子吸引固体表面分子时，产生凹状弯液面。
弯液面的角度（也称为接触角），是液/气界面与固体表面相遇的角度。对于任一给定系统，弯液面的角度是确定的，并由跨越三个界面的内聚力和和粘附力的相互作用所决定。给定弯液面的角度可使用接触角测角仪测量。或者，弯液面角度可使用Young氏方程计算：Ysv=Ysl+Ylvcosθ，其中Ysv=固体表面自由能，Ysl=固/液界面自由能，Ylv=液体表面自由能，θ是弯液面角度。
如本文所述，术语“等张”或“等渗”是指溶液与所分析的细胞样品具有相同的重量摩尔渗透压浓度（osmolality，即，重量克分子渗透浓度）。张力过低（比细胞样品的重量摩尔渗透压浓度低）的计量流体可导致水分扩散入细胞，进而引起细胞膨胀和炸裂，释放可沉积于仪器内表面的细胞碎片。张力过高（比细胞样品的重量摩尔渗透压浓度高）的计量流体可导致水分从细胞中扩散出来，引起细胞萎缩。某些实施例中，细胞样品是血液。诸如血液的生理性流体重量摩尔渗透压浓度的范围约240mOsm/kg至约340mOsm/kg。因此，当生理流体用作细胞样品时，等张溶液的重量摩尔渗透压浓度的范围约240mOsm/kg至约340mOsm/kg。
如此处和本说明书中所述，术语“抗菌剂”是指能够有效减少或消除微生物的化合物，所述微生物包括，但并不局限于，革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和酵母菌。
如此处和本说明书中所述，术语“非溶血性”是指，在自动化细胞分析仪完成细胞样品计数所需一段时间内，当细胞暴露于溶液中时，不会导致细胞样品中大量细胞裂解的溶液。通常情况下，自动化细胞分析仪的一个完整计数周期是1分钟或者更少。因此，例如，暴露于其中一分钟内不裂解细胞的溶液就是非溶血性的。
本发明中采用液体容量计量的自动化细胞分析仪具有计量系统，该系统包括计量管、启动传感器、终止传感器和真空室。启动传感器和终止传感器位于计量管的相反两端。如果自动化分析仪为自下向上构造的计量管，则计量管将垂直安放，启动传感器位于计量管底端，终止传感器位于计量管的顶端。计量管顶端与真空室连通。真空室内施加负压，迫使液体计量流体向上流动穿过计量管，首先通过启动传感器，然后通过终止传感器。传感器经校准后，检测位于气/液/计量管表面界面弯液面的过程。
启动传感器和终止传感器是光学传感器，旨在检测光强度的变化。在某些实施方式中，启动和终止传感器是发光二极管（LED）传感器。当计量流体表面通过启动传感器时，适宜角度弯液面的出现会导致光强度改变，从而产生电信号，触发计数的启动。当计量流体表面到达终止传感器时，适宜角度弯液面再度导致光强度改变，因而产生另一电信号，引起计数的终止。一个典型的采用自下向上计量系统的液体容量设备被公开于张等人的专利公开号为2007/0269882美国专利中，将该专利的全部内容合并入本文以供参考。
因此，本发明的一个目的是提供一种低表面张力的计量流体，用于采用自下而上计量体系的机动化细胞分析仪，该流体在液/气计量管交界面产生具有角度的弯液面，导致光强度的适当变化，从而触发计量时段的开始和终止。某些情况下，由于这些试剂在使用前要被存储很长一段时间，所以优选具有合适抗菌性能的试剂，以防止细菌和真菌生长。预防仪器内、比如计量管内的微生物生长也十分重要，因为微生物生长会造成仪器组件污染并干扰系统性能。例如，微生物可能会被错误地计数为样品细胞。因此，优选具有有效抗菌活性的计量流体。
细胞样品往往含有蛋白质和被溶解细胞的碎片，这些物质可在与样品混合物接触的仪器组件表面沉淀。此外，这些物质亦可与稀释剂中的化学物质形成不溶性复合物，沉淀于仪器组件表面。随着时间推移，这些沉淀物会逐渐增加，导致孔或计量管的部分或完全堵塞，这可能致使仪器无法工作或导致错误的细胞计数。因此，用于自动化细胞分析仪的洗涤试剂1）是非溶血性和等渗的，并且2）具有洗涤能力，有助于去除仪器内表面沉淀的细胞蛋白和碎片，这样是特别理想的。
因此，本发明的另一个目的是提供还可用作洗涤试剂的计量流体试剂。本发明的计量流体是等渗的、非溶血性的、并且具有较低的表面张力和洗涤能力。因此，本发明的计量流体与传统上使用的洗涤试剂相比，是优良的洗涤试剂，因为它们有助于防止细胞碎片在孔内或孔周围沉积。这将减少对单独一种清洗仪器试剂的需要，因此可降低操作成本，增加细胞计数的准确性和一致性，并且增加仪器日常维护和清洁之间的时间。本发明组合物亦可被冻结和解冻而不丧失有效性。此外，本发明组合物在整个一年中产生小于1ppm的甲醛。
螯合剂
本发明组合物包含作为组分的一种或多种螯合剂。螯合剂是一种能够在细胞膜内螯合离子并且削弱它们，使细胞更容易受到生物杀伤的化合物。因此，螯合剂协助组合物中抗微生物的化合物杀灭细菌和真菌。螯合剂亦可与缓冲剂协作，维持组合物的pH。在细胞样品即为血液样品的情况下，螯合剂也有助于通过减少血小板聚集来维持血液的抗凝。
在一个实施方式中，螯合剂可以是乙二胺四乙酸（EDTA），EDTA衍生物，或它们的混合物。在一个特定实施方式中，螯合剂是EDTA的衍生物。EDTA衍生物包括EDTA的盐，如EDTA二钠、EDTA四钠、EDTA二钾、乙二醇-双(3-氨基乙醚)N-N'-四乙酸（EGTA）。例如，在实施方式中，螯合剂是EDTA二钠。另一实施方式中，螯合剂是EDTA二钾。又一个实施方式中，螯合剂是乙二醇-双(2-氨基乙醚)N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）。
在另一个实施方式中，除EDTA或其衍生物之外的附加螯合剂可被加入到本发明的组合物中，这样的附加螯合剂包括如上所述在本领域技术人员所熟知的可螯合离子的化合物。这些螯合剂中的一些包括、但不限于环己二胺四乙酸，二乙烯三胺五乙酸、和/或羟乙基乙二胺三乙酸。
一般地，本发明的组合物中每种螯合剂的浓度为约0.05克每升（g/L）至6g/L。某些实施方式中，组合物中每种螯合剂的浓度为约2g/L至4g/L。螯合剂的浓度优选是2.7g/L至3.3g/L。
稳定离子
优选本发明的组合物包括作为组分的一种或多种稳定离子。稳定离子有助于组合物的等渗性、重量摩尔渗透压浓度和离子强度，有助于溶液的电导性，并且利于维持电化学平衡。稳定离子亦有助于溶解样品中的异常蛋白质，防止它们沉淀。优选地，稳定离子包括硫酸根阴离子。硫酸根阴离子可由硫酸盐例如碱金属硫酸盐提供。示例性的碱金属硫酸盐包括、但不限于硫酸钠和钾盐。优选地，碱金属硫酸盐是硫酸钠。在一个实施方式中，碱金属硫酸盐以水溶液形式加入组合物中。优选，组合物中稳定离子的浓度为约7g/L至约21g/L。更优选的是，组合物中稳定离子的浓度为约12g/L至约16g/L。
也可预期下述盐可以提供稳定离子：盐类，诸如硫酸铵、氯化钠、醋酸镁、胍基硫酸盐，和包括柠檬酸盐、醋酸盐、和磷酸盐在内的中性盐。
离子化盐
本发明的组合物包括作为组分的一种或多种离子化盐。离子化盐有利于硫酸盐调节组合物的重量摩尔渗透压浓度和离子强度。优选，离子化盐是碱金属氯化物。碱金属氯化物包括、但不限于钠和钾的氯化物。更优选的是，离子化盐是氯化钠。在一个实施方式中，离子化盐以水溶液形式加入组合物中。优选，离子化盐的浓度为约0.1g/L至约5g/L。更好的是，离子化盐浓度为约0.5g/L至约1.5g/L。
缓冲剂
组合物所需的pH取决于所使用的细胞分析仪和将进行的测试。优选地，组合物的pH是约5.0至约9.0间。更优选的是，组合物的pH是约6.0至约8.5间。更优选的是，组合物的pH是约6.2至约8.2间。更优选的是，组合物的pH是约6.5至约7.5间。
一般而言，一种或多种缓冲剂以足够达到所需pH的浓度加入到组合物中。该浓度取决于对组合物整体酸度或碱度能做出贡献的其他溶质的浓度。
作为参考情况，本说明书将使用术语“缓冲剂”或“缓冲剂”。但是，应该理解的是，两种或以上的缓冲剂可作为本发明的缓冲剂。加入组合物中的缓冲剂的量足以将pH调节到优选的范围内。调整缓冲剂的量以提供适宜的pH是一种已被建立的方法。在某些实施方式中，缓冲剂包括碱。优选，碱是碱金属氢氧化物。更优选的是，碱金属氢氧化物是氢氧化钠或氢氧化钾。如果不对细胞样品的分析产生干扰，也可利用其他的碱。在一个实施方式中，碱以水溶液形式被加入。另一个实施方式中，碱以50%水溶液的形式被加入。
表面活性剂
本发明的组合物可另外包含非溶血性表面活性剂。表面活性剂可降低组合物的表面张力，这样在计量流体的表面和计量管的内表面就可形成能够触发启动和终止传感器的角度的弯液面。表面活性剂可干扰物质分子与另一分子发生作用的能力，因此，降低了物质的表面张力。表面活性剂亦赋予组合物以洗涤能力，给予其去除沉淀于自动化分析仪内表面细胞碎片和蛋白的能力和/或防止细胞碎片和蛋白沉积的能力。优选地，表面活性剂赋予组合物冷冻/解冻能力，允许其以冷冻状态储存、并且随后解冻使用而不失效力。表面活性剂在高电解质环境下亦应该稳定而不在溶液中沉淀。表面活性剂亦应该是非溶血性的，这样它接触红细胞且不会导致它们裂解，如果裂解将导致细胞碎片和蛋白质的释放，进而污染细胞分析仪的内表面并且/或者阻塞孔。
适宜的非溶血性表面活性剂包括、但并不限于聚乙氧基壬基酚（CO-630,可从GAF公司获得，又称2-[2-(4-壬基苯氧基)乙氧基]乙醇，CAS号9016-45-9）、十二烷基九乙二醇醚（聚多卡醇或吐温，CAS1L9002-92-0）、乙氧基单十二烷基醚（，可从西格玛奥德里奇公司获得，CAS号9006-65-9），乙氧基二甲基硅氧烷（7600，可从美国通用有机硅公司获得）。
表面活性剂使用浓度为约0.1g/L至约3.0g/L。优选，表面活性剂的浓度为约0.5g/L至约2.5g/L。更优选的是，表面活性剂的浓度为约0.9g/L至约2.1g/L。
表面张力
本发明组合物的一个关键参数是表面张力。为了形成可由启动和终止传感器检测角度的弯液面，必须对表面张力进行适当调整。计量流体的组分，如离子化盐，有助于组合物的整体表面张力。表面活性剂的加入通过妨碍组合物中分子间的内聚力而降低表面张力。
某些实施方式中，本发明计量流体的表面张力是约40达因/厘米至约66达因/厘米。某些实施方式中，表面张力是约47达因/厘米至约64达因/厘米。优选实施方式中，表面张力是约52达因/厘米至约62达因/厘米。人们可以调整表面活性剂的浓度从而达到一定的表面张力，在采用液体容量计量的自动化细胞分析仪上对传感器进行校正后，这一表面张力能够产生足以被传感器所检测的角度的弯液面。虽然组合物中溶质（如氯化钠和硫酸钠）的存在会对表面张力产生作用，但是与表面活性剂的作用相比，溶质的这种作用可以忽略不计。
抗菌剂
用于自动化细胞分析仪的组合物使用前可存储较长时间，使用期间可能常暴露于微生物。因此，优选本发明的组合物呈现抗菌效力，因为微生物污染的存在可以扭曲细胞样品的分析。分析前和分析过程中，抗菌剂应该被用来消除微生物的生长。但是，发明人已发现，本领域已知组合物中使用的抗菌剂使得产生的甲醛水平高于1ppm。为了用于本发明的组合物，抗菌剂应具有以下特征：这些试剂与组合物中其他组分组合起来，应该在至少一年内产生很少或无实质性量（如，优选，小于1ppm）的甲醛。试剂亦应提供适当的抗菌保护能力，而不干扰各种分析程序中细胞样品的测量。优选地，抗菌剂不与许多细胞分析方法中常规使用的其他试剂反应。
因此，可选地，本发明组合物包含一种或多种抗菌剂，其能够有效消除革兰氏阴性菌、革兰氏阳性细菌、酵母和真菌，而且一年内在组合物中产生小于1ppm的甲醛。优选地，用于本发明组合物的抗菌剂包括1,2-苯并异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-2-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、4-丁氨基苯甲酸-2-(二甲氨基)乙酯盐酸盐、重氮烷基咪唑脲、1,2-二溴-2,4二氰基丁烷的各种组合，化合物各自的衍生物，和它们的组合。这些抗菌剂是市售的。
当以组合形式应用于本发明的计量流体组合物中时，这些抗菌化合物可采用在组合物的整个有效期内有效对抗微生物生长的任意比例，而不产生甲醛，而且对所选分析过程所测量的细胞样品或细胞参数无负面影响。
抗菌剂应当以在组合物的整个有效期内可有效对抗微生物生长的浓度用于本发明组合物中。抗菌剂的有效浓度可以很方便的确定，而且根据抗菌剂的选择有所不同。一般来讲，用于本发明组合物的抗菌剂浓度为约0.1g/L至约2.0g/L。其他实施方式中，用于本发明组合物的抗菌剂浓度为约0.5g/L至约1.5g/L。优选实施方式中，用于本发明组合物的抗菌剂浓度为约0.5g/L至约1.0g/L。
某些抗菌剂，如4-丁氨基苯甲酸-2-(二甲氨基)乙酯盐酸盐，与上述那些相比，在较低浓度时也有效。因此，某些实施方式中，用于本发明组合物的这些抗菌剂浓度为约0.01g/L至约0.5g/L。其他实施方式中，用于本发明组合物的这些抗菌剂浓度为约0.01g/L至约0.1g/L。其他实施方式中，用于本发明组合物的抗菌剂浓度为约0.01g/L至约0.03g/L。
可以预期，其他抗菌剂可以相似地用于本发明组合物中。按照本文所含教导，选择此类有用的抗菌成分也包括在本发明中。确定一个特定抗菌剂是否适用于本发明的组合物的方法可从专利号是6,706,526的美国专利中找到，将该专利的全部内容并入本文以供参考。
其他成分
本发明组合物可进一步包含其他成分，包括防腐剂、抗凝血剂、洗涤剂、染料、和着色剂。例如，参见美国专利5,935,857和4,528,274。但是，加入组合物中的任何附加化合物一定不能增加试剂的甲醛产量。如果这些其他成分不利地影响了待分析细胞的物理参数至一定程度，则可调整组合物配方来抵消这些影响。
重量摩尔渗透压浓度
一般而言，本发明的计量流体相对于细胞样品（通常是血液样品）来讲将是等渗的，使得细胞样品中的细胞体积不发生变化。正常成年人血液重量摩尔渗透压浓度约285mOsm/kg至约295mOsm/kg。异常血重量摩尔渗透压浓度范围可以从约240mOsm/kg至约340mOsm/kg。优选，组合物的重量摩尔渗透压浓度是约240mOsm/kg至约340mOsm/kg之间。更优选的是，组合物的重量摩尔渗透压浓度是约260mOsm/kg至约320mOsm/kg之间。更优选的是，组合物的重量摩尔渗透压浓度是约280mOsm/kg至约290mOsm/kg之间。但是，若其是与除血液外的细胞样品一起使用时，组合物的重量摩尔渗透压浓度可以不同。通过改变离子化盐和硫酸盐浓度来调整组合物重量摩尔渗透压浓度是常规程序。
计量流体组合物的使用方法
采用液态容量计量的自动化细胞分析仪包括计量管（通常是玻璃毛细管）、启动传感器、终止传感器和真空室。自动化细胞分析仪进一步包括计量流体和以流体形式被连接于细胞分析仪的其他试剂。因此，例如，以流体形式被连接于细胞分析仪的是流体蓄积池或流体试剂容器，至少其中之一含有本发明的计量流体。
至少某些实施方式中，本发明计量流体被储存在一个大容量的经消毒的容器中。优选，这种容器是大容量塑料（一般是低密度聚乙烯）容器。一般而言，本发明所用容器能够容纳至少1升、更优选5升的计量流体。容器优选经过消毒，并且具有真空封密装置，保持储存期间的无菌。
在尤其优选的实施方式中，容器是含有低密度聚乙烯的5升立方体。该容器进一步包括具有聚脂薄膜内衬的导入性（induction）密封盖，在本发明计量流体填充容器过程中形成可破坏的封口。
如上所述，容纳计量流体的容器具有一个盖。某些实施方式中，盖的直径为38mm。当盖子被除去和聚脂薄膜内衬被除去或穿透时，与自动化细胞分析仪相连的雄接头可以与容器连接。在优选实施方式中，雄接头进一步包含摄像管，其应具有足够的长度，以充分适合于容器内并且优选倚靠于或接近于计量流体容器的底部。
如图1所示，启动传感器和终止传感器位于计量管的相反两端。装有终止传感器的计量管一端与真空室连通，装有启动传感器的计量管一端与将计量流体引入设备的孔单元连通。为了准确地控制计数事件的启动和终止点，对真空室的内部施加负压，迫使计量流体流出孔单元，然后经过计量管，首先通过启动传感器，之后穿过终止传感器。启动和终止传感器经校准后检测气/液/计量管表面界面处的弯液面的通过。典型的液体容量设备公开于张等人的专利公开号是2007/0269882的美国专利。
当计量流体表面穿过启动传感器时，适宜角度弯液面的出现造成光强度改变，并被传感器所检测，从而产生电信号，激发计数事件的启动。当液体表面到达终止传感器时，适宜角度弯液面再次造成光强度的改变，并被终止传感器所检测，从而产生另一种电信号，导致计数事件的终止。
计量流体/计量管/空气界面产生能够被正在使用的特定细胞分析仪的传感器所检测的弯液面。一般情况下，当流经计量管时，计量流体产生的角度为约30°至约60°的弯液面足以激发启动传感器开始计数事件，并激发终止传感器终止计数事件。在一个实施方式中，当流经计量管时，计量流体产生角度为约30°至约60°的弯液面。该实施方式的一些方面中，当流经计量管时，计量流体产生的弯液面角度，例如，为约30°至约50°间、30°至约40°间、40°至约60°间、50°至约60°间、40°至约50°间，和35°至约55°间。
计量流体的表面张力、计量管的内径，以及计量管的材料构成了产生弯液面角度的所有因素。因此，当流经计量管时，只要计量流体产生约30°至约60°的弯液面，即可采用计量流体表面张力、计量管内径、和/或计量管材料的任意组合。示例性的实施方式中的计量流体组合物被设计成用于内直径约2.7毫米的玻璃计量管。但是，可以理解的是，改变计量管直径、或甚至是计量管本身组成时，可以要求改变计量流体组合物，从而获得所需的弯液面角度。
因此，本发明的组合物可用于在采用液态容量计量的自动化分析仪上控制启动和终止计数事件的方法。该方法包括：向计量管提供非溶血性计量流体组合物，该组合物包括：螯合剂、离子化盐、非溶血性表面活性剂、以及可选性地硫酸盐和/或一种或多种抗菌剂，其中组合物是非溶血性的，pH为约6.5至约7.5，以及其中组合物表面张力为约40达因/厘米至约66达因/厘米间；使计量流体流过计量管；其中计量流体的弯液面首先激发启动传感器，开始计数事件，然后触发终止传感器，终止计数事件。
除了在控制启动和终止计数事件的方法中用作计量流体之外，本发明的组合物在能够在细胞计数后将其从孔上冲洗下来的方法中也用作洗涤试剂。因此，当描述本发明的组合物时，本文中术语“计量流体”和“洗涤试剂”可互换使用。当用作洗涤试剂时，启动传感器和终止传感器通常不开启。
如上述讨论，细胞分析仪通常安装成使得悬浮于稀释剂中的细胞样品包含于孔一侧的样品浴中。孔另一侧是细胞计数后用于将其从孔上冲刷下来的洗涤试剂。洗涤试剂以流体形式与样品浴相连，因此，能够发生回流，其中一些洗涤试剂进入样品浴。当细胞样品进入样品浴时，任何残留的洗涤试剂能够与细胞样品发生接触。因此，洗涤试剂是非溶血性的。细胞样品中的细胞裂解会产生细胞碎片并堵塞孔，造成仪器无法工作，或导致错误的细胞计数。本发明的计量流体是等渗和非溶血性的，因此适合用作洗涤试剂。在本发明计量流体中使用的非溶血性表面活性剂亦赋予洗涤能力，有助于预防细胞碎片在孔内或孔周围的沉积。因此，本发明计量流体可用于预防细胞碎片在细胞分析仪内表面沉积的方法中和提高细胞分析仪性能的方法中。
即使稀释剂和洗涤试剂是非溶血性的，细胞样品也往往含有来自裂解细胞的蛋白质和碎片。这些物质可沉淀于分析过程中与样品混合物接触的仪器组件的表面。此外，这些材料也可与稀释剂中的化学物质形成不溶性复合物，沉淀于仪器组件的表面。如果不进行定期的有效清洗，这些沉淀可能沉积，造成孔或计量管的部分或完全堵塞，可能导致仪器无法工作。本发明的计量流体组合物具有洗涤能力，因此亦能够作为一种有效试剂，用于清洗来自自动化细胞分析仪内表面的细胞碎片。组合物可在细胞样品分析之间用于将碎片冲刷出设备内表面，以疏通液体通路和去除影响细胞计数和分析的污染。本发明组合物的多功能性质减少了特定细胞分析仪上所需使用的试剂的数目，简化了操作，降低了分析每个样品的成本，并减少了维护的费用。
实施例
如权利要求书所述，以下实施例是对本发明的说明，并且不得解释为对本发明范围的限制。
实施例1
根据本发明，下表1列出根据本发明的多功能计量流体组合物：
实施例2
根据本发明，下表2列出根据本发明的多功能计量流体组合物：
实施例3
如表1所示，自动化细胞分析仪使用的多种市售试剂（购自贝克曼库尔特公司，贝瑞阿市，加州）和本发明计量流体的表面张力通过毛细管升高法测得。结果如下表3所示：
实施例4
为评价本发明组合物作为计量流体的有效性，使用上述表1中所述组合物作为计量流体，在迈瑞BC3000细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子公司）上分析对照细胞样品（4C-ESCell对照细胞，贝克曼库尔特公司）。迈瑞BC300是采用液态容量计量的三分类血液分析仪（3partdifferentialhematologyinstrument）。
4C-ESCell对照细胞是从稳定的人类血液细胞中制备的质量控制品，旨在用于确认和监控自动化细胞分析仪的准确性。可得到三种不同类型的4C-ESCell对照试剂：异常低的白细胞计数（WBC）、正常WBC（正常白细胞计数范围是4.3-10.8×103个细胞/立方毫米）、和异常高的WBC。所有三种类型的对照细胞用于这一分析。如果计量流体没有正常激发计数事件的启动和终止，就会显示“失败（voteout）”。当自动化细胞分析软件检测到的所有计数周期不一致、或者计数不满足内部标准和数据被否决时，“失败”就会发生。当失败发生时，就不能为那些样品的特定吸入采集数据。
每个细胞样品进行两次样品运行，总共得到六次运行。每次运行包括20次细胞样品的吸入。每次运行中，产生失败的吸入次数被记录下来。作为对比，采用上述相同的方案，测试作为计量流体的两种市售试剂（来自上表3的稀释剂I和H）。在同一个样品运行中测试每种试剂，并且将产生失败的吸入次数记录下来。结果列入下表4中：
上述数据表明，作为计量流体，表1所述的本发明组合物优于市售的作为计量流体的稀释剂。使用本发明组合物作为计量流体的6次运行中，未出现一次失败。如上表所示，市售稀释剂在触发计数事件的启动和终止点时产生较高的失败率，导致失败。因此，这些试剂可视为不适合用作计量流体。这些结果表明，市售稀释剂的表面张力太高，因此，这些试剂不能产生具有可被启动和终止传感器检测的角度的弯液面。
尽管溶解试剂的表面张力能够产生可被启动和终止传感器检测的弯液面，但是该试剂也会溶解细胞，产生沉淀于细胞分析仪内表面的细胞碎片并导致不良性能。因此，它也不适合用作计量流体。溶解试剂包括作为溶解剂的季铵盐和碱金属氰化物。
虽然上述描述了本发明的多种实施方式，但是应该理解的是，它们是通过实施例的方式展示，并不局限于此。在不脱离本发明精神和范围的情况下，可以在其形式和细节上进行各种改变，这对相关技术领域的人来说是显而易见的。可以理解的是，此处的措辞或术语用于描述目的，并不受局限，这样根据教程和指导，本领域技术人员可对本说明书中的术语或措辞做出解释。
本发明的广度和范围不应受到上述任何示例性实施方式的限制，但是应该根据下列权利要求和它们的同等要求进行限制。

Claims (16)

1.一种用于采用液体容量计量的自动化细胞分析仪的组合物，该组合物包括：
a)浓度为2.0g/L至4.0g/L的螯合剂，
b)浓度为0.1g/L至5.0g/L的碱金属氯化物，和
c)浓度为0.1g/L至3.0g/L的非溶血性表面活性剂
其中组合物是非溶血性的，pH6.5至7.5，并且其中组合物的表面张力是在40达因/厘米至66达因/厘米之间，该组合物在至少1年时间内产生小于百万分之一甲醛。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述碱金属氯化物的浓度为0.5g/L至1.5g/L。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述非溶血性表面活性剂的浓度为0.5g/L至2.5g/L。
4.如权利要求1所述的组合物，其中当组合物流经计量管时会产生30°至60°之间的角度的弯液面。
5.如权利要求1所述的组合物，其中组合物在内径为2.7毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管中产生30°至60°之间的角度的弯液面。
6.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其特征在于，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA二钠、EDTA二钾、乙二醇-双(2-氨基乙醚)N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、或它们的组合物。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述碱金属氯化物是氯化钠、氯化钾、或它们的组合物。
8.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，进一步包括稳定离子。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述稳定离子由碱金属硫酸盐提供。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述碱金属硫酸盐是硫酸钠、硫酸钾、或它们的组合物。
11.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其特征在于，所述非溶血性表面活性剂是聚乙氧基壬基酚、乙氧基乙二醇醚、乙氧基单十二烷基醚、乙氧基二甲基硅氧烷、十二烷基九乙二醇醚、或它们的组合物。
12.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其特征在于，进一步包括一种或多种抗菌剂。
13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述抗菌剂是1,2-苯并异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、4-丁氨基苯甲酸-2-(二甲氨基)乙酯盐酸盐、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、1,2二溴-2,4-二氰基丁烷、或它们的组合物。
14.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的表面张力在47达因/厘米至64达因/厘米之间。
15.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的表面张力在52达因/厘米至62达因/厘米之间。
16.一种在采用液体容量计量的自动化细胞分析仪上控制启动和终止计数事件的方法，该方法包括：
a)向计量管提供计量流体组合物，所述计量流体组合物如权利要求1-15任一项所述；和
b)使所述计量流体组合物流经计量管；其中计量流体的弯液面首先激发启动传感器，开始计数事件，然后激发终止传感器，终止计数事件。
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