CN103298952A - 在光流控芯片上的无扩增核酸检测方法 - Google Patents

在光流控芯片上的无扩增核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

构造了一种光流控平台以包括用于核酸的特异性检测的平面液芯集成光学波导。最优选地，光学波导包括反谐振反射式光学波导(ARROW)。可以制备液体溶液并且将液体溶液引入到光流控平台中以用于光激发。在光流控平台的边缘处可以收集得到的光信号并且可以对得到的光信号进行分析以确定单核酸和/或特定核酸的存在。

Description

在光流控芯片上的无扩增核酸检测方法
相关申请的交叉引用
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2010年11月19日提交的发明名称为“Method for Amplification-Free Nucleic Acid Detection onOptofluidic Chips”的美国临时申请第61/415,482号的权益(代理机构案号UCSC-0015(SC2011-262))，其全部内容通过引用合并到本文中。
技术领域
本发明一般涉及集成光学的领域，并且更具体地涉及用于光学粒子检测的光流控平台而不需要先进的显微镜设备。光流控平台可以包括用于核酸的特异性检测(specific detection)的平面液芯集成光学波导。光学波导可以采用反谐振反射式光学波导，也称为ARROW或ARROW波导。
背景技术
核酸检测(NAT)是快速发展的分子诊断(MDx)领域的主要部分。它使得能够在基因组水平上对患者进行特异性诊断以及可以对病原体进行完全识别，例如，区分不同的病毒株。
目前对于病毒和其它生物体的核酸检测的黄金标准是实时聚合酶链反应(RT-PCR)，然后测序。RT-PCR需要高度熟练的操作人员、昂贵的试剂以及严格控制的反应环境。这主要是由于需要病毒核酸的扩增以产生足够大的信号以用于读出。这些限制表明迫切需要快速、灵敏、可靠和定量的用于无扩增病毒检测的新型诊断仪器。
发明内容
我们引入了基于平面光流控的核酸检测的不同方法——在同一小型化系统中的集成光学部件和流体部件二者的组合。该方法使用平面液芯集成光学波导用于核酸的特异性检测。这种新方案使得能够构造具有足够灵敏度的紧凑型平面装置以从小(微升)样品体积中检测荧光标记的核酸而不需要昂贵且耗时的靶扩增。同时着重于光和流控能力的垂直功能集成允许检测元件与标准纤维光学和微流控学进行对接。这些创新方面的组合消除了用于在临床设置、生物医药、分析化学和其它领域的众多应用的多功能及时现场护理(point-of-care)病毒分析的主要障碍。
在本发明的当前优选的实施方案中，光流控芯片构造为包括用于光学粒子检测的独立(self-contained)平面光流控平台。在另一实施方案中，光流控平台可以包括空芯反谐振反射式光学波导(ARROW)、实芯ARROW和流控储器。光流控平台的不同部件的构造可以使得液体被引入到空芯ARROW中并且使得其亚皮升体积被光激发而用于单粒子的检测。
在一个实施方案中，可以将液体溶液引入到光流控平台中并且可以对液体溶液进行光激发以产生信号。所产生的信号可以使用例如光电二极管进行收集并且进行分析。该分析可以包括确定由附接到核酸的荧光团产生的荧光信号的存在，这可以指示包含在液体溶液中的单核酸粒子的存在。作为荧光团的实例，可以制备对特定核酸具有特异性的分子信标(molecular beacon)并且将其引入光流控平台中。这样，所产生的信号可以指示特定核酸的存在。在一个实施方案中，可以使用如荧光相关光谱的技术对收集的信号进行进一步分析。
下面描述本发明的说明性实施方案的其它方面。
附图说明
图1：平面光流控平台；(a)示意性布局、波导横截面和完成的芯片的图像；(b)用于产生液芯波导的关键微制造工艺步骤。
图2：(a)分子信标的概念；(b)荧光共振能量传递(FRET)的概念。
图3：芯片上病毒检测。(a)使用Alexa染料标记的Q-β噬菌体衣壳；(b)在ARROW通道中用病毒记录的荧光信号。脉冲群表示单粒子检测事件(插图：缓冲基线)；(c)示出亚单粒子灵敏度(G(0)＞1)的荧光波动的对应自相关G(τ)，与理论值完好吻合(红色线；实线)。
图4：芯片上无扩增病毒检测。(a)HPV-18基因组的菌株特异性区段(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/9626069？report＝graph&log$＝seqview)；(b)在5’和3’末端分别具有荧光标记(F，TYE665)和淬灭基团(Q，Iowa Black)的发夹式信标结构；(c)在10pM靶浓度下用于芯片上信标检测的荧光信号(红色；实线)(插图：背景)；(d)荧光信号与靶浓度/在激发体积中的分子数量的关系曲线。
具体实施方式
光流控学是涉及在显微尺度下处理光和流体(通常是液体)的相互作用的快速发展领域。目前，主要研究趋势包括由流体限定的光学器件、在液体中的光学粒子操控、以及光学粒子检测和分析，特别是在生物学和生物医学领域中的光学粒子检测和分析。
我们已经发明了基于液芯波导的用于无扩增核酸检测的光流控方法，其使光与样品分析物之间的相互作用最大化。基于产生空芯反谐振反射式光学波导(ARROW)，我们已经开发了用于光学粒子检测的具有极高灵敏度的独立平面光流控平台但不需要先进的显微镜设备。这种平台的基本布局以及用于形成空芯波导的制造步骤在图1中示出。
在图1的底部中心的扫描电子图像示出了空芯尺寸为5μm×12μm的这种波导的横截面。此外，实芯ARROW波导(参见图1a的右下方的SEM)连接到液芯的不同点。这产生了用于液体和光进入主通道中的分开的进入路径，并且也可以用来限定具有亚皮升体积的光激发区域以实现单分子灵敏度。图1a描绘了其中激发光(绿色；指向光流控平台中的箭头)穿过正交实芯ARROW进入液芯的典型实验布局。在芯片平面内垂直地收集所产生的光(红色；从光流控平台中向往指的箭头)并且将产生的光引导到芯片边缘用于检测。在通道端部处的流控储器使得能够容易地填充通道和插入电极以诱导电动粒子移动。在图1a左下方的照片中示出了已完成的光流控芯片的小型尺寸。
在图1b中示出了制造方法包括(i)在硅衬底上沉积适当厚度的电介质层(例如，SiO2和SiN)；(ii)将牺牲材料(例如，SU-8)图案化成期望的空心形状；(iii)使用附加的ARROW导向层覆盖牺牲层；以及(iv)在通过等离子蚀刻使牺牲芯的端部露出之后用化学蚀刻移除牺牲芯。可以灵活地使用该方法以限定具有显微尺度精度的各种光学和流体布局。
在图1中示出的平台已经成功地用于多种分子的检测和分析，包括单一染料分子的荧光检测、脂质体和核糖体的荧光相关性分析、以及罗丹明6G分子的表面增强拉曼检测。
本公开内容介绍了光流控平台用于病毒的无扩增分子诊断的用途。
这种方法需要合适的光学读出机构和足够的检测灵敏度。
光学病毒检测
光学检测方法在病毒检测中发挥了很大的作用。在这些方法中，基于荧光的技术占主导地位。通常，将在光激发之后有效地重发射更长波长的光的染料分子或半导体量子点连接到靶物质。用于病毒检测并且与该申请相关的两种先进荧光方法是分子信标和FRET检测。图2a示出了在其末端用荧光染料和淬灭基团分子修饰的短序列寡核苷酸的分子信标的原理。在“断开”状态下，信标形成发夹结构，使得荧光团和淬灭基团紧密靠近并且防止发生荧光。当与DNA或RNA靶上的匹配序列结合时，信标打开并且杂化，这导致从此时未淬灭的染料中发射荧光。信标具有低背景信号(在发夹式构造中没有荧光信号)和单碱基对错配的高灵敏度的优点。缺点是可能展开，特别是在酶和蛋白质的存在下可能展开。信标是市售的，只要提供合适的核苷酸序列即可。
在图2b中示出了将荧光共振能量传递(FRET)的原理应用到遗传物质的识别。两种染料分子(供体D、受体A)连接到短核苷酸序列。供体和受体之间的非辐射能量传递可导致受体发射荧光，即使只是在供体被激发的情况下也是如此。能量传递的效率强烈地取决于两种染料的接近程度，仅当两个探针都结合到具有匹配序列的靶时观察到可测量的受体信号(底部)。
分子信标和FRET两者产生具有高度特异性的可检测荧光信号。此外，这两种技术已经成功地用于单分子分析以及用于基于荧光的病毒检测。
分子信标和FRET是如何能够在光流控芯片上产生用于检测的核酸特异性光信号的两个实例。
在集成芯片上的高灵敏度检测
对于无扩增检测的第二个关键要求是在单粒子水平上检测生物样品的荧光的能力。在该背景下特别感兴趣的是我们最近证明了超灵敏的病毒检测。通过在空芯通道的一端处的流体储器将溶液中荧光标记的Q-E噬菌体病毒(图3a)引入到我们的光流控芯片中并且在液芯波导和实芯波导之间的交叉处进行光激发。所产生的信号沿着液芯波导进行收集(参照图1)并且由于单一病毒粒子而产生清晰的荧光脉冲群(图3b)，如果检测纯缓冲溶液则不会存在清晰的荧光脉冲群(图3b的插图)。通过荧光相关光谱(图3c)证实了单粒子灵敏度，其中在大于1的信号表示在激发体积中少于单个粒子。相关信号也使得我们能够提取已检测粒子的扩散系数，这与对于Q-β的报道值非常一致，进一步证实了病毒粒子的成功检测。
迄今为止，这是在芯片上进行单一病毒检测而无需使用显微镜的唯一的实证，并且建立了平面光流控检测作为对于高度灵敏的生物粒子检测的合适的方法。然而，第二必要的步骤是证明病毒类型和菌株的特异性检测。为此，我们设计了针对人类乳头状瘤病毒HPV-18的基因L1的分子信标。在图4a和图4b中分别示出了在HPV基因组和30聚体信标结构内的相关区域。将分子信标与各浓度的匹配寡核苷酸混合。通过短暂的加热(95℃)和随后进入冷却期(50℃，进行3分钟)来促进信标结合。随后使用2mM、633nm的激光来激发信标荧光并且进行检测，如图1a所示。所得到的信号如图4c所示，并且当与无靶的负面背景(插图)相比时，所得到的信号示出了清晰的信标荧光和随后的光漂白，即使在10pM的最低浓度下也是如此。图4d示出了信号对靶浓度和激发体积中的相应平均分子数的依存性。图4d示出了两者的线性特征并且明确表明我们有能力在具有单分子灵敏度的平面光流控ARROW平台上使用分子信标荧光来检测病毒DNA。
注意，虽然这些结果清楚地表明检测核酸的能力，特别是在光流控装置中检测核酸的能力，但是图4的数据是在通道内含物不移动的“静态”配置下测得的。对于无扩增核酸检测器的优选实施是检测在移动通过激发点的分析物液体的移动流内的核酸。
可以使用光传感器(如光电检测器)收集如上所述的生成的信号。例如，光电二极管可以用于捕获并且将沿着液芯波导产生的荧光信号转换成用于分析荧光脉冲群和用于确定特定核酸的存在的电流或电压。作为另一实例，也可以使用雪崩光电二极管将产生的光转换成电。作为对光高度敏感的半导体，雪崩光电二极管可以配置成提供表示产生的光的高度精确的信号。

Claims (31)

1.一种用于核酸检测的方法，包括：
提供平面光流控平台；
将液体溶液引入所述平面光流控平台中，所述液体溶液包含复数个核酸粒子；
使用所述平面光流控平台对所引入的液体溶液进行光激发以产生信号；
收集所产生的信号；以及
确定所产生的信号包括由附接到复数个所述核酸粒子中的核酸粒子的荧光团产生的荧光。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
将纯缓冲溶液引入所述平面光流控平台中并且对所述纯缓冲溶液进行激发，所述纯缓冲溶液不含所述核酸的粒子；以及
收集产生的对应于所述纯缓冲溶液的信号。
3.根据权利要求2所述的方法，其中确定所产生的信号包括荧光包括将所产生的对应于所述液体溶液的信号与所产生的对应于所述纯缓冲液的信号进行对比。
4.根据权利要求1所述的方法，还包括使用所产生的信号生成荧光相关光谱。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述荧光相关光谱中高于预定阀值的信号表示在激发体积中少于单个粒子。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述荧光相关光谱配置成提取已检测粒子的扩散系数。
7.根据权利要求1所述的方法，其中荧光信号代表单个核酸粒子。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸来源于病毒。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述平面光流控平台包括平面液芯集成光学波导。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述平面光流控平台包括空芯反谐振反射式光学波导(ARROW)、连接到所述空芯ARROW的不同点的实芯ARROW、用于将液体溶液引入到所述空芯ARROW中的装置、用于向所述空芯ARROW提供激发光的装置、以及用于收集所产生的光的装置。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述平面光流控平台包括空芯反谐振反射式光学波导(ARROW)、配置成连接到所述空芯ARROW的不同点的实芯ARROW，所述空芯ARROW和所述实芯ARROW配置成为液体溶液和光提供进入所述空芯ARROW的分开的进入点并且配置成限定具有亚皮升体积的光激发区域以实现单分子灵敏度。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述平面光流控平台包括空芯反谐振反射式光学波导(ARROW)、配置成连接到所述空芯ARROW的不同点的实芯ARROW、在所述空芯ARROW端部处的配置成至少引入液体溶液到所述空芯ARROW中的流控储器、用于使激发光通过与所述空芯ARROW正交的实芯ARROW进入所述空芯ARROW的路径、以及用于在所述平面光流控平台的平面内垂直地收集所产生的光并且用于将所收集的光引导到所述平面光流控平台的边缘以进行检测的路径。
13.根据权利要求1所述的方法，其中引入所述液体溶液包括使用包含在所述平面光流控平台中的流控储器。
14.根据权利要求1所述的方法，其中对所引入的液体溶液进行激发包括使用进入所述平面光流控平台的激发光。
15.根据权利要求1所述的方法，其中收集所产生的光包括收集所产生的垂直于所述平面光流控平台的光并且将其引导到所述平面光流控平台的边缘。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体溶液配制成检测特定核酸。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述液体溶液包括对与匹配的寡核苷酸混合的核酸序列具有特异性的分子信标。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括将分子信标与所述寡核苷酸结合，其中通过对所述液体溶液进行加热和随后使其冷却来促进所述结合。
19.根据权利要求16所述的方法，还包括基于所产生的信号建立所述信标荧光的图以确定在所述液体溶液中存在所述特定核酸序列。
20.根据权利要求1所述的方法，其中引入所述液体溶液包括引入所述液体溶液作为移动通过包含在所述平面光流控平台中的光激发点的所述液体溶液的流。
21.根据权利要求1所述的方法，其中对所引入的液体溶液进行光激发包括使用激光。
22.根据权利要求1所述的方法，其中收集所产生的信号包括使用光检测器。
23.根据权利要求1所述的方法，其中收集所述产生的信号包括使用光电二极管。
24.根据权利要求1所述的方法，其中收集所产生的信号包括使用雪崩光电二极管。
25.一种用于检测单个核酸粒子的系统，包括：
平面光流控平台；
用于将液体溶液引入所述平面光流控平台中的装置，所述液体溶液包括核酸粒子；
用于利用所述平面光流控平台对所引入的液体溶液进行光激发以产生信号的装置；以及
收集所产生的信号的装置。
26.根据权利要求25所述的系统，还包括：
用于确定所产生的信号包括荧光脉冲群、包括分析所产生的信号相对于时间的图的装置。
27.根据权利要求25所述的系统，其中所述平面光流控平台包括平面液芯集成光学波导。
28.根据权利要求25所述的系统，其中所述平面光流控平台包括空芯反谐振反射式光学波导(ARROW)、连接到所述空芯ARROW的不同点的实芯ARROW、用于将液体溶液引入所述空芯ARROW中的装置、用于向所述空芯ARROW提供激发光的装置、以及用于收集产生的光的装置。
29.根据权利要求25所述的系统，其中所述用于引入所述液体溶液的装置包括包含在所述平面光流控平台中的流控储器。
30.根据权利要求25所述的系统，其中所述用于对所引入的液体溶液进行激发的装置包括用于将激发光注入到所述平面光流控平台中的装置。
31.根据权利要求25所述的系统，其中所述用于收集所产生的光的装置包括在所述平面光流控平台的边缘处收集所产生的垂直于所述平面光流控平台的光的装置。
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