CN1759317A - 大肠癌标记物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法，是在RNA分解酶抑制剂的存在下使在采集后根据情况使用液氮立即冻结的生物学样品均质化，调制悬浊物，从得到的悬浊物中提取RNA，将提取的RNA逆转录，得到cDNA，扩增得到的cDNA，检测扩增的cDNA，其特征在于，不包括从生物学样品中分离细胞成分的组分。由此，本发明提供一种具有超过以往的便潜血检查的敏感度和特异度的非侵袭性且简单的用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种包括从生物学样品中提取RNA的工序的用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法，其特征在于，不含从生物学样品中分离细胞成分的工序。
背景技术
大肠癌导致的死亡者正在增加。大肠癌导致的死亡者是在所有的癌症导致的死亡者中数量众多的癌症，在男性为第4位、在女性为第2位(1999年度癌死亡统计)。另外，推算在2015年的癌患者中，男女中都成为第1位，所以需要包括二次预防在内的综合性大肠癌对策，癌的群体筛查是最有效的方法之一。
将简便而且非侵袭性的检测方法用于癌的群体筛查(mass screening)是很重要的。目前可以利用的唯一的非侵袭性方法是，检查有无潜血的粪便检查即便潜血检查，作为大肠癌的群体筛查的标准方法被广泛使用。
但是，由于在粪便中出现血红蛋白并不是肿瘤特异性标记，所以便潜血检查的敏感度和特异度低(敏感度30～90％、特异度70～98％)，为此其缺点是存在很多假阴性或假阳性。
另外，为了诊断大肠癌，在通过免疫学便潜血法进行筛查之后，或者同时将全大肠内窥镜检查或灌肠检查和乙状结肠内窥镜检查组合使用，其缺点是需要花费很多时间和劳力。
作为便潜血检查的替代法，已报道的有检测粪便中的K-ras、p-53、APC基因变异或微卫星不稳定性等使用DNA的方法(Sidransky等著(D.Sidransky，et al.)、Science、第256卷、1992年4月3日、第102页～第105页；Dong等著(S.M.Dong，et al.)、Journal of the National CancerInstitute、第93卷、第11号、2001年6月11日、第858页～第865页；Traverso等著(G.Traverso，et al.)、The New England Journal of Medicine、第346卷、第5号、2002年1月31号、第311页～第320页；Traverso等著(G.Traverso，et al.)、The Lncet、第359卷、2002年2月2日、第403页～第404页)。
这些使用DNA的方法是可以非侵袭地捕捉癌细胞的直接变化的方法，具有特异度高的特征，是很有前途的方法，但与作为以往技术的便潜血检查相比，敏感度低，而且，也需要花费相当的时间和劳力。
另外，作为便潜血检查的进一步替代方法，为了更直接地检测出基因表达，还开发了检测粪便中的蛋白质激酶C(PKC)等的mRNA的方法(Davidson等著(L.A.Davidson，et al.)、Carcinogenesis、第19卷、第2号、1998年、第253页～第257页；Alexander和Raicht等著(R.J.Alexanderand R.F.Raicht)、Digestive Diseases and Sciences、第43卷、第12号、1998年、第2652页～第2658页；Yamao等著(T.Yamao et al.)、Gastroenterology、第114卷、第6号、1998年、第1198页～第1205页)。
但是，即使通过上述使用RNA的方法，也不能从少量的粪便简单而有效地提取RNA，不能得到比便潜血法更高的敏感度。
已知有通过组合PCR法与逆转录酶反应(RT)来定性地且定量地检测RNA的方法。该RT-PCR法在检测微量分子的敏感度方面比Northern印迹法更好，另外，在操作速度或容易程度方面比原位杂交法更出色。
但是，RNA没有DNA稳定，而且经常暴露在有可能被所有生物学样品中普遍存在且极为稳定的RNA分解酶(RNase)分解的危险性中，所以即便在RT-PCR法中或在RNA的纯化过程和纯化后，都要求严密保存以免RNase混入。
因而，在从粪便这样的生物学上极为粗糙的样品中提取RNA时，为了排除RNase的影响，需要进行预先分离细胞区域(fraction)的工序。
因而，从存在来源于极多量的微生物的庞大数量的RNase的粪便中直接检测RNA是不可能的，为了至少除去来源于微生物等的外因性RNase，必须进行细胞区域的分离。
发明内容
但是，本发明人吃惊地发现了通过在RNA分解酶抑制剂的存在下使根据情况冻结的生物学样品均质化，可以解决上述课题，从而完成了本发明。
因而，本发明的目的在于，提供一种具有超过以往的便潜血检查的敏感度和特异度的非侵袭性的而且简单的用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法。
本发明提供一种方法，是包括下述工序的用于提取在用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法中使用的RNA的样品的调制方法，所述的工序是：
a)在RNA分解酶抑制剂的存在下使采集的生物学样品均质化来调制悬浊物的工序，其特征在于，
不包括从生物学样品中分离细胞成分的工序。
在这里，该采集的生物学样品优选被冻结。
另外，本发明是RNA分解酶抑制剂为硫代氰酸胍的上述方法。
另外，本发明是生物学样品为粪便的上述方法。
另外，本发明的用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法，除了包括上述方法的工序以外，还包括下述工序：
b)从用于提取得到的RNA的样品中提取RNA的工序、
c)使提取的RNA逆转录而得到cDNA的工序、
d)扩增得到的cDNA的工序，和
e)检测扩增的cDNA的工序。
本发明是肿瘤标记物为COX-2的用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法。
另外，本发明提供一种试剂盒，是包括下述组分的、用于调制用于提取在用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法中使用的RNA的样品的试剂盒，其中，所述的组分是：
a)在RNA分解酶抑制剂的存在下使采集的生物学样品均质化来调制悬浊物的组分，其特征在于，
不包括从生物学样品中分离细胞成分的组分。
另外，本发明的试剂盒优选包括使该采集的生物学样品冻结的组分。
另外，本发明是RNA分解酶抑制剂为硫代氰酸胍的上述试剂盒。
另外，本发明是生物学样品为粪便的上述试剂盒。
另外，本发明是用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测试剂盒，进一步包括下述组分：
b)从用于提取得到的RNA的样品中提取RNA的组分、
c)使提取的RNA逆转录得到cDNA的组分、
d)扩增得到的cDNA的组分，和
e)检测扩增的cDNA的组分。
另外，本发明是肿瘤标记物为COX-2的上述试剂盒。
附图说明
图1表示实施例2的电泳结果。道1是表示用Alexander等的方法从人粪便中提取的全RNA。道2是表示用本发明的方法从人粪便中提取的全RNA。道3是表示从人大肠癌组织中提取的全RNA。道M是表示分子量标记。
具体实施方式
作为本发明的RNA分解酶抑制剂，可以举出硫代氰酸胍、等基因(Isogene)、ウルトラスペツクII(注册商标)(UltraspecII)等。
作为本发明的生物学样品，可以举出动植物组织、体液、排泄物等，优选粪便，更优选人的粪便。
本发明的生物学样品可以直接或者根据情况冻结后使用。
冻结方法可以使用以往的任何技术，优选使用液氮的方法。关于冻结温度，保存温度为-1～-196℃，优选为-20～-196℃，更优选为-75～-196℃，进一步优选为-110～-196℃，最优选为-196℃。
冻结的样品可以冷冻保存。保存温度为-75～-196℃，优选为-110～-196℃，更优选为-196℃。保存时间为1天～10年，优选为1天～3年，更优选为1天～1年。
作为在本发明中使用的肿瘤标记物，可以举出COX-2、MatrixmetalloProtease(MMP)、c-met、CD44变异体(variants)、EGF-R、EF-1、Wnt-2、Bradeion、SKP2、KPC-1、KPC-2、PRL-3、血管生成素(Angiogenin)、整合素(Integrin)、Snail、Dysadherin等，优选COX-2。
上述工序c)～e)被称为RT-PCR法，例如可以按照关谷刚男等编、PCR法最前线、1997年、共立出版、第187页～第196页所记载的内容进行。
从悬浊物提取RNA可以使用以往公知的方法，例如可以使用RNeasyMini(QIAGEN)或RNA Extraction Kit(Pharmacia Biotech)之类的市售的试剂盒。
在本发明中，逆转录是指使用逆转录酶(Reverse Transcriptase)、将RNA转换为互补的DNA(cDNA)的过程。逆转录反应通常是使用含有缓冲液、MgCl2或KCl等盐类、二硫苏糖醇(dithiothreitol)(DTT)、引物、脱氧核苷酸类、RNase抑制剂以及逆转录酶的溶液进行的。可以将上述盐类适当变更为其它盐类试用。另外，也可以添加明胶、白蛋白等蛋白质或表面活性剂等。
在逆转录之后进行的cDNA的扩增通常使用PCR。PCR反应液通常含有缓冲液、MgCl2或KCl等盐类、引物、脱氧核苷酸类以及耐热性聚合酶。可以将上述盐类适当变更为其它盐类试用。另外，还可以适宜添加明胶、白蛋白等蛋白质，二甲基亚砜或表面活性剂等。
cDNA的扩增还可以使用LAMP法(专利第3313358号公报)或ICAN法(特开2001-136965)。
在本发明中，引物是指在cDNA合成或核酸扩增时发挥合成起始点作用的寡聚核苷酸。引物优选为1条链，也可以使用2条链。在引物为2条链时，在扩增反应之前，需要成为1条链。引物可以按照公知的方法合成，另外，还可以从生物中分离出。
用于逆转录反应的逆转录酶是指可以将RNA逆转录为cDNA的酶。作为逆转录酶，包括RAV(Rous associated virus)或AMV(Avianmyeloblastosis virus)等来源于逆转录病毒的逆转录酶、MMLV(Moloneymurine leukemia virus)等来源于鼠逆转录病毒的逆转录酶，但不限定于这些。
作为用于PCR的耐热性聚合酶，可以举出Taq聚合酶，但不限定于此。
作为扩增的DNA的检测方法，可以利用使用琼脂糖凝胶的电泳，但不限定于此。
另外，本发明的试剂盒还包括记载了本发明的方法的说明书。
实施例1
下面的实施例是说明本发明的例子，但本发明不限定于此。
以为了精确检查、进行治疗而到滨松医科大学第1内科住院并通过全大肠内窥镜已经确认了存在大肠癌的患者30例、以及在大肠部位没有肿瘤或炎症变化(非大肠疾病)的患者22例作为对象。另外，从所有的患者取得了知情同意。
在采便后尽可能快速地将每1g粪便分装到5ml管中，使用液氮冻结，在-80℃下保存。另外，为了比较对照，通过免疫学便潜血检查法对各样品测量便中的人血红蛋白(Hb)。在治疗前接受内窥镜检查时将癌部位和正常部位的活检材料用液氮进行冻结，然后将组织保存于-80℃下。然后，使用匀浆器、胍盐和苯酚使其均质化，用氯仿和乙醇提取全RNA。
使用ReverseScript II(注册商标)(反应液量20μl，和光纯药)，将1μg得到的RNA逆转录，得到cDNA，使用Gene Taq(和光纯药)，通过巢式PCR扩增其中的一部分。使用4％琼脂糖凝胶对得到的PCR产物进行电泳，用溴化乙锭(EB)染色。
另外，使用的引物在逆转录中为随机引物，在PCR中，CEA为Gerhard(JJCO，1994)所报道的标记物，对于COX-2，使用的是独自设计的。PCR以第1轮为20个循环，第2轮为25个循环进行。
将使用的引物显示于下述中。
<CEA>
Forward 1：5′-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG-3′
Forward 2：5′-GGGCCACTGCTGGCATCATGATTG-3′
Reverse：5′-TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3′
<COX-2>
Forward 1：5′-CTGAAAACTCCAAACACAG-3′
Forward 2：5′-GCACTACATACTTACCCACTTCAA-3′
Reverse：5′-ATAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT-3′
结果
尝试通过RT-PCR从大肠癌30例(早期癌3例、进展癌27癌)和对照组22例的粪便中检测CEA、COX-2，得出以下结果。
在大肠癌30例中的全部例子和对照组22例中的21例中检测出CEA。另外还发现，可以从两者中提取能够利用RT-PCR扩增的RNA。
在大肠癌30例中有27例(盲肠2/2、升结肠3/5、降结肠1/1、乙状结肠7/7、直肠12/13、早期癌2/3、进展癌25/27)检测出COX-2，而在对照组22例中，没有检测出1例(敏感度90％、特异度100％)。
在免疫学便潜血检查法中，28例大肠癌中的23例22例和对照组中的3例为阳性(敏感度82.1％、特异度86.3％)。
在3例COX-2阴性大肠癌中，有1例免疫学便潜血检查为阳性，2例为阴性。
免疫学便潜血检查为阴性的5例大肠癌中有3例检测出COX-2。
实施例2
就从人粪便中得到的全RNA的量和分子量的分布对本发明的方法与Alexander的方法(非专利文献6)进行了比较。作为对象，使用市售的RNA提取剂(アイソジエン，和光纯药)，从人的大肠癌组织中提取出全RNA。
将从各个样品中提取出的全RNA的相同量加在琼脂糖凝胶上跑电泳。
在道3(来源于人大肠癌组织的RNA)中可见的2条主要带，表示28S和18SrRNA。另外，弥散状的部分表示在得到的全RNA中含有各种高分子RNA。
在道2(通过本发明的方法的来源于粪便的RNA)中可见的2条主要带，表示来源于肠内细菌的23S和16SrRNA。另外，与道3相同，由于可见弥散状的部分，所以在通过本发明的方法从粪便中得到的全RNA中，含有各种高分子RNA。
与此相对，道1的任何带都没有弥散，表示在样品提取物中没有含高分子RNA。
实际上，可以通过RT-PCR从道2的样品中得到目的产物，而不能从道1的样品得到PCR产物。
从本研究结果可知，利用本发明的方法从人粪便中提取的RNA可以通过RT-PCR进行扩增。另外通过RT-PCR从粪便检测COX-2由于具有90％的敏感度和100％的特异性，所以可以证明：与作为以往技术的免疫学便潜血法相比更出色。
另外，本发明的方法与报道的APC、K-ras或p53基因变异的检测相比，检测中需要的粪便的量少而且检测敏感度高，所以可以大幅度节约检测所需要的时间和劳力。
与以往技术的便潜血法是以从病变的所谓“出血”这种通常而间接的现象作为对象相比，本发明的方法由于是以作为致癌标记物的所谓COX-2表达这种特异而且直接的现象作为对象，所以通过本发明得到的数据，可以提供更高品质的诊断。
因而，本发明的方法作为特异度和敏感度高的新式大肠癌的非侵袭性筛查方法，在临床上极为有用。
序列表
<110>静冈技术特许组织(Shizuoka Technology Licensing Organization)
<120>大肠癌标记物的检测方法
<130>KP-10665
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>设计引物
<400>1
tctggaactt ctcctggtct ctcagctgg 29
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>设计引物
<400>2
gggccactgc tggcatcatg attg 24
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>设计引物
<400>3
tgtagctgtt gcaaatgctt taaggaagaa gc 32
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>设计引物
<400>4
ctgaaaactc caaacacag 19
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工
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<223>设计引物
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gcactacata cttacccact tcaa 24
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>设计引物
<400>6
ataggagagg ttagagaagg ct 22
Claims (12)
1.一种方法，是包括下述工序的用于提取在用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法中使用的RNA的样品的调制方法，所述的工序是：
a)在RNA分解酶抑制剂的存在下使采集的生物学样品均质化来调制悬浊物的工序，其特征在于，
不包括从生物学样品中分离细胞成分的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
冻结所采集的生物学样品。
3.根据权利要求1或者2所述的方法，其特征在于，
RNA分解酶抑制剂是硫代氰酸胍。
4.根据权利要求1～3中任意1项所述的方法，其特征在于，
生物学样品为粪便。
5.一种用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法，其特征在于，
除了包括权利要求1～4中任意1项所述的方法以外，还包括下述工序：
b)从用于提取得到的RNA的样品中提取RNA的工序、
c)使提取的RNA逆转录而得到cDNA的工序、
d)扩增得到的cDNA的工序，和
e)检测扩增的cDNA的工序。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的方法，其特征在于，
肿瘤标记物是COX-2。
7.一种试剂盒，是包括下述组分的、用于调制用于提取在用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测方法中使用的RNA的样品的试剂盒，其中，所述的组分是：
a)在RNA分解酶抑制剂的存在下使采集的生物学样品均质化来调制悬浊物的组分，其特征在于，
不包括从生物学样品中分离细胞成分的组分。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，
进一步包括冻结所提取的生物学样品的组分。
9.根据权利要求7或者8所述的试剂盒，其特征在于，
RNA分解酶抑制剂是硫代氰酸胍。
10.根据权利要求7～9中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，
生物学样品为粪便。
11.一种用于大肠癌诊断的肿瘤标记物的检测试剂盒，其特征在于，
进一步包括下述组分：
b)从用于提取得到的RNA的样品中提取RNA的组分、
c)使提取的RNA逆转录而得到cDNA的组分、
d)扩增得到的cDNA的组分，和
e)检测扩增的cDNA的组分。
12.根据权利要求7～11中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，
肿瘤标记物是COX-2。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: OLYMPUS CO., LTD. |
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Effective date of registration: 20100607 Address after: Japan's Shizuoka Prefecture Co-patentee after: OLYMPUS Corp. Patentee after: HAMAMATSU FOUNDATION FOR SCIENCE AND TECHNOLOGY PROMOTION Address before: Japan's Shizuoka Prefecture Patentee before: HAMAMATSU FOUNDATION FOR SCIENCE AND TECHNOLOGY PROMOTION |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NAT UNIVERSITY CORP. HAMAMATSU Free format text: FORMER OWNER: HAMAMATSU FOUNDATION FOR SCIENCE AND TECHNOLOGY PROMOTION Effective date: 20111024 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20111024 Address after: Shizuoka Co-patentee after: OLYMPUS Corp. Patentee after: NATIONAL University CORPORATION HAMAMATSU UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE Address before: Japan's Shizuoka Prefecture Co-patentee before: OLYMPUS Corp. Patentee before: HAMAMATSU FOUNDATION FOR SCIENCE AND TECHNOLOGY PROMOTION |
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Granted publication date: 20091209 |
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| CX01 | Expiry of patent term |