CN86101798A - 从产生蛋白质的培养基中提取和净化蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
此方法适用于在一种非离子型洗涤剂存在下被破碎的受控酵母细胞的上层清液:它包含用聚乙二醇来沉淀污染物并且用二价金属阳离子或者经最后超滤后用硫酸铵来处理污物沉淀后的上层清液。
Description
本发明叙述了从产生蛋白质的培养基中提取和净化蛋白质的一种改进的方法,更确切地说,本发明讲述了,在采用重组脱氧核糖核酸技术从受控细胞培养物中,或更确切地说,从受控酵母菌株培养物中产生肝炎B病毒表面抗原和α-1-抗胰蛋白酶时,如何提取和净化肝炎B病毒抗原和α-1-抗胰蛋白酶的方法。
在各种微生物中,细菌和酵母可被用作含有一个脱氧核糖核酸分子的不同质体的寄主生物,这种分子包含一种特定蛋白质的核苷酸顺序编码。在这些微生物中,酵母是目前最好的和通用的。例如,欧洲专利申请说明书0106828号公开了使用酿酒酵母生产肝炎B病毒表面抗原(HBsAg)的方法,欧洲专利申请说明书0103409号也叙述了用酵母质体生产α-1-抗胰蛋白酶的方法。
用酵母菌株中生产蛋白质比用细菌菌株中生产蛋白质具有更多的优点。这些优点来自以下二方面,第一,酵母在大规模发酵器中较易生长,第二,酵母在新合成的蛋白质上增加碳水化合物基团的能力和哺乳动物细胞相似,而细菌则没有这种能力。
由于酵母细胞的化学成分相当复杂,特别是为了改进多肽的生产率而延长酵母生长期,结果使脂质含量增高时,从酵母培养物提取和净化蛋白质就出现了一些技术问题。
例如,酵母属细胞壁被认为由三层组成:(a)不溶于碱的β-葡聚糖内层,(b)可溶于碱的β-葡聚糖中层和(c)糖蛋白外层,其中碳水化合物含有磷酸化的甘露聚糖;细胞壁下面是一层细胞质膜,此膜系由中性脂质(单一、二、和三甘油酯)、游离的和酯化的甾醇、一种复杂的神经鞘脂类、甘油磷脂以及中性的和酸性的糖脂等组成的一种非常复杂的混合物;核含有脱氧核糖核酸、各种核糖核酸和一种多聚磷酸盐;空泡含有许多高分子量和低分子量的成分,他们是作为许多水解酶的贮存泡;线粒体富含脂质、磷脂和膜系统的麦角甾醇成分;细胞质则含有大量的核蛋白体、多聚磷酸盐、糖原和许多糖酵解酶。大多数酵母细胞(例如酵母属菌株)也含有一些小球形的脂质,延长培养期,其量会增加。
已经公开了一些用于提取和净化不同来源的蛋白质的多步骤工艺程序。例如关于从受控微生物产生蛋白质的出版物有以下一些:斯塔海伦(Th.Staehelin)等人(J.Biol.Chem.256;9750-54;1981),默里(K.Murray)等人(The EMBO J.3;P.645-650;1984)和希茨曼(R.A.Hitzeman)等人(Nucl.Ac.Res.11;2745-2763;1983)的文章。
典型的是,当产生的蛋白质与细胞结合时,那些不同的方法包含三个步骤系列。
在第一步骤系列中,所需要的蛋白质是从细胞内部脱除。因此,细胞或者被溶解(例如通过酶处理)或者被破碎(例如通过剪切力那样的机械力,例如X-压力机或法国压力机)或同玻璃珠一起摇动,最后加入一种洗涤剂(见默里等人以及希茨曼等人在上述参考文献中所述)。
在第二步骤系列中,培养基在所需要的蛋白质中富集,例如通过加入硫酸铵和(或)在聚乙二醇存在下进行分段沉淀。
最后,在第三步骤系列中,实际上全部污染物都从培养基中被去除,例如,采用下述一种或几种方法,这些方法包括超滤、离子交换、凝胶过滤色谱和等密度梯度离心分离。
在这一工艺程序中,显然,随同蛋白质(希茨曼等人所述,在上述引文中)、核酸和脂质,更准确地说高的脂质含量等污染物,对第三系列步骤中的至少一步骤(例如超滤和柱色谱法)具有有害的影响,而且蛋白酶必须从培养基中快速除去。此外,由于脂质会干扰沉淀,因此如不预先进行粗脱脂,则用硫酸铵沉淀是不可能的。
因此,最重要的是安排一种方法,该方法可以在第三步骤系列前消除大部分污染物。
在某些上述方法中,使用了聚乙二醇作为蛋白质的选择性沉淀剂,还有报告提及用脂蛋白-多阴离子-金属相互作用以从血浆中沉淀脂蛋白的方法。
波尔森(Polson)等人(Biochem.Biophys.Acta 82;463-475;1964)曾提出使用可溶于非离子水的聚合物,更明确的说是聚乙二醇(PEG)、来分段沉淀蛋白质的方法,并由不同的作者进行了讨论。其中霍尼格(W.Honig)等人(Analyt.Biochem.72;502-512;1976)提及“通过使用比通常应用的聚乙二醇6000平均分子量更低的聚乙二醇组分可以改进沉淀的专一性,即所需要的蛋白质和总蛋白质的比例”。然而,作者又讲,“虽然通过控制pH,可以得到某种血浆蛋白质的浓缩物,但是,对更复杂的蛋白质混合物,例如细胞匀浆的上层清液来讲,净化的效果是相当差的”。
福斯特(P.R.Foster)等人(Biochim.Biophys.Acta317;505-516;1973)曾提出用聚乙二醇从酿酒酵母的细胞提取物中沉淀酶的方法。瓦佳(B.P.Vajda)(Folia Microbiol23,88-96;1978)和兰滋(G.J.Lancz)(Arch.Virus-forsch.42;303-306;1973)公开了用聚乙二醇浓缩和净化病毒和细菌噬菌体的一些方法。在肝炎抗原分离方面,亚当姆韦茨(Ph.Adamowicz)等人(Inserm Symposium No.18,P37-49;肝炎B疫苗,荷兰、阿姆斯特丹,Elsevier出版,1981)曾叙述过用聚乙二醇6000的二次连续处理来净化肝炎B表面抗原的方法。这种从血浆净化肝炎B表面抗原的方法分两步,第一步是用5.5%浓度的聚乙二醇6000从血清中沉淀抗原体复合物,第二步通过加入聚乙二醇从分离的上层清液中沉淀出肝炎B病毒表面抗原,使其最后浓度为10%。
在专利文献中:
美国专利3790552号公开了一种从一种蛋白质组分中去除与肝炎有关的抗原的方法,其中一个步骤是使用12-30%(重量/体积)的,分子量为200-6,000的聚乙二醇来沉淀所述的抗原。
美国专利3951937号公开了一种用于净化肝炎B抗原(HBAg)的方法,其中讲到了使用分子量至少为600的聚乙二醇(4.0-4.5重量%)来双沉淀肝炎B抗原的情况。
美国专利3994870号公开了一种用于净化肝炎B抗原(HBAg)的方法,先是通过加入4.0-4.5重量%的聚乙二醇来沉淀肝炎B抗原,然后,利用不溶解的Concaralin.A作为色谱吸附剂对其进行亲合色谱分析。
欧洲专利申请说明书0112506号公开的方法是从血浆生产一种能防止肝炎B感染的疫苗。它先用硫酸铵沉淀,随后吸附在胶态硅酸盐上并用聚乙二醇(分子量为2000-10000)连续进行二次沉淀步骤,聚乙二醇在浓度为3-7%(重量/体积)时沉淀肝炎B病毒和抗原抗体复合物,而在上层清液中浓度为15-20%(重量/体积)时沉淀肝炎B表面抗原。
在α-1-抗胰蛋白酶分离方面,日本专利申请说明书9128-335号(德温特文摘84-217127)公开了通过加入15-20%(重量/体积)的聚乙二醇以从血浆组分中沉淀α-1-抗胰蛋白酶的方法。
如上所述,以前还有报告提及一种通过使用脂蛋白-多阴离子-金属相互作用以沉淀脂蛋白的方法(例如:默斯坦(M.Murstein)等人Adv.Lip.Res.11;67-108;1973和范戴伦(A.Van Dalen)等人,Biochim.Biophys.Acta 147;421-427;1967)。此方法是由脂蛋白、一种二价金属阳离子和一个酸性多糖之间的相互作用来完成的,在这些操作条件中,沉淀物的数量是培养基中二价金属阳离子浓度的函数。
用于本发明的方法中的开始物料(这里也称‘粗提出液’)是受控酵母细胞的上层清液,该酵母细胞产生一种与细胞结合的蛋白质,且象技术上已熟知的那样,在非离子型洗涤剂存在下已被破碎。
按照本发明,将用聚乙二醇进行的分段沉淀(此后称作第一步)同用多价金属阳离子(更准确地说例如钙和锰那样的二价金属)进行分段沉淀或用硫酸铵处理相组合。所述的硫酸铵处理是在将第一步中的上层清液超滤后再进行的。
本发明是从这样一个发现得来的,即当将固体聚乙二醇(例如聚乙二醇6000)以6-12%(重量/体积)的浓度应用于从受控酵母细胞提取肝炎B病毒表面抗原时,所述细胞因非离子型洗涤剂的存在而破碎,此时肝炎B病毒表面抗原并不沉淀。此外,通过随后加入硫酸铵,则形成一个二相系统,该二相系统的特征是肝炎B病毒表面抗原存在于聚乙二醇相中,而大部分污染物则存在于水相中。这一结果是令人惊异的,因为根据以前的说法,在其他粗培养基中,这些操作条件理应引起肝炎B病毒表面抗原的沉淀。因此,本发明的第一个目的是采用聚乙二醇作为从酵母细胞培养物中产生的所需要的蛋白质的溶剂,而大部分污染物则从培养基中沉淀出来而被除去。
根据分子量,聚乙二醇确实能以固态或液态两种形式存在,二种形式分界处的分子量在1500左右。
在本发明方法的第一步中(也可认为是淬化步骤),按照相应的分子量合适地调整浓度,显然可以使用不同分子量的聚乙二醇。
例如,当使用固态聚乙二醇时(例如聚乙二醇6000),聚乙二醇的浓度最好在6-12%(重量/体积)之间,而当使用液态聚乙二醇时(例如聚乙二醇300或400),聚乙二醇的浓度为10-35%(体积/体积),最合适的是20-30%(体积/体积)。然而,出于一些技术上的原因,最好使用液态聚乙二醇,原因之一是便于以后的超滤。
因此,本发明提供了一种用于提取和净化蛋白质,更准确地说是肝炎B病毒表面抗原或α-1-抗胰蛋白酶的方法,该蛋白质系得自在一种非离子型洗涤剂(最好是一种聚山梨酸酯洗涤剂)存在下破碎了的酵母细胞的上层清液,所述的上层清液在这里指‘粗提取液’,在本方法的第一步中,或者用6-12%(重量/体积)的固体聚乙二醇,或者最好用10-25%(体积/体积)的液体聚乙二醇加到粗提取液中,并调整pH至6(±0.1),上述聚乙二醇浓度的极限以达到净化点为准,再多加聚乙二醇只会产生不利的影响,即培养基粘度会增高并且肝炎B病毒表面抗原或α-1-抗胰蛋白酶会发生不好的共沉淀作用。
在本发明的方法中,聚乙二醇是作为一种聚合的有机溶剂,它有利于等电点接近于pH6的(脂)蛋白的沉淀和其他(脂)蛋白的增溶,这些脂蛋白有的等电点明显不同,有的高度疏水。
我们已注意到,此聚乙二醇净化步骤能沉淀约75%污染蛋白质、90%的多糖、94%的核酸和45%的脂质,与此同时,基本上全部肝炎B病毒表面抗原或α-1-抗胰蛋白酶含量被回收在上层清液中。
如上文中所指明的,本发明包括几个步骤的结合,这些步骤中的第一步是净化以产生一种部分净化的和最后是所需要的蛋白质的有点带乳色的溶液。
在本发明的方法的第二步中,或者用多价-更准确地说二价-金属阳离子处理,或者用硫酸铵处理所得到的部分净化的溶液,多价金属离子可用最后浓度为30mM的氯化钙或氯化锰水溶液。在用硫酸铵处理时,或者在乳色溶液经超滤后通过加入固体硫酸铵到40-50%饱和,按照传统的盐析法将所需要的蛋白质沉淀出来并转移到磷酸盐缓冲溶液中,或者将硫酸铵加到含有聚乙二醇的上层清液中至40-50%饱和以形成二相系统,所需要的蛋白质在聚乙二醇相中。
这些应用于第二步腺中各种方法的每一种都产生一种就它的多糖、核酸、脂质和污染蛋白质含量而言是实质上已净化的所需要的蛋白质的澄清溶液。
然后将如此得到的溶液进行上述传统的第三步骤系列的加工,例如最后的超滤、凝胶过滤和柱色谱法。在本发明的一个最佳实施方案中,此第三步骤系列包括连续进行一次超滤、第一次凝胶过滤、用二乙基氨基乙基(DEAE)基团在弱碱性阴离子交换剂上进行柱色谱分离、第二次凝胶过滤或氯化铯梯度离心分离以产生一种高度净化的、可供医药用的肝炎B病毒表面抗原或α-1-抗胰蛋白酶。
当用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(十二烷基硫酸钠)测试时,第二次凝胶渗透以后回收的产品从23K谱带着其纯度大于98%,23K谱带是酵母源的肝炎B病毒表面抗原的特征。
因此,本发明方法的最大优点是它实质上除去了全部多糖、核酸、脂质和蛋白质物料。本发明的另一个优点是可以以比较高的得率最后分离出所需要的蛋白质。
当本发明的方法应用于从受控酵母细胞得到的肝炎B病毒表面抗原的粗提取液时,此得到的肝炎B病毒表面抗原被结合到非离子型洗涤剂上,并由此形成直径约17到20nm的复合微团,当用比色法测定蛋白质(劳里Lowry)、总脂(佐尔纳Zollner)和非离子型洗涤剂(赫德尔斯顿Huddleston和奥尔雷德Allred)时,发现非离子型洗涤剂的数量对聚山梨酸酯复合微团中的蛋白质、总脂和聚山梨酸酯的比例是15-35%(重量/体积)。
通过本发明的方法使用一种非离子型洗涤剂聚山梨酸酯而得到的复合微团是新的化合物,这些化合物也是本发明的目的;它们是致免疫的,而且可以结合成类似传统的肝炎B病毒表面抗原的疫苗形式,这是制备肝炎B病毒疫苗常用的技术。
本发明由以下实例予以阐明,但这些实例并不限定本发明的范围。
实例1
已经成长到每升培养物有30克干重细胞的表示受控酵母菌株肝炎B病毒表面抗原的颗粒状酵母细胞(3850克)被悬浮在7.12升的磷酸氢二钠溶液中(7.098克/升)。
在此悬浮液中再追加142.5毫升的4%(重量/体积)的乙二胺四醋酸溶液、38.5毫升的聚山梨酸酯20和385毫升含2.7克苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)的异丙醇。用NaOH(10%的水溶液重量/体积)将pH调整到8.1(±0.1)。将此悬浮液放在冰浴中致冷并从二个通道经过一个冷却的玻璃珠均化器进行破碎。然后在13000克离心力下将匀浆(粗提取液)离心分离30分钟。
将聚乙二醇400(2.5升)边搅动边缓慢地加到保持在15℃以下的粗提取液中(7.7升)。然后通过加入乙酸(5M)调整pH到6(±0.1)。将培养基在4℃存放1小时,然后在7,400-11,000克力下离心分离45分钟。
用N NaOH调整上层清液到pH7.0(±0.05),再加入300毫升的M CaCl2(即每升上层清液加30毫升)。用N NaOH重新调整pH到7(±0.05),在4℃存放过夜。将悬浮液在3600克力下离心分离45分钟,上层清液在一个AMICON DC(由美国Amicon公司出售的一种仪器)中超滤,该仪器配备有一个100,000道尔顿的断流筒,从而首先浓缩到初始容量的1/4(1500毫升)。然后用12.5升的10mM trometamol连续清洗,该trometamol系用N盐酸调整pH到8(±0.1)(此缓冲液此后叫做trometamol pH 8),再用苯基甲基磺酰基氟化物(2mM)、异丙醇(2.5%体积/体积)和乙二胺四乙酸(2mM)(最后浓度)补充。然后将保留物浓缩至350毫升。
将此浓缩的溶液施加到一个含7升Fractogel TSK HW65(F)的柱上(10厘米直径×100厘米)(该Fractogel TSK HW65(F)是一种半硬的凝胶,它是由大小为32-63微米的颗粒,其基质表面上有无数羟基的亲水乙烯聚合物所组成,是德意志联邦共和国在达姆斯塔特的E.Merck制造和出售的),Fracto-gel TSK HW65(F)用5%(体积/体积)的乙二醇增补的10mM pH7(±0.01)的trometamol/HCI缓冲液中平衡。
将含有肝炎B病毒表面抗原的高峰流施加到一个用4℃的trometamol pH 8平衡的300毫升 Fractogel TSK DEAE 650(M)的柱上(5厘米直径×30厘米)(FRACTOGEL TSK DEAE 650(M)是一种弱碱性的阴离子交换剂,其中二乙基氨基乙基基团通过醚键连接到FRACTOGEL TSK HW-65基质的羟基上,它是由德意志联邦共和国 Darmstadt,的 E.Merck制造和出售的)用含有trometamol pH 8的0.05克分子的NaCl清洗柱和用trometamol pH 8中0.15克分子的NaCl洗脱肝炎B病毒表面抗原。
将洗出液加到一个FRACTOGEL TSK HW 65(F)柱上,柱用以NaCl(150mM)增补的pH6.8的Na2HPO4/Na H2PO4缓冲液(10mM)平衡,产生一种肝炎B病毒表面抗原/聚山梨酸酯复合微团的溶液。
表Ⅰ列出了在净化的每一阶段达到的净化程度。
表Ⅱ扼要地列出了用聚山梨酸酯20通过上法得到的三个不同疫苗批次的复合微团的成分。
表 Ⅱ
批次 蛋白质 总脂 聚山梨酸酯 比例
(微克/毫 微克/毫 20(微克 (C)/(A/B/C)
升) 升) /毫升)
(A) (B) (C)
Ⅰ 20 20 8.5 18
Ⅱ 20 16 8.4 19
Ⅲ 20 14.5 15.6 31
实例2
取聚乙二醇400(882毫升)缓慢地加到2650升的按实例1中叙述的方法制备的粗提取液中,并调整pH到6(±0.1)。将培养基保持在4℃一小时,然后以7400克力离心分离。上层清液在配备有一个100,000道尔顿断流筒的AMICON DC仪器上浓缩到1000毫升,然后用三倍容积的20mM trometamol pH清洗。然后将硫酸铵粉末在4℃边搅动边缓慢地加到保留物中。在4℃保持一小时后,将沉淀物以1000克力离心分离15分钟。弃去上层清液和把沉淀物溶解在400毫升的用1mM苯基甲基磺酰基氟化物补充的20mM trometamol pH 8中。溶液用一个配备有100,000道尔顿断流筒的Amicon DC仪器超滤。用二倍容积的trometamol pH 8清洗此保留物(500毫升),然后施加到一个含有300毫升用trometamol pH8平衡的TSK-DEAE 650M凝胶的柱上。当试样的流通完成后,用在trometamol pH 8中0.05M的NaCl清洗柱,然后将线性梯度的NaCl(0.05M-0.5M)施加到柱上。用0.15M NaCl洗出的组分含有肝炎B病毒表面抗原,将它放在一个配备10,000道尔顿断流筒的AMICON DC仪器中浓缩到50毫升,再施加到一个Sepharose 4B-CL(一种由瑞典UPPsala的药物和精细化学品公司制造和出售的琼酯糖凝胶)的柱上(50×100厘米),柱由用5%乙二醇补充的20mM trometamol pH8所平衡,产生一种肝炎B病毒表面抗原/聚山梨酸酯复合微团的溶液。
表Ⅲ表示在每一阶段所达到的净化程度。
实例3
按照实例1中叙述的方法,用聚乙二醇400净化肝炎B病毒表面抗原粗提取液(2升)。在搅拌下加入粉末状硫酸铵(450克)(最后浓度是45%硫酸铵)。在粉末硫酸铵溶解后,将此溶液保持在4℃三小时,三小时后可以得到明显的二相,在分液漏斗中分离此二相:澄清的(黄色)上层相(聚乙二醇400相)和澄清的下层相(水相),每一相约为原容积的I50%。弃去水相,上层相则按实例1中叙述的用于氯化钙上层清液那样在一个Amicon DC仪器上超滤。然后按照实例1中叙述的方法继续进行净化,产生一种肝炎B病毒表面抗原/聚山梨酸酯复合微团的溶液。
表Ⅳ表示在每一阶段所达到的净化程度。
实例4
按照实例1中叙述的方法用聚乙二醇400净化肝炎B病毒表面抗原粗提取液(2升)。在搅拌下加入粉末状硫酸铵(450克)(最后浓度是45%硫酸铵)。在粉末状硫酸铵溶解后,将此溶液保持在4℃三小时,三小时后在分液漏斗中分离可以得到明显的二相:澄清的(黄色)上层相(聚乙二醇400相)和澄清的下层相(水相),每一相约为原容积的±50%。弃去水相,取一升聚乙二醇(上层),用10mM的trometamol pH稀释至二倍并施加到含300毫升FRACTOGEL TSK-DEAE 650(M)凝胶的柱上,用流速为每小时100毫升的trometamol pH进行平衡。用含有0.05M NaCl的trometamol pH8清洗此凝胶,然后用一个NaCl梯度(trometemol pH8中0.05-0.5M NaCl)稀释肝炎B病毒表面抗原。用0.15M NaCl洗脱肝炎B病毒表面抗原峰流并在配备有10,000道尔顿断流筒的AMICON DC中浓浓缩,保留物施加到Sepharose 4B-CL柱上(5×100厘米),柱用含有5%(体积/体积)乙二醇的trometamol pH8平衡,结果便会产生肝炎B病毒表面抗原/聚山梨酸酯复合微团的峰流。
表Ⅴ表示每一阶段所达到的净化程度。
实例5
在4℃,边搅拌边缓慢加入溶于160毫升水的50克聚乙二醇6000溶液,即可净化肝炎B病毒表面抗原粗提取液(500毫升)。加入5M乙酸将pH调整到6.1。在4℃存放一小时后,以7000克力离心分离此提取液15分钟。然后在搅拌下将粉末状硫酸铵(157克)加入上层清液(最后浓度是在饱和硫酸铵中50%)。溶解后,在4℃存放此溶液3小时,此时可得到明显的二相,在分液漏斗中分离此二相。用trometamol pH8稀释此上层相(含有肝炎B病毒表面抗原的聚乙二醇相)至二倍,然后施加到含300毫升TSK-DEAE 650(M)凝胶的柱上,柱在流速为每小时100毫升的trometamol pH8中平衡。用含有0.05M NaCl的trometamol pH8清洗此凝胶并用含有0.15M NaCl的tromtamol pH8洗脱此肝炎B病毒表面抗原,然后在配备有10,000道尔顿断流的筒的AMICON DC中浓缩,并将保留物施加到FRACTOGEL TSK-HW65(F)的2升柱上(5×100厘米),最后用含10%(体积/体积)乙二醇的trometamol pH8平衡,结果便会产生一个肝炎B病毒表面抗原/聚山梨酸酯复合微团的溶液。
表Ⅵ列出了每一阶段的净化程度。
实例6
取聚乙二醇400(13毫升),缓慢加入从受控酵母培养物中得到的α-1-抗胰蛋白酶粗提取液中(120毫升),并用5M乙酸将pH调整到6.1。在4℃存放1小时后,用5000克力离心分离此培养基15分钟,缓慢加入1M CaCl3溶液到最后浓度为40mM。用1M NaOH调整pH到7,在4℃存放过夜后,用7000克力离心分离此培养基15分钟。用0.1N HCl调整pH到8.7的50mM trometamol稀释此上层清液至二倍,然后施加到FRACTOGEL TSK-DEAE 650(M)的柱上(20毫升),用50mM按上述方法制取的但用5mM氢硫基乙醇增补的trometamol pH8.7平衡。用按上述方法制取的但用10mM NaCl增补的trometamol pH8.7清洗此柱,再施加NaCl梯度(10mM 250mM)并用124mM浓度的NaCl洗脱此α-1-抗胰蛋白酶,再从80mM NaCl洗脱的蛋白质峰流中予以分离。在配备有10,000道尔顿的断流的筒的AMICON DC中浓缩此α-1-抗胰蛋白酶峰流,再施加到在按上述方法制取的50mM trometamol pH8.7中平衡的Sephadex 150柱上,于是便得到净化的α-1-抗胰蛋白酶溶液。
表Ⅶ列出了每个阶段达到的净化程度。
实例7
本方法与实例1中叙述的相同,但是用300毫升M MnCl2代替其中的300毫升M CaCl2。最后产品的特性和在实例1的最终产物的那些特性相似。
实例8
本方法与实例1中叙述的相同,但是用20毫升的Triton X-100(由德意志联邦共和国达姆斯达特的Rohm和Haas生产的产品)代替其中的35毫升的聚山梨酸酯20。此最后产品的特性和在实例1的最终产品的那些特性相似。
实例9
本方法与实例1中叙述的相同,但是用38.5毫升的聚山梨酸酯80代替其中的38.5毫升的聚山梨酸酯20。此最后产品的特性和实例1的最终产品的那些特性相似。
实例10
加入NaCl、磷酸盐缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4)和ALHYDROGEL(由丹麦哥本哈根SUPERPHOS出口公司制造和出售的氢氧化铝凝胶),将实例1的最后得到的肝炎B病毒表面抗原复合微团溶液的蛋白质含量调整到每毫升10微克,加入的量分别使最后浓度达到0.9%(重量/体积)、20mM和0.15%(重量/体积)的Al(OH)3。
将制取物灭菌并分装到2毫升的玻璃管中,每一管含有一毫升剂量单位疫苗。
实例11
以实例10的疫苗剂量单位对二系列的血清反应阴性的受验者施以二次连续的肌肉注射,二次间的间隔一个月。虽然这些注射可认为是原发性的投药,其后,比如第一次注射后两个月,应跟着采用激发药,但是在首次投药后的一个月和二个月已分别出现了阳性抗体反应。
在第一系列中(包含32名血清反应阴性的受验者),在第一次注射后一个月,血清转化率为20/32,也即62.5%,其几何平均值为9.95毫国际单位,而在第二次注射后一个月,血清转化率为31/32,即96.9%,其几何平均值为36毫国际单位。
在第二系列中(包含46名血清反应阴性的受验者),第一次注射后一个月,血清转化率为31/46,即67.4%,其几何平均值为13/6毫国际单位。临床症状记录表明,接受疫苗的体温未见上升,也没有显著的局部反应。
勘误表
文件名称 页 行 补正前 补正后
说明书 12 12 2650升 2.650升
13 1 100,000 106
23 8 35 38.5
20 (漏译) 最后pH为6.9
Claims (15)
1、一种从受控酵母细胞上层清液提取和净化同细胞结合的蛋白质的方法,其特征在于这种受控酵母细胞已产生上述的蛋白质,并在非离子型洗涤剂中已将其破碎,这种方法包括下列步骤:调整上层清液的pH到6(±0.1),然后再将液体的或固体的聚乙二醇加入到上述上层清液中直至其净化,并用二价金属阳离子或硫酸铵在超滤后处理已净化的上层清液以分离出上述蛋白质。
2、依照权利要求1的工艺程序,在上层清液中加入液体聚乙二醇直到最后浓度在10%和35%(体积/体积)之间的方法。
3、依照权利要求1的工艺程序,在上层清液中加入固体聚乙二醇,直到最后浓度在6和12%(重量/体积)之间的方法。
4、权利要求1到3提到的蛋白质是肝炎B表面抗原。
5、权利要求1到3提到的蛋白质是α-1-抗胰蛋白酶。
6、依照权利要求1到5的工艺程序,澄清的上层清液用二价金属阳离子处理。
7、权利要求6提到的二价金属阳离子是钙阳离子或锰阳离子。
8、依照权利要求6和7,工艺程序还包含沉淀的分离、溶液的超滤、保留物的凝胶渗透、含蛋白质的峰流的离子交换色谱法以及最后,第二次凝胶渗透或氯化铯梯度离心分离。
9、依照权利要求1到5的工艺程序,用硫酸铵处理澄清的上层清液直到40-50%饱和并离析此净化的蛋白质到聚乙二醇相中。
10、依照权利要求9的工艺程序,最后进一步对聚乙二醇相进行超滤,接着用凝胶渗透和离子交换色谱法。
11、按照权利要求9的方法,最后进一步对乙二醇相进行超滤,接着用离子交换色谱法和凝胶渗透。
12、依照权利要求2的工艺程序,对澄清的上层清液进行超滤,并用硫酸铵处理保留物直到40-50%饱和,以使转移到合适的缓冲液中的蛋白质沉淀。
13、依照权利要求12的工艺程序,再进一步采用超滤、凝胶渗透和离子交换色谱法。
14、依照权利要求1到5的任意一项方法,非离子型洗涤剂是一种聚山梨酸酯。
15、依照权利要求14的方法,聚山梨酸酯是聚山梨酸酯20。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |