DE10051143A1

DE10051143A1 - Detecting and characterizing binding complexes, useful e.g. for diagnosis, comprises forming sample and reference complexes and determining force required for separation

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Publication number: DE10051143A1
Application number: DE10051143A
Authority: DE
Inventors: Hermann Gaub
Original assignee: NANOTYPE GmbH
Current assignee: Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2000-10-16
Publication date: 2002-02-28
Anticipated expiration: 2020-10-17
Also published as: DE10051143C2

Abstract

Characterizing and/or detecting a binding complex comprising: (a) forming a linkage of binding partners so that binding partner (B1) and binding partner (B2) form a sample complex (SC) and binding partners (B3 and 4) form a reference complex (RC); (b) applying a force to the linkages so that SC or RC is separated; and (c) determining which complex has been separated, is new. Characterizing and/or detecting a binding complex comprising: (a) providing a first binding partner (B1), a conjugate (C) of second and third binding partners (B2, B3) and a fourth binding partner (B4); (b) forming a linkage of binding partners so that B1 and 2 form a sample complex (SC) and B3 and 4 form a reference complex (RC); (c) applying a force to the linkages so that SC or RC is separated and (d) determining which complex has been separated, is new. Independent claims are also included for the following: (1) an apparatus for the process; and (2) kit for the performing the method or for use with the apparatus of (1).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis eines Bindungskomplexes, insbesondere mittels Unterscheidung molekularer Trennkräfte durch einen differentiellen Krafttest.The invention relates to a method and an apparatus for characterization and / or Detection of a binding complex, in particular by distinguishing molecular ones Separation forces through a differential force test.

Binding tests based on equilibrium constants

Nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen Molekülen beruhen auf der atomaren Interaktion von Bindungspartnern durch Wasserstoffbrücken, ionische, hydrophobe und van-der-Waals Kräfte. Schwache Wechselwirkungen sind Größenordnungen geringer als kovalente Bindungen, die durch chemische Reaktionen gebildet oder gelöst werden.Non-covalent interactions between molecules are based on atomic interaction of binding partners through hydrogen bonds, ionic, hydrophobic and van der Waals Forces. Weak interactions are orders of magnitude smaller than covalent bonds, that are formed or dissolved by chemical reactions.

Nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen Bindungspartnern mit einem hohen Grad an selektiver Bindeeigenschaft sind die Voraussetzung für die molekulare Erkennung, die man sich in der chemischen Analytik und der Diagnostik zu Nutze macht. Im Folgenden werden solche Wechselwirkungen als spezifische Wechselwirkungen bezeichnet. Bei den Verfahren zum Nachweis oder der Charakterisierung biochemischer Moleküle handelt es sich meistens um Bindetests.Non-covalent interactions between binding partners with a high degree selective binding properties are the prerequisite for the molecular recognition that you look at in chemical analysis and diagnostics. The following are such Interactions referred to as specific interactions. In the procedures for Detection or the characterization of biochemical molecules is mostly about Binding Assays.

Ein Bindetest basiert auf der Ausbildung eines Bindungskomplexes durch die spezifische Wechselwirkungen eines Liganden mit einem Rezeptor und dem Nachweis dieses Komplexes.A binding test is based on the formation of a binding complex by the specific one Interactions of a ligand with a receptor and the detection of this complex.

Bei diagnostischen Bindetest kommt es darauf an, eine bekannte Substanz in einer Probe nachzuweisen:
Diagnostic binding testing is about detecting a known substance in a sample:

- Determine the identity of a test substance
- Detect a test substance in a complex test mixture
- to distinguish variants of a test substance
- Determine the concentration of a test substance

Bei Bindetests für die Entwicklung neuer Diagnostika oder Therapeutika kommt es darauf an, zu einem bestimmten Bindungspartner einen passenden, noch unbekannten zweiten Bindungspartner zu finden, d. h.:
In the case of binding tests for the development of new diagnostic or therapeutic agents, it is important to find a suitable, yet unknown second binding partner for a specific binding partner, ie:

- To identify those from a large number of test substances that are related to a specific one Receptor binds
- Determine the binding constant of the test substance to the receptor
- Other binding properties such as the rate of association (on rate) or dissociation (off rate)

In der Immunodiagnostik handelt es sich bei den Rezeptoren i.d.R. um Antikörper oder Antikörperderivate, mit denen Antigene von Proteinen, niedermolekulare Substanzen aber auch Viren und ganze Zellen nachgewiesen werden können.In immunodiagnostics, the receptors are usually for antibodies or Antibody derivatives with which antigens of proteins, but also low molecular weight substances Viruses and whole cells can be detected.

In der molekularen Diagnostik spricht man bei dem Rezeptor von einer Sonde, die aus einer Nukleinsäure wie DNA oder RNA besteht und mit der Nukleinsäuren in einer Probe nachgewiesen werden.In molecular diagnostics, the receptor is called a probe that consists of a There is nucleic acid such as DNA or RNA and with the nucleic acids in a sample be detected.

Der verbreitetste immunodiagnostische Test ist der enzym linked immunosorbent assay (ELISA). Beim ELISA wird ein erster Antikörper auf einer Oberfläche immobilisiert. Er bindet selektiv ein Antigen eines zugegebenen Probegemischs über eine erste Bindestelle (Epitop). Ein zweiter Antikörper, der mit einer Markierung versehen ist und der sich in freier Lösung befindet, bindet an ein zweites Epitop des Antigens. Bei einem Separationsschritt wird die Fraktion des markierten Antikörpers abgetrennt, die nicht an das Antigen gebunden hat. Die auf der Oberfläche zurückbleibenden Sandwich-Komplexe aus erstem Antikörper, Antigen und zweitem Antikörper werden anhand der Markierung nachgewiesen. An die Markierung vermag i.d.R. ein Enzym zu binden, das mittels Bildung eines Farbstoffes das Signal entwickelt. Der Farbstoff ist letztlich das Maß für die Menge des Antigens in der untersuchten Probe.The most common immunodiagnostic test is the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). In the ELISA, a first antibody is immobilized on a surface. It binds selectively an antigen of an added sample mixture via a first binding site (epitope). A second Antibody that is labeled and that is in free solution binds to a second epitope of the antigen. In a separation step, the fraction of labeled labeled antibody that has not bound to the antigen. The one on the Surface-remaining sandwich complexes of the first antibody, antigen and second Antibodies are detected using the label. As a rule, the marking can on Bind enzyme that develops the signal by forming a dye. The dye is ultimately the measure of the amount of antigen in the sample examined.

Ein typischer molekulardiagnostischer Test ist die Southern-Hybridisierung. Sie beruht auf der Wechselwirkung eines bekannten Nukleinsäuremoleküls, der Sonde, zu einer komplementären Nukleinsäure eines Probengemischs. Die Probe wird auf einer Oberfläche immobilisiert und die markierte Sonde zugegeben. Bei geeigneten Puffer- und Temperaturbedingungen binden die Sondenmoleküle an komplementäre Sequenzen der Probe. Nach Separation der nicht gebundenen Sonde werden die gebildeten Nukleinsäureduplexe aus Sonde- und Probemolekülen mittels der Markierung quantifiziert. A typical molecular diagnostic test is Southern hybridization. It is based on the Interaction of a known nucleic acid molecule, the probe, into a complementary one Nucleic acid of a sample mixture. The sample is immobilized on a surface and the labeled probe added. With suitable buffer and temperature conditions, the bind Probe molecules on complementary sequences of the sample. After separating the not bound probe, the nucleic acid duplexes formed from probe and sample molecules quantified using the marker.

Bei der reversen Southern-Hybridisierung, die Grundlage für die hoch parallele Nukleinsäureanalyse auf miniaturisierten Sondenanordnungen (DNA microarrays) ist, werden die Sondenmoleküle auf der Oberfläche gebunden und markierte Probemoleküle in freier Lösung zugegeben.In reverse Southern hybridization, the basis for the highly parallel Nucleic acid analysis on miniaturized probe arrays (DNA microarrays) the probe molecules bound to the surface and labeled sample molecules in free solution added.

ELISA und Southern-Hybridisierung haben gemeinsam, daß das Bindeereignis durch eine Markierung nachgewiesen wird und daß einer der Bindepartner auf einer Oberfläche gebunden wird. Eine weitere Eigenschaft, die sie mit allen gängigen Bindetest gemeinsam haben, besteht darin, daß man Bindeeigenschaften zweier Bindungspartner zueinander auf der Basis der Größe der Bindungsenergie im resultierenden Bindungskomplex charakterisiert.ELISA and Southern hybridization have in common that the binding event is triggered by a Marking is detected and that one of the binding partners is bound on a surface becomes. Another property that they have in common with all common binding tests is in that binding properties of two binding partners to each other based on size characterized the binding energy in the resulting binding complex.

Molecular interaction model

Die chemische Wechselwirkung zwischen zwei Bindungspartnern läßt sich anhand verschiedener Modelle beschreiben. Das klassische theoretische Gerüst ist die Thermodynamik. Für die Entwicklung der Thermodynamik war ausschlaggebend, daß es lange nicht möglich war, molekulare Wechselwirkungen an einzelnen Molekülen zu messen. Deshalb beschreibt sie die Wechselwirkung von Teilchen auf der Basis makroskopisch meßbarer Größen. Hieraus resultiert das Konzept der Bindungsenergie, die als die zum Lösen einer Bindung erforderliche Energie definiert ist. Die Bindungsenergie zweier Bindungspartner zueinander kann über die Messung der Konzentrationen von freien und gebundenen Bindungspartnern über die Gleichgewichtskonstante abgeleitet werden.The chemical interaction between two binding partners can be seen from describe different models. The classic theoretical framework is thermodynamics. For the development of thermodynamics it was crucial that it was not possible for a long time to measure molecular interactions on individual molecules. That is why she describes the Interaction of particles on the basis of macroscopically measurable quantities. This results in the concept of bond energy, which is the energy required to release a bond is defined. The binding energy of two binding partners to each other can be measured the concentrations of free and bound binding partners over the Equilibrium constant can be derived.

Ein grundlegend anderes Konzept zur Charakterisierung molekularer Wechselwirkung wurde durch die Kraftmessung, z. B. mit dem Atomic Force Microscope, an einzelnen Molekülen ermöglicht. Die Kräfte, die zwischen den Atomen zweier Bindungspartnern ausgebildet werden, können experimentell durch die aufzuwendende Trennkraft bestimmt werden. Aus der Ratenabhänigkeit der Trennkräfte kann unter bestimmten Voraussetzungen das Bindungspotential eines Bindungskomplexes rekonstruiert werden. Im Gegensatz zu einer Charakterisierung eines Bindekomplexes anhand seiner Bindungsenergien, ist der Zerfall des Komplexes bei einer Kraftmessung nicht durch die thermische Anregung, sondern durch einen manipulativen Eingriff bedingt.A fundamentally different concept for characterizing molecular interaction was developed by force measurement, e.g. B. with the Atomic Force Microscope, on individual molecules allows. The forces that are formed between the atoms of two binding partners can be determined experimentally by the separation force to be used. From the The rate dependency of the separating forces can do this under certain conditions The binding potential of a binding complex can be reconstructed. In contrast to one Characterization of a binding complex based on its binding energies is the decay of the Complexities in a force measurement not by thermal excitation, but by one manipulative intervention.

Zur Erläuterung des Bindungspotentials wird hier ein stark vereinfachtes Bindungsmodell beschrieben. A greatly simplified binding model is used here to explain the binding potential described.

Ein Bindungskomplex ist nicht alleine durch seine Bindungsenergie charakterisiert. Er besitzt auch eine für ihn charakteristische Aktivierungsbarriere, welche seine Binde- und Zerfallswahrscheinlichkeit bestimmt. Auch besitzt jeder Bindungskomplex eine definierte räumliche Struktur. Eine diese Struktur beschreibende charakteristische Größe ist die Bindungslänge oder Potentialweite. Diese Größen lassen sich in folgendem einfachen Modell des Bindungspotentials zusammenfassen, das in Fig. 1 dargestellt ist.A binding complex is not only characterized by its binding energy. It also has a characteristic activation barrier that determines its binding and disintegration probability. Each binding complex also has a defined spatial structure. A characteristic variable describing this structure is the bond length or potential width. These quantities can be summarized in the following simple model of the binding potential, which is shown in FIG. 1.

Im gebundenen Zustand sitzt der Ligand im Minimum des Potentials. Um den Komplex aufzubrechen muß der Ligand über die Potentialbarriere aus der Bindungstasche bzw. aus dem Bindungspotential herausgezogen werden. Die dazu nötige Kraft ist bestimmt durch die Ableitung des Potentials (Steigung).In the bound state, the ligand sits at the minimum of the potential. To the complex the ligand must be broken open via the potential barrier from the binding pocket or from the Binding potential can be extracted. The force required for this is determined by the Derivation of the potential (slope).

Dem mechanischen Aufbrechen ist ein spontaner Zerfall des Komplexes durch thermische Aktivierung überlagert. Dieser spontane Zerfall ist abhängig von der Aktivierungsbarriere ΔG. Eine an den Komplex angelegte Kraft erniedrigt die noch zu überwindende Aktivierungsbarriere. Bei jeder anliegenden Kraft besitzt der Komplex damit eine gewisse Wahrscheinlichkeit innerhalb einer bestimmten Zeit zu zerfallen. Die Kraft, bei der ein Komplex tatsächlich zerfällt, hängt daher auch davon ab, wie schnell die Kraft angelegt wird. Steigert man die angelegte Kraft kontinuierlich mit einer festen Kraftrate r bis der Komplex zerfällt, erhält man folgende mittlere Trennkraft für den Komplex in Abhängigkeit von der angelegten Kraftrate:
A spontaneous disintegration of the complex by thermal activation is superimposed on the mechanical breakup. This spontaneous decay depends on the activation barrier ΔG. A force applied to the complex lowers the activation barrier still to be overcome. With each applied force, the complex has a certain probability of disintegrating within a certain time. The force at which a complex actually disintegrates also depends on how quickly the force is applied. If you increase the applied force continuously with a fixed force rate r until the complex disintegrates, you get the following average separation force for the complex depending on the applied force rate:

Bestimmt man unter verschiedenen Kraftraten jeweils die mittlere Trennkraft, läßt sich daraus die für den Bindungskomplex charakteristische Bindungsweite Δx und die Zerfallsrate k_zerfall des Komplexes bestimmen.If the mean separation force is determined under different force rates, the bond width Δx characteristic of the binding complex and the decay rate k _{decay of} the complex can be determined _therefrom .

Das Messen von Trennkräften stellt daher einen neuen Zugang zur Charakterisierung von Bindungskomplexen dar.Measuring separating forces therefore represents a new approach to the characterization of Binding complexes.

Methods of molecular force measurement

Obwohl die große Mehrheit der Bindetests selektive Wechselwirkungen auf der Basis von Bindungsenergien nachweist, gibt es Beispiele für Methoden, die sich die Vorteile der charakteristischen Trennkräfte der Bindungskomplexe zu eigen machen. Although the vast majority of binding tests are based on selective interactions Evidence of binding energies, there are examples of methods that can take advantage of to make characteristic separation forces of the binding complexes their own.

Das erste Beispiel für eine solche Vorrichtung ist der "surface force apparatus" (SFA), der 1976 von Israelachvili entwickelt wurde (Patent US 5861954, 1999, Israelachvili). Mit diesem Apparat können Adhesionskräfte zweier Molekülschichten zueinander gemessen werden. Jede der Probesubstanzen wird hierzu auf ein zylindrisch gebogenes Glimmerblättchen aufgebracht, die im Idealfall in nur einem Punkt in Berührung gebracht werden. Durch eine genau kontrollierte Bewegung der Glimmeroberflächen zueinander werden Kräfte zwischen den molekularen Schichten angelegt. Mißt man die Bewegung der Oberflächen zueinander in Abhängigkeit der angelegten Kraft, so erhält man eine Aussage über die Adhesionskräfte zwischen den beiden molekularen Schichten.The first example of such a device is the "surface force apparatus" (SFA), which was published in 1976 was developed by Israelachvili (patent US 5861954, 1999, Israelachvili). With this device Adhesive forces between two molecular layers can be measured. Each of the For this purpose, test substances are applied to a cylindrically curved mica sheet ideally be brought into contact in only one point. Through a carefully controlled Movement of the mica surfaces towards each other becomes forces between the molecular ones Layers created. If one measures the movement of the surfaces in relation to each other applied force, you get a statement about the adhesive forces between the two molecular layers.

Bei der zweiten Methode zur Messung molekularer Kräfte handelt es sich um das "atomic force microscope" (AFM). Mit dem AFM gelang die erste Bestimmung der Trennkraft einer schwachen Wechselwirkung eines biologischen Rezeptor-Ligand-Paares, dem Biotin- Streptavidin-System (E.-L. Florin, V. T. Moy and H. E. Gaub, Science 264, 415 (1994)). Im Gegensatz zum SFA werden beim AFM keine makroskopischen Oberflächen in Kontakt gebracht. Die Spitze eines AFM ist nur wenige Nanometer groß und kann sich an ihrem Ende im Idealfall auf ein einzelnes Atom zuspitzen. Im Bestfall kann man zwischen einer AFM-Spitze und einer zweiten Oberfläche einzelnes Molekül, z. B. einen DNA-Doppelstrang, aufhängen. Wird die Spitze nun von der Oberfläche weggezogen, so kommt es zur Spannung des Moleküls und zur Verbiegung des AFM-Cantilevers, die bei bekannter Federkonstante des Cantilevers eine Messung der molekularen Bindekräfte erlaubt.The second method for measuring molecular forces is the "atomic force microscope "(AFM). The AFM was the first to determine the separation force of a weak interaction of a biological receptor-ligand pair, the biotin Streptavidin system (E.-L. Florin, V.T. Moy and H.E. Gaub, Science 264, 415 (1994)). In contrast to the SFA, no macroscopic surfaces are in contact with the AFM brought. The tip of an AFM is only a few nanometers in size and can end up in the Ideally, point to a single atom. At best, you can choose between an AFM tip and a second surface of a single molecule, e.g. B. hang up a DNA double strand. If the tip is now pulled away from the surface, the molecule becomes tensioned and for bending the AFM cantilever, which is known when the spring constant of the cantilever is known a measurement of the molecular binding forces allowed.

Eine Abwandlung der AFM-Methode, die in Richtung diagnostischer Anwendung zielt, wird in Patent US 5992226; Lee et al. beschrieben. Hier ist die Probe satt auf einer flachen Oberfläche zwischen einem spitz auslaufenden Vorsprung und der AFM-Spitze gebunden, bzw. einer Oberfläche auf dem AFM-Cantilever gebunden wird.A modification of the AFM method, which is aimed at diagnostic applications, is described in Patent US 5992226; Lee et al. described. Here the sample is full on a flat surface tied between a tapered projection and the AFM tip, or one Surface on which the AFM cantilever is bound.

Eine dritte Methode zur Charakterisierung molekularer Kräfte basiert auf der Verwendung mikroskopisch kleiner magnetischer Kugeln. Man bindet einen Rezeptor auf einer magnetischen Kugel und läßt diesen mit einem Liganden, der wiederum an einer Oberfläche gebunden ist, einen Bindungskomplex bilden. Setzt man die Magnetkugel einem definierten magnetischen Feld aus, so kann man eine definierte Zugkraft an den Bindungskomplex zwischen Kugel und Oberfläche anlegen. Beobachtet man die Position der Magnetkugel in Richtung der Zugkraft, während man diese variiert, bis es zur Trennung des Bindungskomplexes kommt, so kann man die Trennkraft bestimmen, die benötigt wird, um Rezeptor und Ligand auseinanderzureißen. A third method of characterizing molecular forces is based on use microscopic magnetic balls. You bind a receptor on a magnetic Sphere and leaves it with a ligand, which in turn is bound to a surface, form a binding complex. If you place the magnetic ball in a defined magnetic way Field, so you can have a defined traction on the binding complex between the ball and Create surface. If you observe the position of the magnetic ball in the direction of the tensile force, while varying this until the binding complex is separated, one can determine the separation force required to tear the receptor and ligand apart.

Der Nachweis von Trennkräften mit Magnetkugeln leitet sich von einem immunologischen Sandwichtest ab, bei dem die Kräfte nur zur Separation von ungebundenem und gebundenem Ligand eingesetzt werden (Patente US 5445970 und US 5445971, 1995, Rohr). Ein weitergehender Ansatz sieht eine Feinabstimmung der Zugkräfte vor, so daß prinzipiell schwache spezifische Bindungen eines Antigens zu einem Antikörper von starken unterschieden werden können (Patent WO 9936577, 1999, Lee).The detection of separating forces with magnetic balls is based on an immunological Sandwich test from, in which the forces only for the separation of unbound and bound Ligand can be used (patents US 5445970 and US 5445971, 1995, Rohr). On further approach provides for fine-tuning the tensile forces, so that in principle weak specific bonds of an antigen to an antibody are distinguished from strong ones can be (patent WO 9936577, 1999, Lee).

Bei der vierten Methode handelt es sich um eine Kraftmessung mit "optischen Pinzetten" (Optical Tweezers). Die Grundlagen dieser Technik gehen auf Arthur Ashkin zurück. Die Ausübung der Zugkraft wird hier durch die Bewegung eines stark fokussierten Laserstrahls ausgeübt, der einen mikroskopischen Partikel einfangen und bewegen kann.The fourth method is a force measurement with "optical tweezers" (Optical Tweezers). The basics of this technique go back to Arthur Ashkin. The The pulling force is exerted here by the movement of a highly focused laser beam exercised, which can capture and move a microscopic particle.

Eine Anwendung der Optical Tweezers zur Kraftmessung für diagnostische Zwecke wurde durch Kishore beschrieben (Patent US 5620857, 1997, Kishore et al.). An application of the Optical Tweezers for force measurement for diagnostic purposes was developed by Kishore described (patent US 5620857, 1997, Kishore et al.).

Die fünfte Methode beruht auf der Adhäsion eines elastischen Stempels (Conformal Pillar), der mit einer Probesubstanz beschichtet ist zu einer Oberfläche, die mit einer Sonde beschichtet ist. Beim wieder Ablösen des Stempels von der Oberfläche können Trennkräfte gemessen werden, die der Identifikation der Probe dienen (Patent EP 0962759; 1999, Delamarche et al.). Bindungskomplexe anhand von Trennkräften statt an Bindungsenergien zu charakterisieren bringt einige bedeutende Vorteile. Über die Potentialweite der Bindung erhält man einen neuen unabhängigen Parameter zur Charakterisierung der Bindung, der es erlaubt, verschiedene Bindungsmodi, die gleiche Bindungsenergien besitzen, voneinander zu unterscheiden. Dies gilt insbesondere für die Unterscheidung von unspezifischen von spezifischen Bindungen bei Proteinen, sowie für die Diskriminierung zwischen Nukleinsäureduplexen, die vollständig komplementär sind bzw. Fehlpaarungen aufweisen. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß Assoziationsraten und Dissoziationsraten bestimmt werden können, was mit herkömmlichen Bindetests schwierig ist.The fifth method is based on the adhesion of an elastic stamp (conformal pillar), the is coated with a test substance to a surface that is coated with a probe. When the stamp is detached from the surface again, separating forces can be measured, which serve to identify the sample (Patent EP 0962759; 1999, Delamarche et al.). Characterize binding complexes using separation forces instead of binding energies brings some significant advantages. A new one is obtained via the potential range of the bond independent parameters to characterize the binding, which allows different Differentiate binding modes that have the same binding energies. this applies especially for the differentiation of non-specific from specific bindings Proteins, as well as for discrimination between nucleic acid duplexes that are complete are complementary or have mismatches. Another advantage is that Association rates and dissociation rates can be determined with what is conventional Binding testing is difficult.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, das bzw. die einen einfachen Test ermöglicht.An object of the present invention is to provide a method and an apparatus, that enables a simple test.

Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.This object is achieved with the features of the claims.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die beschriebenen Vorteile von Bindetests, die auf der Unterscheidung von Trennkräften beruhen, für ein breites Anwendungsfeld und die kommerzielle Nutzung zugänglich zu machen, was durch den bisherigen Stand der Technik nicht möglich war.Another object of the present invention is to demonstrate the described advantages of binding tests, which are based on the differentiation of separating forces for a wide range of applications and to make commercial use accessible, which is not possible due to the current state of the art was possible.

Die Erfindung hat Vorteile gegenüber herkömmlichen Kraftdiskriminierungsmethoden. Die herkömmlichen Methoden der molekularen Kraftmessung sind Weiterentwicklungen von Methoden, die ursprünglich einem völlig anderen Zweck dienten. Der SFA wurde für Oberflächenkräfte, AFM für die Abbildung von Oberflächen, Magnetkugeln für die Separation von Molekülen und die Conformal Pillar Methode zum Strukturieren von Oberflächen entwickelt.The invention has advantages over conventional force discrimination methods. The conventional methods of molecular force measurement are further developments of Methods that originally served a completely different purpose. The SFA was created for Surface forces, AFM for imaging surfaces, magnetic spheres for separation of molecules and the conformal pillar method for structuring surfaces developed.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist einen Krafttest bereitzustellen, der Bindeeigenschaften eines Bindungskomplexes durch simultanes Testen vieler nicht kooperativer Einzelereignisse testen kann. Another object of the present invention is to provide a strength test that Binding properties of a binding complex by simultaneously testing many non-cooperative ones Can test individual events.

Bei Methoden mit magnetischen Kugeln (magnetic beads) erhält man i.d.R. Trennkräfte, die auf mehreren kooperativen Ereignissen beruhen, da mehrere Bindungskomplexe an einer Kugel befestigt werden.Methods with magnetic beads usually result in Separating forces on Several cooperative events are based on multiple binding complexes on a sphere be attached.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Krafttest, bei dem die Trennung des Bindungskomplexes und die Detektion des Ergebnisses zeitlich getrennt sind (einmalig). Dies resultiert in einem einfachen apparativen Aufbau und einer hohen Flexibilität bei der Auswahl der Detektionsmethode.Another object of the present invention is a strength test in which the separation of the Binding complex and the detection of the result are separated in time (once). This results in a simple apparatus structure and a high flexibility in the selection the detection method.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Krafttest, der keinen komplexen apparativen Aufbau erfordert und dessen Durchführung keine Experten erfordert. Dies ist vergleichbar mit conformal pillar.Another object of the present invention is a strength test that does not require complex equipment Construction requires and its implementation requires no experts. This is comparable to conformal pillar.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Krafttest, der eine hohe parallele Messung vieler verschiedener Proben ermöglicht.Another object of the present invention is a force test that has a high parallel measurement many different samples.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Krafttest, bei dem Zugkräfte realisierbar sind, die weit über dem der Optical Tweezers und dem der magnetischen Kugeln liegen.Another object of the present invention is a force test in which tensile forces can be realized are far above that of optical tweezers and magnetic balls.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist eine schnellere Bindungskinetik der Bindepartner bereitzustellen, als sie bei einem Verfahren wie dem ELISA möglich ist, bei dem die Kinetik durch die Diffusionsgeschwindigkeit der in freier Lösung befindlichen Reaktionspartner limitiert ist.Another object of the present invention is faster binding kinetics of the To provide binding partners than is possible in a method such as the ELISA in which the kinetics by the rate of diffusion of those in free solution Reaction partner is limited.

Im Gegensatz zu den beschriebenen Methoden handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung um eine Technik, die von Anfang an für die Bestimmung von Bindungspotentialen konzeptioniert wurde, und die gegenüber dem Stand der Technik bedeutende Vorteile bietet. Der Surface Force Apparatus von Israelachvili ist nicht für die Analyse von Biomolekülen geeignet. Der apparative Aufbau ist ausgesprochen komplex und teuer und schon deshalb für diagnostische Anwendungen kaum geeignet. Eine parallele Messung verschiedener Substanzen ist nicht beschrieben und dürfte nur schwer zu verwirklichen sein. In contrast to the methods described, the present invention is concerned a technique that has been used from the beginning for the determination of binding potentials was conceived, and which offers significant advantages over the prior art. The Surface Force Apparatus from Israelachvili is not for the analysis of biomolecules suitable. The construction of the equipment is extremely complex and expensive and therefore for diagnostic applications hardly suitable. A parallel measurement of different substances is not described and should be difficult to achieve.

Der Hauptvorteil des Atomic force Microscope ist seine hohe Kraftauflösung. Der komplexe apparative Aufbau führt jedoch zu hohen Anschaffungskosten und auch die Handhabung, die einen Experten erfordert, macht dieses Gerät ungeeignet für eine Nutzung außerhalb der Grundlagenforschung. Eine weitere Einschränkung besteht darin, daß ein statistisch gesichertes Meßergebnis eine Vielzahl von sequentiellen Experimenten erfordert und deshalb mit einem großen Zeitaufwand verbunden ist. Auch hinsichtlich einer der wichtigsten Anforderungen an ein diagnostisches Meßverfahren, der parallelen Messung vieler verschiedener Probesubstanzen, hat das AFM einen inhärenten Nachteil.The main advantage of the Atomic force Microscope is its high force resolution. The complex apparatus construction, however, leads to high acquisition costs and also the handling that requires an expert, making this device unsuitable for use outside of the Basic research. Another limitation is that it is statistically secure Measurement result requires a large number of sequential experiments and therefore with one takes a lot of time. Also with regard to one of the most important requirements a diagnostic measurement method, the parallel measurement of many different test substances, the AFM has an inherent disadvantage.

Der Einsatz von magnetischen Kugeln ist problematisch hinsichtlich der Ausübung von Kräften. Praktikable Partikelgrößen und Feldstärken erlauben keine Kräfte, die imstande wären einen DNA-Duplex auseinander zu ziehen, was diese Methode von dem Einsatz in der molekularen Diagnostik ausschließt. Die selbe Problematik gilt für die Verwendung von Optical Tweezers. Die realisierbaren Zugkräfte liegen hier deutlich unter 100 pN und sind somit viel zu gering, um einen DNA-Duplex testen zu können. The use of magnetic balls is problematic in terms of the application of forces. Practical particle sizes and field strengths do not allow any forces that would be able to DNA duplex pull apart what this method of use in the molecular Excludes diagnostics. The same problem applies to the use of optical tweezers. The realizable tensile forces here are clearly below 100 pN and are therefore far too low to to be able to test a DNA duplex.

Die Conformal-Pillar-Methode verwendet kleine Stempelchen, die mit einem der Bindungspartner beschichtet sind und die gleichzeitig als Lichtleiter zur Detektion der Ablösung des Stempelchens von der zweiten Oberfläche dienen. Die Miniaturisierung der Stempelchen ist somit limitiert, da sie mindestens die Abmessung der Wellenlänge des verwendeten Lichtes haben müssen. Ein weiterer Nachteil der Conformal-Pillar besteht darin, daß das Zerreißen der Bindungskomplexe nicht unabhängig, d. h. kooperativ erfolgt, was zu einer Verschlechterung der Meßstatistik führt.The conformal pillar method uses small stamps with one of the Binding partners are coated and at the same time as light guides for detection of detachment serve the stamp from the second surface. The miniaturization of the stamp is thus limited because it is at least the dimension of the wavelength of the light used need to have. Another disadvantage of the conformal pillar is that the tearing of the Binding complexes are not independent, i. H. is done cooperatively, which worsens the Measurement statistics leads.

Die vorliegende Erfindung vereinigt mehrere Eigenschaften auf sich, die in dieser Weise keine herkömmliche Methode aufweisen kann:
Ein einfacher und günstiger apparativer Aufbau,
eine einfache Handhabung,
eine hohe Kraftauflösung bei simultaner Messung einer Vielzahl von Bindeereignissen,
nicht limitierte Zugkraft,
nicht kooperatives simultanes Testen vieler Bindungskomplexe.The present invention combines several properties which no conventional method can have in this way:
A simple and inexpensive apparatus structure,
easy handling,
a high force resolution with simultaneous measurement of a large number of binding events,
unlimited traction,
non-cooperative simultaneous testing of many binding complexes.

Die Möglichkeit, viele gleichartige Probenkomplexe während eines Meßvorganges gleichzeitig zu testen, wobei das Ergebnis für jeden Komplex unabhängig von den anderen Komplexen ausfällt, also nicht-kooperativ ist, ist als einer der Hauptvorteile der Erfindung anzusehen. Bei den beschriebenen Methoden mit dem conformal pillar oder mit magnetischen Kugeln handelt es sich stets um kooperative Ereignisse, da eine Trennung einiger der Komplexe sich auf die Trennwahrscheinlichkeit der verbleibenden Komplexe auswirkt. Die Information über die Einzelereignisse geht dabei verloren.The possibility of using many similar sample complexes at the same time during a measurement process to test, with the result for each complex independent of the other complexes fails, i.e. is not cooperative, is to be regarded as one of the main advantages of the invention. at the methods described with the conformal pillar or with magnetic balls are always cooperative events, as a separation of some of the complexes affects the Probability of separation of the remaining complexes affects. The information about the Individual events are lost.

Die Erfindung wir nachstehend anhand von Beispielen und der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigenThe invention is explained in more detail below with the aid of examples and the drawings. It demonstrate

Fig. 1 ein vereinfachtes Bindungspotential eines Bindungskomplexes, Fig. 1 is a simplified potential binding of a binding complex,

Fig. 2 das Prinzip des differentiellen Krafttest. Nach der Ausübung einer Zugkraft auf das Konjugat aus B1 und B2 kommt es zum Zerreißen von B1, falls F₁ < F₂, oder zum Zerreißen von B2, falls F₁ < F₂, Fig. 2 shows the principle of the differential force test. After exerting a tensile force on the conjugate from B1 and B2, B1 breaks if F ₁ <F ₂ , or B2 breaks if F ₁ <F ₂ ,

Fig. 3 die Unterscheidung zwischen unspezifischen Wechselwirkungen mit einem Körper und spezifischen Wechselwirkungen mit einem Bindungspartner, Fig. 3 shows the distinction between non-specific interactions with a body and specific interactions with a binding partner,

Fig. 4 die Unterscheidung eines vollständig gepaarten Nukleinsäureduplexes von einem unvollständig gepaartem, Fig. 4 shows the differentiation of a fully paired nucleic acid duplex of an incompletely mated,

Fig. 5 die simultane Ausführung eines vergleichenden Krafttests an fünf unabhängigen, gleichartigen Bindungskomplexen im Sandwichformat. Die Probe verfügt in diesem Fall über die Bindungspartner BP2 und BP3. Die Probe ist mit einer Markierung versehen. Da F₁ < F₂ ist, zerreißen überwiegend die Bindungskomplexe B2, und Fig. 5, the simultaneous execution of a comparative strength tests on five independent, similar binding complexes in the sandwich format. In this case, the sample has the binding partners BP2 and BP3. The sample is marked. Since F ₁ <F ₂ , the binding complexes B2, and tend to tear

Fig. 6 die simultane Ausführung eines vergleichenden Krafttests an fünf unabhängigen, gleichartigen Bindungskomplexen im Captureformat. Die Probe verfügt in diesem Fall an die Oberfläche 1 gebunden. Das Konjugat aus R₁ und R₂ ist mit einer Markierung versehen. Da F₁ < F₂ ist, zerreißen überwiegend die Bindungskomplexe B2.
Fig. 6, the simultaneous execution of a comparative strength tests on five independent, similar binding complexes in the capture format. In this case the sample is bound to the surface 1. The conjugate from R ₁ and R ₂ is provided with a label. Since F ₁ <F ₂ , the binding complexes B2 mostly tear.

1 Erster Bindungspartner BP1
2 Zweiter Bindungspartner BP2
3 Dritter Bindungspartner BP3
4 Vierter Bindungspartner BP4
5 Bindungskomplex 1 (B1)
6 Bindungskomplex 2 (B2)
7 Konjugat aus B1 und B2
8 Konjugat des zweiten Bindungspartners BP2 und des dritten Bindungspartners BP3
9 Aufhängung des ersten Bindungspartners BP1
10 Aufhängung des vierten Bindungspartners BP4
11 Verbindung des zweiten Bindungspartners BP2 und des dritten Bindungspartners BP3
12 Vektor der Zugeschwindigkeit
13 Oberfläche 1
14 Oberfläche 2
15 Probe
16 Probe mit dem zweiten Bindungspartner BP2 und dem dritten Bindungspartner BP3
17 Aufhängung der Probe
18 Markierung
1 First binding partner BP1
2 Second binding partner BP2
3 Third loyalty partner BP3
4 Fourth attachment partner BP4
5 binding complex 1 (B1)
6 binding complex 2 (B2)
7 conjugate from B1 and B2
8 Conjugate of the second binding partner BP2 and the third binding partner BP3
9 Suspension of the first binding partner BP1
10 Suspension of the fourth binding partner BP4
11 Connection of the second binding partner BP2 and the third binding partner BP3
12 vector of the speed
13 surface 1
14 surface 2
15 sample
16 sample with the second binding partner BP2 and the third binding partner BP3
17 Suspension of the sample
18 mark

Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Methode, die gegenüber den herkömmlichen Krafttests ein gänzlich unterschiedliches Prinzip der Bestimmung von Trennkräften aufweist.The present invention is a method which is compared to the conventional strength tests a completely different principle of determining Has separating forces.

Ein differentieller Krafttest besteht aus zwei Bindungskomplexen, die miteinander verkettet sind. Beim Anlegen einer Kraft, die über den Trennkräften der beiden Bindungskomplexe liegt, kommt es zum Zerreißen einer der beiden Bindungskomplexe. Der Bindungskomplex mit der höheren Trennkraft bleibt dabei intakt. Kennt man die Trennkraft eines der beiden Bindungskomplexe, so kann man auf diese Weise darauf schließen, ob die Trennkraft des zweiten Bindungskomplexes größer oder kleiner als die des ersten ist. Der differentielle Krafttest kann für eine Vielzahl von diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Die Erfindung eignet sich insbesondere als Methode zum diagnostischen Nachweis oder zur Charakterisierung der Bindeeigenschaften von biochemischen Molekülen bzw. Molekülen mit einem hohen Grad an spezifischer molekularer Erkennung.A differential strength test consists of two binding complexes that are linked together. When a force is applied that lies above the separation forces of the two binding complexes it to tear one of the two binding complexes. The binding complex with the higher one The separation force remains intact. If one knows the separation force of one of the two binding complexes, so can be concluded in this way whether the separation force of the second binding complex is larger or smaller than that of the first. The differential force test can be used for a variety of diagnostic applications are used. The invention is particularly suitable as Method for the diagnostic detection or characterization of the binding properties of biochemical molecules or molecules with a high degree of specific molecular Recognition.

Bei der vorliegenden Erfindung erfolgt die Charakterisierung von Bindeeigenschaften von Bindungspartnern auf Basis der Trennkraft, die für das Trennen ihres Bindungskomplexes notwendig ist.In the present invention, binding properties are characterized by Binding partners based on the separating force required for separating their binding complex necessary is.

Zur Charakterisierung der Trennkraft F₁, die für die Trennung eines Bindungskomplexes B1 (5) aufgewendet werden muß, durch den Vergleich mit der bekannten Trennkraft F₂, die zur Trennung eines zweiten Bindungskomplexes B2 (6) aufgewendet werden muß. Beide Bindungskomplexe sind zu einem Konjugat verbunden, an dessen beiden Seiten man eine Zugkraft anlegt. Hervorzuheben ist, daß die Zugkraft auf die beiden seriell angeordneten Bindungskomplexe gleich groß ist. Überschreitet die Zugkraft einen Wert, der über dem einer der Trennkräfte (F₁ oder F₂) liegt, so kommt es zur Trennung der Bindepartner desjenigen Bindungskomplexes, dessen Trennkraft geringer ist. Kommt es z. B. zur Trennung des Bindungskomplexes B1, so folgt daraus, daß F₁ < F₂ war. Wurde B2 getrennt, so folgt, daß F₁ < F₂ war. Fig. 2 zeigt das Prinzip des Krafttests. To characterize the separation force F ₁ , which must be used for the separation of a binding complex B1 ( 5 ), by comparison with the known separation force F ₂ , which must be used for the separation of a second binding complex B2 ( 6 ). Both binding complexes are combined to form a conjugate, on the two sides of which a tensile force is applied. It should be emphasized that the tensile force on the two serially arranged binding complexes is the same. If the tensile force exceeds a value that is greater than one of the separating forces (F ₁ or F ₂ ), the binding partners of the binding complex whose separating force is lower are separated. Is it z. B. to separate the binding complex B1, it follows that F ₁ <F ₂ . If B2 was separated, it follows that F ₁ <F ₂ . Fig. 2 shows the principle of the force test.

Bei dem Bindungskomplex B1 (5) handelt es sich in der Regel um einen Probenkomplex, d. h. einen Bindungskomplex, dessen Bindungseigenschaften charakterisiert werden sollen oder bei dem ein Bindungspartner über eine bekannte Bindeeigenschaft mit einem anderen Bindungspartner nachgewiesen werden soll. Es kann sich jedoch auch um eine undefinierte, unspezifische Wechselwirkung zwischen zwei Bindungspartnern oder zwischen einem Bindungspartner und einem Körper handeln.The binding complex B1 ( 5 ) is generally a sample complex, ie a binding complex whose binding properties are to be characterized or in which a binding partner is to be detected by means of a known binding property with another binding partner. However, it can also be an undefined, non-specific interaction between two binding partners or between a binding partner and a body.

Bei B2 (6) handelt es sich i.d.R. um einen Referenzkomplex, d. h. um einem Bindungskomplex, dessen Bindeeigenschaften, insbesondere eine Trennkraft, bekannt sind.B2 ( 6 ) is usually a reference complex, ie a binding complex whose binding properties, in particular a separating force, are known.

Bei dem vorhergehend beschriebenen Prinzip handelt es sich nicht um eine "Messung" im engeren Sinne, sondern vielmehr um ein "Lehren". Nach der Deutschen Industrienorm beschreibt der Begriff "Lehren" ein Prüfverfahren, bei dem der zu prüfende Gegenstand mit der einer bekannten Größe eines anderen Gegenstandes verglichen wird. In diesem Sinne wird auch bei der vorliegenden Erfindung die Trennkraft des Bindungskomplexes B1 mit einer zweiten bekannten Trennkraft verglichen. Beim "Messen" handelt es sich hingegen um ein Prüfverfahren, bei dem die zu bestimmende Größe einen konkreten Zahlenwert auf der Meßskala ergibt. Dies entspricht dem Sachverhalt einer Kraftmessung mit dem AFM oder mit einer der anderen Methoden des Standes der Technik.The principle described above is not a "measurement" in the narrower sense, but rather a "teaching". According to the German industry standard the term "teaching" means a test procedure in which the object to be tested matches the one known size of another object is compared. With this in mind, of the present invention the separation force of the binding complex B1 with a second known separation force compared. In contrast, "measuring" is a Test method in which the quantity to be determined has a concrete numerical value on the measuring scale results. This corresponds to the situation of a force measurement with the AFM or with one of the other methods of the prior art.

Die Besonderheit der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß jedem zu testenden Probenkomplex eine Kraftlehre im nanoskopischen Maßstab, der Referenzkomplex, zugeordnet ist. Jeder Probenkomplex wird unabhängig getestet, das Ergebnis vieler Einzeltest ergibt schließlich das Meßergebnis. Eine Besonderheit, die aus diesem Prinzip folgt, ist die Möglichkeit die Trennung der Bindungskomplexe und die Detektion zeitlich getrennt ausführen zu können. Die Erfindung berücksichtigt insbesondere die thermische Anregung. Aus dem anfangs erörterten Modell der molekularen Wechselwirkung (Fig. 1) ist es ersichtlich, daß die Trennkraft, die benötigt wird, um den Bindungskomplex B1 bzw. einen weiteren Bindungskomplex B2 zu trennen, variiert, da die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern einer thermischen Anregung unterliegt. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung der Vergleich der beiden Bindungspaare vorzugsweise mehrere Male durchgeführt, um einen statistisch gesicherten Mittelwert, die mittlere Trennkraft, bilden zu können, der besagt ob F₁ < F₂ oder F₁ < F₂ ist. Dies geschieht, indem man viele gleichartige Bindungskomplexe gleichzeitig der gleichen Trennkraft aussetzt, und bestimmt, wieviel der Bindungspartner von B1 und wieviel von B2 getrennt wurden. The special feature of the present invention lies in the fact that each sample complex to be tested is assigned a force gauge on a nanoscopic scale, the reference complex. Each sample complex is tested independently, the result of many individual tests ultimately results in the measurement result. A special feature that follows from this principle is the possibility of being able to carry out the separation of the binding complexes and the detection at different times. The invention particularly takes thermal excitation into account. From the model of molecular interaction ( FIG. 1) discussed at the beginning, it can be seen that the separation force required to separate the binding complex B1 or a further binding complex B2 varies, since the interaction between the binding partners is subject to thermal excitation , Therefore, according to the present invention, the comparison of the two pairs of bonds is preferably carried out several times in order to be able to form a statistically reliable mean, the average separating force, which states whether F ₁ <F ₂ or F ₁ <F ₂ . This is done by exposing many similar binding complexes to the same separation force at the same time and determining how much of the binding partner of B1 and how much of B2 have been separated.

Die Erfindung berücksichtigt zusätzlich oder alternativ die Kraftratenabhängigkeit. Ein wichtiger Parameter für die Ausführung eines differentiellen Krafttests ist die Rate der angelegten Zugkraft, da die Trennkräfte F₁ und F₂ bei verschiedenen Kraftraten stark variieren können. Um einen differentiellen Krafttest nach dem oben beschriebenen Prinzip reproduzierbar wiederholen zu können ist darauf zu achten, mit nur einer bestimmten Kraftrate zu arbeiten.The invention additionally or alternatively takes into account the force rate dependency. An important parameter for the execution of a differential force test is the rate of the tensile force applied, since the separating forces F ₁ and F ₂ can vary greatly at different force rates. In order to be able to repeat a differential force test according to the principle described above, it is important to work with only a certain force rate.

Die Kraftrate ist bestimmt durch die Geschwindigkeit der Zugkraft und die Elastizität des Konjugats der beiden Bindungskomplexe samt der Aufhängung des ersten Bindungspartners BP1 und des vierten Bindungspartners BP4.The rate of force is determined by the speed of the tensile force and the elasticity of the Conjugate of the two binding complexes including the suspension of the first binding partner BP1 and the fourth binding partner BP4.

Je nach Anwendung des differentiellen Krafttests kann man die Kraftrate auch bewußt variieren, um eine bestimmte Information über einen Bindungskomplex zu erhalten.Depending on the application of the differential force test, you can consciously vary the force rate, to get certain information about a binding complex.

Application examples for the invention 1. Differentiation of binding modes 1.1. Differentiation between specific and non-specific interactions

Ein zentrales Problem von Bindetests, bei denen ein erster Bindungspartner auf einer Oberfläche immobilisiert wird, ist das unspezifische Hintergrundsignal. Das unspezifische Hintergrundsignal wird durch Moleküle des zweiten Bindungspartner verursacht, die in freier Lösung zugegeben wurden und unspezifisch an die Oberfläche gebunden haben. Es kommt somit zu einer Überlagerung des spezifischen Signals, derjenigen Moleküle des zweiten Bindepartners, die spezifisch an den ersten Bindungspartner gebunden haben. Da unspezifische und spezifische Wechselwirkungen mit ähnlich großen Bindungsenergien binden können, ist es schwierig, sie durch einen Bindetest, der auf der Diskriminierung von Bindeenergien beruht, zu unterscheiden.A central problem of binding tests, in which a first binding partner on a surface is immobilized is the non-specific background signal. The unspecific Background signal is caused by molecules of the second binding partner that are in free Solution were added and bound non-specifically to the surface. So it comes to a superposition of the specific signal, those molecules of the second binding partner, that have specifically bound to the first binding partner. Because unspecific and specific Can bind interactions with similarly large binding energies, it is difficult to to be distinguished by a binding test based on the discrimination of binding energies.

Fig. 3 zeigt einen differentiellen Krafttest zur Unterscheidung von unspezifischer und spezifischer Bindung. Das Konjugat aus BP2 und BP3 bindet unspezifisch an der Oberfläche und spezifisch mit dem an der Oberfläche immobilisierten Bindungspartner BP1, mit dem er den Bindungskomplex B1 ausbildet. BP4 bildet mit BP3 einen Bindungskomplex B2. Für eine bestimmte Kraftrate ist die Trennkraft F₂ des Bindepaars B2 größer als die unspezifische Trennkraft des Komplexes zur Oberfläche. Die spezifische Trennkraft F₁ von BP2 und BP1 ist jedoch größer als F₂. Nach dem Anlegen der Zugkraft kommt es deshalb zur Abtrennung des unspezifisch gebundenen Komplexes, jedoch nicht des spezifisch gebundenen. Fig. 3 shows a differential force test to differentiate between non-specific and specific binding. The conjugate of BP2 and BP3 binds non-specifically on the surface and specifically with the binding partner BP1 immobilized on the surface, with which it forms the binding complex B1. BP4 forms a binding complex B2 with BP3. For a certain force rate, the separation force F _{2 of} the binding pair B2 is greater than the non-specific separation force of the complex to the surface. However, the specific separation force F ₁ of BP2 and BP1 is greater than F ₂ . After the tensile force is applied, the unspecifically bound complex is separated, but not the specifically bound one.

1.2. Distinguishing weaker specific bonds from stronger specific bonds Example: Differentiation of a single base mismatch in a nucleic acid duplex from a complete mating

Ein wesentliches Problem bei der Unterscheidung von Nukleinsäuresequenzvarianten durch eine reverse Southern-Hybridisierung besteht darin, Nukleinsäureprobemoleküle, die an die immobilisierte Sonde gebunden haben, dahingehend zu unterscheiden, ob sie vollständig komplementär gebunden haben oder eine Einzelbasenfehlpaarung aufweisen. Bei einem Test mit nur einer bestimmten Sonde von ca. 15-25 Basenpaaren können Einzelbasenfehlpaarungen von vollständigen Paarungen auch aufgrund der Bindungsenergien unterschieden werden. Hierzu führt man die Hybridisierung nahe der Schmelztemperatur des vollständig gepaarten Komplexes durch. Unter diesen Bedingungen ist die Fehlpaarung instabil. Bei einer Anordnung mehrerer Sonden verschiedener Sequenz, wie es bei einer reversen Hybridisierung meist der Fall ist, besteht diese Möglichkeit jedoch nicht.A major problem in the differentiation of nucleic acid sequence variants by a reverse southern hybridization consists of nucleic acid sample molecules attached to the immobilized probe bound to distinguish whether it is complete have complementary bound or have a single base mismatch. During a test with only a certain probe of approx. 15-25 base pairs can single base mismatches of complete pairings can also be distinguished based on the binding energies. For this hybridization is carried out close to the melting temperature of the fully paired complex by. Under these conditions, the mismatch is unstable. When arranging several Probes of different sequences, as is usually the case with reverse hybridization, however, this possibility does not exist.

Fig. 4 zeigt eine Unterscheidung einer vollständigen Basenpaarung von einer Einzelbasenfehlpaarung. FIG. 4 shows a distinction between a complete base pairing and a single base mismatch.

2. Determination of dissociation rates

Dissoziationsraten (off rates) zweier Bindungspartner eines Probenkomplexes können bestimmt werden, wenn man einen Probenkomplex gegen mehrere Referenzkomplexe mit verschiedenen Trennkräften bei verschiedenen Kraftraten testet.Dissociation rates (off rates) of two binding partners of a sample complex can be determined when comparing a sample complex against several reference complexes with different Separation forces tested at different force rates.

Die Ausführungen der Erfindung erfolgt mit folgenden Mitteln:The invention is implemented using the following means:

1. Exercise of strength

Das Ausüben von Zugkräften auf den Konjugat der beiden Bindungskomplexe B1 und B2 kann auf sehr unterschiedliche Weise bewerkstelligt werden, wobei es nicht darauf ankommt von welcher Natur die angelegte Kraft ist.The application of tensile forces on the conjugate of the two binding complexes B1 and B2 can are accomplished in very different ways, not depending on what nature the applied force is.

Bei der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Zugkraft um einen mechanischen, makroskopischen Zug. Hierzu wird das Konjugat aus B1 und B2 zwischen zwei Körpern befestigt und diese voneinander wegbewegt, bis es zur Trennung des Komplexes kommt. Die Körper können nanoskopisch klein sein, wie es etwa bei dem Cantilever eines AFM's der Fall ist. Es kann sich jedoch ebenso um makroskopisch große Oberflächen handeln. In the preferred embodiment, the tensile force is a mechanical, macroscopic train. For this purpose, the conjugate from B1 and B2 between two bodies attached and moved these away from each other until the complex is separated. The Bodies can be nanoscopic, as is the case with the cantilever of an AFM. However, they can also be macroscopically large surfaces.

Im zweiten Fall werden die Zugkräfte durch magnetische Partikel hervorgerufen, die am Konjugat (7) aus B1 und B2 befestigt sind und auf die ein magnetisches Feld einwirkt. Es kann sich um zwei verschiedene Partikel handeln, die jeweils an einem Ende des Komplexes befestigt sind und die in einem Fall diamagnetische, im anderen Fall paramagnetische Eigenschaften haben.In the second case, the tensile forces are caused by magnetic particles which are attached to the conjugate ( 7 ) from B1 and B2 and on which a magnetic field acts. They can be two different particles, each attached to one end of the complex and having diamagnetic properties in one case and paramagnetic in the other.

In einem dritten Fall nutzt man die Möglichkeit das Konjugat aus B1 und B2 mit großen Molekülen oder Polymeren zu verbinden und mittels deren Widerstand in einem Flüssigkeitsstrom Zugkräfte aufzubauen. Dynamische Zugkräfte lassen sich aufbauen, wenn das Konjugat aus B1 und B2 zwischen Partikel gebunden wird, in die sich Schallwellen, insbesondere Ultraschall einkoppeln lassen.In a third case, one uses the possibility of using the conjugate from B1 and B2 with large Connect molecules or polymers and their resistance in one Liquid flow to build tensile forces. Dynamic traction can be built up if that B1 and B2 conjugate is bound between particles into which sound waves, in particular let ultrasound couple in.

In einem vierten Fall nutzt man den Einfluß eines elektrischen Feldes auf geladene Moleküle, wie dies etwa bei einem elektrophoretischen Verfahren der Fall ist. Das Konjugat aus B1 und B2 wird hierzu zumindest an einem Ende mit einem geladenen Molekül, vorzugsweise einem vielfach geladenen Polymer verbunden. Werden beide Enden mit einem geladenen Molekül verknüpft, so handelt es sich um gegensätzlich geladene Moleküle.In a fourth case, we use the influence of an electric field on charged molecules, as is the case with an electrophoretic process. The conjugate from B1 and B2 is at least at one end with a charged molecule, preferably one multiply charged polymer linked. Both ends are loaded with a molecule linked, they are oppositely charged molecules.

In einem fünften Fall erfolgt das Aufbringen der Kraft durch eine Verkürzung eines Polymers, das die Aufhängungen der Bindungspartner BP1 und BP2 bzw. der Verbindung zwischen BP2 und BP3 bildet. Die Verkürzung beruht dabei auf einer Konformationsänderung des Polymers, die durch eine Veränderung des chemischen Milieus, z. B. den pH-Wert oder einer Salzkonzentration verursacht wird.In a fifth case, the force is applied by shortening a polymer, that the suspensions of the binding partners BP1 and BP2 or the connection between BP2 and forms BP3. The shortening is based on a change in the conformation of the polymer, caused by a change in the chemical environment, e.g. B. the pH or one Salt concentration is caused.

2. Variation of the force rate

Die Kraftrate, mit der an einem Molekül gezogen wird, wird durch zwei Parameter bestimmt. Zum einen ist es die Federkonstante der Aufhängungen zwischen den Bindungspartnern BP1 und BP4 bzw. die Federkonstante der Verbindung zwischen BP2 und BP3, zum zweiten ist es die Ziehgeschwindigkeit. Um die Kraftrate zu variieren, wählt man entweder andere Federkonstante oder eine andere Ziehgeschwindigkeit.The rate of force with which a molecule is pulled is determined by two parameters. Firstly, it is the spring constant of the suspensions between the binding partners BP1 and BP4 or the spring constant of the connection between BP2 and BP3, the second is that Drawing speed. To vary the force rate, either choose a different spring constant or another pulling speed.

Die bevorzugte Ausführung zur Variation der Federkonstante einer Aufhängung oder eines Konjugats erfolgt durch die Variation der Länge eines Polymers, das die Aufhängung bzw. die Verbindung bildet. The preferred embodiment for varying the spring constant of a suspension or one Conjugate is done by varying the length of a polymer, the suspension or the Connection forms.

3. Detection

Die Detektion hat den Zweck zu bestimmen, welche der beiden Bindungskomplexe eines Konjugats aus B1 und B2 nach dem Anlegen einer Zugkraft getrennt wurden. Dies kann indirekt oder direkt geschehen.The purpose of the detection is to determine which of the two binding complexes one has Conjugates from B1 and B2 were separated after applying a tensile force. This can be indirect or happen directly.

Ein indirekter Nachweis richtet sich auf einen freien Bindungspartner BP, der vor dem Anlegen der Zugkraft Teil eines Bindungskomplexes B war. Dies erreicht man durch Zugabe einer Sonde, die gegen den freien Bindungspartner gerichtet ist. Kommt es z. B. zur Trennung des Bindungskomplexes B1, so können BP1 oder/und BP2 nachgewiesen werden.Indirect proof is directed to a free binding partner BP, which is before the application the tensile force was part of a binding complex B. This is achieved by adding a probe which is directed against the free binding partner. Is it z. B. to separate the Binding complex B1, so BP1 and / or BP2 can be detected.

Beim direkten Nachweis weist man nach, in welche der beiden Zugrichtungen das Konjugat der Bindungspartner BP1 und BP2 nach dem Zerreißen hin verlagert wurde. Zu diesem Zweck wird das Konjugat aus BP1 und BP2 mit einer Markierung versehen.Direct detection shows which of the two pulling directions the conjugate of Binding partner BP1 and BP2 was shifted after tearing. For this purpose label the conjugate of BP1 and BP2.

Zum Nachweis der Sonde der indirekten oder der Markierung der direkten Detektion können verschiedenste Methoden des Standes der Technik herangezogen werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Markierung um ein fluoreszierendes Molekül. Hier kann auch FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zum Einsatz kommen, indem man die beiden Bindungspartner eines Bindungskomplexes mit zwei verschiedenen Fluorophoren versieht, zwischen denen ein Resonanztransfer stattfindet. Bei der Trennung der beiden Fluorophore geht das Fluoreszenzsignal verloren. Eine weitere Abwandlung besteht darin, einen der beiden Bindungspartner eines Bindungskomplexes mit einem Fluorophor zu versehen, den anderen mit einem Molekül, das die Fluoreszenz des Fluorophor auslöscht (quenching). Beim Trennen der Bindungspartner wird die Auslöschung des Fluorophors aufgehoben, es kommt also zu einer Verminderung des Signals. Als bevorzugte Fluorophore kommen nanoskalige, kolloidale Halbleiterpartikel (quantum dots) zur Anwendung. Weitere Möglichkeiten sind die radioaktive Markierung, die Markierung mit einem Affinitätsmarker, an dem ein Enzym bindet, welches das Signal verstärkt, die Chemolumineszenz, elektrochemische Markierungen oder die Massenspektroskopie.To detect the probe the indirect or the label of the direct detection can Various methods of the prior art can be used. With the preferred In one embodiment, the label is a fluorescent molecule. Here FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) can also be used by the two binding partners of a binding complex with two different fluorophores provides between which a resonance transfer takes place. When the two separated Fluorophores lose the fluorescence signal. Another variation is one to provide the two binding partners of a binding complex with a fluorophore, the another with a molecule that quenches the fluorescence of the fluorophore. At the If the binding partners are separated, the extinction of the fluorophore is canceled, so it happens to decrease the signal. The preferred fluorophores are nanoscale, colloidal semiconductor particles (quantum dots) for use. Other options are radioactive labeling, labeling with an affinity marker to which an enzyme binds, which amplifies the signal, the chemiluminescence, electrochemical labels or the Mass spectroscopy.

4. Samples

Der hier beschriebene differentielle Krafttest kann für ein weites Spektrum von Proben eingesetzt werden. Bevorzugt handelt es sich dabei um Proteine, im allgemeinen Antikörper, Antigene, Haptene oder um natürliche und künstliche Nukleinsäuren. Es kann sich jedoch auch um Viren, Phagen, Zellbestandteile oder ganze Zellen handeln. Desweiteren kommen auch komplexbildende Substanzen wie Chelatoren in Betracht.The differential force test described here can be used for a wide range of samples be used. These are preferably proteins, generally antibodies, Antigens, haptens or around natural and artificial nucleic acids. However, it can also be Viruses, phages, cell components or whole cells act. Furthermore come too complex-forming substances such as chelators into consideration.

5. Reference complexes

Ein Bindungspartner eines Referenzkomplexes kann selbst Bestandteil einer Probe sein, wie es beim Sandwichformat der Fall ist. Ein Referenzkomplex kann im Prinzip aus den gleichen Bestandteilen aufgebaut sein, wie ein Probenkomplex.A binding partner of a reference complex can itself be part of a sample, like it is the case with sandwich format. In principle, a reference complex can consist of the same Components be built up, like a sample complex.

6. Sequence of chaining

Die Verbindung der Bindungspartner BP2 (2) und BP3 (3) zu einem Konjugat (8) kann erfolgen, bevor es zur Wechselwirkung von BP2 und BP3 mit BP1 oder BP4 kommt. Alternativ kann das Konjugat aus BP2 und BP3 auch erst gebildet werden, nachdem eine Interaktion mit BP1 und BP4 eingetreten ist.The binding partners BP2 ( 2 ) and BP3 ( 3 ) can be combined to form a conjugate ( 8 ) before the interaction of BP2 and BP3 with BP1 or BP4 occurs. Alternatively, the conjugate of BP2 and BP3 can only be formed after an interaction with BP1 and BP4 has occurred.

Preferred embodiment of the invention

Bei der ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, bei der das Konjugat aus B1 und B2 zwischen zwei Oberflächen befestigt wird, wird die Zugkraft durch einen mechanisch, makroskopischen Zug angelegt, die Detektion erfolgt direkt über eine Markierung.In the first preferred embodiment of the invention, in which the conjugate from B1 and B2 is attached between two surfaces, the tensile force is controlled by a mechanical, macroscopic train applied, the detection takes place directly via a marker.

Diese Ausführungsform wird hier an den beiden Formaten erörtert, die sich auch durch alle anderen Ausführungsformen verwirklichen lassen, dem Sandwich- und dem Capture-Format:This embodiment is discussed here using the two formats, which are also common to all let other embodiments be realized, the sandwich and the capture format:

Beim Sandwichformat des differentiellen Krafttests (Fig. 5) handelt es sich bei dem Konjugat aus BP2 und BP3 um die Probe (15). Ein Bindungspartner BP2 (2) der Probe ist spezifisch für einen Bindungspartner BP1 (1), der auf der ersten Oberfläche (13) gebunden ist. Ein weiterer Bindungspartner BP3 (3) ist spezifisch für einen den Bindungspartner BP4 (4), der auf der zweiten Oberfläche (14) gebunden ist. Bringt man die beiden Oberflächen in Kontakt, so kommt es zur Interaktion der Probe mit BP1 und BP4, wodurch die Oberflächen (13, 14) mittels der entstandenen Bindungskomplexe B1 und B2 verknüpft werden. Zieht man die Oberflächen nun auseinander, so bricht bevorzugt jener der beiden Bindungskomplexe, der die geringere Trennkraft aufweist. Die Probe haftet derjenigen Oberfläche an, zu der noch ein intakter Bindungskomplex besteht.In the sandwich format of the differential force test ( FIG. 5), the conjugate of BP2 and BP3 is the sample ( 15 ). A binding partner BP2 ( 2 ) of the sample is specific for a binding partner BP1 ( 1 ) which is bound on the first surface ( 13 ). Another binding partner BP3 ( 3 ) is specific for the binding partner BP4 ( 4 ), which is bound on the second surface ( 14 ). If the two surfaces are brought into contact, the sample interacts with BP1 and BP4, whereby the surfaces ( 13 , 14 ) are linked by means of the resulting binding complexes B1 and B2. If the surfaces are now pulled apart, then that of the two binding complexes that has the lower separation force tends to break. The sample adheres to the surface to which an intact binding complex still exists.

Beim Captureformat des differentiellen Krafttests (Fig. 6) wird die Probe (15) auf der ersten Oberfläche (13) immobilisiert. Die Probe verfügt über den ersten Bindungspartner BP1 (1), der spezifisch für den zweiten Bindungspartner BP2 (2) ist. BP2 ist mit BP3 (3) zu einem Konjugat verbunden, wobei BP3 einen vierten Bindungspartner BP4 bindet, der auf der zweiten Oberfläche (14) gebunden ist.In the capture format of the differential force test ( FIG. 6), the sample ( 15 ) is immobilized on the first surface ( 13 ). The sample has the first binding partner BP1 ( 1 ), which is specific for the second binding partner BP2 ( 2 ). BP2 is linked to BP3 ( 3 ) to form a conjugate, with BP3 binding a fourth binding partner BP4, which is bound on the second surface ( 14 ).

Man bringt beide Oberflächen in Kontakt, wodurch es zur Interaktion von BP1 mit BP2 kommt. Zieht man die Oberflächen nun auseinander, so bricht bevorzugt der schwächere der beiden Komplexe, d. h. entweder der Komplex aus BP1 mit BP2 oder der Komplex aus BP3 mit BP4. Die Verteilung des Konjugats aus BP2 und BP3 zwischen den beiden Oberflächen wird bestimmt und gibt Aufschluß darüber, welcher der beiden Komplexe der stabilere war.Both surfaces are brought into contact, which causes BP1 to interact with BP2. If you pull the surfaces apart, the weaker of the two tends to break Complexes, d. H. either the complex of BP1 with BP2 or the complex of BP3 with BP4. The distribution of the conjugate from BP2 and BP3 between the two surfaces will determines and gives information about which of the two complexes was the more stable.

Die Anbindung der Probe (15) im Captureformat kann kovalent oder über schwache Wechselwirkungen erfolgen.The connection of the sample ( 15 ) in the capture format can take place covalently or via weak interactions.

Die bevorzugte Vorrichtung zur Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht aus:
The preferred device for carrying out the present invention consists of:

a) A consumable that consists of two surfaces for binding the reactants consists
b) The binding partners that are bound on the surfaces
c) A device to bring the two surfaces into contact and close them again separate after the molecular interaction of the binding partners has occurred
d) A label of the conjugate of the binding partners BP2 and BP3, based on which n Distribution between the two surfaces can be determined
e) A device for detecting the marking

definitions

Aufhängung: Verbindung eines Bindungspartners mit einer Halteeinrichtung.
Bindeeigenschaften: Verhältnis zweier Bindungspartner zueinander wie: keine Bindung; Bindungsaffinität; Bindungsmodus.
Bindungskomplex: Komplex aus mehreren Bindepartnern; Molekülen oder Körpern oder Körpern und Molekülen, die miteinander in Wechselwirkungen stehen und die durch eine Zugkraft getrennt werden können.
Bindungspartner: Bestandteil eines Bindungskomplexes, der durch Zugkräfte von einem anderen Bindungspartner getrennt werden kann. Bindungspartner können spezifisch oder unspezifisch miteinander wechselwirken. Die Wechselwirkung ist nicht-kovalent.
Biomoleküle: Moleküle, die aus biologischen Systemen gewonnen werden bzw. künstliche Moleküle, die solchen aus biologischen Systemen gleichen.
Konjugat: Verbindung von zwei Bindungspartnern.
Verbindung: Verbindungselement eines Konjugats.
Referenzkomplex: Bindungskomplex mit einer bekannten Trennkraft.
Ligand: Einer der Bindungspartner eines spezifischen Bindungskomplexes.
Mittlere Trennkraft: Arithmetrisches Mittel der Trennkräfte mehrerer gleichartiger Bindungskomplexe, deren individuelle Trennkraft aufgrund der thermischen Anregung variiert.
Probe (target): Molekül, Polymer usw., das einen Probenkomplex ausbilden kann.
Probenkomplex: Bindungskomplex, der zu charakterisieren/nachzuweisen ist. Entweder handelt es sich um zwei bekannte Bindungspartner, deren Bindungseigenschaften bestimmt werden sollen oder es handelt sich um einen bekannten Bindungspartner. Es kann sich um eine unbekannte oder eine bekannte Trennkraft handeln.
Rezeptor: Einer der Bindungspartner eines spezifischen Bindungskomplexes.
Separation: Bindungspartner, die keinen Bindungskomplex eingegangen sind, von solchen absondern, die einen Bindungskomplex eingegangen sind.
Spezifische Wechselwirkung: Molekulare Wechselwirkung zwischen zwei Bindungspartnern eines Bindungskomplexes, die sich durch ein hohes Maß an molekularer Erkennung auszeichnet.
Trennkraft (unbinding force): maximal nötige Kraft, um einen Bindungskomplex mechanisch zu trennen.
Verkettung: lineare Anordnung eines ersten Bindungspartners, der an einen zweiten Bindungspartner eines Konjugats bindet, und eines dritten Bindungspartners, der Bestandteil des Konjugats ist und der einen vierten Bindungspartner bindet.Suspension: Connection of a binding partner with a holding device.
Binding properties: ratio of two binding partners to each other such as: no binding; Binding affinity; Binding mode.
Binding complex: complex of several binding partners; Molecules or bodies or bodies and molecules that interact with each other and that can be separated by a tensile force.
Binding partner: Part of a binding complex that can be separated from another binding partner by tensile forces. Binding partners can interact with each other specifically or non-specifically. The interaction is non-covalent.
Biomolecules: molecules that are obtained from biological systems or artificial molecules that are similar to those from biological systems.
Conjugate: connection of two binding partners.
Connection: connecting element of a conjugate.
Reference complex: binding complex with a known separating force.
Ligand: One of the binding partners of a specific binding complex.
Average separation force: Arithmetic mean of the separation forces of several identical binding complexes, whose individual separation force varies due to the thermal excitation.
Sample (target): molecule, polymer, etc., which can form a sample complex.
Sample complex: binding complex to be characterized / demonstrated. Either there are two known binding partners whose binding properties are to be determined or it is a known binding partner. It can be an unknown or a known separation force.
Receptor: One of the binding partners of a specific binding complex.
Separation: Separate binding partners who have not formed a binding complex from those who have formed a binding complex.
Specific interaction: Molecular interaction between two binding partners of a binding complex, which is characterized by a high degree of molecular recognition.
Unbinding force: maximum force required to mechanically separate a binding complex.
Linking: linear arrangement of a first binding partner, which binds to a second binding partner of a conjugate, and a third binding partner, which is part of the conjugate and which binds a fourth binding partner.

Claims

1. A method for characterizing and / or detecting a binding complex, comprising the steps:
Providing a first binding partner and a conjugate of a second and a third binding partner and providing a fourth binding partner,
Forming a linkage of the binding partners, the first binding partner forming a sample complex with the second binding partner and the third binding partner forming a reference complex with the fourth binding partner,
Applying a force to the chain which leads to the separation of the sample complex or the reference complex and
Determine which of the two binding complexes has been separated.

2. The method according to claim 1, wherein first the conjugate from the second and third Binding partner is provided and then the sample complex and / or the Reference complex is formed.

3. The method according to claim 1, wherein first the sample complex and / or the Reference complex is formed and then the conjugate by connecting the second and third binding partner is provided.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein it is the first and the second Binding partner is a ligand and a receptor that are specific to each other tie.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the sample complex on a non-specific interaction.

6. The method according to claims 1 to 5, wherein the reference complex on a specific or an unspecific interaction.

7. The method according to claims 1 to 6, wherein at least one of the binding partners preferably the sample complex is a body.

8. The method according to any one of the preceding claims, wherein at least one of the Binding partner of the sample complex is a biomolecule.

9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first and / or second Binding partners are attached to a first or second holding device, the preferably each have a body.

10. The method according to any one of claims 7 to 9, wherein at least one body Has macroscopically large surface, with which preferably several sample complexes and / or reference complexes can be connected.

11. The method according to any one of claims 7 to 10, wherein at least one body nanoscopic is small, preferably selected from a group consisting of particles, magnetic particles, paramagnetic particles, diamagnetic particles, colloids, molecules, charged molecules, Polymers, and has many charged polymers.

12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the force to separate the Chaining is applied by a macroscopic train.

13. The method according to any one of the preceding claims, wherein the force by a magnetic Field is applied.

14. The method according to any one of the preceding claims, wherein the force by a hydrodynamic flow is applied.

15. The method according to any one of the preceding claims, wherein the force by coupling Sound waves, preferably ultrasonic waves, is applied.

16. The method according to any one of the preceding claims, wherein the force by application electrostatic forces is built up.

17. The method according to any one of the preceding claims, wherein the force by molecular Conformational changes of suspensions and / or the connections applied becomes.

18. The method according to any one of the preceding claims, wherein a force while maintaining a certain force rate is applied.

19. The method of claim 18, wherein adjusting the force rate over the Pulling speed takes place with which the holding devices are separated.

20. The method according to claim 18 or 19, wherein the setting of the force rate over the Spring constant of the chain with its connections.

21. The method of claim 20, wherein adjusting the spring constant via the variation of Length of a polymer from which the bonds of the ligands or the compound that the Connects receptors, takes place.

22. The method according to any one of the preceding claims, wherein a sample complex and / or Reference complex has at least one component that is selected from a Group containing low molecular weight substances, polymers, proteins, antibodies, antigens, Haptens, natural or artificial nucleic acids, particles, viruses, phages, cells, Has cell components and / or complex-forming substances such as chelators.

23. The method according to any one of claims 1 to 22, with the steps of immobilizing the first Binding partner on a first holding device, immobilizing the fourth Binding partner on a second holding device, providing a conjugate from the second and third binding partners, which is the sample, the second Binding partner can bind to the first binding partner and the third binding partner can bind to the fourth binding partner, approximating the first and second Holding device, the binding partner of the sample being assigned to the other two Binding partners can interact.

24. The method according to any one of claims 1 to 22, with the steps of immobilizing the first Binding partner, which is the sample, on a first holding device, immobilization of the fourth binding partner on a second holding device, providing one Conjugate from the second and third binding partners, the second Binding partner can bind to the sample, and the third binding partner to the fourth Binding partner can bind, approaching the first and the second holding device, wherein the assigned binding partners can interact.

25. The method according to any one of the preceding claims with the step of marking the Sample complex and / or the reference complex, preferably at least one Binding partner and indirect or direct detection of the separation point, which is after the Applying the strength results.

26. The method according to claim 25, wherein the labeling is carried out by fluorescent molecules.

27. The method according to claim 26, wherein a binding partner of a binding complex with a first fluorophore and the second binding partner with a second fluorophore between which a fluorescence resonance transfer (FRET) takes place.

28. The method according to claim 26, wherein a binding partner of a binding complex with a fluorophore and the second binding partner is provided with a molecule that the Fluorescence of the fluorophore is quenched.

29. The method of claim 25, wherein the label is fluorescent nanoscopic semiconductor particles (quantum dots).

30. The method of claim 25, wherein it is a radioactive label.

31. The method of claim 25, wherein the label is an enzyme or Is an affinity marker to which an enzyme can bind that binds through a reaction Signal substance developed.

32. The method of claim 31, wherein the separation of a complex, the activation of a Enzyme is coupled, which develops a detectable signal.

33. The method of claim 25, wherein the label is a molecule of Electroluminescence, an electrochemically detectable molecule or around one Mass marking that can be detected by mass spectroscopy.

34. The method according to any one of claims 1 to 33, wherein the method during a Measurement process is carried out on many similar chains.

35. The method of claim 34, wherein only one type of concatenation is tested at only one force rate , the chaining always the same sample complex and always the same Reference complex includes.

36. The method of claim 34, wherein only one type of concatenation at different force rates is tested, the chaining always the same sample complex and always the same Reference complex includes.

37. The method of claim 34, wherein different linkages at only one force rate be tested, whereby the chains always the same sample complex contains different reference complexes with different separating forces.

38. The method of claim 34, wherein different linkages at different force rates be tested, whereby the chains always the same sample complex contain different reference complexes with different separating forces.

39. The method according to any one of claims 36 to 38, wherein the concatenations in series on only one Approach to be tested.

40. The method according to any one of claims 36 to 38, wherein the different linkages or Force rates in separate approaches are preferably tested in parallel.

41. Device for characterizing and / or detecting a binding complex, with:
a first binding partner and a conjugate of a second and a third binding partner and a fourth binding partner,
a device for linking the binding partners, the first binding partner forming a sample complex with the second binding partner and the third binding partner forming a reference complex with the fourth binding partner,
a device for applying a force to the chain which leads to the separation of the sample complex or the reference complex and
means for determining which of the two binding complexes has been separated.

42. The apparatus of claim 41, wherein first the conjugate from the second and third Binding partner is provided and then the sample complex and / or the Reference complex is formed.

43. The apparatus of claim 41, wherein first the sample complex and / or the Reference complex is formed and then the conjugate by connecting the second and third binding partner is provided.

44. Device according to one of claims 41 to 43, wherein it is the first and the second binding partner is a ligand and a receptor that is specific bind together.

45. Device according to one of claims 41 to 44, wherein the sample complex on a non-specific interaction.

46. Apparatus according to claims 41 to 45, wherein the reference complex on a specific or an unspecific interaction.

47. Device according to claims 41 to 46, wherein at least one of the binding partners preferably the sample complex is a body.

48. Device according to one of claims 41 to 47, wherein at least one of the Binding partner of the sample complex is a biomolecule.

49. Device according to one of claims 41 to 48, wherein the first and / or second Binding partners are attached to a first or second holding device, the preferably each have a body.

50. Device according to one of claims 47 to 49, wherein at least one body Has macroscopically large surface, with which preferably several sample complexes and / or reference complexes can be connected.

51. Device according to one of claims 47 to 50, wherein at least one body is nanoscopically small, preferably selected from a group consisting of particles, magnetic Particles, paramagnetic particles, diamagnetic particles, colloids, molecules, charged Molecules, polymers, and multiply charged polymers.

52. Device according to one of claims 41 to 52, wherein the force device for separation the interlinking has a device for applying a macroscopic train.

53. Device according to one of claims 41 to 52, with a device for applying magnetic forces.

54. Device according to one of claims 41 to 53, with a device for applying hydrodynamic forces.

55. Device according to one of claims 41 to 54, with a device for coupling Sound waves, preferably ultrasonic waves.

56. Device according to one of claims 41 to 55, with a device for applying electrostatic forces.

57. Device according to one of claims 41 to 56, with a device for effecting molecular conformational changes of suspensions and / or the connections.

58. Device according to one of claims 41 to 57, wherein the force while maintaining a certain force rate is applied.

59. Apparatus according to claim 58, with a device for adjusting the force rate, preferably the pulling speed at which the holding devices are separated.

60. Apparatus according to claim 58 or 59, wherein the force rate on the spring constant of Chaining with their connections is adjustable.

61. The apparatus of claim 60, wherein the spring constant over the variation in the length of a Polymer from which the bindings of the ligands or the compound that the receptors connects, is adjustable.

62. Device according to one of claims 41 to 61, wherein a sample complex and / or Reference complex has at least one component that is selected from a Group containing low molecular weight substances, polymers, proteins, antibodies, antigens, Haptens, natural or artificial nucleic acids, particles, viruses, phages, cells, Has cell components and / or complex-forming substances such as chelators.

63. Device according to one of claims 41 to 62, wherein the first binding partner on a the first holding device is immobilized, the fourth binding partner on a second Holding device is immobilized, a conjugate from the second and third There is a binding partner that represents the sample, the second binding partner to the can bind the first binding partner and the third binding partner to the fourth Binding partner can bind, and with a facility to approximate the first and the second holding device, the binding partner of the sample with the other two assigned interaction partners can interact.

64. Device according to one of claims 41 to 62, wherein the first binding partner, the Sample is immobilized on a first holding device, the fourth binding partner is immobilized on a second holding device, a conjugate of the second and the third binding partner exists, the second binding partner binding to the sample can, and the third binding partner can bind to the fourth binding partner, and with means for approaching the first and second holding means, the assigned interaction partner can interact.

65. Device according to one of claims 41 to 64, with a marking on the Sample complex and / or the reference complex, preferably at least one Binding partner and a device for indirect or direct detection of the Separation point that results after the application of the force.

66. The apparatus of claim 65, wherein the labeling by fluorescent molecules he follows.

67. The apparatus of claim 66, wherein a binding partner of a binding complex with a first fluorophore and the second binding partner with a second fluorophore between which a fluorescence resonance transfer (FRET) takes place.

68. The apparatus of claim 66, wherein a binding partner of a binding complex with a fluorophore and the second binding partner is provided with a molecule that the Fluorescence of the fluorophore is quenched.

69. The apparatus of claim 65, wherein the label is fluorescent nanoscopic semiconductor particles (quantum dots).

70. The apparatus of claim 65, wherein the label is radioactive.

71. The apparatus of claim 65, wherein the label is an enzyme or Affinity marker to which an enzyme can bind, which by a reaction a Signal substance developed.

72. The apparatus of claim 71, wherein activation of the separation of a complex is coupled to an enzyme that develops a detectable signal.

73. The apparatus of claim 65, wherein the label is a molecule of Electroluminescence, an electrochemically detectable molecule or around one Mass marking that can be detected by mass spectroscopy.

74. Device according to one of claims 41 to 73, with many similar linkages which the measuring process is carried out.

75. The apparatus of claim 74, wherein only one type of concatenation at only one force rate is tested, the chaining always the same sample complex and always the same Reference complex includes.

76. The apparatus of claim 74, wherein only one type of concatenation at different force rates is tested, the chaining always the same sample complex and always the same Reference complex includes.

77. The apparatus of claim 74, wherein different linkages at only one force rate be tested, whereby the chains always the same sample complex contains different reference complexes with different separating forces.

78. The apparatus of claim 74, wherein different concatenations at different Force rates are tested, but the chains always the same sample complex contain different reference complexes with different separating forces.

79. Device according to one of claims 76 to 78, wherein the linkages in series to only one approach.

80. Device according to one of claims 76 to 78, wherein the different linkages or force rates in separate approaches are preferably tested in parallel.

81. Device according to one of claims 41 to 80, wherein the separating forces of Reference complexes are chosen so that the separation force of the sample complex can be determined approximately.

82. Kit for the detection of a binding complex for carrying out a method according to at least one of claims 1 to 40.

83. Kit for the detection of a binding complex with the facilities according to at least one of claims 41 to 81.