DE102004022687A1

DE102004022687A1 - Verfahren zum Bestimmen des Gehalts zumindest einer Komponente einer Probe mittels eines Kernresonanz-Pulsspektrometers

Info

Publication number: DE102004022687A1
Application number: DE102004022687A
Authority: DE
Inventors: Gisela Dr. Guthausen; Andreas Dr. Kamlowski; Klaus-Dieter Dr. Schmalbein
Original assignee: Bruker Biospin GmbH
Current assignee: Bruker Biospin GmbH
Priority date: 2004-05-05
Filing date: 2004-05-05
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2024-05-06
Also published as: US20050270026A1; US7397241B2; DE102004022687B4

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Bestimmen des Gehalts zumindest einer Komponente einer Probe mittels eines Kernresonanz-Pulsspektrometers beschrieben, wobei die Magnetisierung der Probe durch eine Folge von Hochfrequenz-Pulsen so beeinflusst wird, dass die zu beobachtenden Signalamplituden bestimmt werden können. Die Magnetisierung der Probe wird zu Beginn gesättigt und die Signalamplituden, die zu jedem Zeitpunkt durch die longitudinalen und transversalen Relaxationszeiten T¶1¶ und T¶2¶ und/oder T¶2¶* und/oder T¶1p¶ bestimmt sind, aus denen ein Wert für den Gehalt der zumindest einen Komponente bestimmt wird, werden gleichzeitig in einem zusammenhängenden experimentellen Ablauf gemessen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen des Gehalts zumindest einer Komponente einer Probe mittels eines Kernresonanz-Pulsspektrometers, wobei die Magnetisierung der Probe durch eine Folge von Hochfrequenz-Pulsen so beeinflusst wird, dass die zu beobachtenden Signalamplituden bestimmt werden können.
Ein Verfahren der zuvor genannten Art, das auch als zeitaufgelöste Kernresonanzmessung (time-domain NMR, TD-NMR) bezeichnet wird, ist allgemein bekannt und wird seit vielen Jahren zur Bestimmung des Gehalts bestimmter Komponenten in Lebensmitteln, beispielsweise zur Bestimmung des Fettgehalts in Lebensmittelprodukten angewandt.
Die bislang verwendeten zeitaufgelösten Kernresonanzmessungsverfahren zum Bestimmen des Fett- oder Wassergehalts sind auf Proben beschränkt, die einen relativ geringen freien Wassergehalt von weniger als etwa 12% aufweisen. Dies führt dazu, dass die Bestimmung des Fettgehalts eines Lebensmittels mit einem niedrig auflösenden Kernresonanz(NMR)-Pulsspektrometer in Produkten mit hohem Wassergehalt wegen der Überlagerung von Wasser- und Fettsignal erschwert ist. Niedrig auflösende Kernresonanz(NMR)-Pulsspektrometer sind handelsüblich mit einer magnetischen Feldstärke von maximal etwa 1,5 Tesla und mittlerer Homogenität von etwa 10^–5 über das Probenvolumen und damit einer Protonenresonanzfrequenz unter etwa 60 MHz erhältlich, beispielsweise das „minispec" der Firma Bruker. Mit anderen Worten ist die Bestimmung des Fettgehalts von Proben mit relativ hohem Wassergehalt nur in höher auflösenden NMR-Spektrometern leicht möglich, die für diese Anwendung, beispielsweise in der Lebensmittelchemie, in der Regel jedoch viel zu teuer sind.
Bei den klassischen zeitaufgelösten Kernresonanz(NMR)-Verfahren wird nur eine einzige Signalamplitude zu einer bestimmten Zeit oder ein Amplitudenverhältnis gewonnen und mit den Ergebnissen eines Referenzverfahrens zur Bestimmung des Gehalts der Komponente der Probe verglichen. Beispielsweise wird der Ölgehalt in Saatgut über die Messung der Spin-Echo-Amplitude bei einer bestimmten Echozeit bestimmt.

Eine Möglichkeit, auch mittels niedrig auflösenden Kernresonanz-Pulsspektrometern akzeptable Ergebnisse bei Proben mit einem Wassergehalt von größer etwa 12% zu erhalten, besteht darin, die Probe vor der NMR-Messung vorzutrocknen, beispielsweise in einem Trockenofen, Mikrowellen- oder Infrarottrockner oder mittels chemischer Trocknung, wie beispielsweise in der DE 41 33 643 C1 beschrieben ist, um den störenden Wasseranteil zu beseitigen oder zumindest zu vermindern.

Der Nachteil hierbei besteht darin, dass die Methode der Vortrocknung einen weiteren Arbeitsschritt verlangt, der je nach Verfahren mehr oder weniger personalintensiv ist und außerdem ein Trocknungsgerät erfordert, und außerdem die Messung durch den Vortrocknungsschritt zu viel Zeit benötigt, was bei der Vielzahl an Messungen, die in der Lebensmittelindustrie anfallen, nicht akzeptabel ist.

In der WO 99/54751 A1 sowie in der WO 01/92908 A1 werden NMR-Pulsverfahren beschrieben, bei denen neben den unterschiedlichen Relaxationszeiten T₂ von Wasser und Fett auch der unterschiedliche Selbstdiffusionskoeffizient ausgenutzt wird, um zu einer Aussage über den reinen Fettgehalt zu kommen. Diese beiden Dokumente werden vollinhaltlich in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Anmeldung aufgenommen.

Basis der aus den zuvor genannten beiden Dokumenten bekannten Verfahren zur Bestimmung des Gehalts zumindest einer Komponente einer Probe ist die sogenannte PFGSE-Methode (Pulsed Field Gradient Spin Echo), die an sich aus Lehrbüchern bekannt ist, beispielsweise aus P.T. Callaghan: Principles of Nuclear Magnetic Resonance Microscopy, Oxford Science Publications, Clarendon Press, Oxford 1991, dort insbesondere die Seiten 162-169, 330-367, 371-417 und 478-482).

Aber auch die zuvor genannten Verfahren, die zur Bestimmung des Gehalts zumindest einer Komponente einer Probe den unterschiedlichen Selbstdiffusionskoeffizienten ausnutzen, haben Schwachpunkte.

Die in diesen Dokumenten beschriebene Gradientenmethode erfordert nämlich eine präzise Gradientensteuerung zum Erzeugen der entsprechenden Gradientenpulse, die zudem ihrerseits in der Apparatur Wirbelströme induzieren, die die Messung beeinträchtigen können. Zudem sind die kommerziell derzeit zur Verfügung stehenden Apparaturen durch den Platzbedarf der Gradientenspulen limitiert, was die Probenabmessungen angeht.

Die bekannten Verfahren beruhen darauf, dass lediglich eine einfache Messung einer einzigen Relaxationszeit, d.h. die longitudinale Relaxationszeit T₁ oder die transversale Relaxationszeit T₂ gemessen wird.

Des Weiteren ist in dem Artikel von F.C. Tinsley et al., „Evaluation of a Quantitative Magnetic Resonance Method for Mouse Whole Body Composition Analysis", in Obesity Research, Vol. 12, Nr. 1, Jan. 2004, ein Verfahren beschrieben, bei dem die Bestimmung des Fett- und Wassergehalts an lebenden Mäusen mittels einer NMR-Pulssequenz vorgenommen wird, die es erlaubt, die T₁-und T₂-Einflüsse zu messen. Die Kalibration der Messung wird hierbei über synthetische Proben realisiert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art anzugeben, das es ermöglicht, den Gehalt zumindest einer Komponente einer Probe mittels eines kostengünstigen niedrig auflösenden Kernresonanz-Pulsspektrometers zuverlässig messen zu können, ohne auf eine Vortrocknung der Probe angewiesen zu sein.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe hinsichtlich des eingangs genannten Verfahrens dadurch gelöst, dass die Magnetisierung der Probe zu Beginn gesättigt wird, und dass die Signalamplituden, die zu jedem Zeitpunkt durch die longitudinalen und transversalen Relaxationszeiten T₁ und T₂ und/oder T₂* und/oder T_1ρ bestimmt sind, aus denen ein Wert für den Gehalt der zumindest einen Komponente bestimmt wird, gleichzeitig in einem zusammenhängenden experimentellen Ablauf gemessen werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein anderer Ansatz gewählt, nämlich die Beobachtung des Rückgangs der Magnetisierung aus einem anfänglich gesättigten Zustand (M_Z= 0). Die Bestimmung des Gehalts der zumindest einen Komponente der Probe findet außerdem über die Messung verschiedener Relaxationseinflüsse statt, nämlich der Relaxation der longitudinalen als auch der transversalen Magnetisierung. Die NMR-Pulssequenz wird vorzugsweise derart gewählt, dass die verschiedenen NMR-Relaxationszeiten T₁, T₂ bzw. T₂* und/oder T_1ρ sowie über einen möglichen statischen oder zeitabhängigen Gradienten auch die Diffusion des zu detektierenden Signals beeinflussen. Dabei kann die wenn auch niedrige spektrale Auflösung des NMR-Spektrums als weiterer Kontrastparameter in Betracht gezogen werden.

Über das erfindungsgemäße Verfahren besteht die Möglichkeit einer Vereinfachung der Messung, so dass nur ein niedrig auflösendes NMR-Spektrometer benötigt wird, das kommerziell in einer Vielzahl von optimalen Probengeometrien angeboten wird. Des Weiteren ist die Messdauer und die Auswertung der Messungen in einer im Vergleich zur Trocknungsmethode kurzen Zeit möglich. Im Unterschied zu dem oben genannten Artikel von F.C. Tinsley et al. wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Kalibration über reale Proben ermöglicht, die über die derzeit zu verwendenden Referenzmethoden charakterisiert werden. Der Einsatzbereich des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit deutlich vergrößert, und eine Verallgemeinerung auf Proben unterschiedlicher Relaxivität, wie sie beispielsweise auch im Polymerbereich zu beobachten ist, kann vorgenommen werden. Weiterhin können über die verwendete Pulssequenz weitere Eigenschaften der Proben erfasst werden, wie beispielsweise der Proteingehalt von Lebensmitteln.

Erfindungsgemäß wird die Magnetisierung der Probe zunächst gesättigt, um anschließend die Erholung der Magnetisierung beobachten zu können, was das erfindungsgemäße Verfahren von den bekannten Verfahren unterscheidet. Das Ausgehen von einer gesättigten Magnetisierung, wobei darunter zu verstehen ist, dass die Magnetisierung vollständig oder im Wesentlichen gesättigt ist, hat den Vorteil, dass die Wiederholzeit zwischen den Einzelmessungen klein gewählt werden kann und somit eine Zeitersparnis gegenüber einer vom thermischen Gleichgewicht ausgehenden Sequenz bedeutet, die vor allem bei Proben mit geringer Signalintensität, d.h. vielen zu mittelnden Einzelexperimenten bedeutsam wird. Abhängig von der zu untersuchenden Probe kann zusätzlich zu den Parametern T₁ (M(t,T₂), M(t,T₂*)), T₂(M(t,T₁)) eine zusätzliche Größe, T₂*(M(t,T₁*)), gemessen werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann beispielsweise der Wasser-, Fett- und Proteingehalt in Wurstproben und der Wasser- und Fettgehalt in Emulsionen wie Mayonnaisen und Soßen sowie in Margarinen bestimmt werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die aus den Signalamplituden erhaltenen und durch die Relaxationszeiten T₁ und T₂ und/oder T₂* und/oder T_1ρ bestimmten Messwerte über ein chemometrisches Verfahren unter Verwendung von Referenzwerten aus Standardanalyseverfahren an einer Probe derselben Art wie die zu messende Probe analysiert.

Hierbei ist von Vorteil, dass die Auswertung der Messung anhand von abgespeicherten Werten von Kalibrierproben der gleichen Art wie die Messprobe erfolgt, wodurch der Einsatzbereich des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich vergrößert werden kann. Vorzugsweise werden zur Auswertung der Messung chemometrische Methoden angewandt, wie beispielsweise der PLS-Algorithmus.

In weiteren bevorzugten Ausgestaltungen wird die Probe zusätzlich Gradientenfeldern zur Verbesserung des Kontrasts oder zur Verbesserung der Sättigung der Magnetisierung ausgesetzt, wobei diese Gradientenfelder statisch oder gepulst sein können.

Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der beigefügten Zeichnungen.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen sowie in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:
1 eine Pulssequenz zur Messung des Wasser-, Fett- und/oder Proteingehalts an Wurstproben;
2 eine Darstellung der NMR-Rohdaten, wie sie entsprechend den jeweiligen Relaxationseigenschaften einer Probe zur Auswertung zur Verfügung stehen; und
3 eine Korrelation des NMR-Signals mit den entsprechenden Größen aus der konventionellen chemischen Analyse.
In 1 ist eine Pulssequenz, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, schematisch dargestellt.
Wesentlich an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass die Kombination der verschiedenen Relaxationsvorgänge, d.h. die Signalamplituden (diese sind beispielsweise durch die T₁ und T₂-Relaxation bestimmt), d.h. die gegenseitige Abhängigkeit der Parameter berücksichtigt werden.
Es hat sich nämlich gezeigt, dass es zu schlechteren Messergebnissen führt, wenn nur eine Messung des longitudinalen oder des transversalen Magnetisierungszerfalls erfolgt. Es hat sich weiter gezeigt, dass die beste Korrelation zwischen der Messprobe und der Referenzprobe erhalten wird, wenn die kombinierten Magnetisierungszerfälle untersucht werden, d.h. die Korre lation wird verbessert, wenn die kombinierte Information aus T₁- und T₂-Relaxation verwendet werden. Da die Relaxationszeiten sowohl dynamische Aspekte der untersuchten Moleküle als auch statische Eigenschaften ihrer Umgebungen reflektieren, ist zu erwarten, dass kleine Änderungen in der Probenzusammensetzung die Relaxation signifikant beeinträchtigen, obwohl der Gehalt der zu bestimmenden Komponente konstant bleibt. Die bei der vorliegenden Erfindung angewandte kombinierte Methode der Untersuchung der Relaxation sowohl von T₁- als auch T₂-Relaxationsprozessen ist daher gegenüber der quantitativ zu messenden Komponente wesentlich empfindlicher.
Die in 1 dargestellte Pulssequenz beginnt mit einer Sättigungspulsfolge, mit der die Magnetisierung der Probe gesättigt wird. Die Sättigungspulsfolge, die hier verwendet wird, führt zum einen zu einer Verkürzung der Wiederholzeit, zum anderen hat sie einen reproduzierbaren Magnetisierungszustand zur Folge.
Je nach zu untersuchender Probe wird die Anzahl der Sättigungspulse und ihr oft aperiodisch gewählter Zeitabstand optimiert. Ausgehend von diesem gesättigten Zustand der Magnetisierung, der im Übrigen nicht vollständig sein muss, schließt sich die Detektionssequenz an, die im Wesentlichen aus T₁-gewichteten Messungen der transversalen Relaxation unter Multi-Echo-Bedingungen besteht.
Um schnell relaxierende Anteile der zu messenden Probe zu erfassen, können die in 1 gestrichelt eingezeichneten freien Induktionszerfälle (FID) akquiriert werden. Dies stellt sich als Vorteil beispielsweise bei der Proteinbestimmung heraus.
Die Zeitparameter und die Anzahl der zu messenden Echos werden wieder an die zu untersuchende Probe angepasst.
Am Ende der Pulssequenz, bei der die Magnetisierung im thermischen Gleichgewicht vorliegt, wird ein vollständiger transversaler Magnetisierungszerfall digitalisiert, und es werden die Zeitabstände und die Anzahl der Echos probenspezifisch abgestimmt.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Echozeiten für die im dynamischen und die im thermischen Gleichgewicht digitalisierten Echos nicht identisch sein müssen, so dass Relaxationseffekte im rotierenden Koordinatensystem mit erfasst werden können.
Zusätzlich kann statt der Auswertung über die Zeitsignale eine Fourier-Transformation in den Frequenzraum durchgeführt werden, so dass die wenn auch geringe spektroskopische Information der Niederfeldspektren als zusätzlicher Kontrastparameter genutzt werden kann.
Die Pulssequenz kann darüber hinaus in den Schleifen der transversalen Relaxation (Klammern mit den Indices m, n) um die entsprechenden gepulsten Gradienten erweitert werden, so dass Diffusionsinformation zugänglich ist. Verzichtet man auf die Information der FID's, bietet sich auch die Möglichkeit, mit statischen Gradienten zu arbeiten. Darüber hinaus kann die Sättigung der Magnetisierung auch durch die Anwendung von Gradienten vervollständigt werden.
In 2 sind die Rohdaten für Proben mit unterschiedlichen Wasser-, Fett- und Proteingehalten gezeigt. Aufgetragen ist die Signalamplitude als Funktion der Messzeit. Deutlich zu sehen sind Relaxationsunterschiede und unterschiedliche Signalamplituden für die verschiedenen Proben.
Die Auswertung der Relaxationsspektren erfolgt im vorliegenden Fall mit Hilfe von chemometrischen Methoden, es ist aber auch möglich, Verfahren wie beispielsweise die inverse Laplace-Transformation oder andere analytische Methoden einzusetzen.
Der chemometrische Ansatz hat den Vorteil, dass durch die Methode eine Datenreduktion stattfindet, die bei den anderen Methoden durch selbst zu entwickelnde Algorithmen zu implementieren wäre und die unter Umständen abhängig wäre von den jeweiligen Relaxationsparametern der zu untersuchenden Proben.
In 3 sind Korrelationsdiagramme mit den entsprechenden Vorhersagewerten gezeigt, wie sie bei der Analyse von 30 unterschiedlichen Wurstproben erhalten wurden.
Bei verschiedenen Messtemperaturen ergeben sich dabei unterschiedliche Gewichtungen der Signalbeiträge, so dass die Korrelationsergebnisse sich als messtemperaturabhängig erweisen. Diese Eigenschaft der Temperaturabhängigkeit kann verwendet werden, um eine Kontrastoptimierung für die konkret zu messende Probenart vorzunehmen.
Es ist darauf hinzuweisen, dass auch die Wahl der Sequenzparameter auf den Kontrast einen wesentlichen Einfluss hat.
Die Auswertung wurde über die Software „Bruker Opus-Quant 2", einer Software für chemometrisches Datenprocessing, vorgenommen und mit Hilfe der dort implementierten Vorbehandlungsmöglichkeiten wie beispielsweise Bildung der Ableitung oder Basislinienkorrektur optimiert.
Als Ergebnis der chemometrischen Auswertung erhält man den Gehalt der Komponente der Probe durch die NMR-Messung, der mit den Referenzwerten verglichen wird, und zwar für alle gemessenen Proben, und über die gezeigten Korrelationsdiagramme erhält man eine Aussage über die Güte der Methode für die Bestimmung der einzelnen Komponenten. In diesem Fall ergibt sich aus der linearen Regression der Korrelationskoeffizient und der F-Faktor, der die statistische Relevanz der Messung wiedergibt.
Zusätzlich sind in den Abbildungen die Werte für eine 95-Prozent-Vorhersagewahrscheinlichkeit und das 95-Prozent-Konfidenzinterval abhängig vom Referenzwert angegeben.

Claims

Verfahren zum Bestimmen des Gehalts zumindest einer Komponente einer Probe mittels eines Kernresonanz-Pulsspektrometers, wobei die Magnetisierung der Probe durch eine Folge von Hochfrequenz-Pulsen so beeinflusst wird, dass die zu beobachtenden Signalamplituden bestimmt werden können, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnetisierung der Probe zu Beginn gesättigt wird, und dass die Signalamplituden, die zu jedem Zeitpunkt durch die longitudinalen und transversalen Relaxationszeiten T₁ und T₂ und/oder T₂* und/oder T_1ρ bestimmt sind, aus denen ein Wert für den Gehalt der zumindest einen Komponente bestimmt wird, gleichzeitig in einem zusammenhängenden experimentellen Ablauf gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die aus den Signalamplituden erhaltenen und durch die Relaxationszeiten T₁ und T₂ und/oder T₂* und/oder T_1ρ bestimmten Messwerte über ein chemometrisches Verfahren unter Verwendung von Referenzwerten aus Standardanalyseverfahren an einer Probe derselben Art wie die zu messende Probe analysiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zusätzlich Gradientenfeldern zur Verbesserung des Kontrasts und/oder zur Verbesserung der Sättigung der Magnetisierung ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gradientenfelder statisch oder gepulst sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Kernresonanz-Pulsspektrometer niedrigauflösend ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Lebensmittel und die zumindest eine Komponente Fett, Wasser und/oder ein Protein sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Polymer ist.