DE102005018642B4

DE102005018642B4 - Verwendung von Verbindungen zur Hemmung der Glyoxalasen

Info

Publication number: DE102005018642B4
Application number: DE102005018642A
Authority: DE
Inventors: Gerd Birkenmeier; Monika Birkenmeier; Klaus Huse
Original assignee: Bio Mac- Privatinstitut fur Medizinische und Zahnmedizinische Forschung Entwicklung und Diagnostik GmbH; ENTWICKLUNG und DIAGNOSTIK GmbH
Current assignee: Bio Mac- Privatinstitut fur Medizinische und Zahnmedizinische Forschung Entwicklung und Diagnostik GmbH; ENTWICKLUNG und DIAGNOSTIK GmbH
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2011-04-07
Anticipated expiration: 2025-04-16
Also published as: DE102005018642A1

Abstract

Verwendung einer Kombination aus
a. mindestens einem Glykolysesubstrat sowie
b. mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),

wobei R1 einen verzweigten oder unverzweigten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Cycloalkyl-Rest bedeutet und
wobei R2 H- bedeutet,
zur Prävention und/oder Behandlung von Pilzerkrankungen beim Menschen und bei Tieren.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Kombination aus mindestens einem Glykolysesubstrat sowie mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Prävention und/oder Behandlung von Pilzerkrankungen beim Menschen und bei Tieren.
Lebende Zellen benötigen beträchtliche Energiemengen, um ihre Zellteilung ablaufen lassen zu können. Die Energie wird durch den Abbau verschiedener Nahrungsstoffe gewonnen und als chemische Energie in energiereichen Verbindungen, vor allem in Form von ATP, gespeichert. Diese energiereichen Verbindungen unterliegen einem erheblichen Turnover in Kopplung mit anabolen und katabolen Prozessen, indem sie z. B. bei der Synthese zelleigener Substanzen (z. B. Proteine, Nukleinsäuren, Zucker, Lipide u. a.), dem Transport von Substanzen gegen Konzentrationsgradienten und regulatorischen Abläufen verbraucht werden und in bestimmten Stoffwechselwegen wieder neu gebildet werden. Als energieliefernde Substanzen kommt eine Vielzahl von Verbindungen in Betracht, als wichtigste derartige Substanzen dienen Zucker und Fettsäuren. Der Abbau von Zuckern findet, nachdem die verschiedenen Monosaccharide und deren Di-, Oligo- und Polymeren extra- oder intrazellulär in entsprechende Derivate verstoffwechselt worden sind, in der Glykolyse statt. Die Glykolyse ermöglicht sowohl eine anaerobe als auch in Verbindung mit der oxidativen Phosphorylierung eine aerobe Energiegewinnung.
Einige Einzeller und Mehrzeller sind hinsichtlich der von ihnen zur Energiegewinnung benutzten Stoffwechselwege Spezialisten, indem sie ökologische Nischen besiedeln und dort z. B. nur Glucose verwerten. Zu solchen Spezialisten zählen z. B. auf oder in dem menschlichen Körper lebende oder auf oder in Tieren siedelnde Parasiten.
Tierische und menschliche Organismen regeln in ihren Organen und in ihren Körperflüssigkeiten die Glucosekonzentration in einem engen Konzentrationsbereich. So beträgt z. B. die Glucosekonzentration im menschlichen Blut immer etwa 5 mM. Tierische Organismen weisen eine ähnliche Glucosehomöostase auf. Daher haben sich die meisten Parasiten auf die Glucoseverwertung im Blut, in Körperhöhlen und auf der Haut spezialisiert und weisen eine hohe Glykolyserate auf. Mit der Glykolyse geht allerdings immer die Bildung von Glyoxalverbindungen, im besonderen von Methylglyoxal, einher. Diese Verbindungen sind hoch toxisch, da sie leicht Addukte mit zellulären Proteinen und Nukleinsäuren bilden, die zu deren Inaktivierung führen. Alle glykosylierenden Zellen verwenden daher Entgiftungssysteme, die meist in den beiden Enzymen Glyoxalase I und II bestehen.
Auf dem und teilweise im Körper aller Menschen und Tiere leben eine Vielzahl von Pilzen, die keine Probleme verursachen. Unter den über 100.000 Pilzarten, die bisher beschrieben wurden, sind etwa 100 Arten bekannt, die bei Menschen und Tieren eine Krankheit hervorrufen können. Im Allgemeinen ist eine Pilzinfektion (Mykose) das Ergebnis einer opportunistischen Infektion auf der Grundlage einer geschwächten Immunabwehr. Die Schwächung der Immunabwehr ist häufig die Folge einer Chemotherapie, einer Organtransplantation mit einhergehender Immunsuppression oder einer HIV-Infektion. Dabei können auf der Schleimhaut siedelnde Pilze (mukosale Pilze) in das Blut und die Gefäße gelangen und damit für den Patienten hochgefährlich werden (systemische Mykose). Die am häufigsten anzutreffenden humanpathogenen Pilze sind Candida- und Aspergillus-Arten. Allein in Deutschland sind jedes Jahr etwa 40.000 Menschen von einer invasiven Candida-Infektion betroffen. Bei den Krankenhausinfektionen steht dieser Hefepilz inzwischen auf Platz 4 der Liste der gefährlichsten Erreger und erfordert einen hohen finanziellen Therapieaufwand. Eine antimykotische Therapie hat auch einen hohen Stellenwert zur Eindämmung einer Candidiasis und Aspergillosis bei Transplantationen (Higashiyama and Kohno, 2004). Nach Knochenmarktransplantation bilden Pilzinfektionen die häufigste Todesursache des Transplantatempfängers. Etwa die Hälfte aller Transplantatempfänger erkranken an systemischen Pilzinfektionen und ein Drittel sterben an einer nicht beherrschbaren Infektion (Epstein et al. 2003)
Candida-Pilze gehören zu den Hefepilzen. Die Übertragung von Hefepilzen ist durch kontaminierte Nahrungsmittel aber auch durch direkten Kontakt mit anderen Menschen und Tieren, vor allem Haustieren, möglich. Neben dem Befall von Schleimhäuten in Mund, Speiseröhre oder Vagina kann eine Infektion mit Candida auch eine Ausbreitung in Leber, Niere, Milz und andere Organe nach sich ziehen. Die bevorzugten Keime sind Candida albicans, aber zunehmend findet man auch Candida glabrata und Candida krusei in den Isolaten, die häufig eine Resistenz gegenüber herkömmlichen Pilzmitteln aufweisen.
Neben Candida-Infektionen können Aspergillus spp. (Schimmelpilze), insbesondere Aspergillus fumigatus, das lebensbedrohende Krankheitsbild einer invasiven Aspergillose hervorrufen. Der Pilz wächst aus der Lunge, dem Ort der Erstbesiedelung als Folge der Einatmung von Pilzsporen in das Gewebe ein und kann dann alle Organe des Körpers befallen. Für eine Therapie der invasiven Infektion mit A. fumigatus stehen nur bescheidene Möglichkeiten zur Verfügung, so dass die Erkrankung in mehr als 70 Prozent der Fälle zum Tod der Patienten führt. Aber auch wenn die Infektion sich nur auf Körperoberflächen ausbreitet, sind Pilzinfektionen nicht nur unangenehm, sondern auch dort gefährlich. Mit ihren Wurzelfäden nehmen die Pilze Glucose aus dem Blut auf und scheiden zum Teil giftige Stoffwechselprodukte aus, sog. Mykotoxine, die die Leber schädigen. Pilzinfektionen müssen daher behandelt werden.
Pilzinfektionen stellen auch ein großes Problem bei Tieren (z. B. Nutztiere, Vögel, Fische, Klein- und Zootiere sowie wirbellose Tiere wie Bienen) dar, wo sie analoge Erkrankungen auslösen können und therapiert bzw. bekämpft werden müssen.
Pilze sind wie die Organismen, die sie besiedeln, eukaryontische Organismen und daher wesentlich schwieriger zu bekämpfen als Bakterien, ohne den menschlichen oder tierischen Organismus zu schädigen. Insbesondere die Bekämpfung von Candida-Infektionen ist dadurch erschwert, dass es sich dabei um einen besonders flexiblen Mikroorganismus handelt, der ständig seine Gestalt ändert. Er wechselt dabei von einer kleinen, kugeligen Zellform, dem Hefe-Typ, zu langen, mehrzelligen Fäden, der Hyphenform. Gerade diese Hyphenform ist besonders gefährlich, da sie Gewebe durchdringen kann.
Die Behandlung von Pilzerkrankungen ist häufig langwierig. Die Dauer der Behandlung richtet sich nach der Art des Pilzes, der die Infektion verursacht hat. Eine Therapie geht daher mit einer Identifizierung des Pilzes und der Beschreibung seiner Charakteristika, vor allem seiner Resistenz gegen Pilzmittel, in Laborversuchen einher.
Pilzmittel (Antimykotika) können grundsätzlich zwei unterschiedliche Wirkungen haben. Sie können zu einer Hemmung der Pilzvermehrung führen und wirken damit fungistatisch. Sie können aber auch fungizid wirken und damit eine abtötende Wirkung auf die Pilze ausüben. Ein Großteil der gängigen Pilzmittel stören die Synthese der Substanz Ergosterol, bei der es sich um einen wichtigen Bestandteil der Zellmembranen der Pilze handelt. Die Ergosterolsynthese erfolgt in mehreren Schritten, wobei die verschiedenen Pilzmittel jeweils an unterschiedlichen Stellen der Synthese eingreifen können. Die Störung der Ergosterolsynthese kann zu einer Wachstumshemmung der Pilze und sogar zu einem Abtöten der Pilze führen.
Azol-Abkömmlinge hemmen die Biosynthese von Ergosterol, einem wichtigen Bestandteil der Zellmembran von Pilzen, indem sie in das Cytochrom P450-System eingreifen. Die Wirkung der meisten Azol-Abkömmlinge ist fungistatisch, einige haben auch fungizide Eigenschaften. Azol-Abkömmlinge werden vorwiegend lokal angewendet, eignen sich aber auch zur systemischen Behandlung. Dabei ist zu beachten, dass die Wirkstoffe nicht in das Knochengewebe und nicht in das zentrale Nervensystem gelangen dürfen.
Lokal angewendete Wirkstoffe sind z. B. Clotrimazol, Bifonazol und Econazol. Alle drei Substanzen wirken gegen Hefepilze, Schimmelpilze und Dermatophyten.
Die systemische Einnahme erfolgt oral oder in Form von Injektionen oder Infusionen. Indikationen sind beispielsweise systemische Mykosen, Nagelpilzinfektionen und schwere mukokutane Candidamykosen besonders bei AIDS und Immundefekten. Hierfür stehen Medikamente wie Fluconazol, Ketoconazol und andere zur Verfügung. Fluconazol gilt unter Experten heute als Mittel der ersten Wahl sobald Candida in der Blutkultur nachgewiesen wurde, auch wenn die Spezies noch nicht identifiziert ist und der Resistenztest noch aussteht.
Squalenepoxidase-Hemmer greifen ebenfalls in die Ergosterolsynthese ein. Ihre Wirkung ist fungistatisch. Bei den Dermatophyten wirken die Substanzen auch fungizid. Zu diesen Medikamenten gehören Terbinafin und Naftifin.
Medikamente aus der aus der Gruppe der Morpholin-Abkömmlinge (Amorolfin) werden vorzugsweise zur Behandlung von dermatophytischen Erkrankungen eingesetzt.
Die Polyen-Abkömmlinge bilden Komplexe (Verbindungen) mit den Sterolen der Pilzmembranen und stören damit die Funktionen der Membranen. Bei einer systemischen Anwendung der Polyen-Abkömmlinge ist problematisch, dass die Sterole der Pilze den Sterolen in menschlichen Zellmembranen stark ähneln. Daher können für eine systemische Behandlung nur solche Polyen-Abkömmlinge eingesetzt werden, die zu den menschlichen Gerüstsubstanzen, wie dem Cholesterin, nur eine geringe Bindungsfähigkeit besitzen, um nicht auch diese zu schädigen. Die am häufigsten eingesetzten Mittel sind Amphotericin B und Nystatin.
Amphotericin B ist ein Breitband-Antimykotikum dessen Wirkung und Funktion hinreichend im Patent US 2908611 A erklärt ist. Jedoch ist dessen Anwendung limitiert durch seine starke Nieren-, Leber und Myelotoxizität. Auf Grund seiner schlechten Löslichkeit kann es in Form von Kolloiden oder als Liposomen Formulierung gegeben werden ( US 4663167 A , EP 0421733 B1 ).
Bekannt ist auch die prophylaktische und therapeutische Behandlung von Candida-Infektionen durch Verabreichung von probiotischen Mitteln. Diese Probiotika enthalten Laktat-produzierende Bakterien, die bzw. deren Stoffwechselprodukte für die heilende Wirkung verantwortlich zeichnen sollen ( WO 99/17788 A1 ; Perdigon et al., 1990). Insbesondere wird eine immunstimulierende Wirkung angenommen, die wünschenswert für Abwehrreaktionen bei Pilzerkrankungen ist (De Simone et al, 1993). Solch eine antimykotische Therapie ist angezeigt nach Verabreichung von Antibiotika gegen bakterielle Infektionen, da Candida-Erreger die Schleimhaut schädigen und die Immunabwehr unterdrücken.
Weitere, sogenannte nicht-klassische Antimykotika haben unterschiedliche Wirkungsmechanismen. Ein Patent ( US 6414035 B1 ) beschreibt die Verwendung von Polyolen wie Mannitol, Sorbitol oder Xylitol zur Behandlung und Prophylaxe von Pilzerkrankungen der Schleimhaut.
Das Patent WO 97/07802 A1 beschreibt die Verwendung eines Inhibitors der Chitinsynthese (Nikkomycin Z) gegen Candida-Erreger.
Die Patentanmeldung US 2005/0020678 A1 offenbart die Verwendung von Alkylestern der Milchsäure als Fungizid. In der Patentanmeldung JP 08 325107 A wird die Verwendung von alpha-Hydroxy-Fettsäurealkylestern als antimikrobielle Verbindungen beschrieben, die u. a. gegen Pilze und Hefen eingesetzt werden können.
In einem weiteren Patent wird die Verwendung von komplexierenden Substanzen zur Pilzbekämpfung empfohlen ( GB 2033220 A ). Pilze benötigen Zink-Ionen für ihren Stoffwechsel, die durch Komplexbildner entzogen werden.
Die Patentanmeldung WO 01/068085 A1 offenbart die Behandlung bzw. Prävention von Infektionen, die u. a. durch fungale Pathogene wie Candida albicans verursacht sein können, mittels Isoleucin, seiner aktiven Isomere oder Analoga von Isoleucin. Die Aminosäure Isoleucin bzw. deren Isomere oder Analoga stimulieren in Säugerzellen die Produktion von Defensinen, d. h. kationische, cysteinreiche Peptide, die antimikrobiell wirken.
In der Veröffentlichung von Carballeira et al., ”Total synthesis and in vitro anti-fungal activity of (±)-2-methoxy-tetra-dodecanoic acid” wird die antifungale Wirkung von (±)-2-Methoxytetradecansäure gegenüber Aspergillus niger, Candida albicans und Cryptococcus neoformans beschrieben. Die antifungale Wirkung dieser Verbindung wird auf die Inhibition der fungalen N-Myristoyltransferase zurückgeführt.
Neue Ansätze der antimykotischen Therapie basieren auf der Aktivierung der körpereigenen Abwehr. Durch Aktivierung von humanen dendritischen Zellen durch Proteine oder Nukleinsäuren von Pilzen soll eine zelluläre Immunantwort ausgelöst werden. Diese Methode hat aber den Nachteil, dass sie Spezies-spezifisch ist (Bozza et al., 2004) und keine breite antimykotische Reaktion aufweist.
Ein generelles Problem bei der Verwendung von Antimykotika ist die Resistenzentwicklung (Sanglard and Odds, 2002). Resistenzen stehen in engem Zusammenhang mit der Zahl der AIDS-Erkrankungen, der Knochenmarktransplantationen und Chemotherapien (Randhawa, 2000). So ist Candida glabrata und C. Krusei häufig resistent gegenüber Fluconazol (Marr, 2004). Die Resistenzentwicklung ist auf eine gesteigerte Expression von ABC-Transportern zurückzuführen, die das Medikament Fluconazol aus der Pilzzelle wieder heraustransportieren (Bennett et al., 2004).
Zur Bestimmung der Pilzresistenz stehen unterschiedliche Tests zur Verfügung. Hierfür werden u. a. der standardisierte Plättchentest nach Kirby-Bauer (Qin et al., 2004) oder die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) mit dem VITEK2 (bioMerieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) angewendet. Der Plättchentest nach Kirby-Bauer basiert auf der Imprägnierung von Filterscheiben und die Ausmessung von Hemmhöfen nach Auflage der Filter auf inokulierten Agarplatten. Beim MIC Test werden Verdünnungsreihen der Testsubstanz in Nährmedium eingebracht, die den zu testenden Pilz in definierten Konzentrationen enthalten. Gemessen wird die minimale Konzentration des Inhibitors, die das Wachstum der Mikroorganismen hemmt. Die Testungen sollten sich orientieren an den NCCLS-Richtlinien (NCCLS, 1997)
Einige Antimykotika zeigen schwere Nebenwirkungen, die vor allem bei längerer oder hochdosierter Einnahme auftreten (Schwarze et al., 1998). Besonders bei Applikation von Amphotericin B können Angioödeme, Allergien, Schüttelfrost, Appetitlosigkeit, Brechreiz, Erbrechen, teils schwere Anämien, Nieren- und Leberfunktionsstörungen, anaphylaktischer Schock, Gehörverlust oder Tinnitus auftreten. Die Gaben von Antimykotika zusammen mit Cisplatin, Pentamidin, Aminoglykosiden können schwere Nierenschädigungen hervorrufen.
Neue Therapieoptionen sind also mehr als wünschenswert, zumal unter den Candida-Spezies C. glabrata und C. krusei vermehrt Stämme primär gegen Fluconazol resistent sind (13. Europäischer Kongress für Klinische Mikrobiologie und Infektionskrankheiten, Glasgow, Juni 2003). Eine Möglichkeit dafür kann in der Beeinflussung der Glykolyse liegen, da, wie dargestellt, viele Pilze Glucose zur Energiegewinnung glykolytisch abbauen.
Aus der Hemmung der Glykolyse erhoffte man daher die Ableitung einer weiteren Gruppe von Verbindungen, die sich zur Therapie von Parasiteninfektionen einsetzen lassen (Brady und Cameron, 2004; Kavanagh et al., 2004; Lakhdar-Ghazal et al., 2002). Solche Inhibitoren sind auch vor allem zur Bekämpfung von Krebserkrankungen entwickelt und untersucht worden.
So beschreibt US 2004/167079 A1 Verfahren zur Behandlung von Krebs durch den Einsatz von 2-Desoxy-Glucose (2-DG), einem Inhibitor der Glykolyse.
US 2003/181393 A1 offenbart die Glykolyseinhibitoren 2-Desoxyglucose, Oxamat und Iod-Acetat. Iod-Acetat inhibiert dabei die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase und Oxamat die Laktat-Dehydrogenase.
Der hauptsächliche Mangel der Strategie der Glykolysehemmung liegt jedoch darin, dass die Glykolyse in fast allen Zellen zur Energiegewinnung benutzt wird, so dass auch Körperzellen durch die Hemmung der Glykolyse geschädigt werden können. Besonders der Einfluss auf das Gehirn ist dramatisch, da das Gehirn als obligater Glucoseverbraucher stark von der Glykolyse abhängig ist.
Ein neuerer Ansatz für eine therapeutische Intervention mit dem Ziel, die veränderte und erhöhte Glykolyse als Target zu beeinflussen, liegt daher nicht mehr in der Hemmung der Glykolyse, sondern in der Hemmung der Glyoxalasen (Thornalley et al., 1994; Vander et al., 1990; Pemberton und Barrett, 1989; Creighton et al., 2003; Hamilton und Batist, 2004).
Wird durch Glyoxalase-Hemmer der Abbau des in der Glykolyse gebildeten Methylglyoxals verhindert, wird in den Zellen, die durch eine erhöhte Glykolyse vermehrt Methylglyoxal bilden wie beispielsweise Parasitenzellen, das Zellgift jedoch angehäuft. Dies führt zum Absterben der Parasitenzellen.
Auf der Basis des Substrats der Glyoxalase I, dem Halbthioacetal aus Methylglyoxal und Glutathion, wurden bereits peptidische Glyoxalase-Inhibitoren synthetisiert (Johansson et al., 2000; Thornalley et al., 1996; Kalsi et al., 2000; Sharkey et al., 2000).
US 4898870 A beschreibt Pyrrolochinolinchinon Verbindungen in Verbindung mit der Inhibition der Glyoxalase I. WO 99/35128 A1 beschreibt ebenfalls Verbindungen zur Inhibition von Glyoxalase I. WO 2004/101506 A1 beschreibt eine weitere Klasse nicht-peptidischer Glyoxalase I Inhibitoren.
Hall et al. (”Synthesis and evaluation of alpha-hydroxythiol esters as antitumor agents and glyoxalase I inhibitors”; J. Med. Chem. 1977; 20 (10): 1239–1242) offenbaren die Synthese einer Reihe von α-Hydroxythioestern, die als schwache Inhibitoren der Glyoxalase I wirken. Die untersuchten α-Hydroxythioester zeigten in Mäusen jedoch keine anti-leukämische Wirkung.
Die bisher bekannten Glyoxalaseinhibitoren weisen allerdings eine relativ hohe oder sehr hohe Toxizität auf und werden im Stoffwechsel zu Verbindungen metabolisiert, die wiederum vielfältige pharmakologische Effekte haben und teils starke Nebenwirkungen entwickeln.
Die bisher bekannten Glyoxalaseinhibitoren hemmen außerdem jeweils entweder nur Glyoxalase I oder nur Glyoxalase II. Gegenüber Hemmstoffen, die nur gegen ein einziges Proteintarget gerichtet sind, wird jedoch sehr rasch eine Resistenz entwickelt, indem in dem entsprechenden Protein z. B. Mutationen auftreten, die den Hemmstoff wirkungslos werden lassen.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ungiftige und nicht mutagene Verbindungen zur Hemmung der zellulären Methylglyoxaldetoxifikation, insbesondere zur Hemmung der Reaktionen der Glyoxalasen I und II anzugeben, die die Zellproliferation hemmen und somit zur Behandlung von Pilzerkrankungen eingesetzt werden können.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung einer Kombination aus mindestens einem Glykolysesubstrat sowie mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),
wobei R1 einen verzweigten oder unverzweigten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Cycloalkyl-Rest vorzugsweise mit einer Kettenlänge von C1 bis C8 bedeutet und wobei R2 H- bedeutet.
Das Glykolysesubstrat ist vorzugsweise Glucose.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) handelt es sich beispielsweise um Ethylpyruvat, Butylpyruvat, Isobutylpyruvat, Isopropylpyruvat und Cyclohexylmethylpyruvat. Besonders bevorzugt sind die Verbindungen Methylpyruvat, Ethylpyruvat, Butylpyruvat und Isobutylpyruvat.
Überraschend wurde gefunden, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wie z. B. Ethylpyruvat in der Lage sind, sowohl die Reaktion der Glyoxalase I als auch die Reaktion der Glyoxalase II zu hemmen. Die Hemmung der Reaktionen von Glyoxalasen durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verhindert erfindungsgemäß die zelluläre Entgiftung von Methylglyoxal und führt über verschiedene Mechanismen zur Hemmung der Zellproliferation und zum Zelltod.
Vorteilhaft werden durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mehrere Enzyme – im vorliegenden Fall die Reaktionen der Glyoxalasen I und II – inhibiert, was die Wahrscheinlichkeit einer Resistenzausbildung innerhalb des therapeutischen Zeitraums drastisch verringert.
Vorteilhaft werden durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubtrat solche Zellen gehemmt, die eine deutlich erhöhte Glykolyserate aufweisen, während der Stoffwechsel in Zellen mit normaler Glykolyserate nicht oder nur gering beeinträchtigt wird.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei den Zellen, deren Proliferation gehemmt wird, um human- oder tierpathogene Pilze. Pilze rufen verschiedene Pilzerkrankungen hervor.
Der Abbau von Glucose über die Glykolyse und die Bildung von Glyoxalverbindungen sind ubiquitäre Stoffwechselwege, die phylogenetisch stark konserviert sind (Heymans und Singh, 2003; Clugston et al., 1997). Human- oder tierpathogene Pilze, die bei Verfügbarkeit von Glucose vor allem über die Glykolyse ihren Energieverbrauch decken, sind beispielsweise Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Zygomyces spp., Dermatophyten, Blastomyces spp., Histoplasma spp., Coccidoides spp. und Sporothrix spp.. Diese stellen andere energieliefernde Prozesse durch Glucose ab und verwenden die Glykolyse (Katabolitrepression) oder wachsen unter hypoxischen Bedingungen. Es ist daher nicht verwunderlich, dass eine solche Vielzahl von Zellen und Organismen durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in ihrem Wachstum gehemmt und abgetötet werden können.
Die Toxizität von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und deren Derivaten ist zudem nur äußerst gering (Clary et al., 1998). Nach der Verseifung durch Esterasen werden sie im Stoffwechsel in ebenfalls nicht oder nur gering toxische Alkohole und auch im normalen Zellstoffwechsel gebildete Carbonsäuren (z. B. Pyruvat) metabolisiert. Das erklärt auch die geringe oder fehlende Ökotoxizität dieser Verbindungen (Bowmer et al., 1998) in Tests mit Selenastrum capricornutum, Daphnia magna, Pimephales promelas und Brachydanio rerio. Ebenso fehlt diesen Verbindungen ein mutagenes Potential in normalen Zellen, wie in einem etablierten Testsystem nachgewiesen wurde (Andersen und Jensen, 1984).
Die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubtrat zur Hemmung der Reaktionen von Glyoxalasen war bislang nicht bekannt.
In mehreren Patenten ( US 5580902 A , US 234599 A , US 4105783 A wurden Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wie Ethylpyruvat als Mittel beschrieben, die Beschaffenheit der Haut zu verbessern und Falten zu glätten oder Warzen und ähnliche Hauterscheinungen zu entfernen.
Ethylpyruvat ist zur Verbesserung kataraktischer Zustände eingesetzt worden (Devamanoharan et al., 1999). Hierbei wurde ein Absenken von Dulcitol und glykatierter Proteine durch Ethylpvruvat gefunden, die auf die Wirkung von Pyruvat zurückzuführen ist, welches durch Hydrolyse aus Ethylpyruvat entsteht. Der Vorteil der Verwendung von Ethylpyruvat ist in seiner leichteren Membrangängigkeit zu suchen.
Die Patentanmeldung EP 0 273 202 A2 offenbart, dass die Zugabe von Verbindungen wie u. a. Keto-Carbonsäureestern zu kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen, die u. a. antifungale Wirkstoffe enthalten, den therapeutischen Effekt bei der topischen Behandlung von dermatologischen Erkrankungen verstärkt. Die Keto-Carbonsäureester dienen dabei lediglich als Additiv für bekannte antifungale Verbindungen.
Die internationale Patentanmeldung WO 03/88955 A1 offenbart pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Ester einer alpha-Ketoalkansäure (insbesondere Ethylpyruvat) und Laktat zur Stabilisierung des Esters in wässriger Lösung enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt werden. Eine antifungale Wirkung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wird jedoch nicht beschrieben.
Das Patent US 5633285 A offenbart eine zellschützende und wundheilende Zusammensetzung, die eine zytotoxische Verbindung und eine Zusammensetzung zur Wundheilung umfasst, wobei die Zusammensetzung zur Wundheilung ein Pyruvatderivat wie z. B. Methylderivat, ein Antioxidans und eine Mischung von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren enthält.
Die Patentanmeldung WO 02/102366 A1 beschreibt die Verwendung von Methylpyruvat, Propylpyruvat und Butylpyruvat zur Behandlung von Zuchtfischen, die von Parasiten befallen sind.
Weiterhin wurde beschrieben, dass durch die Verwendung von Ethylpyruvat entzündliche Zustände und Sepsis verbessert werden können. Im Patent US 2004/110833 A wird Ethylpyruvat eingesetzt, um Zytokin-vermittelte Erkrankungen zu beeinflussen. Dies wurde auf die Aufhebung der Wirkung von NFκB zurückgeführt (Han et al., 2005; Yang et al., 2004.; Fink et al., 2004; Miyaji et al, 2003; Ulloa et al., 2002). Allerdings liegen zu diesem Befund auch gegensätzliche Beobachtungen vor (Mulier et al., 2005). In keinem Fall kann dieser Mechanismus jedoch herangezogen werden, um die Hemmung des Wachstums von Zellen in ihrer hier dargestellten Vielfalt zu erklären, da wie gezeigt auch Hefezellen in ihrem Wachstum durch Ethylpyruvat gehemmt werden, die weder über NFκB, noch über Zytokine noch über andere inflammatorische Proteine verfügen. Insbesondere kann dieser Mechanismus nicht zur Erklärung der proliferationshemmenden Wirkung von Ethylpyruvat herangezogen werden, da sich die Wirkung von Ethylpyruvat auf die Zytokinausschüttung auch nachweisen lässt, wenn die untersuchten tierischen Zellen nicht proliferieren.
Die proliferationshemmende und abtötende Wirkung von Ethylpyruvat in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubstrat, vermittelt über die Hemmung der Reaktionen von Glyoxalasen, ist umso überraschender, da Ethylpyruvat aufgrund seiner beschriebenen Wirkung als „scavenger” (Fänger) von reaktiven Sauerstoffradikalen eher eine wachstumsfördernde Wirkung haben sollte (Varma et al., 1998). Dies ist tatsächlich auch für humane T-Lymphozyten beschrieben worden (Dong et al., 2005). In dieser Arbeit wurde außerdem beschrieben, dass die Bildung des Zytokins Interleukin-2 in den T-Lymphozyten gesteigert wurde. Dies ist ein wichtiger Hinweis darauf, dass normale Körperzellen durch Ethylpyruvat nicht nur nicht geschädigt werden, sondern dass sogar ein positiver Effekt auf die Zell-vermittelte Immunabwehr ausgeübt wird. Dies hat einen synergistischen Einfluss bei der Behandlung einer Pilzerkrankung mit einer erfindungsgemäßen Kombination. Pilze werden durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubstrat geschädigt und in ihrem Wachstum gehemmt, gleichzeitig erfolgt eine Stärkung des Immunsystems, insbesondere der zellulären Abwehr durch die Wirkung auf Zytokine, die Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten und durch die Entfernung von Sauerstoffradikalen.
Von besonderem Vorteil ist die Anwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubstrat zur Behandlung von Tumorpatienten, die auf Grund ihrer hohen Infektanfälligkeit häufig an Pilzinfektionen leiden. Es ist bekannt, dass die meisten Tumore ebenfalls eine hohe Glykolyse aufweisen (Gatenby RA und Gillies RJ., 2004). Damit können Tumorzellen und Pilze gleichzeitig in ihrem Wachstum gehemmt werden.
Auch aus der bekannten insulinotropen Wirkung von Methylpyruvat war die Beeinflussung der Glyoxalasen nicht vorhersagbar. Methylpyruvat ist seit Jahren als insulinotrope Verbindung intensiv untersucht worden (Dufer et al., 2002; Valverde et al., 2001; Lembert et al., 2001). Diese Wirkung wird über die Beeinflussung von Kaliumkanälen und mitochondriale Effekte vermittelt.
Ein weiteres Beispiel für den überraschenden Befund, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubstrat die Proliferation von Zellen hemmen, wird aus den Angaben im Patent JP 8208422 A deutlich Normale humane Zellen, zum Beispiel Keratinozyten, werden nach JP 8208422 A durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in ihrer Proliferation sogar angeregt, was zur Verbesserung des Erscheinungsbildes der Haut Anwendung findet.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubstrat werden bevorzugt als Nahrungsmittelzusatz und/oder als Chemopräventivum und/oder als Therapeutika zur Behandlung von Pilzerkrankungen bzw. Infektionen in der Human- und/oder Veterinärmedizin eingesetzt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubstrat werden zur Behandlung von mucosalen (topischen) und/oder systemischen Erkrankungen angewendet. Die mucosalen Erkrankungen können durch orale oder vaginale Infektionen hervorgerufen sein. Die oralen oder vaginalen Infektionen sind dabei z. B. die Folge von AIDS, einer Chemotherapie oder einer immunsuppressiven Therapie oder immunsuppressiven Zuständen.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit mindestens einem Glykolysesubstrat können dabei topisch oder systemisch angewendet werden, insbesondere kann die Anwendung intravenös, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, oral, rektal, nasal, percutan, transdermal, als Aerosol, als Spüllösung, über Minipumpen, als Mundspülung, als Creme als Paste, als Lotion, als Bad, als Gel, als Pflaster, als Salbe, und/oder mittels pulmonärer Applikation erfolgen.
Ester sind naturgemäß nur begrenzt stabil, dadurch besteht die Notwendigkeit, bei einer systemischen Applikation höhere Dosen der Verbindungen zu verwenden. Letzteres lässt sich umgehen, indem eine lokale Applikation erfolgt.
Um einen therapeutischen Effekt zu erreichen, werden die erfindungsgemäßen Kombinationen im allgemeinen für mehrere Tage oder Wochen mit der jeweiligen therapeutisch effektiven Dosis appliziert. Die Applikation erfolgt dabei beispielsweise systemisch, z. B. durch wiederholte orale oder parenterale Applikation, oder auch lokal, z. B. während stereotaktischer Operationen, bei denen das Medikament an den gewünschten Ort gebracht wird, durch lokal gesetzte Sonden in Verbindung mit Pumpen, durch Cremes oder durch Verfahren, bei denen das Medikament in einem inerten Vehikel systemisch in den Körper gebracht wird und erst am gewünschten Ort durch entsprechende Manipulationen freigesetzt wird.
Erfindungsgemäß kann auch zusätzlich zur erfindungsgemäßen Kombination eine Kombination mit mindestens einer weiteren pharmazeutisch wirksamen Verbindung eingesetzt werden. Als weitere pharmazeutisch wirksame Verbindung werden bevorzugt Chemotherapeutika, Immunsuppressiva, bekannte Wurm- und Pilzmittel oder Glykolysehemmstoffe eingesetzt.
Im Allgemeinen ist eine Pilzinfektion eine opportunistische Infektion auf der Grundlage einer geschwächten Immunabwehr. Die Schwächung der Immunabwehr ist häufig die Folge einer Chemotherapie bei einer Krebserkrankung, einer Organtransplantation mit einhergehender Immunsuppression oder einer HIV-Infektion.
Eine Hemmung der Reaktion der Glyoxalasen durch mindestens ein Glykolysesubtrat sowie mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) und insbesondere durch Ethylpyruvat und verwandte Substanzen ist in Kombination mit einer Chemotherapie bei der Krebsbehandlung von besonderem Vorteil, da die Reaktionen der Glyoxalasen sowohl in Krebszellen als auch in Pilzzellen gehemmt und die Krebszellen und Pilzzellen abgetötet werden.
Die bekannte Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung Ethylpyruvat als „scavenger” (Fänger) von reaktiven Sauerstoffradikalen stellt zudem eine wünschenswerte Nebenwirkung für Zellen, die nicht über eine hohe Glykolyserate verfügen (Körperzellen), dar, da solche Zellen zusätzlich geschützt werden. Bei einer Kombinationstherapie mit einem Chemotherapeutikum oder Immunsuppressivum ist dies ein zusätzlicher Vorteil, da dann auch normale Zellen einem Stress unterworfen sind, der durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) abgeschwächt wird.
Eine bevorzugte Kombination besteht aus mindestens einem Glykolysesubtrat sowie mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) und einem Glykolysehemmstoff, wobei der Glykolysehemmstoff unterhalb der Triosephosphatisomerase-Reaktion in die Glykolyse eingreift. Der Sinn einer solchen Kombination besteht darin, die Konzentration der Triosephosphate, aus denen Methylglyoxal parametabolisch oder parakatalytisch entsteht, zu erhöhen und damit die Effektivität der Therapie zu verbessern.
Besonders bevorzugt ist dabei die Kombination von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), insbesondere Ethylpyruvat, einem Glykolysesubtrat und dem Laktatdehydrogenaseinhibitor Oxamat. Ebenfalls besonders bevorzugt ist die Kombination aus einem Glykolysesubstrat und einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), mit dem Glycerinaldehyd-phosphat-dehydrogenase-Hemmer Jodacetat.
Als weitere pharmazeutisch wirksame Verbindungen sind bevorzugt Substanzen enthalten, die das Wachstum der Pilze fördern, indem sie als Entkoppler der Atmungskette wirken, beispielsweise 2,4-Dinitrophenol.
Anhand der folgenden Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert.
Dabei zeigen
1: Einfluß von Ethylpyruvat (EP), Butylpyruvat (BP) und Butyllaktat (BL) auf die enzymatische Reaktion der Glyoxalase I aus Hefe.
2 Einfluß von Ethylpyruvat (EP) auf die enzymatische Reaktion der Glyoxalase II aus Hefe.
3: Effekt von D-Ethyllaktat (DEL), L-Ethyllaktat (LEL) und Ethylpyruvat (EP) auf die Vitalität von primären humanen Fibroblasten
Tabelle 1: Hemmung des Wachstums von Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) durch Ethylpyruvat (EP) und Butylpyruvat (BP).
Tabelle 2: Hemmung des Wachstums eines Fluconazol-resistenten Stammes von Candida albicans durch Ethylpyruvat (EP), Butylpyruvat (BP) und Ethyl-2-oxo-butyrat (EOB).
Tabelle 3: Hemmung des Wachstums eines Fluconazol-sensitiven Stammes von Candida albicans durch Ethylpyruvat (EP) und Butylpyruvat (BP).
Ausführungsbeipiel 1
Einfluß von Ethylpyruvat (EP), Butylpyruvat (BP) und Butyllaktat (BL) auf die enzymatische Reaktion der Glyoxalase I aus Hefe.
Die Bestimmung der Hefe-Glyoxalase I (E. C. 4.4.1.5, Laktoyl-Glutathionlyase Sigma, G-4252) erfolgte nach einer Vorschrift von McLellan and Thornalley (1989). Das Prinzip beruht auf der Messung der initialen Geschwindigkeit der Bildung von S-D-Laktoylglutathion aus Methylglyoxal (Sigma, MO252, 40%) und reduziertem L-Glutathion (Aldrich, G4251, > 99%). Die Bildung des Produktes wird unter Verwendung des Exktinktionskoeffizienten von ε = 2.86 mM^–1cm^–1 bei 240 nm verfolgt. Die Bestimmung wurde in 50 mM Natrium phosphatpuffer pH 7.0 durchgeführt. Dazu wurden 2 mM Methylglyoxal und 2 mM reduziertes Glutathion zur Bildung des Hemithioazetals für 2 Minuten bei 30°C inkubiert. Anschließend wurden zu dem Messansatz von 1 ml 20 μl einer 1:1000 Verdünnung der Glyoxalase I zum Starten der Reaktion hinzu pipettiert.
Die Glyoxalaseaktivität (IE) entspricht der Menge an Enzym, die 1 μmol des S-D-Laktoylglutathion/min bildet. Der Einfluss von Effektoren auf die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von ansteigenden Konzentrationen (0–30 mM) von EP (Sigma; Nr. E4, 780-8; Lot S18972-513) (Dreiecksymbol), BP (hergestellt nach den Angaben in Patent JP 11080089 A ; 98%) (Kreissymbol) und BL (Fluka, 69819; Lot 443090/1 21503090) (Kreuzsymbol) zum Messansatz untersucht (s. 1).
Die Experimente zeigen, dass sowohl EP als auch BP die Reaktion der Glyoxalase konzentrationsabhängig hemmen, wobei die Wirkung von BP stärker ist als die Wirkung von EP. BL beeinflusst die Reaktion der Glyoxalase nicht, wenn es nicht in BP umgewandelt worden ist.
Ausführungsbeispiel 2
Einfluß von Ethylpyruvat (EP) auf die enzymatischen Reaktion der Glyoxalase II aus Hefe.
Eine Kolonie des Stammes HD65-5a (Saccharomyces cerevisiae) wurde in 5 ml YPD-Medium [(2% Glucose (Fluka), 1% Yeast Extract (BD, Sparks), 2% Peptone (BD, Sparks)] in über Nacht bei 30°C unter Drehen inkubiert. Ein Aliquot (10 ml) wurde zu 200 ml Nährmedium in einer 500 ml Glasflasche pipettiert und bei 30°C auf einem Schüttler (250 U/min) inkubiert. Die Hefezellen wurde aus der stationären Wachstumsphase (O. D.^1cm/600nm = 2–4) durch Zentrifugation (15 min, 3000 × g) geerntet. Die Zellen wurde mit 0.1 M MES-Puffer, pH 6.5 bis zu einer O. D. von 4 verdünnt und anschließend erfolgte der Zellaufschluss in einer Glasmühle (Schwock et al., 2004). Der Zellaufschluss wurde dann bei 23000 × g, 4°C 30 min zentrifugiert. Die Bestimmung der Proteinkonzentration des zellfreien Extraktes erfolgte nach der Bradford-Methode (Bradford, 1976). Die Bestimmung der Aktivität der Glyoxalase II (Hydroxyacylglutathionhydrolase, E. C. 3.1.2.6.) erfolgte nach einer Vorschrift von Martins et al. (1999) in 0.1 M MES-Puffer, pH 6.5, 1.5 mM S-D-Laktoylglutathion (L7140, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) und 0.75 mM DTNB (Sigma, D8130). Nach Zugabe von geeigneten Mengen des Zellextraktes und einer Inkubationszeit von 15 min bei 25°C wurde die Bildung des Glutathions bei 412 nm (ε = 13.6 mM^–1cm^–1) gemessen. Die Glyoxalase II Aktivität (IE) entspricht der Menge an Enzym, die 1 μmol des S-D-Laktoylglutathion/min hydrolysiert.
Der Einfluß des Ethylpyruvat auf die Enzymaktivität wurde durch Zugabe von ansteigenden Konzentrationen an EP (Sigma; Nr. E4, 780-8; Lot S18972-513) (0–20 mM) zum Messansatz untersucht.
Die relativen Aktivitäten der Glyoxalase II in Abwesenheit und Anwesenheit von EP sind in 3 dargestellt. Die Experimente zeigen, dass EP die Reaktion der Glyoxalase II konzentrationsabhängig hemmt.
Ausführungsbeispiel 3
Hemmung des Wachstums von Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) durch Ethylpyruvat (EP) Butylpyruvat (BP) und oxidiertem L-Ethyllaktat (LEL).
Eine Kolonie des Stammes HD65-5a (Saccharomyces cerevisiae) wurde in 5 ml YPD-Medium [(2% Glucose (Fluka), 1% Yeast Extract (BD, Sparks), 2% Peptone (BD, Sparks)] in 20 ml Glasröhrchen angeimpft und über Nacht bei 30°C unter Drehen inkubiert. Bei einer O. D. von 12.9 (580 nm) wurde durch Verdünnen mit Nährmedium eine Anfangsdichte von O. D. 0.19 eingestellt. Der Ansatz wurde zu 10 ml aliquotiert (in 20 ml Glasröhrchen), mit ansteigenden Konzentrationen von EP und BP versetzt und bei 30°C unter kontinuierlichem Drehen (200 U/min) inkubiert. Ein weiterer Zellansatz wurde mit LEL versetzt, das zuvor mit Kaliumpermanganat (KMnO4) oxidiert wurde. Nach 8 Stunden wurden Proben von je 1 ml entnommen und die O. D. bei 600 nm vermessen.

Das Experiment (Tabelle 1) zeigt, dass EP und BP das Wachstum der Hefezellen konzentrationsabhängig hemmen. Tabelle 1:

	Inhibitorkonzentration
Inhibitor	ohne	1 mM	10 mM	20 mM	50 mM
	Zellzahl in Prozent der Zellzahl im Ansatz ohne Inhibitor
Ethylpyruvat (EP)	100	94	23	11	9.4
Butylpyruvat (BP)	100	96	88	73	14
Ethyllaktat + KMnO4	100	101	94	75	62

Ausführungsbeipiel 4
Hemmung eines Fluconazol-resistenten Stammes von Candida albicans durch Ethylpyruvat (EP) Butylpyruvat (BP) und Ethyl-2-oxo-butyrat (EOB)
Eine Kolonie des Fluconazol-resistenten Candida albicans Stammes A435 wurde in 5 ml YPD-Medium [(2% Glucose (Fluka), 1% Yeast Extract (BD, Sparks), 2% Peptone (BD, Sparks)] in 20 ml Glasröhrchen angeimpft und über Nacht bei 30°C unter Drehen inkubiert.
Bei einer O. D. von 14.4 (600 nm) wurde durch Verdünnen mit Nährmedium eine Anfangsdichte von O. D. 0.20 eingestellt. Der Ansatz wurde zu 10 ml aliquotiert (in 20 ml Glasröhrchen), mit ansteigenden Konzentrationen von EP, BP und BOB versetzt und bei 30°C unter kontinuierlichem Drehen (200 U/min) inkubiert. Nach 5 Stunden wurden Proben von je 1 ml entnommen und die O. D. bei 600 nm als Maß für die Zellzahl bestimmt. Die Resistenzbestimmung gegenüber Fluconazol folgte den Richtlinien der NCCLS (1997). Als resistent gilt ein Wachstum bei einer Dosis von ≥ 64 μg/ml für Fluconazol.

Das Experiment (Tabelle 2) zeigt, dass EP, BP und BOB das Wachstum von Fluconazol-resistenten Candida albicans Zellen hemmen. Tabelle 2

	Inhibitorkonzentration
Inhibitor	ohne	1 mM	10 mM	25 mM	50 mM
	Zellzahl in Prozent der Zellzahl im Ansatz ohne Inhibitor
Ethyl-2-oxo-butyrat (EOB)	100	81	5,7	1,4	1,7
Ethylpyruvat (EP)	100	94	1.8	0.9	0.9
Butylpyruvat (BP)	100	100	42	15	7

Ausführungsbeipiel 5
Hemmung des Wachstums eines Fluconazol-sensitiven Stammes von Candida albicans durch Ethylpyruvat (EP) und Butylpyruvat (BP)
Eine Kolonie des Fluconazol-sensitiven Candida albicans Stammes R/HO13 wurde in 5 ml YPD-Medium [(2% Glucose (Fluka), 1% Yeast Extract (BD, Sparks), 2% Peptone (BD, Sparks)] in 20 ml Glasröhrchen angeimpft und über Nacht bei 30°C unter Drehen inkubiert.
Bei einer O. D. von 14.4 (600 nm) wurde durch Verdünnen mit Nährmedium eine Anfangsdichte von O. D. 0.20 eingestellt. Der Ansatz wurde zu 10 ml aliquotiert (in 20 ml Glasröhrchen), mit ansteigenden Konzentrationen von EP und BP versetzt und bei 30°C unter kontinuierlichem Drehen (200 U/min) inkubiert. Nach 9 Stunden wurden Proben von je 1 ml entnommen und die O. D. bei 600 nm vermessen. Die Sensitivität gegenüber Fluconazol s lag bei einer Dosis von ≤ 0.13 μg/ml.
Das Experiment (Tabelle 3) zeigt, dass EP und BP das Wachstum von Fluconazol-sensitiven Candida albicans Zellen hemmen. Tabelle 3

Inhibitorkonzentration

Inhibitor ohne 1 mM 10 mM 25 mM 50 mM

Zellzahl in Prozent der Zellzahl im Ansatz ohne Inhibitor

Ethylpyruvat (EP) 100 89 3 1 1

Buylpyruvat (BP) 100 100 55 15 7
Ausführungsbeipiel 6
Effekt von D-Ethyllaktat (DEL), L-Ethyllaktat (LEL) und Ethylpyruvat (EP) auf die Vitalität von primären humanen Fibroblasten
Eine identische Zahl (10⁴ Zellen pro Kavität) von primären humanen Hautfibroblasten wurden in 24-well Platten (Greiner, Nr. 662160) ausgesät und in DMEM (Gibco, Nr. 41966-092) in Anwesenheit von 10% Kälberserum (Biochrom, S0113/5), 2 mM L-Glutamin (Gibco, Nr. 25030-024), Penicillin/Streptomycin (je 100 Einheiten Penicillin/ml; 100 μg Streptomycin/ml) (Gibco, Nr. 15140/122), 5 mg% Ascorbinsäure (Serva, Nr. 14030.02) bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Herstellung von primären humanen Fibroblasten erfolgte nach einer Vorschrift von Birkenmeier et al (1998). Nach Erreichen einer 50% Konfluenz wurde das Medium durch frisches serumfreies Medium ersetzt. Anschließend wurden folgende Zusätze zu den Zellen gegeben:
Ansatz 1: Serumfreies Medium-Volumenäquivalent
Ansatz 2: 1 mM DEL oder 1 mM LEL oder 1 mM EP
Ansatz 3: 5 mM DEL oder 5 mM LEL oder 5 mM EP
Ansatz 4: 10 mM DEL oder 10 mM LEL oder 10 mM EP
Ansatz 5: 20 mM DEL oder 20 mM LEL oder 20 mM EP
Ansatz 6: 50 mM DEL oder 50 mM LEL oder 50 mM EP.
Die Kultivierung wurde bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurden die Überstände entfernt und 100 μl einer 50% Thymolblaulösung in die Kavitäten pipettiert. Nach dem Waschen mit Medium wurden die ungefärbten und gefärbten Zellen unter dem Lichtmikroskop mit Koordinatensystem ausgezählt. Blau-gefärbte Zelle wurden als avital, ungefärbte Zellen als vital angesprochen. Der prozentuale Anteil der ungefärbten Zellen an der Gesamtzellzahl entspricht der Vitalität der Zellen.
Das Experiment (siehe 3) zeigt, dass DEL, LEL und EP über den untersuchten Konzentrationsbereich nicht toxisch sind und die Vitalität von primären humanen Fibroblasten nicht signifikant beeinflussen.
Ausführungsbeispiel 7
Ein 54 Jahre alter männlicher Patient mit diagnostiziertem Diabetes mellitus (Nüchternblutzuckerspiegel bei Vorstellung 6.88 mM) klagte über Trockenheitsgefühl im Mund, rissige Lippen und weiße-fleckige Veränderungen an der Mundschleimhaut. Ein Mundhöhlenabstrich ergab eine Infektion mit Candida albicans Erregern. Die Bestimmung der Keimzahl in einer Mundhöhlenspülung (10 ml Physiologische Kochsalzlösung, 30 Sekunden) ergab einen Wert von > 100 CFU/ml Spüllösung.
Der Patient führte dreimal täglich eine Mundspülung mit 10 ml Ethylpyruvatlösung (75 mM Ethylpyruvat, 1% Glukose in Physiologischer Kochsalzlösung) durch. Die Mundspülungen wurden über einen Zeitraum von 4 Tagen durchgeführt. Die erneute Keimzahlbestimmung nach Spülung mit 10 ml Kochsalzlösung ergab eine Reduktion der Keimzahl auf < 5%.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung von Ethylpyruvat gegen orale Candidiasis hilfreich ist.
Literaturverzeichnis

Andersen PH, Jensen NJ. Mutagenic investigation of flavourings: dimethyl succinate, ethyl pyruvate and aconitic acid are negative in the Salmonella/mammalian-microsome test. Food Addit Contam. 1984 Jul–Sep; 1 (3): 283–8
Bennett JE, Izumikawa K, Marr KA. Mechanism of increased fluconazole resistance in Candida glabrata during prophylaxis. Antimicrob Agents Chemother. 2004 May; 48 (5): 1773–7.
Birkenmeier G, Heidrich K, Glaser C, Handschug K, Fabricius EM, Frank R, Reissig D. Different expression of the alpha2-macroglobulin receptor/low-density lipoprotein receptorrelated protein in human keratinocytes and fibroblasts. Arch Dermatol Res. 1998 Oct; 290 (10): 561–8 Bowmer CT, Hooftman RN, Hanstveit AO, Venderbosch PW, van der Hoeven N.
The ecotoxicity and the biodegradability of lactic acid, alkyl lactate esters and lactate salts. Chemosphere. 1998 Sep; 37 (7): 1317–33.
Bozza S, Montagnoli C, Gaziano R, Rossi G, Nkwanyuo G, Bellocchio S, Romani L. Dendritic cell-based vaccination against opportunistic fungi. Vaccine. 2004 Feb 17; 22 (7): 857–64.
M. M. Bradford A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72: 248–254.
Brady RL, Cameron A. Structure-based approaches to the development of novel anti-malarials. Curr Drug Targets. 2004 Feb; 5 (2): 137–49.
Caballeira NM, Ortiz, D, Parang K, Sardari S. Total Synthesis and in Vitro-Antifungal Activity of (±)-2-Methoxytetradecanoic Acid. Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 2004, 337, 152–155.
Clary JJ, Feron VJ, van Velthuijsen JA. Safety assessment of lactate esters. Regul Toxicol Pharmacol. 1998 Apr; 27 (2): 88–97.
Clugston SL, Daub E, Kinach R, Miedema D, Barnard JF, Honek JF. Isolation and sequencing of a gene coding for glyoxalase I activity from Salmonella typhimurium and comparison with other glyoxalase I sequences. Gene. 1997 Feb 20; 186 (1): 103–11.
Creighton DJ, Zheng ZB, Holewinski R, Hamilton DS, Eiseman JL. Glyoxalase I inhibitors in cancer chemotherapy. Biochem Soc Trans. 2003 Dec; 31 (Pt 6): 1378–82.
Devamanoharan PS, Henein M, Ali AH, Varma SD. Attenuation of sugar cataract by ethyl pyruvate. Mol Cell Biochem. 1999 Oct; 200 (1–2): 103–9.
Dong YQ, Yao YM, Wei P, Liu H, Dong N, Yu Y, Sheng ZY. Effects of ethyl pyruvate on cell-mediated immune function in rats with delayed resuscitation after burn injury. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 2005 Jan; 17 (1): 12–5.
Dufer M, Krippeit-Drews P, Buntinas L, Siemen D, Drews G. Methyl pyruvate stimulates pancreatic beta-cells by a direct effect on KATP channels, and not as a mitochondrial substrate. Biochem J. 2002 Dec 15; 368 (Pt 3): 817–25.
Epstein JB, Hancock PJ, Nantel S. Oral candidiasis in hematopoietic cell transplantation patients: an outcome-based analysis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2003 Aug; 96 (2): 154–63
Fink MP. Ethyl pyruvate: a novel treatment for sepsis and shock. Minerva Anestesiol. 2004 May; 70 (5): 365–71.
Garcia CK, Goldstein JL, Pathak RK, Anderson RG, Brown MS. Molecular characterization of a membrane transporter for lactate, pyruvate, and other monocarboxylates: implications for the Cori cycle. Cell. 1994 Mar 11; 76 (5): 865–73
Gatenby RA, Gillies RJ. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nat Rev Cancer. 2004 Nov; 4 (11): 891–9.
von Grumbckow L, Elsner P, Hellsten Y, Quistorff B, Juel C. Kinetics of lactate and pyruvate transport in cultured rat myotubes. Biochim Biophys Acta. 1999 Mar 4; 1417 (2): 267–75.
Hall SS, Doweyko LM, Doweyko AM, Ryan Zilenovski JS. Synthesis and Evaluation of α-Hydroxythiol Esters as Antitumor Agents and Glyoxalase I Inhibitors. J. Med. Chem. 1977; 20 (10): 1239–1242
Hamilton D, Batist G. Glutathione analogues in cancer treatment. Curr Oncol Rep. 2004 Mar; 6 (2): 116–22.
Han Y, Englert JA, Yang R, Delude RL, Fink MP. Ethyl Pyruvate Inhibits Nuclear Factor-{kappa}B-Dependent Signaling by Directly Targeting p65. J Pharmacol Exp Ther. 2005 Mar; 312 (3): 1097–105. Epub 2004 Nov 03.
Heymans M, Singh AK. Deriving phylogenetic trees from the similarity analysis of metabolic pathways. Bioinformatics. 2003; 19 Suppl 1: i138–46.
Higashiyama Y, Kohno S. Micafungin: a therapeutic review. Expert Rev Anti Infect Ther. 2004 Jun; 2 (3): 345–55.
de Jaham C. Effects of an ethyl lactate shampoo in conjunction with a systemic antibiotic in the treatment of canine superficial bacterial pyoderma in an open-label, nonplacebo-controlled study. Vet Ther. 2003 Spring; 4 (1): 94–100.
Johansson AS, Ridderstrom M, Mannervik B. The human glutathione transferase P1-1 specific inhibitor TER 117 designed for overcoming cytostatic-drug resistance is also a strong inhibitor of glyoxalase I. Mol Pharmacol. 2000 Mar; 57 (3): 619–24.
Kalsi A, Kavarana MJ, Lu T, Whalen DL, Hamilton DS, Creighton DJ. Role of hydrophobic interactions in binding S-(N-aryl/alkyl-N hydroxycarbamoyl) glutathiones to the active site of the antitumor target enzyme glyoxalase I. J Med Chem. 2000 Oct 19; 43 (21): 3981–6.
Kavanagh KL, Elling RA, Wilson DK. Structure of Toxoplasma gondii LDH1: active-site differences from human lactate dehydrogenases and the structural basis for efficient APAD+ use. Biochemistry. 2004 Feb 3; 43 (4): 879–89.
Lakhdar-Ghazal F, Blonski C, Willson M, Michels P, Perie J. Glycolysis and proteases as targets for the design of new anti-trypanosome drugs. Curr Top Med Chem. 2002 May; 2 (5): 439–56
Lembert N, Joos HC, Idahl LA, Ammon HP, Wahl MA. Methyl pyruvate initiates membrane depolarization and insulin release by metabolic factors other than ATP. Biochem J. 2001 Mar 1; 354 (Pt 2): 345–50
Lluis C, Bozal 4. LDH and structural analogues of pyruvate Rev Esp Fisiol. 1976 Mar; 32 (1): 9–13
Marr KA. Invasive Candida infections: the changing epidemiology. Oncology (Huntingt). 2004 Dec; 18 (14 Suppl 13): 9–14.
Martins AM, Cordeiro C, Freire AP. Glyoxalase II in Saccharomyces cerevisiae: in situ kinetics using the 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) assay. Arch Biochem Biophys. 1999 Jun 1; 366 (1): 15–20.
McLellan AC, Thornalley PJ. Glyoxalase activity in human red blood cells fractioned by age. Mech Ageing Dev. 1989 Apr; 48 (1): 63–71
Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Muramatsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 2003 Nov; 64 (5): 1620–31.
Mulier KE, Beilman GJ, Conroy MJ, Taylor JH, Skarda DE, Hammer BE. Ringer's ethyl pyruvate inhemorrhagic shock and resuscitation does not improve early hemodynamics or tissue energetics. Shock. 2005 Mar; 23 (3): 248–252.
Murray MJ, Barbose JJ, Cobb CF. Serum D(–)-lactate levels as a predictor of acute intestinal ischemia in a rat model. J Surg Res. 1993 May; 54 (5): 507–9.
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast; approved standard. NCCLS document M27-A. Wayne, Pa, 1997
Pemberton KD, Barrett J. The detoxification of xenobiotic compounds by Onchocerca gutturosa (Nematoda: Filarioidea). Int J Parasitol. 1989 Dec; 19 (8): 875–8.
Perdigon G, Nader de Macias ME, Alvarez S, Oliver G, Pesce de Ruiz Holgado AA. Prevention of gastrointestinal infection using immunobiological methods with milk fermented with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus. J Dairy Res. 1990 May; 57 (2): 255–64.
Qin X, Weissman SJ, Chesnut MF, Zhang B, Shen L. Kirby-Bauer disc approximation to detect inducible third-generation cephalosporin resistance in Enterobacteriaceae. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2004 Jul 15; 3 (1): 13.
Randhawa HS. Respiratory and systemic mycoses: an overview. Indian J Chest Dis Allied Sci. 2000 Oct–Dec; 42 (4): 207–19.
Roth DA, Brooks GA. Lactate and pyruvate transport is dominated by a pH gradient-sensitive carrier in rat skeletal muscle sarcolemmal vesicles. Arch Biochem Biophys. 1990 Jun; 279 (2): 386–94
Sanglard D, Odds FC. Resistance of Candida species to antifungal agents: molecular mechanisms and clinical consequences. Lancet Infect Dis. 2002 Feb; 2 (2): 73–85.
Schwarze R, Seebacher C, Blaschke-Hellmessen R. Candida infections in infancy and early childhood Z Ärztl Fortbild Qualitätssich. 1998 Apr; 92 (3): 163–8.
Schwock J, Kirchberger J, Edelmann A, Kriegel TM, Kopperschlager G. Interaction of 6-phosphofructokinase with cytosolic proteins of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2004 Apr 30; 21 (6): 483–94.
Sharkey EM, O'Neill HB, Kavarana MJ, Wang H, Creighton DJ, Sentz DL, Eiseman JL. Pharmacokinetics and antitumor properties in tumor-bearing mice of an enediol analogue inhibitor of glyoxalase I. Cancer Chemother Pharmacol. 2000; 46 (2): 156–66.
De Simone C, Tzantzoglou S, Famularo G, Moretti S, Paoletti F, Vullo V, Delia S. High dose L-carnitine improves immunologic and metabolic parameters in AIDS patients. Immunopharmacol Immunotoxicol. 1993 Jan; 15 (1): 1–12.
Thornalley PJ, Strath M, Wilson RJ. Antimalarial activity in vitro of the glyoxalase I inhibitor diester, S-p-bromobenzylglutathione diethyl ester. Biochem Pharmacol. 1994 Jan 20; 47 (2): 418–20.
Thornalley PJ. Pharmacology of methylglyoxal: formation, modification of proteins and nucleic acids, and enzymatic detoxification-a role in pathogenesis and antiproliferative chemotherapy. Gen Pharmacol. 1996 Jun; 27 (4): 565–73.
Ulloa L, Ochani M, Yang H, Tanovic M, Halperin D, Yang R, Czura CJ, Fink MP,
Tracey KJ. Ethyl pyruvate prevents lethality in mice with established lethal sepsis and systemic inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Sep 17; 99 (19): 12351–6. Epub 2002 Sep 03
Valverde I, Cancelas J, Villanueva-Penacarrillo ML, Malaisse WJ. Potentiation by methyl pyruvate of GLP-1 insulinotropic action in normal rats. Int J Mol Med. 2001 Jun; 7 (6): 621–3.
Vander Jagt DL, Hunsaker LA, Campos NM, Baack BR. D-lactate production in erythrocytes infected with Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 1990 Sep-Oct; 42 (2): 277–84.
Varma SD, Devamanoharan PS, Ali AH. Prevention of intracellular oxidative stress to lens by pyruvate and its ester. Free Radic Res. 1998 Feb; 28 (2): 131–5.
Yang R, Uchiyama T, Watkins SK, Han X, Fink MP. Ethyl pyruvate reduces liver injury in a murine model of extrahepatic cholestasis. Shock. 2004 Oct; 22 (4): 369–75.

Abkürzungsverzeichnis

BP

Butylpyruvat

BL

Butyllaktat

DEL

D-Ethyllaktat

DMEM

Dulbecco's modified Eagle Medium

DTNB

5,5'-Dithiobis(2-Nitrobenzoesäure)

E. C.

Enzyme commission

EDTA

Ethylendiamintetraacetat

EP

Ethylpyruvat

IE

Internationale Einheit

LEL

L-Ethyllaktat

MCT

Monocarboxylattransporter

MES

4-Morpholineethanesulfonic acid

NFκB

Nuklear Faktor Kappa B

O. D.

Optische Dichte

PBS

Phosphat buffered salt

EOB

Ethyl-2-oxo-butyrat

SF

Serum-frei

YPD

Yeast Peptone Dextrose Medium

Claims

Verwendung einer Kombination aus a. mindestens einem Glykolysesubstrat sowie b. mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),
wobei R1 einen verzweigten oder unverzweigten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Cycloalkyl-Rest bedeutet und wobei R2 H- bedeutet, zur Prävention und/oder Behandlung von Pilzerkrankungen beim Menschen und bei Tieren.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykolysesubstrat Glucose ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 ein bis acht C-Atome enthält und dass R2 H- ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Methylpyruvat, Ethylpyruvat, Butylpyruvat oder Isobutylpyruvat sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination als Nahrungsmittelzusatz eingesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Pilzerkrankungen auf Hefen (z. B. Candida spp., Cryptococcus spp.), Schimmelpilze (z. B. Aspergillus spp., Zygomyces spp.) oder Fadenpilze (Dermatophyten) zurückzuführen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination zur Behandlung von mucosalen (topischen) und/oder systemischen Erkrankungen angewendet wird.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mucosalen Erkrankungen durch orale oder vaginale Infektionen hervorgerufen sind.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die oralen oder vaginalen Infektionen die Folge von AIDS, einer Chemotherapie oder einer immunsuppressiven Therapie oder immunsuppressiven Zuständen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur topischen und systemischen Anwendung die Kombination intravenös, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, oral, rektal, nasal, perkutan, transdermal, als Aerosol, als Spüllösung, über Minipumpen, als Mundspülung, als Creme, als Paste, als Lotion, als Bad, als Gel, als Pflaster, als Salbe und/oder mittels pulmonärer Applikation verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur Kombination mindestens eine weitere pharmazeutisch wirksame Verbindung eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als weitere pharmazeutisch wirksame Verbindung Chemotherapeutika, bekannte Pilzmittel, Immunsuppressiva, Glykolysehemmstoffe oder Substanzen, die den Stoffwechsel der Pilze fördern, eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Substanz, die den Stoffwechsel der Pilze fördert, 2,4-Dinitrophenol eingesetzt wird.