DE102011112649B4

DE102011112649B4 - Laser spot control in MALDI mass spectrometers

Info

Publication number: DE102011112649B4
Application number: DE201110112649
Authority: DE
Inventors: Armin Holle; Andreas Haase; Jens Höhndorf
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2014-02-27
Anticipated expiration: 2031-09-07
Also published as: GB2495805B; GB201710860D0; DE102011112649A1; GB2495805A; US8872103B2; GB2551060B; GB201215872D0; US20130056628A1; GB2551060A

Abstract

Flugzeitmassenspektrometer mit einem Lasersystem (2) zur Ionisierung von Proben auf einer Probenträgerplatte (13) durch matrixunterstützte Laserdesorption, wobei das Lasersystem (2) folgende Teilsysteme umfasst: – eine Strahlerzeugungseinheit (3) zur Erzeugung von Laserstrahlpulsen, – nachfolgend ein Spiegelsystem (7, 8), – danach ein Teleskop (9) für die Aufweitung des Laserstrahls, und – danach ein Objektiv (11) zur Fokussierung des aufgeweiteten Laserstrahls in Laserspots auf der Probenträgerplatte (13), wobei das Spiegelsystem (7, 8) die Position der Laserspots auf der Probenträgerplatte (13) steuert.Time-of-flight mass spectrometer with a laser system (2) for ionizing samples on a sample carrier plate (13) by means of matrix-assisted laser desorption, the laser system (2) comprising the following subsystems: - a beam generating unit (3) for generating laser beam pulses, - subsequently a mirror system (7, 8 ), - then a telescope (9) for expanding the laser beam, and - then an objective (11) for focusing the expanded laser beam in laser spots on the sample carrier plate (13), the mirror system (7, 8) on the position of the laser spots the sample carrier plate (13) controls.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Massenspektrometer mit Ionisierung der Proben durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), wobei sich die Proben auf einer beweglichen Trägerplatte befinden und dort von einem Pulslaser bestrahlt werden.The invention relates to mass spectrometers with ionization of the samples by matrix-assisted laser desorption (MALDI), wherein the samples are located on a movable support plate and are irradiated there by a pulse laser.

Die Erfindung sieht die Verwendung einer schnellen Positionssteuerung von Laserspots über ein System drehbarer Spiegel zur Unterstützung des Trägerplatten-Bewegungsantriebs vor, der bei schneller Analysenfolge einer schnellen Bewegung von Probe zu Probe prinzipiell nicht mehr folgen kann. Wird die Spotposition durch das Spiegelsystem fein justiert und wenigstens phasenweise mit der Bewegung der Probenträgerplatte geführt, so kann die stoßweise Bewegung des Probenträgers durch eine kontinuierliche Bewegung, bevorzugt mit gleichmäßiger Geschwindigkeit, ersetzt werden. Des Weiteren erlaubt die schnelle Positionssteuerung eine gleichmäßigere Abtragung einer Probenfläche für eine bessere Ausnutzung der Analytmoleküle in dieser Fläche. Es werden bevorzugt Galvospiegel geringen Trägheitsmoments zwischen der Strahlerzeugung und einem Kepler-Teleskop im Gehäuse des Lasers eingesetzt. Die Positionssteuerung kann auch für eine vollautomatische Justierung von MALDI-Flugzeitmassenspektrometern eingesetzt werden, jedenfalls, soweit die ionenoptischen Elemente wie Reflektor und Detektor mit Bewegungseinrichtungen versehen sind.The invention provides for the use of fast position control of laser spots via a system of rotatable mirrors to support the platen motion drive, which in principle can no longer follow a fast sample-to-sample motion in a fast analysis sequence. If the spot position is finely adjusted by the mirror system and guided at least in phases with the movement of the sample carrier plate, the intermittent movement of the sample carrier can be replaced by a continuous movement, preferably at a uniform speed. Furthermore, the fast position control allows a more uniform ablation of a sample surface for a better utilization of the analyte molecules in this area. Galvanic mirrors of low moment of inertia are preferably used between beam generation and a Kepler telescope in the housing of the laser. The position control can also be used for a fully automatic adjustment of MALDI time-of-flight mass spectrometers, at least insofar as the ion-optical elements such as reflector and detector are provided with moving devices.

Stand der TechnikState of the art

In Flugzeitmassenspektrometern mit einer Ionisierung der Proben durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) wird der Laserstrahl in der Regel durch fest justierte Linsen und Spiegel so auf eine Probe auf einem Probenträger fokussiert, dass ein Bestrahlungsspot mit gewünschtem Durchmesser und gewünschter Energiedichte an einem für eine hohe Empfindlichkeit optimal festgelegten Ort im Beschleunigungssystem der Ionenquelle erzeugt wird. Die Probe enthält eine dünne Schicht von Kriställchen der Matrixsubstanz, in die eine geringe Menge an Analytmolekülen eingebaut ist. Durch einen Lichtpuls des Lasers, üblicherweise eines UV-Lasers, wird eine Plasmawolke des Probenmaterials generiert, in der Ionen der Matrix- und Analytmoleküle erzeugt werden. In moderneren Ausführungen von MALDI-Lasern (siehe DE 10 2004 044 196 A1 ; A. Haase et al., 2004, entsprechend GB 2 421 352 B ; US 7,235,781 B2 ) wird nicht nur ein einziger Bestrahlungsspot erzeugt, sondern gleichzeitig ein Muster aus mehreren Bestrahlungsspots, wodurch sich Spotdurchmesser und Energiedichte so optimieren lassen, dass eine hundertfach höhere Ausbeute an Analytionen erzielt wird. Das Muster kann beispielsweise 4, 9 oder 16 Bestrahlungsspots in quadratischer Anordnung, aber auch 7 oder 19 Spots in hexagonaler Anordnung enthalten. Durch den sparsameren Verbrauch des Probenmaterials lässt sich der Nutzungsgrad der Proben erhöhen.In time-of-flight mass spectrometers with ionization of the samples by matrix-assisted laser desorption (MALDI), the laser beam is usually focused onto a sample on a sample carrier by means of fixed lenses and mirrors so that an irradiation spot with the desired diameter and desired energy density is optimally positioned for high sensitivity fixed location in the acceleration system of the ion source is generated. The sample contains a thin layer of crystals of the matrix substance, in which a small amount of analyte molecules is incorporated. By a light pulse of the laser, usually a UV laser, a plasma cloud of the sample material is generated, are generated in the ions of the matrix and analyte molecules. In more modern versions of MALDI lasers (see DE 10 2004 044 196 A1 ; A. Haase et al., 2004, correspondingly GB 2 421 352 B ; US Pat. No. 7,235,781 B2 ) generates not only a single irradiation spot, but at the same time a pattern of several irradiation spots, whereby the spot diameter and energy density can be optimized so that a hundredfold higher yield of analyte ions is achieved. The pattern can contain, for example, 4, 9 or 16 irradiation spots in a square arrangement, but also 7 or 19 spots in a hexagonal arrangement. The more economical consumption of the sample material can increase the degree of utilization of the samples.

Eine Spannung, die an Blenden in der Ionenquelle angelegt wird, beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen in der Ionenquelle auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt. Leichtere Ionen erreichen den Ionendetektor früher als schwerere. Am Ionendetektor werden die Ionenströme mit zwei bis acht Messungen pro Nanosekunde vermessen und digitalisiert. Aus den Messwerten werden die Flugzeiten der Ionen ermittelt und aus den Flugzeiten die Massen der Ionen. Wie dem Fachmann bekannt, lassen sich für eine Erhöhung des Auflösungsvermögens geschwindigkeitsfokussierende Reflektoren einsetzen. Insbesondere kann zusätzlich eine verzögert einsetzende Beschleunigung der Ionen (DE = delayed extraction) Ionen einer Masse trotz ihrer anfänglich breiten Verteilung der Anfangsenergien durch die sich ausdehnende Plasmawolke wieder gut fokussieren. Es entspricht dem Stand der Technik, mindestens 50 bis 1000 Einzelflugzeitspektren einer Probe zu einem Summenflugzeitspektrum zu addieren und daraus das Massenspektrum der Probe zu gewinnen. Es werden heute mit guten Flugzeitmassenspektrometern Massenauflösungen von R = m/Δm > 50000 erreicht, in einem weiten Massenbereich von 1000 u < m/z < 4000 u. Die Massengenauigkeiten erreichen heute Werte in der Größenordnung von einem Millionstel der Masse (1 ppm).A voltage applied to diaphragms in the ion source accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, the ions in the ion source are accelerated to different speeds. Lighter ions reach the ion detector earlier than heavier ones. At the ion detector, the ion currents are measured and digitized at two to eight measurements per nanosecond. From the measured values the flight times of the ions are determined and from the flight times the masses of the ions. As is known to those skilled in the art, speed-focusing reflectors can be used to increase the resolution. In particular, in addition, delayed acceleration of the ions (DE = delayed extraction) of ions of a mass can again focus well, despite its initially broad distribution of the initial energies due to the expanding plasma cloud. It is the state of the art to add at least 50 to 1000 individual flight time spectra of a sample to a sum flight time spectrum and to obtain therefrom the mass spectrum of the sample. With good time-of-flight mass spectrometers, mass resolutions of R = m / Δm> 50,000 are achieved today, in a wide mass range of 1000 u <m / z <4000 u. The mass accuracies today reach values of the order of one millionth of the mass (1 ppm).

Im Dokument DE 101 12 386 B4 (A. Holle und J. Franzen 2001; entsprechend GB 2 376 794 B oder US 6 734 421 B2 ) wird für die synchrone Aufnahme mehrerer Massenspektren von mehreren Probenstellen auf einem Probenträger nebst anderen Lösungen auch vorgeschlagen, eine schnelle Strahlablenkung für die Position eines Laserspots auf der Probenträgerplatte einzuführen, ohne jedoch eine realisierbare Ausführungsform darzustellen. Es wird lediglich vorgeschlagen, dass die Strahlablenkung mit beweglichen Spiegeln arbeiten könne; ausdrücklich werden piezo-gesteuerte Spiegel genannt. Der Probenträger sollte während des Abtasten mehrerer Proben unbewegt bleiben; die Ionen der verschiedenen Probenstellen sollten auf verschiedene Detektoren gelenkt werden. So sollten Massenspektren von mehreren Proben zeitlich überlappend gemessen werden können. Auch im Dokument US 2004/0183009 A1 (J. P. Reilly et al.) werden Spiegel zur Positionssteuerung eingesetzt; hier werden sie zur Abtastung von inhomogen präparierten Proben verwendet, um Stellen höherer Ionenausbeute zu finden („sweet spots”). Kommerziell erhältliche Flugzeitmassenspektrometer mit Positionssteuerungen für Laserspots sind bisher nicht entwickelt worden.In the document DE 101 12 386 B4 (A. Holle and J. Franzen 2001; GB 2 376 794 B or US Pat. No. 6,734,421 B2 ), it is also proposed for the synchronous recording of several mass spectra from several sample points on a sample carrier and other solutions, to introduce a rapid beam deflection for the position of a laser spot on the sample carrier plate, but without representing a feasible embodiment. It is only suggested that the beam deflection could work with movable mirrors; expressly called piezo-controlled mirrors. The slide should remain motionless while scanning multiple samples; the ions of the different sample sites should be directed to different detectors. So mass spectra of several samples should be able to be measured overlapping in time. Also in the document US 2004/0183009 A1 (JP Reilly et al.) Are used for position control mirrors; Here they are used to scan inhomogeneously prepared samples to find sites of higher ion yield ("sweet spots"). Commercially available time-of-flight mass spectrometers with position controls for laser spots have not yet been developed.

Im Laufe der Jahre hat sich die Lasertechnik für MALDI-Flugzeitmassenspektrometer außerordentlich verbessert. Es wurde nicht nur die Aufteilung in mehrere Laserspots eingeführt und unter dem Namen „Smartbeam” weithin verbreitet, es wurde auch die Laserschussfrequenz von anfänglich 20 Schüssen pro Sekunde mit UV-Stickstofflasern auf heute 1000 bis 5000 Schüsse pro Sekunde mit UV-Festkörperlasern immer weiter erhöht. Gegenwärtig wird eine Schussfrequenz von 10 kHz angestrebt, wodurch aber für die Aufnahme eines Flugzeitspektrums, aber auch für Positionsänderungen des Laserspots nur noch 100 Mikrosekunden zur Verfügung stehen. Bei fünf Messungen des Ionenstroms am Detektor pro Nanosekunde besteht dann ein Einzelflugzeitspektrum aus 500000 Messwerten. Wie schon erwähnt, werden an einer Probe mindestens 50 bis 1000 Einzelflugzeitspektren akquiriert, die Messwert für Messwert zu einem Summenflugzeitspektrum addiert werden. Daraus wird dann das Massenspektrum der Probe gewonnen. Over the years, laser technology for MALDI time-of-flight mass spectrometers has greatly improved. Not only was it split into several laser spots and widely used under the name "Smartbeam", it also increased the laser firing frequency from initially 20 shots per second with UV nitrogen lasers to today's 1000 to 5000 shots per second with UV solid-state lasers , Currently, a firing frequency of 10 kHz is desired, which, however, only 100 microseconds are available for recording a time-of-flight spectrum, but also for position changes of the laser spot. With five measurements of the ion current at the detector per nanosecond then a single flight time spectrum consists of 500,000 measured values. As already mentioned, at least 50 to 1000 individual flight time spectra are acquired on a sample, the measured value for measured value being added to a sum flight time spectrum. From this, the mass spectrum of the sample is then obtained.

Eine besondere Anwendung findet diese Technik mit hohen Laserschussraten in der „bildgebenden Massenspektrometrie” („imaging mass spectrometry”) von Gewebedünnschnitten, mit der von einem Dünnschnitt viele Zehn- bis Hunderttausende von Massenspektren aufgenommen werden. Wie ein originales Farbbild in jedem Bildpunkt ein volles Farbspektrum enthält, so enthält ein massenspektrometrisches Bild in jedem Bildpunkt ein volles Massenspektrum. Dabei werden heute Abstände der Bildpunkte zwischen 50 bis herunter zu 20 Mikrometern verwendet, in Zukunft werden Abstände von 10 oder sogar 5 Mikrometer angestrebt. Von einem Quadratzentimeter Gewebedünnschnitt werden bei 50 Mikrometer Auflösung 40000 Massenspektren gewonnen, bei 10 Mikrometer Auflösung bereits eine Million Massenspektren. Auch hier werden im Allgemeinen für das Massenspektrum eines Bildpunkts die Einzelflugzeitspektren von 50 bis 1000 Laserschüssen zu einem Summenflugzeitspektrum addiert, woraus dann das Massenspektrum des Bildpunkts gewonnen wird. Je höher die Anzahl der jeweils addierten Einzelflugzeitspektren ist, umso besser werden Nachweisgrenze und Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Es können jedoch nicht immer beliebig viele Einzelflugzeitspektren aufgenommen und addiert werden, da sich die Probe meist rasch erschöpft.A particular application of this technique is the high laser shot rate in imaging mass spectrometry of thin tissue sections, which allows many tens to hundreds of thousands of mass spectra to be taken from a thin slice. As an original color image contains a full color spectrum in each pixel, a mass spectrometric image in each pixel contains a full mass spectrum. Distances of the pixels between 50 down to 20 micrometers are used today, in the future distances of 10 or even 5 micrometers are desired. From a square centimeter of tissue thin section at 50 microns resolution 40000 mass spectra are obtained, at 10 microns resolution already a million mass spectra. Again, for the mass spectrum of a pixel, the individual flight time spectra of 50 to 1000 laser shots are generally added to a sum flight time spectrum, from which the mass spectrum of the pixel is then obtained. The higher the number of each added individual time-of-flight spectra, the better the detection limit and signal-to-noise ratio. However, it is not always possible to record and add any number of individual time-of-flight spectra, since the sample usually quickly expires.

In heutiger Technik werden diese Massenspektren mit feststehender Position des Laserspots oder Laserspotmusters in Bezug auf die Achse der Ionenquelle aufgenommen. Die räumliche Auflösung wird allein durch die Bewegung der Probenträgerplatte hergestellt. Wegen der erforderlichen Ebenheit der Oberfläche sind die Probenträger recht massiv und zusammen mit der Halterung recht schwer. Die pulsweise Bewegung der Probenträgerplatte von Probenstelle zu Probenstelle ergibt somit eine außerordentlich hohe Belastung für die Bewegungseinrichtung, die im Allgemeinen aus Schrittmotor und Gewindestange besteht. Es werden heute bereits bis zu 10 Probenstellen pro Sekunde angefahren, bei künftigen 10-kHz-Lasern werden es bis zu 200 Probenstellen pro Sekunde und mehr sein müssen, eine Bewegung, die mechanisch nicht mehr erreicht werden kann. Als Ausweg wird heute schon versucht, für die bildgebende Massenspektrometrie bei feststehender Laserspotposition mit kontinuierlicher Bewegung der Probenträgerplatte zu arbeiten. Dabei muss ein Kompromiss aus Vortriebsgeschwindigkeit und Laserschussfrequenz gebildet werden, um einigermaßen brauchbare Signalqualität zu erhalten, außerdem wird die Ausnutzung der Probe stark begrenzt. Diese Betriebsweise ist für die bildgebende Massenspektrometrie nicht befriedigend [siehe J. M. Spraggins und R. M. Caprioli, J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2011) 22: 1022–1031].In today's technology, these mass spectra are recorded with fixed position of the laser spot or laser spot pattern with respect to the axis of the ion source. The spatial resolution is produced solely by the movement of the sample support plate. Because of the required flatness of the surface, the sample carriers are quite massive and quite heavy together with the holder. The pulsed movement of the sample support plate from sample to sample point thus results in an extremely high load on the movement device, which generally consists of stepper motor and threaded rod. Up to 10 sample sites per second are already being started today, with future 10 kHz lasers it will have to be up to 200 sample sites per second and more, a movement that can no longer be achieved mechanically. As an alternative, attempts have been made today to work for the imaging mass spectrometry with fixed laser spot position with continuous movement of the sample carrier plate. In this case, a compromise between propulsion speed and laser firing frequency must be formed in order to obtain reasonably usable signal quality, and the utilization of the sample is severely limited. This mode of operation is not satisfactory for imaging mass spectrometry [see J.M. Spraggins and R.M. Caprioli, J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2011) 22: 1022-1031].

Darüber hinaus ist heute auch die gleichmäßige Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Fläche einer Probenstelle und damit die Ausnutzung der verfügbaren Analytmoleküle für die Aufnahme der Einzelflugzeitspektren wenig zufriedenstellend. So wird beispielsweise bei heutigen Präparationen von Gewebedünnschnitten für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) eine Schicht winziger Kriställchen aus Matrixmaterial auf den Dünnschnitt aufgebracht, wobei die löslichen Peptide und Proteine aus dem Dünnschnitt in die oberste Schicht der Kriställchen transportiert werden. Wird das Spotmuster nicht bewegt, so sind nach drei bis fünf Laserschüssen die Analytmoleküle unter den Laserspots verbraucht. Das Spotmuster wird daher heute taumelnd rotiert, um immer wieder andere, noch unverbrauchte Stellen abzutragen. Es ist jedoch bis heute nur durch Bewegungen der Probenträgerplatte möglich, eine wirklich gleichmäßige Abtragung einer vorgegebenen Probenfläche zu erzielen. Die notwendig hohe Frequenz dieser Bewegungen ist aber heute mit der Bewegungseinrichtung für die Probenträgerplatte nicht zu erreichen.In addition, the uniform utilization of the available area of a sample site and thus the utilization of the available analyte molecules for the recording of the individual flight time spectra is today also unsatisfactory. Thus, for example, in today's preparations of tissue thin sections for ionization by matrix-assisted laser desorption (MALDI), a layer of tiny crystals of matrix material is applied to the thin section, wherein the soluble peptides and proteins are transported from the thin section into the uppermost layer of the crystals. If the spot pattern is not moved, the analyte molecules are consumed under the laser spots after three to five laser shots. The spot pattern is therefore rotated today staggering to remove again and again other, still unused places. However, it is still possible today only by movements of the sample support plate to achieve a truly uniform removal of a given sample surface. However, the necessary high frequency of these movements can not be achieved today with the movement device for the sample carrier plate.

Die amerikanische Patentanmeldung US 2005/0236564 A1 offenbart ein optisches System, in dem ein optisches Element zur Aufweitung eines Laserstrahls vor einem Spiegelsystem angeordnet ist. Das optische System kann neben einer optischen Ablenkeinheit und einem Fokussierungselement weitere optische Elemente enthalten.US patent application US 2005/0236564 A1 discloses an optical system in which an optical element for expanding a laser beam is arranged in front of a mirror system. The optical system may include other optical elements in addition to an optical deflection unit and a focusing element.

Die deutsche Patentanmeldung DE 10 2005 044 307 A1 offenbart ein Verfahren für die Erzeugung von Analyt-Ionen aus Analytmolekülen für eine Analyse in einem Spektrometer, wobei sich die Analytmoleküle in Proben auf einem festen Probenträger befinden und in einem Umgebungsgas bei einem Druck zwischen 10 und 1000 Pascal desorbiert werden, wobei in einer Reaktant-Ionenquelle Reaktant-Ionen erzeugt, diese durch ein Ionenleitsystem der Desorptionsstelle zugeführt, und die desorbierten Analytmoleküle durch die Reaktant-Ionen ionisiert werden.The German patent application DE 10 2005 044 307 A1 discloses a method for generating analyte ions from analyte molecules for analysis in a spectrometer, wherein the analyte molecules are in samples on a solid sample carrier and are desorbed in an ambient gas at a pressure between 10 and 1000 pascal, wherein in a reactant Ion source generates reactant ions, these fed by an ion guide to the desorption site, and the desorbed analyte molecules are ionized by the reactant ions.

Die deutsche Patentanmeldung DE 10 2004 061 820 A1 offenbart ein Lasersystem als Ersatz für einen Stickstofflaser in einem UV MALDI-Massenspektrometer, bei dem ein Festkörper oder ein Halbleiter als Lasermedium des Lasersystems eingesetzt wird und das Lasersystem gepulste Laserstrahlung im Wellenlängenbereich zwischen 332 und 342 Nanometern emittiert.The German patent application DE 10 2004 061 820 A1 discloses a laser system as a replacement for a nitrogen laser in a UV MALDI mass spectrometer, in which a solid or a semiconductor is used as the laser medium of the laser system and the laser system emits pulsed laser radiation in the wavelength range between 332 and 342 nanometers.

Die amerikanische Patentanmeldung US 2005/0056776 A1 offenbart eine Laserdesorptions-Ionenquelle.US patent application US 2005/0056776 A1 discloses a laser desorption ion source.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Es ist die Aufgabenstellung für die Erfindung, sowohl für die Analyse von Proben in hoher räumlicher Dichte, wie beispielsweise in der bildgebenden Massenspektrometrie, wie auch für die gleichmäßige Abtragung der Proben auf vorgegebenen Flächen die Einrichtung zur Bewegung des Probenträgers von schnellen stoßweisen Bewegungen zu entlasten.It is the object of the invention, both for the analysis of samples in high spatial density, such as in imaging mass spectrometry, as well as for the uniform removal of the samples on predetermined surfaces to relieve the device for moving the sample carrier of rapid jerky movements.

Kurze Beschreibung der ErfindungBrief description of the invention

Die Erfindung sieht im Grundsatz zur Entlastung des Trägerplatten-Bewegungsantriebs die Verwendung eines Lasersystems mit einer schnellen Positionssteuerung des Laserspots auf der Probenträgerplatte vor. Für die Erzeugung sehr feiner Laserspots von wenigen Mikrometern Durchmesser ergibt sich allerdings ein Problem: Einerseits muss das Objektiv zur Erzeugung der Laserspots zur Vermeidung von Bedampfungen mit Probenmaterial recht weit von der Probenträgerplatte entfernt angebracht sein, daher muss nach den Gesetzen der Optik ein Objektiv großer Öffnung und längerer Brennweite in Verbindung mit einem aufgeweiteten Laserstrahl eingesetzt werden, um einen genügend kleinen Laserspot auf der Probenträgerplatte in der Ionenquelle des Massenspektrometers erzeugen zu können. Andererseits müssen für schnelle Positionsänderungen im Zeitrahmen von etwa 100 Mikrosekunden sehr kleine Spiegel mit geringem Trägheitsmoment eingesetzt werden; diese müssen daher vor der notwendigen Aufweitung des Laserstrahls eingesetzt werden. Dieses Problem lässt sich dadurch lösen, dass ein Spiegelsystem, beispielsweise mit kleinen Galvospiegeln, das gebrauchsfertig im Handel zu beziehen ist und eine Ablenkung in zwei Richtungen erlaubt, im Inneren des Lasersystems vor einem eigens berechneten Keplerschen Teleskop zur Aufweitung des Laserstrahls verwendet wird, und zwar so, dass sich die Winkelablenkung des dünnen Laserstrahls durch das Teleskop und das Objektiv hindurch in eine Änderung der Spotposition umsetzt. Das Lasersystem enthält also neben der eigentlichen Einrichtung zur Laserstrahlerzeugung aus dem Laserkristall und gegebenenfalls einer Einrichtung zur Vervielfachung der Frequenz des Laserlichts das erwähnte Spiegelsystem, ferner das Spezialteleskop zur Strahlaufweitung und das weit geöffnete Objektiv zur Fokussierung des aufgeweiteten Strahls zum Laserspot. Außerdem kann das Lasersystem einen Mustergenerator zur Erzeugung eines Spotmusters aus beispielsweise 4, 7, 9, 16 oder 19 einzelnen Laserspots enthalten. Wird UV-Licht für die Ionisierung verwendet, so müssen bevorzugt alle Linsen des Teleskops und des Objektivs und auch der Mustergenerator aus reinem Quarzglas gefertigt sein.The invention provides in principle for the relief of the carrier plate movement drive, the use of a laser system with a fast position control of the laser spot on the sample carrier plate. For the production of very fine laser spots of a few micrometers diameter, however, there is a problem: On the one hand, the lens must be mounted far away from the sample support plate to generate the laser spots to avoid vapor deposition with sample material, therefore, according to the laws of optics, a lens with a large opening and longer focal length in conjunction with an expanded laser beam can be used to generate a sufficiently small laser spot on the sample carrier plate in the ion source of the mass spectrometer can. On the other hand, for fast position changes in the time frame of about 100 microseconds, very small moment of inertia mirrors must be used; These must therefore be used before the necessary expansion of the laser beam. This problem can be solved by using a mirror system, for example, with small galvic mirrors, ready to use commercially available and allowing for bidirectional deflection, inside the laser system in front of a specially calculated Keplerian telescope for expanding the laser beam, namely such that the angular deflection of the thin laser beam through the telescope and the lens is converted into a change in the spot position. The laser system thus contains not only the actual device for laser beam generation from the laser crystal and optionally a device for multiplying the frequency of the laser light mentioned mirror system, also the special telescope for beam expansion and the wide-open lens for focusing the expanded beam to the laser spot. In addition, the laser system may include a pattern generator for generating a spot pattern of, for example, 4, 7, 9, 16 or 19 individual laser spots. If UV light is used for the ionization, then preferably all lenses of the telescope and of the lens and also the pattern generator must be made of pure quartz glass.

Die schnelle Positionssteuerung erlaubt eine optimale Ausnutzung aller Analytmoleküle aus einer vorgegebenen Fläche einer Probe (der „Probenstelle”) durch gleichmäßiges Abtragen der Probe innerhalb dieser Fläche mit einem einzelnen Laserspot oder bevorzugt mit einem Laserspotmuster, ohne dass dabei das Bewegungsmuster für das Abtragen durch Bewegungen der Probenträgerplatte erzeugt werden müsste.The rapid position control allows optimal utilization of all analyte molecules from a given area of a sample (the "sample site") by evenly ablating the sample within that area with a single laser spot, or preferably with a laser spot pattern, without sacrificing the movement pattern for ablation by movements of the laser sample Sample carrier plate would have to be produced.

Für die Aufnahme von Massenspektren vieler Probenstellen nacheinander erlaubt es die Positionssteuerung für den Laserspot, den Probenträger kontinuierlich, bevorzugt mit gleich bleibender Geschwindigkeit in einer Richtung, zu bewegen und die Spotposition durch Bewegung des Laserstrahls so mitzuführen, dass die Einzelflugzeitspektren für jedes Massenspektrum von jeweils derselben Probenstelle gewonnen werden. In dieser Phase haben also die Relativbewegungen zwischen Probenträgerplatte und Laserspot den Wert null. Dabei können dieser Mitführungsbewegung auch noch die feineren Laserspotbewegungen für ein gleichmäßiges Abtragen einer vorgegebenen Probenstellenfläche überlagert werden. Für die bildgebende Massenspektrometrie bleibt dann die räumliche Auflösung für die einzelnen Massenspektren erhalten und es wird gleichzeitig ein hoher Nutzgrad für die Analytmoleküle erreicht. Für die jeweils nächste Aufnahme eines Massenspektrums an einer anderen Probenstelle wird die Spotposition durch sprunghafte Bewegung des Spiegels innerhalb der Zeitdauer von nur 100 Mikrosekunden bis zum nächsten Laserschuss zu dieser anderen Probenstelle gesteuert. In dieser Phase sind die Relativbewegungen zwischen Probenträgerplatte und Laserspot stark verschieden. Für diese Betriebsweise ist es allerdings erforderlich, ionenoptische Korrekturen des sich ändernden Strahlenganges der Ionen durch das Massenspektrometer und Korrekturen der veränderten Flugzeit vorzunehmen. Die Probenstellen brauchen sich auf der Probenträgerplatte nicht in eindimensionaler Reihung zu befinden, es können auch durch laterale Bewegungen des Laserspots nebeneinander liegende Probenstellen analysiert werden. Es ist so ein mehrspuriges Analysieren von Proben während einer gleichmäßigen Bewegung der Probenträgerplatte in einer Richtung möglich.For the acquisition of mass spectra of many sample points successively, the position control for the laser spot allows the sample carrier to move continuously, preferably at constant speed in one direction, and to carry the spot position by movement of the laser beam so that the individual flight time spectra for each mass spectrum of each of them Sample spot to be won. In this phase, therefore, the relative movements between sample carrier plate and laser spot have the value zero. In this case, this tracking movement can also be superimposed on the finer laser spot movements for a uniform removal of a given sample site area. For imaging mass spectrometry, the spatial resolution for the individual mass spectra is then retained and, at the same time, a high degree of usefulness for the analyte molecules is achieved. For the next recording of a mass spectrum at another sample location, the spot position is controlled by sudden movement of the mirror within the period of only 100 microseconds until the next laser shot to this other sample location. In this phase, the relative movements between sample carrier plate and laser spot are very different. For this mode of operation, however, it is necessary to make ion-optical corrections of the changing beam path of the ions through the mass spectrometer and corrections to the changed flight time. The sample sites do not need to be in one-dimensional order on the sample carrier plate; they can also be juxtaposed by lateral movements of the laser spot Sample points are analyzed. Such a multi-track analysis of samples during a uniform movement of the sample support plate in one direction is possible.

Diese Aufnahmeverfahren für Massenspektren können insbesondere bei der bildgebenden Massenspektrometrie von Gewebedünnschnitten, bei der Analyse dünnschichtchromatographischer Platten, aber auch bei anderen analytischen Aufgaben mit hoher Dichte an Proben eingesetzt werden.These mass spectral recording methods can be used in particular in the imaging mass spectrometry of tissue thin sections, in the analysis of thin-layer chromatographic plates, but also in other analytical tasks with high density of samples.

In verschiedenen Ausführungsformen kann der Laserspot ein Intensitätsmuster enthalten. Die Relativbewegung wird dann vorzugsweise zwischen einem Schwerpunkt des Intensitätsmusters auf dem Probenträger und dem Probenträger erzeugt. Bei diesem Schwerpunkt kann es sich zum Beispiel um einen geometrischen Schwerpunkt oder auch einen Intensitätsschwerpunkt handeln. Auch in diesen Ausführungsformen können klein-skalige Relativbewegungen des Intensitätsmusters zum Probenträger ausgeführt werden, um den Probenabtrag möglichst gleichmäßig über eine Laserspotgesamtfläche zu verteilen.In various embodiments, the laser spot may include an intensity pattern. The relative movement is then preferably generated between a center of gravity of the intensity pattern on the sample carrier and the sample carrier. This center of gravity may be, for example, a geometric center of gravity or an intensity center of gravity. Also in these embodiments, small-scale relative movements of the intensity pattern to the sample carrier can be carried out in order to distribute the sample removal as evenly as possible over a laser spot total area.

Die schnelle Positionssteuerung für die Laserspots kann auch zur Lösung weitere Probleme eingesetzt werden. So ist es beispielsweise möglich, mit besonderen Proben, die über genügend lange Zeiten hinweg Spektren in gleich bleibender Intensität liefern, eine vollautomatische Justierung von MALDI-Flugzeitmassenspektrometern vorzunehmen, gesteuert durch Programme im angeschlossenen Rechner. Dabei können nicht nur die beste Spotposition in Bezug auf die Ionenoptik des Spektrometers und alle notwendigen Korrekturspannungen für die Ionen aus Spots außerhalb dieser optimalen Stelle automatisch ermittelt werden, sondern es können auch die Elemente der Ionenoptik selbst optimal justiert werden, jedenfalls, soweit diese ionenoptischen Elemente wie beispielsweise Reflektor und Detektor zumindest für die Zeit einer Justierung mit Bewegungseinrichtungen versehen sind.The fast position control for the laser spots can also be used to solve other problems. It is thus possible, for example, to carry out fully automatic adjustment of MALDI time-of-flight mass spectrometers with special samples which supply spectra of constant intensity over sufficiently long periods, controlled by programs in the connected computer. Not only can the best spot position with respect to the ion optics of the spectrometer and all necessary correction voltages for the ions from spots outside this optimal location be automatically determined, but also the elements of the ion optics themselves can be optimally adjusted, at least insofar as these ion optical elements such as reflector and detector are provided at least for the time of adjustment with moving means.

Kurze Beschreibung der AbbildungenBrief description of the illustrations

zeigt schematisch ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer mit einem Flugzeitanalysator (1) und einem Lasersystem (2), das durch ein Spiegelsystem (7, 8) eine Steuerung der Laserspotposition des Lichtpulses auf der Probenträgerplatte (13) bewirkt. Der Laserpuls wird in der Strahlerzeugungseinheit (3) generiert, die einem Laserkristall (4) und erforderlichenfalls eine Vorrichtung (5) für eine Vervielfachung der Frequenz enthält, im Mustergenerator (6) in ein Spotmuster zerlegt, und im Spiegelsystem durch zwei Galvospiegel (7) und (8) in beiden Raumrichtungen abgelenkt. Der abgelenkte Laserstrahl wird dann in einem Keplerschen Teleskop (9) aufgeweitet und gemäß der Winkelablenkung parallel verschoben, der austretende Laserstrahl wird mit verkleinerter Winkelablenkung über den Spiegel (10) wieder genau zentral in das Objektiv (11) gerichtet. Das Objektiv (11) wird je nach Winkelablenkung zentral, aber unter leicht verschiedenen Winkeln durchstrahlt, wodurch sich die Positionsverschiebung des Spotmusters auf der Probenträgerplatte (13) ergibt. Die in den Plasmawolken des Laserspotmusters generierten Ionen werden durch Spannungen an den Blenden (14) und (15) zu einem Ionenstrahl (18) beschleunigt, der die beiden Ablenkkondensatoren zur Bahnkorrektur passiert und im Reflektor (19) auf den Detektor (20) fokussiert wird. Es sei hier angemerkt, dass die Strahlführung innerhalb eines Teleskops (9) nach Kepler komplizierter ist und aus Vereinfachungsgründen von der Abbildung nicht real wiedergegeben wird, die Abbildung gibt aber die Außenwirkung des Teleskops auf den Laserlichtstrahl richtig wieder. schematically shows a MALDI time-of-flight mass spectrometer with a time-of-flight analyzer ( 1 ) and a laser system ( 2 ) through a mirror system ( 7 . 8th ) a control of the laser spot position of the light pulse on the sample carrier plate ( 13 ) causes. The laser pulse is generated in the beam generation unit ( 3 ) generated by a laser crystal ( 4 ) and, if necessary, a device ( 5 ) for a multiplication of the frequency, in the pattern generator ( 6 ) decomposed into a spot pattern, and in the mirror system by two galvo mirrors ( 7 ) and ( 8th ) deflected in both directions. The deflected laser beam is then in a Kepler telescope ( 9 ) expanded and moved in parallel according to the angular deflection, the emerging laser beam is with reduced angular deflection of the mirror ( 10 ) again exactly in the center of the lens ( 11 ). The objective ( 11 ) is irradiated centrally depending on the angular deflection, but at slightly different angles, whereby the positional shift of the spot pattern on the sample carrier plate (FIG. 13 ). The ions generated in the plasma clouds of the laser spot pattern are caused by voltages at the diaphragms ( 14 ) and ( 15 ) to an ion beam ( 18 ), which passes the two deflection capacitors for path correction and in the reflector ( 19 ) on the detector ( 20 ) is focused. It should be noted here that the beam guidance within a telescope ( 9 ) is more complicated according to Kepler and is not reproduced in reality for reasons of simplification, but the figure correctly reproduces the external effect of the telescope on the laser light beam.

stellt verschiedene Laserspotmuster mit 1, 4, 7 und 9 einzelnen Laserspots dar. Die Abstände zwischen den Spots sind hier gerade so groß gewählt wie der Spotdurchmesser, es können jedoch auch Muster mit anderen Abständen und Spotdurchmessern hergestellt werden. represents different laser spot patterns with 1, 4, 7 and 9 individual laser spots. The distances between the spots here are just as large as the spot diameter, but it is also possible to produce patterns with different distances and spot diameters.

In wird gezeigt, wie sich von einer quadratischen Probenfläche mit 50 Mikrometer Seitenlänge durch ein Laserspotmuster mit neun Laserspots eine erste Abtragungsschicht durch insgesamt 32 Laserschüsse gleichmäßig abtragen lässt, wenn die einzelnen Laserspots des Musters vier Mikrometer Durchmesser und Mittelpunktsabstände von acht Mikrometern haben. Je nach Art der Probenpräparation können Analytionen aus Tiefen von drei bis zehn solcher Abtragungsschichten geliefert werden. Bei dreimaligem Abrastern werden aus der Fläche 96 Einzelflugzeitspektren gewonnen, die addiert und zu einem Massenspektrum umgewandelt werden können. Aus einem Quadratzentimeter Probenfläche werden dann 40000 Massenspektren aufgenommen, die bei 10 kHz Laserschussrate aus etwa 4 Millionen Einzelflugzeitspektren in nur sieben Minuten gewonnen werden.In It is shown how a first ablation layer can be uniformly ablated by a total of 32 laser shots from a 50 micron square side sample area through a laser spot pattern with nine laser spots when the individual laser spots of the pattern are four microns in diameter and eight micron center distances. Depending on the type of sample preparation, analyte ions can be delivered from depths of three to ten such ablation layers. By scanning three times, single-flight time spectra are obtained from the area 96, which can be added together and converted into a mass spectrum. From a square centimeter of sample surface then 40,000 mass spectra are recorded, which are obtained at 10 kHz laser shot rate from about 4 million individual flight time spectra in just seven minutes.

zeigt das Schema, mit dem bei einer gleichmäßig bewegten Probenträgerplatte (13) eine Mitführung des Laserspots erfolgt. Zunächst werden von der Probenstelle (c) genügend Einzelflugzeitspektren für die Erzeugung eines Massenspektrums aufgenommen, wonach der Laserspot auf die Probenstelle (b) gelenkt und mit dieser Probenstelle mitgeführt wird, bis auch von dieser Probenstelle genügend Einzelflugzeitspektren erhalten wurden. Dieser Vorgang wird mit weiteren Probenstellen fortgesetzt. shows the scheme with which in a uniformly moving sample support plate ( 13 ) carried along a laser spot. First of all, sufficient individual time-of-flight spectra for the generation of a mass spectrum are taken from the sample site (c), after which the laser spot is directed to the sample site (b) and carried along with this sample site until enough individual time-of-flight spectra have been obtained from this sample site. This process is continued with further sample points.

zeigt, dass bei gleichmäßig und langsam in Richtung (23) bewegter Probenträgerplatte (13) mit einer größeren Probenfläche (22) in einem Bewegungsdurchgang für die Probenträgerplatte auch Probenstellen in mehreren Spuren (25) nebeneinander analysiert werden können, wobei die Positionssteuerung für den Laserspot dem Bewegungsmuster (24) folgt, mit jeweils einem Halt auf jeder Probenstelle, hier durch Punkte symbolisiert. shows that when moving evenly and slowly in the direction ( 23 ) moving Sample carrier plate ( 13 ) with a larger sample area ( 22 ) in a movement passage for the sample support plate also sample points in multiple tracks ( 25 ) can be analyzed side by side, wherein the position control for the laser spot the movement pattern ( 24 ), each with a stop on each sample point, symbolized here by dots.

Beste AusführungsformenBest embodiments

Wie oben bereits ausgeführt, hat die Erfindung zum Ziel, stoßweise Bewegungen oder auch schnelle Hin- und Herbewegungen der mechanisch trägen Probenträgerplatte einschließlich ihrer Halterung soweit möglich zu vermeiden und durch eine massearme Bewegungsvorrichtung für den Laserlichtstrahl zu ersetzen. Die Bewegungsvorrichtung soll in der Lage sein, den Laserspot in der Zeit von nur 100 Mikrosekunden, also zwischen zwei Laserschüssen, auf eine andere Stelle zu versetzen. Für die schnelle Positionssteuerung des Laserspots oder Laserspotmusters können im Prinzip verschiedenartige Ablenksysteme eingesetzt werden, wie beispielsweise piezoelektrisch bewegte Spiegel oder Kristalle mit elektrisch veränderbarer Refraktion. Technisch am weitesten ausgereift und preislich besonders günstig sind allerdings elektrisch bewegte Galvospiegel, wie sie für Laserscanner oder für Laserbeschriftungsapparate entwickelt wurden. Im technischen Grenzfall können kleine Galvospiegel mit etwa 4 Millimeter Durchmesser innerhalb von 100 Mikrosekunden von einer Winkelposition in eine andere bewegt werden, sofern die Winkeländerungen nur klein sind: es ist damit in idealer Weise möglich, den Laserspot zwischen zwei Schüssen eines 10-kHz-Lasers geeignet zu verschieben. Es gibt kommerzielle Einheiten mit jeweils zwei dieser Galvospiegel für Ablenkungen in beiden Raumrichtungen quer zum Strahl. Diese Galvospiegel haben darüber hinaus den Vorteil, in der angefahrenen Winkelposition stromlos zu verharren, wobei sie aber durch einen Winkelpositionsgeber rückgekoppelt gesteuert dort festgehalten werden.As already stated above, the invention has the goal to avoid jerky movements or even fast back and forth movements of the mechanically inert sample support plate including its holder as far as possible and to replace it with a low-mass movement device for the laser light beam. The movement device should be able to move the laser spot to a different position within a period of only 100 microseconds, ie between two laser shots. In principle, various types of deflection systems can be used for the rapid position control of the laser spot or laser spot pattern, such as piezoelectrically moving mirrors or crystals with electrically variable refraction. However, technically most advanced and priced particularly favorable are electrically moving Galvo mirrors, as they were developed for laser scanners or for laser marking apparatus. In the technical limit, small galvo mirrors with a diameter of about 4 millimeters can be moved from one angular position to another within 100 microseconds, provided that the angle changes are small: it is thus ideally possible to emit the laser spot between two shots of a 10 kHz laser suitable to move. There are commercial units, each with two of these galvo mirrors for distractions in both spatial directions across the beam. In addition, these galvo mirrors have the advantage that they remain currentless in the approached angular position, but they are held back there controlled by an angular position sensor.

Das Einbringen dieser Galvospiegel in den Strahlengang zwischen Laser und Probenträgerplatte bietet allerdings ein Problem und erfordert eine technische Lösung mit einigem Aufwand. Es ist nicht möglich, die zur Erzielung eines geringen Trägheitsmoments notwendigerweise kleinen Spiegel in räumlicher Nähe zur Probenträgerplatte anzuordnen, da hier ein Laserstrahl nach den Gesetzen der Optik einen großen Durchmesser haben muss, um mit einem relativ weit entfernten Objektiv einen kleinen Laserspot erzeugen zu können. Eine Position im verjüngten Laserstrahl dicht vor der Probenträgerplatte ist ungünstig, weil die Spiegel rasch mit verdampfendem oder verspritzendem Probenmaterial bedeckt werden würden. Das Problem wird dadurch gelöst, dass die Galvospiegel (7, 8) stattdessen, wie in schematisch dargestellt, in der Lasereinheit (2) selbst vor jeder Aufweitung des Laserstrahls und weit weg von der Probenträgerplatte (13) angeordnet werden, aber so, dass sie trotzdem eine Veränderung der Position des Laserspots auf der Probenträgerplatte (13) bewirken. Das geschieht dadurch, dass zunächst mit der Strahlerzeugungseinheit (3), beispielsweise mit einem Nd-YAG-Laserkristall (4) und einem Frequenzverdreifacher (5) auf 355 Nanometer (in diesem Beispiel also im ultravioletten Spektralbereich), ein gepulster Laserlichtstrahl von nur 2 Millimeter Durchmesser erzeugt wird. Eine von den Galvospiegeln (7) und (8) bewirkte Winkelablenkung dieses dünnen Laserlichtstrahls wird dann in einem eigens berechneten und hergestellten Keplerschen Teleskop (9) in einen Parallelversatz des Laserlichtstrahls innerhalb des Teleskops (9) umgesetzt, wobei der Parallelversatz beim Verlassen des Teleskops (9) wieder in einen (schwächeren) Winkelversatz transformiert wird. Das Teleskop (9) weitet gleichzeitig den Laserstrahl von 2 auf etwa 16 Millimeter auf. Für die Erzeugung eines kleinen Laserspots von nur 4 bis 5 Mikrometer Durchmesser auf der Probenträgerplatte (13) ist es notwendig, den aufgeweiteten Laserstrahl mit einem gut gegen sphärische Aberration und andere Bildfehler wie Astigmatismus und Koma korrigiertes Objektiv (11) mit hohem Öffnungsdurchmesser auf die Probenträgerplatte zu fokussieren. Die Winkelablenkung des Laserlichtstrahls beim Verlassen des Teleskops (9) in Verbindung mit dem Versatz des Strahls richtet den Laserlichtstrahl bei richtiger Justierung wieder genau zentral auf die Mitte des Objektivs (11), wobei aber nun das Objektiv (11) unter einem kleinen Winkel durchstrahlt wird, der sich in eine Verschiebung des Laserspots auf der Probenträgerplatte (13) umsetzt. Die mittige Durchstrahlung des Objektivs (11) ist wichtig für eine Erzeugung eines sauberen Laserspots kleinen Durchmessers, da nur so die Fehlerkorrekturen des Objektivs (11) voll zur Wirkung kommen. Es sei hier angemerkt, dass die Strahlführung innerhalb des Keplerschen Teleskops (9) kompliziert ist und von der nicht konkret wiedergegeben wird, die gibt aber die Außenwirkung des Teleskops (9) auf den Laserlichtstrahl richtig wieder.The introduction of these galvo mirrors in the beam path between the laser and sample support plate, however, presents a problem and requires a technical solution with some effort. It is not possible to arrange the necessary to achieve a low moment of inertia small mirror in proximity to the sample support plate, since a laser beam according to the laws of optics must have a large diameter in order to produce a small laser spot with a relatively distant lens can. A position in the tapered laser beam close to the sample support plate is unfavorable because the mirrors would be rapidly covered with evaporating or spattering sample material. The problem is solved by the galvos ( 7 . 8th ) instead, as in shown schematically in the laser unit ( 2 ) even before each expansion of the laser beam and far away from the sample carrier plate ( 13 ), but in such a way that they nevertheless change the position of the laser spot on the sample carrier plate ( 13 ) cause. This happens because first with the beam generation unit ( 3 ), for example with an Nd-YAG laser crystal ( 4 ) and a frequency tripler ( 5 ) to 355 nanometers (in this example, in the ultraviolet spectral range), a pulsed laser light beam of only 2 millimeters in diameter is generated. One of the galvo mirrors ( 7 ) and ( 8th ) induced angular deflection of this thin laser light beam is then in a specially calculated and manufactured Kepler telescope ( 9 ) in a parallel offset of the laser light beam within the telescope ( 9 ), wherein the parallel offset when leaving the telescope ( 9 ) is transformed back into a (weaker) angular offset. The telescope ( 9 ) simultaneously expands the laser beam from 2 to about 16 millimeters. For creating a small laser spot of only 4 to 5 microns in diameter on the sample carrier plate ( 13 ), it is necessary to have the expanded laser beam with a lens well corrected against spherical aberration and other aberrations such as astigmatism and coma ( 11 ) with a high opening diameter to focus on the sample carrier plate. The angular deflection of the laser light beam as it exits the telescope ( 9 ) in conjunction with the offset of the beam directs the laser light beam with proper adjustment again exactly central to the center of the lens ( 11 ), but now the lens ( 11 ) is irradiated at a small angle, which translates into a displacement of the laser spot on the sample carrier plate ( 13 ). The central transmission of the lens ( 11 ) is important for generating a clean laser spot of small diameter, since only so the error corrections of the lens ( 11 ) come to full effect. It should be noted here that the beam guidance within the Kepler telescope ( 9 ) is complicated and of the is not reproduced in concrete terms, the but gives the external effect of the telescope ( 9 ) on the laser light beam properly again.

Wenn es sich um UV-Strahlung handelt, sind alle Linsen des Teleskops (9) und des Objektivs (11) wegen der hohen Energiedichte vorzugsweise aus sehr sauberem, UV-durchlässigem Material wie beispielsweise Quarzglas zu fertigen. Bewährt haben sich für einen Laserstrahl von primär 2 mm Durchmesser Galvospiegel (7) und (8) mit 4,5 mm Durchmesser, die für kleinere Winkelablenkungen bis zu etwa 5 Millirad die Bedingung einer Winkeländerung in nur 100 Mikrosekunden erfüllen. Das Objektiv (11) hat einen Öffnungsdurchmesser von etwa 20 mm. Es können damit Laserspots mit Durchmessern von etwa vier bis fünf Mikrometern in einer Entfernung von etwa 100 Millimeter vom Objektiv (11) erzeugt werden. Dieser Abstand des Objektivs von der Probenträgerplatte ist günstig, um Verschmutzungen durch verdampfendes oder verspritzendes Probenmaterial zu vermeiden.If it is UV radiation, all lenses of the telescope ( 9 ) and the lens ( 11 ) because of the high energy density preferably from very clean, UV-transparent material such as quartz glass to manufacture. Have proven useful for a laser beam of primary 2 mm diameter Galvo mirror ( 7 ) and ( 8th ) with 4.5 mm diameter that meet the condition of an angle change in just 100 microseconds for smaller angular deflections up to about 5 millirad. The objective ( 11 ) has an opening diameter of about 20 mm. It can thus laser spots with diameters of about four to five microns at a distance of about 100 millimeters from the lens ( 11 ) be generated. This distance of the lens from the Sample carrier plate is favorable to avoid contamination by evaporating or splashing sample material.

Die Laserspots oder Laserspotmuster lassen sich mit den Galvospiegeln (7) und (8) auf der Probenträgerplatte (13) um etwa plus oder minus 150 Mikrometer verschieben. In diesem quadratischen Bewegungsbereich der Laserspots mit 300 Mikrometer Seitenlänge können die dort erzeugten Ionen noch von der beschleunigenden Ionenoptik (14, 15) der Ionenquelle erfasst und beschleunigt werden. Durch Verwendung eines geeigneten Mustergenerators (6) lassen sich mit dieser Anordnung auch Muster mit beispielsweise vier, sieben, neun oder 16 Laserspots generieren, wie sie beispielsweise in gezeigt werden.The laser spots or laser spot patterns can be combined with the galvo mirrors ( 7 ) and ( 8th ) on the sample carrier plate ( 13 ) by about plus or minus 150 microns. In this quadratic range of movement of the laser spots with a side length of 300 micrometers, the ions generated there can still be detected by the accelerating ion optics (FIG. 14 . 15 ) of the ion source are detected and accelerated. By using a suitable pattern generator ( 6 ) can be with this arrangement also generate patterns with, for example, four, seven, nine or 16 laser spots, as for example in to be shown.

Werden die Ionen allerdings etwas außerhalb der Achse der Ionenoptik (14, 15) für die Ionenquelle erzeugt, so werden sie nicht mehr auf den Ionendetektor (20) am Ende der Flugstrecke abgebildet. Es ist somit notwendig, die Ionen durch Ablenkeinheiten (16) und (17) wieder auf den Ionendetektor auszurichten. Solche Ablenkeinheiten bestehen hier aus zwei gekreuzten Ablenkkondensatoren (16) und (17); die zur Korrektur notwendigen Spannungen betragen einige 100 Volt und müssen von einem gut steuerbaren Spannungsgenerator geliefert werden.However, if the ions are slightly out of the axis of the ion optics ( 14 . 15 ) are generated for the ion source, so they are no longer on the ion detector ( 20 ) at the end of the route. It is thus necessary to pass the ions through deflecting units ( 16 ) and ( 17 ) to align with the ion detector again. Such deflection units here consist of two crossed deflection capacitors ( 16 ) and ( 17 ); the voltages required for correction are a few 100 volts and must be supplied by a well controllable voltage generator.

Außerdem haben Ionen, die außerhalb der Achse der Ionenquelle (13, 14, 15) generiert werden, einen etwas längeren Flugweg bis zum Ionendetektor (20) und erleiden dadurch eine Verlängerung ihrer Flugzeit. Die Verlängerung des Flugweges kann mehrere Mikrometer ausmachen. Da eine Verlängerung des Flugweges von nur einem Mikrometer bei einer Gesamtfluglänge von zwei Metern bereits eine Flugzeitverlängerung von einem halben Millionstel der Flugzeit, gleichbedeutend mit einem Millionstel der Masse, ergibt, ist auch hierfür eine Korrektur notwendig, wenn eine hohe Massengenauigkeit erhalten bleiben soll. Das kann beispielsweise durch eine Korrektur der Verzögerungszeit der Beschleunigung, durch eine Korrektur der Spannung in der ersten Beschleunigungsstrecke zwischen Probenträgerplatte (13) und erster Beschleunigungsblende (14), durch eine Korrektur der Gesamtbeschleunigung oder durch eine andere Vorrichtung zur Korrektur der Flugzeit geschehen. Korrekturspannungen für zusätzliche Beschleunigungen betragen einige Volt. Die Korrektur der Flugzeit ist dann ebenso mit der Position des Laserspots mitzuführen wie auch schon die Ablenkspannung für die Bahnkorrektur an den Ablenkeinheiten (16) und (17).In addition, ions outside the axis of the ion source ( 13 . 14 . 15 ), a slightly longer flight path to the ion detector ( 20 ) and thereby suffer an extension of their flight time. The extension of the flight path can be several micrometers. Since an extension of the flight path of only one micrometer for a total flight length of two meters already results in a flight time extension of half a millionth of the flight time, equivalent to one millionth of the mass, this also a correction is necessary if a high mass accuracy is to be maintained. This can be achieved, for example, by correcting the deceleration time of the acceleration, by correcting the voltage in the first acceleration section between the sample carrier plate (FIG. 13 ) and first accelerator diaphragm ( 14 ), by a correction of the total acceleration or by another device for correcting the time of flight. Correction voltages for additional accelerations are a few volts. The correction of the time of flight is then carried along with the position of the laser spot as well as the deflection voltage for the path correction at the deflection units ( 16 ) and ( 17 ).

Im Prinzip kann die verlängerte Flugstrecke auch rechnerisch bei der Umrechnung von Flugzeiten in Massen berücksichtigt werden. Diese Umrechnung wird im Allgemeinen durch parametrisierte Kalibrierfunktionen durchgeführt. Die Korrektur besteht dann in einer Änderung der Parameterwerte. Für den Einsatz dieses Verfahrens auf einer gleichmäßig bewegten Probenträgerplatte, wie sie unten geschildert werden wird, ist diese rechnerische Korrektur aber nicht möglich, da die Einzelflugzeitspektren verschiedener Genesepunkte zunächst zu einem Summenflugzeitspektrum addiert werden sollen. Die Einzelflugzeitspektren sind somit vor ihrer Addition zu einem Summenflugzeitspektrum zu korrigieren, daher ist eine elektrische Korrektur der Flugzeiten, die die sofortige Addition ermöglicht, zu bevorzugen.In principle, the extended flight path can also be mathematically taken into account in the conversion of flight times in masses. This conversion is generally performed by parameterized calibration functions. The correction then consists in a change of the parameter values. For the use of this method on a uniformly moving sample carrier plate, as will be described below, this computational correction is not possible because the individual time-of-flight spectra of different Genesepunkte should first be added to a sum flight time spectrum. The individual flight time spectra are thus to be corrected before their addition to a sum flight time spectrum, so an electrical correction of the flight times, which allows the immediate addition, to be preferred.

In einem ersten Ausführungsbeispiel wird eine schnelle Positionssteuerung des Laserspots zur Entlastung des Trägerplatten-Bewegungsantriebs bei schnellen Folgen von Analysen dicht benachbarter Probenstellen eingesetzt. Das Prinzip dazu ist in wiedergegeben. Der Bewegungsantrieb für die Probenträgerplatte (13), der in der Regel aus Schrittmotor und Gewindespindel besteht, ist nach heutiger Technik für eine schnelle Analysenfolge von bis zu 200 Probenstellen pro Sekunde ungeeignet. Durch den pulsweisen Weitertransport der relativ schweren Probenträgerplatte von Probe zu Probe wird der Bewegungsantrieb außerordentlich stark belastet und hohem Verschleiß unterworfen. Durch die Trägheit des Systems wird für das Bewegen von Probenstelle zu Probenstelle wesentlich mehr Zeit benötigt, als zwischen zwei Laserschüssen zur Verengung steht. Daher können in dieser Zeit keine Massenspektren aufgenommen werden und die gewünschte Aufnahmerate von 10 kHz kann nicht erreicht werden. Versuche, die Probenträgerplatte kontinuierlich zu bewegen und mit unbewegter Laserspotposition abzurastern, haben selbst für die bildgebende Massenspektrometrie an Gewebedünnschnitten keine befriedigenden Ergebnisse gezeigt; für einzeln präparierte Proben auf Probenträgern ist dieses Verfahren aus ersichtlichen Gründen überhaupt nicht anzuwenden.In a first embodiment, a fast position control of the laser spot is used to relieve the carrier plate movement drive in rapid succession of analyzes closely adjacent sample points. The principle is in played. The movement drive for the sample carrier plate ( 13 ), which usually consists of stepper motor and threaded spindle, is unsuitable for a rapid analysis sequence of up to 200 sample points per second according to current technology. Due to the pulsed further transport of the relatively heavy sample carrier plate from sample to sample of the motion drive is extremely heavily loaded and subjected to high wear. Due to the inertia of the system, much more time is needed to move the sample site to the sample site than to constrict between two laser shots. Therefore, no mass spectra can be recorded during this time and the desired recording rate of 10 kHz can not be achieved. Attempts to continuously move the sample support plate and scrape it with stationary laser spot position have not shown satisfactory results even for thin-slice tissue mass spectrometry; For individually prepared samples on sample carriers, this procedure should not be used at all for obvious reasons.

Es wird nun vorgeschlagen, die Probenträgerplatte kontinuierlich weiter zu bewegen, beispielsweise mit gleich bleibender Geschwindigkeit in einer Richtung, aber für die notwendige Anzahl an Einzelflugzeitspektren aus einer Spotposition auf der Probe, beispielsweise der Spotposition (c) in , die Spotposition durch die schnelle Positionssteuerung mitzuführen. Durch diese phasenweise Mitführung der Spotposition auf dem kontinuierlich bewegten Probenträger (13) wird erreicht, dass die Einzelflugzeitspektren von derselben Probenstelle (c) gewonnen werden und somit keine Vermischung von Einzelflugzeitspektren von verschiedenen Probenstellen stattfindet. Für die bildgebende Massenspektrometrie bleibt so die räumliche Auflösung des massenspektrometrischen Bildes erhalten. Es verschiebt sich allerdings der Entstehungsort der Ionen in Bezug auf die Achse des Massenspektrometers, insbesondere in Bezug auf die Achse der ionenoptischen Anordnung (14, 15) in der Ionenquelle, so dass auch eine synchrone ionenoptische Korrektur des sich ändernden Strahlenganges der Ionen, beispielsweise durch die x-y-Ablenkungskondensatoren (16) und (17) im Strahlengang der Ionen im Flugzeitmassenspektrometer und eine Korrektur der Flugzeit durch zusätzliche Beschleunigungsspannungen vorzunehmen ist. Die Korrekturspannungen für diese Ablenkung und für die Zusatzbeschleunigung sind dann mit den Veränderungen der Spotposition gegenüber der optischen Achse mitzuführen. Für die nachfolgende Aufnahme des Massenspektrums einer anderen Probenstelle, beispielsweise der Probenstelle (b), das wieder aus vielen Einzelflugzeitspektren gewonnen werden muss, wird die Spotposition sprunghaft zur dieser anderen Probestelle (b) gesteuert und dann wieder mitgeführt. Es wechseln sich also Phasen, in denen die Relativgeschwindigkeit zwischen Probenträgerplatte und Laserspot den Wert null hat, mit solchen Phasen ab, in den die Relativgeschwindigkeiten ungleich null sind. Dabei werden jeweils auch alle Korrekturspannungen geändert. Bei richtiger Abstimmung der Bewegungsgeschwindigkeit der Probenträgerplatte (13), des Abstandes der Probenstellen (a, b, c, d) voneinander und der Aufnahmerate von Massenspektren kann die Probenträgerplatte (13) von einem Ende der Probenauftragung bis zum anderen Ende ohne Halt mit gleicher Geschwindigkeit durchfahren werden. Diese Technik kann insbesondere bei der bildgebenden Massenspektrometrie, aber auch bei anderen analytischen Aufgaben mit hoher Dichte an Proben eingesetzt werden.It is now proposed to continuously move the sample carrier plate further, for example at constant speed in one direction, but for the necessary number of individual time-of-flight spectra from a spot position on the sample, for example the spot position (c) in FIG to carry the spot position by the fast position control. Due to this phased entrainment of the spot position on the continuously moving sample carrier ( 13 ) it is achieved that the individual time-of-flight spectra are obtained from the same sample location (c) and thus no mixing of individual flight time spectra from different sample sites takes place. For imaging mass spectrometry, the spatial resolution of the mass spectrometric image is retained. However, the place of origin of the ions with respect to the axis of the mass spectrometer shifts, in particular with respect to the axis of the ion optical arrangement ( 14 . 15 ) in the ion source, so that also a synchronous ion-optical correction of the changing beam path of the ions, for example by the xy-deflection capacitors ( 16 ) and ( 17 ) in the beam path of the ions in the time-of-flight mass spectrometer and a correction of the time of flight by additional acceleration voltages. The correction voltages for this deflection and for the additional acceleration are then to be carried along with the changes of the spot position with respect to the optical axis. For the subsequent recording of the mass spectrum of another sample point, for example the sample point (b), which again has to be obtained from many individual time-of-flight spectra, the spot position is suddenly controlled to this other sample point (b) and then carried along again. In other words, phases in which the relative velocity between sample carrier plate and laser spot has the value zero alternate with those phases in which the relative speeds are not equal to zero. In this case, all correction voltages are changed in each case. With correct coordination of the movement speed of the sample carrier plate ( 13 ), the distance of the sample sites (a, b, c, d) from each other and the absorption rate of mass spectra, the sample carrier plate ( 13 ) are traversed from one end of the sample application to the other end without stopping at the same speed. This technique can be used in particular in imaging mass spectrometry, but also in other high density analytical tasks.

Dabei können nicht nur Probenstellen in linearer Reihung nacheinander gemessen werden, sondern es können Probenstellen auch zweidimensional abgerastert werden, wie schematisch in gezeigt. Dazu ist der Laserspot nicht nur mit der Bewegung (23) der Probenträgerplatte (13) einfach linear mitzuführen und linear zurückzuschalten, sondern auch in einem Muster (24) seitwärts zu bewegen, mit einem Halt auf jeder Probenstelle (in durch Punkte symbolisch dargestellt). So können beispielsweise für die bildgebende Massenspektrometrie mehrere Spuren (25) von Bildpunkten nebeneinander in einem Bewegungsdurchgang der Probenträgerplatte abgerastert werden, soweit diese Spuren von der Positionssteuerung erreicht werden können. Das nächste Bündel an Spuren kann dann auf der Rückfahrt der Probenträgerplatte (13) aufgenommen werden; es kann aber in Hinsicht auf die Positionspräzision der Bildpunkte günstiger sein, die Probenträgerplatte (13) schnell zurückzufahren und die Massenspektren aller Spuren in der gleichen Bewegungsrichtung aufzunehmen. An jeder Probenstelle kann dem Bewegungsmuster (24) ein feineres, in nicht gezeigtes Bewegungsmuster des Laserspots für das schichtweise Abtragen der Probenstelle überlagert sein.In this case, not only sample points in linear sequence can be measured one after the other, but sample points can also be scanned in two dimensions, as shown schematically in FIG shown. For this purpose, the laser spot is not just with the movement ( 23 ) of the sample carrier plate ( 13 ) linearly carry and linearly switch back, but also in a pattern ( 24 ) move sideways, with a stop on each sample site (in symbolically represented by dots). For example, for imaging mass spectrometry, several tracks ( 25 ) of pixels next to each other in a movement passage of the sample support plate are scanned, as far as these tracks can be achieved by the position control. The next bundle of tracks can then be returned to the sample carrier plate ( 13 ) are recorded; but it may be cheaper in terms of the positional precision of the pixels, the sample carrier plate ( 13 ) to go back fast and record the mass spectra of all tracks in the same direction of motion. At each sample point, the movement pattern ( 24 ) a finer, in not shown motion pattern of the laser spot for layered ablation of the sample site to be superimposed.

Die optimale Position des Laserspots oder des Laserspotmusters in Bezug auf die Achse der Ionenoptik muss allerdings zunächst ermittelt werden. Auch hier kann die schnelle Positionssteuerung für die automatische, programmgesteuerte Ermittlung der optimalen Position der Laserspots eingesetzt werden, wobei die optimale Position durch die dadurch erzielte höchste Empfindlichkeit des Massenspektrometers definiert ist. Dafür werden zweckmäßig besondere Proben eingesetzt, die über viele Stunden und Millionen von Laserschüssen hinweg Flugzeitspektren völlig gleich bleibender Intensität liefern. Solche Proben sind bekannt, beispielsweise können hier flüssige Auftragungen aus Peptiden gelöst in Glyzerin verwendet werden. Bei diesen Glyzerinproben ist es für den Erhalt eines gleichmäßigen Ionensignals besonders vorteilhaft, den Laserspot immer auf exakt dieselbe Stelle des Tropfens abzubilden. Als Nachschub diffundieren ständig neue Analytmoleküle durch die Flüssigkeit zu dieser Stelle. Für die Verwendung dieser Proben sollte also beim Verschieben der Probenträgerplatte (13) der Laserstrahl exakt mitgeführt werden. Insbesondere kann mit diesem Verfahren auch die Abhängigkeit aller Korrekturspannungen für Ablenkungen und Zusatzbeschleunigungen von der Spotposition vollautomatisch bestimmt werden.However, the optimum position of the laser spot or the laser spot pattern with respect to the axis of the ion optics must first be determined. Again, the fast position control for the automatic, programmatic determination of the optimal position of the laser spots can be used, the optimum position is defined by the highest sensitivity of the mass spectrometer achieved thereby. For this purpose, it is expedient to use special samples which, over many hours and millions of laser shots, provide time-of-flight spectra of completely constant intensity. Such samples are known, for example, liquid applications of peptides dissolved in glycerol can be used here. With these glycerine samples it is particularly advantageous for obtaining a uniform ion signal to always image the laser spot to exactly the same spot of the drop. As replenishment, new analyte molecules constantly diffuse through the fluid to that site. For the use of these samples, therefore, when moving the sample carrier plate ( 13 ) The laser beam are carried exactly. In particular, with this method, the dependence of all correction voltages for deflections and additional accelerations of the spot position can be determined fully automatically.

Es wurde hier des Öfteren der Begriff „Probenstelle” verwendet, von der ein Massenspektrum genommen wurde. Dieser Begriff bedarf einer etwas eingehenderen Betrachtung und Erläuterung. Für die Aufnahme der Einzelflugzeitspektren einer Probe ist es nicht günstig, mit einem Laserspot oder einem Laserspotmuster immer genau an exakt der gleichen Stelle zu arbeiten, da sich hier die Probe sehr schnell erschöpft, bei Dünnschichtpräparationen nach etwa drei bis zehn Laserschüssen. Es ist daher zweckmäßig, die zur Verfügung stehende Fläche der Probe so abzurastern, dass eine gleichmäßige Abtragung der Probe erfolgt. Es sollten nach Möglichkeit sogar die einzelnen Laserspots in aufeinander folgenden Laserschüssen nicht dicht an dicht nebeneinander gesetzt werden, da sich dadurch das Probenmaterial zu stark lokal erhitzen könnte. Es ist also ein Rasterungsmuster zu wählen, das nach Möglichkeit sowohl die lokale Überhitzung des Probenmaterials vermeidet wie auch eine gleichmäßige Abtragung der Probe über die verfügbare Fläche hinweg bewirkt. In ist das Rastermuster für eine solche gleichmäßige Abtragung anhand eines Laserspotmusters mit 9 Laserspots dargestellt, wobei in einem Probenflächenquadrat von genau 50 Mikrometer Seitenlänge eine Schicht der Probe recht gleichmäßig mit insgesamt 32 Laserschüssen abgetragen wird. Auch diese Abrasterung wird durch die schnelle Positionssteuerung für den Laserspot oder das Laserspotmuster ermöglicht. Es kann damit die Ausnutzung einer Probe durch ein besseres Abtragungsraster mit dem Laserspot oder Laserspotmuster gegenüber bisher verwendeten Techniken verbessert werden. Das gilt sowohl für die bildgebende Massenspektrometrie wie auch für die Analyse einzeln präparierter Proben. Das oben beschriebene „Mitführen” des Laserspots auf der Probenstelle bei gleichmäßig bewegter Probenträgerplatte ist also bevorzugt noch mit dieser Rasterbewegung zu überlagern.Often the term "sample site" was used here, from which a mass spectrum was taken. This term requires a more detailed consideration and explanation. For the recording of the individual flight time spectra of a sample, it is not favorable to work with a laser spot or a laser spot pattern always exactly in exactly the same place, since the sample is exhausted very quickly, with thin film preparations after about three to ten laser shots. It is therefore appropriate to scrape the available surface of the sample so that a uniform removal of the sample takes place. If possible, even the individual laser spots in successive laser shots should not be placed close to each other, as this could cause the sample material to heat up too much locally. It is therefore necessary to choose a screening pattern that avoids both the local overheating of the sample material as far as possible and also causes a uniform removal of the sample over the available area away. In the raster pattern for such a uniform erosion is illustrated by means of a laser spot pattern with 9 laser spots, wherein in a sample surface square of exactly 50 micrometer side length a layer of the sample is removed quite uniformly with a total of 32 laser shots. This rasterization is also made possible by the fast position control for the laser spot or the laser spot pattern. It can thus be the utilization of a sample improved by a better erosion grid with the laser spot or laser spot pattern over previously used techniques. This applies both to imaging mass spectrometry and to the analysis of individually prepared samples. The above-described "entrainment" of the laser spot on the sample point with uniformly moving sample support plate is therefore preferred to be superimposed with this raster movement.

Es können auch feinere Quadrate abgerastert werden, dann ist es jedoch unumgänglich, die Laserspots dicht an dicht zu setzen. So kann mit dem Muster aus neun Laserspots in acht Laserschüssen ein Quadrat von 26 Mikrometer Seitenlänge abgerastert werden. Erlaubt die Ergiebigkeit der Probe die Abtragung von fünf Abtragungsschichten, so können jeweils 40 Einzelflugzeitspektren zu einem Summenflugzeitspektrum dieser feineren Probenfläche addiert werden. Mit Spotmustern von nur vier Spots lassen sich Quadrate mit 18 Mikrometer Seitenlänge abrastern. Die Abtragung feinerer Quadrate erhöht die räumliche Auflösung des Gewebebildes, allerdings auf Kosten der Nachweisgrenze und des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses; in vielen Fällen können aber später feinere Bildpunkte wieder zu größeren Flächen zusammengesetzt werden, wenn sich in den feineren Flächen nicht überraschend verschiedene Massenspektren aus sehr feinen Gewebestrukturen zeigen.Even finer squares can be scanned, but then it is essential to put the laser spots close together. For example, with the pattern of nine laser spots in eight laser shots, a square of 26 micron side length can be scanned. If the yield of the sample permits the ablation of five ablation layers, 40 individual time-of-flight spectra can be added to a sum flight time spectrum of this finer sample surface. With spot patterns of just four spots, you can scan squares that are 18 microns long. The removal of finer squares increases the spatial resolution of the tissue image, but at the expense of the detection limit and the signal-to-noise ratio; In many cases, however, finer pixels can later be reassembled into larger surfaces, if surprisingly different mass spectra of very fine tissue structures do not show up in the finer areas.

Im Extremfall kann man mit diesem Verfahren mit Einzelspots von beispielsweise fünf Mikrometer Durchmesser und zehn Laserschüssen pro Stelle eine Oberfläche mit höchster Auflösung vermessen, damit die Massenspektren auch feinste Strukturen wiedergeben können. Zeigen sich dabei keine Feinstrukturen, so kann die Datenverarbeitung später wieder Gruppen dieser Massenspektren zu geringer räumlich aufgelösten Bildpunkten zusammenfassen, um ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erzielen. So können schwache Signale mit geringer Auflösung und starke Signale mit hoher Auflösung aus den Daten im Nachhinein entnommen werden.In extreme cases, this method can be used with individual spots of, for example, five micrometers in diameter and ten laser shots per site to measure a surface with the highest resolution so that the mass spectra can reproduce even the finest structures. If no fine structures show up, the data processing can later combine groups of these mass spectra into smaller spatially resolved pixels in order to achieve a better signal-to-noise ratio. Thus, weak signals with low resolution and strong signals with high resolution can be retrieved from the data afterwards.

Das Abtragungsraster braucht aber nicht aus quadratisch geformten Probenflächen zu bestehen. So ist es beispielsweise für die Aufnahme von Massenspektren von besonderen Platten für die Dünnschichtchromatographie zweckmäßig, die Massenspektren einer chromatographischen Spur mit einem breiten, rechteckigen Abtastmuster aufzunehmen; die Probenfläche zur Gewinnung der Einzelflugzeitspektren kann dabei beispielsweise 50 mal 300 Mikrometer betragen. Zur massenspektrometrischen Vermessung von Platten der Dünnschichtchromatographie siehe Dokument DE 199 37 438 C2 (F. Mayer-Posner und J. Franzen 1999; entsprechend GB 2 355 581 B oder US 6,414,306 B1 ).However, the ablation grid need not consist of square-shaped sample surfaces. For example, for the acquisition of mass spectra from particular plates for thin-layer chromatography, it is convenient to take the mass spectra of a chromatographic trace having a broad, rectangular scan pattern; The sample area for obtaining the individual flight time spectra can be, for example, 50 by 300 micrometers. For the mass spectrometric measurement of thin-layer chromatography plates see document DE 199 37 438 C2 (F. Mayer-Posner and J. Franzen 1999; GB 2 355 581 B or US Pat. No. 6,414,306 B1 ).

Verfahren für die optimale Präparation der Proben, der optimalen Aufnahme und Verarbeitung von Massenspektren für verschiedene analytische Aufgaben sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht detailliert wiedergegeben zu werden. Beispielsweise sind für die bildgebende Massenspektrometrie an Gewebedünnschnitten die Probenpräparationen auf besonderen Objektträgern mit Auftragung der Schichten von feinen Kriställchen des Matrixmaterials in den Dokumenten DE 10 2006 019 530 B4 (M. Schürenberg et al.) und DE 10 2006 059 695 B3 (M. Schürenberg) einzeln dargelegt. Im Dokument DE 10 2010 051 810 A1 (D. Suckau et al.) ist geschildert, wie ein lokaler Verdau von Proteinen zu Verdaupeptiden vorgenommen und für die Identifizierung der Proteine des Gewebedünnschnitts verwendet werden kann. Das Dokument DE 10 2008 023 438 A1 gibt wieder, wie dem massenspektrometrischen Bild ein hoch auflösendes optisches Bild unterlegt wird. Dokument DE 10 2010 009 853 A1 stellt dar, wie durch mathematische Bearbeitung ein weitgehend rauschfreies Bild der Proteine auf dem Gewebedünnschnitt erzeugt werden kann.Methods for the optimal preparation of the samples, the optimal recording and processing of mass spectra for various analytical tasks are known in the art and need not be detailed here. For example, for thin-slice tissue mass spectrometry, the sample preparations are on special slides with the layers of fine crystals of the matrix material in the documents DE 10 2006 019 530 B4 (M. Schuerenberg et al.) And DE 10 2006 059 695 B3 (M. Schürenberg) individually presented. In the document DE 10 2010 051 810 A1 (Suckau, D., et al.) Describes how local digestion of proteins into digestive peptides can be made and used for the identification of tissue thinning proteins. The document DE 10 2008 023 438 A1 shows how the mass spectrometric image is backed by a high-resolution optical image. document DE 10 2010 009 853 A1 shows how mathematical processing can produce a largely noise-free image of the proteins on the tissue thin section.

Die schnelle Positionssteuerung für die Laserspots kann des Weiteren für eine vollautomatische Justierung von MALDI-Flugzeitmassenspektrometern genutzt werden. Dabei können alle Komponenten der Ionenoptik selbständig optimal justiert werden, jedenfalls, soweit diese ionenoptischen Komponenten wie Reflektor und Detektor zumindest für die Zeitdauer der Justierung mit Bewegungseinrichtungen oder elektrisch betriebenen Justierelementen versehen sind. Die automatische Justierung der Komponenten des Massenspektrometers spart Prüfzeiten im Prüffeld ein; sie ist aber auch besonders wertvoll für den späteren Service an den Massenspektrometern, bei dem nach Reinigungs- oder Reparaturarbeiten in aller Regel eine Justierung vorzunehmen ist.The fast position control for the laser spots can also be used for fully automatic adjustment of MALDI time-of-flight mass spectrometers. In this case, all components of the ion optics can be optimally adjusted independently, at least insofar as these ion optical components such as the reflector and detector are provided with movement devices or electrically operated adjustment elements at least for the duration of the adjustment. The automatic adjustment of the components of the mass spectrometer saves test times in the test field; but it is also particularly valuable for the later service to the mass spectrometers, in which after cleaning or repair work usually an adjustment is made.

Die hier angegebene Anordnung ist nicht die einzig mögliche lichtoptische Anordnung für die Erzeugung der Laserspots oder der Laserspotmuster; es soll daher die Erfindung nicht auf diese Anordnung beschränkt sein. Weiterhin wurden zuvor Ausführungsformen beschrieben, die zur Desorption ultraviolettes Licht verwenden. Die Erfindung soll aber nicht darauf beschränkt sein. In Frage kommen auch anderen Arten kohärenten Lichts, beispielweise im infraroten Spektralbereich.The arrangement given here is not the only possible light-optical arrangement for the production of laser spots or laser spot patterns; It is therefore not intended to limit the invention to this arrangement. Furthermore, embodiments using ultraviolet light for desorption have been described above. The invention should not be limited thereto. Other types of coherent light may also be considered, for example in the infrared spectral range.

Claims

Time-of-flight mass spectrometer with a laser system ( 2 ) for the ionization of samples on a sample carrier plate ( 13 ) by matrix-assisted laser desorption, wherein the laser system ( 2 ) comprises the following subsystems: A beam generating unit ( 3 ) for generating laser beam pulses, - hereinafter a mirror system ( 7 . 8th ), - afterwards a telescope ( 9 ) for the expansion of the laser beam, and - then a lens ( 11 ) for focusing the expanded laser beam in laser spots on the sample carrier plate ( 13 ), where the mirror system ( 7 . 8th ) the position of the laser spots on the sample carrier plate ( 13 ) controls.

Time-of-flight mass spectrometer according to claim 1, characterized in that the mirror system comprises two mirrors ( 7 ) and ( 8th ) for the deflection of the laser spot in both spatial directions.

Time-of-flight mass spectrometer according to claim 1 or 2, characterized in that between the beam-generating unit ( 3 ) and the mirror system ( 7 . 8th ) a pattern generator ( 6 ) is arranged for the production of a Laserspotmusters.

Time-of-flight mass spectrometer according to one of Claims 1 to 3 with a sample carrier plate ( 13 ), characterized in that it comprises an ion beam deflection unit ( 16 . 17 ), the ions that are generated outside the ion optical axis of the ion source, on an ion detector ( 20 ) steers.

A time-of-flight mass spectrometer according to claim 4, characterized in that it includes means for time-of-flight correction for such ions generated outside the optical axis of the ion source.

Time-of-flight mass spectrometer according to claim 4, characterized in that the ion beam deflection unit ( 16 . 17 ) consists of two crossed deflection capacitors.

Method for sample examination in a MALDI time-of-flight mass spectrometer, comprising an ion source with a movable sample carrier plate and a control unit for positioning a laser spot or laser spot pattern on said sample carrier plate, characterized in that the sample carrier plate is moved continuously, and the control unit detects the position of the laser spot or of the laser spot pattern for recording individual time-of-flight spectra of a mass spectrum of a sample with the movement of the sample carrier plate so that the relative speed between the laser spot and the laser spot pattern and the sample carrier plate assumes the value zero.

A method according to claim 7, characterized in that the position of the laser spot or the laser spot pattern after completion of the recordings of the individual flight time spectra for a mass spectrum of a sample is directed to another sample and carried for the recording of single-flight spectra of this sample with this sample.

A method according to claim 7 or 8, characterized in that ions which are generated by laser spots or laser spot pattern outside the optical axis of the ion source, are directed on their flight path through the time-of-flight mass spectrometer by a deflection device to an ion detector.

Method according to claim 7 or 8, characterized in that ions generated by laser spots or laser spot patterns outside the optical axis of the ion source are additionally accelerated by an additional acceleration device such that their time of flight equals the ions present in the axis of the ion source to be generated.

Method for sample examination in a MALDI time-of-flight mass spectrometer, which contains an ion source with a movable sample carrier plate and a control unit for positioning a laser spot on the sample carrier plate, characterized in that the sample carrier plate is continuously moved in a spatial direction and the control unit the laser spot on the sample carrier plate so moves so that phases with relative zero speed between the laser spot and sample support plate alternate with phases with relative speeds not equal to zero.

The method of claim 11, wherein the laser spot contains an intensity pattern and the movements for positioning the laser spot on the sample carrier plate relate to a center of gravity of the intensity pattern.

Method according to one of Claims 11 or 12, in which the laser spot and sample carrier plate move in different directions in the phases of relative non-zero speed.

A method according to claim 7, characterized in that the entrainment movement in the phases with relative speed zero are superimposed even finer laser spot movements for a uniform ablation of a given sample site area.

Use of the methods according to any one of claims 7 to 14 for the acquisition of mass spectra in the imaging mass spectrometry.