DE112014001699T5

DE112014001699T5 - Für Magnetsensordetektion nützliche magnetische Nanopartikel speziell bei Biosensoranwendungen

Info

Publication number: DE112014001699T5
Application number: DE112014001699.3T
Authority: DE
Inventors: Makoto Murakami; Bing Liu
Original assignee: IMRA America Inc
Current assignee: IMRA America Inc
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2015-12-10
Also published as: JP2016522983A; WO2014160844A3; US20160158155A1; WO2014160844A2

Abstract

Es wird ein Prozess für das Herstellen von magnetischen Nanopartikeln (MNPs) offenbart, der in sehr empfindlichen MNPs resultiert, die bei einer Vielzahl von Diagnose- und Analyseverfahren verwendet werden können. Die MNPs weisen Superparamagnetismus auf und finden speziell bei Riesenmagnetowiderstand-(GMRS)-Sensoren Verwendung. Die MNPs werden durch einen Prozess hergestellt, der erlaubt, die Größe von Nanopartikeln auf einen Bereich von 10 bis 20 Nanometer mit einer sehr kleinen Größenverteilung von +/–2 Nanometer oder weniger einzustellen. Die MNPs können mit einer Vielzahl von Markierern markiert werden und finden daher in vielen analytischen Tests, Zellsortiertechniken, Abbildungsverfahren, Medikamentenverabreichungsverfahren und Krebsbehandlungen Verwendung. Die erfindungsgemäßen MNPs können in Magnetfeldstärken von 2000 Oe oder weniger detektiert werden.

Description

VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 61/805,539 eingereicht am 27. März 2013 und der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 61/933,989 eingereicht am 31. Januar 2014.
ERKLÄRUNG BEZÜGLICH DER BUNDESSTAATLICH GEFÖRDERTEN FORSCHUNG KEINE
TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft generell magnetische Nanopartikel und insbesondere magnetische Nanopartikel, die superparamagnetisch sind.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Magnetische Nanopartikel sind aus dem Stand der Technik bekannt, z. B.: MACS^® von Miltenyi Biotec für magnetgestützte Zellsortieranwendungen; Dynabeads^® von Life Technologies; und magnetische Nanopartikel von Ocean Nanotech. Sie wurden bei magnetgestützter Zellsortierung, Isolierung von Proteinen, Isolierung von RNA- und DNA-Abschnitten, Immunoassays und anderen Diagnostikverfahren verwendet. Die magnetischen Nanopartikel werden auch als Markierungen für biologische Sensoranwendungen unter Verwendung von Magnetfeldsensoreinrichtungen wie Riesenmagnetowiderstand-(GMR) und Tunnelmagnetowiderstand-(TMR)-Sensoreinrichtungen verwendet. Aufbau und Verwendung von GMR-Sensoren sind in der Literatur beschrieben, siehe beispielsweise „Giant Magnetoresistive Biosensors for Molecular Diagnosis: Surface Chemistry and Assay Development”, Heng Yu et al., Proc. of SPIE Bd. 7035, 70350E (2008); „The Matrix Neutralized”, Ilia Fishbein und Robert J. Levy, Nature, Bd. 461, 890, (15. Okt. 2009); und „Giant Magnetoresistive Biochip for DNA Detection and HPV Genotyping”, Liang Xu et al., Biosensors and Bioelectronics 24, 99, (2008).
Magnetische Nanopartikel (MNPs) weisen Superparamagnetismus auf, wenn sie sich im Größenbereich von ungefähr 3 Nanometern (nm) bis zu ungefähr 50 nm befinden, und diese Eigenschaft wurde verwendet, um Zellsortierverfahren, bioanalytische Tests und Formen von Riesenmagnetowiderstandsensoren (GMRS) herzustellen.
Es ist wünschenswert, MNPs bereitzustellen, die eine höhere Magnetsensorreaktion aufweisen als die zurzeit verfügbaren. Dies ermöglicht die Detektion von niedrigeren Analytniveaus und eine verbesserte Empfindlichkeit. Diese Technologie kann beim Erzeugen von Reaktionen mit höherer Empfindlichkeit bei Systemen, die GMRS-Einrichtungen verwenden, Anwendung finden.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Allgemein stellt diese Erfindung magnetische Nanopartikel (MNPs) mit einer sehr kleinen Größenverteilung und sehr hohen Wechselfeld-Suszeptibilität bereit, die bei einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können.
Beispielsweise kann ein Verfahren zum Herstellen von erfindungsgemäßen MNPs die Schritte umfassen: Mischen von Eisen-Acetylacetonat Fe(acac)3 1,2-Hexadecandiol, Ölsäure, Oleylamin in einem Volumen von Trioctylamin unter einer Abdeckung eines nicht reaktiven Gases mit Erhitzen auf 120°C für 1 Stunde, wobei das Molverhältnis von Ölsäure und das Molverhältnis von Oleylamin zu dem molaren Niveau von Eisen-Acetylacetonat, unabhängig voneinander, von 1:1 bis 2,5:1 beträgt; Erhitzen der Mischung auf 200°C für 2 Stunden; dann Erhitzen der Mischung mit einer Rate von 2°C/Minute auf eine Rückflusstemperatur von 350°C und Refluxieren für 2 Stunden; dann Abkühlen der Mischung auf Raumtemperatur durch Entfernen der Wärmequelle; dann Ausfällen der magnetischen Nanopartikel durch Hinzufügen von Ethanol zur Mischung und Rückgewinnen der Nanopartikel durch Zentrifugation.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung wasserdispergierbare MNPs wie magnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Partikelgröße von 10 bis 25 Nanometer (nm), vorzugsweise 13 bis 20 nm und am meisten bevorzugt 13 bis 18 Nanometer mit einer Größenverteilung von +/–2 Nanometer und mit einer Tensidbeschichtung von Ölsäure und Oleylamin, wobei, unabhängig voneinander, das Molverhältnis von Ölsäure und das Molverhältnis von Oleylamin zu Eisenoxid von 1:1 bis 2,5:1 beträgt.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung MNPs mit einer Wechselfeld-Suszeptibilität pro Partikel in einem flüssigen Zustand bei 25°C, welche die folgende Formel erfüllt: χ/N ≥ A(D – 13)
Wobei:

χ: die Wechselfeld-Suszeptibilität bei 100 Hz ist
N: die Anzahl an MNPs ist
D: der Durchmesser der Nanopartikel in Nanometern ist
A: gleicht (χ/N) / D und reicht im Wert von 5·10^–17 bis 2·10^–16

In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bedeutet der Begriff „in einem flüssigen Zustand”, dass die magnetischen Nanopartikel in einer Flüssigkeit suspendiert sind. Die bevorzugte Flüssigkeit ist Wasser; die gemessene Wechselfeld-Suszeptibilität wird jedoch in anderen Flüssigkeiten mit einer Viskosität, die der von Wasser ähnlich ist, ähnlich sein. Andere Flüssigkeiten mit einer ausreichend ähnlichen Viskosität zu Wasser umfassen beispielsweise: phosphatgepufferte Salzlösung, biologische Puffer, Chloroform, Toluol, Hexan, Methanol und Ethanol. Wenn man die magnetischen Nanopartikel in sehr hochviskosen Flüssigkeiten suspendiert, dann wird eine Verringerung in der Wechselfeld-Suszeptibilität auftreten. Es wird aber nur bei sehr hochviskosen Flüssigkeiten erwartet, dass dies auftritt.
Diese und andere Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden für den Fachmann aus der ausführlichen Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform offensichtlicher. Die Zeichnungen, welche die ausführliche Beschreibung begleiten, werden nachfolgend beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A ist eine Darstellung einer Größenverteilung für ein magnetisches Nanopartikel mit einer Größe von 15 nm +/–0,5 nm, 1B ist eine Darstellung der theoretischen Werte für x_real, obere Spur, x_imag und untere Spur für das magnetische Nanopartikel von 1A;
2A ist eine Darstellung einer Größenverteilung für ein magnetisches Nanopartikel mit einer Größe von 15 nm +/–2,0 nm, 2B ist eine Darstellung der theoretischen Werte für x_real, obere Spur, x_imag, untere Spur für das magnetische Nanopartikel von 2A;
3A ist eine Darstellung einer Größenverteilung für ein magnetisches Nanopartikel mit einer Größe von 15 nm +/–5,0 nm, 3B ist eine Darstellung der theoretischen Werte für x_real, obere Spur, x_imag und untere Spur für das magnetische Nanopartikel von 1A;
4A ist eine Darstellung des theoretischen Wertes für x_real gegenüber der Spitzenpartikelgröße unter Annahme einer Größenverteilung von +/–1 nm nach Normalisierung auf eine Frequenz von 100 Hz bei 25°C;
4B ist eine Darstellung des theoretischen Wertes für x_real berechnet unter der Annahme einer Spitzenpartikelgröße von 15 nm und unter Variation der Größenverteilung von +/–0,5 bis +/–5 nm mit Normalisierung auf 100 Hz und 25°C;
5 ist ein Schema eines Prozesses zum Herstellen von erfindungsgemäßen magnetischen Nanopartikeln;
6A enthält eine Reihe von Darstellungen des erhaltenen GMRS-Signals gegenüber der Expositionszeit von streptavidinmarkierten magnetischen Nanopartikeln die erfindungsgemäß hergestellt wurden, nach der Exposition gegenüber einem GMRS, der mit einer Reihe von Analytlösungen beschichtet ist, die 0,0001 bis 1,0 mg/ml Biotin enthalten;
6B enthält eine Reihe von Darstellungen des erhaltenen GMRS-Signals gegenüber der Expositionszeit von handelsüblichem MACS^® SA, streptavidinmarkierten magnetischen Nanopartikeln, nach der Exposition gegenüber einem GMRS, der mit einer Reihe von Analytlösungen beschichtet ist, die 0,0001 bis 1,0 mg/ml Biotin enthalten;
7 enthält eine Reihe von Darstellungen des erhaltenen GMRS-Signals gegenüber der Expositionszeit von handelsüblichem MACS^® AB, biotinantikörpermarkierten magnetischen Nanopartikeln, nach der Exposition gegenüber einem GMRS, der mit einer Reihe von Analytlösungen beschichtet ist, die 0,0001 bis 1,0 mg/ml Biotin enthalten;
Die 8A bis 8D zeigen Rasterelektronenmikroskopie-(SEM)-Bilder von einigen der Resultate, die in 6A und 7 gezeigt sind, speziell zeigen 8A und 8C jeweils die Ergebnisse von Probe 4 von MNPs, die erfindungsgemäß bei Niveaus von 1 mg/ml Analyt und 0,0005 mg/ml Analyt hergestellt sind, während 8B und 8D jeweils die Ergebnisse von MACS^® AB magnetischen Nanopartikeln bei Niveaus von 1 mg/ml Analyt und 0,0005 mg/ml Analyt zeigen;
9 ist ein Prinzipschaltbild, das einige Verwendungen von den erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Nanopartikeln zeigt;
Die 10A bis 10C zeigen die magnetische Wechselfeld-Suszeptibilität und relative Signalstärke von erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Nanopartikeln in einem flüssigen Zustand verglichen mit handelsüblichen magnetischen Nanopartikeln in dem gleichen flüssigen Zustand;
Die 11A bis 11D zeigen die Kristallinität wie sie in Transmissionselektronenmikroskopie-(TEM)-Bildern zu sehen ist und Selective Area Diffraction-(SAD)-Muster von erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Nanopartikeln verglichen mit handelsüblichen magnetischen Nanopartikeln; und
12 ist eine grafische Darstellung der Hysteresisschleife für erfindungsgemäß hergestellte magnetische Nanopartikel.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG EINER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung ist an das Herstellen von magnetischen Nanopartikeln (MNPs) und deren Verwendung in diagnostischen und medizinischen Anwendungen gerichtet. Die zurzeit handelsüblichen MNPs weisen geeignete Rauschabstände auf, aber es wird immer danach gestrebt, die Signalstärke zu verbessern, um die Detektionsgrenzen nach unten zu verschieben.
Die betreffenden Erfinder haben MNPs hergestellt, die eine viel verbesserte Empfindlichkeit und einen viel verbesserten Rauschabstand aufweisen. Diese MNPs können mit nützlichen Reportermarkierungen wie Streptavidin markiert werden. Die Ursachen der verbesserten Empfindlichkeit und des verbesserten Rauschabstandes werden zurzeit noch nicht gut verstanden; sie scheinen jedoch mit einer Anzahl von einzigartigen Eigenschaften von erfindungsgemäß hergestellten MNPs in Zusammenhang zu stehen. Diese Eigenschaften umfassen eine viel engere Partikelgrößenkontrolle der MNPs, niedrigere Tensidniveaus auf der Oberfläche der MNPs und ein höherer Kristallinitätsgrad der MNPs. Die Kombination dieser Eigenschaften erzeugt MNPs, die eine definierte einzelne magnetische Domänenstruktur aufweisen, einen viel höheren Rauschabstand aufweisen und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber einem äußeren magnetischen Feld aufweisen. Aufgrund dieser Änderungen sind die gegenwärtigen MNPs in einer Vielzahl von Rollen als ein magnetisches Reportermaterial für viele empfindliche Magnetfelderfassungstests und -umgebungen sehr nützlich. Die vorliegenden MNPs können bei einem Pegel eines äußeren magnetischen Feldes detektiert werden, der gegenüber den zuvor zum Detektieren von magnetischen Nanopartikeln erforderlichen sehr reduziert ist.
Die MNPs der vorliegenden Erfindung weisen einen theoretischen Größenbereich von 10 bis 30 Nanometer auf. Sie basieren auf magnetischen Substanzen wie Eisen, Eisenoxiden einschließlich Fe₃O₄, das auch als Magnetit bekannt ist, und anderen bekannten Magnetwerkstoffen wie beispielsweise Eisenferrit, Magnetit, Maghemit oder eine Mischung davon. Andere Magnetwerkstoffe können auch diejenigen, die Nickel, Kobalt, Legierungen von diesen Metallen und einige Seltenerdmetalle enthalten, umfassen. Die gegenwärtigen MNPs können aus Ferromagnetika, Ferrimagnetika und Superparamagnetika hergestellt sein. Die Ferrimagnetika und Ferromagnetika sind spontan magnetisch, solange sich ihre Temperatur unter ihrer Curie-Temperatur befindet; oberhalb ihrer Curie-Temperatur sind sie paramagnetisch, was bedeutet, dass sie keine magnetische Ordnung aufweisen. Ferrimagnetika weisen hochohmige und anisotrope Eigenschaften auf.
Magnetfeldsensoren wie GMR und TMR basieren auf einer quantenmechanischen magnetischen Widerstandsänderung, die bei Dünnschichtlaminaten anzutreffen ist, die aus abwechselnden Schichten von ferromagnetischen und nichtmagnetischen Schichten bestehen. Die nichtmagnetische Schicht wird als eine nichtmagnetische leitende Schicht für GMR und als eine nichtmagnetische Isolatorschicht für TMR verwendet. Der wesentliche Effekt, der beobachtet wird, ist ein viel größerer als die erwartete Änderung, und tatsächlich eine riesige Änderung im elektrischen Widerstand, die unabhängig davon resultiert, ob die Magnetisierung von angrenzenden ferromagnetischen Schichten in einer parallelen oder antiparallelen Ausrichtung vorhanden ist. Der Gesamtwiderstand ist niedrig, wenn die Schichten parallel ausgerichtet sind, und relativ hoch, wenn sie antiparallel ausgerichtet sind. Der Magnetowiderstand ist die Abhängigkeit des elektrischen Widerstands eines Materials von der Stärke eines äußeren Magnetfelds. In magnetoresistiven Einrichtungen ist die beobachtete Widerstandsänderung basierend auf einem Magnetfeld viel größer als der anisotrope Magnetowiderstand, der üblicherweise nur einige Prozent beträgt. Die Magnetisierungsrichtung kann durch die Anwendung eines äußeren magnetischen Feldes gesteuert werden. Der GMR-Effekt wird verwendet, um Magnetfeldsensoren herzustellen, die verwendet werden, um Daten auf Festplattenlaufwerken zu lesen, um Biosensoren herzustellen und in mikroelektromechanischen Systemen. Das Binden eines MNP an die Oberfläche eines GMRS kann eine Änderung im Magnetismus bewirken, der als eine Änderung im Widerstand des GMRS detektiert wird. Aufgrund der Empfindlichkeit des GMRS müssen sich sehr wenige MNPs binden, um eine detektierbare Widerstandsänderung zu bewirken.
Ein weiteres Gebiet, wo diese MNPs Anwendung finden können, ist bei der Herstellung von Zellsortierungstechnologien wie vorstehend beschrieben. Die gegenwärtigen MNPs können oberflächenmodifiziert sein, um einen Antikörper oder eine funktionelle Verbindung zu transportieren, die sich entsprechend an ein Antigen auf einer Zelloberfläche oder an einen anderen Zellmarker binden kann. Dies stellt Zellen her, wobei das Antigen oder der Zellmarker eine magnetische Ladung transportiert. Die Zellen von Interesse können durch Schütten einer Mischung von markierten und nicht markierten Zellen durch eine magnetische Säule isoliert werden. Die mit den MNPs markierten Zellen werden in der magnetisierten Säule zurückgehalten und die anderen Zellen gehen hindurch. Die markierten Zellen können dann durch Entfernen des Magnetfeldes freigegeben werden. Das Unternehmen Miltenyi Biotec verkauft MACS^®-(magnetgestützte Zellsortierung)-Kits und magnetische Sortiersäulen. Die Techniken können verwendet werden, um ein direktes magnetisches Markieren, bei dem die MNPs sich direkt an ein Antigen auf einer Zelloberfläche binden, oder ein indirektes magnetisches Markieren, bei dem die Zellen zuerst mit einem primären Antikörper markiert werden und die MNPs sich dann an den Antikörper oder eine an den Antikörpern angefügte funktionelle Gruppe binden, auszuführen. Sobald sie markiert sind, können Zellen durch eine Vielzahl von Mitteln einschließlich positiver Auswahl von magnetisch markierten Zellen, Verminderung von ungewünschten Zellen, indem sie magnetisch markiert werden, Verminderung gefolgt von positiver Auswahl oder von zwei anschließenden positiven Auswahlen isoliert werden. Diese Techniken sind von Miltenyi Biotec und anderen ausgereift worden und sind dem Fachmann bekannt.
Aufgrund ihrer Größe weisen die MNPs der vorliegenden Erfindung Superparamagnetismus auf. Superparamagnetismus ist eine Form des Magnetismus, der in kleinen ferromagnetischen und ferrimagnetischen Nanopartikeln auftritt. In dieser Form von Magnetismus wechselt die Magnetisierung unter Temperatureinfluss zufällig die Richtung um. Die Zeit zwischen zwei Wechseln wird Néel-Relaxationszeit genannt. Normalerweise erfährt ein ferrimagnetisches oder ferromagnetisches Material einen Übergang in einen paramagnetischen Zustand, wo es in Abwesenheit eines Magnetfelds keine Magnetisierung aufweist, bei einer Temperatur über dessen Curie-Temperatur; bei Superparamagnetika erfolgt dies bei einer Temperatur unter der Curie-Temperatur. Damit Superparamagnetismus auftritt, muss die MNP-Größe ausreichend klein genug sein, dass die Partikel eine einzelne Domäne sind, was bedeutet, dass der Partikel eine einzelne magnetische Domäne ist. Der typische Größenbereich liegt abhängig vom Material im Bereich von 3 bis 50 nm.
Der erste bei den erfindungsgemäß hergestellten MNPs beobachtete Effekt war, dass die Durchschnittsgröße und die Größenverteilung beim Erreichen eines hohen Signalpegels entscheidend waren. Speziell sind die MNPs vorzugsweise von 10 bis 25 nm im Durchmesser, mehr bevorzugt von 13 bis 20 nm im Durchmesser und am meisten bevorzugt 13 bis 18 nm im Durchmesser. Unter Verwendung von erfindungsgemäßen MNPs bei einer Größe von 15 nm +/–1 Nanometer wurde eine Reihe von Berechnungen ausgeführt. In einer Reihe von Berechnungen basierend auf einer Gleichung, welche die magnetische Gleichfeld-Suszeptibilität zur magnetischen Wechselfeld-Suszeptibilität in Beziehung setzt, die nachfolgende Formel 1 und die Néel-Arrhenius-Gleichung, die nachfolgende Formel 2 kann man die Auswirkung der Größe und der Größenverteilung auf die Reaktionsfähigkeit der vorliegenden MNPs sehen.
FORMEL 1

χ = χ₀ / 1 + ίϖτ

Wobei:

χ: die magnetische Wechselfeld-Suszeptibilität ist
χ₀: die magnetische Gleichfeld-Suszeptibilität ist
ί: die Quadratwurzel von 1 ist
ϖ: die Frequenz ist
τ: die Relaxationszeit ist, die als Reaktionszeit gesehen werden kann

FORMEL 2

τ_N = τ₀exp(KV/k_BT)

Wobei:

τ_N: die Néel-Relaxationszeit ist
τ₀: eine materialabhängige Zeitkonstante genannt die Versuchszeit oder die Versuchsfrequenz ist und einen typischen Wert von 10^–9 bis 10^–10 Sekunden aufweist
K: eine materialabhängige Konstante ist, die Magnetanisotropieenergiedichte des Nanopartikels
V: das Nanopartikelvolumen ist
k_B: die Boltzmann-Konstante ist
T: die Temperatur ist

In FORMEL 1 kann die magnetische Wechselfeld-Suszeptibilität X in einen Abschnitt x_real, der das Signal verstärkt und für die beste Empfindlichkeit maximiert werden muss, und einen imaginären Abschnitt x_imag, der die Energiedissipation darstellt und der minimiert werden muss, aufgegliedert werden. Unter Verwendung dieser Gleichungen wurden die Daten in den 1 bis 4 bei 25°C in einem flüssigen Zustand generiert. In 1A ist eine Größenverteilung für MNPs mit einem Spitzendurchmesser von 15 nm und einer angenommenen Größenverteilung von +/–0,5 nm gezeigt. In 1B ist der berechnete Abschnitt x_real in der oberen Spur gezeigt und der berechnete imaginäre Abschnitt x_imag ist in der unteren Spur gezeigt. Es ist zu ersehen, dass der berechnete Abschnitt x_real im Wesentlichen über den gezeigten Frequenzbereich konstant bleibt und bei einem Niveau von ungefähr 0,42 ist. Die Daten der 2A und 2B zeigen, dass, während die Größenverteilung sich auf +/–2 nm erhöht, selbst bei dem gleichen Spitzendurchmesser von 15 nm der x_real-Wert speziell bei Frequenzen über 100 Hz zu fallen beginnt und der imaginäre Wert x_imag zu steigen beginnt. In den 3A und 3B sind die Daten für eine Größenverteilung von +/–5 nm mit einem Spitzendurchmesser von 15 nm gezeigt. Man sieht jetzt, dass der Anfangswert von x_real niedriger ist und das Abfallen, während die Frequenz zunimmt, viel dramatischer ist. Der Wert von x_real bei 1000 Hz ist ungefähr die Hälfte von dem, der für den 15-nm-Durchmesser berechnet ist, mit einer Größenverteilung von +/–0,5 nm. In 4A wurde die MNP-Größe variiert und der Wert für x_real wurde nach der Normalisierung auf eine Frequenz von 100 Hz bei 25°C und einer Größenverteilung +/– von 1 nm aufgezeichnet. Diese Daten zeigen, dass es eine theoretische normalisierte Wechselfeld-Suszeptibilität-Spitze von ungefähr 0,5 für diese Größenverteilung gibt, wenn der Spitzendurchmesser im Bereich von 15 bis 18 nm liegt. In 4B wurde x_real unter der Annahme eines Spitzendurchmessers von 15 nm und Variieren der Größenverteilung von +/–0,5 bis +/–5 nm mit Normalisierung auf 100 Hz und 25°C berechnet. Diese Daten zeigen, dass es über eine Größenverteilung von +/–2 nm hinaus ein ziemlich dramatisches Abfallen im berechneten Wert von x_real gibt.
Basierend auf den Daten der 1 bis 4 ist zu ersehen, dass man für Eisenoxid-MNPs in der Theorie Nanopartikel mit einer Größe von 15 bis 18 nm und einer Größenverteilung von +/–2 nm verwenden sollte. Die betreffenden Erfinder entwickelten einen Prozess für das Bilden von mit Streptavidin (SA) beschichtete MNPs, der zu dramatisch besseren Resultaten bei GMR-Sensoranwendungen führt und das Versprechen hält, die Brauchbarkeit von MNPs dramatisch zu verbessern. Eine Übersicht über den Prozess ist schematisch in 5 gezeigt.
In einem erfindungsgemäßen Prozess werden beispielsweise Eisenoxid-MNPs mit einer Größe von 10 bis 20 nm gemäß dem folgenden Prozess hergestellt. In einem ersten Schritt werden 2 mmol Eisen-Acetylacetonat Fe(acac)3 mit 10 mmol 1,2-Hexadecandiol, 2 bis 4,5 mmol Ölsäure, 2 bis 4,5 mmol Oleylamin und 10 ml Trioctylamin verbunden. Alternativ kann 1-Octadezen oder Ether wie Dibenzylether, Dioctylether oder Diphenylether anstelle des Trioctylamin verwendet werden. Die Mischung wird magnetisch unter einer Abdeckung eines nichtreaktiven Gases wie Argon oder Stickstoff gerührt und auf 120°C für 1 Stunde erhitzt. Die Mischung wird dann auf 200°C für 2 Stunden erhitzt. Dann wird die Mischung langsam bei einer Rate von 2°C/Minute auf eine Rückflusstemperatur von 350°C erhitzt und für 2 Stunden refluxiert. Die Mischung wird dann auf Raumtemperatur 25°C durch Entfernen der Wärmequelle abgekühlt. Sobald die Mischung Raumtemperatur 25°C erreicht, wird 40 ml Ethanol zur Mischung hinzugefügt und die MNPs werden ausgefüllt und über Zentrifugation getrennt. Die MNPs werden dann mehrere Male in Ethanol und Mischungen von Ethanol und Chloroform gewaschen und über Zentrifugation gesammelt. Die MNPs werden dann in Chloroform suspendiert und bis zu Verwendung aufbewahrt. Alternativ können die MNPs in anderen organischen Lösungsmitteln wie Hexan oder Toluol aufbewahrt werden. Die betreffenden Erfinder haben festgestellt, dass man durch Anpassen der Niveaus von Ölsäure und Oleylamin zwischen 2 bis 9 mmol, sodass das Molverhältnis dieser Tenside zum molaren Wert von Eisen-Acetylacetonat, unabhängig voneinander, von 1:1 bis 5:1 variiert wird, die Größe der hergestellten MNPs abstimmen kann. Diejenigen, die gute Eigenschaften in dieser Anwendung zeigen, diejenigen, die Partikelgrößen von ungefähr 10 bis 25 nm aufweisen, werden durch Anpassen der Niveaus von Ölsäure und Oleylamin auf zwischen 2 bis 4,5 mmol für 2 mmol Eisen-Acetylacetonat hergestellt. Daher betragen die Molverhältnisse von Ölsäure und Oleylamin zu Eisen-Acetylacetonat vorzugsweise, unabhängig voneinander, von 1:1 bis 2,5:1. Diese bevorzugten Verhältnisse liegen deutlich unter denjenigen, die üblicherweise verwendet werden, um MNPs, herzustellen, das heißt, 3 oder größer zu 1. Die betreffenden Erfinder haben festgestellt, dass die Größe der MNPs auch zunimmt, während die Niveaus von Ölsäure und Oleylamin von 4,5 mmol auf 2 mmol verringert werden. Daher werden im vorliegenden Prozess die Tenside Ölsäure und Oleylamin während der Synthese von magnetischen Nanopartikeln basierend auf Eisenoxid vorzugsweise verwendet. Vorzugsweise beträgt das Molverhältnis von Ölsäure und das Molverhältnis von Oleylamin zu Eisen-Acetylacetonat, unabhängig voneinander, von 1:1 bis 2,5:1.
Die vorstehend beschriebenen MNPs weisen wie hergestellt eine Beschichtung der Tenside Ölsäure und Oleylamin auf und sind in biologischen oder wasserbasierenden Lösungsmitteln nicht dispergierbar. Die MNPs sind wie hergestellt sehr hydrophob. Um in den meisten gewünschten Systemen nützlich zu sein, müssen die MNPs oberflächenmodifiziert sein, damit sie als kolloidale Suspensionen in Wasser oder biologisch basierten Lösungsmittelsystemen und in Lösungen mit hohem Salzgehalt verbleiben können. Als ein erster Schritt werden die meisten gewerblichen MNPs in Toluol aufbewahrt, das in Chloroform geändert werden muss, sodass die MNPs in Toluol gewaschen und über Zentrifugation gesammelt werden, um das Toluol zu entfernen. Zu den MNPs wird Trioctylamin hinzugefügt, nach dem Mischen werden die MNPs zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und die MNPs werden gesichert. Dies erfolgt mehrere Male, um die MNPs zu waschen. Nach der endgültigen Wäsche werden die MNPs in Chloroform suspendiert. Die erfindungsgemäßen MNPs werden üblicherweise in Chloroform aufbewahrt, sodass dieser Waschschritt optional ist.
Der zweite Schritt ist Oberflächenmodifikation der MNPs mit funktionellen Verbindungen, um die MNPs hydrophiler zu machen. Ein Prozess, der verwendet werden kann, ist, die MNPs mit Lipid-Polyethylenglykolen (PEGs) zu oberflächenmodifizieren und dadurch die MNPs hydrophiler zu machen. Andere Oberflächenmodifikationsprozesse können wie sie dem Fachmann bekannt sind verwendet werden. Nützliche funktionelle Lipid-PEGs für die vorliegende Erfindung umfassen die Ammoniumsalze von: 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000](Methoxy-PEG); 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[succinyl(polyethylenglykol)-2000] (Succinyl-PEG); und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[succinyl(polyethylenglykol)-2000] (Amin-PEG). Die Fläche kann mit Succinyl-PEG, Mischungen aus Methoxy-PEG und Succinyl-PEG, Amin-PEG oder Mischungen aus Amin-PEG und Methoxy-PEG modifiziert werden. Bei einem beispielhaften Prozess werden die funktionellen Lipid-PEGs in Chloroform gelöst und dann zu den MNPs in Chloroform hinzugefügt und 5 Minuten oder länger reagieren gelassen. Die funktionellen Lipid-PEGs binden sich dann an die Fläche der MNPs durch eine hydrophobe Reaktion mit den Tensiden auf der Oberfläche der MNPs.
Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die MNPs unter einem Strom von Argongas getrocknet. Dann wird das restliche Chloroform unter Vakuum bei 80°C entfernt. Die MNPs werden dann mehreren Wasserwaschen unterzogen und über Zentrifugation gesammelt, um verbliebenes Lipid-PEG zu entfernen. Die im Wasser dispergierten MNPs mit daran gebundenen Lipid-PEGs können dann weiteren Oberflächenmodifikationen unterzogen werden, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind. Für Versuchszwecke werden in der vorliegenden Erfindung in einem Prozess die MNPs nach der Lipid-PEG-Modifikation einer Streptavidin-(SA)-Modifikation unterworfen. Streptavidin ist ein wohlbekanntes Proteinbiomolekül, das sehr hohe Affinität für die wohlbekannte Verbindung Biotin, Vitamin B7, aufweist. Biotin ist auch als Vitamin H oder Coenzym R bekannt. Avidin ist ein anderes Proteinbiomolekül mit hoher Affinität für Biotin. Die Streptavidin-Biotin-Bindung und die Avidin-Biotin-Bindung werden in vielen Diagnosesystemen, Zellsortierprozessen und immunologischen Tests verwendet. Wenn die MNPs mit Amin-PEG modifiziert wurden, kann das Streptavidin an die funktionelle Lipid-PEG-Gruppe unter Verwendung von beispielsweise der wohlbekannten Reaktion mit 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) gebunden werden. Die EDC-Reaktion wird verwendet, um eine Vernetzung zwischen der Amingruppe des Lipid-PEG und einer Carboxylgruppe an dem Streptavidin zu bewirken. Üblicherweise kann die Reaktion bei 4°C über Nacht ausgeführt werden. Im Falle der Verwendung des Succinyl-PEG kann die Bindung des Streptavidin unter Verwendung der bekannten EDC/Sulfo-NHS-Reaktion erreicht werden, wobei Sulfo-NHS N-Hydroxysulfosuccinimid ist. Diese Reaktion erfolgt üblicherweise bei 4°C über Nacht oder bei Raumtemperatur für ungefähr 2 Stunden. Das unreagierte NHS und das EDC werden dann durch Waschen durch eine magnetische Säule entfernt, welche die MNPs zurückhält und allen nichtmagnetischen Komponenten ermöglicht hindurchzugehen. Nach mehreren Wäschen wird die magnetische Säule ausgeschaltet und die MNPs können gesammelt und in der phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) dispergiert werden. Trägerproteine wie bovines Serumalbumin (BSA) oder der Reagenz-Block ACE können optional zur Lösung hinzugefügt werden, um die Reaktion zwischen den MNPs und dem Streptavidin und zwischen den markierten MNPs und dem Biotin auf dem GMRS zu stabilisieren. Bei einem Beispiel ist das Endergebnis wie gezeigt in 5 ein MNP, der mit einem Lipid-PEG und gebundenen Streptavidin oberflächenmodifiziert wurde. Die oberflächenmodifizierten MNPs sind jetzt wasserdispergierbar und in Biosystemen und Puffer hochstabil. Die erfindungsgemäßen MNPs können auch viele andere Biomoleküle als Oberflächenmodifikationen umfassen. Beispielsweise können diese anderen Biomoleküle ein Protein, einen Antikörper oder ein Enzym umfassen.
Wie vorstehend beschrieben, besteht eine Verwendung von MNPs in Sensoranwendungen, die GMRS verwenden. Ein GMRS besteht aus einer Laminatanordnung von Dünnschichten, die nichtmagnetische Schichten mit Magnetschichten abwechseln. Die Schichten sind sehr dünn in der Größenordnung von etwa 2 bis 30 nm in der Dicke. In diesen GMR-Sensoren erfolgt eine riesige Änderung im spezifischen Widerstand, wenn sich das Magnetfeld um kleine Beträge ändert. Um die Brauchbarkeit von erfindungsgemäß hergestellten MNPs zu testen, wurden GMRS-Signale für eine Vielzahl von handelsüblichen MNPs und für eine Reihe von erfindungsgemäß hergestellten MNPs bewertet. Für ein Experiment wurde der verwendete GMRS anfänglich mit Biotin-BSA beschichtet, sodass sich mit Streptavidin beschichtete MNPs an den GMRS binden und dadurch eine Widerstandsänderung erzeugen würden, die detektiert werden könnte. Außerdem wurden die Resultate für erfindungsgemäß hergestellte MNPs mit den Resultaten verglichen, die unter Verwendung von handelsüblichen MNPs konjugiert zu SA erhalten wurden. Die MNP-Größen für die handelsüblichen Produkte wurden aus der Herstellerliteratur erlangt. Die Partikelgrößen für erfindungsgemäß hergestellte MNPs wurden durch Dispergieren der MNPs in Wasser oder Chloroform und dann Trocknen auf einem Raster und Verwenden von Transmissionselektronenmikroskopie-(TEM)-Zählen bewertet. Ein weiteres Verfahren zur Partikelgrößenabschätzung, das verwendet werden kann, ist die bekannte Scheibenzentrifugentechnik, die zuverlässigere Abschätzungen der Partikelgröße liefert. Die beobachteten Daten sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt. Die Einheiten emu/(Oe mg) sind der Abschnitt des realen Wertes der magnetischen Wechselfeld-Suszeptibilität pro Einheit Eisenoxidgewicht (mg). Die Festkörperzustand-Wechselfeld-Suszeptibilität wird unter Verwendung eines Wechselfeld-Supraleiter-Quanteninterferometers (AC SQUID) bei einer Frequenz von 100 Hz mit einer Amplitude von 5 Oe bei 300°Kelvin erlangt, was ca. 27°C entspricht, wobei sich die Magnetpartikel wie erforderlich durch die Methodik in einem festen Zustand befinden. Die GMRS-Signal-Werte nach der Exposition von ungefähr 0,1 bis 5 mg/ml an Test-MNPs gegenüber dem GMRS, die berichtet werden, sind das Verhältnis des beobachteten Wertes zu einem Standardwert unter Verwendung von handelsüblichen MACS^® SA-MNPs. Die MACS^® SA-MNPs bestehen aus einem Cluster von ungefähr 10 nm oder kleiner an γ-Fe₂O₃-Nanopartikeln, die durch eine Matrix aus Dextran zusammengehalten werden.

Aufgrund der kleinen Größe der γ-Fe₂O₃-Nanopartikel sind die MACS^® SA-Partikel superparamagnetisch mit einem Gesamtdurchmesser von ungefähr 50 nm und enthalten ungefähr 10% magnetisches Material. Die getesteten magnetischen Nanopartikel von Ocean Nanotech sind ebenfalls handelsübliche Nanopartikel. Daher bedeutet ein GMRS-Signalwert von kleiner als 1, dass die Testprobe eine kleinere Reaktion als die MACS^® SA-MNPs aufwies, und ein Wert von größer als 1 bedeutet, dass die Testprobe eine größere Reaktion als die MACS^® SA-MNPs aufwies. Tabelle 1

MNP ID	Wechselfeld-Suszeptibilität pro Gewicht emu/(Oe mg)	Partikelgröße in Wasser	Partikelgröße in CHCL3	GMRS-Signalwert
Modifizierte Ocean Nanotech 18-nm-Partikel	4.75			1.06
Ocean Nanotech 18-nm-Partikel	1.04			0.53
Ocean Nanotech 25-nm-Partikel	2.77			0.45
Erfindungsgemäß e MNPs Probe 1	7.16	15.0	20.5	4.04
Erfindungsgemäß e MNPs Probe 2	6.76	14.5	18.3	2.02
Erfindungsgemäß e MNPs Probe 3	7.47	15.8	18.0	1.83
Erfindungsgemäß e MNPs Probe 4	7.47	13.9	19.9	4.23
Erfindungsgemäß e MNPs Probe 5	1.24	10.9		0.80

Die Daten zeigen mehrere interessante Trends. Bezüglich den erfindungsgemäß hergestellten MNPs ist es eindeutig, dass Partikel im Bereich von 15 bis 20 nm im Sinne von Sensorsignalwert besser waren, als die kleinere Partikelgröße von 10 nm. Dies passt zu den vorstehenden theoretischen Daten. Dies ist der Fall trotz viel niedrigerer emu/Oe mg-Werte in diesen größeren Partikeln. Außerdem waren die erfindungsgemäß hergestellten MNPs viel besser als die drei handelsüblichen Proben von Ocean Nanotech, und im Größenbereich von über 10 nm waren sie viel besser als die Standard-MACS^® SA-MNPs. In einigen Fällen gaben die erfindungsgemäßen MNPs das 4fache Signal, das bei den MACS^® SA-MNPs festgestellt wurde. Dies ist der Fall trotz viel niedrigerer emu/Oe mg-Werte.
Bei einem weiteren analytischen Experiment wurde die Empfindlichkeit von erfindungsgemäßen MNPs von Probe 4 von der vorstehenden Tabelle 1 mit mehreren MNPs von Miltenyi Biotec verglichen. Speziell waren die vergleichbaren MNPs MACS^® AB (MNPs konjugiert zu einem Antikörper zu Biotin) und MACS^® SA. Der Test diente dazu, den Betrag an Widerstandsänderung zu bestimmen, der durch zunehmende Analytniveaus für GMRS-Sensoren bewirkt wird, die mit dem Analyten beschichtet und dann den Test-MNPs ausgesetzt wurden. In
6A wurden die MNPs erfindungsgemäß hergestellt, Probe 4 von Tabelle 1. Die Kurven für REF, REF2 und N2 sind Kontrollwerte. Die Daten für die erfindungsgemäße Probe 4 zeigen, dass 0,0001 mg/ml Analyt im Sinne von Widerstand von den Kontrollwerten für REF. REF2 und N2 nicht unterscheidbar war. Alle Kurven überdecken sich nahezu. Mit 0,0005 mg/ml Analyt beginnt eine detektierbare Widerstandsänderung vorhanden zu sein. Bei einem Niveau von 0,005 mg/ml gibt es eine signifikante Widerstandsänderung, die ein Plateau von 8.000 ppm an Widerstandsänderung nach 90 Minuten erreicht. Der ppm-Wert ist als die Widerstandsänderung definiert, die durch an den Sensor angefügte magnetische Nanopartikel bewirkt wird, in Bezug auf den Widerstand des GMRS ohne angefügte Partikel. Bei einem Niveau von 0,05 mg/ml wird das Plateau bei einem Niveau von über 15.000 ppm an Widerstand erreicht. Letztendlich wird bei einem Analytniveau von 1 mg/ml das Plateau bei ungefähr 17.000 ppm an Widerstand erreicht. Dies steht in krassem Gegensatz zu den Resultaten, die in 6B für die handelsüblichen MACS^® SA-MNPs gezeigt sind. In dieser Probe beginnt man keine detektierbare Widerstandsänderung zu erkennen, bis das Analytniveau 0,05 mg/ml beträgt, und die niedrigeren Niveaus und Kurven überlagern sich alle. Bei einem Analytniveau von 0,05 mg/ml erreicht der Wert das Plateau bei ungefähr 2.200 ppm an Widerstand. Dieser Wert liegt weit unter dem Resultat in 6A, die ein Plateau von über 15.000 ppm an Widerstand für dieses Analytniveau zeigt. Der Wert für 1 mg/ml Analyt in 6B erreicht bei einem Wert von ungefähr 3.800 ppm an Widerstand das Plateau, was ebenfalls weit unter dem Wert von ungefähr 17.000 liegt, der in 6A zu sehen ist. Unter jetziger Bezugnahme auf die gezeigten Resultate in 7 ist zu ersehen, dass die handelsüblichen MACS^® AB empfindlicher sind als die MACS^® SA, aber weniger empfindlich als die erfindungsgemäß hergestellte Probe 4. Bei den MACS^® AB beginnt man eine detektierbare Widerstandsänderung bei einem Analytniveau von 0,005 mg/ml zu sehen, die in einem Plateauwert von ungefähr 2.900 ppm an Widerstand resultiert. Ein Analytniveau von 0,05 mg/ml resultiert in einem Plateau von ungefähr 5.000 ppm an Widerstand. Letztendlich resultiert ein Analytniveau von 1 mg/ml in einem Plateauwert von 6.000 ppm an Widerstand. Alle Werte für MACS^® AB liegen weit unter den Resultaten, die in 6A für die gleichen Analytniveaus unter Verwendung von erfindungsgemäß hergestellten MNPs zu sehen sind. Die Resultate zeigen, dass die vorliegenden MNPs viel sensibler sind als handelsübliche MNPs, und dies birgt die Hoffnung auf einen dramatischen Anstieg ihrer Brauchbarkeit.
Die 8A bis 8D zeigen SEM-Bilder von einigen der Resultate, die in 6A und 7 gezeigt sind. Speziell zeigen 8A und 8C die Ergebnisse von Probe 4 jeweils bei Niveaus von 1 mg/ml Analyt und 0,0005 mg/ml Analyt. 8B und 8D zeigen die Ergebnisse von MACS^® AB jeweils bei Niveaus von 1 mg/ml Analyt und 0,0005 mg/ml Analyt. Zudem sind neben jeder Fig. die tatsächlichen Plateauwerte für die ppm an Widerstand gezeigt. Erneut zeigen diese Resultate die dramatische Empfindlichkeitssteigerung, die bei erfindungsgemäß hergestellten MNPs festgestellt wurde.
9 ist ein Schema von einer Art und Weise, in der die vorliegenden MNPs beim Herstellen eines GMRS Verwendung finden, der empfindlicher ist als die zurzeit verfügbaren. Wie in dem Schema gezeigt können die MNPs mit einer funktionellen Gruppe eines Bindemittels wie Streptavidin konjugiert sein. Ein Detektionsantikörper, der gegen eine Zelle oder einen Analyten von Interesse gerichtet ist, umfasst eine funktionelle Konjugation zu Biotin. Dies erlaubt den MNPs, sich an den Detektionsantikörper zu binden, der wiederum an das Antigen an dem Biomarker gebunden ist. Die Oberfläche des GMRS ist mit einem Fängerantikörper beschichtet, der gegen ein anderes Antigen an dem Biomarker gerichtet ist. Das System erzeugt wie gezeigt in dem Schema ein detektierbares Sandwich. Diese Technologie verspricht die Brauchbarkeit von GMRS bei vielen Anwendungen zu verbessern, da empfindlichere GMRS hergestellt werden können. Die erfindungsgemäß hergestellten MNPs finden auch in vielen Bereichen Verwendung, die Anwendungen umfassen, wie z. B.: als Kontrastmittel für Magnetresonanztomografie (MRI); Magnetpartikelbildgebung (MPI); immunologische analytische Tests; Trenntechniken für die Isolierung von Zellen, Proteinen, DNA und RNA; Medikamentenverabreichung unter Verwendung von Medikamenten, die mit MNPs und Magnetfeldern markiert sind, um die Medikamente zu den gewünschten Zielzellen oder Organen zu lenken; therapeutische Behandlung von Krebszellen oder Tumoren unter Verwendung von MNPs, um Hyperthermie in Krebs- oder Tumorzellen zu schaffen. Bei der Hyperthermieverwendung werden die MNPs in einen Host eingespritzt und dann in die Krebszellen transloziert oder direkt in den Tumor eingespritzt. Dann werden von außen angewandte wechselnde Magnetfelder verwendet, um die Richtung der Magnetfelder in den MNPs zu ändern, wenn ihnen dann ermöglicht wird, sich zu entspannen, tritt eine Wärmeableitung auf und die Krebs- oder Tumorzellen, die temperaturempfindlicher sind als gesunde Zellen, werden bevorzugt getötet. Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen MNPs ist ihre Verwendung bei hohen Niveaus in Flüssigkeiten, um Ferrofluide herzustellen, die aufgrund von Aggregation und Disaggregation durch die Verwendung von Magnetfeldern wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, eine einstellbare Viskosität aufweisen können.
Eine Reihe von MNPs von verschiedenen Größen, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, wurden mit handelsüblichen magnetischen Nanopartikeln bezüglich ihrer Flüssigzustand-Wechselfeld-Suszeptibilität verglichen. Die verwendeten handelsüblichen magnetischen Nanopartikel waren: Ocean Nanotech 15-nm-Partikel (ON 15 nm); Ocean Nanotech 25-nm-Partikel (ON 25 nm); Sigma 20-nm-Partikel (Sigma 20 nm); und MACS^® AB-Nanopartikel wie vorstehend beschrieben. Die Größen der handelsüblichen magnetischen Nanopartikel sind durch den Hersteller bestimmt. Die Flüssigzustand-Wechselfeld-Suszeptibilität der verschiedenen magnetischen Nanopartikel wurde unter Verwendung eines Wechselfeld-Suszeptometers, DynoMag Instrument von Acreo AB, bei einer Frequenz von 100 Hz mit einer Amplitude von 5 Oe mit den magnetischen Nanopartikeln in Wasser und bei einer Temperatur von 25°C gemessen. Wie vorstehend beschrieben bedeutet in der vorliegenden Spezifikation und den Ansprüchen der Begriff „in einem flüssigen Zustand”, dass die magnetischen Nanopartikel in einer Flüssigkeit suspendiert sind. Die bevorzugte Flüssigkeit ist Wasser; die gemessene Wechselfeld-Suszeptibilität wird jedoch in anderen Flüssigkeiten mit einer Viskosität, die der von Wasser ähnlich ist, ähnlich sein. Andere Flüssigkeiten mit einer ausreichend ähnlichen Viskosität zu Wasser umfassen beispielsweise: phosphatgepufferte Salzlösung, biologische Puffer, Chloroform, Toluol, Hexan, Methanol und Ethanol. Wenn man die magnetischen Nanopartikel in sehr hochviskosen Flüssigkeiten suspendiert, dann wird eine Verringerung in der Wechselfeld-Suszeptibilität auftreten. Es wird aber nur bei sehr hochviskosen Flüssigkeiten erwartet, dass dies auftritt. Die erzeugten Daten wurden dann in einer Reihe von unterschiedlichen Arten und Weisen aufgezeichnet. In allen Fällen wurde die Größe der MNPs in nm auf der X-Achse gegenüber der berechneten Wechselfeld-Suszeptibilität aufgezeichnet.
In 10A wurde die Größe gegenüber der Massen-Wechselfeld-Suszeptibilität aufgezeichnet, was die Wechselfeld-Suszeptibilität pro Milligramm an MNP-Material bedeutet. Die Partikelgrößen für die gesamten Proben wurden anhand Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt. Die gesamten magnetischen Nanopartikel wurden vor den TEM-Messungen in Wasser übertragen. Zu beachten ist, dass die beobachtete Partikelgröße der handelsüblichen Partikel sich von der von den Lieferanten angegebenen Größe unterschied. Es ergeben sich mehrere wesentliche Informationen. Die anderen handelsüblichen magnetischen Nanopartikel wiesen alle eine niedrigere Wechselfeld-Suszeptibilität pro Milligramm an Material auf als die MACS^® AB-Nanopartikel. Die Wechselfeld-Suszeptibilität der zwei Größen von magnetischen Nanopartikeln von Ocean Nanotech, 15 nm und 25 nm, war auf einer Pro-Milligramm-Basis die gleiche, was bedeutet, dass es keine Größenabhängigkeit für diese magnetischen Nanopartikel gab. Dies steht in krassem Gegensatz zu den Resultaten unter Verwendung der erfindungsgemäßen MNPs. Für diese erfindungsgemäßen MNPs gibt es eine Abhängigkeit der Wechselfeld-Suszeptibilität pro Milligramm an Material von der Größe der MNPs. Während die Größe zunimmt, nimmt auch die Wechselfeld-Suszeptibilität pro Milligramm auf über das 3fache höher als die kleineren MNP-Partikel zu. Die größte Größenabhängigkeit ist zu sehen, wenn die MNPs von ungefähr 15 bis 25 nm in der Größe sind.
In 10B wurde die Magnetpartikelgröße in nm gegenüber der Wechselfeld-Suszeptibilität pro Nanopartikel, der Anzahl-Wechselfeld-Suszeptibilität aufgezeichnet. Wie in 10A zeigten die handelsüblichen magnetischen Nanopartikel keine große Auswirkung der Größe auf die gemessene Wechselfeld-Suszeptibilität. Andererseits zeigten erfindungsgemäße MNPs mit zunehmender Nanopartikelgröße einen eindeutigen Anstieg in der Wechselfeld-Suszeptibilität pro Nanopartikel. Der Anstieg war für erfindungsgemäße MNPs sehr groß, wobei die bei MNPs erreichten Werte mit einer Größe von 25 nm ungefähr 30fach höher waren als diejenigen, die bei MNPs von ca. 10 nm festgestellt wurden.
In 10C ist die relative Signalstärke verglichen mit den MACS^® AB-Nanopartikeln gegenüber der Partikelgröße aufgezeichnet. Wie bereits erwähnt, stellen die anderen handelsüblichen magnetischen Nanopartikel alle ein Signal bereit, das schwacher ist als das der MACS^® AB-Nanopartikel. Die vorliegenden erfindungsgemäßen MNPs zeigen ein signifikant erhöhtes Signal, wenn ihre Größe von 15 auf 25 nm vergrößert wird. Das Signal ist viel größer als das bei den MACS^® AB-Nanopartikeln zu sehende, fast 4fach höher. Die Resultate der 10A bis 10C zeigen, dass die vorliegenden erfindungsgemäßen MNPs verglichen mit handelsüblichen magnetischen Nanopartikeln eine erheblich höhere Wechselfeld-Suszeptibilität aufweisen. Die erhöhte Wechselfeld-Suszeptibilität resultiert in einem erheblich höheren Signal verglichen mit handelsüblichen magnetischen Nanopartikeln.
Um die möglichen Gründe für die erheblich verbesserte Wechselfeld-Suszeptibilität der vorliegenden MNPs verglichen mit handelsüblichen magnetischen Nanopartikeln zu erforschen, wurden die MNPs Transmissionselektronenmikroskopie-(TEM)- und Selected Area Diffraction-(SAD)-Behandlungen unterworfen. Ein Querschnitts-TEM-Bild eines erfindungsgemäßen MNP, der von der Herstellung, die als A in den 10A bis 10C gekennzeichnet ist, entnommen wurde, und eines magnetischen 25-nm-Nanopartikels von Ocean Nanotech sind jeweils in den 11A und 11D gezeigt. Die TEM des erfindungsgemäßen MNP zeigt, dass es eine einzelne magnetische Domäne ist, was bedeutet, dass sich alle Dipole leicht in der gleichen Ausrichtung anordnen lassen. Die Magnetpartikel-TEM von Ocean Nanotech zeigt mehrere magnetische Domänen. Die SAD-Bilder und ihre Grauwert-Graphen sind in den 11B, 11C, 11E und 11F gezeigt. Diese Resultate demonstrieren, dass die Kristallinität dieser zwei magnetischen Nanopartikel sehr unterschiedlich ist. Der erfindungsgemäße MNP zeigt eindeutige Halo-Ringe und unterschiedliche Grauwertspitzen. Dies weist in hohem Maße auf eine geordnete kristalline Struktur bei den erfindungsgemäßen MNPs hin. Andererseits zeigen die Resultate für das Partikel von Ocean Nanotech eine einzelne unscharfe Mitte mit unscharfen Außenringen. Dies bestätigt die mehrere Domänen, die im TEM-Bild von 11D zu sehen sind. Es wird theoretisiert, dass die in hohem Maße geordnete kristalline Struktur und die einzelne magnetische Domäne der vorliegenden MNPs teilweise für ihre höhere Wechselfeld-Suszeptibilität verantwortlich sind.
12 ist eine grafische Darstellung der Hysteresisschleife für MNPs der Probe A in den 10A bis 10C gemäß der Erfindung. Es ist zu ersehen, dass die Schleife in beiden Richtungen des Magnetismus sehr eng, fast überlagert ist. Die erforderliche Feldstärke, um Sättigung zu erreichen, ist viel niedriger als sie für magnetische Nanopartikel typisch ist. Wenn das Magnetfeld klein ist, ist die Steigung der Hysteresisschleife nahezu gleich der Wechselfeld-Suszeptibilität. Magnetische Reporter wie MNPs werden üblicherweise bei magnetischen Feldstärken verwendet, die ausreichend sind, um ihre Magnetisierung zu sättigen. Die Resultate von 12 zeigen, dass dies für die vorliegenden MNPs mit einer Feldstärke von 2000 Oe oder weniger erreicht werden kann. Aufgrund ihrer hohen Wechselfeld-Suszeptibilität können die erfindungsgemäßen MNPs bei einer Feldstärke von ungefähr 25 Oe in einem höheren Ausmaß magnetisiert werden und als magnetische Reporterpartikel bei diesen niedrigen Feldstärken dienen. Magnetpartikel mit hoher Wechselfeld-Suszeptibilität sind insbesondere für Magnetfeldsensoren, die niedrige magnetische Feldstärken unter 2000 Oe, vorzugsweise unter 1000 Oe und am meisten bevorzugt unter 100 Oe einsetzen, um die magnetischen Reporterpartikel zu magnetisieren, großartige Kandidaten.
Zusammenfassend sind die vorliegenden erfindungsgemäßen MNPs hervorragende Kandidaten für hochempfindliche magnetische Reportermaterialien. Die MNPs bestehen aus mindestens einem Magnetwerkstoff und sie können in der Art ferrimagnetisch, ferromagnetisch oder superparamagnetisch sein. Die MNPs weisen eine Größe von 10 bis 25 nm, vorzugsweise 13 bis 20 nm und am meisten bevorzugt von 13 bis 18 nm auf. Vorzugsweise ist die Größenverteilung ±5 nm, mehr bevorzugt ±2 nm. Die MNPs sind durch GMRS, TMRS, AC SQUID, Hall-Sensoren und andere Magnetsensoren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, detektierbar. Die MNPs sind bei magnetischen Feldstärken von kleiner als 2000 Oe, vorzugsweise kleiner als 1000 Oe und am meisten bevorzugt kleiner als 100 Oe detektierbar. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen MNPs eine Flüssigzustand-Wechselfeld-Suszeptibilität pro Partikel bei 25°C auf, welche die folgende Formel erfüllt: χ/N ≥ A(D – 13)
Wobei:

Vorzugsweise ist der Wert von χ/N gleich oder größer als 5·10^–16. Die erfindungsgemäßen MNPs weisen wie in der SAD-Analyse ersichtlich eine in hohem Maße geordnete kristalline Struktur auf mit eindeutigen Halo-Ringen und signifikanten Grauwertspitzen, die eine geordnete Struktur und eine einzelne magnetische Domäne zeigen.
Bei mindestens einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel mit einer Flüssigzustand-Wechselfeld-Suszeptibilität pro Partikel bei 25°C, welche die folgende Formel erfüllt: χ/N ≥ A(D – 13)
Wobei:

Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei der Wert von χ/N gleich oder größer als 5·10^–16 ist.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei die magnetischen Nanopartikel bei einer magnetischen Feldstärke von 2000 Oe oder weniger detektierbar sind.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei die magnetischen Nanopartikel bei einer magnetischen Feldstärke von 1000 Oe oder weniger detektierbar sind.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei die magnetischen Nanopartikel bei einer magnetischen Feldstärke von 100 Oe oder weniger detektierbar sind.
Bei mindestens einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Partikelgröße von 10 bis 25 Nanometer mit einer Größenverteilung von +/–2 Nanometer, die eine Tensidbeschichtung aus Ölsäure und Oleylamin aufweisen, wobei, unabhängig voneinander, das Molverhältnis der Ölsäure und das Molverhältnis von Oleylamin zu Eisenoxid von 1:1 bis 2,5:1 beträgt.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Partikelgröße von 13 bis 20 Nanometer mit einer Größenverteilung von +/–2 Nanometer.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Partikelgröße von 13 bis 18 Nanometer mit einer Größenverteilung von +/–2 Nanometer.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei die magnetischen Nanopartikel als Magnetfeld-Reporterpartikel verwendet werden und durch einen Magnetfeldsensor detektierbar sind.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei der Magnetfeldsensor einer von einem Riesenmagnetowiderstand-(GMR)-Sensor, einem Tunnelmagnetowiderstand-(TMR)-Sensor, einem Supraleiter-Quanteninterferometer (SQUID) oder einem Hall-Sensor ist.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei die magnetischen Nanopartikel weiter mindestens ein Biomolekül umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Protein, einem Antikörper und einem Enzym.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei die magnetischen Nanopartikel Eisenferrit, Magnetit, Maghemit oder eine Mischung davon umfassen.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei die magnetischen Nanopartikel weiter mit mindestens einem Polyethylenglykol oberflächenmodifiziert sind.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei das Polyethylenglykol mindestens eines aus einem Succinylpolyethylenglykol, einem Methoxypolyethylenglykol, einem Aminpolyethylenglykol und Mischungen davon umfasst.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei das mindestens eine Biomolekül mindestens eines aus Streptavidin, Avidin, Biotin und Mischungen davon umfasst.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei jedes magnetische Nanopartikel eine einzelne magnetische Domäne umfasst.
Bei einer oder mehreren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung magnetische Nanopartikel, wobei die magnetischen Nanopartikel eine in hohem Maße geordnete kristalline Struktur, wie gemessen durch SAD-Analyse aufweisen.
Die vorhergehende Erfindung wurde gemäß den relevanten rechtlichen Standards beschrieben und daher ist die Beschreibung in der Art beispielhaft anstatt begrenzend. Variationen und Modifikationen an der offenbarten Ausführungsform können einem Fachmann offensichtlich werden und fallen in den Umfang der Erfindung. Dementsprechend kann der Umfang des gewährten rechtlichen Schutzes dieser Erfindung nur durch Studieren der folgenden Ansprüche bestimmt werden.

Claims

Magnetische Nanopartikel, die eine Flüssigzustand-Wechselfeld-Suszeptibilität pro Partikel bei 25°C aufweisen, welche die folgende Formel erfüllt: χ/N ≥ A(D – 13) Wobei: χ die Wechselfeld-Suszeptibilität bei 100 Hz ist N die Anzahl an MNPs ist D der Durchmesser der Nanopartikel in Nanometern ist A gleicht (χ/N) / D und reicht im Wert von 5·10^–17 bis 2·10^–16.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei der Wert von χ/N gleich oder größer als 5·10^–16 ist.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Nanopartikel in einer magnetischen Feldstärke von 2000 Oe oder weniger detektierbar sind.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Nanopartikel in einer magnetischen Feldstärke von 1000 Oe oder weniger detektierbar sind.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Nanopartikel in einer magnetischen Feldstärke von 100 Oe oder weniger detektierbar sind.
Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Partikelgröße von 10 bis 25 Nanometer mit einer Größenverteilung von +/–2 Nanometer, die eine Tensidbeschichtung aus Ölsäure und Oleylamin aufweisen, wobei, unabhängig voneinander, das Molverhältnis der Ölsäure und das Molverhältnis von Oleylamin zu Eisenoxid von 1:1 bis 2,5:1 beträgt.
Magnetische Eisenoxid-Nanopartikel nach Anspruch 6, mit einer Partikelgröße von 13 bis 20 Nanometer mit einer Größenverteilung von +/–2 Nanometer.
Magnetische Eisenoxid-Nanopartikel nach Anspruch 6, mit einer Partikelgröße von 13 bis 18 Nanometer mit einer Größenverteilung von +/–2 Nanometer.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Nanopartikel als Magnetfeld-Reporterpartikel verwendet werden und durch einen Magnetfeldsensor detektierbar sind.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 9, wobei der Magnetfeldsensor einer von einem Riesenmagnetowiderstand-(GMR)-Sensor, einem Tunnelmagnetowiderstand-(TMR)-Sensor, einem Supraleiter-Quanteninterferometer (SQUID) oder einem Hall-Sensor ist.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Nanopartikel weiter mindestens ein Biomolekül umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Protein, einem Antikörper und einem Enzym.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Nanopartikel Eisenferrit, Magnetit, Maghemit oder eine Mischung davon umfassen.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Nanopartikel weiter mit mindestens einem Polyethylenglykol oberflächenmodifiziert sind.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 13, wobei das Polyethylenglykol mindestens eines aus einem Succinylpolyethylenglykol, einem Methoxypolyethylenglykol, einem Aminpolyethylenglykol und Mischungen davon umfasst.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 11, wobei das mindestens eine Biomolekül mindestens eines aus Streptavidin, Avidin, Biotin und Mischungen davon umfasst.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei jedes magnetische Nanopartikel eine einzelne magnetische Domäne umfasst.
Magnetische Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Nanopartikel wie gemessen durch Selective Area Diffraction-Analyse eine in hohem Maße geordnete kristalline Struktur aufweisen.