DE19534632A1 - System zur Temperaturwechselbehandlung von Probenflüssigkeiten - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein System zur Temperaturwechselbehandlung von Nuklein­ säuren, ein Verfahren zur Temperaturwechselbehandlung von Probenflüssigkeiten und ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure in einer Probe.

Die Einstellung einer bestimmten Temperatur in einer Flüssigkeit ist bei Reaktionen, die unter Beteiligung biologisch aktiver Komponenten ablaufen, ein wichtiges Kriterium. Wenn die Temperatur nicht richtig eingestellt ist, kann es sein, daß eine bestimmte Reaktion über­ haupt nicht oder nur in unerwünschtem Umfange abläuft. Dies gilt insbesondere für alle Re­ aktionen, bei denen Enzyme beteiligt sind. Enzyme weisen, abhängig von der Temperatur, unterschiedliche Reaktionskinetiken auf. Außerdem ist die Bildung von Komplexen zwischen biologischen Bindepartnern, z. B. zueinander komplementäre Nukleinsäuren, von der Temperatur abhängig. Oberhalb der Schmelztemperatur liegen die Nukleinsäuren in einzelsträngiger und unterhalb der Temperatur in doppelsträngiger Form vor. Für den Fall, daß mehrere Reaktionen hintereinander ablaufen sollen, die unterschiedliche Temperatur­ bedingungen erfordern, ist es erforderlich, die Temperatur des Reaktionsmediums zu ändern.

Bisher wurde dies dadurch bewirkt, daß das Gefäß, in dem sich die Reaktionsmischung be­ findet, zwischen Flüssigkeitsbädern unterschiedlicher Temperatur hin und her transportiert wurde. Dadurch, daß das Gefäß eine gewisse Zeit in jedes Bad eintauchte, nahm die im Ge­ fäß befindliche Flüssigkeit die Temperatur des Temperiermediums an. Nach einer für die gewünschte Reaktion ausreichenden Zeit wurde das Gefäß mit der Flüssigkeit in ein weite­ res Flüssigkeitsbad transferiert. Diese Verfahren waren naturgemäß sehr arbeitsaufwendig und schlecht automatisierbar.

In jüngerer Zeit wurden Geräte entwickelt, bei denen das Gefäß mit der zu temperierenden Flüssigkeit an einem Ort belassen, jedoch die Temperatur des Temperiermediums geändert wurde. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß sie relativ zeitaufwendig sind weil die Temperatur des gesamten Kühlmediums geändert werden muß. Insbesondere bei Kühl­ vorgängen ist dies nachteilig.

Insbesondere auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik werden Temperaturwechselbe­ handlungen oft eingesetzt. Beispielsweise in der Polymerase-Kettenreaktion (EP-A-201 184) wird die Temperatur des Temperiermediums zyklisch variiert. Hierzu wurden sogenannte Thermocycler beschrieben (US-A-5,038,852 und EP-A-0 488 769). Bei diesem Verfahren wird ein Reaktionsblock aus Metall, in dem sich Ausnehmungen für die Reaktionsgefäße befinden, erhitzt und abgekühlt, um die Temperaturwechselbehandlungen zu erreichen.

In WO 92/07089 ist ein System beschrieben, bei dem die Reaktionsflüssigkeit in einem ge­ schlossenen Kreislauf zwischen Zonen mit Kühl- bzw. Heizelementen hin und her transpor­ tiert wird. Das hierfür erforderliche System ist jedoch kompliziert und für einen Gebrauch in der Routine wenig geeignet.

In der älteren, nicht vorpublizierten DE-A-44 09 436 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem ein kombiniertes Heiz-/Kühlelement in das Reaktionsmedium eingetaucht wird und die Temperatur des Reaktionsmediums nur in der unmittelbaren Nähe des Heizelementes ge­ ändert wird.

Bei der Durchführung einer Temperaturwechselbehandlung von Probenflüssigkeiten, insbe­ sondere während der Polymerase-Kettenreaktion werden Temperaturen angewandt, bei denen der Dampfdruck des Wassers relativ hoch liegt, schlägt sich üblicherweise Flüssigkeit am Deckel des Reaktionsgefäßes nieder. Da dies jedoch zu einer Konzentrierung der Reak­ tionskomponenten führt, welche nicht kontrollierbar ist, wurde vorgeschlagen, in den Deckel eine Heizung zu integrieren, wodurch eventuell am Deckel niedergeschlagene Flüssigkeitströpfchen wieder in die Gasphase überführt werden können. Diese Deckel­ heizungen sind jedoch so positioniert, daß sie nur Bereiche erhitzen, die nicht in die Flüssig­ keit eintauchen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung war es, ein alternatives System zur Temperatur­ wechselbehandlung von Flüssigkeiten bereitzustellen.

Gegenstand der Erfindung war daher ein System zur Temperaturwechselbehandlung von nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten in einem Gefäß, enthaltend ein wiederverwertbares Temperierelement und ein disposibles Heizelement, wobei das Heizelement integrierter Be­ standteil des Gefäßes oder eines Deckels des Gefäßes ist und zur Durchführung der Be­ handlung in die Flüssigkeit eintaucht.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung von Nukleinsäuren in einer Flüssigkeit unter Einstellung von 2 oder mehr Temperaturen mittels eines Temperier- und eines Heizelements, wobei das Temperierelement Teil eines wiederverwertbaren Ge­ rätes und das Heizelement Teil einer disposiblen Vorrichtung ist.

Das erfindungsgemäße System ist zum Einsatz in solchen Verfahren gedacht, bei denen eine Flüssigkeit oder Segmente davon auf verschiedene Temperaturniveaus gebracht werden muß. Dies ist beispielsweise erforderlich, wenn Vorgänge, die in der Flüssigkeit ablaufen sollen, z. B. chemische oder vorzugsweise enzymatische Reaktionen, nur oder bevorzugt bei bestimmten Temperaturen ablaufen. Weitere Vorgänge, die temperatursensitiv sind, sind wie oben geschildert die Trennung von zueinander komplementären Nukleinsäuresträngen durch Erwärmung bzw. Inkubation der Flüssigkeit auf eine Temperatur oberhalb des ent­ sprechenden Schmelzpunktes (T_m) und die Bildung von Hybriden aus Nukleinsäuren, die im wesentlichen zueinander komplementär sind bei Temperaturen, die unterhalb des Schmelzpunktes, bevorzugt mehr als 15°C unterhalb des Schmelzpunktes liegen, die soge­ nannte Hybridisierung. Ein weiterer Vorgang, der die Behandlung bei einer erhöhten Temperatur erfordert, ist der Aufschluß von Zellkompartimenten. Des weiteren können erhöhte Temperaturen zur gezielten Zerstörung von in der Flüssigkeit enthaltenen, tempera­ turinaktivierbaren Inhaltsstoffen benutzt werden, z. B. auch zur Inaktivierung von für den Aufschluß benutzten Enzymen, z. B. Proteinasen. Das erfindungsgemäße System erlaubt die Einstellung der jeweils erforderlichen oder gewünschten Temperatur, unabhängig davon, wie oft ein Temperaturwechsel erforderlich ist. Es ist daher auch möglich, einige oder mehrere dieser Schritte hintereinander und abwechselnd mehrfach durchzuführen.

Unter einer Temperaturwechselbehandlung einer Flüssigkeit soll im Sinne der Erfindung eine Behandlung der Flüssigkeit verstanden werden, bei denen die Flüssigkeit so behandelt wird, daß Vorgänge, die in der Flüssigkeit ablaufen sollen, bei unterschiedlichen Temperatu­ ren ablaufen können. Hierbei sind sowohl zeitliche Temperaturprofile als auch örtliche Temperaturprofile umfaßt.

Ein prominentes Beispiel für die mehrfache Durchführung von Behandlungen bei unter­ schiedlichen Temperaturen ist die Amplifikation von Nukleinsäuren gemäß der Polymerase- Kettenreaktion. Diese Reaktion ist in der Fachwelt mittlerweile vielfach und in verschie­ densten Modifikationen beschrieben. Ein prominentes Beispiel einer solchen Offenbarung ist US-A-4,683,202. Essentielles Merkmal der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist die mehrfache Durchführung von Temperaturzyklen, welche eine Behandlung bei hohen Temperaturen, z. B. in einem Bereich zwischen 90 und 95°C zur Einzelsträngigmachung eventuell vorhandener doppelsträngiger Nukleinsäuren, eine Behandlung bei niedrigen Temperaturen, z. B. im Bereich zwischen 50 und 65°C, zur Hybridisierung von Primern an die zu amplifizierenden Nukleinsäuresequenzen und einer mittleren Temperatur, z. B. in einem Bereich zwischen 70 und 75°C zur optimalen Verlängerung des Primers unter Ver­ wendung der zu amplifizierenden Nukleinsäure als Matrize. Die Möglichkeiten zur Varia­ tion der Temperaturzyklen sind beispielsweise auch beschrieben in EP-A-0 511 712.

Nukleinsäuren, die einer erfindungsgemäßen Behandlung unterzogen werden können, sind alle natürlich vorkommenden, davon abgeleiteten, Nukleobasen enthaltende Biopolymere oder Analoge hierzu, die durch Modifizierung entweder der Base oder des Zuckerphosphat­ backbones erhältlich sind. Die Nukleinsäuren können in der Flüssigkeit in gelöster Form, in zellgebundener Form und in an eine feste Oberfläche gebundener Form (immobilisiert), z. B. an Partikeln, vorliegen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren zumindest während eines Schrittes der Temperaturwechselbehandlung in gelöster Form vor. Es ist möglich, die Nukleinsäuren von einer immobilisierten Form in die gelöste Form zu überführen und um­ gekehrt.

Als Flüssigkeiten eignen sich prinzipiell alle nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten, z. B. Proben, die direkt aus ihrer ursprünglichen Umgebung entnommen wurden. Als Flüssigkei­ ten sind jedoch insbesondere solche geeignet, die eine gewisse Aufbereitung erfahren haben, z. B. einen Schritt zur Entfernung bestimmter Probenbestandteile, zur Verflüssigung der Probe, einer Konzentration oder Verdünnung der Probe, eines Aufschlusses, jedoch auch zur Isolierung der Nukleinsäuren aus einer ursprünglichen Probe.

Als Proben kommen insbesondere Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin, Sputum oder Ab­ striche in Betracht.

Das Gefäß, in dem die Temperaturwechselbehandlung vorgenommen wird, ist vorzugsweise hergestellt aus einem Material, welches die Temperaturwechselbehandlung ohne Verände­ rung der Form oder Abgabe von Materialbestandteilen an die Flüssigkeit übersteht. Be­ sonders geeignet hierfür sind Kunststoffe, z. B. Polypropylen oder Polystyrol. Die Größe des Gefäßes wird so gewählt, daß die Probe und eventuell zugegebene Reagenzien und das Heizelement hineinpassen. Besonders geeignet sind z. B. von Eppendorff-Hütchen abge­ leitete Gefäße, die jedoch bevorzugt keinen im Material mit dem Hütchen verbundenen Deckel aufweisen. Solche Gefäße sind kommerziell erhältlich oder auf einfache Weise durch Spritzgußverfahren herstellbar.

Weiterer wesentlicher Bestandteil des Systems ist ein Deckel, mit welchem das Gefäß ver­ schlossen werden kann. Er sollte dazu geeignet sein, den Ein- und Austrag von Kontamina­ tionen aus dem Gefäß und in das Gefäß hinein in Grenzen zu halten. Auch er besteht aus einem im wesentlichen temperaturbeständigen Material, wie für das Gefäß angegeben. Ein Temperierelement ist ein Gegenstand, der aktiv auf eine gewünschte Temperatur gebracht werden kann, bevorzugt ein Kühlelement. Das Kühlelement im Sinne der Erfindung ist ein Gegenstand, welcher aktiv gekühlt wird und Wärme direkt oder indirekt aus der Flüssigkeit aufnehmen kann. Er umfaßt nicht das Gefäß. In einer ersten Ausführungsform ist das Kühl­ element beispielsweise ein Metallblock, welcher über Peltierelemente (Trockenkühlung) oder über gekühlte Flüssigkeiten (Flüssigkeitskühlung) gekühlt werden kann. Sofern es sich um einen Metallblock handelt, ist dieser bevorzugt an die äußere Kontur des Gefäßes ange­ paßt. Die Anpassung kann z. B. dadurch geschehen, daß das Kühlelement hohlzylindrische Ausnehmungen aufweist, in welche die Gefäße eingedrückt werden können. Je besser die Anpassung des Kühlelementes an die Außenform des Gefäßes ist, desto besser ist auch die Kühlwirkung. In einer anderen Ausführungsform ist das Kühlelement ein bevorzugt metallisches Bauelement, welches durch eine Öffnung, bevorzugt eine durch den Deckel verschließbare Öffnung, in das Gefäß hineinragt. Hier ist insbesondere eine Kühlung über Peltierelemente bevorzugt. Das Kühlelement ist in diesem Fall bevorzugt über eine Folie, z. B. aus Teflon oder Polyester, vor direkter Kontamination durch die Flüssigkeit geschützt. Die Folie wird nicht als Teil des Kühlelementes angesehen, da sie nicht wiederverwertbar ist. Das Kühlelement kann jedoch auch ein Wasserbad sein, in das das Gefäß hineinragt. Hierbei ist der Wärmeübergang vom flüssigen Kühlmedium über das Gefäß in die Reak­ tionsmischung besonders direkt. Ein Temperierelement im Sinne der Erfindung kann jedoch durchaus auch Heizfunktion haben, wenn die Temperaturwechselbehandlung in der Flüssig­ keit eine untere Grenztemperatur erfordert, die wesentlich oberhalb der Raumtemperatur liegt. In diesem Fall kann es sein, daß die Wärmeabfuhr durch das Temperierelement an die Umgebung so groß ist, daß zum Erhalt der unteren Schwellentemperatur sogar Wärme zu­ geführt werden muß. Dennoch liegt die Temperatur des Temperierelements immer unterhalb der Temperatur des Heizelementes.

Unter der Wiederverwertbarkeit des Kühlelementes wird die Möglichkeit verstanden, das Kühlelement zu seiner Behandlung mindestens einer weiteren Flüssigkeit zu benutzen. Diese weitere Flüssigkeit hat bevorzugt eine von der ersten Flüssigkeit unterschiedliche Zu­ sammensetzung, so daß darauf geachtet werden muß, daß eine Kontamination der weiteren Flüssigkeit durch die erste Flüssigkeit minimiert ist. Aus diesem Grund ist die Ausführungs­ form, in der das Kühlelement das Gefäß von außen kühlt, bevorzugt.

Ein Heizelement im Sinne der Erfindung ist ein Gegenstand, der aktiv geheizt wird und dessen Wärmeentwicklung zur Erwärmung der zu behandelnden Flüssigkeit benutzt wird. Es kann sich hierbei um ein mehrkomponentiges Heizelement handeln. Bevorzugt enthält das Heizelement einen Metalldraht oder eine Metallfolie, z. B. aus Gold, oder ein Graphit­ element. Solche Heizelemente sind dem Fachmann bekannt. Die Heizleistung des Heiz­ elements wird so ausgelegt, daß die gewünschte Temperatur der Flüssigkeit in gewünschter Zeit erreicht wird. Dies kann beispielsweise durch Variation der Größe des Heizelementes, der verwendeten Materialien und der Stromzufuhr erreicht werden.

Disposibel im Sinne der Erfindung ist ein Element, welches nach Durchführung eines Ver­ fahrens zur Temperaturwechselbehandlung einer Flüssigkeit weggeworfen wird. Es wird nicht für die Temperaturwechselbehandlung von Flüssigkeiten benutzt, die einer unabhängi­ gen Temperaturwechselbehandlung unterzogen werden sollen. Insbesondere wird in der Analytik solcher Flüssigkeiten das Heizelement zwischen jeder Analyse verworfen. Aus diesem Grund sind einfach gebaute und kostengünstig hergestellte Heizelemente bevorzugt.

Ein integrierter Bestandteil im Sinne der Erfindung ist ein Bestandteil, welcher nicht ohne Zerstörung entweder des Heizelementes oder des Gefäßes oder des Deckels von diesen ge­ trennt werden kann. Besonders bevorzugt ist das Heizelement in das Gefäß oder den Deckel eingegossen, was besonders Vorteile für die spritzgußtechnische Herstellung mit sich bringt. In einer ersten Ausführungsform kann das Heizelement in das Gefäß integriert sein. Hierbei muß darauf geachtet werden, daß das Heizelement im Bereich der Flüssigkeitsaufnahme lokalisiert ist, d. h. zum Beispiel am Boden des Gefäßes oder an der Seitenwand des Ge­ fäßes, die mit der Flüssigkeit in Kontakt kommt. In der bevorzugten Ausführungsform, nämlich, daß das Heizelement ein integrierter Bestandteil des Deckels ist, ist das Heizele­ ment bevorzugt an der Innenseite des Deckels befestigt und ragt bei aufgesetztem Deckel in das Gefäß hinein. Das Heizelement oder Anschlüsse, z. B. für Strom, ragen dann durch den Deckel auf die Außenseite des Deckels hinaus und können mit Kopplungselementen an ein wiederverwertbares Gerät zur Versorgung des Heizelementes mit Strom und gegebenenfalls zur Regulierung der Heizleistung versehen sein.

Das Eintauchen des Heizelementes in das Gefäß geschieht so, daß die aufzuheizenden Teile der Flüssigkeit eine ausreichende Wärme erhalten können. Das Heizelement ragt daher be­ vorzugt über seine gesamte Höhe in die Flüssigkeit hinein.

Zu dem erfindungsgemäßen System können neben den essentiellen Bestandteilen Gefäß, Deckel, Heizelement und Kühlelement noch weitere, für die Durchführung von Tempera­ turwechselbehandlungen von Flüssigkeiten und gegebenenfalls anschließenden Weiterbe­ arbeitungsschritten, geeignete Elemente enthalten sein. Hierzu gehören insbesondere Bau­ elemente zur Versorgung der Heiz- und Kühlelemente mit Kühlmittel bzw. Strom, Elemente zur Regelung der Temperatur, Elemente zur Messung der Temperatur, Einheiten zum Transport von Gefäßen, Elemente zur Pipettierung von Flüssigkeiten in das Gefäß und aus dem Gefäß heraus und Elemente zur Steuerung des Gesamtsystems. Bevorzugt enthält das System eine Vielzahl von Gefäßen und Deckel, so daß es zur Behandlung einer Vielzahl von nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten in Serie oder/und parallel geeignet ist.

Bezüglich der Heizung und Kühlung der Flüssigkeit sind zwei besondere Ausführungs­ formen möglich. In einer ersten Ausführungsform ist das Heizelement in Intervallen aktiv, z. B. wird der Flüssigkeit Heizleistung nur wenige Bruchteile von Sekunden zugeführt, während die Kühlung permanent erfolgt. Hierdurch bilden sich in der Flüssigkeit bevorzugt zeitlich aufeinanderabfolgende unterschiedliche Temperaturgradienten, wobei die Tempera­ turen in der Nähe des Kühlelementes im wesentlichen konstant bleiben, während die Tempe­ ratur der Flüssigkeit in der Nähe des Heizelementes stark variiert. Hierdurch kann bei­ spielsweise erreicht werden, daß in unterschiedlichen Regionen im Gefäß unterschiedliche Reaktionen ablaufen. Beispielsweise würde im Fall der Erhitzung des Heizelements auf für die Denaturierung von Nukleinsäuren erforderliche Grade eine Denaturierung nur in der Nähe des Heizelementes stattfinden, wonach die denaturierten Nukleinsäuren in Bereiche transportiert werden können, in denen eine Hybridisierung mit anderen Nukleinsäuren statt­ finden kann.

In einer zweiten, besonders bevorzugten Ausführungsform sind sowohl die Heizung als auch die Kühlung permanent eingeschaltet und bevorzugt konstant. Hierdurch bildet sich ein Temperaturgradient aus, welcher durch Diffusion und gegebenenfalls Konvektion kontrolliert ist. Auch hier können in unterschiedlichen Bereichen des Gefäßes unterschied­ liche Reaktionen ablaufen. In dieser Ausführungsform sind bevorzugt alle Komponenten, die an den jeweiligen Reaktionen teilnehmen sollen, in der Flüssigkeit gelöst.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Gerät im wesentlichen aus einem Temperierblock sowie Elementen zur Bereitstellung und Regelung von elektrischer Energie für den Betrieb des Heizelementes.

Der Temperierblock ist ein vorzugsweise metallischer Körper mit Aufnahmebohrungen für Kunststoffgefäße. Die nötige Temperierleistung kann hierbei entweder durch Verwendung temperierter Flüssigkeiten (Wärmeträger-Flüssigkeit, Umlauf-Kühlung), Einsatz von Peltier- Elementen oder sonstigen bekannten Temperierverfahren zugeführt werden.

Die Abmessungen der Aufnahmebohrungen für die Kunststoffgefäße orientieren sich streng an den Außenabmessungen der Kunststoffgefäße, direkter Kontakt von Temperierblock und Kunststoffgefäß ist für den guten Wärmeübergang erforderlich.

Vorzugsweise sollte die Tiefe der Bohrung im Verhältnis 5 : 1 zum Durchmesser stehen, da dadurch bei guter Ausbildung von Temperaturgradienten eine für das System günstige Um­ wälzung der Flüssigkeit stattfindet.

Das Kunststoffgefäß, in welchem die kontinuierliche Temperaturwechselbehandlung abläuft, ist vorzugsweise aus Polypropylen mit einer Wandstärke kleiner als 1,0 mm (jedoch ab­ hängig vom Gesamtvolumen der Reaktionslösung).

Bei Reaktionsführungen im Bereich der Anwendungen in der Klinischen Chemie und in der Nukleinsäurediagnostik werden üblicherweise Volumina kleiner 1 ml eingesetzt. Daraus ergeben sich ca.-Abmessungen für das Gefäß von 8 mm Innendurchmesser und 40 mm Höhe.

Zur Verhinderung von Verunreinigungen der Reaktionslösung und zur Unterbindung von Verdunstungsverlusten wird das Gefäß mit einem Deckel, ebenfalls im Spritzguß aus Poly­ propylen gefertigt, verschlossen.

Das disposible Heizelement besteht im wesentlichen aus dem Kunststoff-Formkörper, den Elektroanschlüssen sowie der Heizleiterfolie. Die Abmessungen des disposablen Heiz­ elementes sind angepaßt an die Abmessungen des Reaktionsgefäßes.

Eine Ausführungsform des disposiblen Heizelementes besteht darin, daß in ein aus Deckel und Halterungen bestehendes, im Spritzgußverfahren gefertigtes Kunststoffieil, eine vorge­ fertigte Anordnung von Heizieiterfolie und Kontaktierungen integriert ist.

Die Heizleiterfolie ist bevorzugt eine 20 µm dicke Goldfolie. Der für das Spritzgußteil ver­ wendete Kunststoff ist Polypropylen. Die Fläche des aktiven Heizelementes beträgt vor­ zugsweise 60 mm², das untere Ende des Elementes ragt bis zum Gefäßboden in das Reak­ tionsgefäß.

Das oben geschilderte System zur Temperaturwechselbehandlung von nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten kann vorteilhaft in vieler Weise eingesetzt werden.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Behandlung von Nuklein­ säuren in einer Flüssigkeit unter Einstellung von zwei oder mehr Temperaturen mittels eines Kühl- und eines Heizelementes, wobei das Kühlelement Teil eines wiederverwertbaren Ge­ rätes und das Heizelement Teil einer disposiblen Vorrichtung ist. Die oben genannten be­ vorzugten Merkmale gelten auch für dieses Verfahren. Als besonders zweckmäßig hat sich die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in thermozyklisch geführten Reak­ tionen erwiesen. Bei solchen Verfahren finden bei unterschiedlichen Temperaturen unter­ schiedliche Reaktionen statt. Durch Unterwerfung der Reagenzien unter bestimmte Tempe­ raturen können die Reaktionen ablaufen. Dies kann einerseits, wie oben beschrieben, durch zeitliche Variation des Temperaturprofils in der Reaktionsmischung durch Erhöhung oder Erniedrigung der Heiz- bzw. Kühlleistung geschehen, andererseits jedoch auch durch An­ legen eines konstanten Temperaturprofils zwischen den beheizten Bereichen und den ge­ kühlten Bereichen. Übergangsformen, z. B. bewirkt durch Konvektionen der Mischung sind denkbar.

Wesentlich ist, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktanten der gewünsch­ ten Reaktion nacheinander unterschiedlichen Temperaturen ausgesetzt werden, so daß die unterschiedlichen Reaktionen ablaufen können. Während der Gesamtbehandlungszeit kann beispielsweise für zyklische Reaktionen durch Steuerung der Heiz- bzw. Kühlleistung er­ reicht werden, daß die Reaktanten zyklisch unterschiedlichen Reaktionsbedingungen unter­ worfen werden und daher Reaktionszyklen nacheinander durchgeführt werden. Bei Anlegen eines relativ konstanten Temperaturgradienten an der Reaktionsmischung erfolgt die Zyklusbehandlung durch Diffusion der Reaktionspartner aus einem Raumsegment der Reaktionsmischung in ein Segment mit einer anderen Temperatur. Durch Rediffusion bzw. Diffusion in ein Segment mit einer Temperatur, wie sie die darauffolgende Reaktion be­ nötigt findet die Zyklusführung statt. Da Diffusionsvorgänge üblicherweise relativ langsam stattfinden, ist es bevorzugt, einen relativ steilen Temperaturgradienten zu wählen, d. h., daß das Temperaturgefalle zwischen Heizelement und Kühlelement auf eine relativ kurze Strecke beschränkt wird. Typische Wegstrecken zwischen Heiz- und Kühlelement sind wenige Millimeter.

Ein typisches Beispiel für ein Verfahren zur Temperaturwechselbehandlung von Nuklein­ säuren ist die Amplifikation von Nukleinsäuren oder Teilen davon. Ein Beispiel hierfür ist die Polyermasekettenreaktion, wie sie in US-A-4,683,202 beschrieben ist. Ein weiteres Bei­ spiel ist die Ligasekettenreaktion.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure einer Probe durch

• a) Freisetzen der Nukleinsäure, auf der der Nachweis beruhen soll, aus Kompartimenten, in denen sie enthalten ist, in einem Gefäß,
• b) Vermehrung von Sequenzinformationen, die auf der Anwesenheit der Nukleinsäure in dem Gefäß beruht und
• c) Nachweis der Sequenzinformationen,

wobei die Nukleinsäure während und zwischen den Schritten a) und b) nicht aus dem Gefäß entfernt wird.

Das erfindungsgemäße System kann somit zur deutlichen Vereinfachung von Nuklein­ säurenachweisverfahren eingesetzt werden. Besonders bevorzugt wird die Flüssigkeit mit Ausnahme von Mischvorgängen nicht innerhalb des Gefäßes von einem Ort an einen ande­ ren transportiert.

Die Freisetzung der Nukleinsäuren kann auf im Prinzip bekannte Weise geschehen. Übliche Behandlungen enthalten die Lyse von Zellwänden, z. B. durch geeignet Reagenzien, wie Proteinase K, Detergenzien oder Alkali, oder aber durch Hitze. Dies bewirkt, daß die Nukleinsäuren in Lösung und zugänglich für Reagenzien zur Weiterverarbeitung vorliegen. Dieser Schritt findet in einem Gefäß statt, das inert ist gegenüber den Reaktionsbedingun­ gen der Freisetzung und dem folgenden Schritt b). In dem selben Gefäß wird nun Sequenz­ information, die auf der Anwesenheit der Nukleinsäure in dem Gefäß beruht, vermehrt, z. B. durch Amplifikation eines Teilbereiches der freigesetzten Nukleinsäuren. Dies kann bei­ spielsweise geschehen durch die Polymerasekettenreaktion.

Prinzipiell kann die Sequenzinformation jedoch auch in einer Nukleotidsequenz bestehen, die durch eine Bindereaktion an die nachzuweisende Nukleinsäure gekoppelt und an­ schließend vermehrt wurde. Es kann sich hierbei z. B. um eine sogenannte Signalamplifika­ tion handeln. Wesentlich für den Gegenstand der Erfindung ist, daß die Reaktionen der Schritte a) und b) in dem selben Gefäß stattfinden. Schritt b) kann beispielsweise dadurch gestartet werden, daß die nukleinsäurehaltige Flüssigkeit in dem Gefäß einer Temperatur­ wechselbehandlung mit Hilfe des oben genannten wiederverwertbaren Temperierelements, insbesondere Kühlelements, und dem disposiblen Heizelement unterworfen wird. Dies kann bevorzugt dadurch geschehen, daß das Gefäß während der Schritte a) und b) in dem wiederverwertbaren Kühlelement aufbewahrt wird und zur Durchführung des Schrittes b) das disposible Heizelement in das Gefäß eingeführt wird. Wenn das disposible Heizelement in einen Deckel integriert ist, kann dieser auch schon während des Schrittes a) auf dem Ge­ fäß befindlich sein und nach Freisetzung der Nukleinsäure zur Hitzebehandlung eingesetzt werden.

Der Nachweis der Sequenzinformation kann nach prinzipiell bekannten Verfahren ge­ schehen, z. B. durch Überführung der Reaktionsmischung aus Schritt b) in ein Gefäß, in dem die entstandenen Nukleinsäuren, bevorzugt über eine Hybridisierungsreaktion, nach­ gewiesen werden. Eine mögliche Versuchsführung benützt das sogenannte Sandwich- Prinzip, wie es in EP-B-0 079 139 beschrieben ist. Dieses Verfahren benutzt eine zu der vermehrten Sequenzinformation komplementäre Fangsonde, die entweder an eine feste Phase gebunden ist oder gebunden werden kann und eine Nachweissonde, die markiert ist und zu einem anderen Teil der vermehrten Sequenzinformation komplementär ist. Die Bildung des Komplexes aus Sonden und vermehrter Sequenzinformation enthaltene Nukleinsäure wird zum Zeichen der Anwesenheit von Nukleinsäuren in der Probe benutzt. Durch die Vermeidung einer Überführung der Nukleinsäure von einem Gefäß in ein anderes wird die Gefahr einer Kontamination der Reaktionsmischung und der Umgebung stark re­ duziert. Darüber hinaus ist das Verfahren natürlich sehr viel einfacher und unter Verwen­ dung weniger Geräte durchführbar.

In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßer Deckel (1) mit integriertem Heizelement gezeigt. Es ist erkennbar, daß der Deckel ein Verschlußteil (3) aufweist, der der Form der Öffnung des zu verschließenden Gefäßes angepaßt ist. Der Verschlußteil setzt sich fort in einer Kunststoff­ halterung (6) für das Heizelement (5). An der Oberfläche dieser Kunststoffhalterung ist das Heizelement so befestigt, daß die Zuleitungen (4) für das Heizelement im Inneren der Kunststoffhalterung bzw. des Verschlußteiles zu liegen kommen und an einem Ende in Elektrokontakte (2) zum Anschluß an eine Stromversorgung enden.

In Fig. 2 ist der Deckel in auf ein Gefäß aufgesetzter Form gezeigt. In Fig. 2 sind auch Außenmaße für ein Gefäß und den in Fig. 1 gezeigten Deckel angegeben. Diese Außen­ maße sind für die Durchführung von erfindungsgemäßen Verfahren, z. B. Durchführung von Amplifikationsverfahren, geeignet, können jedoch von einem Fachmann insbesondere an abweichende Flüssigkeitsmengen auf einfache Weise angepaßt werden. Das Gefäß ist mit dem Bezugszeichen (7) gekennzeichnet.

In Fig. 3 ist ein erfindungsgemäßes System gezeigt, mit welchem eine Vorbereitung von nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten für die Amplifikation und die Amplifikation selbst durch­ geführt werden kann. In dieser Figur kann der Tophandler den Deckel der Fig. 1 (Top) ergreifen und auf bereitstehende Reaktionsgefäße (Disposable-Devices) aufsetzen. In den Tophandler sind darüber hinaus Kontakte für die Stromversorgung der Deckelheizung inte­ griert. Mit Hilfe der Pipettiereinheit und Pipettenspitzen (Disposable-Tips) können Reagenzien oder/und Probenflüssigkeiten in die Reaktionsgefäße überführt werden. Sobald der erfindungsgemäße Deckel ausgebraucht ist, kann er in ein Abfallgefäß überführt werden (solid phase disposable with top). Die gesamten Vorgänge werden bevorzugt in einem Ge­ rät durchgeführt, in dem in alle 3 Raumrichtungen Pipettier- und Transportvorgänge statt­ finden können (z. B. Laborroboter).

In Fig. 4 ist ein System mit Stromanschluß (8), Elektrokontakten (2), Reaktionsge­ misch (9), welches durch die Wärmeentwicklung des Heizelements konvektiv gemischt wird, Gefäß (7) und Kühlblock (10) gezeigt.

Beispiel 1 Erstellung eines Systems für die Durchführung einer DNA-Analyse

Das System ist aufgebaut aus einem Wasserbad, das auf eine Temperatur von 57°C geregelt ist. Über der Wasseroberfläche ist eine Lochplatte in einem Abstand befestigt, daß das Reaktionsgefäß gemäß Fig. 2 zu ungefahr der Hälfte in das Wasser eintaucht. Ein Rand am Gefäß verhindert, das Abrutschen des Gefäßes in das Wasserbad. Die Aufnahmebohrungen der Lochplatte sind daher nur geringfügig größer als 8 mm. Das Kunststoffgefäß ist aus Propylen mit einer Wandstärke von 0,4 mm (Fig. 2).

Das eingesetzte Heizelement ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. Es handelt sich um ein im Spritzgußverfahren gefertigtes Kunststoffieil, in welches eine 20 µm dicke Goldfolie und Heizleitungen so integriert sind, daß die Goldfolie auf einer Folienseite von der Flüssigkeit benetzt werden kann.

Beispiel 2 Durchführung einer DNA-Analyse 1. Probenvorbereitung/DNA-Isolierung

Humane Leukozyten-DNA wurde nach folgender Methode aus Vollblut unter Verwen­ dung des QIAamp Blood Kit (Best. Nr. 29104) der Fa. Quiagent (Postfach, 40719 Hilden) isoliert.

In einem 2 ml Eppendorf-Gefäß werden 200 µl EDTA-antikoaguliertes Vollblut, 25 µl Proteinase-K-Lösung (19 mg/ml) und 200 µl Probenaufschluß/Bindungspuffer pipettiert. Die Probe wird sofort mittels Vortex geschüttelt, um das sich bildende Pellet zu resuspendieren. Die Probe wird für 10 Minuten bei 70°C erhitzt, danach auf Raum­ temperatur abgekühlt und mit 210 µl Isopropanol aufgestockt. Die Probe wird in ein QIAamp "spin-column" überführt. Das "spin-column" ist ein nach unten offenes Zentri­ fugationsdevice/Röhrchen, an dessen Boden sich ein Glasfaservlies befindet.

Das "spin-column" wird auf ein 2 ml Probenauffanggefäß (2 ml Eppendorf-Gefäß) ge­ steckt und in einer Tischzentrifuge bei 6000 × g (= 8000 rpm) für 1 Minute zentri­ fugiert. Das Filtrat wird verworfen und in das "spin-column" 500 µl Waschpuffer pipettiert. Es wird erneut 1 Minute bei 6000 × g zentrifugiert. Das Filtrat wird ver­ worfen und der Waschvorgang nochmals wiederholt.

Danach werden 200 µl Elutionslösung (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) in das "spin-column" pipettiert und die gebundene DNA durch erneute Zentrifugation (1 Minute bei 6000 × g) vom Glasfaservlies elutiert.

Die gereinigte DNA wird mittels Extinktionsmessung am Photometer bei 260 nm und 280 nm und mittels Gelelektrophorese charakterisiert. Aus 200 µl Vollblut (ca. 5 × 10⁶ Leukozyten pro ml) werden typischerweise 6 µg DNA in 200 µl Elutionslösung (entspricht ca. 30 ng DNA/µl) mit einem Extinktionskoeffizienten A₂₆₀/A₂₈₀von 1,7-1,9 erhalten (eine Extinktion von 1000 mE bei 260 nm entspricht einem DNA-Gehalt der Probe von 50 ng/µl).

Die Fragmentgröße der eluierten DNA liegt zwischen 1 und 50 Kbp, hauptsächlich zwischen 20 und 40 Kbp, bestimmt mittels Gelelektrophorese an einem 1%igen Agarosegel (Ethidiumbromid-Färbung).

2. Amplifikation/Vervielfältigung der DNA

Mittels zweier spezifischer Primer wird eine Sequenz aus dem human-tPA-Gen (tPA = tissue-type plasminogen activator) amplifiziert. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind:

Forward (d. h. "upstream"): 5′-AGA CAG TAC AGC CAG CCT CA-3′
Reverse (d. h. "downstream"): 5′-GAC TTC AAA TTT CTG CTC CTC-3′.

Bei Verwendung dieses Primer-Paares entsteht ein Amplifikat mit einer Länge von 375 Bp.

Es wird folgender Mastermix in ein oben beschriebenes (PCR)-Reaktionsgefäß aus Polypropylen pipettiert:

10 µl
10fach PCR-Puffer mit MgCl₂ (100 mM Tris Hcl pH 8,9, 500 mM Kcl, 15f mM MgCl₂)
2 µl	10 mM d-NTP-Mix (d. h. je 10 mM d-ATP, d-GTP, d-CTP und d-TTP)
0,5 µl	Taq-Polymerase (5 U/µl)
1 µl	Forward-Primer (30 µM, Sequenz siehe oben)
1 µl	Reverse-Primer (30 µM, Sequenz siehe oben)
82,5 µl	autoklaviertes, bidestiliertes Wasser.

Sämtliche zur Amplifikation verwendeten Reagenzien (mit Ausnahme der Primer) stammen aus dem PCR Care Kit (Best. Nr. 1578 553) der Fa. Boehringer Mannheim.

Der Mastermix (Σ = 97 µl) wird kurz gevortext, in einer Tischzentrifuge kurz zentri­ fugiert und danach 3 µl DNA-haltige Probe (aus Punkt 1, DNA-Gehalt ca. 30 ng/µl) dazupipettiert. Das PCR-Gefäß wird in einen erfindungsgemäßen Heiz-/Kühlblock ge­ stellt und mit einem ein disposables Heizelement enthaltenden Deckel verschlossen.

Das Heizelement des Deckeis ist so angebracht, daß der Heizdraht zu zwei Dritteln in den PCR-Mix ragt. Das Heizelement wird an die Spannungsversorgung angeschlossen und der PCR-Mix für ca. 1/2 Stunde so inkubiert, daß sich am Heizdraht im Tube eine Temperatur von 95°C und an der Tube-Innenwand eine Temperatur von 58°C ein­ stellt.

Nach beendeter Amplifikation wird der PCR-Mix gemäß Punkt 3 analysiert.

3. Analyse des DNA-Amplifikates

In die Probenauftragstasche eines 1%igen Agarosegels werden 10 µl des PCR-Ampli­ fikates aufgegeben. In eine benachbarte Probenauftragstasche werden 800 ng des Boehringer DNA-Längenstandards VI (Best. Nr. 1062 590, Fragmentgröße 2176 Bp bis 154 Bp) aufgetragen.

Das Gel wird für 2 Stunden im Spannungsfeld entwickelt und danach auf einem UV- Tisch analysiert.

Bei Anwesenheit von humaner Leukozyten-DNA im Mastermix ist im Gel eine inten­ sive DNA-Bande sichtbar (375 Bp), deren Lage zwischen der 394 Bp-Bande und der 298 Bp-Bande des Längenstandards VI liegt.

Bezugszeichenliste

1 Deckel mit disposiblem Heizelement
2 Elektrokontakte
3 Verschlußteil des Deckels
4 Elektrozuleitung für das Heizelement (ins Innere des Kunststoffs eingegossen)
5 Heizelement (Goldfolie)
6 Kunststoffhalterung für das Heizelement
7 Gefäß
8 Stromanschluß
9 Reaktionsmischung
10 Kühlelement

Claims (8)

1. System zur Temperaturwechselbehandlung von nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten in einem Gefäß, enthaltend ein wiederverwertbares Temperierelement und ein disposibles Heizelement, wobei das Heizelement integrierter Bestandteil des Gefäßes oder eines Deckels des Gefäßes ist und zur Durchführung der Behandlung in die Flüssigkeit hineintaucht.

2. Verfahren zur Behandlung von Nukleinsäuren in einer Flüssigkeit unter Einstellung von zwei oder mehr Temperaturen mittels eines Kühl- und eines Heizelements, da­ durch gekennzeichnet, daß das Kühlelement Teil eines wiederverwertbaren Gerätes und das Heizelement Teil einer disposiblen Vorrichtung ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die disposible Vorrich­ tung der Deckel eines Gefäßes ist, in dem das Verfahren stattfindet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Heizelement während des Heizvorganges in die Flüssigkeit hineinragt.

5. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure einer Probe durch

• a) Freisetzen der Nukleinsäure, auf der der Nachweis beruhen soll, aus Komparti­ menten, in denen sie enthalten ist, in einem Gefäß,
• b) Vermehrung von Sequenzinformationen, die auf der Anwesenheit der Nuklein­ säure in dem Gefäß beruht und
• c) Nachweis der Sequenzinformation,

dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure während und zwischen den Schritten a) und b) nicht aus dem Gefäß entfernt wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Vermehrung der Sequenzinformation in Temperaturzyklen durchgeführt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperaturzyklen mit Hilfe eines Heiz- und eines Kühlelementes vorgenommen werden, wobei das Heizelement Teil einer disposiblen Vorrichtung ist.