DE19629141A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen LigandInfo
- Publication number
- DE19629141A1 DE19629141A1 DE19629141A DE19629141A DE19629141A1 DE 19629141 A1 DE19629141 A1 DE 19629141A1 DE 19629141 A DE19629141 A DE 19629141A DE 19629141 A DE19629141 A DE 19629141A DE 19629141 A1 DE19629141 A1 DE 19629141A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- fluorescence
- substrate
- image
- bacteria
- ligands
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/04—Cell isolation or sorting
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
- G01N15/1468—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
- B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
- B01J2219/00707—Processes involving means for analysing and characterising the products separated from the reactor apparatus
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/808—Optical sensing apparatus
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für eine optimierte
Selektion von Molekülen aus Molekülbibliotheken hinsichtlich ihres Bindungsver
haltens gegenüber einem oder mehreren vorgegebenen Targetmolekülen, das erst
mals eine sehr große Vielfalt von Molekülen zu untersuchen gestattet, Auskunft
über individuelle Bindungsereignisse gibt und eine schonende Selektion der zu
selektierenden Moleküle erlaubt.
Die Molekülbibliotheken als Basis für das erfindungsgemäße Selektionsverfahren
werden durch chemische Methoden (kombinatorische Chemie) oder durch bio
technologische Methoden im Rahmen der angewandten molekularen Evolution
(AME) generiert. Die kombinatorische Chemie nutzt dabei verschiedenartigste
chemische Reaktionen zum Aufbau von Molekülbibliotheken, während die AME
mit Hilfe von Mutationsstrategien eine große Population von unterschiedlichen
Biopolymeren erzeugt. Die effiziente Selektion von an ein spezifisches Target
bindende Moleküle bzw. Biopolymere ist ein wesentlicher Bestandteil zum Auf
finden neuer pharmazeutischer Wirkstoffe (Leitstrukturen) und daher von großer
Bedeutung.
Grundsätzlich sind Verfahren im Rahmen der AME zum Protein-Design bekannt
und etabliert. Anwendung fand die evolutive Strategie z. B. in dem Auffinden von
Peptid-Liganden (O'Nell et al., Prot. 14, 509 (1992)) und der Entwicklung hochaf
finer maßgeschneiderter Antikörper (Breitling et al., Gene 104, 147 (1991), Clack
son et al., Nature 352, 624 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991),
Persson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2432 (1991)). Insbesondere das
Antikörper-Engineering stellt ein vielversprechendes Konzept der angewandten
evolutiven Biotechnologie dar. Aufgrund ihrer hochselektiven Bindungseigen
schaften sind Antikörper bedeutende Reagenzien in der Forschung, Diagnostik und
Therapie (Plückthun, J. Anal. Chem. 337, 13 (1990), Plückthun, Biotechnology 9,
545 (1991), Little et al., Biotech. Adv. Vol. 12, 539 (1994)).
Neben der Bildung von Molekülbibliotheken durch die AME hat sich in letzter
Zeit vor allem die Nutzung der kombinatorischen Chemie etabliert, die unter
schiedlichste chemische Reaktionen zur Synthese der Bibliothek auf festen Trägern
wie z. B. der von Polymerbeads ausnutzt (D.J. Ecker, S.T. Crooke, Biotechnology,
1995, 13, 351; R.M.J. Liskamp, Angew. Chemie, 1994, 106, 661; T. Carell, E.A.
Winter, A. Bashir-Hashemi, J. Rebek, Angew. Chemie, 1994, 106, 2159; J.W.
Metzger, K.-H. Wiesmüller, V. Gnau, J. Brünjes, G. Jung, Angew. Chemie, 1993,
105, 901). Exemplarisch sei hier die Festphasensynthese von Benzodiazepinen
durch Hobbs De Witt et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 60, 6909)
erwähnt.
Als Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren müssen die Molekül
bibliotheken trägerbasiert vorliegen. Damit wird eine Messung an einer großen
Zahl gleicher Moleküle ermöglicht. Auf diese Weise kann das individuelle Bin
dungsverhalten ausreichend charakterisiert werden. Als trägerbasiertes System
kommen z. B. Bakterien im Rahmen der AME oder Polymerbeads im Rahmen der
kombinatorischen Chemie in Frage.
In der Literatur sind Verfahren zur Darstellung von Proteinbibliotheken auf E. coli
Bakterien (Hofnung, Meth. Enzymol. 134, 77 (1991), Klauser et al., EMBO J. 9,
1991 (1990), Fuchs et al., Biotechnology 9, 1369 (1991), Francisco et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 2713 (1992), Pugsley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
12058 (1992)) bekannt. Darüberhinaus wird die Expression auf einer
Phagenoberfläche (Hoogenboom et al., Immunolog. Reviews 130, 41 (1992))
beschrieben, die aufgrund der Phagengröße (« 1 µm) für das erfindungsgemäße Verfahren irrelevant ist.
Technische Lösungen für Selektionsverfahren zur Separierung von Zellen aus einer
großen Zahl (< 106) sind mit dem FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) und
MACS (Magnetic Activated Cell Sorter) kommerziell erhältlich.
Bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung kommen elektrostatische Prinzipien
zur räumlichen Separation zum Einsatz. Ein kommerzieller FACS (Becton &
Dickinson: FACStar plus) ist in der Lage, pro Tag ca. 108 Zellen sequentiell zu
prozessieren. Hierbei ist aber damit zu rechnen, daß die nutzbare Sortierrate
deutlich unter 100% liegt. Bei sehr seltenen Ereignissen in einer Zellpopulation
sind jedoch hohe Durchsätze wünschenswert von etwa 109 Zellen.
Im Vergleich zum erfindungsgemäßen Verfahren findet beim FACS zudem der
Sortierprozeß unmittelbar nach dem Meßprozeß statt, so daß bei einer nach
träglichen Korrektur der Schwellwerte für Affinitäten der Sortierprozeß als ganzes
wiederholt werden müßte. Damit geht eine weitere mechanische Belastung des
Molekülträgers bzw. der Bakterien einher.
Bei dem MACS-Sortierverfahren wird die Bindung der relevanten Zellen an
magnetische Beads ausgenutzt. Im Separationsschritt werden die in dieser Weise
markierten Zellen in der MACS-Säule durch ein inhomogenes Magnetfeld zurück
gehalten, während die nichtmarkierten Zellen ungehindert die Säule passieren.
Hierbei kann jedoch nur zwischen magnetischen und nichtmagnetischen Zellen
unterschieden werden. Damit erlaubt der MACS eine schnelle Bearbeitung großer
Populationen, doch lassen sich keine Informationen über individuelle Bindungs
ereignisse gewinnen.
Die Separation von Beads in der kombinatorischen Chemie wird üblicherweise in
einem manuellen Prozeß durchgeführt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zu entwickeln, mit dem
aus einer großen Anzahl (109) von Molekülen aus einer Molekülbibliothek
einzelne Objekte innerhalb von 24 h detektiert und separiert werden, die durch
ihre speziellen Bindungsaffinitäten an einen oder mehrere vorgegebene Liganden
gekennzeichnet sind. Für die anschließende Vermehrung (Amplifikation) von
Bakterien im Rahmen der AME, soll die Vitalität der Bakterienpopulation erhalten
bleiben.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemaß durch ein Verfahren mit folgenden Schritten
gelöst:
- a) Die zu bindenden Liganden werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und mit der in Form einer Suspension vorliegenden Molekül bibliothek gemischt.
- b) Die überschüssigen, nicht an Moleküle der Molekülbibliothek gebundenen Liganden werden danach ausgewaschen und entfernt.
- c) Diese Mischung wird auf ein zweidimensionales Substrat ausplattiert.
- d) Das so beschichtete Substrat wird in ein Fluoreszenzmikroskop gebracht. Anschließend werden die auf dem Substrat beobachteten örtlichen Fluoreszenzintensitäten elektrooptisch erfaßt und mit Hilfe einer CCD- Kamera als Gesamtbild oder schrittweise in Form von Teilbildern digital erfaßt und nach vorgegebenen Selektionskriterien in Form von Schwell werten elektronisch diskriminiert, wobei die auf dem Substrat befindlichen, durch eine hohe Bindungsaffinität der Liganden an Moleküle der Molekülbibliothek gekennzeichneten und damit die Selektionskriterien er füllenden Objekte erkannt und durch Abspeicherung in einem Bildrechner lokalisiert werden.
- e) Die so selektierten Objekte werden dann sequentiell durch eine vom Bildrechner koordinatengesteuerte, relative Verschiebung zwischen dem Substrat und einem Separationsaktor in den Arbeitspunkt des Separations aktors positioniert, vom Substrat entnommen und örtlich getrennt abgelegt.
Der verfahrensgemäßen Identifikation und Separation von Molekülen aus einer
Biomolekül-Bibliothek geht voraus, daß diese Moleküle in ausreichender Anzahl
auf der Oberfläche einer geeigneten biologischen Zelle dargestellt werden. Hierzu
wird die genetische Information für ein Biomolekül in eine große Population von
Mikroorganismen eingeschleust, welche daraufhin das Biomolekül synthetisieren.
Die Verfahren, welche diese Steuerung eines Mikroorganismus zur biochemischen
Synthese beinhalten, werden unter dem Begriff Expressions-Systeme zusammenge
faßt. Die Vielfalt der Bibliothek entsteht durch Mutantenvielfalt der eingeschleu
sten Information. Dabei können Komplexitäten < 109 erzeugt werden.
Vorteilhaft erfolgt die elektrooptische Erfassung der örtlichen Fluoreszenz
intensitäten auf dem Substrat mit Hilfe einer CCD-Kamera in Form eines
Gesamtbildes oder schrittweise in Form von Teilbildern. Das Gesamtbild oder die
Teilbilder werden dann, gegebenenfalls nach einer Datenreduktion, dem Bild
rechner zur Abspeicherung und zur bildanalytischen Weiterverarbeitung und Aus
wertung nach den vorgegebenen Selektionskriterien zugeleitet.
Alternativ kann die elektrooptische Erfassung der örtlichen Fluoreszenzintensitäten
auf dem Substrat auch mit Hilfe eines Laser-Scanners erfolgen, dessen Ausgangs
signale nach den vorgegebenen Selektionskriterien elektronisch bewertet und in
Verbindung mit den zugehörigen Ortskoordinaten dem Bildrechner zugeführt
werden.
Vorzugsweise werden bei der Bereitstellung einer Biomolekülbibliothek als
bakterielles Expressionssystem E. coli Bakterien verwendet.
Besonders bevorzugt werden zur Bereitstellung einer Peptid- und/oder Protein
bibliothek als spezielles bakterielles Expressionssystem E. coli Bakterien verwen
det, die durch genetische Manipulation Variationen von LamB-Transmembran
proteinen exprimieren.
Neben einer optimierten Selektion und Separation von Molekülen aus einer
Bibliothek, die von Mikroorganismen gebildet werden, betrifft das Verfahren auch
die Selektion und Separation von Molekülen aus einer mittels chemischen
Methoden hergestellten Molekül-Bibliothek. In der kombinatorischen Chemie
werden Molekülbibliotheken an einer festen Phase mittels chemischer Methoden
(Reaktionen) erzeugt. Die Vielfalt der Bibliothek entsteht dabei durch die Nutzung
unterschiedlichster Reaktionen und Reagenzien. Diese Molekülbibliotheken werden
vorteilhaft auf polymeren Beads dargestellt. Vorzugsweise werden als polymere
Träger Kunststoffbeads auf Polystyrol- oder Polyacrylamidbasis mit einem Durch
messer von 50 µm bis 200 µm eingesetzt.
Um mehrere Liganden gleichzeitig untersuchen zu können, werden zweckmäßig
verschiedene Liganden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Für
die verschiedenen Liganden werden die Selektionskriterien in Form einer Liste mit
den Schwellwerten für die verschiedenfarbigen Fluoreszenzintensitäten vorge
geben.
Eine Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die
die Molekülbibliothek tragenden Proteine auf den Bakterien oder die Verbin
dungen aus der kombinatorischen Chemie auf den Polymerbeads mit einem weite
ren Fluoreszenzfarbstoff markiert werden und die Fluoreszenzintensität der Bin
dungsstellen als zusätzliches Selektionskriterium bei der Bildauswertung berück
sichtigt wird.
In diesem Fall kann das Verhältnis der für den Liganden charakteristischen
Fluoreszenzintensität und der für die Bindungsstelle charakteristischen Fluores
zenzintensität als ein für die Bindungsaffinität maßgebliches Selektionskriterium
bei der Bildauswertung benutzt werden.
Die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist ein
inverses Fluoreszenzmikroskop und einen Verschiebetisch zur Halterung eines
Trägers mit der ausplattierten Objektsuspension, sowie mindestens eine Lichtquelle
zur Fluoreszenzanregung auf und ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet,
- a) daß eine aus einer CCD-Kamera oder aus einem Laser-Scanner bestehende elektrooptische Abtasteinrichtung zur Erfassung der örtlichen Fluoreszenz intensitäten der auf dem Substrat ausplattierten Bakteriensuspension vorge sehen ist, die mit einem Bildrechner zur Weiterverarbeitung und Speiche rung der Fluoreszenzbildinformation verbunden ist,
- b) daß oberhalb des Verschiebetisches ein Separationsaktor zum Transfer der selektierten Objekte angeordnet ist,
- c) und daß der Bildrechner die Positionierung des Verschiebetisches relativ zum Separationsaktor steuert.
Der Separationsaktor besteht dabei vorteilhaft aus einer in einen Mikromanipulator
eingebauten, absenkbaren Mikrokapillare.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird dem Substrat das Fluoreszenz
anregungslicht über mindestens einen vom Mikroskop-Strahlengang getrennten
Lichtleiter zugeführt. Zu diesem Zweck sind zwei verschiedene, in denselben
Lichtleiter einkoppelbare Laser mit verschiedenen Wellenlängen zur Fluoreszenz
anregung vorgesehen.
Zur Vermeidung von Artefakten wird das Fluoreszenzmikroskop einschließlich der
Beleuchtungseinrichtung und der Mikrokapillare in eine Klimakammer eingebaut
wird, die durch einen wasserdampfgesättigten Luftstrom auf Temperaturen zwi
schen 1°C und 10°C gekühlt wird. Solche Artefakte können z. B. die Vermehrung
der Bakterien, Schrumpf des Agarosesubstrates und Temperaturschwankungen
sein.
Der Hauptvorteil des beschriebenen Verfahrens besteht in der Einzelquantifizie
rung und -selektion von Bindungskomplexen bei einem gleichzeitig hohen
Durchsatz der zu analysierenden Bindungsereignisse. Dies führt zu einer erheb
lichen Reduktion des Zeitaufwandes und der Kosten. Bei biologischen Objekten
wird zudem die Vitalität der selektierten Zellen gewahrt.
Im Rahmen grundlagenwissenschaftlicher Untersuchungen kann das Verfahren zur
Charakterisierung von Molekülbibliotheken eingesetzt werden. Für einen industriel
len Einsatz kommt die Leitstruktursuche für neuartige Pharmaka in Frage. Mit Hil
fe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bei Etablierung geeigneter Antikörperbi
bliotheken eine pharmakologische Individual-Therapie möglich, bei der ein maßge
schneidertes Medikament für den Einzelpatienten an einem Tag gefunden, isoliert
und vermehrt werden kann.
Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Zeichnungen und Ausführungs
beispielen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein planares Substrat mit der ausplattierten Bakteriensuspension,
Fig. 2 schematisch eine Selektionsapparatur auf der Basis einer CCD-Kamera,
Fig. 3 schematisch eine Selektionsapparatur auf der Basis eines Laser-Scanners,
Fig. 4 einen Separationsaktor zum Transfer (Trennung) der selektierten,
charakteristischen Objekte.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Selektions- und Separationsverfahrens
zur Selektion und Separation von Molekülen mit hoher Bindungsaffinität zu einem
Targetmolekül erfordert die Bereitstellung einer geeigneten Molekülbibliothek und
ein Targetmolekül, das im folgenden als Ligand bezeichnet wird. Dies wird
nachstehend am Beispiel einer Peptidbibliothek beschrieben. Für die Präsentation
dieser Biomolekül-Bibliothek werden hier E. coli Bakterien verwendet, die durch
genetische Manipulation Variationen von LamB-Transmembranproteinen exprimie
ren. Als Ligand wird der Acetylcholinrezeptor gewählt. Im Gegensatz zu der weit
verbreiteten Phagenmethode bietet das Bakteriensystem aufgrund der Vielzahl
gleichartiger Bindungsereignisse auf der Bakterienoberfläche den Vorteil, eine Ein
zelbetrachtung der Wechselwirkung zwischen peptidtragender Zelle und Rezeptor
vorzunehmen. Ein analoges Vorgehen mit Phagen scheidet aufgrund der geringen
Größe der Phagenpartikel aus.
Zu den peptidtragenden Bakterien werden Liganden gemischt, die mit einem
Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Hierzu wird beispielsweise der Farbstoff ®Cy5
der Firma Biological Detection Systems eingesetzt, der bei 650 nm angeregt wird
und bei 670 nm emittiert. Aufgrund der langwelligen Anregung kann das
Fluoreszenzsignal weitgehend frei von Autofluoreszenz detektiert werden. Da die
Anzahl der Peptide auf der Bakterienoberfläche nicht konstant ist, wird ein
Molekülabschnitt, der bei sämtlichen Peptiden auf allen Bakterien gleich ist,
spezifisch mit einem weiteren Farbstoff markiert, um mit dessen Fluoreszenzsignal
ein Maß für die Anzahl der Bindestellen zu erhalten. Aus dem Verhältnis der
beiden Fluoreszenzintensitäten kann ein Maß für die Bindungsaffinität des
Komplexes angegeben werden. Als zweiter Fluoreszenzfarbstoff wird ®FITC der
Firma Molecular Probes eingesetzt, das bei 490 nm angeregt wird und bei 520 nm
emittiert. Mit diesen spektralen Charakteristiken werden die beiden Fluoreszenz
signale ohne gegenseitige Beeinflussung gemessen.
Nach dem Mischen des farbstoffmarkierten Liganden mit der Bakteriensuspension
(Inkubation) werden die Bakterien durch Abzentrifugieren und anschließendes
Dispergieren in reiner Pufferlösung gewaschen. Damit verbleiben in der Bakterien
dispersion nur noch Fluoreszenzfarbstoffe zurück, die sich ausschließlich auf der
Oberfläche der Bakterien befinden.
Diese Bakteriendispersion 1 wird sodann auf eine auf einem planaren Substrat 2
befindlichen Agaroseoberfläche mit einem Spatel ausplattiert (s. Fig. 1). Die
Agaroseoberfläche ist in der Weise geteilt, daß sich im Randbereich jeweils
getrennte Zonen 3 befinden, auf denen später die separierten Bakterien zu liegen
kommen. Diese Agaroseoberflächen 3, die im Gegensatz zum Substrat Nährstoffe
enthalten, lassen sich von dem Substrat 2 durch Abheben trennen. Zur anschließenden
effizienten Vermessung der Fluoreszenzintensitäten der auf dem
Substrat planar ausgebrachten Bakterien wird eine Flächenbelegungsdichte von
10% angestrebt. Bei einer Population von 109 Spezies ergibt sich daraus eine
Gesamtfläche von 250 cm2.
Fig. 2 zeigt schematisch den Aufbau der gesamten Selektionsmaschine. Die ver
fahrenstechnischen Aufgaben liegen in der Aufnahme von Fluoreszenzaufnahmen
und der anschließenden Separation von Bakterien, die sich durch vorgegebene,
spezifische Bindungseigenschaften auszeichnen. Während der Messung sollen
Artefakte wie z. B. die Bakterienvermehrung ausgeschlossen werden. Dies wird
durch eine Klimakammer 4 bewerkstelligt, die von einem wasserdampfgesättigten
Luftstrom bei 4°C gekühlt wird. Der Kern der Maschine besteht aus einem
inversen Mikroskop 5. Zu dem Mikroskop gehören das Abbildungsobjektiv 6, der
Beleuchtungskondensor 7, sowie der Verschiebetisch 8, auf dem das Substrat 2
gehaltert wird. Als Lichtquelle für die Fluoreszenzspektroskopie wird ein
Lasermodul 9 eingesetzt, das aus zwei Lasern und einer optischen Anordnung
besteht, die die zwei Laserstrahlen über elektronische Verschlüsse alternierend in
einen Lichtwellenleiter 10 mit einen Kerndurchmesser von 200 µm einkoppelt. Zur
Anregung des Ligandenfluorophors kommt ein Kr-Ionengaslaser zum Einsatz, der
bei einer Wellenlänge von 647 nm mit einer Leistung von 500 mW betrieben
wird. Die zweite Lichtquelle für die Anregung des zweiten Fluorophors an der
Bindungsstelle auf der Bakterie ist ein Ar-Ionengaslaser, der auf eine Emission bei
488 nm und einer vergleichbaren Leistung eingestellt wird. Am Ende der Faser ist
eine Mikrooptik 11 angebracht, die auf der Probe einen Leuchtfleck von 1.5 mm
Durchmesser erzeugt. Die externe Laseranregung vermeidet Streulicht und Hinter
grundfluoreszenz im Abbildungsobjektiv 6. Die hohe Laserintensität erlaubt Be
lichtungszeiten pro Aufnahme im Bereich von 0.1 bis 1 s. Das von dem Substrat 2
emittierte Fluoreszenzlicht wird von einer gekühlten CCD-Kamera 12 detektiert.
Die Pixelanzahl dieses Fluoreszenzbildes beträgt 1000*1018, so daß bei einer 10-fachen
Mikroskopvergrößerung mit einer Auflösung von 1.2 µm gerechnet werden
kann. Dieser Wert ist auf die Bakteriengröße abgestimmt, die in diesem Bereich
liegt. Vor der Kamera 12 befindet sich ein auf die beiden Fluorophore abge
stimmtes Emissionsfilter. Über eine hier nicht dargestellte Einrichtung wird die
Fokusposition des Objektivs 6 motorisch nachgeregelt. Eine Vorrichtung zu dieser
Nachfokussierung, die mit einem Rückreflex einer Oberfläche arbeitet, ist z. B. in
(G. Bouwhuis et al., p. 75ff, A. Hilger Ltd. (UK(USA), 1985)) beschrieben.
Zur effektiven Bildauswertung wird noch auf der Ebene des Frame Grabber
Boards der CCD-Kamera eine Datenreduktion vorgenommen. Die Software ist
hierbei auf die Detektion erwartungsgemäß seltener Bindungsereignisse ausgelegt.
Unter Zuhilfenahme von Look up Tables (LUT) wird zunächst geprüft, ob auf der
Fluoreszenzaufnahme der markierten Liganden Fluoreszenzsignale oberhalb einer
gewählten Schwelle S1 liegen. Bei einem positiven Bescheid wird die zweite
Fluoreszenzaufnahme des Bindungsstellenfluorophors vorgenommen. Nach Berech
nung des Quotienten aus den beiden Signalen werden nur die Pixelkoordinaten
samt Quotient auf dem Bildrechner abgespeichert, bei denen diese Quotienten
oberhalb einer gewählten Schwelle S2 liegen. Hierzu werden auf dem Frame
Grabber Board die Zeilen ermittelt, die signifikante Pixel enthalten. Im zweiten
Schritt werden diese Zeilen auf den Bildrechner transferiert und dort nach den
signifikanten Pixeln abgesucht. Alternativ kann aber auch die gesamte bild
analytische Auswertung des Ligandenbildes nach den vorgegebenen Selektions
kriterien, d. h. die Erkennung und Lokalisierung der auf dem Substrat 2 be
findlichen, durch eine hohe Bindungsaffinität der Liganden an die Moleküle der
Molekülbibliothek gekennzeichneten Objekte, allein im Bildrechner erfolgen.
Unter "hoher Bindungsaffinität" wird dabei verstanden, daß die Fluoreszenz
intensitäten dieser Objekte die Selektionskriterien hinsichtlich des oben erwähnten
Schwellwertes S2 erfüllen.
Dem gesamten Prozeß der Fluoreszenzaufnahmen liegt die folgende Zeitbetrach
tung zu Grunde. Bei einer 10-fachen Vergrößerung erfaßt die CCD-Kamera ein
Bildfenster von 1.2*1.2 mm. Mit dem Flächenbedarf für alle Bakterien von
2.5*104 mm2 müssen 17 400 Rahmen abgearbeitet werden. Pro Rahmen wird für
die Auswertung einer Doppelfluoreszenz eine Zykluszeit von 4.1 s abgeschätzt, die
eine jeweilige Belichtungszeit von 1 s einschließt. Die Zeit für die Bewegung des
Verschiebetisches ist hierbei berücksichtigt. Dies führt zu einer Gesamtzeit für den
kompletten Belichtungsvorgang von 20 h bzw. zu einem Bearbeitungsdurchsatz
von 109 pro Tag und entspricht damit der Vorgabe.
Alternativ zur Detektion fluoreszierender Objekte mit Hilfe einer simultanen
Fluoreszenzanregung des gesamten Mikroskopgesichtsfeldes und der parallelen
Detektion des Fluoreszenzbildes mit einer CCD Kamera kann auch eine
punktweise abrasternde Fluoreszenzanregung mit einer Laser-Scan-Einrichtung
gewählt werden. Ein derartiger Aufbau ist schematisch in Fig. 3 dargestellt. Der
von einem Ar-Kr-Laser 13 mit einer Ausgangsleistung von 20 mW erzeugte
Laserstrahl 14 wird über eine Monomode-Lichtleitfaser 15 in ein Optikmodul 16
eingekoppelt. In diesem Modul 16 wird der anregende Laserstrahl über einen
dichroitischen Strahlteiler 17 auf einen x-y-Spiegel 18 geführt. Der computer
gesteuerte Spiegel 18 lenkt den Laserstrahl in der Weise ab, daß der über das
Objektiv 6 zu einem Punkt fokussierte Laserstrahl die Probenebene in x-y-
Richtung abrastert. Die Ortskoordinaten eines fluoreszierenden Objekts werden
hierbei über die Steuerparameter des Ablenkspiegels gespeichert. Hierbei sind
diese Parameter in eindeutiger Weise mit dem x-y-Ort des Laserstrahls auf der
Probenoberfläche verknüpft. Diese Zuordnung wird in handelsüblichen Scannern
ausgenutzt (z. B. Leica TCS4D Scanner, Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg,
Deutschland). Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht gelangt über das
Objektiv 6 und den Ablenkspiegel 18 auf den Strahlteiler 17 und wird hier im
Gegensatz zum Anregungsstrahl transmittiert. Das Fluoreszenzlicht wird hinter
dem Strahlteiler 17 in einem Detektionsmodul 19 nachgewiesen. Dieses Modul be
steht aus einem Pinhole (Lochblende), mit dem Fluoreszenzlicht außerhalb der
Fokusebene unterdrückt werden kann, zwei Photomultipliern für die zwei
Fluoreszenzemissionen von FITC und Cy5 und den entsprechenden chromatischen
Filtern. Während des Scanprozesses werden die Fluoreszenzintensitäten der
markierten Liganden und auch des Bindungsstellenfluorophors simultan gemessen
und durcheinander dividiert, so daß keine separate zweite Fluoreszenzaufnahme
erforderlich ist. Damit kann der Quotient anhand eines Schwellwertes S2 online
diskriminiert werden kann und nur die Koordinaten und Intensitäten der Pixel
stehen nach erfolgtem Scan im Arbeitsspeicher des Steuer- bzw. Auswerterechners,
deren Intensitäten oberhalb der gesetzten Schwelle S2 liegen. Alternativ dazu kann
jedoch auch das gesamte Bild auf dem Auswerterechner einer Bearbeitung nach
erfolgtem Scanprozeß unterzogen werden, um gegebenenfalls nachträglich mit
verschiedenen Schwellwerten zu diskriminieren.
Bei einer Scanfläche von 2.5*104 mm2, einer Gesichtsfeldgröße von 1 mm2,
einer Scandauer von 1.1 s (Zeiss-LSM) pro Gesichtsfeld ergibt sich unter
Berücksichtigung der Verschiebung des Probentisches eine Gesamtzeit von 11 h
für die komplette Fluoreszenzanalyse.
Nach dem kompletten Scanvorgang der CCD-Kamera oder des Laser-Scanners
liegt im Speicher des Bildrechners eine Liste der Ortskoordinaten von Bakterien
mit spezifischen Bindungseigenschaften vor, mit deren Hilfe die Separation der
Bakterien vorgenommen wird. Gegebenenfalls kann die Anzahl der zu separie
renden Bakterien anhand der Liste eingeschränkt werden.
Nachdem das Screening abgeschlossen ist und die Ortskoordinaten der zu
separierenden Bakterien bekannt sind, müssen diese mit einem geeignetem
Separationsaktor von dem Substrat entfernt und auf einem Zielsubstrat abgelegt
werden. Zu diesem Zweck wird ein auf einer Mikrokapillare 20 beruhender
Separationsaktor eingesetzt. Derartige Separationsaktoren sind prinzipiell aus der
Patch Clamp Technik bekannt.
In Fig. 4 ist die Apparatur für den Transferprozeß schematisch dargestellt. Die mit
Hilfe eines Mikromanipulators 21 verfahrbare Mikrokapillare 20 wird nun ent
sprechend der im Bildrechner vorliegenden Koordinatenliste nacheinander zu den
zu selektierenden Bakterien gebracht und exakt oberhalb davon positioniert. Der
Bildrechner fungiert also als Steuerrechner für den Mikromanipulator 21 zum
Aufsuchen und zur Positionierung der Mikrokapillare 20 am Ort der ausgewählten
Bakterien. Sodann wird die ausgewählte Bakterie mit der Mikrokapillare 20 von
der Substratoberfläche abgesaugt und auf einem Zielsubstrat wieder ausgebracht.
Als Zielsubstrat dienen hier die Randzonen 3 auf dem Substrat 2, die mit Agar- bzw.
Agaroseoberflächen präpariert sind. Der Durchmesser der Mikrokapillare
wird aufgrund der angestrebten Manipulation einzelner Bakterien bei einer hohen
Belegungsdichte an die Größe der Objekte angepaßt und hat demgemäß einen
Durchmesser zwischen 2 und 20 µm.
Für den Transfer der Bakterien werden vorzugsweise Mikrokapillaren aus einem
Spezialglas verwendet, die durch einen Ziehprozeß im geschmolzenen Zustand
hergestellt werden. Für die zu beschreibenden Experimente werden Borosilikat
glasröhrchen (Fa. Hilgenberg, Malsfeld, GER) mit einem Ausgangsdurchmesser
von 1.6 mm eingesetzt. In einem dreistufigen Ziehprozeß mit einem handelsübli
chen Pipettenziehgerät (DMZ Universalpuller, Fa. Zeitz-Instrumente, München,
GER) werden Kapillaren mit einer zylindrischen Pipettenform (d. h. nicht zu einer
Spitze ausgezogen) mit einem Öffnungsdurchmesser von ca. 6 µm an dem auf
geschmolzenen Ende hergestellt. Auf der anderen Seite bleibt der Ausgangsdurch
messer unverändert erhalten. Für die Reproduzierbarkeit des Transferprozesses
insbesondere des Ausspülprozesses hat sich diese Pipettenform bewährt.
Wie aus Fig. 4 ersichtlich, wird die Mikrokapillare 20 in einer Spannzange 22
gehaltert, die an dem Mikromanipulator 21 montiert ist, der dreidimensional im
µm-Bereich positioniert werden kann und dessen Bewegung vom Bildrechner
gesteuert wird. Solche Manipulatoren sind kommerziell erhältlich. Die Mikro
kapillare ist über einen Schlauch 23 mit einer Spritze 24 verbunden, mit deren
Hilfe der Kapillareninnendruck eingestellt wird. Der Druck wird über einen
Dreiwegehahn 25 mit einem Druckmesser 26 bestimmt. Sowohl der Mikro
manipulator 21 als auch die Spritze 24 werden mit Schrittmotoren, die hier nicht
dargestellt sind, mit Hilfe des Bildrechners fernbedient.
Im folgenden wird der Separationsvorgang als interaktiver Prozeß beschrieben. Er
kann aber auch computergesteuert vollautomatisch ablaufen.
Der gesamte Vorgang des Ansaugens und der Separation einer Bakterie
(Pickvorgang) unterliegt der visuellen Kontrolle, die durch die Beobachtung mit
einer 40-fachen Vergrößerung im Phasenkontrast ermöglicht wird. Von dem
Mikroskop sind hier nur das Objektiv 6 und der Beleuchtungskondensor 7
dargestellt. Im Hinblick auf den erforderlichen Arbeitsabstands des Kondensors 7
von ca. 22 mm zum Objekt werden die Mikrokapillaren 20 über den Er
weichungspunkt erhitzt und in der Weise umgebogen, das sie nahezu einen 90°
Winkel bilden und damit platzsparend unterhalb des Kondensors positioniert
werden können. Auf diese Weise kann die Beobachtung des Transferprozesses
ungestört stattfinden. Für die hohe räumliche Auflösung des Transferprozesses in
der Größe des Pipettendurchmessers (hier 6 µm) ist es entscheidend, daß die
Pipette senkrecht auf das zu pickende Objekt trifft. Damit bildet sich kein
Wasserfilm zwischen Kapillarenwand und Agarsubstrat, der umliegende Objekte
beim Transferprozeß in Mitleidenschaft ziehen könnte. Zur Vorbereitung des
Pickens wird über einen Unterdruck aus einem Vorratsgefäß eine Pufferlösung in
die Kapillare 20 eingesogen. Hierbei reicht es aus, daß nur der verjüngte Teil der
Kapillare mit der Pufferlösung gefüllt ist.
Nun wird das zu pickende Objekt bzw. die von dem Substrat 2 zu separierende
Bakterie 27 durch die vom Bildrechner koordinatengesteuerte Bewegung des
Mikroskopverschiebetisches 8 unterhalb der Kapillare 20 positioniert. Hierbei wird
der Kapillareninnendruck auf -300 mbar gegenüber Umgebungsdruck eingestellt.
Bei gleichzeitiger Mikroskopbeobachtung wird die Kapillare 20 direkt über der zu
pickenden Bakterie 27 auf das Agarosesubstrat 2 aufgesetzt. Anschließend wird
die Mikrokapillare 20 über die Höhenverstellung am Mikromanipulator angehoben
und als Resultat bleibt im Mikroskopbild die leere Substratfläche zurück. Zum
Ausspülen der Bakterie 27 wird entweder die Mikrokapillare 20 oder der
Verschiebetisch 8 zu einer entsprechenden Stelle auf dem Zielsubstrat gefahren.
Hierbei wird der Innendruck auf +100 mbar erhöht. Während die Kapillare auf
das Zielsubstrat (hier die Randzone 3 auf dem Substrat 2) aufgesetzt wird, findet
der Ausspülprozeß statt. Nachdem die Kapillare 20 wiederum von dem
Zielsubstrat 3 abgehoben wurde, wird die ausgespülte Bakterie im Phasenkon
trastbild des Mikroskops erneut sichtbar.
In vier Ausführungsbeispielen wurden jeweils 10 Bakterien von einem Aus
gangssubstrat auf ein Zielsubstrat, das Nährstoff enthielt, übertragen. Nach einer
Anwachszeit von einigen Tagen bildeten sich in 50 bis 60% der Fälle aus den
einzelnen Bakterien Kolonien. In einem Test der Vitalitätsrate der Ausgangs
population wurde ein Wert von 60% bestimmt, so daß hiermit der Transferprozeß
als sehr schonend angesehen werden kann. Alternativ können die Bakterien in eine
Flüssigkeit z. B. PBS-Puffer ausgebracht werden. Diese Flüssigkeit kann sich in
den Vertiefungen (Wells) von handelsüblichen 96- oder 384-Mikrotiterplatten
befinden.
Neben dem unmittelbar nacheinander stattfindenden Pick- und Ausspülprozeß
wurden auch mehrere Bakterien hintereinander gepickt und entsprechend
hintereinander ausgespült. Diese Prozedur ist vergleichsweise zeitsparend, da die
Wege zwischen den zu sortierenden Objekten optimiert werden können und auch
die Druckeinstellung in der Kapillare jeweils nur einmal vorgenommen werden
muß. Der Vorteil in der Verwendung von Bakterien besteht in der einfachen
Amplifizierung durch reguläres Anwachsen. Darüber hinaus können mit Hilfe der
Polymerase Chain Reaction (PCR) können aus einzeln sortierten Bakterien die
Gensequenzen amplifiziert werden, die für die spezifische Eigenschaft der
Bakterien verantwortlich sind.
Im folgenden wird der gesamte Selektions- und Separationsprozeß noch einmal im
Überblick beschrieben. Der erste Schritt besteht in der Probenpräparation. Zu der
Bakteriendispersion werden fluoreszenzmarkierte Liganden gemischt. Nach diesem
Inkubationsschritt werden die Bakterien durch Abzentrifugieren mit einer
Pufferlösung gewaschen. Diese Bakteriendispersion wird auf einem planaren
Agarosesubstrat 2 ausgebracht. Das Substrat 2 wird auf den Verschiebetisch 8 des
inversen Mikroskops 5 gebracht. Der zweite Schritt des Selektionsvorgangs besteht
nun in der Durchführung der Fluoreszenzaufnahmen. Zu Beginn wird der
Verschiebetisch 8 derart positioniert, daß die linke obere Ecke des abzurasternden
Probenbereiches im Bildbereich des Mikroskops zu liegen kommt. Die anschlie
ßenden Tischverschiebungen folgen einem Mäander, der die gesamte Probenfläche
abdeckt. Für die Fluoreszenzaufnahme wird der Laserstrahl mit einem Verschluß
zur Anregung der Ligandenfluoreszenz freigegeben und in die Lichtleitfaser 10
eingekoppelt, um die Probe zu bestrahlen. Anschließend wird der Aufnahmemodus
der CCD-Kamera 12 gestartet. Nach Ablauf der Belichtungszeit wird der
Verschluß des Lasermoduls 9 geschlossen. Auf dem Frame Grabber Board der
CCD-Kamera 12 wird das Fluoreszenzbild nach Pixeln oberhalb der gewählten
Schwelle S1 abgesucht. Falls keine Pixel gefunden werden, wird der Tisch an die
nächste Position gefahren und der Bildaufnahmeprozeß wiederholt sich in der
beschriebenen Weise. Werden bei der Analyse Pixel oberhalb der Schwelle
detektiert, so wird eine weitere Fluoreszenzaufnahme des Bindestellenfluorophors
bei der gleichen Tischposition ausgeführt. Hierzu wird der Verschluß des
Lasermoduls 9 für den zweiten Laser geöffnet und die Bildaufnahme der CCD-
Kamera 12 gestartet. Nach Abschluß der Bildaufnahme wird der Verschluß wieder
geschlossen. Wiederum auf der Ebene des Frame Grabber Boards wird der Quo
tient aus dem Bild der Ligandenfluoreszenz und dem Bild der Bindestellen
fluoreszenz gebildet. Aus dem Quotientenbild werden nun diejenigen Pixel
detektiert, die oberhalb der Schwelle S2 liegen. Die Pixelkoordinaten sowie die
zugehörigen Quotientenwerte werden im Bildrechner bestimmt, der diese
Informationen in einem Datenfile ablegt. Nach Abschluß dieser Softwareanalyse
wird die nächste Tischposition angefahren und der Abrasterungsprozeß wiederholt
sich zyklisch so lange, bis die gesamte Probe fluoreszenzspektroskopisch
charakterisiert ist.
Ist der Abrasterungsprozeß abgeschlossen, so erfolgt nun mit der Bakterien
separation der dritte Schritt. Hierzu wird anhand der im Bildrechner gespeicherten
Pickliste der Verschiebetisch sukzessive zu den Bakterien gefahren, die separiert
werden sollen. Sodann wird die Mikrokapillare 20 wird auf die selektierte Bakterie
27 abgesenkt und mit Unterdruck eingesogen. Nachdem die Kapillare 20 wieder
von dem Substrat 2 abgehoben worden ist, fährt der Verschiebetisch 8 zu den
freigehaltenen Zielsubstratflächen 3, wo die Bakterie 27 abgesetzt wird. Dazu wird
die Kapillare 20 auf das Substrat 3 abgesenkt und die Bakterie 27 wird durch den
eingestellten Überdruck in der Kapillare 20 ausgespült. Dieser Prozeß wiederholt
sich so lange, bis die gesamte Pickliste abgearbeitet ist. Im Bildrechner sind die
Positionen der ausgebrachten Bakterien erfaßt, so daß eine spätere Zuordnung
gewährleistet ist. Nach Abschluß der Bakterientransfers wird das Zielsubstrat 3 mit
den separierten Bakterien vom Verschiebetisch 8 abgenommen und zur Kultivie
rung der Bakterien in einen Brutschrank gelegt.
In Analogie zum oben beschriebenen Ausführungsbeispiel aus dem Gebiet der
molekularen Evolution kann eine Separation von Bindungsereignissen aus
Bibliotheken der kombinatorischen Chemie, die sich auf Polymerbeads befinden,
durchgeführt werden. Die Polymerbeads durchlaufen einen mehrstufigen chemi
schen Syntheseprozeß, der zu einer Molekülbibliothek führt. Diese ist dadurch ge
kennzeichnet, daß auf der jeweiligen Beadoberfläche eine Vielzahl gleichartiger
Moleküle ausgeprägt ist, während die Molekülsorten auf unterschiedlichen Beads
paarweise verschieden sind. Die Beadsuspension wird wie die Bakteriensuspension
mit einem farbstoffmarkierten Liganden gemischt und anschließend gewaschen.
Für die Farbstoffmarkierung wird hier vorteilhaft ein langwelliger Farbstoff wie
etwa Cy5 eingesetzt, um die Hintergrundfluoresenz der Beads zu reduzieren.
Anschließend werden die Beads auf eine Agarosefläche aufgebracht und fluores
zenzspektroskopisch in der oben beschriebenen Weise analysiert. Für den Separa
tionsprozeß einzelner Beads wird als Separationsaktor ebenfalls eine Glaskapillare
eingesetzt, deren Öffnungsdurchmesser nun aber den Dimensionen der Beads mit
einem Durchmesser von ca. 100 µm angepaßt ist. Der Separationsprozeß wird
ebenfalls durch Ansaugen einzelner Beads und anschließendem Ausspülen auf
einem räumlich getrennten Substrat bewerkstelligt.
Claims (15)
1. Verfahren zum Screening von Molekülen aus Molekülbibliotheken bezüg
lich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorge
gebenen Ligand und zur Einzelselektion hochaffiner Spezies, dadurch ge
kennzeichnet,
- a) daß die zu bindenden Liganden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden und mit der in Form einer Suspension vorliegenden Molekülbibliothek gemischt werden,
- b) daß die überschüssigen, nicht an Moleküle der Molekülbibliothek gebundenen Liganden ausgewaschen und entfernt werden,
- c) daß diese Mischung auf ein zweidimensionales Substrat (2) aus plattiert wird,
- d) daß das beschichtete Substrat (2) in ein Fluoreszenzmikroskop (5) gebracht wird und die örtlichen Fluoreszenzintensitäten auf dem Substrat (2) elektrooptisch erfaßt und nach vorgegebenen Selek tionskriterien in Form von Schwellwerten elektronisch diskriminiert werden, wobei die auf dem Substrat (2) befindlichen, durch eine hohe Bindungsaffinität der Liganden an Moleküle der Molekül bibliothek gekennzeichneten und damit die Selektionskriterien er füllenden Objekte erkannt und durch Abspeicherung in einem Bild rechner lokalisiert werden,
- e) daß diese Objekte sequentiell durch eine vom Bildrechner koordina tengesteuerte, relative Verschiebung zwischen dem Substrat (2) und einem Separationsaktor (20, 21) in den Arbeitspunkt des Separa tionsaktors (20, 21) positioniert und durch den Separationsaktor (20, 21) vom Substrat (2) entnommen und örtlich getrennt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die elektro
optische Erfassung der örtlichen Fluoreszenzintensitäten auf dem Substrat
(2) mit Hilfe einer CCD-Kamera (12) als Gesamtbild oder schrittweise in
Form von Teilbildern erfolgt und das Gesamtbild oder die Teilbilder,
gegebenenfalls nach einer Datenreduktion, dem Bildrechner zur Abspeiche
rung und zur bildanalytischen Weiterverarbeitung und Auswertung nach
den vorgegebenen Selektionskriterien zugeleitet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die elektro
optische Erfassung der örtlichen Fluoreszenzintensitäten auf dem Substrat
(2) mit Hilfe eines Laser-Scanners (13, 15, 16) erfolgt, dessen Ausgangs
signale nach den vorgegebenen Selektionskriterien elektronisch bewertet
und in Verbindung mit den zugehörigen Ortskoordinaten dem Bildrechner
zugeführt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bereit
stellung einer Molekülbibliothek als bakterielles Expressionssystem E. coli
Bakterien verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß zur Bereitstellung
einer Peptid- und/oder Proteinbibliothek als spezielles bakterielles Expres
sionssystem E. coli Bakterien verwendet werden, die durch genetische
Manipulation Variationen von LamB-Transmembranproteine exprimieren.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Her
stellung einer Molekülbibliothek Methoden der kombinatorischen Chemie
verwendet werden und demzufolge die Molekülbibliotheken auf polymeren
Beads dargestellt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß verschie
dene Liganden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert
werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für die ver
schiedenen Liganden als Selektionskriterien eine Liste von Schwellwerten
für die Fluoreszenzintensitäten vorgegeben wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die die
Molekülbibliothek tragenden Proteine auf den Bakterien oder Verbindungen
aus der kombinatorischen Chemie auf Polymerbeads mit einem weiteren
Fluoreszenzfarbstoff markiert werden und die Fluoreszenzintensität der
Bindungsstellen als zusätzliches Selektionskriterium bei der Bildauswertung
berücksichtigt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis
aus der für den Liganden charakteristischen Fluoreszenzintensität und der
für die Bindungsstelle charakteristischen Fluoreszenzintensität als ein für
die Bindungsaffinität maßgebliches Selektionskriterium bei der Bildauswer
tung berücksichtigt wird.
11. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 8,
ausgehend von einem inversen Fluoreszenzmikroskop (5) und einem Ver
schiebetisch (8) zur Halterung eines Trägers (2) mit der ausplattierten
Objektsuspension, sowie mindestens einer Lichtquelle (9) zur Fluoreszenz
anregung dadurch gekennzeichnet,
- a) daß eine aus einer CCD-Kamera (12) oder aus einem Laser-Scanner (13, 15, 16) bestehende elektrooptische Abtasteinrichtung zur Erfas sung der örtlichen Fluoreszenzintensitäten der ausplattierten Bakteriensuspension vorgesehen ist, die mit einem Bildrechner zur Weiterverarbeitung und Speicherung der Fluoreszenzbildinformation verbunden ist,
- b) daß oberhalb des Verschiebetisches (8) ein Separationsaktor (20, 21) zum Transfer der selektierten Objekte angeordnet ist
- c) und daß der Bildrechner die Positionierung des Verschiebetisches (8) relativ zum Separationsaktor (20, 21) steuert.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Separa
tionsaktor (20, 21) aus einer mit einem Mikromanipulator (21) verbundenen,
absenkbaren Mikrokapillare (20) besteht.
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß dem
Substrat (2) das Fluoreszenzanregungslicht über mindestens einen vom
Mikroskop-Strahlengang getrennten Lichtleiter (10) zugeführt wird.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zwei ver
schiedenene, in denselben Lichtleiter (10) einkoppelbare Laser mit ver
schiedenen Wellenlängen zur Fluoreszenzanregung vorgesehen sind.
15. Vorrichtung nach Anspruch 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fluoreszenzmikroskop (5) einschließlich der Beleuchtungseinrichtung (7)
und der Mikrokapillare (13) in eine Klimakammer (4) eingebaut ist, die
durch einen wasserdampfgesättigten Luftstrom auf Temperaturen zwischen
1°C und 10°C gekühlt wird.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19629141A DE19629141A1 (de) | 1996-07-19 | 1996-07-19 | Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand |
EP97111453A EP0819930A3 (de) | 1996-07-19 | 1997-07-07 | Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand |
US08/891,778 US6713264B2 (en) | 1996-07-19 | 1997-07-14 | Process and device for the screening of molecules with regard to their individual binding behaviour towards at least one given ligand |
JP9203966A JPH1078434A (ja) | 1996-07-19 | 1997-07-15 | 少なくとも一つの与えられたリガンドに対する個々の結合特性に関する分子のスクリーニングのための方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19629141A DE19629141A1 (de) | 1996-07-19 | 1996-07-19 | Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19629141A1 true DE19629141A1 (de) | 1998-04-16 |
Family
ID=7800266
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19629141A Withdrawn DE19629141A1 (de) | 1996-07-19 | 1996-07-19 | Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6713264B2 (de) |
EP (1) | EP0819930A3 (de) |
JP (1) | JPH1078434A (de) |
DE (1) | DE19629141A1 (de) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10145226A1 (de) * | 2001-09-13 | 2003-04-10 | Lifebits Ag | Herstellung von trägergebundenen Molekülen |
DE10210831A1 (de) * | 2002-03-12 | 2003-11-06 | Zeiss Carl | Optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem |
DE202005000844U1 (de) * | 2005-01-18 | 2005-04-14 | Passow, Harald | Versuchsanordnung zur Untersuchung der Wirkung von medizintechnischen Laserinstrumenten auf biologische Präparate |
DE10346130A1 (de) * | 2003-10-01 | 2005-06-02 | Leclerc, Norbert, Dr. | Mikrodissektion/Verfahren zum Isolieren von kleinen Ausschnitten |
DE102004051508A1 (de) * | 2003-10-21 | 2005-06-16 | Leica Microsystems Wetzlar Gmbh | Verfahren zur automatischen Erzeugung von Laser-Schnittlinien in der Laser-Mikrodissektion |
DE102004023262A1 (de) * | 2004-05-11 | 2005-12-08 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Ag | Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels Laserbestrahlung und Steuersystem |
DE102005026540A1 (de) * | 2005-06-08 | 2006-12-14 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Handhabung von Objekten |
US7576912B2 (en) | 2004-05-07 | 2009-08-18 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Gmbh | Microscope table and insert |
US9217694B2 (en) | 2003-10-21 | 2015-12-22 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Method for automatically generating laser cutting lines in laser microdissection processes |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999040536A1 (en) * | 1998-02-10 | 1999-08-12 | Ey Laboratories, Inc. | Reflectometry system with compensation for specimen holder topography and with lock-rejection of system noise |
EP1153282A2 (de) * | 1998-12-14 | 2001-11-14 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Verfahren und vorrichtungen zur erfassung optischer eigenschaften, insbesondere von lumineszenz-reaktionen und brechungsverhalten, von auf einem träger direkt oder indirekt gebundenen molekülen |
DE19945351C2 (de) | 1999-09-22 | 2002-04-18 | Lohmann Therapie Syst Lts | Verfahren zum Auffinden und zur Isolierung pharmakologisch wirksamer Verbindungen aus Substanzgemischen |
US20040126275A1 (en) * | 2002-07-31 | 2004-07-01 | Klaus Doering | Method and device for measuring the lifetime of the fluorescence of fluorophores in samples |
US7351574B2 (en) | 2002-11-27 | 2008-04-01 | 3M Innovative Properties Company | Loading and ejection systems for biological growth plate scanner |
US20040102903A1 (en) * | 2002-11-27 | 2004-05-27 | Graessle Josef A. | Biological growth plate scanner |
US7319031B2 (en) * | 2002-11-27 | 2008-01-15 | 3M Innovative Properties Company | Mounting platform for biological growth plate scanner |
BRPI0316471B1 (pt) * | 2002-11-27 | 2017-06-20 | 3M Innovative Properies Company | Device and method for squaring biological growing plates |
US20040101954A1 (en) * | 2002-11-27 | 2004-05-27 | Graessle Josef A. | Back side plate illumination for biological growth plate scanner |
US7298885B2 (en) * | 2002-11-27 | 2007-11-20 | 3M Innovative Properties Company | Biological growth plate scanner with automated image processing profile selection |
US7496225B2 (en) | 2003-09-04 | 2009-02-24 | 3M Innovative Properties Company | Biological growth plate scanner with automated intake |
US7298886B2 (en) | 2003-09-05 | 2007-11-20 | 3M Innovative Properties Company | Counting biological agents on biological growth plates |
US8249816B2 (en) * | 2004-02-13 | 2012-08-21 | Chevron Oronite Company, Llc | High throughput screening methods for fuel compositions |
US7310147B2 (en) * | 2005-01-27 | 2007-12-18 | Genetix Limited | Robotic apparatus for picking of cells and other applications with integrated spectroscopic capability |
EP4071458A1 (de) | 2005-09-21 | 2022-10-12 | Luminex Corporation | Verfahren und systeme für die bilddatenverarbeitung |
US9528939B2 (en) | 2006-03-10 | 2016-12-27 | Indx Lifecare, Inc. | Waveguide-based optical scanning systems |
US9423397B2 (en) | 2006-03-10 | 2016-08-23 | Indx Lifecare, Inc. | Waveguide-based detection system with scanning light source |
US9976192B2 (en) | 2006-03-10 | 2018-05-22 | Ldip, Llc | Waveguide-based detection system with scanning light source |
US8288157B2 (en) * | 2007-09-12 | 2012-10-16 | Plc Diagnostics, Inc. | Waveguide-based optical scanning systems |
US7629124B2 (en) * | 2006-06-30 | 2009-12-08 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Real-time PCR in micro-channels |
US7593560B2 (en) | 2006-11-30 | 2009-09-22 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Systems and methods for monitoring the amplification and dissociation behavior of DNA molecules |
EP1936363A3 (de) * | 2006-12-19 | 2010-12-08 | JEOL Ltd. | Vorrichtung, Verfahren und System zur Probenuntersuchung |
US8380457B2 (en) | 2007-08-29 | 2013-02-19 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microfluidic devices with integrated resistive heater electrodes including systems and methods for controlling and measuring the temperatures of such heater electrodes |
JP5306382B2 (ja) | 2008-03-04 | 2013-10-02 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 測定された製造特性に基づく生物学的増殖培地の処理 |
US8417013B2 (en) | 2008-03-04 | 2013-04-09 | 3M Innovative Properties Company | Information management in automated processing of biological growth media |
GB2461026B (en) * | 2008-06-16 | 2011-03-09 | Plc Diagnostics Inc | System and method for nucleic acids sequencing by phased synthesis |
CN102460254B (zh) * | 2009-04-29 | 2015-05-06 | Plc诊断股份有限公司 | 具有扫描光源的基于波导的检测系统 |
JP5552298B2 (ja) * | 2009-11-11 | 2014-07-16 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 細菌コロニ釣菌装置及びその前処理方法 |
EP2513635A4 (de) | 2009-12-18 | 2017-06-28 | FPInnovations | Online-analysegerät und -verfahren für makroverunreinigungen |
WO2013059338A1 (en) | 2011-10-18 | 2013-04-25 | Luminex Corporation | Methods and systems for image data processing |
JP5977131B2 (ja) * | 2012-09-27 | 2016-08-24 | 株式会社Screenホールディングス | 分析システムおよび分析方法 |
US10018566B2 (en) | 2014-02-28 | 2018-07-10 | Ldip, Llc | Partially encapsulated waveguide based sensing chips, systems and methods of use |
US11181479B2 (en) | 2015-02-27 | 2021-11-23 | Ldip, Llc | Waveguide-based detection system with scanning light source |
JP6613736B2 (ja) * | 2015-09-07 | 2019-12-04 | セイコーエプソン株式会社 | 物質検出方法および物質検出装置 |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988005908A1 (en) * | 1987-02-04 | 1988-08-11 | Richmond Cell Screening Limited | Cell screening, apparatus and methods |
DE3718066A1 (de) * | 1987-05-29 | 1988-12-08 | Zeiss Carl Fa | Verfahren zur mikroinjektion in zellen bzw. zum absaugen aus einzelnen zellen oder ganzer zellen aus zellkulturen |
GB2211111A (en) * | 1987-10-21 | 1989-06-28 | Saxon Micro Limited | Micropipette and method of operation |
DE3808531C1 (de) * | 1988-03-15 | 1989-07-13 | Eppendorf - Netheler - Hinz Gmbh, 2000 Hamburg, De | |
EP0539888A1 (de) * | 1991-10-30 | 1993-05-05 | Shimadzu Corporation | Auswahlvorrichtung für Zellen und dergleichen |
DE4221063A1 (de) * | 1992-06-26 | 1994-01-05 | Thomas Dr Heiden | Optisches System für Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie |
DE4233686A1 (de) * | 1992-10-02 | 1994-04-07 | Ism Ingenieurbuero Fuer Spezia | Verfahren zur selektiven optischen Darstellung bzw. Markierung vorbestimmter Atome, Moleküle oder Molekülgruppen |
DE4301005A1 (de) * | 1993-01-18 | 1994-07-21 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren und Vorrichtung zur Bewertung der Fitness von Biopolymeren |
DE4414940A1 (de) * | 1994-04-28 | 1995-11-02 | Pekka Haenninen | Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie und ein Lumineszenz-Rastermikroskop |
US5480804A (en) * | 1989-06-28 | 1996-01-02 | Kirin Beverage Corporation | Method of and apparatus for detecting microorganisms |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL68507A (en) * | 1982-05-10 | 1986-01-31 | Univ Bar Ilan | System and methods for cell selection |
JPS611378A (ja) * | 1984-06-14 | 1986-01-07 | Hitachi Electronics Eng Co Ltd | コロニ−自動移植装置 |
FR2628530B1 (fr) * | 1988-03-08 | 1994-01-28 | Chemunex Sa | Appareil et procede de detection et de numeration de particules fluorescentes, portees par un support solide |
US5073495A (en) * | 1988-10-21 | 1991-12-17 | Large Scale Biology Corporation | Apparatus for isolating cloned vectors and cells having a recovery device |
US5760900A (en) * | 1989-03-18 | 1998-06-02 | Canon Kabushiki Kaisha | Method and apparatus for optically measuring specimen |
US5143854A (en) * | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
WO1991019199A1 (en) * | 1990-06-01 | 1991-12-12 | Pb Diagnostic Systems, Inc. | Automated analytical instrument |
JPH06167453A (ja) * | 1992-11-30 | 1994-06-14 | Suzuki Motor Corp | 蛍光坑体判定装置 |
JP3269039B2 (ja) | 1999-02-08 | 2002-03-25 | 理学電機工業株式会社 | X線分析用試料ホルダおよびx線分析装置 |
JP2000231165A (ja) | 1999-02-09 | 2000-08-22 | Sanyo Electric Co Ltd | 液晶パネルを用いた投写装置 |
-
1996
- 1996-07-19 DE DE19629141A patent/DE19629141A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-07-07 EP EP97111453A patent/EP0819930A3/de not_active Withdrawn
- 1997-07-14 US US08/891,778 patent/US6713264B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-15 JP JP9203966A patent/JPH1078434A/ja active Pending
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988005908A1 (en) * | 1987-02-04 | 1988-08-11 | Richmond Cell Screening Limited | Cell screening, apparatus and methods |
DE3718066A1 (de) * | 1987-05-29 | 1988-12-08 | Zeiss Carl Fa | Verfahren zur mikroinjektion in zellen bzw. zum absaugen aus einzelnen zellen oder ganzer zellen aus zellkulturen |
GB2211111A (en) * | 1987-10-21 | 1989-06-28 | Saxon Micro Limited | Micropipette and method of operation |
DE3808531C1 (de) * | 1988-03-15 | 1989-07-13 | Eppendorf - Netheler - Hinz Gmbh, 2000 Hamburg, De | |
US5480804A (en) * | 1989-06-28 | 1996-01-02 | Kirin Beverage Corporation | Method of and apparatus for detecting microorganisms |
EP0539888A1 (de) * | 1991-10-30 | 1993-05-05 | Shimadzu Corporation | Auswahlvorrichtung für Zellen und dergleichen |
DE4221063A1 (de) * | 1992-06-26 | 1994-01-05 | Thomas Dr Heiden | Optisches System für Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie |
DE4233686A1 (de) * | 1992-10-02 | 1994-04-07 | Ism Ingenieurbuero Fuer Spezia | Verfahren zur selektiven optischen Darstellung bzw. Markierung vorbestimmter Atome, Moleküle oder Molekülgruppen |
DE4301005A1 (de) * | 1993-01-18 | 1994-07-21 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren und Vorrichtung zur Bewertung der Fitness von Biopolymeren |
DE4414940A1 (de) * | 1994-04-28 | 1995-11-02 | Pekka Haenninen | Verfahren zur Lumineszenz-Rastermikroskopie und ein Lumineszenz-Rastermikroskop |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Ref. 94-231165/28 zu JP 06168333 A * |
WPIDS Abstracts: Ref. 94-230912/28 zu JP 06167453 A * |
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10145226A1 (de) * | 2001-09-13 | 2003-04-10 | Lifebits Ag | Herstellung von trägergebundenen Molekülen |
DE10210831A1 (de) * | 2002-03-12 | 2003-11-06 | Zeiss Carl | Optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem |
DE10346130B4 (de) * | 2003-10-01 | 2006-10-05 | Leclerc, Norbert, Dr. | Vorrichtung und Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials oder eines Präparats |
DE10346130A1 (de) * | 2003-10-01 | 2005-06-02 | Leclerc, Norbert, Dr. | Mikrodissektion/Verfahren zum Isolieren von kleinen Ausschnitten |
DE102004051508B4 (de) * | 2003-10-21 | 2006-09-21 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Verfahren zur automatischen Erzeugung von Laser-Schnittlinien in der Laser-Mikrodissektion |
DE102004051508A1 (de) * | 2003-10-21 | 2005-06-16 | Leica Microsystems Wetzlar Gmbh | Verfahren zur automatischen Erzeugung von Laser-Schnittlinien in der Laser-Mikrodissektion |
US9217694B2 (en) | 2003-10-21 | 2015-12-22 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Method for automatically generating laser cutting lines in laser microdissection processes |
US7576912B2 (en) | 2004-05-07 | 2009-08-18 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Gmbh | Microscope table and insert |
DE102004023262A1 (de) * | 2004-05-11 | 2005-12-08 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Ag | Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels Laserbestrahlung und Steuersystem |
US7848552B2 (en) | 2004-05-11 | 2010-12-07 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Gmbh | Method for processing a material by means of a laser irradiation and control system |
DE102004023262B4 (de) * | 2004-05-11 | 2012-08-09 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels Laserbestrahlung und Steuersystem |
DE102004023262B8 (de) * | 2004-05-11 | 2013-01-17 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Verfahren zur Bearbeitung einer Masse mittels Laserbestrahlung und Steuersystem |
DE202005000844U1 (de) * | 2005-01-18 | 2005-04-14 | Passow, Harald | Versuchsanordnung zur Untersuchung der Wirkung von medizintechnischen Laserinstrumenten auf biologische Präparate |
DE102005026540A1 (de) * | 2005-06-08 | 2006-12-14 | P.A.L.M. Microlaser Technologies Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Handhabung von Objekten |
US7923679B2 (en) | 2005-06-08 | 2011-04-12 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Method and device for handling objects |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0819930A3 (de) | 1999-12-22 |
JPH1078434A (ja) | 1998-03-24 |
EP0819930A2 (de) | 1998-01-21 |
US20020137091A1 (en) | 2002-09-26 |
US6713264B2 (en) | 2004-03-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE19629141A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zum Screening von Molekülen bezüglich ihres individuellen Bindungsverhaltens zu mindestens einem vorgegebenen Ligand | |
EP1125112B1 (de) | Vorrichtung zur visualisierung von molekülen | |
DE602004010578T3 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur Aufnahme von Tierzellenkolonien | |
EP2064310B1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur automatisierten entnahme von zellen und/oder zellkolonien | |
US7235373B2 (en) | System for cell-based screening | |
EP1153282A2 (de) | Verfahren und vorrichtungen zur erfassung optischer eigenschaften, insbesondere von lumineszenz-reaktionen und brechungsverhalten, von auf einem träger direkt oder indirekt gebundenen molekülen | |
WO2000013018A2 (de) | Träger für analytbestimmungsverfahren und verfahren zur herstellung des trägers | |
AT502855A1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur automatischen analyse von biologischen proben | |
DE19731479A1 (de) | Vorrichtung und Verfahren mit Feldlichtquellenarray für eine integrierte Probenerfassung | |
EP3161463B1 (de) | Vorrichtung und verfahren für die stöchiometrische analyse von proben | |
EP1903336B1 (de) | Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von einer mit einer fluoreszierenden Substanz markierten Struktur einer Probe | |
DE10138072A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen von Proteinen auf einem Reaktionsträger | |
DE19938479A1 (de) | Prüfstreifen, Verfahren und Vorrichtung zu seiner Herstellung und Verfahren und System zum Lesen des Prüfstreifens | |
DE10209609A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Parallelanalyse von Bio-Molekülen | |
WO2009071065A2 (de) | Vorrichtung zur messung von transportsystemen | |
EP1296756A2 (de) | Verfahren und vorrichtung zum aufbau und untersuchung von substanzbibliotheken | |
DE60026190T2 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur selektiven Anzeige von Ergebnissen und übereinstimmenden Bildern | |
LU102108B1 (de) | Verfahren zum automatischen Untersuchen einer flüssigen Probe | |
DE10353985A1 (de) | Einrichtung und Verfahren zum Manipulieren und Analysieren von Mikroobjekten auf Grundlage eines zumindest bereichsweise als fluidisches Mikrosystem oder/und Chipsystem ausgeführten Mikrosystems | |
DE102017113454A1 (de) | Verfahren zur Verifizierung des Erfolgs von Einzelzellaussaaten in Nanowellarrays sowie Vorrichtung und Nanowellarray | |
DE102011117273A1 (de) | Automatische Strukturbestimmung | |
KR20230042059A (ko) | 이벤트 기반 이미징을 위한 방법 및 시스템 | |
EP2773994A2 (de) | Automatische strukturbestimmung | |
DE102008038467A1 (de) | Verfahren zur Bildauswertung und/oder Manipulation einer Probe |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OM8 | Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law | ||
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |