DE2501855A1 - Reagens und verfahren zur bestimmung von leukozyten und haemoglobin im blut - Google Patents

Reagens und verfahren zur bestimmung von leukozyten und haemoglobin im blut

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Description

8 München 40
Ens&bcthitraße 34
COULTER DIAGNOSTICS, INC.
740 West 83rd Street
Hialeah, Florida 33014 / U.S.A.
Reagens und Verfahren zur Bestimmung von Leukozyten und Hämoglobin im Blut
Die Erfindung betrifft ein Reagens und ein Verfahren zur Bestimmung von Leukozyten und Hämoglobin im Blut, insbesondere ein diagnostisches "in vitro"-Reagens zum schnellen Stromatolysieren von Erythrozyten mit rapider Umwandlung von Hämoglobin in ein Chromogen zur Bestimmung von Leukozyten und Hämoglobin im Blut.
Durch die Einführung von schnell arbeitenden automatischen hämatologischen Geräten, wie des Coulter-Zähler-Modells "S", sind das Stromatolysieren von Erythrozyten mit hoher Geschwindigkeit sowie chromogenbildende Reagenzien notwendig geworden, die eine klare, stabile, reproduzierbare Lösung ergeben, deren optische Dichte direkt proportional zur Hämoglobinkonzentration ist. In einem Gerät dieser Art wird Blut mit einem herkömmlichen Verdünnungsmittel vermischt. Man erhält eine erste verdünnte Blutprobe. Einem Teil dieser Probe wird ein Auslösungmittel hinzugefügt. Man erhält so eine zweite verdünnte Blutprobe. Diese beiden Proben können beispielsweise ein Verdünnungsverhältnis von 224:1 aufweisen. Die Mischung verbleibt für kurze,
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aber ausreichende Zeit in der Auflösungskammer, wobei sich die roten Blutkörperchen auflösen und ihr Hämoglobin abgeben. Die daraus entstehende Suspension wird in einer Leukozyten-Zählvorrichtung durch Meßöffnungen geleitet, wo die weißen Blutkörperchen elektronisch gezählt werden. In der gleichen Vorrichtung wird auch die Konzentration des in der Leukozyten-Zählsuspension enthaltenen Hämoglobins spektrophotometrxsch bestimmt. Sobald das Verhältnis von Erythrozyten zu Leukozyten im normalen Blut um 1000:1 liegt, müssen die Erythrozyten schnell in sehr kleine Teile zerkleinert werden, um eine Störung der Leukozytenzählung zu vermeiden. Gleichzeitig dürfen keine Leukozyten zerstört werden, und das Hämoglobin muß in eine für die genaue photometrische Bestimmung geeignete Form gebracht werden.
Bisher wurden in schnell arbeitenden automatischen hämatologischen Geräten auflösende und cyanmethämoglobinchromogenbildende Reagenzien verwendet. Diese erwiesen sich jedoch als nicht genügend stabil.
Es ist auch bereits bekannt, quartäres Ammoniumsalz vorteilhafterweise als Stromatolysiermittel zu verwenden, wobei die Erythrozyten sofort soweit zerstört werden, daß sie die Bestimmung der Leukozytenzahl nicht mehr beeinträchtigen und ein relativ stabiles Reagens bilden (she. z.B. The American Journal of Clinical Pathology, Bd. 36, Nr. 3, S. 220-223, Sept. 1961). Das quartäre Ammoniumion in dem Salz hat drei an Stickstoff angehängte kurze Alkylketten und eine lange Alkylkette.
Bei dem herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung von Hämoglobin wird das Drabkin-Reagens verwendet, das Kaliumferricyanid, Kaliumcyanid und Natriumbikarbonat enthält. Wenn diesem Reagens Hämoglobin zugefügt wird, wird das Kaliumferricyanid zu Kaliümferrocyanid reduziert, und das Hämoglobin wird zu Methämoglobin oxydiert. Dieses reagiert mit dem Cyanidion,
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um das stabile Chromogen, Cyanine thämog lob in zu bilden, das photometrisch meßbar ist. Das Drabkin-Reagens ist jedoch gegen Temperaturen unter Null nicht stabil.
Das Ferricyanidion hat die Tendenz, nichtlösliche Komplexe mit quartären Ammoniumverbindungen zu bilden. Daher kann eine Mischung des bekannten quartären Ammoniumverbindungsreagens mit dem Drabkin-Reaktionsmittel unzuverlässig sein, da das Ausfällprodukt, wenn auch nur leicht, die Leukozytenzählung fälschlicherweise erhöhen würde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein genau arbeitendes und schnell wirksames stromatolysierendes und chromogenbildendes Reagens für schnell arbeitende automatische hämatologische Geräte zu schaffen, wobei das Reagens vorzugsweise nicht durch Temperaturen unter Null beeinträchtigt wird.
Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch gelöst, daß eine ferricyanidionenfreie, wäßrige Lösung verwendet wird, die ein quartäres Ammoniumion und Cyanidion enthält, wobei an den Stickstoff des quartären Ammoniumions drei kurze Alkylketten und eine lange Alkylkette angehängt ist, und wobei die Ionen in ausreichenden Mengen vorhanden sind, um Erythrozyten und die plättchenförmigen Teilchen im Blut zu stromatolysieren und Hämoglobin in ein Chromogen zur Leukozyten- und Hämoglobinbestimmung umzuwandeln, und wobei das Reagens mit einer Blutprobe zur Reaktion gebracht wird, um Leukozyten und Hämoglobin im Blut zu bestimmen.
Das erfindungsgemäße Reagens ist eine stabile Verbindung, mit der Leukozyten und Hämoglobin mit der erforderlichen diagnostischen Genauigkeit bestimmt werden können. Insbesondere reduziert das Reagens Erythrozyten in kurzer Zeit
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zu sehr kleinen Teilen, ohne die Leukozyten zu zerstören. Es bildet kein Ausfällprodukt, das die Leukozytenbestinunung beeinträchtigen würde.
Das Reagens wandelt Hämoglobin in ein stabiles Chromogen um, dessen spektrale Eigenschaften denen von Cyanmethämoglobin ähneln und das für die genaue photometrische Analyse geeignet ist: Es wird dabei für die Analyse eine klare, stabile und reproduzierbare Lösung erzielt, deren optische Dichte direkt proportional zur Hämoglobinkonzentration ist.
Erfindungsgemäß braucht kein Ferrizyanidion verwendet werden, sondern nur Cyanidion zusammen mit einem quartären Ammoniumion, um Hämoglobin in ein stabiles, für die Analyse geeignetes Chromogen umzuwandeln. Es besteht daher keine Gefahr einer Komplex-Bildung auf Grund von Ferricyanidion. Das Reagens ist eine farblose Lösung.
Nachfolgend werden die bevorzugten Ausführungsbeispiele beschrieben.
Das erfindungsgemäße Reagens ist eine wäßrige, von Ferricyanid freie Lösung, die als aktive Ionen ein quartares Ammoniumion und Cyanidion enthält. Jedes der Ionen kann in Form eines geeigneten Salzes mit einem Ion entgegenr gesetzten Vorzeichens vorhanden sein. Das quartäre Ammoniumion hat vorzugsweise die Form eines Salzes mit einem anorganischen Anion, insbesondere einem Halogenid, wie z.B. Chlorid oder Bromid, einem Sulphat, einem Phosphat oder einem Nitrat. Das Cyanidion hat vorzugsweise die Form eines Salzes mit einem anorganischen Kation, insbesondere einem Alkalimetallkation, z.B. Natrium- oder Kaliumkation. Die Lösung kann im wesentlichen aus solchen in Wasser gelösten Salzen bestehen.
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Im allgemeinen ist das verwendete quartäre Ammoniumion von der bereits früher verwendeten Art eines Stromatolyseagens, wobei an den Stickstoff drei kurze Alkylketten und eine lange Alkylkette angehängt ist. Zweckmäßigerweisewerden die kurzen Alkylketten nachstehend mit R1, R2 und/oder R3 zwischen 1 und 4 Kohlenstoffatomen enthalten, wie sie durch Methyl-, Äthyl-, Propyl- und Butylradikale dargestellt werden. R4 kann im Bereich von etwa 10 bis 20 Kohlenstoffatomen liegen, die von Decyl bis Eicosyl reichen.
Das quartäre Ammoniumion wird durch ein in wäßriger Lösung von einer Konzentration von etwa 0,5 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1-5 Gew.-% enthaltenes quartäres Ammoniumsalz dargestellt. Eine Lösung von solcher Konzentration wird als Auflösungmittel verwendet und mit zuvor mit einem herkömmlichen Verdünner verdünnten Blut in einem Verhältnis von Ausfällmittel zu Verdünnerprobe von etwa 1:8,6 wie oben beschrieben gemischt. Wenn die anfängliche Verdünnung der Blutprobe am Anfang von der obigen Angabe verschieden ist, kann natürlich ein Auflösungsmittel mit einem anderen Verhältnis gewählt werden, um dieselbe Konzentration von reagierendem Ion zu erhalten. Das quartäre Ammoniumion und seine Konzentration werden jeweils so gewählt, daß die erforderliche hämolytische Aktivität und Löslichkeit der quartären Ammoniumverbindung erzielt wird. Im allgemeinen nimmt die Löslichkeit der Verbindung mit zunehmender Zahl der Kohlenstoffatome ab, während die hämolytische Aktivität mit steigender Zahl von R4-Kohlenstoffatomen zunimmt. Wenn beispielsweise R1, R2 und R3 Methyl sind, kann R4 10 - 20 Kohlenstoffatome (C10 bis C20) enthalten, um in dem oben beschriebenen analytischen Verfahren eine ausreichende hämolytische Aktivität bei einer Konzentration von etwa o,5 % und mit R1, R2 und R3 = Methyl sollte R4 mindestens etwa 14 Kohlenstoffatome aufweisen, um die erforderliche hämolytische Aktivität zu erzielen. Bei einer Konzentration von etwa 10 % und mit R1, R2 und R3 = Methyl sollte R4 maximal etwa 16 Kohlenstoffatome enthalten, um die erforderliche Löslichkeit der Verbindung zu
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• (ο .
erzielen. Als weitere Beispiele kann bei R4 = Tetradecyl R1, R2 und R3 = Methyl, Äthyl oder Propy!radikale in einer 0,5 - 10 %igen Konzentration sein, wobei eine ausreichende hämolytische Aktivität und eine vollständige Lösung erreicht wird. Wenn R4 = Tetradecyl und R1 = Methyl, ist R2 = Methyl oder Äthyl, und R3 = Butyl, wobei die hämolytische Aktivität ausreichend und die Verbindung bei 0,5 bis 5% löslich ist, während sie bei einer Konzentration von 10% nur unvollkommen löslich ist.
Es ist ein Merkmal der Erfindung, daß das Reagens so zusammengesetzt sein kann, daß die Lösung eingefroren und aufgetaut werden kann, ohne daß sich ein Teilchenüberschuß bildet, wodurch die Genauigkeit des Instruments überfordert und eine genaue Leukozytenzählung beeinträchtigt würde. Dieses Instrument hat eine Genauigkeitsgrenze von etwa 200 Zellen. Wenn beispielsweise R4 = Decyl, Dodecyl oder Tetradecyl und R1, R2 und R3 = Methyl, kann eine Lösung mit 5%iger Konzentration eingefroren und wieder aufgetaut werden, wobei sich in 0,5 ml weniger als 200 Teilchen bilden, wie mit dem Coulter-Zähler FN bei Schwellenwert— einstellung für Blutkörperchen festgestellt wurde. Wenn R4 = Tetradecyl und R1, R2 und R3 = Methyl bis Propyl, kann eine 5%ige Lösung eingefroren und aufgetaut werden mit einer resultierenden Zählung von weniger als 200 Teilchen. Wenn andererseits R4 = C16 bis C20, und R1, R2 und R3 = Methyl, übersteigt die Teilchenzählung nach dem Einfrieren und Auftauen einer 5%igen Lösung die Zahl 200. Ebenso übersteigt die Teilchenzählung die Zahl 200 nach dem Einfrieren und Auftauen einer 5%igen Lösung, wenn R4 = Tetradecyl, R1 = Methyl, R2 = Methyl oder Äthyl, und R3 = Butyl. R1, R2 und R3 haben dementsprechend vorzugsweise 1-3 Kohlenstoffatome, und R4 vorzugsweise 10 -14 Kohlenstoffatome.
Die Konzentration des Cyanidions wird vorzugsweise so gewählt, daß eine etwa 89 %ige Umwandlung von Hämoglobin
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in ein Chromogen erfolgt. In einer Lösung für'- den oben beschriebenen Zweck ist das Cyanidion z.B. vorzugsweise in einer Menge von 0,0006 bis 0,005 Mol, vorzugsweise mehr als ca. 0,001 Mol vorhanden. Ein Salz lieferndes Cyanidion wird in einem Molverhältnis verwendet, das die gewünschte Cyanidion-Konzentration ergibt, wobei dieses Molverhältnis bei einem Salz mit einem einwertigen Kation beispielsweise ein Alkalimetall sein kann. Es können Umwandhungen in ein Chromogen mit bis zu etwa 96 % des Härnoglobins erzielt werden. Das Chromogen wird bei 540 Nanometer spektrophotometrisch analysiert.
Nachfolgend wird ein Beispiel des erfindungsgemäßen Reagens beschrieben. Selbstverständlich ist dieses Beispiel nur illustrativ zu verstehen , und es können verschiedene andere Bestandteile und Verhältnisse verwendet werden, die in den Erfindungsbereich fallen.
Beispiel
Nach dem beschriebenen Verfahren kann folgende Verbindung als Ausfäll- und chromogenbildendes Reagens im Coulter-Zähler-Modell S verwendet werden:
Bestandteil Verhältnis
Wasser !' 1 Liter
Kaliumcyanid 0,25 g (0,00385 Mol) Tr imetliy 1-Te tr a-
decyl-ÄHiiaonium-
chlorid 35 g (3,38 %)
Die Verbindung hat einen pH-Wert von etwa 9. Bei Verwendung zur Analyse mit einem handelsüblichen gepufferten, unter der Bezeichnung ISOTON bekannten Blutverdünnungsmittel und bei Anwendung des vorliegenden Verfahrens beträgt der pH-Wert der endgültigen Lösung ca. 7,6.
tentonwälte
Wiping. L Edsr Din!-!et & ζ**ί«»ι*ϊΓ·
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Claims (8)

Patentansprüche
1.) Reagens zur Verwendung in der Bestimmung von Leukozyten und Hämoglobin im Blut, dadurch gekennzeichnet, daß eine ferricyanid-ionenfreie wäßrige Lösung verwendet wird, die ein quartäres Ammoniumion und Cyanidion enthält, wobei an den Stickstoff des quartären Ammoniumions drei kurze Alkylketten und eine lange Alky-1-kette angehängt ist, und wobei die Ionen in ausreichenden Mengen vorhanden sind, um Erythrozyten und plättchenförmige Teilchen zu stromatolysieren und Hämoglobin in ein Chromogen zur Leukozyten- und Hämoglobinbestimmung umzuwandeln.
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das chartäre Ammoniumion durch ein quartäres Ammonium— salz dargestellt wird, das in der Lösung in einer Konzentration zwischen etwa 0,5 und 10 Gew-% enthalten ist, wobei das Cyanidion in einer Konzentration zwi- .
. sehen etwa 0,0006 und 0,005 Mol vorhanden ist.
3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Trimethyltetradecyl-Ammoniumhalogenid, -sulphat, -phosphat, oder -nitrat ist, wobei das Cyanidion durch ein in der Lösung enthaltenes Alkalimetallcyanid dargestellt wird.
4. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die kurzen Alkylketten jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatome und die lange Alkylkette 10 bis 14 Kohlenstoffatome enthält.
5. Reagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das quartäre Ammoniummol durch ein quartäres Ammoniumsalz dargestellt wird, das in der Lösung in einer Konzentration zwischen etwa 0,5 und 10 Gew-% enthalten ist,
— 9 —
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.- ar -
•3 ·
wobei das Cyanidion durch ein Alkalimetallcyanxd dargestellt wird, das in der Lösung in einer Konzentration zwischen etwa 0,0006 und 0,005 Mol enthalten ist.
6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Halogenid, Sulphate Phosphat oder Nitrat ist.
7. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da'ß es aus einer Verbindung besteht, die folgende Bestandteile und Anteile enthält:
Bestandteil Anteil Wasser 1 Liter
Kaliumcyanid 0,25 g Trimethyl tetra- 35 g decylammoniumchlorid
8. Verfahren zur Bestimmung von Leukozyten und Hämoglobin im Blut, wobei ein Reagens mit einer Blutprobe in Reaktion gebracht wird, um Erythrozyten und plättchenförmige
zu stromatolysieren und Hämoglobin in ein Chromogen für diese Bestimmung umzuwandeln, dadurch gekennzeichnet, daß alH Reagens eine ferricyanidion-freie wäßr-ige Lösung verwendet wird, die ein quartäres Ammonium ion und Cyanidion enthält, wobei an den Stickstoff des quartären Ammoniums drei kurze Alkylketten und eine lange Alky!kette angehängt ist.
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