DE2631909A1 - Mehrschichtige membran und ihre verwendung als synthetische haut - Google Patents

Description

Mehrschichtige Membran und ihre Verwendung als synthetische Haut

Die Erfindung betrifft Stoffe, die sich zur Verwendung als synthetische Haut eignen. ,----■ . - ■"."'

Berichte über Versuche, offene Wunden und starke Verbrennungen zu bedecken, reichen bis zum Jahre 1500 vor Christi Geburt zurück; vgl. J.H. Breasted: "Edwin Smith, Surgical Papyrus", Band 1, Verlag University of Chicago Press, Chicago, Illinois (1930), Seite 83. Obwohl seitdem umfangreiche Forschungen zur Entwicklung eines brauchbaren Hautersatzes durchgeführt worden sind, ist bis jetzt keine brauchbare Alternative für die Autoplastik entwickelt worden. Jedoch haben Beobachtungen, die « aus den auf diesem Forschungsgebiet bereits durchgeführten Ar- ψ beiten angesammelt wurden, zur Entwicklung einer Anzahl von Grundvorstellungen geführt, die auf den Aufbau eines Systems zur Behandlung von offenen Wunden und Verbrennungen dritten Grades mit besserer Aussicht auf Erfolg angewandt werden körinen.

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Die bisherigen Versuche zur Lösung dieses Problems\ die angewandt wurden, um einen Hautersatz zu entwickeln, können in vier grosse Kategorien eingeteilt werden, nämlich die Homoplastik, modifizierte Hautxenotransplantationen, synthetische polymere Gebilde und regenerierte (reconstituted) Kollagenfilme .

Die Anwendung der Homoplastik zur Behandlung -van massiven Verbrennungen ist gegenwärtig eine übliche Methode. Als Quelle für das Hauttransplantat kann ein lebender Spender oder Haut dienen, die von Leichen entnommen und in einer Hautbank aufbewahrt worden ist. Die Rechtfertigung für die Anwendung der Homoplastik ist die Notwendigkeit, den Flüssigkeitsverlust zu vermindern, Infektionen zu verhindern und den Bereich der Vernarbung zu verkleinern.

In Abwesenheit von eine Immunreaktion unterdrückenden Mitteln werden jedoch Homotransplantate immer abgestossen. Die Abstossung erfolgt anscheinend in erster Linie auf dem Wege über die Hemmung der Gefässbildung in dem Transplantat, die den Beginn der Immunreaktion begleitet; vgl. E.A. Guthy, J.B. Billotte, R.J.K. Koumans und J.F. Burke in "Research in Burns", Herausgeber P. Matter, T.L. Barclay und Z. Konickova, Verlag Hans Huber, Stuttgart, 1971· Aus der Verwendung von eine Immunreaktion unterdrückenden Mitteln, um die Abstoßung solcher Transplantate zu vermeiden, ergeben sich aber bekanntlich viele Probleme.

Verschiedene Forscher haben Versuche unternommen, die Immunogenität (die Immunreaktionen erzeugende Natur) von Homotransplantaten durch Organkulturmethoden zu regulieren. Nach einer Anzahl von einander widersprechenden Berichten wurden die Ergebnisse einer endgültigen Untersuchung solcher Verfahren von Ninnemann und Good veröffentlicht, die daraus den Schluss gezogen haben", dass die Modifizierung von Antigenen in KuItur-

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geweben bei diesen Versuchen nicht bewiesen worden war; vgl. J.L. Ninnemann und R.A. Good, "Transplantation", 1&, 1 (1974).

Ein anderer Versuch, die Homoplastik anzuwenden, war die Untersuchung der Möglichkeit der Modifizierung von tierischer Haut. Das 'Grundziel dieses Lösungsgedankens ist der Entzug derjenigen Bestandteile aus der Haut, die die Bildung von Wirtsantikörpern hervorrufen.

Oliver und Mitarbeiter verfolgten diesen Gedanken, indem sie Schweinehaut mit Trypsin behandelten, um zelluläres und nichtkollagenartiges Material daraus zu entfernen; vgl. R.F. Oliver, R. A. Grant und CM. Kent, "Brit. J. Exp. Path.", 53, 5^0 (1972). Dies führte zu einem Transplantationsmaterial, das vorwiegend aus unlöslichem"Kollagen aus der ursprünglichen Morphologie der Dermis bestand und ein zu vernachlässigendes Ausmaß an Antigenität aufwies. Das so erhaltene modifizierte Hautkollagen wurde auf in voller Dicke ausgeschnittene Hautwunden des Schweins transplantiert und sein weiteres Schicksal mit demjenigen von Autotransplantaten und Homotransplantaten aus unbehandelter Haut verglichen. Die Autotransplantate verhielten sich normal, wie es zuvor von Henshaw und Miller beschrieben worden war; vgl. J.R. Henshaw und E.R. Miller, "Arch. Surg.", 658 (1965). Die unbehandelten Homotransplantate waren am 5. Tag abgestorben, wobei einkernige Zellen vorhanden waren, und hatten am 10. Tag an der Basis zu degenerieren be gönnen. Am 20. Tag war die Abstoßung der Homotransplantate praktisch vollständig. Bei den behandelten Hautkollagen-Transplantaten war der untere Teil des Transplantats am 5. Tag wieder mit Kapillaren und Bindegewebszellen ausgestattet, während eine epidermische Wanderung durch das Transplantat hindurch vor sich ging. Die basophile Lyse des Transplantatkollagens begann ungefähr am 5. Tag und war von der Bildung von Infiltrationsund Granulationsgewebe begleitet, welches.das Kollagen in Gegenwart von vielkernigen Riesenzellen fortschreitend

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ersetzte. Am 20. Tag waren die Transplantate im wesentlichen durch Granulationsgewebe ersetzt und verhielten sich wie offene Wunden. Hierdurch wird die Notwendigkeit der Erhöhung des Widerstandes von nativem Kollagen gegen Lyse unterstrichen.

Als Ergebnis dieser Untersuchungen verzeichneten Oliver und Mitarbeiter vier Anforderungen an ein erfolgreiches Transplantat:

1. Die Hautkollagenfasern sollen über einen langen Zeitraum hinweg unverändert bleiben und dadurch einen wesentlichen Strukturrahmen für die Neubildung der Gefäss- und Zellelemente des Gewebes bilden;

2. das Transplantat soll keine Premdkörperreaktion hervorrufen, die zur schliesslichen Zerstörung des Transplantats führt, in dem sich frische Zellen gebildet haben;

3. das Transplantat soll ein für das Wachstum und die Entwicklung normaler Epidermis geeignetes Hautbett bilden; und

4. das Transplantat soll die Bildung von Granulationsgewebe unterdrücken.

Eine dritte Möglichkeit ist die Verwendung von synthetischen polymeren Gebilden. Im Schrifttum gibt es zahlreiche Berichte über die Untersuchung der Eignung von polymeren Stoffen für die verschiedensten biomedizinischen Anwendungszwecke, unter anderem auch als Hautersatzstoffe und provisorische Wundverbände. In Anbetracht der Fähigkeit der Wissenschaftler auf dem Gebiete der Polymeren, eine polymere Struktur an nahezu jede beliebige Kombination von physikalischen und chemischen (aber bisher nur wenigen biologischen) Anforderungen anzupassen, ist dies nicht überraschend. Bei den Untersuchungen über die Brauchbarkeit von Polymerfilmen als Hautersatz ist bisher

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eine beträchtliche Anzahl von geprüften Stoffen als untauglich verworfen worden, man hat aber wertvolle Erkenntnisse über die an einen zufriedenstellenden Hautersatz zu stellenden Anforderungen gewonnen. Zum Beispiel hat die Verwendung einer Samtstruktur zu einer verbesserten Haftfestigkeit an dem Gewebe geführt, und durch die Entwicklung von Methoden zur Herstellung von sogenannten biologisch verträglichen Polymeren von gesteuerter Porengrösse ist die Möglichkeit zur Synthese von Stoffen verbessert worden, die imstande sind, in dem Transplantat Zellenwanderung und -fortpflanzung hervorzurufen; vgl. C.W. Hall, D. Liotta, J.J. Chidoni, M.E. Debakey und D,P-. Dressler, "J. Biomed. Mat. Res«,·¹, 1_, 187 (1967) und G.L. Wilkes und S.L. Samuels, ¹¹J. Biomed. Mat. Res.", 7, 541 (1973). Ein anderer aussichtsreicher Gedanke war die Polymerisation von vernetzten Polymeren in Hydrogelform, um eine zusätzliche Fähigkeit zur Anregung für das Einwachsen von Zellen und die Gefässbildung zur Verfügung zu stellen; vgl. J. Hubacek, K. Kliment, J. Dusek und Hubacek, "J. Biomed. Mat. Res.", I_-, 387 (1967). Die Verwendung von synthetischen Polymeren zum Ersatz von Haut hat aber bisher nicht zur Lösung des Problems geführt, und zwar hauptsächlich wegen der Häufigkeit von Infektionen und der Unfähigkeit der bisher untersuchten Stoffe, Gefäss- und Epithelbildung anzuregen..

Da der Hauptbestandteil von normaler Haut Kollagen ist, ware ein logischer Lösungsgedanke für die Entwicklung eines Hautersatzes die Untersuchung des Schicksals von regenerierten (reconstituted) Kollagengebilden nach ihrem Inberührungbringen mit lebendem Gewebe.

Dieser Lösungsweg wurde von einer Anzahl von Forschern angewandt, deren allgemeines Arbeitsverfahren darin bestand, das Kollagen aus Tieren zu extrahieren, es zu verschiedenen Graden zu reinigen, und es in Folien oder sonstige Gebilde überzuführen, die als Wundverbände verwendet oder in lebendes Ge-

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webe implantiert wurden, um ihr Schicksal in vivo zu bestimmen. Frühere Arbeiten auf diesem Gebiet haben gezeigt, dass Kollagen als solches eine chronische Entzündungsreaktion mit anscbliessender Resorption des Implantats hervorruft; vgl. B.D. Pullinger und A. Pirie, »J. Path. Bact.», 34, 341 (1942). Grillo und Gross konnten zeigen, dass die Resοrptionsgeschwindigkeit von Kollagen sich durch gesteuerte Vernetzung mit Formaldehyd vermindern lässt. Sie konnten ferner zeigen, dass die Immunreaktion auf Implantate aus regeneriertem Kollagen! minimal war; vgl. H.C. Grille und J. Gross, "J. Surg. Res.", 2, 69 (1962).

Enzymatisch modifiziertes Kollagen ist von Rubin und Stenzel hergestellt und ausgewertet worden, die gezeigt haben, dass diese Behandlung nicht so viel zelluläre Reaktion hervorruft wie das unbehandelte Material. Die Erklärung für dieses unterschiedliche Verhalten ist die, dass das verwendete Enzym (Proctase) die Telopeptide in wirksamer Weise aus dem Kollagenmolekül entfernt, ohne die native Molekularstruktur zu zerstören; vgl. A.L. Rubin und K.H. Stenzel in "Biomaterials" (Herausgeber L. Stark und G. Aggarwal), Verlag Plenum Press,. New York (1969). Durch die Verwendung von regenerierten Kollagenfolien sind die Probleme der Lyse, der Infektion und der Verhinderung des Einwachsens von Gewebe und der Gefässbildung, die bei anderen Methoden auftritt, nicht gelöst worden.

Die Erfindung betrifft eine mehrschichtige Membran, die die für künstliche Haut erforderlichen Eigenschaften aufweist.

Eine erste Schicht ist nicht-immunogen, in Gegenwart von KÖrperflüssigkeiten unlöslich und in Gegenwart von Körperenzymen nicht-abbaubar. Zu den für die erste Schicht bevorzugten Stoffen gehören vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die durch inniges Inberührungbringen von Kollagen mit einem Mucopolysaccharid und anschliessendes Vernetzen des da-

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bei entstehenden Produktes synthetisiert werden. Geeignetes Kollagen kann aus einer Anzahl von tierischen Quellen gewonnen werden, und zu den geeigneten Mucopolysacchariden gehören z..B. Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparansulfat, Heparin und Hyaluronsäure.

Das Vernetzen kann auf chemischem Wege, durch Bestrahlung, dehydrothermisch oder nach einem sonstigen geeigneten Verfahren erfolgen. Eine geeignete chemische Methode ist die Aldehydvernetzung; jedoch sind andere chemische Vernetzungsmittel ebenso geeignet. Die dehydrothermische Vernetzung, die bevorzugt wird, erfolgt durch Herabsetzung des Feuchtigkeitsgehalts der Verbundprodukte auf einen sehr niedrigen Wert,'ζ„B. indem man das Verbundprodukt der Einwirkung von erhöhten Temperaturen und Hochvakuum aussetzt. Die. dehydrothermische Vernetzung vermeidet die Notwendigkeit, Vernetzungsmittel zuzusetzen und im Falle von toxischen Stoffen, wie Aldehyden, das nicht-umge-■ setzte Vernetzungsmittel nachträglich zu entfernen; durch dehydrothermische Vernetzung entstehen auch Verbundprodukte, deren Mucopolysaccharidgehalt in einem weiteren Bereich liegt.

Es wird angenommen, dass die Produkte dieser Synthesen aus Kollagenmolekülen oder Kollagenfibrillen bestehen, an die lange Mucopolysaccharidketten gebunden sind. Offenbar werden die Mucopolysaccharidketten durch das Vernetzen so fest an das Kollagen gebunden, dass sie sich nicht eluieren oder anderweitig von ihnen trennen lassen. Mechanisch können diese Stoffe als Analoge von faserverstärkten Verbundstoffen aufgefasst werden, in denen das Kollagen die Faser und das Mucopolysaccharid die Einbettungsmasse bildet, weswegen diese Stoffe hier auch als polymere Verbundprodukte bezeichnet werden.

Es wurde gefunden, dass vernetzte Verbundprodukte aus'Kollagen und Mucopolysaccharid die vorteilhaften Eigenschaften des nativen Kollagens beibehalten. Ausserdem lassen sich solche

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Stoffe so synthetisieren, dass sie nicht-antigen sind, durch Kollagenase und andere Enzyme nicht abgebaut werden und in Gegenwart von Körperflüssigkeiten unlöslich sind. Ferner können solche Verbundprodukte so synthetisiert werden, dass sie die für künstliche Hauttransplantate und Wundverbände geeigneten Bruchfestigkeiten, Bruchdehnungen und sonstigen mechanischen Eigenschaften aufweisen.

An die erste Schicht ist durch Haftbindung eine die Feuchtigkeit sdurchlässigkeit steuernde Schicht gebunden. Diese Steuerungsschicht besteht aus einem nicht-toxischen Werkstoff, der der gesamten Membran eine Feuchtigkeitsdurchlässigkeit

(moisture flux) von etwa 0,1 bis 1 mg/cm /h verleiht, die ungefähr der Feuchtigkeitsdurchlässigkeit von normaler Haut entspricht. Beispiele für Werkstoffe für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht sind synthetische Polymere, wie · Siliconharze, Polyacrylsäure- und Polymethacrylsäureester und deren Copolymere sowie Polyurethane.

Die hier beschriebenen Membranen erfüllen wegen ihrer besonderen Kombination von Schichten die Aufgaben von künstlicher Haut oder Wundverbänden. Die Geschwindigkeiten des Körperfeuchtigkeitsverlustes und des Wärmeverlustes aus dem verletzten Hautbereich werden so gesteuert, dass sie ähnliche Grossen wie bei -normaler Haut haben. Ausserdem wird durch diese Membranen bakterielle Infektion vermieden und der Wundbereich gegen mechanischen Abrieb oder sonstige Abnutzung geschützt« Wesentlich ist, dass Membranen, die mit einer ersten Schicht aus einem vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt hergestellt sind, eine Schablone (template) für das Einwachsen und die Fortpflanzung (Vervielfältigung) von Zellen aus dem unter dem verletzten. Hautbereich liegenden subkutanen Gewebe oder aus dem dem verletzten Hautbereich benachbarten Gewebe der Epidermis, für das Einwachsen und die Fortpflanzung (Vervielfältigung) von Kapillaren und anderen mit darunterliegen-

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dem subkutanem Gewebe in Verbindung stehenden Blutgefässen oder von anderem, an'den Bereich der Verletzung angrenzendem Gewebe und für die Entwicklung von neuem dermischem und epidermischem Gewebe darstellt. Diese Membranen sind auch imstande, die Intensität, Richtung und Geschwindigkeit von Ko ntrakturen, zu denen es im Verlaufe des Heilungsprozesses kommt, unter Kontrolle zu haltern

In der Zeichnung ist die mehrschichtige Membran gemäss der Erfindung schematisch dargestellt.

Die mehrschichtigen Membranen gemäss der Erfindung bestehen aus mindestens zwei Schichten aus unterschiedlichen Werkstoffen. Wie die Abbildung zeigt, ist eine erste Schicht 10 vorhanden. Da die Schicht 10 in unmittelbare Berührung mit dem subkutanen Gewebe oder Wundbett kommt, muss sie drei wesentliche Merkmale aufweisen, nämlich Unlöslichkeit in Körperflüssigkeiten, Unabbaubarkeit bei Berührung mit Körperenzymen und Nicht-Immunogenität. Diese mehrschichtigen Membranen weisen ferner mindestens eine zusätzliche Schicht auf, deren Hauptaufgabe es ist, die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit der Gesamtmembran zu steuern. Die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht 12 ist in der Abbildung als unmittelbar an die erste Schicht gebunden dargestellt. Es muss -jedoch darauf hingewiesen werden, dass auf der Oberseite der Schicht 12 oder zwischen der ersten Schicht 10 und der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht 12 weitere Schichten hinzugefügt werden können, sofern diese die wesentlichen Funktionen dieser Schichten nicht stören.

Ausser den oben erwähnten wesentlichen Eigenschaften für die erste Schicht gibt es noch andere Eigenschaften, die diese Schicht nach Möglichkeit aufweisen soll.

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Eine solche vorteilhafte Eigenschaft bezieht sich auf die Benetzungs- und Haftfähigkeit. Es ist wünschenswert, dass die erste Schicht aus einem Werkstoff besteht, der anfänglich von dem Wundbett benetzt ,wird und an ihm anhaftet,, Dieses sind Vorbedingungen für die Vermeidung der Bildung von Lufteinschlüssen, die sich später zu Stellen des Bakterienwachstums entwickeln können. Die sofortige Ausbildung einer massig star-, ken Bindung zwischen dem Membrantransplantat und dem Wirtsgewebe schützt das Transplantat gegen Verschiebung über dem Wundbett auf Grund von Scherkräften beim Verbinden und Heilen und verhindert daher die Bildung von Lufteinschlüssen. Daher verwendet man vorzugsweise für die erste Schicht einen Werkstoff, der schnell mit dem Wirtsgewebe eine Bindung bildet,

die eine Scherfestigkeit von mindestens etwa 0,7 kg/cm und

vorzugsweise von mindestens etwa 7 kg/cm aufweist.

Ferner ist es wünschenswert, dass die erste Schicht aus einem Stoff besteht, dessen mechanische Eigenschaften es der Membran gestatten, sich der Wunde wie ein Textilstoff anzuschmiegen ("drape")» und der trotzdem bei der Verwendung nicht reisst„ Daher werden Werkstoffe mit einem Young'sehen Modul zwischen etwa 7 und 70 kg/cm und einer Bruchfestigkeit von mindestens 7 kg/cm bevorzugt.

Die Epithelbildung an der Grenze zwischen dem Membrantransplantat und dem Gewebe der Epidermis führt zur Bildung einer natürlichen Sperrschicht gegen Infektion. Eine solche Sperrschicht kann sich dadurch bilden, dass eine Epithelschicht über oder durch das Transplantat vorrückt, wie es in der Abbildung dargestellt ist. Aus diesem Grunde ist es zweckmässig, für die erste Schicht einen Werkstoff zu verwenden, der Epithelbildungsgeschwindigke'iten von mindestens etwa 0,1 mm pro Tag ermöglicht.

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Die Infiltration des mehrschichtigen Transplantats mit Epithelzellen, Bindegewebszellen und anderen Zellen, wie es in der Abbildung dargestellt ist, ist eine Voraussetzung dafür, dass das Transplantat als Schablone (template) für die Neubildung von Hautgewebe wirkt. Daher werden Werkstoffe bevorzugt, die eine Infiltrationsgeschwindigkeit solcher Zellen von mindestens etwa 0,1 nun pro Tag gestatten. Dies ermöglicht den Zellen, in 10 Tagen oder weniger die Hälfte der Dicke einer Transplantatmembran mit einer typischen Dicke von 2 mm zu durchsetzen.

Bevorzugte Werkstoffe für die erste Schicht sind vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte. Diese werden durch Inberührungbringen von Kollagen mit einem Mucopolysaccharid und anschliessendes Vernetzen des so erhaltenen Kollagen-Mucopolysaccharidprodukts erhalten. .

Kollagen ist ein Hauptproteinbestandteil des Bindegewebes von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren. Es kommt oft in Form makroskopischer Fasern vor, die sich chemisch und mechanisch von den nicht aus Kollagen bestehenden Gewebekomponenten trennen lassen. Es eignet sich Kollagen beliebiger Herkunft, das unlöslich oder in sauren, neutralen oder basischen wässrigen Lösungen löslich ist, sowie die im Handel erhältlichen KoI-lagene. Typisches Ausgangsgut zur Gewinnung von Kollagen sind Kalbsfell, Rinder-Achillessehne und Rinderknochen.

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Der Ausdruck "Mucopolysaccharid" bezeichnet hexosaminhaltige Polysaccharide tierischen Ursprungs. Diese Klasse von Verbindungen wird auch oft als "Glykosaminoglykane¹¹ bezeichnet.
Chemisch sind Mucopolysaccharide in abwechselnder Reihenfolge aufgebaute Copolymere aus glykosidisch gebundenen Hexosaminresten, die sich in mehr oder weniger regelmässiger Weise entweder mit Hexuronsäureresten oder mit Hexoseresten abwechseln; vgl. "Carbohydrate Metabolism and its Disorders" von
K.S. Dodgson und A.G. Lloyd, herausgegeben von F. Dickens und Mitarbeitern, Band 1, Verlag Academic Press (1968).

Einige der besser bekannten Mucopolysaccharide tierischen Ursprungs entsprechen den folgenden Strukturformeln:

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Hyaluronsäure

Chondroitin-4-sul£at

Chondroitin-6-sulfat

Dermatansulfat

Keratansulfat

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COOH

NHAo

OH

CH.OH

NHAe

OH

COOH H.COSO»H HO λ O.

HEPARIH

Heparansulfat

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Zur Herstellung, der hier beschriebenen Verbundprodukte eignen sich auch andere Mucopolysaccharide, die der Fachmann entweder kennt oder durch Routineversuche ermitteln kann. Eine eingehendere Beschreibung von Mucopolysacchariden findet sich in dem Werk "Polysaccharides" von G.O. Aspinall, Verlag Pergamon Press, Oxford (1970).

Typische Ausgangsstoffe für Heparin sind Schweinedarm, Rinderlunge, Rfhderleberkapsel. und Mäusefell.· Hyaluronsäure kann aus Hahnenkamm und menschlicher Nabelschnur gewonnen werden, während Chondroitin-4-sulfat und Chondroitin-6-sulfat aus Rinderknorpel und Haifischknorpel gewonnen werden können. Dermatansulfat und Heparansulfat können aus Schweineschleimhautgewebe gewonnen werden, während Keratansulfat aus Rinderhornhaut gewonneil werden kann. ■

Kollagen lässt sich mit einem Mucopolysaccharid in wässrigen. Lösungen umsetzen, die sauer, basisch oder neutral sein können. Diese Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden. In typischer Weise werden geringe Mengen von Kollagen, z.B. 0,3 Gewichtsprozent, in verdünnter Essigsäure dispergiert und die -Dispersion gründlich gerührt. Dann setzt man langsam, z.B. tropfenweise, das Polysaccharid zu der wässrigen Kollagendispersion zu, was zur gemeinsamen Ausfällung von Kollagen" und Mucopolysaccharid führt. Der gemeinsam ausgefällte Niederschlag ist eine verschlungene Masse von Kollagenfibrillen, die mit Mucopolysaccharid überzogen sind, und ähnelt etwas einem Garnknäuel. Diese verschlungene Fasermasse .kann durch Homoge-. nisieren in eine homogene Dispersion von feinen Fasern übergeführt werden, die dann abfiltriert und getrocknet werden. Gemeinsam ausgefällte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte sind von V. Podrazky, F.S. Steven, D.S. Jackson, JvB. Weiss und '■-■ S«J'_e- Leibovich untersucht worden; vgl. "Biochim. Biophys. Acta.", 229, 690 (1971).

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Obwohl das Reaktionsprodukt aus Kollagen und Mucopolysaccharid aus dem wässrigen Medium, in dem es sich bildet, gemeinsam ausfällt, wurde gefunden, dass die Mucopolysaccharidkomponente in anderen wässrigen Lösungen in Lösung gehen kann. Dies trifft besonders auf konzentriertere wässrige Salzlösungen, wie Körperflüssigkeiten, zu. Es ist z.B. bekannt, dass gemeinsame Ausfällungen von Kollagen und Mucopolysaccharid in 0,01 molarer Kochsalzlösung unlöslich, in 0,1-molarer Kochsalzlösung etwas löslich und in 0,4-molarer Kochsalzlösung recht löslich sind - die physiologische Konzentration beträgt etwa 0,14-molar NaCl. Diese Reaktionsprodukte haben daher nur eine begrenzte Unlöslichkeit und kommen als solche nicht für die erste Schicht der als. synthetische Haut verwendbaren mehrschichtigen Membranen in Betracht.

Während die oben beschriebene Mitfällungsmethode "bevorzugt wird, können Kollagen und Mucopolysaccharide auch in anderer Weise umgesetzt werden. Das wesentliche Erfordernis ist, dass die beiden Stoffe unter solchen Bedingungen innig miteinander in Berührung gebracht werden, dass sich die Mucopolysaccharide an die Kollagenketten binden können. Eine andere geeignete Methode ist das Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharid, indem man z.B. aus Kollagen hergestellte Erzeugnisse, wie Blätter, Folien und Röhren, in eine Lösung des Mucopolysaccharide eintaucht. Eine geeignete Abänderung des letztgenannten Verfahrens besteht darin, dass man zuerst ein Erzeugnis, wie ein Blatt, eine Folie oder eine Röhre, das aus einem anderen Material als Kollagen, wie z.B. aus einem synthetischen, natürlichen oder modifizierten natürlichen Polymeren, besteht, mit Kollagen beschichtet und das mit Kollagen beschichtete Erzeugnis (Blatt, Folie, Röhre usw.) dann in die Mucopolysaccharidlösung eintaucht. Eine noch andere geeignete Methode besteht darin, das-Kollagen mit den Mucopolysacchariden, beide in Form von trockenem Pulver, innig zu mischen.

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Der Fachmann auf dem Gebiete der Herstellung von Folien, Filmen, Röhren und anderen Formkörpern nach Methoden, die in der Kunststoff-, Elastomer- und Textilindustrie bekannt sind, versteht ohne weiteres,- dass-das, wie oben beschrieben, hergestellte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt sich nach diesen Methoden ebenfalls zu Folien,- Filmen, Röhren und sonstigen Formkörpern verformen lässt. ' ·.

Um eine bedeutende Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen die Kollagenresorption zu erzielen, müssen mindestens etwa 0,5 Gewichtsprozent Mucopölysaccharid an die ,Kollagenketten gebunden sein. Die obere Grenze richtet sich nach den an dem Kollagen für die Bindung des Mucopolysaccharids zur Verfugung stehenden Stellen. Für Verbundprodukte, bei denen das Mucopölysaccharid Chondroitin-6-sulfat ist, sind Mucopolysaccharidgehalte von etwa 28 Gewichtsprozent erzielt worden; mit Hyaluronsäure andererseits ist als" obere Grenze etwa.25 %■ erzielt worden.

Die Umsetzung mit den Mucopolysacchariden verleiht dem Kollagen auch eine weitere wertvolle Eigenschaft, nämlich die Unfähigkeit, bei einem-Wirtstier eine Immunreaktion (Fremdkörperreaktion) hervorzurufen. Um Kollagen in ein Material überzuführen, welches nach dem Implantieren nicht als Fremdkörper erkannt wird, muss das Kollagen mit mindestens etwa 1 Gewichtsprozent Mucopölysaccharid umgesetzt werden.

Der Unlöslichkeitsgrad der Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte kann durch Vernetzung nach Wunsch erhöht werden. Allgemein eignet sich für die Vernetzung dieser Verbundprodukte jede Verne'tzungsmethode, die sich auch zum Vernetzen von Kollagen eignet. Durch die Vernetzung wird die Auflösung des Mucopolysaccharids in wässrigen Lösungen verhindert, wodurch diese Stoffe für chirurgische Prothesen usw. geeignet werden.

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Die Vernetzung hat auch noch eine andere wichtige Aufgabe, indem sie die Widerstandsfähigkeit dieser Stoffe-gegen Resorption erhöht. Die genaue Funktion der Vernetzung in dieser Beziehung ist noch nicht bekannt; es kann jedoch, sein, dass die Hucopolysaccharideinheiten durch die Vernetzung fest an Stellen auf der Kollagenkette gebunden werden, die normalerweise von Kollagenase angegriffen v/erden. . " . ' . .

Es wurde gefunden, dass die vernetzten Verbundprodukte ein M_Q (Zahlenmittel des Molekulargewichts zwischen Vernetzungsstellen) zwischen etwa 800 und 60 000 aufweisen sollen. Stoffe mit M -Werten unter etwa 800 oder über etwa 60 000 zeigen eine bedeutende Verschlechterung ihrer mechanischen Eigenschaften. Verbundprodükte mit einem M_ zwischen etwa 5000 und 10 000 ha-

ben offenbar die beste Kombination von mechanischen Eigen- ' schäften und werden daher bevorzugt. ■'"·".

Die Vernetzung kann nach vielen Methoden erfolgen, die in die allgemeinen Kategorien der chemischen Vernetzung, der Strahlung svernetzung und der dehydrothermischen Vernetzung fallen. Ein Vorteil der meisten, hier in Betracht gezogenen Vernetzungsmethoden einschliesslich der Vernetzung durch Glutar- . aldehyd und der dehydrothermischen Vernetzung ist der, dass dabei auch das Bakterienwachstum auf diesen Stoffen vernichtet wird. Die Verbundprodukte werden also bei ihrer Vernetzung gleichzeitig sterilisiert. · .

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Eine geeignete chemische Vernetzungsmethode für Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte ist die Aldehydvernetzung. Bei diesem Verfahren werden die Stoffe in wässriger .Lösung mit Aldehyden behandelt, die als Vernetzungsmittel wirken. Geeignete Aldehyde sind z.B. Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal. Der bevorzugte Aldehyd ist Glutaraldehyd, weil er die gewünschte Vernetzungsdichte schneller liefert als andere Aldehyde und ausserdem imstande ist, die Vernetzungsdichte auf einen verhältnismässig hohen Wert zu erhöhen.

Nicht-umgesetzte Aldehyde sollen aus den Kollagen-Mucopolysaccharidprodukten entfernt werden, da restliche Aldehydmengen recht toxisch wirken. Wenn man die Verbundprodukte in Aldehydlösungen taucht, kommt es, wie gefunden wurde, zum teilweisen Entzug der Polysaccharidkomponente durch Auflösung, wodurch der Gehalt des Endprodukts an Polysaccharid vermindert wird.

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Andere geeignete chemische Methoden sind die Carbodiimidkupplung, die Azidkupplung und die Diisocyanatvernetzung.

Die bevorzugte Yernetzungsmethode wird hier als dehydrothermisches Verfahren bezeichnet. Bei der dehydrothermischen Vernetzung braucht kein besonderes Vernetzungsmittel zugesetzt zu werden. Das Verfahren beruht auf dem Entzug eines grossen Prozentsatzes des V/assers aus dem zu vernetzenden Produkt. Die Menge an Wasser, die entzogen werden muss, richtet sich nach vielen Faktoren; allgemein muss jedoch eine ausreichende Menge Wasser entzogen werden, um die gewünschte Vernetzungsdichte zu erreichen. So kann man das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt der Einwirkung erhöhter Temperaturen und/oder von Vakuum unterwerfen, bis der Feuchtigkeitsgehalt auf äusserst geringe Werte vermindert worden ist. Wenn kein Vakuum zu Hilfe genommen wird, können Temperaturen über etwa 80° C und vorzugsweise über 90° C angewandt werden. Bei 23 C eignet sich ein. Vakuum von mindestens etwa 10 mm Quecksilbersäule und vorzugsweise weniger als 10"* mm Quecksilbersäule. Erhöhte Temperatur und Vakuum können auch gemeinsam angewandt v/erden, und dies ist die vorteilhafteste und daher bevorzugte Methode. Bei einem

-5 ' " · . Vakuum von mindestens etwa 10 mm Quecksilbersäule" arbeitet man vorzugsweise bei Temperaturen von mindestens etwa 35° C. Im allgemeinen werden die Stoffe der Einwirkung von erhöhten Temperaturen und. Vakuum ausgesetzt, bis der gewünschte Grad von Unlöslichkeit erreicht ist. Je höher die. Temperatur ist, ' desto geringer ist das Vakuum, das' erforderlich ist, um eine gegebene Vernetzungsdichte zu erzielen,"und" umgekehrt. "■..·".'_ Ein .typisches ■Vernetzungsverfahren zur Erreichung eines In zwischen etwa 5000 und 10 000 besteht darin, dass man das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt 24 Stunden der Einwirkung einer Temperatur von 95° C und eines Vakuums von 0,01 mm-Hg unterwirft. Dieses dehydrothermische Vernetzungsverfahren vermeidet gewisse Nachteile der Aldehydvernetzungs-

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methode und führt zur Bildung von Verbundprodukten, bei denen verhältnismässig grosse Mengen von Mucopolysaccharid fest an die Kollagenkette gebunden sind.

Der Mechanismus, nach dem die dehydrotherinische Vernetzung verläuft, ist noch nicht genau bekannt. Es kann sich um eine Amidkondensation handeln, an der £-Aminogruppen des Kollagens und Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids.beteiligt sind, es kann sich um eine Veresterung handeln, an der Carboxylgruppen das Kollagens und Hydroxylgruppen des Mucopolysaccharids beteiligt" sind, oder es kann sich um eine Veresterung der Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids mit den Hydroxylgruppen des Kollagens handeln. Möglicherweise finden alle drei Arten von Reaktionen zu einem gewissen Ausmaß statt. Eine genauere Beschreibung der dehydro thermischen Vernetzung geben I.V. Yannas und A.V. Tobolsky in der Arbeit "Crosslinking of Gelatin by Dehydration», »Nature», Band 215, Nr. 5100, Seite 509-510, 29. Juli 1967.

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Vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte sind im einzelnen in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung, betitelt: "Vernetztes Polymeres", entsprechend der USA-Patentanmeldung Serial No. 596 111 vom 15. Juli 1975, beschrieben.

Vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte können derart synthetisiert werden, dass sie alle Eigenschaften, die für die erste Schicht wesentlich sind, und ausserdem viele, wenn nicht alle derjenigen Eigenschaften aufweisen, die für die erste Schicht erwünscht sind.

Die Immunogenität von, wie oben beschrieben, hergestellten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten ist zu vernachlässigen, was aus den nachstehend beschriebenen Implantationsund Transplantationsversuchen an Meerschweinchen hervorgeht. Wenn diese Stoffe subkutan implantiert oder anstelle von Hauttransplantaten verwendet werden, verursachen sie in dem Wirtsgewebe eine gelinde Entzündungsreaktion, die sich in einigen polymorphkernigen Leukozyten und Monozyten äussert. Typischerweise werden Lymphozyten weder im Inneren dieser Implantate oder Transplantate noch in dem sie umgebenden Gewebe festgestellt. Häufig ist beobachtet worden, dass eine Kollagenfasersynthese an der Grenzfläche zwischen dem Implantat und dem Wirtsgewebe stattfindet, wobei es zur Bildung von Faserbrücken zwischen den benachbarten Oberflächen und einer sich daraus ergebenden mechanischen Verankerung des Implantats an dem Wirtsgewebe kommt. Die Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte besitzen daher nicht nur eine sehr schwache Immunogenität, sondern scheinen ausserdem Medien zu sein, die die Binde» gewebszellenwanderung und Kollagensynthese begünstigen.

Um- ein Maß für die Widerstandsfähigkeit der Verbundprodükte gegen enzymatischem Abbau in vitro zn- gewinnen₉ wurde ein© mechanochemische Methode angewandt. Nach dieser Methode wird das Verbundprodukt in Gegenwart einer Lösung von Kollagenase

bis zu einem bestimmten Grad gedehnt und die Entspannungsgeschwindigkeit der auf das Material einwirkenden Kraft gemessen. Bei Verwendung von bakterieller Kollagenase wurde immer eine Abnahme der Kraft mit der Zeit beobachtet. Die negative Steigung der linearen Kurve, die den Logarithmus der Kraft in Abhängigkeit von der Zeit (1/*£ ) darstellt, dient als Maß für die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaues. Die Methode liefert Daten für Kollagenfasern, die mit anderen, durch subkutane Implantation in Meerschweinchen erhaltenen bekannten Daten übereinstimmen; vgl. I.V. Yannas, J.F. Burke, C. Huang und P.L. Gordon: "Correlation of In ViVo Collagen Degradation Rate With In Vivo Measurements","J, Biomed. Materials Research", im Druck, 1975. Nach dieser Methode wurde gefunden, dass der enzymatische Abbau von Kollagen durch vernetzte Verbundprodukte, bei denen das Mucopolysaccharid eine Sulfatgruppe enthält, stark gehemmt wird. Dieser Befund stimmt sehr gut mit in vivo-Untersuchungen an Meerschweinchen überein.

Für die erste Schicht besonders bevorzugte Werkstoffe sind vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die etwa 6 bis 15 % sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthalten und bis auf einen M_c-Wert zwischen etwa 5000 und 10 000 vernetzt sind. Chondroitin-6-sulfat bildet besonders hervorragende Verbundstoffe.

Wie oben erwähnt, enthalten die mehrschichtigen Membranen noch eine zweite Schicht, deren Hauptaufgabe es ist, die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit der Gesamtmembran zu steuern, wie es in der Abbildung dargestellt ist.

Aus normaler, unverletzter menschlicher Haut (Unterarm) fliesst Feuchtigkeit mit Geschwindigkeiten Inder Grössenordnung von-0,5 mg/cm /hj vgl« D. Spruit und K.E. Malten_? ⁿDermatologica^w -, V52, 115· (1966). Nach dem Entfernen des Stratum corneum (und möglicherweise eines Teils des Stratum

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granuTosum) durch "Abziehen" mit Klebband steigt der Feuehtigkeitsverlust um das 100- bis 200-fache auf 60 bis 100 mg/cm /h an. Dieser Wert ist der Verdampfungsgeschwindigkeit aus einer freien Wasseroberfläche vergleichbar, die unter den obigen Bedingungen gleichwertigen Versuchsbedingungen 85 mg/cm /h beträgt; vgl, D. Spruit, "Dermatological, 141, 54 (1970).

Offensichtlich ist also das Stratum corneum die Hauptsperrschicht der Haut gegen Wasserverlust, da ihre Entfernung zu einer Wasserverlustgeschwindigkeit führt, die nahezu elbeisso gross ist wie diejenige von einer freien Wasseroberflache«. Der Wirkungsgrad dieser Feuchtigkeitssperrschicht ist unabhängig von der Richtung der Wasserströmung? denn es wurde (iunter Verwendung von -tritiumhaltigem Wasser) bewiesen, dass die Geschwindigkeit des Durchdringens von flüssigem Wasser durch die TJnterarinhaut 0,6 mg/cm /h beträgt, wenn das Wasser auf die Aussenseite der Haut aufgebracht wird; vgl. A.M. Downes., T.M. Sweeney und A.G. Matoltsy, ¹¹J. Invest. Derm.¹¹, Jö, 230 (1967).

Zum Aufbau einer als künstliche Haut verwendbaren Membran muss man sich bemühen» ein Material zu finden, das den gleichen Feuchtigkeitsdurchlässigkeitswert hat wie normale Haut_o Wenn die normalen Durehlässigkeitsgeschwindigkeitswerte überschritten werden, wird, das Wirtsgewebe in der Nachbarschaft des Transplantats sowie das Transplantat selbst dehydratisiert; wenn andererseits viel geringere Durchlässigkeitsgeschwiiidigkeiten vorherrschen, kann es zum Ödem kommen. Diese Erwägungen gelten natürlich nur unter Bedingungen des innigen Kontakts zwischen Transplantat und Wirtsgewebe j sollten sich an der Grenzfläche wesentliche Lufteinschlüsse bilden, so können bedeutende Feuehtigkeitsmengen von dem Wirtsgewebe an die Atmosphäre entweichen, ohne durch das Transplantat hindurchzugehen·

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Daher wird die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem Werkstoff hergestellt, der eine Feuchtigkeitsdurchlässigkeit je Flächeneinheit der Gesamtmembran von mindestens etwa 0,1 bis 1 mg/cm /h ergibt. Vorzugsweise beträgt die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit je Flächeneinheit etwa

• 2

0,3 bis 0,5 mg/cm /h, was ungefähr dem Bereich der Durchlässigkeit menschlicher Unterarmhaut entspricht. Diese Werte erzielt man durch entsprechende Kombination von Dicke und Wasserdurchlässigkeit.

Die andere wesentliche Eigenschaft dieser Schicht ist die, dass sie nicht-toxisch sein muss. Der Werkstoff soll keine toxischen Stoffe enthalten, die aus der Schicht in die mit dem mehrschichtigen Membrantransplantat in Berührung stehenden Gewebe diffundieren oder aus der Schicht extrahiert werden können. Ferner soll der Werkstoff gegen den enzymatischen Abbau oder sonstigen auf einer Berührung mit anderen Schichten der Membran oder mit Gewebe beruhenden Abbau widerstandsfähig sein, der zur Bildung von Stoffen führen könnte, die für das benachbarte Gewebe toxisch sind.

Ebenso wie die erste Schicht soll auch die Schicht, die in erster Linie die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuert, noch andere vorteilhafte Eigenschaften aufweisen. So ist es wünschenswert, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht an der nassen Oberfläche der ersten Schicht mit einer Bindungsscherfestigkeit;von mindestens etwa 0,7 und vorzugsweise etwa 7 kg/cm anhaftet. Ebenso ist es wünschenswert, dass sie einen Young^rsehen Modul im Bereich von etwa 7 bis

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kg/cm , eine Bruchfestigkeit von etwa 7 bis 70 kg/cm und

eine Bruchdehnung von etwa 20 bis 100 % aufweist.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht sterilisationsfähig ist, d.h. physikalischen oder chemischen Behandlungen unterworfen werden

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kann, durch die Bakterien oder Bakteriensporen an der Oberfläche abgetötet werden. Geeignete Sterilisierungsmethoden sind trockene Wärme, Einwirkung von Äthylenoxid·, Bestrahlung, Eintauchen in Glutaraldehydlösung usw.

Es ist auch wünschenswert, dass der Werkstoff der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht, wenn er in flüssiger oder halbflüssiger Form auf die erste Schicht aufgetragen wird, in die erste Schicht zu nicht mehr als etwa 20 Gewichtsprozent der fertigen, halbfesten oder festen gehärteten Form der ersten Schicht eindringt Ein weiteres Eindringen ist schädlich, weil die Porosität der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht dadurch beträchtlich abnehmen und infolgedessen der Feuchtigkeitsdurchtritt durch die letztgenannte Schicht und die sich in ihr abspielenden Wiederherstellungsvorgänge, wie das Einwachsen von Gewebe, Gefässbildung usw., behindert werden wurden.

Schliesslich ist es auch erwünscht, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht Widerstandsfähigkeit gegen jeden Abbauproze.ss aufweist, der durch die Nähe oder den Kontakt dieser Schicht mit angrenzenden Schichten oder Gewebe hervorgerufen wird und zu einer bedeutenden Beeinträchtigung der oben erwähnten biologischen, mechanischen und chemischen Eigenschaften führen würde.

Gewisse synthetische polymere Stoffe genügen den wesentlichen und auch vielen der erwünschten Eigenschaften der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht. Zu diesen gehören Siliconpplymere, wie "Silastic Medical Adhesive" (Dow Corning), ein Gemisch aus einem·Siliconpolymeren mit endständigen Hydroxylgruppen und Methyltriäthoxysilan, das unter dem Einfluss von Feuchtigkeit zu einer biegsamen, zähen Schicht erhärtet, die sehr gut an den Werkstoffen der ersten Schicht, wie vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbund-

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produkten, anhaftet, Polyacrylsäure- oder Polymethacrylsäureester oder deren Copolymere, wie der aus einem Copolymerisat aus Acrylsäureäthylester und Acrylsäure gebildete Acrylkautschuklatex, der auf den Werkstoffen der ersten Schicht einen biegsamen Film bildet und Carboxylgruppen enthält, die mit den Hydroxylgruppen der vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte unter Bildung starker Bindungen reagieren, Polyurethane, wie ein Reaktionsprodukt von überschüssigem Toluylendiisocyanat mit einem Gemisch aus Diolen und Triolen, welches ein reaktionsfreudiges, unter der Einwirkung von Feuchtigkeit aushärtendes Prepolymeres darstellt, das imstande ist, auf vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten eine elastomere Schicht zu bilden, und das chemische Gruppen aufweist, die mit Aminogruppen oder Hydroxylgruppen solcher Verbundprodukte reagieren. Der Fachmann ist imstande, durch Routineversuche andere Stoffe zu ermitteln, die sich als Werk-, stoffe für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht eignen.

Ein Siliconpolymeres wird für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht bevorzugt. Es ist als nicht-toxisches Produkt in einem sorgfältig gesteuerten medizinischen Gütegrad erhältlich. Sein Fliessvermögen ist von thixotroper Art, so dass es sich gleichmässig mit der Rakel auf die Oberfläche der Schicht aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt mit einer gesteuerten Eindringtiefe in die letztgenannte Schicht auftragen lässt. Die Härtung kann bei 100 % relativer Feuchte erfolgen, wodurch die Dehydratisierung der unteren, aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bestehenden Schicht und die Verformung des mehrschichtigen Gebildes verhindert wird. Das Siliconpolymere erhärtet durch Umsetzung mit Hydroxylgruppen, und da die aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid- Verbundprodukt bestehende Schicht Hydroxylgruppen enthält, können sich genügend kovalente Bindungen zwischen den Schichten bilden, so dass -diese zufriedenstellend

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aneinander anhaften und kein Klebstoff erforderlich ist, um " die Siliconpolymerschicht an die aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bestehende Schicht zu binden.

Mehrschichtige Membranen können auch unter Verwendung eines unter der Einwirkung von Feuchtigkeit aushärtenden,Siliconelastomeren als Bindemittel zwischen der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht und einem anderen Material hergestellt werden. Durch Aufbringen eines dünnen (0,025 bis 0,05 mm dicken) Films auf einen Film aus synthetischen Polymeren, wie den segmentierten Polyurethanen, Methacrylsäurehydroxyäthylester oder anderen "Hydrogelen", Polyethylenterephthalat oder PoIytetrafluoräthylen, oder aus modifizierten natürlichen Polymeren, wie Celluloseacetat, oder aus natürlichen Polymeren, wie Elastin (dem faserförmigen, unlöslichen, nicht-kollagenarti-"■ gen Protein, das in Bindegewebe, wie der Brustaorta und dem Nackenband,vorkommt), kann man ein mehrschichtiges Verbundprodukt durch 16- bis 24-stündiges Aushärten bei Raumtemperatur und 100 % relativer Feuchte erhalten.

Wenn eine mechanische Verstärkung erwünscht ist, kann man eine - Schicht aus Gaze oder anderem Textilstoff oder Netzwerk verwenden. Baumwolle oder ein sonstiges Textilnetzwerk kann als Verstärkungsmaterial eingelagert werden, indem man den Textilstoff über das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt legt und über dem Textilnetzwerk auf die Oberfläche der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht mit der Rakel das ^llSilasticⁿ-Silicon aufträgt. Durch Aushärten Übernacht (16 bis 24 Stunden) bei Raumtemperatur und 100 % relativer Feuchte kann man einen verstärkten Schichtstoff erhalten, der etwas steifer ist als ein Schichtstoff ohne das Textilnetzwerk, aber eine wesentlich verbesserte Zugfestigkeit aufweist.

Die Dicke der synthetischen Haut steht zu den folgenden Parametern in Beziehung: (1) der Dicke der zu ersetzenden Haut,

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(2) der Art und den Abmessungen der Wunde, (3) der Dicke der zur Steuerung der Feuchtigkeitsdurchlässigkeit erforderlichen. Deckschicht und (4) der Beziehung zwischen Nähbarkeit und Dicke.

Im Falle von Meerschweinchenhaut von voller Dicke beträgt die mittlere Dicke der ausgeschnittenen Haut 0,64 bis 0,75 mm. Schichtstoffe zum Ersatz von Meerschweinchenhaut weisen eine Schicht aus Kollagen-Chondroitin-6-sulfat von einer Dicke von 0,38 mm und eine Schicht aus dem Siliconpolymeren von einer Dicke von 0,13 mm auf., Diese Kombination liefert die gleiche Feuchtigkeitsdurchtrittsgeschwindigkeit wie Meerschweinchenhaut und lässt sich bei Transplantationsversuchen leicht an den Umfang des Wundbettes annähen.

Die niedrigste erreichbare Grenze der Dicke der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht hängt von der Teilchengrösse der Kollagen-Mucopolysaceharid-Verbundprodukte ab und liegt typischerweise im Bereich von 0,04 bis 0,05 mm. Die obere Grenze der Dicke richtet sich nach der beabsichtigten Anwendungsart, und in der Praxis sind unbegrenzt grosse Dicken verfügbar, deren Grösse von der Menge der Dispersion abhängt, die auf einer gegebenen Filterfläche abfiltriert wird. Nach dem hier beschriebenen Verfahren lassen sich Dicken von 2,5 bis 5 nun leicht erreichen; jedoch werden für die Anwendung als Hautersatz Dicken im Bereich von 0,64 bis 2,5 mm bevorzugt.

Andererseits wird die Dicke der Deckschicht von der gewünschten Feuchtigkeitsdurchlässigkeit und Wasserdampfdurchlässigkeit des Polymeren bestimmt, das zur Herstellung der Deckschicht verwendet wird. Im Falle von "Silastic Medical Grade¹¹-Silicon besteht eine typische mehrschichtige künstliche Haut von dem gewünschten Bereich der Feuchtigkeitsdurchlässigkeit aus einem 0,13 mm dicken Siliconfilm, der auf eine 0,38 mm dicke Schicht aus Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt

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aufgetragen ist. Wenn man Polymere mit niedrigen Wasserdampfdurchtrittsgeschwindigkeiten verwendet, muss die Dicke der
die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht entsprechend verringert werden.

Die hier beschriebenen mehrschichtigen Membranen eignen sich als Verbände zur Behandlung von Brand-, Schnitt-, Riss-,
Schürfwunden und anderen ähnlichen Zuständen, bei denen Verletzung oder Zerstörung von Haut durch mechanische, thermische, chemische oder sonstige äussere Schädigung durch örtliche oder allgemeine Krankheiten gegeben ist. Die Membranen selbst können auch als künstliche Transplantate verwendet
werden, in welchem Falle sie die Funktionen von normaler Haut ersetzen und eine Schablone (template) für die Zellenregenerierung bilden.

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Beispiel

Herstellung von Kollagendispersionen und Mucopolysaccharidlösungen

Das in diesem Beispiel verwendete Kollagen -wurde"hergestellt, indem gekalkte Kalbshäute in Streifen von 9,5 mm Breite und dann zu dünnen Stücken zerschnitten wurden. Diese dünnen Hautstücke wurden mit 3 Teilen Wasser behandelt, die 0,3 % Propionsäure und 0,1 % Benzoesäure enthielten, iiach 4 Stunden hatte sich ein Gleichgewicht eingestellt, und die Lösung hatte einen pH-Wert von ungefähr 5,3. Die Kollagenaufschlämmung wurde von dem Wasser getrennt und mit Hilfe eines zentrifugal wirkenden Schneid- und Mahlgeräts zu Produkten von unterschiedlichen Teilchengrössen und Strukturen vermählen. Die Kalbshautkollagenaufschlämmung (Gewichtsverhältnis von Wasser zu Haut 1:1) hatte einen Gelatinegehalt von etwa 2 %. Ferner enthielt sie 0,41 % Calcium und 0,041 % Magnesium. Physikalisch bestand die Aufschlämmung aus hochgradig verschlungenen Fibrillenaggregaten.

Die Kalbshautkollagenaufschlämmung wurde durch wiederholte Ausfällung aus einer trüben Dispersion in 0,05-molarer Essigsäure mit 0,2-molarer Mononatriumphosphatlösung (Na^PO^) gereinigt. Nach dem Reinigen wurde das Kollagen in 0,05-molarer Essigsäure oder in einer Citronensäure-Pufferlösung von einem pH-Wert von 3,2 (0,1-molare-Citronensäure, 0,2-molares Mononatriumphosphat) dispergiert. Die Dispersion wurde gründlich in einem Waring-Mischer homogenisiert, bis die Extinktion einer .0,3 g Kollagen je 100 ml enthaltenden Dispersion bei 440 mu, bestimmt mit einem Spektrophotometer (CoIeman Junior ■II A, Maywood, Illinois), 0,5 betrüg. Die so erhaltenen Kollagendispersionen wurden bis zur Weiterverarbeitung bei 4 C gelagert . . . -

Mucopolysaccharidlösungen wurden aus Natriumheparin, Hyaluron-: säure bzw. Chondroitin-6-sulfat hergestellt. Das Natrium-

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heparin, aus Schweinedarmschleimhaut'gewonnen, mit 143 U.S.P.-Aktivitätseinheiten je mg wurde von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, erhalten. Die Hyaluronsäure wurde aus Hahnenkamm nach der von D.A*. Swann in "Biochim. 3iophys. Acta", 136, 17 (1968),"beschriebenen Methode hergestellt. Die so erhaltene Hyaluronsäure enthielt 47,1 % Hexuronsäure und 42,6 % Hexosamin. · ' ■

Chondroitin-4-sulfat aus Rindernasenknorpel wurde nach der Methode hergestellt, die von L. Roden, J.R. Baker, J.A. Cifonelli und" M.B. Mathews in "Methods .of Enzymology", herausgegeben von V. Ginshurg, Band 28B, Verlag Academic Press, New York, Seite 73ι beschriebenist. Heparansulfat und Dermatansulfat wurden aus SchweineSchleimhautgewebe extrahiert und nach den Methoden gereinigt, die von J.A. Cifonelli und L. Roden in "Biochemical Preparations", JU2, 12 (1968),. beschrieben sind. . - .,-.

Chondroitin-6-sulfat, gewonnen aus Haifischknorpel - Gütegrad B, wurde von Calbiochem, San Diego, California, erhalten. Es enthielt 2,66 % Stickstoff * 37 »2 Si Glucuronsäure und 5,61 % Feuchtigkeit. :

Heparin, Hyaluronsäure, Chondroitin-4-sulfat, Heparansulfat, Dermatansulfat und Chondroitin-6-sulfat wurden in einer Konzentration von 1 g je 100 ml in einer Citronensäure-Phosphatpufferlösung (pH 3,2) gelöst. Die Mucopolysaccharidlösungen wurden bei 4° C aufbewahrt. . .

B^i spiel 2

Herstellung von gemeinsamen Niederschlägen aus Kollagen und Heparin sowie aus Kollagen und Hyaluronsäure ■

Eine Dispersion von 0,3 g Kollagen je 100 ml 0,05-molarer Essigsäure wurde bei .23^Q C mit einem Polytetrafluoräthylenrüh-

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rer gründlich gerührt. Während des Mischens der Dispersion wurde Heparin "bzw. Hyaluronsäure in einer Konzentration von 1 g je 100 ml 0,05-molarer Essigsäure aus einer Bürette mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/sec zugetropft. Beim Zusatz des Mucopolysaccharids wurde das Kollagen in Form einer verschlungenen Masse aus mit Mucopolysaccharid beschichteten Kollagenfibrillen mitgefällt, die einem Garnknäuel ähnelte. Sobald 90 Gewichtsprozent Kollagen mit 10 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid in dieser Weise gemeinsam ausgefällt worden waren, zeigte eine systematische Massenbilanz, dass 95 $£ des ursprünglichen Mucopolysaccharids mitgefällt worden waren.

Nach der gemeinsamen Ausfällung wurde die verschlungene Fi- . brillenmasse im'Waring-Mischer homogenisiert, bis die Fibril-· len etwa -1 mm lang waren. Das Gemisch aus Fibrillen in 0,05-molarer Essigsäure trennte sich, wenn es langer als 5 Hinuten ruhig stehengelassen wurde, in zwei Phasen, weswegen es vor dem Filtrieren gemischt werden musste. Die Kollagen-Mucopolysaccharid-Dispersion wurde durch eine Nutsche, auf der sich ein Filterpapier von Schleicher und Schuell (Keene, New Hampshire) Nr. 576 befand, abgesaugt. Der gemeinsame Niederschlag wurde unter atmosphärischen Bedingungen dehydratisieren gelassen, bis der Feuchtigkeitsgehalt etwa 20 Gewichtsprozent betrug.

Beispiel 5

Herstellung von gemeinsamen Ausfällungen

von Kollagen und Chondroitin-6-sulfat " \

Eine Dispersion von 0,3 g Kollagen je 100 ml Citronensäure-Phosphatpufferlösung (pH 3,2) wurde bei 23° C mit einer 1 g Chondroitin-6-sulfat je 100 ml Pufferlösung (pH 3,2) von 23° C gemeinsam ausgefällt. Der Niederschlag wurde gemäss Beispiel 2 homogenisiert, filtriert und an der Atmosphäre trocknen gelassen. ...

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Beispiel 4

Aldehydvernetzung eines Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukts '

Die nach Beispiel 3 hergestellte gemeinsame Ausfällung von Kollagen-Chondroitin-6-sulfat wurde durch Eintauchen in "eine 0,02-molare Lösung von Glutaraldehyd vernetzt. Durch diese Behandlung wurde ein Bruchteil der Polysaccharidkomponente auf den Kollagenfibrillen oder -molekülen immobilisiert. Die Vernetzung machte sich daran bemerkbar, dass es nicht gelang, das Polysaccharid aus dem mit dem.Aldehyd behandelten Film durch längeres Auswaschen mit einer Phosphatpufferlösung, die 0,4-molar an Natriumchlorid war und einen pH-Wert von 7,4 aufwies, und die als Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat bekannt ist, zu entfernen» Nicht-umgesetzter Aldehyd wurde durch Behandeln mit einer Lösung von 5,5-Dimethylcyclohexandion-(1,3) (Dimedon) entfernt. Nach dem Verdampfen des Wassers hinterblieb ein Film, der bis etwa 10 Gewichtsprozent Polysaccharid enthielt. . - ■ ,

Beispiel 5 ■ " ...

Dehydrothermische Vernetzung von Kollagen-Chondroitin-6-sulfat

Das Produkt des Beispiels 3 wurde in einem Vakuumofen 48 Stunden der Einwirkung einer Temperatur von 115° C und eines Vakuums von mindestens 0,3 mm. Hg ausgesetzt. Nach dieser Behandlung Hessen sich.weniger, als 10 Gewichtsprozent des ursprünglich in den Film eingelagerten Polysaccharids durch 48-stündiges Eintauchen in destilliertes Wasser, welches als Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat bekannt ist, entfernen.

Beispiel 6 Hexosaminanalyse und Molekulargewicht zwischen den Vernetzungsstellen ' - .

Da Mucopolysaccharide hexosaminhaltige Polymere sind, steht der Hexosamingehalt in direkter Beziehung zu der Menge des je-

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weiligen Mucopolysaccharide in einem Verbundprodukt. Sobald erst einmal die Beziehung zwischen dem Hexosamingehalt und dem Gewicht für ein jedes Mucopolysaccharid festgestellt worden ist, ist die Bestimmung einfach. Die Analyse ist im einzelnen in der Doktorarbeit von C. Huang, Meeh. Eng.. Dept., M.I.T., Cambridge, Massachusetts, Kapitel 3, 4 (1974), beschrieben. Die Methode kann folgendermaßen zusammengefasst werden: Eine bekannte Gewichtsmenge des 48 Stunden bei 105 C im Va- kuum getrockneten Verbundprodukts wird in eine'5 ml fassende Ampulle eingebracht und mit 1 ml 8-molarer Salzsäure versetzt. Die Ampulle wird evakuiert, dann mit Stickstoff gespült und unter Vakuum zugeschmolzen. Die Hydrolyse beginnt, wenn die Ampulle in einen Ofen mit Luftumlauf bei 95° C eingesetzt wird. Nach 4-stündigem Verweilen bei 95° C wird die Ampulle mit Leitungswasser auf 10 C gekühlt. Dann wird der Inhalt bei 40 C zur Trockne eingedampft, bis nur noch trockenes Hydrolysat hinterbleibt. Das Hydrolysat wird in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von etwa 50 bis 150 mg Mucopolysaccharid je ml Wasser gelöst. 1 ml der Hydrolysatlösung wird zu 1 ml einer 8-volumprozentigen Lösung von Acetylaceton in 1-molarer Natriumcarbonatlösung zugesetzt. Bei 1-stündigem Erhitzen auf 95 C reagiert das in dem Hydrolysat enthaltene Hexosamin mit dem Acetylaceton in alkalischer Lösung unter Bildung von Pyrrolderivaten. Nach dem Kühlen der Lösung auf 10° C. setzt man 5 ml 95-prozentiges Äthanol und 1 ml Ehrlichsches Reagens [hergestellt durch Lösen von 1,33 g p-Dimethylaminobenzaldehyd (DAB) in 50 ml 6-molarer Salzsäure und Zusatz von' 50 ml 95-prözentigem Äthanol] zu und mischt dann gründlich. Die Reaktion zwischen dem DAB und den Pyrrolderivaten führt zur Bildung eines "Chromophors, welches dem Produkt eine intensive rote Farbe verleiht. Nach 2-stündigem Stehenlassen der Mischung wird" die Extinktion bei 527 mu gegen eine Reagens-Leerprobe mit Hilfe eines Coleman Junior II A-Spektrophotometers gemessen. Die Ergebnisse der Analyse werden mit genormten Eichkurven für ein jedes Mucopolysaccharid verglichen.

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Die Ergebnisse der Hexosaminanalyse verschiedener vernetzter Kdllagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die nach den Verfahren der vorhergehenden Beispiele hergestellt worden sind, finden sich in Tabelle I. Der Mucopolysaccharidgehalt vor dem Vernetzen betrug für jedes in Tabelle I aufgeführte Verbundprodukt etwa 10 ?6. Offenbar sind während des Vernetzens mit GIutaraldehyd und beim nachfolgenden Waschen grosse Mengen an Mucopolysaccharid verlorengegangen. Dies bedeutet, dass die Löslichkeit der unvernetzten Mucopolysaccharide in der wässrigen Glutaraldehydlösung, in die sie zum Zwecke der Vernetzung eingetaucht v/erden, hoch ist. Bei der dehydrothermischen Vernetzung wurden nur höchstens 10 % Mucopolysaccharid ausgewaschen, während bei der Vernetzung mit Glutaraldehyd bis zu 61 % ausgewaschen wurden.

Die mechanischen Eigenschaften der Verbundprodukte werden stark von der Anzahl der Vernetzungsstellen je Polymerkette beeinflusst. Das Molekulargewicht zwischen Vernetzungsstellen (M₀) ist umgekehrt proportional der Anzahl der Vernetzungsstellen je Volumeneinheit. Die Werte für M_ können durch Messen des Spannungs-Dehnungsverhaltens der thermisch denaturierten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte bestimmt werden. Diese Methode ist in dem Werk "The Physics of Rubber Elasticity" von L.R.G. Treloar, 2.Auflage, Verlag Clarendon Press,(1958), beschrieben. Eine Zusammenfassung der Versuchsergebnisse für verschiedene Kollagen-Mucopolysaccharid^Verbundprodukte findet sich in Tabelle I.

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Tabelle, I
Material Vernetzung % MPS

Kollagen Kollagen-Η Kollagen-Η Kollagen-Η

Kollagen-Η Kollagen-CS-6 Kollagen-CS-6 Kollagen-HA Kollagen-HA

G	(24,	7,4)	C)	0,0
G	(24,	3,2)		5,7-1,2
G	(48,	7,4)	C)	5,5-1,3
G	(24,	3,2		4,oii,o
	24,	7.4)	C)
D	(48,	90°	9,7±1,0
G	(24,	3,2)	3,9^0,3
D	(48,-	90°	9f6±1,1
σ	(24,	7,4)	2,3^0,4
D	(48,	90°	9,0^0,5

'2631909	- io so
Mc C-	500
1	400
9	200
. 1	800
1	800
2	800
6	200
1	200
2	500
2

G = Glutaraldehyd bei 23° C (Stunden, pH)

D = dehydrοthermisch (Stunden, Temperatur)

H = Heparin

CS-6 = Chondroitin-6-sulfat

HA = ■■ Hyaluronsäure

MPS = Mucopolysaccharid

Beispiel

Durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysacchariden
hergestellte Verbundprodukte

Es wurden Mucopolysaccharidlösungen durch Lösen von 40 mg des betreffenden Mucopolysaccharids in 20 ml Citronensäure-Phosphatpuffer (pH 3,2) hergestellt. Ein Stück einer unlöslichen
Kollagenfolie wurde dann zu jeder der Mucopolysaccharidlösungen zugesetzt und,das Ganze· auf einer konstanten Temperatur
von 37° C gehalten und 24 Stunden inkubieren gelassen.. Dann
wurde zu der Lösung Glutaraldehyd bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,025 Mol/l zugesetzt. Das Kollagen wurde weitere 24 Stunden in dieser Lösung belassen und dann in eine auf
einem pH-Wert von 7,4 gehaltene, 0,025-molare Lösung von GIu-

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taraldehyd überführt. Die letztere Verfahrensstufe wurde durchgeführt, um eine wirksame Vernetzung des Kollagens zu gewährleisten. Nach 24-stündigem Verbleiben in der Glutaraldehydlösung wurden die Kollagenfasern zweimal mit destilliertem V/asser gesprült und in eine 0,2-gewichtspfozentige Lösung von Dimedon überführt, um den Überschuss von nicht-umgesetztem Aldehyd zu entfernen. Nach weiterem 24-stündigem Verbleiben in der Dimedonlösung wurden die Fasern fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 4 C in Citronensäure-Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,4 aufgehoben. Die gewichtsprozentuale Menge von Mucopolysaccharid, die sich an das Kollagen gebunden hatte, wurde durch Hexosaminanalyse bestimmt. Das Molekulargewicht M" '·. zwischen den Vernetzungsstellen wurde nach dem von R.L.G. Treloar in "The Physics of Rubber. Elasticity", 2.Auflage, Clarendon Press (1958), beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle II.

	Tabelle	II	.t.
	Material % MPS (ίθ	,5) .	' 3 800
	Kollagen . O		4 100"
	Kollagen-CS-6 11,3		4 000
	Kollagen-CS-4 8,7		4 200
	Kollagen-HA ' 8,2		3-90.0
	Kollagen-DS - 8,2		3 800
	Kollagen-H · 8,7		·;■■■ 3 800
	Kollagen-KS 10,5		= Dermatansulfat .
CS-6	= Choridroitin-6-sulfät	DS	= ·Heparin
CS-4	= Chondroitin-4-sulfat	H-	=.. Keratansulfat
HA	= Hyaluronsäure	KS
MPS	= Mucopolysaccharid	■"■·''- .

-37 -

609886/0338

Beispiel 8

Enzymatischer Abbau von durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharid hergestellten Verbundprodukten

Es wurde eine Untersuchung des enzymatisehen Abbaues von nach Beispiel 7 durch Beschichten von Kollagenfasern mit Mucopolysaccharid hergestellten Verbuhdprodukten durchgeführt. Die mit Mucopolysaccharid beschichteten Kollagenfolien wurden in Bandform in Gegenwart einer Lösung von Kollagenase -(40 Einheiten je ml) um 4,0-0,5 % gedehnt-, und die auf das Band ausgeübte Kraft als Funktion der Zeit registriert. Es wurde gefunden, dass die Kraft durch eine einzige negative Exponentialgrösse der Zeit dargestellt v/erden kann und daher ein Diagramm der Abhängigkeit des Logarithmus der Kraft von der Zeil: eine gerade Linie ergibt. Die Steigung der Geraden ergibt 1/τ, einen Wert, der als Maß für die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaues des Kollagens durch Kollagenase venvendet wird. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle III.

T a b e 1 1 e III

	*	Λ/Κ χ 104 (-0,07)
Material	% MPS (ίο,5)	(min"1)
Kollagen	0	8,48
Kollagen-CS-6	11,3 .	1,46
Kollagen-CS-4	. 8,7	0,88
Kollagen-HA	8,2	. 5,38
Kollagen-DS	8,2	0,90
Kollagen-H	8,7	0,98 .
Kollagen-KS	10,5	1,10

- 38 -

60 9886/0338

Beispiel 9

Enzymatiseber Abbau von durch gemeinsame Ausfällung von Kollagen und Chondroitin-6-sulfat hergestellten Yerbundprodukten

Nach dem Verfahren des Beispiels 4 aus Kollagen und Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundprodukte wurden auf

ihre Anfälligkeit für den Abbau durch Kollagenase untersucht. Hierbei wurde die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Methode mit dem Unterschied angewandt, dass der Dehnungsgrad 20-2 % betrug. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

. T a b e 1 le IV ·

% CS-6 (-0,2)

1,8

3,0

4,8

6,5

8,6 11,2 13,3

14,9 . 16,0

Beispiel 10 " - .

Mechanische Eigenschaften von vernetzten Kollagen- . - ■ Mucopolysaccharid-Verbundprodukten

Die mechanische Untersuchung erfolgte mit einem Instron-Zugfestigkeitsprüfgerät unter Verwendung einer Belastungszelle vom Typ B. Von jedem zu untersuchenden Material wurden hanteiförmige Proben von 6,35 mm Breite und 0,25 mm Dicke hergestellt. Das obere Ende einer jeden Probe wurde an der BeIa-

ν " ■

. ■ : \ ■ -'39. - - ■ ■-. ■;■■■·-.■■.. 609886/0338 .

	1/ε χ ίο2 (±ο,οο9)
Mr (±1000)	(min"1)
15 000	0,255
14 000	0,149
12 000	0,153
13 000	0,093
11 000	0,084
9 000	0,049
10 000	'- ' - 0,052 - ' "
12 000	0,047 .
11.000	0,064
14 000	0,067

stungszelle des Zugfestigkeitsprüfgerätes befestigt, während das untere Ende durch eine Klemmvorrichtung an der Gleitbacke befestigt wurde. Die Dehnung der Probe wurde aus der Bewegung der Gleitbacke berechnet. Alle Messungen wurden bei konstanter Dehnungsgeschwindigkeit von 50 %/mln unter Spannung bei 37° C in einer Citronensäure-Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,4 durchgeführt.

Für jedes Material wurden aus der experimentellen Spannungs-Dehnungskurve die Werte für die Kraft je Flächeneinheit beim Bruch oder die Bruchfestigkeit (U.T»S.), die Tangente an der Spannungs-Dehnungskurve bei 1-prozentiger Dehnung (1 %-Tangentenmodul), die Bruchdehnung (E.B.) und die zum Bruch erforderliche Arbeit (Brucharbeit) berechnet.

Die Ergebnisse finden sich in Tabelle V.

- 40 -

609886/0338

. Tabelle

Material · .

Vernetzung

(24,

90

7,

0O

% MPS

_

1 %,Tangen

; .U.T.S.,

E.-B. ,·

Bruch

A

4

Brust-Aorta

(48,

90

3,

0O

_

9200

tenmodul ',

kg/cm

arbeit 2

5

Kollagen

D

(0,25,·

3,

7,4)

0,0

6500 '

kg/cm

. 25,2

.85

Kollagen

D

(24,

90

4

0,0

3800

3,5 ' ·

.26,6*0,7

40*10

Kollagen '

G

(24,

7,

2) \

■ ο,ο

1200 '

.'16,45*3,5·

36,75*4,55

45*5"

kg/cm -%

N3 CD

Kollagen

G

(48,

3,

2)

0,0

9400

. 35*4,55 .'

' 23,4*3,57

15*2

*10 %

CO

Kollagen-H

G

(48,

3,

0C)

5,7*1,2

6800

66,5*7 '.

25,13*0,77

10*1

1470

CD

Kollagen-H

G

(24,

7,

4)

5,7*1,2..

2800

126*14

'9,1*1,4

23*2

616

O CD

cn ο

Kollagen-H

D

(24,

90

2)

9,7*1,0

1800

14,2*2,1

11,2*1,4

16*2

756

co OO ,

Kollagen-H ·

G

(48,

90

2) ■■

5,5*1,2·

6800

33,25*4,9

30,1-2,8

35*1 '

. 350

CO ' σ> *»

Kollagen-CS-6

. G

(24,

G . <=>■ Glutaraldehyd oei

4)

3,9*0,3

5500

21*0,7

'26,6*3,5

.14*3-

133

ο ι

Kollagen-CS-6

G

(48,

0O

3,7*0,3

2500

133*42 .

• 9,1*0,7

21*2

84

CO

Kollagen-CS-6

G

(48,

0C):.

.3,5*0,3

1200

. 24*8,4

6,44*2,8

16±2

77

CO. . , ' GO

Kollagen-CS-6."".

D

230C.

9,6*1,1

2500.

15,8*0,7.

9,31*2,1

11*3

371

Kollagen-HA . ·. ' I

D

9,0*0,5

(Stunden, pH)

17,7*6,44

44,17*1,96

20*1

224

D β dehydrοthermisch (Stunden, Temperatur) .

49*4,55

34,3*4,9 ·

20*1

' 77

MPS ss' Mucopolysaccharid

30,1*2,8

β Hyaluronsäure

57,

H · ■» Heparin

HA

45,

■-■■'■■ .''.·.'·

CS-6

497

'.,'.■

U.T.

266

E.B.

= Chondroitin-6-sul.fat

S. = Bruchfestigkeit

= Bruchdehnung

Beispiel 11

Erhöhte Zähigkeit auf Grund der Einlagerung von Mucopolysacchariden

Ein Vergleich von Proben aus Kollagen und aus vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten bei ähnlichem Vernetzungsgrad führt zu der Schlussfolgerung, dass die Anwesenheit des Mucopolysaccharids- die Zähigkeit des Kollagens bedeu^- tend erhöht. Beispielsweise ist die Brucharbeit für aus der vorhergehenden Tabelle ausgewählte Stoffe bei ähnlichen Vernetzungsdichten in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Brucharbeit, •Material 'JiMPS " M„ kg/cm²-% ^1O %

Kollagen 0,0 1200 133 Kollagen-CS-6 9,6-1,1 1200 497

¥ie sich aus der Tabelle ergibt, wird durch die Einlagerung von etwa 10 Gewichtsprozent Chondroitin-6-sulfat in Kollagen die Brucharbeit von 133 auf 4.97 kg/cm -% erhöht. Da die Bruch arbeit bei einem M-Wert von etwa 6500 maximal ist, ist es wahrscheinlich, dass ein Verbundprodukt aus Kollagen und" Chondroitin-6-sulfat mit einem Mucopolysaccharidgehalt von •10 Gewichtsprozent und einem M_ von 6500 eine Bruchenergie

• 2

von mehr als etwa 770 kg/cm -%, der höchsten Bruchenergie auf weisen könnte, die für reines Kollagen unter den Bedingungen dieser Versuche festgestellt worden ist.

42

"6 0"9.8 8 67 0 3" 3.8

B e i s ρ i e 1 12

Untersuchung der Yiider Standsfähigkeit gegen Resorption und des Nichtauftretens von Fremdkörperreaktion gegen die Verbundprodukte in vivo

In diesem Beispiel wurden vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharidraembranen, die einerseits durch Beschichten von Kollagen mit je einem der Mucopolysaccharide gemäss Beispiel 7 und andererseits durch gemeinsame Ausfällung von Kollagen mit je . einem der Mucopolysaccharide gemäss Beispiel 2 und 3 hergestellt worden waren, subkutan in Meerschweinchen implantiert, wie nachstehend beschrieben.

Die Kollagen-Mucopolysaccharidmembranen waren durch das Vernetzungsverfahren sterilisiert worden. Das Eintauchen in ein' Aldehydbad (und insbesondere ein Glutaraldehydbad) für eine Zeitdauer von mehreren Stunden, wie in Beispiel 4 beschrieben, ist eine bekannte Methode zum chemischen Sterilisieren verschiedener Stoffe vor dem Implantieren oder sonstigen chirurgischen Verfahren. Ferner ist bekannt,· dass die mehrstündige Einwirkung von Temperaturen, über 100° C eine andere Methode zum Sterilisieren von Stoffen ist, die implantiert oder anderweitig in der Chirurgie verwendet werden so.llen. Vfenn andererseits die Stoffe längere Zeit vor dem Implantieren hergestellt worden sind, sollen sie vorzugsweise unmittelbar vor dem Implantieren durch 24-stündiges Eintauchen in ein Gemisch aus.' 70 % Isopropanol und 30 % Wasser bei 23° C desinfiziert werden. Durch das Eintauchen in diese Flüssigkeit werden weder die Vernetzungsdichte noch andere wichtige Strukturmerkmale der Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte geändert.

Die subkutane Implantation wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Weisse weibliche Hartley-Meerschweinchen- mit ".: einem Gewicht von ungefähr 400 g wurden als Versuchstiere verwendet. Über 7 Tage vor der Implantation hinweg wurde eine Gewichtsänderungsgeschichte für jedes Tier aufgenommen. Kurz vor

609886/0338

der Implantation wurde der Rücken eines Jeden Tieres mit einer elektrischen Haarschneidemaschine in einer Fläche von etwa 6 cm χ 5 cm geschoren, und lose Haarabfälle wurden sorgfältig abgesaugt. Dann wurde das Tier durch Einwirkung eines Gemisches aus Sauerstoff und Halothan anästhesiert und sein Rücken mit einem Gemisch aus 70 % Isopropanol und 30 % Wasser gewaschen. .

Auf einer Seite des Rückens des Tieres wurde ein 2,5 cm langer Schnitt geführt. Der Schnitt wurde so ausgeführt, dass zwischen der Dermis und' dem Panniculus carnosus eine Tasche entstand. In-diese Tasche wurde die Probe so eingesetzt, dass die ganze Probe flach in der Tasche lag. Dann wurde der Schnitt mit" Nylon-Nahtmaterial zugenäht. Um den Schnitt zu schliessen, wurden etwa 5 bis 6 Stiche ausgeführt. Auf der anderen Seite des Rückens des Meerschweinchens "wurde das Verfahren mit einer gleichen Probe wiederholt. Dann wurde die rechte. Seite für histologische Untersuchungen verwendet, während Proben von der linken Seite nach dem Explantieren zur physikalisch-chemischen Kennzeichnung verwendet wurden.

Am 4., 10. bzw» 20. Tag nach der Implantation wurden die Tiere getötet, indem sie in einen Äther enthaltenden Exsikkator eingebracht wurden. Sowohl von den linken als auch von den rech- " ten Implantationsstellen wurden unter der subkutanen Schicht Gewebe quadrate von 3,8 cm χ 3,8 cm derart ausgeschnitten, dass sie implantierten Proben in dem Gewebe verblieben. Das Gewebe von der rechten Seite wurde in 10-prozentige Formalinlösung eingelegt und dann, wie nachstehend beschrieben, für histologische Untersuchungen verwendet. Das Gewebe von der linken Seite "wurde in 50 ml sterile Dulbeccosche Lösung eingetaucht, die einige Tropfen Chloroform (als Bactericid) enthielten, und nicht langer als 24 Stunden vor der Entfernung der Probe unter Kühlung gelagert. ■''.■■■

6 09886/0338

Das Entfernen der Probe in dem Gewebe erfolgte, indem das Ge-. webe auf den Tisch eines schwach vergrössernden Mikroskops (das mit einer Kamera ausgerüstet war) gelegt und das subkutane Gewebe derart von der Dermis abgezogen wurde, dass der. Zustand der Probe in dem Gewebe klar in dem Mikroskop untersucht werden konnte. Dies wurde ermöglicht, indem zuerst ein Schnitt zwischen der Dermis und dem subkutanen Gewebe geführt wurde und die beiden Teile dann vorsichtig mit einer Pinzette voneinander getrennt wurden. Bei Beobachtung im Mikroskop konnten an dem Gewebe und der darin eingebetteten Probe Merkmale, wie die Bindung von Geweben an das implantierte Material, festgestellt werden. Das Entfernen der Probe aus dem Gewebe erfolgte auf dem Mikroskoptisch mit Hilfe einer ,.Pinzette. _: Nachdem das Material aus dem Gewebe entfernt worden war, wurde es bei 4° C in Dulbeccoscher Lösung aufbewahrt, bis es zur Bestimmung der folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften benötigt wurde: ...

1. Die bruchteilmässige (anteilige) Gewichtsänderung der Probe AW/Vi^. Dieser Viert wurde durch Bestimmung des Trockengewichts der Proben (nach 48-stündigem Dehydratisieren bei 1.05° C unter einem Druck von 10 mm Hg) erhalten. Die anteilige Gewichtsänderung wurde dann aus der Gleichung .

■ ¥_Q - W,

berechnet, in der'VL das Trockengewicht der explantierten Pro be und W. das Trockengewicht der Probe vor dem Implantieren bedeutet (der letztgenannte ¥ert wurde unter Verwendung einer Kontrollprobe bestimmt). _; :,

2. Zugmodul E (in frfd/cxa. ). Dieser wurde nach der in Bei-. spiel 10 beschriebenen Methode mit dem Unterschied erhalten, dass der Modul als die Steigung des geraden Teils der Spannungs-Dehnungskurve bestimmt wurde. ■ ·

- Ht -

mischen wurde gemäss Beispiel 4 bestimmt.

3. Molekulargewicht M_ zwischen Vernetzungsstellen. Dieses

Die charakteristischen Eigenschaften von Kollagen-Mucopolysaccharidproben unmittelbar vor der Implantation sowie am 4., 10. und 20. Tag nach der Implantation sind für Produkte, die durch Beschichten von Kollagen mit verschiedenen Mucopolysacchariden vor der Vernetzung hergestellt worden sind, in Tabelle VH und für Produkte, die durch gemeinsame. Ausfällung von Kollagen mit Mucopolysacchariden vor der Vernetzung hergestellt worden sind, in Tabelle VIII angegeben.

- 46 -

60988670338

" · Tabelle VII

Durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharide^ hergestellte Verbundprodukte.

Eigenschaften vor und nach, der Implantation. .

Vor der Eigen- · Implanta- Verweilzeit in vivo

schäften tion 4 Tage 10 Tage 20 Tage

(1) Kollagen

₁ ίο, 04 -0,16^0,04 -0,15-0,04 -0,31-0,04

—9

■^{E X 1}^₂ 3,3^,3 2,5^0,3 1,4±0,3 1,6^0,3 (dyn ·cm~ )

M, χ 10³ 3,8^0,5 6,6^0,5 6,1^0,5 8,6-0,5

(2) Kollagen-Hyaluronsäure .

Δ¥/¥_± 0,00^0,04 -0,12^0,04 -0,30^0,04 -0,28^0,04

—9

^{E X 1}°2 3,5^,3 2,3ίθ,3 1,8^0,3 (dyn-cm )

-0,9-0,3

M₀XiO"*³ 4,2^0,5 7,2±0_f5 6,7^0,5. 8,5-0,5

(3) Kollage.n-Heparansulfat . .

Δ¥/¥_± 0,00^0,04 . -0,06^0,04 +0,04^0,04 +0,38^0,04

—9 ·

^{E X 1}°2 ⁴*0-0i3 . 3,5-0,3 3,8io,5 3,6^0,5

(dyn«cm ) .

M_n x10"³ 3,8Ϊ0,5 4,6ίθ,5 4,7^0,5 4,5-0,5

(4) Kollagen-Heparin

Δ¥/¥_± 0,00^0,04-0,02^0,04 +0,08-0,04 +0,32-0,04

-9 ' ·■■■■."·

^{E X 1}°2 4,2i0,3 3,9^0,3 4,2±0,3 4,3^0,3. (dyn·cm )

M_c χ 10~³ ; 3,8^0,5 4,3-0,5 4,3^,5 3,6ίθ,5

609886/0338

- Fortsetzung der Tabelle VII -

Vor der Eigen- Implanta- Verweilzeit in vivo '

schäften tion 4 Tage 10 Tage 20 Tage

(5) Kollagen-Dermatansulfat .
Δν//¥_± O,OO±O,.O4 -0,09-0,04 -0,05-0,04 +0,31-0,04

^{E x 1}°₂ 3,9-0,3 4,0^0,3 3,oio,3 3,1-0,3 (dyn«cm )

K_n x 10"³ 4,0±0,5 4,9-0,5 5,3^0,5 5,2^0,5

(6) Kollagen-Chondroitin-6-sulfat

Δ%/¥_± O,Ooio,O4 -0,02-0,04 -0,07-0,04 +0,40^0,04

^{Ξ X 1}-2 ⁴»^oi°»3 3,βίο,3 3,2^0,3 3,3^0,3 (dyn«cm~ )

M„ χ 10~³ 4,1^0,5 4,3^0,5 5,7^0,5 5,4^0,5

60 9 8 86/0338

Tabelle- VIII

Durch gemeinsames Ausfällen von Kollagen
mit Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundprodukte;
Eigenschaften vor und nach der Implantation

Eigen- ' Implanta- Verweilzeit in vivo

schäften tion 4 Tage 10 Tage . 20 Tage

(T) Kollagen ·

₁ 0,00*0,02 -0,16*0,02 -0,52*0,02 -0,60-0,02

—8

^{E x 10}_₂ 1,8*0,2. 1,3-0,2 ' 1,4*0,2 0,7*0,2 (dyn»cm~ )

■ M, χ 10"⁴ 1,5-0,1 2,4*0,1. 3,5-0,1 3,8*0,1.

(2) 1,8 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat

Δν//¥_± 0,00*0,02 -0,20^0,02 -0,28^0,02 -0,39-0,2

-8

^{E X 1}-2 ¹»9-0,2 1,5^0,2 . 1,0^0,2 1,0^0,2

(dyn»cm~ ) ■

M^ χ 10"⁴ 1,4-0,1 1,8^0,2 2,9-0,2 3,0^0,2

(3) 4,8 Gew.-$ Chondroitin-6-sulfat

Δ¥/¥_± 0,00*0,02 -0,04*0,02 -0,08*0,02 +0,33*0,2

^{E X} % 1f8*0i² 1,5*0,2 1,2*0,2 1,3*0,2

(dyn«cm ) ^:

Μ_Λ χ 10"⁴ 1,3*0,1 1,5*0,2 2,0*0,2 2,4*0,2

(4) 11,2 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat

Δ¥/¥_± 0,00*0,02 -0,04*0,02 +0,18*0,2 +0,65*0,2

—8

^{E X 1}2p 1,9*0,2 1,6*0,2 .1,6*0,2 1,7*0,2

(dynvcm"" )

M_c χ 10"⁴ 1,0*0,1 . 1,4*0,1 1,3*0,1 1,6*0,1

■ . · - 49 - ■

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Aus den Tabellen VII und -VIII geht hervor., dass in fast ,allen Fällen, in denen Kollagen mit einem Mucopolysaccharid entweder nach dem Beschichten oder nach der gemeinsamen Ausfällung mit einem Mucopolysaccharid vernetzt wurde, der anteilige Gewichtsverlust unterdrückt wurde, woraus sich ergibt, dass der Abbau des Kollagens durch die Umsetzung mit dem Mucopolysaccharid in wirksamer Weise verhindert wurde. Die einzigen Ausnahmen waren mit Hyaluronsäure (einem nicht-sülfatierten Mucopolysaccharid) beschichtetes Kollagen und mit nur 1,8 Gewichtsprozent Chondroitin-6-sulfat gemeinsam ausgefälltes Kollagen; im letzteren Falle wurde der anteilige Gewichtsverlust des Kollagens nicht vollständig verhindert, sondern nur verzögert. In allen anderen Fällen kehrte sich ein gelegentlieber sehr geringer anfänglicher Gewichtsverlust, der möglicherweise auf die Entquellung der implantierten Probe zurückzuführen war, gewöhnlich am 10. Tage um, bis das Implantat am 20. Tage schwerer als zur Zeit der Implantation war. Die Ge-₅ v/ichtszunähme des Implantats war auf das Anhaften einer gewissen Menge des umgebenden Gewebes an dem Implantat zurückzuführen, wenn das letztere aus dem Versuchstier entfernt wurde. Das an dem Implantat anhaftende Gewebe wurde analysiert, wobei sich herausstellte, dass es fast vollständig aus Kollagen bestand, eine Beobachtung, die zeigt, dass durch die Zellen in den umgebenden Geweben neues Kollagen synthetisiert worden war. Daher verhinderte die Reaktion mit sulfatierten Mucopolysacchariden nicht nur den Abbau des Kollagens, sondern führte auch zur Bildung eines Verbundproduktes, welches imstande war, die Synthese von neuem Bindegewebe auf seiner Oberfläche durch, die Zellen in dem umgebenden Gewebe hervorzurufen.

Der Schutz gegen Resorption, den das Kollagen durch.die Umsetzung mit sulfatierten Mucopolysacchariden erhält-, - aussert sich auch in der Verhinderung einer wesentlichen Abnahme des Moduls E und einer Abnahme der Vernetzungsdichte (Erhöhung von M_c), die bei Kollagen selbst oder bei einem Verbundprodukt aus

- 50-

609886/0338

Kollagen und Hyaluronsäure beobachtet wird. Die Aufrechterhaltung von E und M_ auf verhältnismässig konstanten Höhen (innerhälb der experimentellen Unsicherheitsgrenzen) bis zum 20. Tage nach der Implantation von Verbundprodukten aus Kollagen und einem der sulfätierten Mucopolysaccharide ist ein Anzeichen für ein vernetztes makromolekulares Netz, welches in dem Gewebe des lebenden Tieres mindestens 20 Tage intakt bleibt.

An dem aus der rechten Seite des. Versuchstieres am 4., 10. und 20. Tage entnommenen Gewebe-Implantatblock wurden histologische Untersuchungen durchgeführt. Zur Herstellung der Proben für die histologische Untersuchung wurde das folgende genormte Verfahren angewandt:

1. Das Gewebe wurde mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur in 10-prozentigem Formalin (Fischer Scientific Co.', NJ). fixiert. : .- ^; ' '

2,- Dann wurde es durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in Gemische aus Wasser und Äthylalkohol mit Alkoholgehalten von ". 50 %, 70 %; 85 %, 95 % bzw. 100 % dehydratisiert, wobei die" Dauer des Eintauchens in ein jedes Gemisch 1 Stunde betrug.

3. Dann wurde das Gewebe 2 Stunden in Dioxan getaucht, bevor es in ein Gewebe-Einbettungsmedium (Paräplast; F. 56-57°C; Cur tin Scientific Co"., Houston, Texas) eingebettet wurde. Das Einbetten erfolgte, indem das. Gewebe zunächst 4 Stunden in das auf 58 C gehaltene geschmolzene Paraffin eingebracht wurde, wobei das Paraffin stündlich ausgewechselt wurde. Dann wurde das. Gewebe in eine Form eingelegt und in einen frischen Ansatz von Paraffin eingebettet. . · V" .

4. ' Der das Gewebe enthaltende Paräffinblock wurde dann

-20 Minuten in einem zerkleinertes Eis enthaltenden Bad auf 0° C

609886/03 38

gekühlt und auf einem Mikrotom (Minot Custom Microtome; International Equipment Co., Needham Heights, MAj montiert. Scheiben des das Gewebe enthaltenden Paraffins wurden mit dem Mikrotom auf Dicken von etwa 6 ^u geschnitten.

5. Die mit dem Mikrotom geschnittene Probe wurde dann auf einem klaren Mikroskop-Objektträger montiert und durch je 3 Minuten langes Eintauchen der montierten Probe'in zwei Ansätze von Xylol von Paraffin befreit.

6. Dann wurde die Probe durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in Gemische aus Wasser und Äthylalkohol mit Alkoholgehalten von 100 %, 95 %, 85 %, 70 >, 50 % bzw. 0 % dehydratisiert, wobei die Eintauchzeit in jedes Gemisch 1 Stunde betrug. Schllesslich wurde die Probe gründlich mit destilliertem Wasser gespült. .

7. Dann wurde die Probe 5 Minuten mit Hämatoxylin gefärbt und kurz mit destilliertem Wasser gespült. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Spülen der Probe mit 0,5-prozentigem Säurealkohol (70 % Äthylalkohol in konzentrierter Salzsäure) entfernt. Schliesslich wurde der Säurealkohol durch Spülen der Probe und 1/2-stündiges Eintauchen in Wasser ausgewaschen.

8. Die Probe wurde sodann 3 Minuten in 0,5-prozentiger wässriger Eosinlösung'gefärbt und hierauf fünfmal mit frischem Wasser gespült. . ^ :

9. Die Probe wurde, wie für Stufe (2) beschrieben, dehydratisiert und dann einige Male mit Xylol gewaschen..

10. Hierauf wurde die Probe mit Hilfe eines bleibenden Montiermittels (Harleco Synthetic Resin; Hartman-Leddon Co.,". Philadelphia, PA) auf einem reinen Deckglas montiert.

- 52 -

609886/033 8

11. Das die gefärbte Probe aufweisende Deckglas wurde unter dem Mikroskop untersucht.

Die histologischen Untersuchungen zeigten, dass das Ausmaß und die Stärke von chronischer Entzündung in dem das Kollagenimplantat umgebenden Gewebe stetig abnahm, wenn der Chondroitin-6-sulfatgehalt einer Reihe von Implantaten auf der Basis von gemeinsam ausgefällten Kollagen~Ghond.roitin-6-sulfat-Verbundprodukten im Bereich von 1,8 bis 11,2 Gewichtsprozent zunahm. Diese Ergebnisse zeigten, dass das in den Verbundprodukten verwendete Kollagen zwar für sich allein eine mäßige Immunreaktion hervorrief, die Umsetzung des Kollagens mit dem Chondroitin-6-sulfat jedoch zu einer praktisch vollständigen Unterdrückung dieser Immunreaktion führte. Gleiches wurde auch festgestellt,.wenn das Implantat.aus einem ■Verbundprodukt bestand, welches durch Beschichten von Kollagen.mit einem der sulfatierten Mucopolysaccharide erhalten worden war. Die histologischen Beobachtungen zeigten, dass die Fähigkeit von implantiertem Kollagen, bei dem Wirtstier eine Fremdkörperreaktion hervorzurufen, durch Umsetzung mit einem jeden der sulfatierten Mucopolysaccharide gesteuert und unterdrückt werden konnte. ' .

609886/0338

596 112
Beispiel 13

Herstellung eines zweischichtigen Schichtstoffs aus einer ersten Schicht aus Kollagen-Chondroitin-6-sulfat und einer zweiten Schicht aus einem "Silastic^!t-Siliconpolymeren

150 ml einer 0,67-gewichtsprozentigen Kollagendispersion, hergestellt nach Beispiel 1, wurden unter schnellem Rühren mit 50 ml Citronensäure-Phosphatpuffer (pH. 3_t2) gemischt, die 0,2 g Chondroitin-6-sulfat enthielten. Der Niederschlag wurde durch eine Nutsche auf ein Filterpapier von 11 cm Durchmesser (Schleicher und Schuell Nr. 589) abfiltriert. Die so erhaltene Verbundproduktfolie aus Kollagen-Mucopolysaccharid wurde von dem Filterpapier entfernt, in 0,02-molare Glutaraldehydlösung getaucht und nach Beispiel 4 verarbeitet. Die Dicke der entstandenen Folie betrug 0,38 bis 0,43 mm.

Die Verbundproduktfolie wurde dann mit Löschpapier getrocknet und mit Hilfe eines Spatels mit einem 0,13 mm dicken Überzug eines Siliconklebstoffs ("Medical Grade Silastic", Typ A, der Dow Corning Co.) beschichtet. Das beschichtete Verbundprodukt wurde 16 Stunden bei 73° C und 100 % relativer Feuchte in einem Exsikkator gehalten. Nach dem Sterilisieren in Isopropylalkohol und Auswaschen mit sterilem destilliertem Wasser und steriler Dulbeccoscher Lösung wurde die beschichtete Folie auf ihren Wert als synthetische Haut untersucht.

Beispiel 14 Transplantation von mehrschichtiger synthetischer Haut in vivo

Das nach Beispiel 13 hergestellte und mit Siliconharz beschichtete Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukt wurde auf die gewünschten Abmessungen (4 cm χ 6 cm) geschnitten und zum Desinfizieren 24 Stunden bei 23° C in ein Gemisch aus 70 % Isopropanol und 30 % Wasser getaucht. Die Hantierung der Proben erfolgte in einer sterilen Atmosphäre, die durch einen Abzug (Tenney Relialab Laminar flow hood) zur Verfügung gestellt

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wurde. Während der Hantierung der Probe wurden chirurgische Handschuhe und Masken verwendet. Nach dem Entfernen aus der Alkohollösung wurden die Proben zweimal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und dann bis zur Verwendung bei h C. in Dulbeccoscher Lösung aufbewahrt. Nach Beendigung dieses Verfahrens ergaben bakteriologische Untersuchungen der Kollagen-Chondroitin-ö-sulfatproben auf gram-positive und gram-negative Bakterien und auf anaerobe Mikroorganismen negative Resultate.

Die Transplantation wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Als Versuchstiere wurden weisse weibliche Hartley^ Meerschweinchen von ungefähr 400 g Körpergewicht verwendet. Für einen Zeitraum von 7 Tagen vor der Transplantation wurde für jedes Tier die Geschichte seiner Gewichtsänderung aufgenommen. Kurz vor der Transplantation wurde der Rücken eines jeden Tieres über eine Fläche von 6 cm χ 5 cm hinweg mit der Haarschneidemaschine geschoren, und lose Haarabfälle wurden sorgfältig abgesaugt. Dann wurde das Tier durch Einwirkenlassen eines Gemisches aus Sauerstoff und Halothan anästhesiert und sein Rücken mit einer Lösung von 70 % Isopropanol und 30 % Wasser gewaschen.

Über eine Fläche von 4 cm χ 6 cm hinweg wurden entsprechend . einer mit Jodlösung markierten Kontur, die der Grosse des . Transplantats entsprach, Schnitte ausgeführt. Die Haut über dem Panniculus carnosus wurde ausgeschnitten, wobei sorgfältig darauf geachtet wurde, nur ein minimales Bluten hervorzurufen. Alles Blut wurde aus der Wunde durch Abtupfen mit mit steriler Kochsalzlösung befeuchteten sterilen Gazebäuschen entfernt. Das Transplantat wurde dicht angrenzend an die Haut am Umfang der Wunde über das Wundbett gelegt. Dann wurde das Transplantat mit Nahtmaterial aus Nylon angenähtj wobei ungefähr 16 Nähte nahe der Wunde angewandt wurden. Das Tier wurde mit einem seinen Körper umgebenden Verband bedeckt, der um das

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Genick herum befestigt wurde, um Verschiebungen zu verhindern. Während der Dauer des Versuchs war jedes untersuchte Tier in einem gesonderten Käfig untergebracht.

Die untersuchten Tiere wurden täglich gewogen, und das Gewicht wurde verzeichnet. Nach 5 Tagen wurde der Verband geöffnet und die Transplantatstelle untersucht. Die Tiere wurden nach unterschiedlichen Zeitspannen getötet, und das Transplantat sowie das Wundbett wurden ausgeschnitten und in zwei gleiche Abschnitte unterteilt. Ein Abschnitt wurde der histologischen Untersuchung unterworfen, und der andere Abschnitt wurde ohne weitere Behandlung unter einem schwach vergrössernden Mikroskop beobachtet. Durch Abheben des Transplantatmaterials von dem Gewebe mit einer Pinzette konnte der Zustand der Wundstelle und des Transplantats untersucht werden. Für Zeiträume bis zu 10 Tagen war kein Anzeichen für Gewebewachstum in das Transplantat hinein und kein Anzeichen von Wundkontraktion oder akuter Entzündung festzustellen. Die Epithelbildung am Umfang des Wundbettes war minimal.

Beispiel 15

Mit Kollodium beschichtete mehrschichtige Kollagen-Chondro itin-6-sulfat-Membran

Ein nach Beispiel 5 hergestelltes Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukt wurde nach dem Verfahren des Beispiels 14 auf ein Meerschweinchen transplantiert. Nach dem Einnähen wurde das gesamte Transplantat zusammen mit etwa 3,2 mm der benachbarten Haut mit einer Kollodiumlösung (Celluloseester in einem geeigneten organischen Lösungsmittel) beschichtet und vor dem Anlegen eines Verbandes gründlich trocknen gelassen. Das Verhalten des Transplantats und des Gewebes war ähnlich wie in Beispiel 14, jedoch sprang der Überzug am 10. Tag infolge Versprödung, und es erfolgte eine Dehydratisierung der Kollagen-Chondroitin-6-sulfatschicht unter Kontraktion der Wunde und Epithelbildung längs der Ränder der Wundstelle„

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   ( 1J Mehrschichtige Membran, dadurch gekennzeichnet, dass sie

   a. eine erste Schicht aus einem Werkstoff, der in Gegenwart von Körperenzymen nicht abgebaut wird, in Gegenwart von Körp.erflüssigkeiten unlöslich und nach der Transplantation oder Implantation nicht-immunogen ist, und

   b. eine die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem nicht-toxischen Werkstoff aufweist, die der mehrschichtigen Membran eine Feuchtigkeitsdurchlässig-

   keit von etwa 0,1 bis 1 mg/cm /h verleiht.

   · Mehrschichtige Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Schicht aus einem verhetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt besteht, das mindestens etwa 0,5 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid enthält.

   3. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem natürlichen Polymeren besteht.

   4. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem synthetischen Polymeren besteht.

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   5. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt ein sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthält.

   6. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt etwa 6 bis 12 Gewichtsprozent sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthält.

   7. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das sulfathaltige Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Heparin, Heparansulfat, Keratansulfat oder Dermatansulfat ist.

   8. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bis zu einem M-VTert zwischen etwa 800 und 60 000 vernetzt ist.

   9. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das sulfathaltige Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat ist.

   10. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 4 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem synthetischen Polymeren, nämlich einem Siliconharz, Polyacrylsäureester, Polymethacrylsäureester oder Polyurethan, besteht.

   11. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem Siliconharz besteht.

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   12. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht der mehrschichtigen Membran eine Feuchtigkeitsdurchlässigkeit von etwa 0,3 bis 0,5 mg/cm /h verleiht.

   13. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 1 bis 12j dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Gesamtdicke von etwa 0,64 bis 2,5 mm aufweist.

   14. Verwendung der mehrschichtigen Membran gemäss Anspruch 1 bis13 als synthetische Haut.

   15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt verwendet wird, welches etwa 6 bis 12 Gewichtsprozent sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthält und bis zu einem M -Wert von etwa 5000 bis 10 000 vernetzt worden ist.

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