DE2636757A1

DE2636757A1 - METHOD OF CONCENTRATING AND PURIFYING THE ANTIHAEMOPHILIC FACTOR

Info

Publication number: DE2636757A1
Application number: DE19762636757
Authority: DE
Inventors: Edward Shanbrom
Original assignee: RECHERCHES HEMATOLOGIQUES
Current assignee: RECHERCHES HEMATOLOGIQUES
Priority date: 1976-08-14
Filing date: 1976-08-14
Publication date: 1978-02-16
Also published as: NL7609349A; SE448274B; DE2636757C2; GB1551928A; SE7609012L; CA1054052A; ATA611376A; JPS5326313A; NL177181B; JPS5910645B2; NL177181C; AT349639B

Description

P/^ ΓΕΝΊ >-.NW,\LTKP / ^ ΓΕΝΊ > -. NW, \ LTK

HELMUT SCHROETER KLAUS LEHMANNHELMUT SCHROETER KLAUS LEHMANN

DIPL.-PHYS. *?«« DIPL.-ING. 2636757DIPL.-PHYS. *? «« DIPL.-ING. 2636757

EDWARD SHANBROM, INC.EDWARD SHANBROM, INC.

kn-sh-1o tM/thkn-sh-1o tM / th

Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen des Antihämophiliefaktors.Process for concentrating and cleaning of antihemophilia factor.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen des Antihämophiliefaktors (AHF oder Faktor VIII) durch selektive Ausfällung einer Lösung mit geringer Ionenstärke in der Kälte.The invention relates to a method for concentrating and Purification of antihemophilic factor (AHF or factor VIII) by selective precipitation of a solution with low ionic strength in the cold.

D-707 SCHWABISCH CMONDD-707 SCHWABISCH CMOND

Telefon: (07171) 56 90Telephone: (07171) 56 90

H. SCHROETER Telegramme: Schroepat Bocksgas« 49 Telex: 7248 868 pagd dH. SCHROETER Telegrams: Schroepat Bocksgas «49 Telex: 7248 868 pagd d

809807/0441809807/0441

GEMEINSAME KONTEN:SHARED ACCOUNTS:

D-8 MÜNCHEN 70D-8 MUNICH 70

Deutsche Bank München 70/37369 (BLZ 700 700 10) Schwäbisch Gmiind 02/00 535 (BLZ 613 700 86) Postscheckkonto München 1679 41-804Deutsche Bank Munich 70/37369 (bank code 700 700 10) Schwäbisch Gmiind 02/00 535 (bank code 613 700 86) Postal checking account Munich 1679 41-804

K. LEHMANN Lipow&kystraße 10K. LEHMANN Lipow & kystraße 10

Telefon: (0 89) 77 89 56 Telegramme: Sdiroepat Telex: 5 212 248 pawe dTelephone: (0 89) 77 89 56 Telegrams: Sdiroepat Telex: 5 212 248 pawe d

kn-sh-1okn-sh-1o

Zur Herstellung des für therapeutische Zwecke geeigneten Antihämophiliefaktors (Faktor VIII oder AHF bzw. AHG) sind verschiedene Verfahren beschrieben worden, beispielsweise die selektive Ausfällung, die absatzweise Absorption und Elution, die Extraktion mit Medien mit geringer Ionenstärke und die Chromatographie. Die am häufigsten für die Ausfällung eingesetzten Chemikalien schließen Alkohol, Gerbsäure, Ammoniumsulfat, Glycin und Polyäthylenglykol ein. Obwohl die Reinigung des Faktors VIII die Beseitigung einer Vielzahl von anderen Plasmaproteinen umfaßt, stellt Fibrinogen das wichtigste und am schwierigsten zu beseitigende dieser Proteine dar, insbesondere wenn es denaturiert ist, beispielsweise durch Ausfällen mit Alkohol oder durch Gefrieren und Auftauen. Dieses denaturierte Fibrinogen beeinträchtigt die Filtration des Faktors VIII, verursacht erhebliche Verluste des Faktors VIII während der Reinigungsschritte und vermindert die Löslichkeit des gefriergetrockneten Produktes in der für die Herstellung einer Lösung eingesetzten Flüssigkeit. Somit muß ein zufriedenstellendes Verfahren zur Reinigung des Faktors VIII in der Lage sein, erhebliche Mengen Fibrinogen zu entfernen. Die oben beschriebenen selektiven Ausfällungstechniken sind für diesen Zweck entwickelt worden, besitzen jedoch den Nachteil, daß sie entweder das Fibrinogen und den Faktor VIII denaturieren oder unerwünschte Verluste an dem Faktor VIII mit sich bringen.For the production of the antihemophilic factor suitable for therapeutic purposes (factor VIII or AHF or AHG) are various processes have been described, for example selective precipitation, batch absorption and Elution, extraction with low ionic strength media, and chromatography. The most common for precipitation chemicals used include alcohol, tannic acid, ammonium sulfate, glycine and polyethylene glycol. Even though Factor VIII purification involves the removal of a variety of other plasma proteins, fibrinogen provides that most important and most difficult of these proteins to remove, especially when it is denatured, for example by precipitation with alcohol or by freezing and thawing. This denatured fibrinogen affects filtration of factor VIII causes significant losses of factor VIII during the purification steps and reduces the solubility of the freeze-dried product in that used for the preparation of a solution Liquid. Thus, a satisfactory process for the purification of factor VIII must be able to: remove significant amounts of fibrinogen. The selective precipitation techniques described above are for this Purpose developed but have the disadvantage that they denature either fibrinogen and factor VIII or cause undesirable losses of factor VIII.

Jene Methoden, bei denen lediglich eine Ausfällung in der Kälte ohne die Anwendung von Chemikalien (Kryopräzipitation) durchgeführt wird, sind auf Verfahren in kleinem Maßstab beschränkt, die üblicherweise in Blutbanken durchgeführt werden, und führen bei der therapeutischen Anwendung der Materialien zu hohen Fibrinogenspiegeln im Blut, eine Tatsache, die von gewissen Fachleuten als unerwünscht ange-Those methods in which only a cold precipitation without the use of chemicals (cryoprecipitation) are limited to the small-scale procedures commonly performed in blood banks and lead to high levels of fibrinogen in the blood when the materials are used therapeutically, a fact which certain experts consider undesirable

35 sehen wird. ₈₀*807/044135 will see. ₈₀ * 807/0441

kn-sh-1okn-sh-1o

Die Verfahrensweisen, bei denen der Faktor VIII mit Hilfe von Puffern mit geringer Ionenstärke aus dem Kryopräzipitat (bzw. dem in der Kälte ausgefällten Produkt) extrahiert wird, ergeben, obwohl sie zu einer gewissen Erniedrigung des Fibrinogengehalts des Endprodukts führen, Produkte mit einem noch unerwünscht hohen Proteingehalt, erfordern die Anwendung spezieller Vorrichtungen und Verfahrensweisen zum Zentrifugieren und sind in der Gesamtmenge des Faktors VIII, der ohne die Reinigung zu beeinträchtigen aus dem Kryopräzipitat extrahiert werden kann, beschränkt.The procedures in which the factor VIII is removed from the cryoprecipitate with the aid of buffers with low ionic strength (or the product precipitated in the cold) is extracted, although they lead to a certain lowering of the Fibrinogen content of the end product, products with an undesirably high protein content require the Use special devices and procedures for centrifugation and are in the total amount of the factor VIII, which can be extracted from the cryoprecipitate without impairing the purification.

Weitere Probleme, die üblicherweise bei der großtechnischen Herstellung des Faktors VIII auftreten, sind die Verunreinigung des Endprodukts durch pyrogene Substanzen und Viren, die Hepatitis verursachen können (mit Hepatitis verbundenes Antigen, HAA). Durch chemische Ausfällungsmittel können diese unerwünschten Verunreinigungen noch weiter verstärkt werden.Other problems commonly encountered in the large-scale production of Factor VIII are contamination of the end product by pyrogens and viruses that can cause hepatitis (hepatitis-related Antigen, HAA). Chemical precipitants can spread these undesirable contaminants even further be reinforced.

Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, diese Probleme zu überwinden und ein Verfahren bereitzustellen, das nicht an den Nachteilen, die durch die Verwendung von chemischen Ausfällungsmitteln auftreten, leidet und das in einfacher Weise eine selektive Ausfällung des Fibrinogens und der davon abgeleiteten denaturierten und abgebauten Produkte in der Kälte ermöglicht. (Wenn im folgenden auf die Entfernung von Fibrinogen Bezug genommen ist, so ist hiermit die Entfernung von Fibrinogen und den davon abgeleiteten denaturierten und abgebauten Produkten gemeint.)The object of the invention is thus to overcome these problems and to provide a method that does not suffer from the disadvantages associated with the use of chemical precipitants and that in simply a selective precipitation of the fibrinogen and the denatured and degraded derived therefrom Products in the cold. (Whenever reference is made below to the removal of fibrinogen, so is This means the removal of fibrinogen and the denatured and degraded products derived from it.)

Diese Aufgabe wird nun durch das erfindungsgemäße Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen von Faktor VIII oder Antihämophiliefaktor gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Kryopräzipitat bei etwa normaler Raumtemperatur mit einem wässrigen Medium mit geringer Ionenstärke extrahiert; ßQ9807/0441This object is now achieved by the method according to the invention for concentrating and cleaning factor VIII or antihemophilia factor dissolved, which is characterized is that you can create a cryoprecipitate at about normal room temperature with an aqueous medium with low ionic strength extracted; Q9807 / 0441

_kn-sh-1o _k n-sh-1o

anschließend lediglich durch Abkühlen der Lösung während etwa einer halben Stunde oder mehr auf eine Temperatur von etwa 1⁰C bis etwa 2°C Fibrinogen aus der Lösung mit geringer Ionenstärke ausfällt;then only by cooling the solution for about a half hour or more fails to a temperature of about 1 ⁰ C to about 2 ° C fibrinogen from the solution with low ionic strength;

die erhaltene überstehende Flüssigkeit, die mindestens etwa 80% des in dem als Ausgangsmaterial eingesetzten Kryopräzipitats enthaltenen Faktors VIII enthält, abtrennt; undthe resulting supernatant liquid which is at least about 80% of that used as the starting material Contains factor VIII contained in cryoprecipitate, separates; and

die Flüssigkeit zur Langzeitlagerung des darin vorhandenen Konzentrats des Faktors VIII behandelt.treated the liquid for long-term storage of the factor VIII concentrate contained therein.

Die selektive Ausfällung von Fibrinogen ohne einen damit verbundenen Verlust des Faktors VIII ist bislang in einem praktischen Verfahren für die großtechnische Herstellung eines gereinigten Konzentrats des Faktors VIII nicht erreicht worden. In der Tat hebt Wickerhauser (M.Wickerhauser "Large scale fractionation of Factor VIII - Concentrate from cryoethenol precipitate", Thromb. Diath. Haemorrh. (1971) 165) die Tatsache hervor, beim Extrahieren des Fak-The selective precipitation of fibrinogen without an associated loss of factor VIII is so far in one practical method for the large-scale production of a purified concentrate of factor VIII has not been achieved been. Indeed, Wickerhauser (M.Wickerhauser "Large scale fractionation of Factor VIII - Concentrate from cryoethenol precipitate", Thromb. Diath. Hemorrhage. (1971) 165) the fact that when extracting the factor

20 tors VIII die Zeit und die Temperatur einzuschränken.20 tors VIII to limit the time and temperature.

"Etwas höhere Ausbeuten an dem Faktor VIII wurden durch längere Extraktion mit Tris-Puffer bei 30°C während mehr als 60 Minuten erzielt, wobei jedoch der Extrakt zunehmend mit zusammengeballtem Fibrinogen verunreinigt ist, das das"Slightly higher yields of factor VIII were achieved by longer extraction with Tris buffer at 30 ° C for more than 60 minutes, but the extract is increasingly contaminated with agglomerated fibrinogen, the

25 Endkonzentrat schlecht filtrierbar macht. Andererseits25 makes the final concentrate difficult to filter. on the other hand

wurden mit einer kürzeren Extraktionsζext oder bei niedrigerer Temperatur geringere und variable Ausbeuten an dem Faktor VIII erzielt". Das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt nun all diese Probleme, da ohne einen Verlust des Faktors VIII die gesamten überschüssigen Fibrinogenverunreinigungen während des Abkühlens entfernt werden.were with a shorter extraction ext or at lower Temperature lower and variable yields of the factor VIII achieved ". The process according to the invention eliminates now all of these problems, since without loss of factor VIII all of the excess fibrinogen impurities removed while cooling.

Obwohl der Kühleffekt bereits von Hershgold et al (E.J.Hershgold, J.G.Pool und A.R.Papperhagen "The potent 5 antihemophilic concentrate derived from a cold insoluble fraction of human plasma; Characterization and further dataAlthough the cooling effect has already been reported by Hershgold et al (E.J. Hershgold, J.G. Pool and A.R. Papperhagen "The potent 5 antihemophilic concentrate derived from a cold insoluble fraction of human plasma; Characterization and further data

80 9807/044180 9807/0441

— Jo — - Jo -

on preparation and clinical trial" J.Lab.Clin.Med. 67 (1966) 23) bemerkt worden ist, benötigten die Autoren 18 bis 30 Stunden bei 4⁰C und erzielten oder empfehlen die beschleunigte und selektive Ausfällung des Fibrinogens und der Isohämagglutinine bei der niedrigeren Temperatur von O⁰C bis 2⁰C nicht. (In der Tat haben Hershgold et al in einer späteren Arbeit, die sich mit der Bildung von sehr stark gereinigtem Faktor VIII befaßt, vollständig auf die Kühlstufe verzichtet (E.J.Hershgold, A.M.Davison und M.E. Janzen "Isolation and some chemical properties of human Factor VIII (antihemophilic factor)" j.Lab.Clin. Med. 77 (1971) 185). Hershgold et al (siehe die erstgenannte Literaturstelle) geben zu, daß sie nicht in der Lage waren, ein therapeutisch geeignetes Konzentrat herzustellen, das ohne weiteres einer Sterilfiltration unterzogen werden kann und daß sie weitere Schritte, wie die Ausfällung mit Alkohol oder Glycin, durchführen mußten. Angesichts dieser enttäuschenden Ergebnisse, über die Hershgold und andere Autoren berichtet haben, erscheinen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielten drastischen Verbesserungen als äußerst überraschend.on preparation and clinical trial "J.Lab.Clin.Med. 67 (1966) 23) has been noted, the authors needed 18 to 30 hours at 4 ⁰ C and achieved or recommend the accelerated and selective precipitation of fibrinogen and isohemagglutinins at the lower temperature of ⁰ ° C not to 2 ⁰ C. (in fact, Hersh gold have et al in a later work, which is concerned with the formation of highly purified factor VIII, entirely on the cooling stage omitted (EJHershgold, AMDavison and ME Janzen "Isolation and some chemical properties of human factor VIII (antihemophilic factor)" J. Lab. Clin. Med. 77 (1971) 185). Hershgold et al (see the former reference) admit that they were unable to prepare a therapeutically suitable concentrate that can be readily subjected to sterile filtration and that they had to carry out additional steps such as precipitation with alcohol or glycine. In view of these disappointing results, over As reported by Hershgold and other authors, the drastic improvements achieved with the process of the invention appear extremely surprising.

James und Wickerhauser (H.L.James und M.Wickerhauser "Development of large scale fractionation methods" Vox Sang. 23 (1972) 402) führen zwar aus:"Weiterhin muß die Methode bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um die Ausfällung des Fibrinogens zu vermeiden", waren jedoch nicht in der Lage, irgendein Verfahren zu entwickeln, mit dem man auf der Grundlage der Prinzipien der vorliegenden Erfindung ein Konzentrat des Faktors VIII bereiten kann. Das Endprodukt, das diese Autoren erhielten, wurde mit sehr viel geringerer Ausbeute und mit niedrigerer Reinheit im Vergleich zu dem erfindungsgemäß erhaltenen Produkt gebildet. Eine weitere Behandlung mit Polyäthylenglykol (PEG) zur Entfernung des Fibrinogens und zur Steigerung der Reinheit führte zu noch stärkeren Verlusten des Faktors VIIIJames and Wickerhauser (H.L. James and M.Wickerhauser "Development of large scale fractionation methods" Vox Sang. 23 (1972) 402) state: "Furthermore must the method can be carried out at room temperature in order to avoid the precipitation of the fibrinogen " however unable to develop any method by which one can based on the principles of the present invention can prepare a concentrate of factor VIII. The end product that these authors was obtained in much lower yield and with lower purity compared to that formed according to the invention product obtained. Another treatment with polyethylene glycol (PEG) for removal of fibrinogen and an increase in purity led to even greater losses of factor VIII

80-9807/044180-9807 / 0441

kn-sh-1okn-sh-1o

(siehe die Literaturstelle M.Wickerhauser (Thromb.Diath. Haemorrh. 43 (1971) 165) und J.T.Sgouris und M.Wickerhauser "Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate" Transfusion 13 (1973) 399).(see the literature reference M. Wickerhauser (Thromb.Diath. Hemorrhage. 43 (1971) 165) and J.T.Sgouris and M.Wickerhauser "Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate "Transfusion 13 (1973) 399).

Es ist somit zu erkennen,daß andere Autoren angenommen oder aufgrund ihrer Erfahrungen geschlossen haben, daß keine besondere Verbesserung der Ergebnisse zu erwarten ist, wenn man bei der Ausfällung und Abtrennung von Fibrinogen nur geringfügig niedrigere Temperaturen und dies bei einer sehr kurzen Ausfällzeit, anwendet.Die unerwarteten und überraschend verbesserten Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich sind, stehen somit im Gegensatz zu den Lehren und Vorschlägen des Standes der Technik.It can thus be seen that other authors have accepted or have concluded on the basis of their experience that no particular improvement in the results is to be expected, if only slightly lower temperatures are used in the precipitation and separation of fibrinogen and this at a very short downtime, the unexpected and Surprisingly improved results which are possible with the method according to the invention are thus available in Contrary to the teachings and suggestions of the prior art.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit spezifisch geeignet zur großtechnischen Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII. Eines der wesentlichen Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die selektive Ausfällung in der Kälte von übermäßigen Mengen von Fibrinogen, denaturiertem fibrinogen und Fibrinogenabbauprodukten aus einer Lösung mit geringer Ionenstärke, ohne daß hierbei Chemikalien zugesetzt werden müssen und ohne daß ein unerwünschter Verlust der Aktivität des Faktors VIII auftritt. Ein weiteres wesentliches Merkmal ist die überraschend hohe Ausbeute, mit der der Faktor VIII erhalten wird, die etwa 25 bis 40% der theoretischen Plasmamenge beträgt. Im Vergleich zu anderen Produkten ist trotz der hohen Rückgewinnung des Faktors VIII der Proteingehalt zusätzlich um 50 bis 75% erniedrigt. Dies wird durch die folgende Tabelle I verdeutlicht. Das Bedürfnis für ein mit hoher Ausbeute erhaltenes, hochreines, gefriergetrocknetes Konzen-The method according to the invention is thus specifically suitable for the large-scale production of a concentrate of factor VIII. One of the essential characteristics of The method according to the invention is the selective precipitation in the cold of excessive amounts of fibrinogen, denatured fibrinogen and fibrinogen degradation products from a solution with low ionic strength without this Chemicals have to be added and without an undesired loss of the activity of factor VIII occurring. Another essential feature is the surprisingly high yield with which the factor VIII is obtained, which is about 25 to 40% of the theoretical amount of plasma. Compared to other products is despite the high recovery of factor VIII, the protein content is additionally reduced by 50 to 75%. This is illustrated by the table below I clarified. The need for a high-yield, high-purity, freeze-dried concentrate

35 trat des Faktors VIII ist international anerkannt35 step of factor VIII is internationally recognized

("Recent Advances in Hemophilia" Ann.N.Y.Acad.Sci. 240("Recent Advances in Hemophilia" Ann.N.Y.Acad.Sci. 240

809807/04A1809807 / 04A1

kn-sh-1okn-sh-1o

(1975) 1-426; J.H.Pool "Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein" West.J.of Med. 122 (1975) 406), wobei es allgemein geläufig ist, daß die kommerziellen Konzentrate im allgemeinen weniger als 20% des theoretisch in dem Plasma vorhandenen Paktors VIII enthalten (Ann.N.Y.
Acad.Sci. 240 (1975) 1-426, West.J.of Med. 122 (1975) 406
und L.F.Fekete und S.L.Holst "Stabilization of AHF using
Heparin", Ü.S.Patent No. 3,803,115, 9. April 1974).(1975) 1-426; JHPool "Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein" West, J. of Med. 122 (1975) 406), it being common knowledge that the commercial concentrates generally contain less than 20% of the theoretical in the plasma existing Pactor VIII included (Ann.NY
Acad.Sci. 240 (1975) 1-426, West. J. of Med. 122 (1975) 406
and LFFekete and SLHolst "Stabilization of AHF using
Heparin ", U.S. Patent No. 3,803,115, April 9, 1974).

809807/0441809807/0441

Table I.

Einige Eigenschaften von Konzentraten des Faktors VIIISome properties of factor VIII concentrates

2)2)

Produktproduct Einheiten
des Fak
tors
VIII/mlunits
of the faculty
tors
VIII / ml gesamtes
verab
reichtes
Volumen
(ml)whole
administer
is it enough
volume
(ml) Gesamt
ein
heiten
des
Faktors
VIIItotal
a
units
of
Factor
VIII Gesamt-
fibri-
nogen-
gehalt
(g)Total-
fibri-
nogen-
salary
(G) Gesamt-
protein-
gehalt
(g)Total-
protein-
salary
(G) Gesamt- Gesamt -
natrium-chlorid-
gehalt gehalt
m?Sq) (mSq)Total total -
sodium chloride
salary salary
m? Sq) (mSq) 800800 Gesamt
kosten
(Dollar)total
costs
(Dollar) Quellesource (1) Frisches gefrorenes
Plasma(1) Fresh frozen
plasma 0,50.5 80008000 40004000 8,08.0 240240 12001200 4040 400400 BlutbankBlood bank (2) Kryopr äz ipitat(2) cryoprecipitation 10³>10 ³ > 400400 40004000 4,04.0 2020th 4040 8080 400400 BlutbankBlood bank ^:, (3) Faktorat ^: , (3) Factor rate 1010 400400 40004000 0,80.8 1414th 9696 4848 480480 Armour-
Pharmaceu-
ticalArmor
Pharmaceu-
tical (4) Faktor VIII(4) Factor VIII 1010 400400 40004000 4)4) 2020th 8080 2020th 480480 Abbott-
LaboratoryAbbott
Laboratory (5) Hsrofil(5) Hsrofil 2525th 160160 40004000 1,01.0 5,65.6 2525th 528528 RylandRyland (6) Faktor VIII⁵·'(6) Factor VIII ⁵ · ' 1010 400400 40004000 6,06.0 ShanbrcxnShanbrcxn (7) Faktor VIII⁶'¹ (7) Factor VIII ⁶ ' ¹ 1010 400400 40004000 2,02.0 ShanbromShanbrom

Fortsetzung Tabelle ITable I continued

Diese Tabelle stammt, mit Ausnahme der Angaben hinsichtlich "Shanbrom" aus dem Artikel von Robert T. Breckenridge "Recent Advances in Hemophilia", Ann.N-Y.Acad. Sciences 240 (1975) 165 bis 171. Die Shanbrom-Ergebnisse stammen von der Anmelderin.With the exception of the information relating to "Shanbrom", this table is taken from the Article by Robert T. Breckenridge, "Recent Advances in Hemophilia," Ann.N-Y.Acad. Sciences 240 (1975) 165-171. The Shanbrom results are from the applicant.

^^

Diese Zahlen basieren auf den Erfahrungen des Hemophilia Center of Rochester and Monroe County und sind als Gesamtmenge ausgedrückt, die erforderlich ist, einen Patienten mit einem Gewicht von 70 kg mit einer Einheit pro Milliliter zu behandeln.These numbers are based on the experience of the Hemophilia Center of Rochester and Monroe County and are expressed as the total amount a patient is required to use a weight of 70 kg to be treated with one unit per milliliter.

Q₀ Es wird dabei von einer in vivo-Rückgewinnung von 80% ausgegangen. OQ ₀ An in vivo recovery of 80% is assumed. O

Oo Variabel, jedoch üblicherweise zwischen 7 bis 12 μ/ml.Oo Variable, but usually between 7 to 12 μ / ml.

_ο Wegen einer Ausfällung bei 37⁰C ist die Bestimmung des Fibrinogens nicht möglich. _ο Because of a precipitation at 37 ⁰ C, the determination of the fibrinogen is not possible.

—* Einstufengewinnung ohne weitere Ausfällung.
Weitere Ausfällung mit Hilfe eines Polyols.- * One step recovery without further precipitation.
Further precipitation with the aid of a polyol.

cn -j cn cn -j cn

kn-sh-1okn-sh-1o

Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.The following example serves to further explain the invention.

example

Man taut gefrorenes Plasma, beispielsweise 100 bis 3OOO 1, von etwa -5⁰C auf etwa +2⁰C auf und bringt das Material in einen geeigneten Tank oder ein geeignetes Gefäß ein. Größere Volumina können ebenfalls verarbeitet werden, wobei sich jedoch die Verfahrensmaßnahmen erschweren. Die in der Kälte unlösliche Fraktion (Kryopräzipitat) wird bei weniger als 3⁰C abgetrennt, vorzugsweise unter Anwendung von kontinuierlich betriebenen Zentrifugen (Sharpless oder ähnliche Zentrifugen). Man kann das Material auch mit anderen Methoden gewinnen, die jedoch weniger wirksam sind.Thaw frozen plasma, for example 100 to 3ooo 1 of about -5 ⁰ C to about +2 ⁰ C, and bring the material in a suitable tank or a suitable vessel a. Larger volumes can also be processed, but the procedural measures become more difficult. The fraction which is insoluble in the cold (cryoprecipitate) is ^{separated off at less than 3 °} C., preferably using continuously operated centrifuges (Sharpless or similar centrifuges). Other methods can be used to obtain the material, but they are less effective.

Das Kryopräzipitat wird gewogen und dann mit einer geringen Menge von destilliertem, pyrogenfreiern Wasser unter Bildung einer Aufschlämmung oder einer Emulsion vermischt, wozu man das Material vorzugsweise während einiger Sekunden in einer Mischeinrichtung (Waring-type blender) durchrührt. Die Aufschlämmung wird dann mit etwa 2 bis etwa 3 Volumen destilliertem, pyrogenfreiem Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 während etwa 30 bis etwa 60 Minuten nach dem Erwärmen auf 20⁰C bis 3O°C extrahiert. Dann gibt man Aluminiumhydroxidgel in einer Menge von 10 bis 30 ml/1 zu und läßt die Absorption während 15 Minuten ablaufen. Zu einer weiteren Reinigung kann man 0,5 bis 2,0 Gew.-% Tricalciumphosphat zusetzen und die Menge des Aluminiumhydroxids vermindern. Diese Maßnahmen unterstützen die Abtrennung der Lipide, der denaturierten Proteine und des Prothrombinkomplexes. Die gesamte Behandlung erfolgt in einem mit einem Mantel ausgerüsteten Beaktionsgefäß unter ständigem Rühren, wobei Sorge dafür getragen wird, daß das Material nicht schäumt. Der Gefäßinhalt wird dann während etwa einer halben Stunde bis 2 Stunden auf eine Innentemperatur von etwa 1 bis etwa 2⁰C abgekühlt. Der gebildete voluminöseThe cryoprecipitate is weighed and then mixed with a small amount of distilled, pyrogen-free water to form a slurry or an emulsion, for which purpose the material is preferably stirred for a few seconds in a mixing device (Waring-type blender). The slurry is then extracted with about 2 to about 3 volumes of distilled, pyrogen-free water at a pH value of 7.0 for about 30 to about 60 minutes after heating to 20 ⁰ C to 3O ° C. Aluminum hydroxide gel is then added in an amount of 10 to 30 ml / l and the absorption is allowed to proceed for 15 minutes. For further purification, 0.5 to 2.0% by weight of tricalcium phosphate can be added and the amount of aluminum hydroxide can be reduced. These measures support the separation of the lipids, the denatured proteins and the prothrombin complex. The entire treatment takes place in a reaction vessel equipped with a jacket with constant stirring, care being taken that the material does not foam. The contents of the vessel are then cooled to an internal temperature of about 1 to about 2 ^{° C. for about half an hour to 2 hours.} The formed voluminous

. 809807/0441. 809807/0441

kn-sh-1okn-sh-1o

Niederschlag wird durch kontinuierliche Zentrifugation (beispielsweise mit Hilfe einer Sharpless-Zentrifuge) abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 0,02 molarem Trinatriumcitrat und 0,1 molarem Glycin bei einer Temperatur von 20 bis 25°C stabilisiert, worauf man den pH-Wert mit Zitronensäure auf 7,0 einstellt. Die Lösung wird dann geklärt und sterilisiert, indem man die Flüssigkeit durch 293 mm Millipore-Membranfilter (oder äquivalente Patronenfilter) führt, die typischerweise Poren mit Durchmessern von 1,2, 0,65, 0,45 oder 0,3 μπι aufweisen. Die erhaltene sterile Lösung, die etwa 25 bis 40% des in dem als Ausgangsmaterial eingesetzten ursprünglichen Plasmas enthaltenen Faktors VIII enthält, wird dann in üblicher Weise zur Verbesserung der Lagerfähigkeit ge-Precipitate is separated off by continuous centrifugation (for example with the aid of a Sharpless centrifuge). The supernatant liquid is made with 0.02 molar trisodium citrate and 0.1 molar glycine at a temperature from 20 to 25 ° C, after which the pH is adjusted to 7.0 with citric acid. The solution is then clarified and sterilized by passing the fluid through 293 mm Millipore membrane filters (or equivalent Cartridge filter), which typically have pores with diameters of 1.2, 0.65, 0.45 or 0.3 μm. The sterile solution obtained, which is about 25 to 40% of that in the original used as starting material Factor VIII contained in plasma is then used in the usual way to improve shelf life.

15 friergetrocknet.15 freeze-dried.

Man kann das Verfahren auch abwandeln, insbesondere durch die Anwendung von erneut gefrorenem Kryopräzipitat oder Varianten der Cohn-Fraktion, obwohl in diesem Fall die Ausbeute an dem Faktor VIII erniedrigt wird und von der Konzentration dieses Materials in dem Ausgangsmaterial abhängt. Die Extraktion des Faktors VIII kann auch mit Hilfe von anderen Puffern mit geringer Ionenstärke, wie Tr is-Puffer, durchgeführt werden. Die Kühlzeit kann ebenfalls variiert werden und kann verlängert oder wiederholt angewandt werden, wobei eine weitere Zusammenballung des Fibrinogens erfolgt. In ähnlicher Weise kann man die bei dem Verfahren angewandte Extraktionszeit auf bis zu 24 Stunden verlängern.The method can also be modified, in particular by using re-frozen cryoprecipitate or Variants of the Cohn fraction, although in this case the yield of factor VIII is reduced and from the Concentration of this material in the starting material depends. The extraction of factor VIII can also be done with the help other low ionic strength buffers such as Tris buffers can be performed. The cooling time can also can be varied and can be extended or applied repeatedly, with further agglomeration of the Fibrinogen occurs. Similarly, the extraction time used in the process can be up to Extend 24 hours.

Das erhaltene Produkt kann während längerer Zeitdauern und mindestens während eines Jahres bei +5⁰C- gelagert werden und mit destilliertem Wasser oder einer physiologischen Salzlösung in eine für die therapeutische An-Wendung geeignete Form gebracht werden. Wegen seines relativ niedrigen Fibrinogengehalts und seinem höheren Albumin-The product obtained can be stored for longer periods of time and at least for one year at +5 ⁰ C- and brought into a form suitable for therapeutic use with distilled water or a physiological salt solution. Because of its relatively low fibrinogen content and higher albumin

, 809807/0441, 809807/0441

kn-sh-1okn-sh-1o

gehalt löst sich das Material sehr schnell. Da beginnend von dem Zeitpunkt, da die Plasmabehälter geöffnet werden, die gesamte Behandlungszeit im Vergleich zu den anderen Herstellungsmethoden sehr kurz ist, wird das Bakterienwachstum ebenfalls stark eingeschränkt. Durch die Tatsache, daß die Extraktion in destilliertem Wasser erfolgt, werden die Mengen, in denen sich Fibrinogen undcontent, the material dissolves very quickly. Since starting from the point in time when the plasma containers are opened, the total treatment time is very short compared to the other manufacturing methods, bacteria will grow also severely restricted. Due to the fact that the extraction is carried out in distilled water, are the amounts in which fibrinogen and

ir-Globuline lösen, vermindert. Durch Abkühlen auf 2⁰C wird eine selektive Ausfällung von überschüssigem Fibrinogen und den davon abgeleiteten denaturierten und abgebauten Produkten und der Isohämagglutinine (Makroglobuline) erreicht, ohne daß ein merklicher Verlust des Faktors VIII auftritt. Zusätzlich schließt der flockige, voluminöse Fibrinogen-Niederschlag offensichtlich vorhandenes pyrogenes Material ein und vermindert die Mengen des Hepatitis verursachenden Antigens (HAA oder Hepatitisvirus). Dies führt insbesamt zu einem Produkt, das im Vergleich zu Plasma um den Faktor 30 bis 60 gereinigt ist und einen sehr geringen Gehalt an Fibrinogen und "Salz"-Isohämagglutininen aufweist. Gewünschtenfalls kann dieses Produkt in üblicher Weise oder mit Hilfe neuer Verfahrensweisen weiter gereinigt und aufkonzentriert werden. Gemäß einem Beispiel für eine solche neue Verfahrensweise kann man den Faktor VIII mit extrem hoher Reinheit mit Hilfe einer zusätzlichen Verfahrensstufe herstellen, gemäß der man 3 bis 6% eines Polyols (Polyäthylenglykol oder ein 0(-Hydroxy- oo-hydroxy-poly(oxyäthylen)-poly(oxypropylen)-poly(oxyäthylen)-Blockcopolymeres (Pluronic der Firma BASF-Wyandotte Corp.: "The Wonderful World of Pluronic Polyols, (1971)) zusetzt und dann das Material erneut während 1 bis 2 Stunden auf 0⁰C bis 2⁰C kühlt. Hierzu sei auf das Produkt 7 der obigen Tabelle I hingewiesen. Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß man in weniger als 8 Stunden extrem reinen Faktor VIII herstellen kann, im Vergleich zu den um den Faktor 2 bis 3 längeren Behandlungszeiten, dieDissolve ir globulins, diminished. A selective precipitation of excess fibrinogen and the denatured derivative thereof and degraded products and the isohemagglutinins (macroglobulins) is achieved by cooling to 2 ⁰ C without any appreciable loss of factor VIII occurs. In addition, the fluffy, bulky fibrinogen precipitate apparently traps pyrogenic material present and reduces the levels of the hepatitis-causing antigen (HAA or hepatitis virus). Overall, this leads to a product that is purified by a factor of 30 to 60 compared to plasma and has a very low content of fibrinogen and "salt" isohaemagglutinins. If desired, this product can be further purified and concentrated in the usual way or with the aid of new procedures. According to an example of such a new procedure, factor VIII can be produced with extremely high purity with the aid of an additional process stage, according to which 3 to 6% of a polyol (polyethylene glycol or a 0 (-hydroxy- oo-hydroxy-poly (oxyethylene)) poly (oxypropylene) poly (oxyethylene) block copolymer (Pluronic from BASF-Wyandotte Corp .: "The Wonderful World of Pluronic Polyols, (1971)) is added and then the material is again at 0 ^° C. for 1 to 2 hours 2 ^° C. For this purpose, reference is made to the product 7 of the above Table I. A great advantage of the process according to the invention is that extremely pure factor VIII can be produced in less than 8 hours, compared to that by a factor of 2 up to 3 longer treatment times, the

80^807/04*180 ^ 807/04 * 1

kn-sh-1okn-sh-1o

bei den herkömmlichen Verfahren erforderlich sind.are required in the conventional method.

Das obige Beispiel steht für eine besonders bevorzugte optimale Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Es versteht sich jedoch, daß man bei dem erfindungsgemässen Verfahren auch übliche Verarbeitungstechniken und Materialien anwenden kann. Obwohl es beispielsweise im allgemeinen nicht wirtschaftlich ist, von weniger als etwa 100 1 Plasma oder einem aus dieser Plasmamenge gewonnenen Kryopräzipitat auszugehen, ist es unkritisch, entweder größere oder kleinere Volumina und demgegenüber Veränderungen von etwa 50% durchzuführen, ohne daß hierdurch die erzielten Effekte beeinträchtigt würden. Die in dem obigen Beispiel angegebenen Verfahrensweisen werden unter Anwendung gut bekannter und leicht zugänglicher Vorrichtungen durchgeführt, wie der Sharpless-Zentrifuge, dem Waring-Blender etc., obwohl jedoch ersichtlich ist, daß diese Schritte als solche, abgesehen von dem erfindungsgemäßen Prinzip, und die angewandten Vorrichtungen nicht kritisch sind, so daß in Abhängigkeit von dem vorhandenen Personal, den vorhandenen Vorrichtungen etc. erhebliche Variationen angewandt werden können. Die Adsorption an Aluminiumhydroxid ist an sich bekannt und erfindungsgemäß nicht kritisch. Man kann demzufolge auch andere Adsorbentien etc, verwenden oder den gleichen Zweck mit Hilfe einer äquivalenten Maßnahme erreichen oder auch ganz darauf verzichten. Nachdem man die den Faktor VIII in hoher Ausbeute enthaltende überstehende Flüssigkeit gewonnen hat, wird sie in üblicher Weise zum Zwecke der Lagerung und der späteren Verwendung behandelt, das heißt durch eine übliche Sterilfiltration geklärt und sterilisiert, zur Einengung des Faktors VIII auf ein kleines, leicht lagerfähiges Volumen gefriergetrocknet und bei der Verwendung unter Anwendung üblicher Flüssigkeiten, beispielsweise pyrogenfreiem Wasser oder physiologischer Salzlösung, wieder aufgelöst.The above example stands for a particularly preferred optimal embodiment of the method according to the invention. It goes without saying, however, that customary processing techniques and Can apply materials. For example, although it is generally not economical, less than It is uncritical to assume either about 100 l of plasma or a cryoprecipitate obtained from this amount of plasma carry out larger or smaller volumes and, on the other hand, changes of about 50% without this the effects achieved would be impaired. The procedures given in the example above are described in Using well known and readily available devices such as the Sharpless centrifuge, the Waring Blender etc., although it can be seen that these steps as such, apart from the principle according to the invention, and the devices used do not are critical, so that depending on the staff, the devices available, etc. considerable Variations can be applied. Adsorption on aluminum hydroxide is known per se and according to the invention not critical. You can therefore also use other adsorbents, etc., or the same purpose with the help achieve an equivalent measure or even forego it altogether. After having the factor VIII in high Yield containing supernatant liquid has been obtained, it is used in the usual manner for the purpose of storage and treated for later use, i.e. clarified and sterilized by a conventional sterile filtration, freeze-dried to reduce factor VIII to a small, easily storable volume and during use using conventional liquids, for example pyrogen-free water or physiological ones Saline solution, redissolved.

804807/0441804807/0441

Claims

Μ). Process for concentrating and cleaning Factor VIII, characterized in that a cryoprecipitate at approximately normal Room temperature with an aqueous medium with

5 ringer ionic strength extracted;

then only by cooling the solution for about a half hour or more fails to a temperature of about 1 ⁰ C to about 2 ° C fibrinogen from the solution with low ionic strength; the supernatant liquid obtained, which contains at least about 80% of the factor VIII contained in the cryoprecipitate used as starting material, is separated off; and
treated the liquid for long-term storage of the factor VIII concentrate contained therein.

2. A method for concentrating and purifying factor VIII, characterized in that that he

forms a cryoprecipitate from about 100 liters or more of frozen plasma;

extracts the cryoprecipitate obtained in this way at a temperature of about 25 ⁰ C to 30 ° C and at a pH value of 7 for about 30 to about 60 minutes with about 2 to about 3 volumes of pyrogen-free water;

by adsorption lipids, denatured proteins and the prothrombin complex from the extracted solution removed;

without removing substantial amounts of the factor VIII fibrinogen and its denatured and degradation products from the obtained liquid extract with lower

809807/0441 WSPECTED

kn-sh-1o

Ionic strength separated by the liquid cools during about a huts hour to about 2 hours at a temperature of about 1 ° C to about 2 ⁰ C;

the obtained supernatant liquid containing about 80% or more of the factor VIII present in the starting material is separated, stabilized, clarified and sterilized; and
the stabilized, supernatant liquid under

10 Formation of a concentrate of factor VIII, the

be stored for long periods of time and easily by dissolving in distilled water or physiological saline solution can be restored, freeze-dried.

3. The method according to any one of claims 1 or 2,

characterized in that the factor VIII is further purified by adding about 3% to about 6% of a polyol to the supernatant liquid containing at least about 80% of factor VIII and bringing the resulting mixture to a temperature for 1 to 2 hours cools from about 0 ° C to 2 ⁰ C in order to precipitate additional fibrinogen and denatured and degradation products thereof.

809 B 07/0441