DE2830524C2 - - Google Patents

Description

Die bestehenden Verfahren zum Auszählen von Blutplättchen haben sich als nicht ganz verläßlich erwiesen. Automatisierte Ausführungen dieser Verfahren haben sich bisher auf Chemismen gestützt, die zu falsch bestimmten Blutplättchenzählungen geführt haben.

Bei typischen Verfahren zur Zählung von Blutplättchen wird ein Material zu einer Gesamtblutprobe hinzugegeben, um die roten Blutkörperchen aufzulösen. Die Verfahren zum Auflösen der roten Blutkörperchen, die bisher angewandt wurden, besitzen jedoch schädliche Nebenwirkungen: Material von den Blutplättchen selbst wird extrahiert, einige weiße Blutkörperchen werden zerteilt, und in einigen Fällen bilden sich Niederschläge aus Proteinen. Wenn von diesen Vorgängen einer oder mehrere stattfinden, wird die angezeigte Plättchenzählung falsch berechnet.

Was die Differentialzählungen für weiße Blutkörperchen, die gegenwärtig verfügbar sind, angeht, so ist es bisher nicht möglich, weiße Blutkörperchen zu erhalten, die durch Hämolyse frei von roten Blutkörperchen sind, ohne daß die weißen Blutkörperchen gleichzeitig geschädigt werden. Daher ist eine angemessene Differenzierung der Leukocyten, wie sie in der US-PS 37 41 875 beschrieben ist, nur möglich, wenn die Zellen durch cytochemische Umsetzung angefärbt werden.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ohne Anfärbung die Unterscheidung der Blutplättchen von den Hüllen der roten Blutkörperchen und den Leukocyten sowie Informationen über die Größe der Blutplättchen zu gewinnen und die Unterscheidung der meisten Klassen der ungefärbten Leukocyten aufgrund ihrer Größe und Granulareigenschaften zu ermöglichen.

Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Verfahren.

In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Detergens Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat verwendet und die Bebrütung 2 min bei etwa 58°C durchgeführt.

In einer automatisierten Apparatur für kontinuierlichen Durchflußbetrieb, die der Erleichterung der differentiellen Zählung der weißen Blutkörperchen dient, und bei dem automatisierten Verfahren gemäß US-PS 37 41 875 werden die einzelnen Zellarten mit Hilfe von cytochemischen Verfahren speziell identifiziert und markiert. Der Strom aus gefärbten und ungefärbten Zellen fließt durch eine optische Sichtkammer, in der ein fotoelektrisches Meßverfahren die Amplituden des absorbierten Lichtes und getrennt davon das von jeder Zelle gestreute Licht mißt. Elektronische Signale werden aufgrund ihrer Amplitude eingeteilt und zu Kategorien klassifiziert, die den unterschiedlichen Zellarten entsprechen. Für die fünf hauptsächlichen Arten von weißen Blutkörperchen von Gesamtblut werden die entsprechenden Daten für eine Probe/min ausgedruckt. Mit dem spezifischen Verfahren zur chemischen Identifizierung werden die weißen Blutkörperchen angefärbt. Das gestreute Licht mißt die durch das Verfahren beeinflußte Größe der Zellen grob.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzielung einer differentiellen Zählung der weißen Blutkörperchen läßt sich sowohl der manuellen als auch der automatisierten Durchführungsform anpassen. In jedem der beiden Fälle ermöglicht das Verfahren eine wirksame Unterscheidung der meisten normalen Klassen ungefärbter Leukocyten durch Lichtstreuung allein, da die Morphologie der weißen Blutkörperchen nicht beeinträchtigt worden ist. Die Zählung ist genau, weil die vorbereiteten Zellen frei von Klumpen aus weißen Blutkörperchen, Hüllen roter Blutkörperchen oder Blutplättchen sind.

Eine weit verbreitete Methode zur Zählung von Blutplättchen beruht auf der Verwendung einer konzentrierten Harnstofflösung zur Auflösung der roten Blutkörperchen. Bei diesem Verfahren wird auch etwas Material von Blutplättchen extrahiert, und es werden einige weiße Blutkörperchen zerteilt, wodurch Teilchen erzeugt werden, die sich in den dabei verwendeten Instrumenten nicht von Blutplättchen unterscheiden lassen, wodurch die Zählung der Blutplättchen falsch wird, und bei einigen abnormen Blutproben wird die Bildung von sehr feinen Proteinniederschlägen verursacht, die sich ebenfalls in den verwendeten Instrumenten von Blutplättchen nicht unterscheiden lassen und wodurch ebenfalls in derartigen Blutproben die Zählung der Blutplättchen beeinträchtigt wird.

Die Extraktion von Blutplättchenmaterial durch den Harnstoff erniedrigt das Lichtbrechungsvermögen der Blutplättchen, wodurch die Größe des Signals des gestreuten Lichtes erniedrigt wird, das durch sie in den verwendeten Instrumenten erzeugt wird. Demzufolge verschmelzen die kleinsten Signale, die von den Blutplättchen ausgehen, mit den größten Rauschsignalen des Systems, die durch das elektronische Rauschen in den Detektoren und Verstärkern sowie von den gleichzeitig durch den fotometrischen Lichtstreuungsdetektor erfolgenden durchtritt einer großen Anzahl von Zellhüllen von roten Blutkörperchen, d. h. Membranen von roten Blutkörperchen, die von ihrem Inhalt durch die Hämolyse befreit worden sind, erzeugt werden. Es ist daher nicht möglich, eine Schwelle zwischen dem Rauschen und der durch die Blutplättchen hervorgerufenen Anzeige mit großer Zuverlässigkeit genau festzusetzen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine Methode geschaffen, bei der die roten Blutkörperchen hämolysiert werden, ohne daß Material von den Blutplättchen extrahiert wird, ohne daß die weißen Blutkörperchen zerteilt werden und ohne daß sich aus den Proteinen abnormer Blutproben Niederschläge bilden. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine Impulshöhenverteilung von Signalen mit einem großen, wohl definierten Minimum zwischen Rauschen und Blutplättchen sowie einem weiteren großen, wohldefinierten Minimum zwischen Blutplättchen und weißen Blutkörperchen.

Außerdem bleiben bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Unterschiede in der Morphologie der weißen Blutkörperchen erhalten, wodurch die Unterscheidbarkeit der meisten Klassen an weißen Blutkörperchen voneinander ohne Anfärbung ermöglicht wird.

Gleichgültig, ob das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzielung einer differentiellen Zählung der weißen Blutkörperchen oder einer Zählung der Blutplättchen eingesetzt wird, wird zunächst eine am Koagulieren gehinderte Blutprobe mit einem Detergens versetzt, das die roten Blutkörperchen für die anschließende Hämolyse vorbehandelt.

Der Zusatz des Detergens zu diesem Zeitpunkt ist ein wichtiger Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das Detergens wirkt als Vorbehandlungsmittel oder Vorkonditionierungsmittel derart, daß es bei den Konzentrationen, in denen es zugesetzt wird, die Morphologie der weißen Blutkörperchen oder der Blutplättchen nicht beeinträchtigt und auch die roten Blutkörperchen nicht hämolysiert, indesen die roten Blutkörperchen für die anschließende Hämolyse vorbereitet.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird als Detergens vorzugsweise Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat verwendet, wenngleich andere Detergentien, wie beispielsweise Polyoxyethylen-23-monolaurylether oder Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonooleat, ebenfalls in der Lage sind, die roten Blutkörperchen vorzubehandeln, ohne sie zu hämolysieren, und daher in gleicher Weise verwendbar sind.

Die Konzentration des Detergens in dem erhaltenen Gemisch liegt zwischen etwa 0,03 und 2,0% (Volumen/Volumen) und beträgt vorzugsweise etwa 0,4 bis etwa 0,6% (Volumen/Volumen).

Während des erwähnten Vorbehandlungsschrittes wird das erhaltene Gemisch bei Raumtemperatur oder Umgebungstemperatur, beispielsweise bei etwa 25°C, etwa 1 min lang bebrütet. Dadurch wird ermöglicht, daß das Detergens seine Aufgabe zufriedenstellend erfüllt.

Das bebrütete Gemisch wird unter Rühren und Halten des pH-Wertes im neutralen Bereich mit einem Fixierungsmittel versetzt. Vorzugsweise ist das Fixierungsmittel eine mit Phosphat gepufferte Formaldehydlösung, und der pH-Wert liegt im Bereich von 6 bis 8.

Das Gemisch wird anschließend bei einer Temperatur von etwa 55 bis etwa 62°C mindestens 2 min lang und vorzugsweise bei 58°C 2 min lang bebrütet.

Anschließend wird das Gemisch nötigenfalls verdünnt und optisch gemessen. Zur Bestimmung der Blutplättchenzahl wird die Verdünnung mit einer angesäuerten isotonischen Salzlösung vorgenommen, wonach das erhaltene Gemisch einen pH-Wert von 2 bis 4 besitzt. Eine Suspension unter Verwendung von 0,5% Essigsäure angesäuerter Salzlösung ergibt eine hinreichende Verdünnung, ein verbessertes Verhältnis von Blutplättchensignal zu Rauschen, eine saubere Abtrennung der Blutplättchen von den Hüllen der roten Blutkörperchen und Leukocyten, und die ursprünglichen einzelnen Volumina der Blutplättchen bleiben erhalten. Es ist auch möglich und in manchen Fällen bevorzugt, die Probe durch Zugabe einer isotonischen Salzlösung vor der Behandlung mit dem Detergens teilweise zu verdünnen.

Zur Bestimmung der weißen Blutkörperchen wird die Probe durch Zusatz einer isotonischen Salzlösung mindestens teilweise nach der Berührungsstufe verdünnt. Alternativ kann die Probe mindestens teilweise vor der Behandlung mit dem Detergens verdünnt werden.

Die Suspension von weißen Blutkörperchen, die auf die angegebene Weise mit einer isotonischen Salzlösung verdünnt worden ist, erhält die Morphologie der weißen Blutkörperchen, erlaubt eine Unterscheidung der ungefärbten weißen Blutkörperchen durch Lichtstreuung mit niedrigem und großem Winkel sowie die Unterscheidung von Lymphocyten, Monocyten, Neutrophilen und Eosinophilen ohne Anfärbung.

Das Verfahren erhält außerdem die Peroxidaseaktivität der weißen Blutkörperchen, was die weitere Unterscheidung der beiden sonst schwierig zu unterscheidenden Gruppen von Leukozyten ermöglicht, nämlich die der peroxydaseaktiven und -inaktiven Agranulocyten.

Die hergestellte Suspension kann sofort (on line) für die klinisch-hämatologische Analyse durch Lichtstreuung verwendet werden, und sie kann aufbewahrt werden, um als Bezugssupension für ein derartiges System zu dienen.

Beispiel 1 Macro-Methode

0,1 ml einer am Koagulieren gehinderten Gesamtblutprobe werden mit 0,32 ml einer 1%igen Lösung von Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat in isotonischer Salzlösung versetzt und das erhaltene Gemisch bei Raumtemperatur etwa 1 min lang bebrütet.

Danach wird das Gemisch unter Rühren mit 0,42 ml phosphatgepufferter Formaldehydlösung mit einem Gehalt von 8 Vol.-% Formaldehyd versetzt und das erhaltene Gemisch 2 min bei 57°C bebrütet.

A. Bestimmung der weißen Blutkörperchen

Das obige bebrütete Gemisch wurde mit 1,2 ml isotonischer Salzlösung versetzt, und die differentielle Zählung der weißen Blutkörperchen wurde durch Lichtstreuung durchgeführt.

B. Bestimmung der Blutplättchen

Das oben erwähnte bebrütete Gemisch wurde mit 1,2 ml isotonischer Salzlösung versetzt. 0,1 ml des erhaltenen Gemisches wurde zu 4,0 ml einer mit 0,5% Essigsäure angesäuerten isotonischen Salzlösung hinzugefügt. Die Zählung der Blutplättchen und die Messung der Größe wurden mit Hilfe der Lichtstreuung durchgeführt.

Beispiel 2 Micro-Bestimmung

0,01 ml vor dem Koagulieren geschütztes Gesamtkapillarblut wurden im Verhältnis von 1 : 10 mit einer isotonischen Salzlösung verdünnt, und 0,1 ml des erhaltenen Gemisches wurden zu 0,32 ml einer 0,125%igen Lösung von Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat in isotonischer Salzlösung hinzugegeben und das erhaltene Gemisch etwa 1 min bei Raumtemperatur bebrütet.

Das Gemisch wurde danach unter Rühren mit 0,42 ml einer phosphatgepufferten Formaldehydlösung mit einem Gehalt von 8 Vol.-% Formaldehyd versetzt und das erhaltene Gemisch bei 57°C 2 min lang bebrütet.

A. Bestimmung der weißen Blutkörperchen

Die differentielle Zählung der weißen Blutkörperchen der obigen Suspension wurde durch Lichtstreuung gemessen.

B. Bestimmung der Blutplättchen

Das obige bebrütete Gemisch wurde mit 1,2 ml isotonischer Salzlösung versetzt. 0,1 ml des erhaltenen Gemisches wurden zu 1,0 ml einer mit 0,5% Essigsäure angesäuerter isotonischer Salzlösung hinzugefügt. Die Zählung der Blutplättchen und die Bestimmung der Größe erfolgten durch Lichtstreuung.

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung einer Zellsuspension aus einer verdünnten Blutprobe zur Unterscheidung von weißen Blutkörperchen und Blutplättchen von anderen Blutteilchen durch Zusatz eines Fixiermittels und Hämolyse der Erythrocyten, dadurch gekennzeichnet, daß man

• (a) eine am Koagulieren gehinderte Blutprobe mit Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat, Polyoxyethylen-23- monolaurylether oder Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonooleat als einem Detergens versetzt, das die roten Blutkörperchen für die anschließende Hämolyse vorbehandelt, ohne die Morphologie der weißen Blutkörperchen zu beeinträchtigen;
• (b) das Fixiermittel unter Aufrechterhaltung des neutralen pH-Wertes des Gemisches zumischt und
• (c) das erhaltene Gemisch zur Durchführung der Hämolyse bei einer Temperatur von 55 bis 62°C mindestens 2 min bebrütet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Detergens Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat in einer Menge verwendet, daß eine Konzentration in dem Gemisch von 0,3 bis 2,0% (Volumen/Volumen) erhalten wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe (a) die mit dem Detergens versetzte Blutprobe etwa 1 min bei Raumtemperatur inkubiert.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch in Stufe (b) nach dem Zusatz des Fixiermittels bei einem pH-Wert von 6 bis 8 hält.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fixiermittel eine phosphatgepufferte Formaldehydlösung verwendet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur in Stufe (c) bei etwa 58°C und die Inkubationszeit bei 2 min hält.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung von weißen Blutkörperchen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verdünnung der Probe mindestens teilweise nach der Bebrütungsstufe (c) unter Verwendung einer isotonischen Salzlösung durchführt, wobei man für das erhaltene Gemisch einen pH-Wert von 6 bis 8,5 wählt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung von weißen Blutkörperchen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verdünnung der Probe mindestens teilweise vor der Behandlung mit dem Detergens in Stufe (a) durchführt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung von Blutplättchen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verdünnung der Probe nach der Bebrütungsstufe (c) unter Verwendung einer angesäuerten isotonischen Salzlösung durchführt und für das erhaltene Gemisch einen pH-Wert von 2 bis 4 wählt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die isotonische Salzlösung mit Essigsäure ansäuert.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verdünnung der Probe teilweise durch Zusatz der isotonischen Salzlösung vor der Behandlung mit dem Detergens in Stufe (a) durchführt.