DE2902158A1

DE2902158A1 - Verfahren zur herstellung von fibrinogen, einem die gerinnungsfaktoren ii, vii, ix und x enthaltenden prothrombinkomplex, antithrombin iii und einer loesung von lagerstabilen serumproteinen

Info

Publication number: DE2902158A1
Application number: DE19792902158
Authority: DE
Inventors: Ronald Dipl Chem Dr Kotitschke; Wolfgang Dipl Chem Dr Stephan
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Priority date: 1979-01-20
Filing date: 1979-01-20
Publication date: 1980-07-31
Also published as: EP0014333B1; ATE384T1; JPS55100319A; EP0014333A1; DE3060075D1; US4272523A

Description

-I₁-Unsere Nr. 22 174 Ec/br

BIOTEST-Serum-Institut GmbH

Plughafenstraße 4

6000 Frankfurt-Niederrad

Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen, einem die Gerxnnungsfaktoren II, VII, IX und X enthaltenden Prothrombinkomplex, Antithrombin III und einer Lösung von lagerstabilen Serumproteinen. .

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen, einem die Gerxnnungsfaktoren II, VII, IX und X enthaltenden Prothrombinkomplex, der Antithrombin III enthalten kann, Antithrombin III und einer Lösung von lagerstabilen Serumproteinen aus einem mit Citrat stabilisierten Blutplasma, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man aus dem Plasma durch Adsorption an kolloidaler Kieselsäure mit einer spezifischen Oberfläche von 50 bis 400 m /g, die in einer Konzentration von 50 bis ¹IOO mg je g Plasmaprotein angewendet wird, Fibrinogen isoliert; anschließend entweder (a) zunächst durch Ultrafiltration oder Dialyse Citrat- und Calciumionen entfernt und dann aus der Proteinlösung über Proteine adsorbierenden Anxonenaus tauschern oder Tricalciumphosphat die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und Antithrombin III adsorbiert oder (b) die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X vor der Ultrafiltration oder Dialyse adsorbiert, wobei Antithrombin III nicht gleichzeitig adsorbiert wird, und Antithrombin III erst nach der Entfernung der Citrat- und Calciumionen durch Ultrafiltration oder Dialyse an den genannten Adsorbentien adsorbiert; und sodann aus der verbleibenden Plasmaflüssigkeit weitere unstabile Proteine durch

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eine errrmte Adsorption an kolloidaler Kieselsäure entfernt und eine Lösung von lagerstabilen Serumproteinen gewinnt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden aus einem mit Citrat stabilisierten Blutplasma unter Vermeidung des Gerinnungsvorganges drei gerinnungsaktive₉ hepatitissichere und therapeutisch anwendbare Eiweißpräparate und ein gerinnungsinaktives, hepatitissicheres Serum bzw. eine Lösung lagerstabiler Serumproteine erhalten» Die drei gerinnungsaktiven Präparate sind;

1. Fibrinogen

2. Prothrombinkomplex (Gerinnungs f akt oren H₉ VII, IX und X, gegebenenfalls AT III-haltig)

3. Antithrombin III (AT III).

Die Gerinnungs f akt oren H₁ VII₁, IX und X werden bekanntlich auch als PPSB-Faktoren bezeichnet gemäß folgender Bedeutungj_

P = Prothrombin (Faktor II)

P ~ Proconvertin (Faktor VII)

S = Stuart-Prower-Faktor (Faktor X)

B = antihämophiles Globulin B (Faktor IX),

In der DE-OS 2Φ· 59 291 ist ein Verfahren zur Herstellung eines antihämophiles Globulin A enthaltenden Konzentrats neben einem Prothrombin-Komplex und einer Lösung von lagerstabilen Serumproteinen beschrieben,, bei dem als Ausgangsmaterial ein gefrorenes Ionenaustauscherplasma verwendet wird, das bei Temperaturen von 2 bis 8°C wieder aufgetaut wird und aus dem die überstehende Plasmaflüssigkeit von dem Faktor-VIII-enthaltenden Proteinniederschlag abgetrennt und dieses Kryopräzipitat in an sich bekannter Weise zu einem Faktor-VIII-

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Konzentrat aufgearbeitet wird, während die Plasmaflüssigkeit durch Adsorption über handelsüblichem Tricalciumphosphast von den Faktoren II, VII, IX und X befreit wird, und anschließend aus der Plasmaflüssigkeit über kolloidaler Kieselsäure mit einer spezifischen Oberfläche von 50 bis 400 m /g die noch im Plasma vorliegenden Gerinnungsfaktoren und andere unstabile Proteine adsorbiert werden und eine Lösung von lagerstabilen Serumproteinen zurückbleibt.

In der gleichlaufenden deutschen Patentanmeldung (

(unsere Nr. 22 214), die einen Zusatz zu P 25 59 291.4 darstellt, wird eine Abänderung des vorstehend beschriebenen Verfahrens vorgeschlagen, bei der als Ausgangsmaterial ein übliches Citratplasma verwendet und nach dem Auftauen und Abtrennen des Kryopräzipitates der überstand mit Anionenaustauseherharzen auf Basis Polystyrol/Divinylbenzol/ quaternäres Amin und Kationenaustauscherharzen auf Basis Polystyrol/Sulfonat behandelt wird. Bei diesemVerfahren wird also Citratplasma in Ionenaustauscherplasma verwandelt und aus diesem Ionenaustauscherplasma läßt sich neben antihämophilem Globulin A₉ dem Prothrombinkomplex und lagerstabilen Serumproteinen noch Fibrinogen herstellen. .

überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man zur Herstellung von Fibrinogen, einem die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X enthaltenden Prothrombinkomplex und einer Lösung von lagerstabilen Serumproteinen nicht nur Ionenaustauscherplasma - wie es in den genannten Anmeldungen verwendet wird -, sondern auch ein über kolloidaler Kieselsäure mit einer spezifischen Oberfläche von 50 bis 400 m /g adsorbiertes und dialysiertes oder ultrafiltriertes Citratplasma verwenden kann,

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Der im erfindungsgemäßen Verfahren herstellbare Prothrom™ binkomplex enthält angereichert Anithrombin IH₉ das sich von den Paktoren II, VII, IX und X trennen läßt und als zusätzliches Produkt gewonnen werden kann. Mach der schrittweisen Elimination der Gerinnungsfaktoren aus dem Citratplasma erhält man die Lösung lagerstabiler Serumproteine.

Die Herstellung von Antithrombin III neben dem Prothrombinkomplex ist auch möglich, ohne daß dabei zunächst ein Antithrombin Ill-haltiger Prothrombinkomplex hergestellt werden muß.

In den DE-PSn 16 17 319 und 16 17 335 wurde die Verwendung von kolloidaler Kieselsäure in einer Konsentration von 250 bis 500 mg je Gramm Gesamtprotein bei Temperaturen von 20 bis 50°C zur Entfernung von Lipoproteinen und Fibrinogen besehrieben. Ziel der zitierten Patentschriften war die Herstellung stabiler und steriler Serumproteinlösungen.

überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei Verwendung geringer Konzentrationen an kolloidaler Kieselsäure bei der Adsorption von Citratplasma bei Temperaturen von 1 bis 37 0 nahezu spezifisch Fibrinogen an die kolloidale Kieselsäure gebunden wird, während die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X in dem von der kolloidalen Kieselsäure befreiten "Rest-Citratplasma" erhalten bleiben. Diese Trennung erfolgt besonders gut bei Temperaturen von 2 bis 6°C, insbesondere 4°C.

Durch die Entfernung des Fibrinogens aus dem Citratplasma wird es möglich, dieses "Citratplasma"zu dialysieren oder zu ultrafiltrieren, um somit die Citrat™ und Calciumionen aus diesem "Plasma" zu entfernen. Die Dialyse oder Ultrafiltration eines fibrinogenhaltigen Citratplasmas ist nicht

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möglich, weil es durch die Entfernung des Citratstabilisators auch ohne die Gegenwart von Calciumionen zu Fibrinogenfällungen kommt, die die Membranen verstopfen und die technische Durchführung einer Dialyse oder Ultrafiltration prinzipiell unmöglich machen.

Die nachstehende Tabelle I zeigt die Abhängigkeit der Konzentration des Pibrinogens und der Paktoren II, VII, IX und X sowie des Paktors XII von der bei der Adsorption angewandten Konzentration der kolloidalen Kieselsäure ("Aerosil AE 38O", geschütztes Warenzeichen der Pa. Degussa) unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und den in den DE-PSn 16 17 335 und l6 17 319 genannten Bedingungen. Als Ausgangsmaterial a wurde ein unbehandelter Citratplasmapool eingesetzt; als Ausgangsmaterial b wurde ein mit ß-Propiolacton und UV-Bestrahlung behandelter Citratplasmapool verwendet. Durch die Behandlung von Plasma mit ß-Propiolacton und UV-Bestrahlung wird zwar die Aktivität der Gerinnungsfaktoren vermindert (R.Kotitschke und W. Stephan: Struktur und Funktion des Fibrinogens. Schattauer-Verlag, Stuttgart - New York 1976, S. 222 - 228); diese Behandlung mit ß-Propiolacton und UV-Bestrahlung dient jedoch der Sterilisation, um womöglich im-Plasma vorhandene Viren zu inaktivieren und insbesondere die Hepatitisfreiheit der Proteinfaktoren zu gewährleisten. . .

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Tabelle J

Abhängigkeit der Konzentration der Gerinnungsfaktoren von der bei der Adsorption angewandten Konzentration der kolloidalen Kieselsäure

Kieselsäure Aktivität der Paktoren in % Fibrinogen mg/g Protein der Norm mg/100 ml

II VII IX X XII

0(Ausgangs- material a )	100	100	100	100	100	320
250 bei +4^CC	95	92	98	95	0	0
500 bei 45°C	0	0	0	0	0	0
0 (Ausgangs- material b ⁺)	50	60	60	55	55	200
250 bei +4⁰C	45	55	55	50	0	0
500 bei + 45⁰C	0	0	0	0	0	0

Human-Citratplasmapool

mit ß-Propiolacton und UV-Bestrahlung behandelter Human-Citratplasmapool

Die Beaeichnung "Restcitratplasma" soll deutlich machen, daß die Bezeichnung dieser Proteinlösung zu Nomenklatur-Schwierigkeiten führt, da üblicherweise unter Plasma eine Proteinlösung verstanden wird, die noch Fibrinogen in gerinnbarer Form enthält. Fibrinogenfreie Proteinlösungen werden üblicherweise als Serum bezeichnet, so daß man das "Restcitratplasma" auch als "Resteitratserum" bezeichnen könnte. Unter einem Serum versteht man jedoch die Protein-

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- ίο -

lösung, die aus einem Plasma oder aus B^lut ertsteht, nachdem der Gerinnungsvorgang abgelaufen ist. In der erfindungsgemäß mit kolloidaler Kieselsäure adsorbierten Proteinlösung sind nun aber die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X noch als Proenzyme bzw. in aktivierbarer Form enthalten und somit auch noch für einen Gerinnungsablauf zu verwenden, während das Fibrinogen nicht mehr vorhanden ist.

Werden nun durch Dialyse oder Ultrafiltration das ursprünglich für die Stabilisierung des Blutes erforderliche Citrat und gleichzeitig auch die Calciumionen aus der mit kolloidaler Kieselsäure adsorbierten Proteinlösung entfernt, so erhält man eine stabilisatorfrexe Proteinlösung, die noch gerinnungsaktive Gerinnungsfaktoren enthält.

Die nachstehende Tabelle II zeigt die Zusammensetzung des Citratplasmas und der erfindungsgemäß nach Adsorption an kolloidaler Kieselsäure und nach Ultrafiltration erhaltenen Lösungen im Hinblick auf den Gehalt an Protein, Fibrinogen, Citrat und Calciumionen.

	Protein g/100 ml	Tabelle II	Citrat mäq/l	Ca^{+ +} mäq/l
Gehalt an:	5,65	Fibrinogen mg/100 ml	60
Citratplasma		320
Nach SiO₉-	5,29		60	4,4
Adsorption	5,20	0	0,5	0,30
Nach Ultra filtration	0

Das unterschiedliche verhalten eines normalen Citratplasmas im Vergleich zu dem mit kolloidaler Kieselsäure adsorbierten und ultrafiltrierten Citratplasma wird auch aus der folgenden Tabelle III deutlich. Mit 1,5 g DEAE-Sephadex A-50 pro 1 1 Plasma werden etwa 8 % der Proteine aus dem Citratplasma

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adsorbiert, während aus de-a -an Kieselsäure, adsorbierten und ultrafiltrierten Plasma unter diesen Bedingungen etwa 23 % der Plasmaproteine adsorbiert werden.

Tabelle III Proteinkonzentration in g/100 ml

Citratplasma Citratplasma an normal adsorbiert und __^ ultrafiltriert

Ausgang 5»65 ' 5»20

DEAE-Sephadex A-50

(1,5 g/l) 5,20 4,00

% A-50
(0,5 g/l) 5,40 4,70

Aus. der nach der SiQp-Adsorption und Ultrafiltration oder Dialyse erhaltenen Lösung lassen sich die Gerinmungsfaktoren II, VII, IX und X sowie Antithrombin III an Triealeiumphosphat oder überraschenderweise auch an Proteine adsorbierenden Αηχοnenausbausehern, insbesondere Diethylaminoethy!gruppen tragende, quervernetzte Dextrane oder Cellulose, ζ.B. an "DEAE-Sephadex" oder "DEAE-Cellulose* adsorbieren.

Die nachstehende Tabelle IV zeigt in einem Vergleich die unterschiedliche Adsorbierbarkeit von Antithrombin III aus normalem und mit kolloidaler Kieselsäure adsorbiertem und ultrafiltriertem Citratplasma» Als kolloidale Kieselsäure wurde "Aerosil 380" (AE 3B0) verwendet.

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Tabelle IV
Adsorbierbarkeit von AT III

AT III in Citratplasma normal (IU⁺/ml)

AT III in Citratplasma

AE 380, ultrafiltriert

(IU⁺ZmI)

Aus gangsmaterial

nach Adsorption mit "DEAE-Sephadex A 50"

19,1

17,5

19,1

10,3

⁺Iü = Inhibitor-Einheiten (Inhibitor Units) gemäß der Bestimmung mit einem Peptidsubstrat (Tos-Gly-Pro-Arg-pNA).

Das Antithrombin III läßt sich zusammen mit den PPSB-Faktoren mit Hilfe citrathaltiger Lösungen vom Tricalciumphosphat oder von den Proteine adsorbierenden Anionenaustauschern eluieren. Die Bedeutung dieses Befundes liegt darin, daß bisherigen PPSB-Präparaten ohne Antithrombin III ein Thromboserisiko angelastet wurde (S. Chandra und M. Wickerhauser: Preparation of a Nonthrombogenic Prothrombin Complex Concentrate. Thrombos. Haemostas. VI Int.Cong., Schattauer Verlag, Stuttgart-NewYork, 1977, S. 219).

Daher wurde in den letzten Jahren die Forderung aufgestellt, PPSB-Präparate mit entsprechenden Tests auf ihr Thromboserisiko hin zu überprüfen, wobei als Maß für das Thromboserisiko die TGt₅₀-ZeXt eingeführt wurde. Mit der TGt₅₀-ZeIt wird die Inkubationszeit bestimmt, die erforderlich ist, um eine Fibrinogengerinnungszeit von 50 Sekunden zu erreichen. Mit ihrer Hilfe wird also die Bildung von Thrombin bestimmt. (J.D.Cash, G.Sas, R.G. Dalton u.R. Owens: Thrombogenicity of Factor IX Concentrates. Workshop on inhibitors of factors VIII and IX, Wien 26. - 27. 1. 1976, S. 112-117).

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PPSB-Präparate ohne Antithrombin III besitzen TGt_cn-Zeiten unter 20 Minuten, wenn sie unter Verwendung von "DEAE-Sephadex" aus Citratplasma hergestellt werden, während die entsprechenden Antithrombin-Ill-haltige« PPSB-Präparate aus mit Aerosil adsorbiertem und ultrafiltriertem Citratplasma von über 5 Stunden besitzen.

Bei den in der Literatur beschriebenen, bekannten Verfahren (J. Heystek, H.G.J.Brummelhuis, H.W. Krijnen; Contributions to the Optical Use of Human Blood. II. The Large-Scale Preparation of Prothrombin Complex. A Comparison
between 2 Methods Using the Anion Exchangers DEAE-Cellulose DE 52 and DEAE-Sephadex A 50. Vox.Sang. 25: Nr. 2 S.II3-123 (1973)) der Herstellung von PPSB aus Citratplasma unter Verwendung von DEAE-Sephadex A 5o"bzw."DEAE-Cellulose"wurden die PPSB-Faktoren mit Citrat/NaCl-Pufferlösungsn vom
Absorbens eluiert. überraschenderweise wurde nun gefunden, daß - wie in Tabelle IV gezeigt - Antithrombin III mit an
Proteine adsorbierenden Anionenaustauscherharzen, z.B.
"DEAE-Sephadex A 50" oder"DEAE-Cellulose", adsorbiert wird, wenn die Citrationenkonzentratxon im Citratplasma stark
erniedrigt wird*. Die Tabelle V zeigt, wie entscheidend die Citratkonzentration für die Antithrombin III-Adsorbierbarkeit an die genannten Adsorbentien ist.

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- in -

Tabelle V

Abhängigkeit der AT III-Adsorbierbarkeit an "DEAE-Sephadex A 50" von der Citratkonzentration in einem mit "Aerosil 380" adsorbierten und anschließend dialysierten oder ultrafiltrierten Citratplasma,

Citrat AT III in IU/ml

Vor DEAE-Sephadex- Nach DEAE-Sephadex-Adsorption Adsorption

63 17,5 17,0

10 17,5 16,8

2,5 17,5 15,9

0,5 17,5 10,5

Aus den Daten der Tabelle V wird auch der überraschende Befund verständlich, daß man z»B. gemäß Abb. I ein Antithrombin III-Präparat dadurch gewinnen kann, daß man mit kolloidaler Kieselsäure adsorbiertes und anschließend ultrafiltriertes oder dialysiertes Citratplasma mit Proteine adsorbierenden Anionenaustauschern, z.B. "DEAE-Sephadex A 50" adsorbiert und das adsorbierte Antithrombin III anschliessend durch niedrige Citratkonzentrationen, z.B. 0,01M Citrat in physiologischer NaCl-Lösung, eluiert. Unter diesen Bedingungen werden die PPSB-Faktoren nicht vom "DEAE-Sephadex" eluiert,, In Abhängigkeit von der Citratkonzentration des Elutionsmittels wird Antithrombin III mehr oder weniger eluiert. Da es aus den vorstehend aufgeführten Gründen wünschenswert ist, Antithrombin III im PPSB zu haben (Minderung des Thromboserisikos), wird man bei der Elution des Antithrombin III von den Proteine adsorbierenden Anionenaus tauschern zur Herstellung eines Antithrombin-III-Konzentrats eine Citratkonzentration wählen, bei der nicht das gesamte Antithrombin III eluiert wird, sondern noch etwas Antithrombin III an den Proteine adsorbierenden An-

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ionenaustauschern verbleibt und erst mit den PPSB-Faktoren zusammen vollständig eluiert wird.

Das an die kolloidale Kieselsäure adsorbierte Fibrinogen läßt sich mit 5 bis 20 % Alkalihalogenide enthaltenden Pufferlösungen, z.B. citrathaltigen 10 bis 20#igen Kochsalzlösungen, bei pH-Werten von 8,0 bis 10,0 eluieren. Gerinnbares Fibrinogen läßt sich durch Ultrafiltration dieser Lösungen und anschließender Alkoholfraktionierung gewinnen.

Durch erneute Adsorption mit kolloidaler Kieselsäure gemäß den in den obengenannten Patentschriften angegebenen Bedingungen oder auch davon abweichenden Adsorptionsbedingungen bezüglich der SiOp-Konzentration, Temperatur und Zeit₉ erhält man unter Adsorption von Lipiden aus der über Tricalciumphosphat oder Proteine adsorbierenden Anxonenaustausehern adsorbierten Proteinlösung eine Lösung lagerstabiler Serumproteine, die frei von Gerinnungsfaktoren oder Metaboliten der Gerinnungsfaktoren ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X, Fibrinogen und Antithrombin III läßt sich auch realisieren, wenn aus dem Citratplasma (gegebenenfalls nach Entfernung von Kryopräzipitat) zunächst die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X (PPSB) durch Adsorption mit Proteine adsorbierenden Anionenaustauschern entfernt werden und dieses Plasma anschließend mit kolloidaler Kieselsäure zur Adsorption des Fibrinogens gemischt wird. Bei diesem Vorgehen wirkt sich allerdings die

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häufig bereits ablaufende Fibrinolyse gegebenenfalls nachteilig auf die Fibrinogen£3winnung aus. Das von der kolloidalen Kieselsäure getrennte "Citratplasma".dient dann nach seiner Ultrafiltration als Ausgangsmaterial zur Gewinnung des Antithrombin III und der Lösung der Serumproteine, wobei das Antithrombin III durch Adsorption an Tricalciumphosphat oder Proteine adsorbierenden Anionenaustauschern und anschließende Elution gewonnen wird. Diese Variante ist in Abb. II dargestellt.

Die Abb. III und IV zeigen weitere Ausführungsformen, bei denen die Reihenfolge der Adsorptions-und Ultrafiltrationsschritte verändert wurde. Allen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist gemeinsam, daß ein Citratplasma durch Adsorption mit kolloidaler Kieselsäure und danach erfolgende Ultrafiltration oder Dialyse in die günstigste weiter zu verarbeitende Form gebracht wird_s die unter Vermeidung der in der Proteinfraktionierung üblichen Fraktioniermethoden, die alle einen ungünstigen Einfluß auf die native Struktur der Proteine haben, die gleichzeitige Herstellung mehrerer gerinnungsaktiver Produkte und einer gerinnungsinerten Lösung vonSerumproteinen erlaubt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als Ausgangsmaterial ein mit Citrat stabilisiertes Plasma verwendet. Aus diesem Plasma kann in an sich bekannter Weise zunächst durch Auftauen bei Temperaturen nahe +4⁰C ein Kryopräzipitat gewonnen werden, das dann weiter zu Konzentraten von antihämophilem Globulin A aufgearbeitet werden kann. Mit dem vom Kryopräzipitat befreiten Plasma läßt sich dann das erfindungsgemäße Verfahren durchführen. Es ist aber auch möglich, ein Citratplasma, das nicht vom Kryopräzipitat befreit wurde, zu verwenden. Das verwendete Citratplasma muß also nicht tiefgefroren gewesen sein und kann, wenn es tiefgefroren war, rasch auf Temperaturen von

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+37⁰C aufgetaut und direkt im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Vorzugsweise verwendet man ein Citratplasma, das nach seiner Gewinnung eingefroren wurde und bei O bis 8⁰C oder auch bei +37°C aufgetaut wird. Die gewählte Auftautemperatur entscheidet darüber, ob man in einem Fall größeren Wert auf die bekannte Herstellung von Kryopräzipitat bzw. antihämophilem Globulin A oder aber auf die Herstellung von fibrinogen legt. Obwohl beide Produkte nebeneinander herstellbar sind, ist die Pibrinogenausbeute aus Von Kryopräzipitat befreitem Plasma deutlich geringer als bei der Verarbeitung eines Plasmas, dem das Kryopräzipitat nicht entzogen wurde, da bekanntermaßen Kryopräzipitat sehr viel Fibrinogen enthält. Vor der Adsorption des Plasmas mit kolloidaler Kieselsäure wird das Plasma in bekannter Weise bei pH-Werten von 6,5 bis 8,0 mit ß-Propiolacton und sodann mit UV-Bestrahlung behandelt, um die Hepatitissicherheit der Produkte zu gewährleisten. Das mit kolloidaler Kieselsäure adsorbierte "Citratplasma" aus dem gegebenenfalls die PPSB-Faktoren bereits durch Adsorption an Proteine adsorbierenden Anionenaustauschern entfernt wurden, kann nach einer^Ausführungsfornr^gemäß Abb. I bis IV weiterverarbeitet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorteile gegenüber den bekanntenfyerfahren: -

1. Das als Ausgangsmaterial verwendete Citratplasma fällt üblicherweise bei Blutspenden und Plasmapheresen an und ist daher verhältnismäßig leicht erhältlich.

2. Die sich bezüglich der technischen Verarbeitung ergebenden Probleme der Sterilisation und Pyrogenfreihaltung von Ionenaustauschern auf Basis von Polystyrol, wie sie zur

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Herstellung von Ionenaustauscherplasma erforderlich sind, sowie deren erhebliche Kosten entfallen.

3. Die Probleme der Ionenaustauscherharze auf Basis von Polystyrol, wie z.B.· Abrieb und mögliche Abgabe von niedermolekularen Bestandteilen aus den Harzen, entfallen.

4. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhälliche Fibrinogen ist noch nicht durch Fibrinolyse abgebaut, wie es sonst in Plasmalösungen üblich ist, aus denen das Fibrinogen nicht sofort nach dem Auftauen des Plasmas entfernt wird»

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

A. Herstellung von aniihämophiles Globulin A enthaltendem Konzentrat ^ ,

Neun Teile Spender-Venenblut wurden zu einem Teil einer 3,Beigen Natriumcitrat-Stabilisatorlösung gegeben. Das Blut wurde möglichst bald nach der Blutentnahme zentrifugiert und die in physiologischer Kochsalzlösung aufgeschlemmten Erythrozyten dem Spender reinfundiert. Das Plasma wurde spätestens innerhalb von 48 Stunden bei -4O°C eingefroren.

Das gefrorene Plasma wurde bei einer Temperatur von +2 bis +4⁰C aufgetaut. Es wurde durch Einzelgefäßzentrifugierung zentrifugiert. Aus der erhaltenen Kälteausfällung (Kryopräzipitat) ließ sich in bekannter Weise ein Konzentrat herfctellen, das antihämophiles Globulin A enthielt.

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B. Herstellung von hepatitissicherem Fibrinogen

Der in Stufe A beim Zentrifugieren erhaltene kryopräzipitatfreie Citratplasmapool wurde bei Raumtemperatur bis zu einer Konzentration von 0,25 Vol.-SS mit frisch destilliertem ß-Propiolacton versetzt. Es wurde eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt und während dieser Zeit durch kontinuierliche Zugaben von IN NaOH-Lösung der pH-Wert bei 7,2 gehalten. Nach UV-Bestrahlung mit einem ÜV-Durchfluß-Bestrahlungsgerät (Dill-Apparatur) wurde die Hydrolyse des ß-Propiolactons durch kontinuierliche Zugabe von IN NaOH unter Konstanthaltung des pH-wertes zu Ende geführt, bis eine pH-Konstanz ohne weitere NaOH-Zugabe erreicht war. Das mit ß-Propiolacton behandelte und ÜV-bestrahlte Citratplasma wurde auf 4°C abgekühlt und bis zu einer Konzentration von 1,5 g kolloidaler Kieselsäure/100 ml Plasma bzw. 250 mg je g Protein mit "Aerosil 380" gemischt. Anschließend wurde zentrifugiert und der Niederschlag zur Fibrinogengewinnung weiterverarbietet, während der überstand als Ausgangsmaterial für die Herstellung von PPSB/AT III und der Lösung lagerstabiler Serumproteine verwendet wurde.

Der Aerosil-Niederschlag wurde mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend das Fibrinogen mit einer citrathaltigen 152igen NaCl-Lösung bei pH 9,5 eluiert. Diese Fibrinogenlösung wurde anschließend zur Entfernung der hohen Kochsalzkonzentration ultrafiltriert. Die ultrafiltrierte Fibrinogenlösung wurde durch eine der Cohn-Fraktionierung analoge Ethanol-Fällung weiter gereinigt. Das mit Ethanol gefällte Fibrinogen wurde in citrathaltiger physiologischer Kochsalzlösung gelöst, anschließend sterilfiltriert und gefriergetrocknet.

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C. Herstellung von AT Ill-haltigem Prothromb.inkomplex

10 1 fibrinogenfreies Citratplasma, die nach der Arbeitsweise von Stufe B erhalten worden waren, wurden bei Zimmertemperatur ultrafiltriert, wobei (unter Anwendung des Hollowfiber-Systems der Firma Amicon) gegen O,45#ige NaCl-Lösung dialysiert und zunächst das Plasmavolumen auf 2/3 des Ausgangsvolumens ankonzentriert wurde. So wurden die 10 1 Plasma in 15 Minuten auf 7 1 ankonzentriert und anschließend in 3 Stunden gegen 70 1 O,45#ige NaCl-Losung dialysiert. Unter diesen Bedingungen sank die Citratkonzentration von 60 mäq/1 unter 1 mäq/1. Anschliessend wurde durch Zugabe von O,45£iger NaCl-Lösung das Ausgangsvolumen wieder hergestellt. Dieses vcn Fibrinogen befreite und ultrafiltrierte "Citratplasma" diente als Ausgangsmaterial für die Herstellung des AT Ill-haltigen PPSB-Konzentrats.

Durch Zugabe von Tricalciumphosphat bis zu einer Konzentration von O₃8 Gew,^j£ zu der vorstehenden Proteinlösung und Rühren dieser Mischung bei +4⁰C für 45 Minuten und anschließende Zentrifugation in Bechern wurde das AT III-haltige PPSB durch Elution mit einer 0,05M Trinätriumcitratlösung von dem Tricalciumphosphat-Niederschlag getrennt, während der überstand des Tricalciumphosphat-Niederschlages als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Lösung lagerstabiler Serumproteine diente.

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Die AT Ill-haltige PPSB-Lösung wurde entweder direkt weiter auf ein AT Ill-haltiges PPSB-Konzentrat aufgearbeitet oder diente als Ausgangsmaterial zur Herstellung von PPSB und einem AT III-Präparat.

Wurde ein AT III-haltiges PPSB-Konzentrat hergestellt, so wurden die Triealciumphosphat-Eluate mit kolloidaler Kieselsäure (0,5 Gew.-^) adsorbiert und die PPSB/AT Illhalt ige Lösung nach Entfernung der kolloidalen Kieselsäure durch Zentrifugation mit einem Ultrafiltrationsgerät ankonzentriert bis die Paktor IX-Aktivität der Lösung 30 Einheiten pro ml betrug«

^D· Herstellung von AT III und PPSB-Konzentrat

Die in Stufe C erhaltene AT Ill-haltige PPSB-Lösung wurde gegen 0,9 #ige NaCl-Lösung dialysiert, wobei die Citratkonzentration auf einen Wert von ¹JO mäq/1 sank. Aus dieser Lösung wurden durch Adsorption mit DEAE-Sephadex A 50 (Diethylaminoethyl-Sephadex, Handelsname der Pa. Pharmacia Fine Chemicals für ein mit Epichlorhydrin quervernetztes Dextran) die PPSB-Faktoren*, die O₅OlM Citrat enthielt, bei pH 7,0 eluiert. Der DEAE-Sephadex A 50-überstand enthielt das AT III und wurde durch Ankonzentrierung durch Ultrafiltration auf die zehnfache Konzentration eines Normalplasmas gebracht, sterilfiltriert und gefriergetrocknet.
+) adsorbiert und anschließend mit einer 2M NaCl-Lösung

E. Herstellung einer Lösung lagerstabiler Serumproteine

Das in Stufe C als überstand des Tricalciumphosphat-Niederschlages verbliebene Restplasma wurde 3 Stunden bei 45°C mit kolloidaler Kieselsäure (Aerosil 38O der Firma Degussa) gemischt, wobei pro 1 1 Plasma 2 g Aerosil 38O eingesetzt wurden, und gerührt. Anschliessend wurde die kolloidale Kieselsäure durch Zentrifuga-

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tion in Bechern abgetrennt. Die Proteinlösung wurde ultrafiltriert und auf eine Proteinkonzentration von 5 g/100 ml ankonzentriert.

Anschließend wurde diese Proteinlösung über heißluftsterilisierte Membranfilter der Pcrengröße 0,45 und 0,22 p. in leere sterile Flaschen abgefüllt.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß das Kryopräzipitat nicht aus dem Ausgangsplasraa entfernt wurde.

Beispiel 3

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde für die Stufen A, B, C und E wiederholt, während in Stufe D bei der Herstellung von AT III und PPSB aus der AT Ill-haitigen PPSB-Lösung diese zunächst durch Ultrafiltration auf 1/5 ihres Ausgangsvolumens ankonzentriert wurde, bevor die Adsorption des PPSB mit DEAfi-Sephadex A 50 erfolgte.

Beispiel 4 (gemäß Abb. I)

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde für die Stufen A und B wiederholt.

C. Herstellung von AT III und AT III-haltigem Prothrombinkomplex '

10 1 fibrinogenfreies Citratplasma, die nach der Arbeitsweise von Stufe B des Beispiels 1 erhalten worden waren, wurden nach der Arbeitsweise von Stufe C des Beispiels 1 ultrafiltriert.

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Das so erhaltene ultrafiltrierte Plasma wurde bei einem pH-Wert von 7,2 unter Rühren mit β,5 g DEAE-Sephadex A 50 pro 1 Plasma adsorbiert, die vorher wie folgt behandelt worden waren:

150 g DEAE-Sephadex A 50 wurden etwa 20 Stunden in 10 destilliertem Wasser gequollen. Das über dem gequollenen Gel stehende Wasser wurde abgesaugt und durch frisches Wasser ersetzt. Das Gel wurde aufgerührt, und nach dem Absetzen wurden die feinen, noch suspendierten Teilchen abgesaugt. Diese Arbeitwweise wurde noch einmal wiederholt. Anschließend wurde das gequollene und in Wasser suspendierte Gel 20 Minuten bei 121°C sterilisiert.

Nach der Adsorption am DEAE-Sephadex A 50 wurde das Plasma vom Sephadex abgesaugt und diente als Ausgangsmaterial für die weitere Aufarbeitung auf AT III und die Lösung von Serumproteinen.

Das Sephadex A 50 wurde zweimal mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und dann pro 0,5 g Sephadex A (Trockengewicht) für 20 Minuten bei Zimmertemperatur mit 100 ml eines 0,01M Citratpuffers vom pH-Wert 7,0, der 0,2M an NaCl war, eluiert, der wie folgt erhalten worden war:

11*69 g NaCl und 2,29 g Trinatriumcitrat wurden in etwa 800 ml HpO gelöst.. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von IN HCl auf pH 7,0 eingestellt. Diese Lösung wurde mit H₂O auf 1 1 aufgefüllt.

Diese Elution wurde wiederholt. Die vereinigten AT III-Eluate wurden mit einem Ultrafiltrationsgerät(der Fa. Amicon) unter Verwendung einer Ultrafiltrationspatrone ankonzentriert.

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- 2¹I -

Anschließend wurden die PPSB-Faktoren vorn DEAE-Sephadex A 50 eluiert. Diese Elution erfolgte durch Rühren mit 1Ö ml eines Ο,ΟΙΜ Citratpuffers vom pH-Wert 7,0, der 2M an NaCl war, pro 0,5 g Sephadex A 50 (Trockengewicht) für 20 Minuten bei Zimmertemperatur. Die hierbei verwendete Pufferlösung wurde wie folgt erhalten:

116,9 g NaCl und 2,29 g Trinatriumcitrat wurden in etwa 800 ml H₂O gelöst. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 N HCl auf pH 7,0 eingestellt. Diese Lösung wurde mit H₂O auf 1 1 aufgefüllt.

Die Elution wurde wiederholt. Die Ankonzentrier ung der Elüate erfolgte mit einem Ultrafiltrationsgerät (der Fa. Amicon) unter Verwendung einer Ultrafiltrationspatrone (Amicon SM 10). Das Retentat aus der Ankonzentrierung wurde mit der Gerinnungsaktivitätsmessung auf die Aktivitäten der PPSB-Faktoren überprüft. Anschließend wurde das PPSB-Konzentrat mit 5 Einheiten Heparin/ml versetzt und sterilfiltriert.

Beim Lösen des so erhaltenen PPSB-Konzentrates nach der Trocknung in destilliertem Wasser ergaben sich die in der nachstehenden Tabelle VI aufgeführten Eigenschaften.

Tabelle VI Eigenschaften des PPSB-Konzentrates

Protein Na⁺ Cl" Citrat Ca⁺⁺ Aktivität in % d.N. S.% mäq/1 mäq/1 mäq/1 mäq/1 II VII IX X

2,5 140 125 HO 45 2300 1800 2500 2500

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~ 25 -

Bei den Angaben der Tabelle VI ist zu berücksichtigen, daß das Volumen des gelösten PPSB-Präparates um etwa % größer als das abgefüllte Volumen war (Volumenvergrößerung durch die Trockensubstanz).

Das PPSB-Konzentrat hatte einen AT III-Gehalt, der etwa bis 4mal so hoch wie der eines Normalplasmas war. Die TGtC₀ eines Svilchen Präparates betrug mehrere Stunden.

D. Herstellung von AT III

a) durch Adsorption an Tricalciumphosphat

Das in Stufe C nach der Adsorption am DEAE-Sephadex A 50 vom Sephadex abgesaugte Plasma wurde mit IN NaOH auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht und mit 0,8 Gew.-% Tricalciumphosphat (Ca₁. (PO₂I)OH, Pentaealciumhydroxytriphosphat, Molekulargewicht 502,32, Art.-Nr. 21*13 von Merck) versetzt. Das Tricalciumphosphat wurde vor Gebrauch 2 Stunden auf l80°C erhitzt. Die Adsorptionszeit betrug 40 Minuten. Die anschließende Trennung des Tricalciumphosphates vom Plasma erfolgte durch Zentrifugation mit der Durchflußzentrxfuge.

Der Plasmaüberstand wurde als Ausgangsmaterial für Stufe E verwendet.

Um das Antithrombin III vom Tricalciumphosphat-Niederschlag zu eluieren, wurde dieser Niederschlag zunächst für die Dauer von 10 Minuten durch Anrühren mit etwa 33 Vol.-? an 0,9£iger NaCl-Lösung, bezogen auf das Plasmaausgangsvolumen, gewaschen. Anschließend wurde zentrifugiert. Anschließend wurde das AT III 30 Minuten bei Zimmertemperatur unter Rühren mit 5 Vol.-?,

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bezogen auf das ultrafiltrierte Plasma, an 0,05M Trinatriumcitrat-2-hydrat (Merck) bei einem pH-Wert von 8,8 bis 9,1 eluiert. Dann wurde das Tricalciumphosphat vnn der AT III-Lösung durch Zentrifugation getrennt. Eine zweite Elution des Tricalciumphosphat-Niederschlages wurde analog zur ersten Elution durchgeführt. Das verwendete Volumen des Elutionsmittels betrug 2,5 Vol.-Ä, bezogen auf das ultrafiltrierte Plasma.

Anschließend wurde bei Zimmertemperatur eine Ankonzentrierung der AT III-Lösung durch Ultrafiltration mit einem Ultrafiltratinnsgerät (der Pa. Amicon) unter Verwendung einer Ultrafiltrationspatrone (Amicon PM 10), durchgeführt. Das Retentat aus der Ankonzentrierung der Lösung ergab eine etwa 10-fache AT III-Anreicherung gegenüber Normalplasma.

Beim Lösen des erhaltenen, getrockneten AT III-Konzentrates in destilliertem Wasser wurden die in Tabelle VII aufgeführten Eigenschaften festgestellt.

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Tabelle VII Eigenschaften des AT III Konzentrates

Protein Na⁺ Cl" Citrat Ca⁺⁺ AT III in g % mäq/1 mäq/1 niäq/1 mäq/1 IU/ml

etwa

4,0-5,0 14O 25 110 45 200

Bei den Angaben in Tabelle VII ist zu berücksichtigen, daß das Volumen des gelösten AT III-Präparates um etwa 10 % größer als das abgefüllte Volumen ist (Volumenvergrößerung durch die Trockensubstanz).

b) Herstellung von AT III durch Adsorption an DEAE-Sephadex A 50 oder DEAE-Cellulose

Die in Stufe D a) beschriebene Arbeitsweise wurde wiederholt, wobei jedoch als Adsorbens anstelle von Tricalciumphosphat DEAE-Sephadex A 50 oder DEAE-Cellulose verwendet wurden.

Es wurde ein analoges Antithrombin III-Konzentrat erhalten.

^E* Herstellung einer Lösung lagerstabiler Serumproteine

Das in Stufe Da) als überstand des Tricalciuxnphosphat-Niederschlages verbliebene Plasma wurde 3 Stunden bei +45°C mit 2 % Aerosil AE 38O adsorbiert und anschliessend zur Abtrennung des Aerosils zentrifugiert. Zur Klärung dieser Proteinlösung wurde sie über heißluftsterilisierte Membranen einer Porengröße von 5,0u

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gegeben.

Um den Gehalt der nach der Aerosil-Adsorption geklärten Lösung an Silikat, Calcium und Phosphat zu verringern, wurde sie unter Verwendung von Ultrafiltrationspatronen (Amicon PM 10) bei etwa +2O°C ultrafiltriert. Die ultrafiltrierte Proteinlösung wurde sodann über heißluftsterilisierte Membranfilter der Porengröße 0,45 und 0,22 u in leere,sterile 1 1-Flaschen abgefüllt.

Das in Stufe D b) als überstand des Niederschlages aus DEAE-Sephadex Ä 50 verbliebene Plasma wurde auf gleiche Weise wie vorstehend beschrieben an Aerosil AE 38O adsorbiert, ultrafiltriert und sberxlfxltriert, um daraus die Lösung der lagerstabilen Serumproteine zu erhalten.

Für: Biotest-Serum-Institut GmbH Flughafenstraße 4 6OOO Frankfui/t-Niederrad

Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt

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Leerseite

Claims

P- Ζ-ΰ ΐ"-'·· · -τ ß, n-r-.ny au;.. *■_-■■._.., Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen,, einem die Gerinnungsfaktoren II, VII₈ IX und X enthaltenden Prothrombinkomplex, der Antithrombin III enthalten kann., Antithrombin III un:d einer Lösung von lagerstabilen Serumproteinen aus einem mit Citrat stabilisierten Blutplasma, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Plasma durch Adsorption an kolloidaler Kieselsäure mit einer spezifischen Oberfläche von 50 bis 400 m /g, die in einer Konzentration von 50 bis 400 mg je g Plasmaprotein angewendet"wird, Fibrinogen isoliert; anschließend entweder (a) zunächst durch Ultrafiltration oder Dialyse Citrat- und Calciumionen entfernt und dann aus der Proteinlösung ü'oev Proteine adsorbierenden Anionenaustauschern oder Tricalciumphosphat die Gerinnungsfaktoren II, VII₉ IX und X und Antibhrombin III adsorbiert ,oder (b) die Gerinnungsr faktoren II, VII₃ IX und X vor der Ultrafiltration oder Dialyse adsorbiert, wobei Antithrombin III nicht gleichzeitig adsorbiert wird, und Antithrombin III erst nach der Entfernung der Citrat- und Calciumionen durch Ultrafiltration oder Dialyse an den genannten Adsorbentien adsorbiert; und sodann aus der verbleibenden Plasmaflüssigkeit weitere unstabile Proteine durch eine erneute Adsorption an kolloidaler Kieselsäure entfernt und eine Lösung von lagerstabilen Serumproteinen gewinnt.

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BAD ORIGINAL

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Adsorption von Antithrömbin III und den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X aus dem mit kolloidaler Kieselsäure adsorbierten und ultrafiltrierten oder dialysierten Citratplasma Proteine adsorbierende Anionenaustauscher, insbesondere Diethylaminoethylgruppen tragende, quervernetzte Dextrane oder Cellulose, verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Adsorption von Antithrömbin III und den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X aus dem mit kolloidaler Kieselsäure adsorbierten und ultrafiltrierten oder dialysierten Citratplasma handelsübliches Tricalciumphosphat verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3> dadurch gekennzeichnet, daß man Antithrömbin III von, den Adsorbentien mit einem Citrat/NaCl-Puffer niedriger Molarität eluiert und anschliessend die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X mit einem Citrat/NaCl-Puffer höherer Molarität eluiert.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4_S dadurch gekennzeichnet, daß man durch eine zweite Adsorption an Proteine adsorbierenden Anionenaustauschern oder Tricalciumphosphat weiteres Antithrömbin III adsorbiert und durch Elution von diesen Adsorbentien gewinnt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Adsorption der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X aus dem mit kolloidaler Kieselsäure adsorbierten Citratplasma Proteine adsorbierende Anionenaustauscher, insbesondere Diethylaminoethylgruppen tragende, quervernetzte Dextrane oder Cellulose, verwendet, anschließend das adsorbierte Plasma ultrafiltriert oder dialysiert und dann Antithrömbin III an den vorstehend genannten Adsorbentien adsorbiert.

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7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6₉ dadurch gekennzeichnet, daß man das an kolloidaler Kieselsäure adsorbierte Fibrinogen mit 5 bis 20 % Alkalihalogenide enthaltenden Pufferlösungen eluiert und in bekannter Weise zu einem für therapeutische Zwecke geeigneten Fibrinogenpräparat aufarbeitet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7₉ dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial ein mit ß-Propiolacton und UV-Bestrahlung behandeltes Citratplasma verwendet .

9· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Adsorption des'Fibrinogens die kolloidale Kieselsäure in einer Konzentration von 150 bis 250 mg je g Plasmaprotein verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Adsorption über kolloidaler Kieselsäure eine Adsorption der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X an Proteine adsorbierenden Anionenaustauschern durchführt.."

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