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Verfahren zur Herstellung eines antihämophiles Globulin A
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enthaltenden Konzentrats neben einem Prothrombin-Komplex und einer
Lösung von lagerstabilen Serumproteinen (Zusatz zu P 24 59 291.4-41) Im Hauptpatent
(P (P 24 59 291.4-41) ist ein Verfahren zur Herstelleung eines antihämophiles Globulin
A enthaltenden Konzentrats neben einem Prothrombin-Komplex und einer Lösung von
lagerstabilen Serumproteinen beschrieben, bei dem als Ausgangsmaterial ein gefrorenes
lonenaustauscherplasma verwendet wird, das bei Temperaturen von 2 bis 80C wieder
aufgestaut wird und aus dem die überstehende Plasmaflüssigkeit von dem Faktor-1II-enthaltenden
Proteinniederschlag abgetrennt und dieses Kryoprazipitat in an sich bebekannter
Weise zu einem Faktor-VIII-Konzentrat aufgearbeitet wird während die Plasmaflüssigkeit
durch Adsorption über handelsüblichem Tricalciumphosphat von den Faktoren II, VIID
IX und X befreit wird, und anschließend aus der Plasmaflüssigkeit über kolloidaler
Kieselsäure mit einer spezifischen Oberfläche von 50 bis 400 m2 /g die noch im Plasma
vorliegenden Gerinnungsfaktoren und andere unstabile Proteine adsorbiert werden
und eine Lösung von lagerstabilen Serumproteinen zurückbleibt
Bei
diesem Verfahren des Hauptpatents wurde als Ausgangsmaterial ein gefrorenes Ionenaustauscher,plasma
verwendet, das durch direkte Entnahme von Spender-Venenblut über einen Polystyrol/Sulfonat-Kationenaustauscher
und Einfrieren auf etwa -400C innerhalb etwa 48 Stunden gewonnen worden war.
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Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß als Ionenaustauscherplasma
im Verfahren des Hauptpatents auch ein übliches eingefrorenes Citratplasma verwendet
werden kann, wenn man nach dem Auftauen und Abtrennen des Kryoprazipitates den über
stand mit Anionenaustauscherharzen auf Basis Polystyrol/ Divinylbenzolquartäres
Amin und Kationenaustauscherharzen auf Basis Polystyrol/Sulfonat behandelt. Da übliches
Citratplasma jederzeit in ausreichender Menge zur Verfügung steht, läßt sich das
Verfahren des Hauptpatents nunmehr jederzeit unabhängig von der Entnahme von Spenderblut
durchführen.
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Bekanntlich wird Blut üblicherweise in citrathaltigen Stabilisatoren
abgenommen, wobei durch Komplexbindung des Blutcalciums mit dem Citrat die Gerinnung
des Blutes verhindert wird, da bekanntermaßen für den Ablauf des Gerinnungsvorganges
freie CalciumJIonen vorhanden sein müssen. Calcium gehört daher zu den Gerinnungsfaktoren
und wird auch als Gerinnungsfaktor IV bezeichnet. Durch die erfindungsgemäße Zugabe
von Ionenaustauschern zu dem mit Citrat stabilisierten Plasma kann das Citrat an
den Anionenaustauscher gebunden werden, wodurch Calcium-Ionen wieder freigesetzt
werden und für den Ablauf des Gerinnungsgeschehens wieder zur Verfügung stehen.
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Die Calciumionen des mit Citrat stabilisierten Plasmas können erfindungsgemäß
durch Zugabe eines Xationenaustaus chers gegen Natrium- oder Wasserstoff-Ionen ausgetauscht
werden Wird im
Anschluß an diesen Austausch das Citrat erfindungsgemäß
mit einem Anionenaustatjcher gegen Chlorid- oder Hydroxyl-Ionen ausgetauscht, so
wird überraschenderweise der gleiche Effekt der Stabilisierung des Plasmas erreicht
wie dEr, den man erhält, wenn Calcium dem Blut direkt bei der Blutabnahme mit einem
Kationenaustauscher entzogen und gegen Wasserstoff-oder Natrium-Ionen ausgetauscht
wird. Der Austausch der Calcium-Ionen und Citrationen eines Citratplasmas kann auch
in einem Schritt unter Verwendung eines sogenannten Mischbettes (Mischung aus Kationen-
und Anionenaustauscher) erfolgen. Durch diesen Austausch der Calcium und Citrat-Ionen
gegen Wasserstoff- und Hydroxyl-Ionen oder auch Natrium-und Chlorid-Ionen wird es
erfindungsgemäß möglich, aus einem Citratplasma ein Ionenaustauscherplasma herzustellen,
aus dem sich sodann die gleichen drei therapeutisch anwendbaren Produkte wie nach
dem Hauptpatent und gegebenenfalls noch als viertes Produkt Fibrinogen herstellen
lassen.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren werden daher aus einem mit Citrat stabilisierten
Blutplasma unter Vermeidung des Gerinnungsvorganges drei oder vier hepatitissichere
und therapeutisch anwendbare Produkte erhalten. Die vier Produkte ßinda 1 Antihämophiles
Globulin A 2. Prothrombinkomplex (Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X) 3. Lösung
lagerstabiler Serumproteine 4. Fibrinogen Die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und
X werden bekanntlich auch als PPSB-Faktoren bezeichnet gemäß folgender Bedeutung:
P
= Prothrombin (Faktor II) P = Proonvertin (Faktor VII) S = Stuart-Prower-Faktor
(Faktor X) B = antihämophiles Globulin B (Faktor IX).
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Das verwendete Citratplasma soll vorzugsweise spätestens 48 Stunden
nach der Blutabnahme bei etwa -40°C eingefroren werden. Diese Maßnahme dient dem
Erhalt der Faktor VIII-Aktivität. Die Gewinnung von Kryopräzipitat aus diesem Citratplasma
erfolgt in an sich bekannter Weise. Das vom Kryopräsipitat befreite Citratplasma
wird bei Zimmertemperatur mit Kationenaustauschern auf Basis Polystyrol/Sulfonat
und Anionenaustauschern auf Basis Polystyrol/Divinylbenzol/ quartäres Amin behandelt,
wobei die überführung des Citratplasmas in Antionenaustauscherplasma im diskontånuierlichen
("batch") Verfahren oder durch Säulenchromatographie erfolgen kann.
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Durch den Kationenaustauscher wird Calcium im Citratplasma entweder
gegen Natrium- oder Wasserstoff-Ionen ausgetauscht.
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Der Anionenaustauscher tauscht die Citrationen des Citratplasmas gegen
Hydroxyl- oder Chlorid-Ionen aus. Der Austausch der Calcium-Ionen und Citrat-Ionen
des Citratplasmas kann entweder nacheinander oder gleichzeitig im sogenannten Mischbettverfahren
erfolgen.
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Die verwendeten Kationenaustauscher auf Basis Polystyrol/ Sulfonat
und Anionenaustauscher auf Basis PolystyrolDivinylbenzol/quartäres Amin werden nach
Vorschrift der Harzherstell e"tweder die Natrium- und Chlorid- oder in die Wasserstoff-
und Hydroxyl-Form gebracht, wobei bei der Umwandlung des Citratplasmas in Ionenaustauscherplasma
im Mischbettverfahren die Harze in der Wasserstoff- bzw.
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Hydroxyl-Form und bei aufeinanderfolgender Adsorption die Harze
in
der Natrium- bzw. Chlorid-Form verwendet werden. Die Adsorption Kann im Batch-Verfahren
oder durch Chromatographie an geeigneten Chromatographierohren (Säulentechnik) erfolgen.
Bei Anwendung der Ionenaustauscher im Mischbettverfahren kann das Mischungsverhältnis
von Anionen- zu Kationenaustauscher variiert werden. In der Praxis hat sich ein
Mischungsverhältnis von Kationen- zu Anionenaustauscher von 1:1,5 gut bewährt. Die
Harze können auch in der Nat:ium-bzw. Chlorid-Form verwendet werden, was lediglich
zu einer etwas höheren Natriumchloridionenkonzentration im Ionenaustauscherplasma
führt.
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Die Ionenaustauscher können auch in Mischungen in der Wasserstoff-und
Natrium-Form bzw. Hydroxyl- und Chlorid-Form vorliegen Das auf diese Weise hergestellte
Ionenaustauscherplasma eignet sich zur Herstellung von Prothrombikomplex-Konzentrat
und lagerstabilen Serumproteinen.
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Zusätzlich wurde gefunden, daß die kolloidale Kieselsäure, die vorzugsweise
eine spezifische Oberfläche von 50 bis 400 m2/g hat, und die die Aufgabe hat , noch
im Plasma vorliegende Gerinnungsfaktoren und andere unstabile Proteine zu adsorbieren,
ein geeignetes Ausgangsmaterial zur Gewinnung von Fibrinogen ist. Das bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren an die kolloidale Kieselsaure adsorbierte Fibrinogen läßt sich durch Kochsalz,
vorzugsweise in Form einer 10%igen Kochsalzlösung, wieder von der kolloidalen Kieselsäure
eluieren. Durch Dialyse und Ultrafiltration des Eluates läßt sich eine sterilfiltrierbare
Fibrinogenlösung herstellen Das Fibrinogen kann durch Gefriertrocknung stabilisiert
werden und ist nach Lösen mit sterilem Wasser für die therapeutische Anwendung geeignet.
Dieses Verfahrens schema, das der der beigefügten Zeichnung gezeigt ist, und bei
dem therapeutisch anwendbare Gerinnungstherapeutika und Humanserum
gewonnen
werden, hat gegenüber den im Hauptpatent aufgeführten Vorteilen den weiteren Vorteil,
auch das üblicherweise bei Plasmapheresen und Blutspenden anfallende Citratblut
verwenden zu können, indem der diesen Bluten und Plasmen anhaftende Nachteil des
Stabilisatorzusatzes durch die Behandlung mit Ionenaustauschern wieder eliminiert
wird.
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Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1 A) Herstellung von Ionenaustauscherplasma aus Citratplasma Neun Teile
Spender-Venenblut wurden zu einem Teil einer 3,8%gen Natriumcitrat-Stabilisatorlösung
gegeben. Das Blut wurde möglichst bald nach der Blutentnahme zentrifugiert und die
in physiologischer Kochsalzlösung aufgeschlemmten Erythrozyten dem Spender reinfundiert.
Das Plasma wurde spätestens innerhalb von 48 Stunden, vorzugsweise bei -400C, eingefroren.
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Das gefrorene Plasma wurde bei einer Temperatur unter +4 0C aufgetaut.
Es wurde im kontinuierlichen Fluß zentrifugiert.
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Die erhaltene Kälteausfällung (Kryopräzipitat) wurde nach der Arbeitsweise
von Beispiel 1.A des Hauptpatents zu einem Faktor Vill-Konzentrat aufgearbeitet.
Das Restplasma wurde mit den Kationen-und Anionenaustauschern behandelt und sodann
der weiteren Fraktionierung zwecks Gewinnung des Prothrombinkomplex-Konzentrats,
des Fibrinogens und der Lösung der lagerstabilen Serumproteine unterworfen.
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Die Behandlung mit den Ionenaustauschern wurde einmal im
Batch-Verfahren
und mit einer anderen Probe im Chromatographieverfahren durchgeführt: A 1) Batch-Verfahren:
Zu 1 000 ml Plasma wurden 75 ml eines Anionenaustauscr.erharzes auf Basis Polystyrol/Divinylbenzol/quartäres
Amin in der Hydroxyl-Form gegeben. Nach Adsorption und Zentrifugation wurde die
Adsorption noch zweimal mit dem regenerierten Anionenaustauscher wiederholt. Dann
wurde die Citratkonzentration des adsorbierten Plasmas bestimmt.
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A 2) Chromatographie-Verfahren: eines Ein Chromatographierohr wurde
mit 75 ml/Anionenaustauscherharzes auf der Basis Polystyrol/Divinylbenzol/ quartäres
Amin in der Hydroxyl-Form gefüllt. Über die Säule wurde 1 1 Citratplasma gegeben.
Es wurden jeweils 100 ml Fraktionen gesammelt und die Citratkonzentration in den
Fraktionen bestimmt.
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In Tabelle I sind die Ergebnisse der Ionenkonzentrationen des Citrats
für die vorstehenden Vergleichsversuche A 1) und A 2) aufgeführt.
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Tabelle I Entfernung von Citratplasma im Batch- und Chromatographieverfahren
Batchverfahren Chromatographieverfahren Citrat (mäq/l) Citrat (mäq/l) Ausgangsmaterial
(Citratplasma) 48,8 Ausgangsmaterial 48,8 1. Adsorption 24,5 Fraktion 1 0,15 2.
Adsorption 11,9 Fraktion 2 0,37 3. Adsorption 4,4 Fraktion 3 1,29 Fraktion 4 3,01
Fraktion 5 6,28 Fraktion 6 13,7 Fraktion 7 30,6
B) Herstellung
von Prothrombi1nkomplex-Konzentrat und lagerstabilen Serumproteinen Nach der Arbeitsweise
von Beispiel IB und C des Hauptpatents wurden aus dem aus Citratplasma durch Verwendung
von Ionenaustauschern gewonnenen Ionenaustauscherplasma der Stufe A ein Prothrombinkomplex-Konzentrat
und eine Lösung lagerstabiler Serumproteine hergestellt.
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Beispiel 2 250 ml eines Kationenaustauscherharzes auf Basis Polystyrol/
Sulfonat (in der Wasserstoff-Form) und 375 ml eines Anionenaustauscherharzes auf
Basis Polystyrol/Divinylbenzol/quartäres Amin (in der Hydroxyl-Form) wurden gemischt
(Mischungsverhältnis von Kationen- zu Anionenaustauscher 1:1,5) und in ein Chromatographierohr
gegeben. Über die Harzmischung wurden 1,45 1 Citratplasma gegeben. Die Tabelle II
zeigt die Ergebnisse dieses Versuches.
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Tabelle II Entfernung von Citrat- und Calcium-Ionen aus Citratplasma
im Mischbettverfahren Ionenkonzentration in mäq/l Citrat Calcium Natrium Chlorid
Ausgangsmaterial (Citratplasma) 66,1 4;15 216 83 Nach Chromatographie 1,74 0 84
(Ionenaustauscher-Plasma)
Beispiel 3 A) Herstellung von Ionenaustauscherplasma
In ein Chromatographierohr wurden 120 ml eines Kationenaustauscherharzes auf Basis
Polystyrol/Sulfonat in der Natrium-Form gegeben. Über diese Säule wurde 1 1 Citratplasma
gegeben. Anschließend wurde dieses Plasma über 180 ml eines Anionenaustauscherharzes
auf Basis Polystyrol/ Divinylbenzol/quartäres Amin in der Chlorid-Form in einem
zweiten Chromatographierrohr gegeben. Tabelle III zeigt die Ergebnisse dieses Versuches.
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Tabelle III Entfernung von Citrat- und Calciumionen aus Citrat-Plasma
durch aufeinanderfolgende Adsorption Ionenkonzentration in mäq/l Citrat Calcium
Ausgangsmaterial (Citratplasma) 64,0 4,10 nach Kationenaustauscher 63,0 0,60 nach
Anionenaustauscher 0,49 0,60 (Ionenaustauscher-Plasma) B) Herstellung von lagerstabilen
Serumproteinen und Fibrinogen 1 Liter des in Stufe A) erhaltenen Ionenaustauscher-Plasmas
wurde zur Herstellung der lagerstabilen Serumproteine nach der Arbeitsweise von
Beispiel 1C des Hauptpatents mit kolloidaler Kieselsäure behandelt. Nach Abtrennung
der kolloidalen Kieselsäure wurde diese zweimal mit 500 ml 0,9%iger NaCl, die 60
mäq/l an Citrat enthielt, gewaschen.
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Die abzentrifugierte kolloidale Kieselsäure wurde zur Gewinnung des
Fibrinogens zweimal mit 400 ml einer 10%igen NaCl-Lösung, die 60 mäq/l Citrat enthielt,
für eine Stunde bei Zimmertemperatur extrahiert. Aus den Eluaten wurde das Fibrinogen
durch Alkoholfällung isoliert, in citrathaltiger physiologischer NaCl-Lösung gelöst,
steril filtriert und gefriergetrocknet. Tabelle IV onthält die Ergebnisse dieses
Versuches.
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Tabelle IV Fibrinogenherstellung
| Volumen Protein Fibrinogen Ausbeute |
| ml g % mg % |
| Ausgangsmaterial |
| (Ionenaustau- |
| scher-Plasma) 1 000 6,5 235 100 |
| 1. Elution 400 0,66 140 |
| 2. Elution 400 0,47 200 |
L e e r s e i t e