DE3129987A1 - Verfahren zur herstellung eines faktor viii(ahf)-hochkonzentrates - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines faktor viii(ahf)-hochkonzentratesInfo
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Description
IMMUNO Aktiengesellschaft für chemisch-medizinische Produkte Wien, Österreich
Verfahren zur Herstellung eines Faktor VIII (AHF) Hochkonzentrates
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
Faktor VIII (AHF)-Hochkonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2,5 Einheiten AHF und einem Fibrinogengehalt
von weniger als 0,25 mg/mg Protein aus menschlichem oder tierischem Plasma durch mehrstufige Fraktionierung
des Plasmas, insbesondere durch Kryopräzipitieren und Reinigen mittels Proteinfällungsmittel, wie Polyäthylen-·
glykol. .
Es sind bereits Faktor VIII(AHF)-Konzentrate bekannt,.die
aus menschlichem oder tierischem Plasma hergestellt werden" und im Vergleich zum nativen Plasma eine erhöhte Aktivität
an Faktor VIII aufweisen. Bekannte Verfahren zur Herstel^
lung von Faktor VIII-Konzentraten bedienen sich als Fr aktionierungsmaßnahmen
einer Behandlung des Plasmas mit Äthanol, mit Äther, mit Polyäthylenglykol und/oder Glycin.
Bekannt ist auch die Kryopräzipitation des Plasmas nach Pool (1965, "The New England Journal of Medicine" 273,
1443) oder die Kryoäthanolprazipitation des Plasmas nach Johnson (Congr. Int. Soc. Blood Trarisf., Sydney, Australia,
Abstracts of Paper, Seite 1109 (1966)).
Es gibt auch noch andere Methoden, um Faktor VIII-Konzentrate
herzustellen, nämlich die Behandlung des Plasmas mit Adsorptionsmittel^ wie Florigel·, Bentonit, Ionenaustauschern
und permeationschromatographischen Mitteln.
Soweit der Stand der Technik die Behandlung des Plasmas mit
Äthanol betrifft, wurde diese erstmals von Gohn .(J. Amer.
Chem. Soc. J58, 459 (1946)) beschrieben. Bei der Behandlung
des Plasmas mit Äthanol wird die sogenannte Cohn-Fraktion I erhalten, die jedoch nur eine relativ geringe Faktor VIII-Aktivität
besitzt. Die Cohn-Methode wurde von Blombäck (Arkiv for Kemir--12_ 387 (1958)) verbessert, wobei Cohn-Fraktion
I durch Extraktion mit einem Äthanol-Glycin-Zitrat-Puffer
weiter gereinigt wurde. Dabei entstand die sogenannte Fraktion I-O. Diese kann, wie Simonetti et al. (Hemo-·
stase 1, 57 (1961)) beschrieben, mit Gerbsäure noch weiter
gereinigt werden? auch diese verbesserten Konzentrate haben nur eine relativ geringe Faktor VIII-Aktivität.' Diese Konzentrate
haben auch den Nachteil, daß sie hohe Fremdproteingehalte, d. h. Faktor VIII unwirksame Proteingehalte besitzen.
So ist in der Cohn-Fraktion I mehr als 60 % des Proteins Fibrinogen und in der Blombäck-Fraktion I-O so- ·
gar über 80 % Fibrinogen enthalten.
Was die bekannte Fraktionierung durch Kryopräzipxtieren betrifft, wurde diese so vorgenommen, daß menschliches oder
tierisches Ausgangsplasma tiefgefroren und wieder aufgetaut wurde. Das Kryoprazipitat wurde in einer Pufferlösung gelöst
und gegebenenfalls durch Proteinfällungsmittel, wie Polyäthylenglykol und Glycin, weiter gereinigt. Durch die ·
Kryppräzipitation ist es nicht gelungen, die Faktor VIII-Aktivität wesentlich zu steigern. Die Faktor VIII-Aktivität
wird durch das Kryopräzipitieren im Vergleich zum Ausgangsplasma nur um etwa das 1Ofache gesteigert, doch auch die
in Kombination mit dem Kryopräzipitieren angewendeten weiteren Maßnahmen haben bisher die Aktivität der erhaltenen
Produkte nicht in der Weise steigern können, wie es erwünschenswert wäre.
Mehrstufige Fraktiönierungsverfahren in Verbindung mit einer ersten Kryoprazipitationsstufe sind in den US-PSen
3,652,530, 3,631,018, 3,682,881 sowie in der AT-PS 349 639 beschrieben.
Solche Produkte werden als "hochgereinigter AHF" oder als "High Purity AHF" bezeichnet. Ihre Faktor VIII-Aktivität
beträgt jedoch auch bloß die 90 bis lOOfache Aktivität
gegenüber nativem Plasma, während der Faktor-VIII-unwirksame
Proteingehalt (Fibrinogen) immer noch 35 % des Gesamtproteins ausmacht.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung der geschilderten '
Nächteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, ein Faktor VIII-Hochkonzentratzu schaffen, in welchem die
inerten, nicht-Faktor-VIII-wirksamen Proteine weitestgehend
entfernt sind, der Gehalt an Fibrinogen so niedrig wie möglich gehalten ist und die Faktor VTII-Aktivität, bezogen
auf das im Konzentrat vorhandene Protein, höher ist als bei den bekannten therapeutisch verwendeten Präparaten.
-Im besonderen ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren
zur Herstellung eines Faktor VIII (AHF)-Hochkonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von mindestens
2,5 Einheiten AHF und einem Fibrinogeng.ehalt von weniger als 0,25 mg/mg Protein zu schaffen, welches Verfahren betriebsmäßig
bzw. in technischem Maßstab anwendbar ist und eine hohe Wirtschaftlichkeit gewährleistet.
Diese Aufgabe wird durch ein mehrstufiges Fraktionierungsverfahren
der eingangs bezeichneten Art, bei welchem vor-. zugsweise als erste Stufe eine Kryopräzipitation. angewendet
wird, dadurch gelöst, daß eine durch diese Fraktionierungsmaßnahmen"gereinigte
und an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion einer Kryoalkoholfallung unterworfen und "
der erhaltene Niederschlag in eine haltbare Form aufgearbeitet wird.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
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ö ο · «α λ
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— 7 —
der gereinigten und an Faktor VIII (AHF) angereicherten Fraktion bei einem pH-Wert von 5,9 bis 6,3 und einer Temperatur
von 0 bis -3° C ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder
Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt, die Mischung tiefgefroren und sodann.'bei einer Temperatur von 0 bis 4° C
aufgetaut, worauf der das AHF-Hochkonzentrat enthaltende' Niederschlag gelöst-und durch Tieffrieren und Lyophilisieren
in haltbare Form gebracht wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt die
Kombination der folgenden Maßnahmen:
-<■ daß menschliches oder tierisches Plasma einer ersten
Kryoprazipxtation unterworfen wird; das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung
gelöst, auf einen pH-Wert von 6,15 bis 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit Polyäthylenglykol
unterworfen wird;
- daß der nach Verwerfen des Niederschlags erhaltene Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfäliung
mit Polyäthylenglykol unterworfen und
- die nach Verwerfen der Niederschläge schließlich erhaltene
gereinigte, an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem
dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol/ Polyäthylenglykol oder
Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt; die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4 C
aufgetaut wird, worauf der das AHF-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und
Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.
Vorteilhaft werden dabei die erste Polyäthylenglykol-Fällung mit 3 G/V %igem Polyäthylenglykol und die zweite bzw. die
weiteren Polyäthylenglykol-Fällungen mit 8 G/V %igem Polyäthylenglykol durchgeführt.
Zweckmäßig wird zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates
eine etwa 10 G/V %ige PLURONIC-Lösung verwendet.
Anstelle von Polyäthylenglykol als Proteinfällungsmittel
kann auch "PLURONIC" verwendet werden, in welchem Fall die Kombination aus den folgenden Merkmalen besteht:
- daß menschliches oder tierisches Plasma einer ersten
Kryoprazipitation unterworfen wird/
- das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst,
auf einen pH-Wert von 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit PLURONIC unterworfen
wird;
- daß der nach Verwerfen des Nieiderschlages erhaltene Überstand mindestens einer .weiteren Reinigungsfällung
mit PLURONIC unterworfen und
- die nach Verwerfen der Niederschläge schließlich erhaltene,
gereinigte, an Faktor VIII. (AHF) angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem
dieser Fraktion ein ein-? oder mehrwertiger Alkohol,
wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder
Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt/ die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4°'C
aufgetaut wird, worauf der das AHF-Hochkonzentrat enthaltende
Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden
Beispiele näher erläutert:
4.60 1 frisch gefrorenes Plasma werden bei 0° und +4°· C aufgetaut.
Das entstandene Kryopräzipitat wird durch Zentrifugieren
abgetrennt und in 9,6 ] Tri-Natriumcitrat bei 37° C gelöst. · '
β β Ο · β 8
Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,2 gestellt und 3 G/V
%iges Polyäthylenglykol 2000 wird zugesetzt. Dabei entsteht ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren abgetrennt
und verworfen wird. .
Die Ionenstärke des Überstandes, der Faktor VIII (AHF) enthält, wird durch Zugabe von Tri-Natriumcitrat erhöht.
Die restlichen unerwünschten Proteine werden durch Erhöhung der Polyäthylenglykol 2000-Konzentration .auf 8 G/V
% ausgefällt und nach dem Zentrifugieren· verworfen.
Durch Zugabe von 8 G/V %igem Äthanol, bei -2° C und einem
pH-Wert von 6,1, wird Faktor VIII-Konzentrat ausgefällt; die Suspension wird eingefroren und nach Auftauen bei
+4° C wird das Faktor VIII enthaltende Kryoalkoholpräzipitat in einem physiologischen Puffer gelöst, sterilfiltriert,
abgefüllt und gefriergetrocknet.
9600 ml frisch gefrorenes Plasma werden bei 0 bis +4° C
aufgetaut. Das zentrifugierte Kryopräzipitat wird in 240. ml Tri-Natriumcitrat bei 37° C gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,2 gestellt und 3 G/V
%iges Polyäthylenglykol 2000 zugesetzt. Der entstandene
Niederschlag wird abgetrennt und verworfen.
Durch Zugabe von Tri-Natriumcitrat wird die Ionenstärke erhöht, durch Zugabe von weiterem Polyäthylenglykol 2000
bis auf 8 G/V % fallen unerwünschte Proteine aus; diese werden abgetrennt und verworfen.
Bei pH 6,0 und -2 bis -3° C wird Faktor VIII-Konzentrat
mittels 10 G/V %igem Methanol ausgefällt; die Suspension
wird eingefroren und nach Auftauen wird das Kryoalkohol-
präzipitat in einem isotonen Puffer gelöst, sterilfiltriert/ abgefüllt und gefrxergetrocknet.
Die Arbeitsweise des Beispieles 2 wird wiederholt, jedoch
wird statt 10 G/V %igem Methanol 12 %iges Polyäthylenglykol zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates verwendet.
•Beispiel 4:
Die Arbeitsweise des Beispieles 2 wird wiederholt, jedoch wird statt 10 G/V %igem Methanol 10 G/V %iges "PLURONIC"
zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates verwendet.
10,4 1 frisch gefrorenes Plasma werden bei 0° bis +4° C aufgetaut. Das Kryopräzipitat wird in 250 ml Tri-Natriumcitratpuffer
gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,3 gestellt und 2,5 G/V
TJ
%iges PLURONIC zugesetzt. Der Niederschlag wird verworfen.
Nach Erhöhung der Ionenstärke wird die PLURONIC-Konzentration auf 7,5 G/V % gesteigert und der Niederschlag
abermals verworfen.
Der Überstand wird bei einem pH-Wert von 6,0 und einer ·
Temperatur von -2° C mit 8 G/V %igem Äthanol behandelt,
wobei Faktor VIII-Konzentrat ausfällt. Die Suspension
wird eingefroren und nach Auftauen bei +4 C das Kryo-.alkoholpräzipitat
abgetrennt; '
■Die durch das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich erhöhte
spezifische Aktivität der'erhaltenen Hochkonzentrate
bzw. die Anreicherung an AHF um mehr als das 20Ofache
gegenüber Ausgangsplasma zeigt Tabelle I im Vergleich zu bekannten, im Handel befindlichen AHF-Konzentraten.
| • » ■ β *- ο t • . Ολο »ο t> e ■ ο ο ^. £ |
Spezifität Einh«/mg |
Ό i.3 129987 ■ | |
| - 11 - | 0,017 | ||
| Tabelle I | 0,145 | ||
| 1,667 | Reinheit im" Ver gleich zu Plasma |
||
| Plasma | 1 | ||
| Kryopräzipität | 9fache | ||
| High Purity AHP | >3,500 | 98fache | |
| Hochkonzentrat, | herge- | ||
| stellt nach der | Erfin- | ||
| dung | 206fache | ||
Der geringere Gehalt des erfindungsgemäßen Hochkonzentrates
an Fibrinogen gegenüber bekannten Konzentraten ergibt sich aus der Tabelle II.
Cohn-Fraktion I Blombäck-Fraktion 1-0 gereinigter, oder High
Purity AHF
Hochkonzentrat, hergestellt nach der Erfindung
> 60 % Fibrinogen ;> 80 % Fibrinogen
> 35 % Fibrinogen 10 % Fibrinogen
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung eines Faktor VIII (AHF)-Hochkonzentrates
mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2,5 Einheiten AHF und einem Fibrinogengehalt von
weniger als 0,25 mg/mg Protein aus menschlichem oder ·
tierischem Plasma durch mehrstufige Fraktionierung des Plasmas, insbesondere durch Kryopräzipitieren und Reinigen
mittels Proteinfällungsmittel, wie Polyäthylenglykol,
dadurch gekennzeichnet, daß eine durch diese Frak-
. tionierungsmaßnahmen gereinigte und an Faktor VIII CAHF)
angereicherte Fraktion einer Kryoalkoholfällung unterworfen und der erhaltene Niederschlag in eine haltbare
Form aufgearbeitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der gereinigten und an Faktor VIII (AHF) angereicherten Fraktion bei einem pH-Wert von 5,9 bis 6,3 und einer
Temperatur von Ö bis -
3 C ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol
oder Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt wird, die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4° C aufgetaut wird, worauf der das
AHF-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und
durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form
gebracht wird.
-"3.. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet
durch die Kombination der folgenden Maßnahmen:
- daß menschliches oder tierisches Plasma einer ersten
Kryopräzipitation unterworfen wird,·
- das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung
gelöst, auf einen pH-Wert von 6,15 bis 6,25 gestellt
und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit Polyäthylenglykol unterworfen wird;
- daß der nach Verwerfen des Niederschlags erhaltene überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung
mit Polyäthylenglykol unterworfen und
- die nach Verwerfen der Niederschläge schließlich er-,
haltene gereinigte, an Faktor VIII (AHF) angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfallung unterworfen wird,
indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol
oder Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt,' die Mischung tiefgefroren und'sodann bei einer Temperatur
von 0 bis 4° C aufgetaut wird, worauf der das AHF-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und
durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Polyäthylenglykol-Fällung mit 3 G/V %igem
* . . Polyäthylenglykol und die zweite bzw. die weiteren PoIy-
äthylenglykol-Fällungen mit 8 G/V %igem Polyäthylen-'
glykol durchgeführt werden. . · ■
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ■ ■ zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates eine etwa
G/V %ige PLURONIC-Lösung verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet.durch die
Kombination der folgenden Maßnahmen:
daß menschliches oder tierisches Plasma einer ersten Kryoprazipitation unterworfen wird/
- das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst, auf einen pH-Wert von 6,25 gestellt und die
Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit PLURONIC unterworfen wird/
daß der nach Verwerfen des Niederschlages erhaltene überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung
mit PLURONIC unterworfen und
die nach Verwerfen der Niederschläge schließlich erhaltene gereinigte, an Faktor VIII (AHF) angereicherte
Fraktion der Kryoalkoholfallung unterworfen wird, indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol,
wie Methylalkohol, Äthylalkohol, PοIyäthy1engIykol
oder Polyesterglykol (PLURONIC) zugesetzt/ die
Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur
von 0 bis 4° C aufgetaut wird, worauf der das AHF-Hochkonzentrat
enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht
wird.
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