DE3218348A1 - Verfahren zur extraktion von proteinen, insbesondere von lactoferrin und immunglobulinen aus milch - Google Patents
Verfahren zur extraktion von proteinen, insbesondere von lactoferrin und immunglobulinen aus milchInfo
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Description
• 4 · · ·* oft
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Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Extraktion bestimmter Proteine aus Milchprodukten. Sie betrifft
insbesondere die Erzielung von Proteinen, die Eisen fixieren» Trans ferrin und Lactoferrin sowie von Iiranunglobulinen.
Das Interesse an verschiedenen Proteinen, die sich vom Kasein
unterscheiden, die man in der Milch von Säuaetieren findet,
hat die Aufmerksamkeit zahlreicher Industrien und Forscher
gewonnen. Es wurden auch Arbeiten bezüglich der Trennung der /*"►>
10 verschiedenen Proteine durchgeführt, insbesondere solcher, die sich in Molke finden, d. h. im Lactoserum, nach der Abtrennung
der Kaseine. Unter den besonders interessanten Substanzen, die dieser Kategorie angehören, befinden sich
a-Lactalbumin, Transferrin, Lactoferrin, Lysozym, Serum-Albumin,
Immunglobuline, usw. Das Lactoferrin ist nicht nur vom ErnährungsStandpunkt her, sondern auch vom pharmakoloaxschen
Standpunkt her interessant: Man weiß bisher, daß dieses Protein, das Eisen fixiert, nicht nur ein sehr nützlicher
Nährstoff ist, sondern auch einen echten Schutz gegen verschiedene
Bakterieninfektionen bildet. Diese letztere Rolle drückt sich gerade in der ehelatbildenden Wirkung dieses Proteins
gegenüber Eisen aus, wodurch dieses Element aus dem Milieu entzogen wird, und so die Entwicklung von Bakterien
verhindert wird, für die dieses Element absolut notwendig ist. Die bakteriostatische Eigenschaft stellt offensichtlich
einen bedeutenden Vorteil dar. Was die Immunalobuline IgA.
IgM, IaG betrifft, so steigt deren Bedeut\mg täglich mit der
fortschreitenden Entwicklung der Immunologie. Darüber hinaus sind die Nützlichkeit und die Anwendungszwecke von Lactalbuminen,
dem S er um-Albumin,- von Lysozvm und .bestimmten
anderen Proteinen sowie auch der Proteine, die Vitamin-B12
fixieren, oder des Ceruloplasmins, das die Eigenschaft
besitzt, eine Kombination mit Kupfer einzugehen, bekannt. Es versteht sich daher, daß Arbeiten durchgeführt wurden,
^ die verschiedenen Proteine aus den Milchprodukten und
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β *
• W · ·
insbesondere aus Molke, die sie im gelösten Zustand enthält und die allgemein einen Rückstand in der Milchindustrie darstellt,
abzutrennen. Der Hauptteil der verwendeten Verfahren basiert auf der Anwendung von Ionenaustauschern oder
auf der Chromatografie an Sephadex, bei pH-Werten, die 7 nicht überschreiten, und besonders häufig unter 6,3 liegen.
Dies trifft beispielsweise auf die Methode der US-PSn 3 234 199 und 3 969 337 zu. Man hat auch auf die Elektrophorese
oder die Ausfällung mit Salzen und das Zentrifugieren zurückgegriffen, wobei die letztgenannte Methode von
Montreuil und Mullet in CR. 250, 17 36-7 '(1960) beschrieben wird. In jüngerer Zeit wurden Arbeiten betreffend die
Abtrennung von Proteinen aus Milch in den FR-PSn 2 390 906 und 2 399 214 beschrieben, bei denen die Proteine, die sich
von Kasein unterscheiden, zunächst mit einem Anionenaustauscherharz
und anschließend mit Siliziumdioxid oder umgekehrt extrahiert werden, wobei die Extraktion bei pH-Werten von 4
bis 7,5 stattfindet.
Die verschiedenen Verfahren der bekannten Technik eignen sich wohl zur Trennung von Proteinen, wie den Lactalbuminen
oder dem Serum-Albumin, jedoch ermöglicht keine die wirksame
und praktische Erzielung von Proteinen, die Eisen fixieren, d. h. von Transferrinen und Lactoferrinen. Zwar bildet das
Lactoserum ein wenig kostspieliges Material, es enthält nur etwa 6,5 g Proteine pro Liter, von denen ein gerinqer Anteil
aus Lactoferrinen besteht, jedoch muß man große Volumenmengen dieses Ausgangsmaterials behandeln, um ein geringes
Gewicht an interessanten Proteinen zu extrahieren. Es ist daher wichtia, über ein Verfahren zu verfügen, das es ermöglicht,
diese Extraktion mit so guten Ausbeuten wie möglich durchzuführen. Dieses Ziel wird durch, die vorliegende Erfindunq
erreicht. Tatsächlich eignet sich das erfindunasgemäße
neue Verfahren aanz besonders zur Erzielung von Ferro chelierenden
Proteinen, insbesondere von Lactoferrin und Transferrin,
und andererseits von Immunglobulinen, ausgehend von
α · · ο
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Milchserum (im folgenden als Molke bezeichnet), das nach der-Abtrennung
von Kaseinen zurückbleibt.
In der folgenden Beschreibung wird zur Vereinfachung nur von
Lactoferrin gesprochen, jedoch versteht es sich, daß dieser Ausdruck auch Transferrin und gegebenenfalls andere Ferrochlierende
Proteine des gleichen Typs umfaßt, die in Milch verschiedener Säugetiere enthalten sein können.
^ 10 Das erfindungsaemäße Verfahren beruht auf der Feststellung,
daß im Gegensatz zur "bisherigen Technik die Abtrennung der vorstehend genannten Proteine durch Adsorption am besten in
einem leicht basischen Milieu bzw. Medium erfolgt.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, das Milieu,
das Lactoferrin enthält, einer Fixierung an einem geeigneten Adsorbens in schwach basischem Milieu zu unterziehen, d. h.
in einer Flüssigkeit von einem pH-Wert über 7,5. Vorzugsweise liegt der pH-Wert des Milieus bei 7,7 bis 8,8 und besonders
bevorzugt bei 7,9 bis 8,5.
Als erfinduncrsgemäß zu behandelndes Milieu kann jede wäßri-A
ge Flüssigkeit dienen, die die verschiedenen Proteine der Milch enthält, und die zumindest zum größten Teil von Kaseinen
befreit ist; die praktischte Quelle ist die Molke, die gegebenenfalls konzentriert wurde oder bereits zur Extraktion.von
Proteinen, die sich von Lactoferrin unterscheiden, behandelt wurde.
Nach der Adsorption in schwach basischem.Milieu und dem
Eliminieren der überstehenden Flüssigkeit werden die an dem Adsorbens fixierten Proteine durch Verringern des pH-Werts
unter 7, vorzugsweise etwa 4, eluiert. Eine bevorzugte Arbeitsweise besteht darin, ein saures Eluiermittel zu verwenden,
dessen Ionenstärke durch Zusatz eines löslichen
3807 B.254 - β -
Salzes erhöht wurde.
Als Adsorbens kann man vorteilhaft ein Siliziumdioxid.mit
einer spezifischen Oberfläche von etwa 5' bis 150 m2/g verwenden7
das einen Porendurckmesser von 25 bis 250 nm (250 bis
^ ο
2500 A) aufweist. Das Siliziumdioxid kann in Pulverform verwendet werden mit einer ausreichend qroßen Granulometrie
bzw. Kornqröße, beispielsweise von 5 um bis 5 mm. Zur Verwendung
in der Kolonne bzw. Säule ist es bevorzugt/ sich sphärischen Kügelchen mit Durchmessern in der Größenordnung
von 10 bis 5 00 um zu bedienen.
Zwar bildet das Siliziumdioxid einen ausgezeichneten Träger zur bevorzugten Fixierung von Lactoferrin# jedoch können
auch andere Träqer verwendet werden, insbesondere verschiedene natürliche oder künstliche Silikate, wie Bimsstein/
Diatomeenerden/ Bentonit, usw., sowie aktivierte Aluminiumoxide.
Das Fixieren in schwach basischem Milieu bietet den Vorteil
einer großen Selektivität für das Lactoferrin, das nur von einem Teil der Immunqlobuline begleitet wird. Die anderen
Proteine, insbesondere Lactalbumine, Lactoglubiline, Serum-Albumin
und der Rest der Immunglobuline, verbleiben in Lösung in der überstehenden Flüssigkeit.
Nach der Gewinnung des Lactoferrins und der Immunglobuline wird der Träqer - insbesondere■das Siliziumdioxid - in Kontakt
mit einer leicht basischen Lösuna/ beispielsweise vom
^O pH-Wert 8 bis 9, gebracht/ wodurch er fähig, wird, für eine
neue Extraktion, ausgehend von einem Milchprodukt, zu dienen.
Es ist ersichtlich, daß das erfindunasgemäße Verfahren wesentlich
einfacher ist als die des Stands der Technik. So genüqt im Vergleich mit den vorstehend genannten FR-Patentschriften
ein einziger mineralischer Träger anstelle von zwei Trägern, von denen einer ein Ionenaustauscher ist. Darüber hinaus
— 6 —
3807 B.254 - 7" - ■
erfolgt das Fixieren im basischen Milieu anstelle der Durchführung
bei pH-Werten unter-7,5 und insbesondere unter 7, wie dies beim gesamten Stand der Technik der Fall ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wäscht man nach
dem Eluieren des Träqers mit einer sauren Lösung den Träqer mit einer basischen Lösung, wodurch die Fraktion der Immunglobuline,
die in saurem Milieu nicht eluiert wurde, extra-,
hiert werden kann. In diesem Fall kann die basische Lösung auch die Gewinnung eines Rests des Lactoferrins ermöglichen.
Die Wäsche gemäß dieser Ausführungsform kann beispielsweise
mit einem pH-Wert von 8 bis 10 erfolgen. Die Kapazität eines Siliziumdioxidträgers gegenüber Lactoferrin wird durch eine
solche Was.ehe nicht beeinflußt; letztere kann daher weggelassen
werden, wenn nur Lactoferrin extrahiert werden soll.
Das erfindungsaemäße Verfahren kann auf Lactoserum unabhängig
von der Entfernungsmethode für das Kasein, die zu diesem Lactoserum führte, angewendet werden: Mit anderen Worten
unabhängig davon, ob das Kasein durch Ansäuern der ursprünglichen Milch oder durch Einwirken eines Enzyms ausgefällt
wurde. Das Verfahren ist geeignet für Molke, sowie auch für
Flüssigkeiten, die erhalten wurden durch Auflösen von Feststoffen des Lactoserums, die nach jedem bekannten Mittel erhalten
wurden, beispielsweise durch Ultrafiltration oder Troqknung.
Die Erfindung·kann auch auf die Extraktion von Lactoferrin
verschiedener Milchsorten angewendet werden, insbesondere auf solche von Schafen, Rindern,"sowie auch menschliche Milch.
Da die erstgenannten wesentlich weniger Lactoferrin als letztere aufweisen, ist ihre Behandlung nach bekannten Techniken
weniger wirksam und auf diesem Gebiet ist die
· - 7 -
3807 B.254 - 8 -
Möglichkeit der vorliegenden Erfindung besonders zu spüren.
Die Erfindung kann unter den Bedingungen durchaeführt werden,
die vorgesehen sind von Gordon, Ziegler & Basch, Biochim. Biophys. Acta 60, 410-411 (1962). Bei dieser Ausführungsform erfolgt das Fixieren auf einem Adsorbensträger in leicht
basischem Milieu an einer Flüssigkeit, die Lactoferrin enthält, der vorher eine Eisenverbindung zugesetzt worden war,
derart, daß das gesamte vorhandene Lactoferrin mit Eisen gesättigt wurde.
Der Extraktionsgrad des Lactoferrins nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren ist erhöht. Was die Zusammensetzung der nach diesem Verfahren erhaltenen Proteine anschließend an
das Eluieren des Adsorbensträgers mit einer sauren Lösung
betrifft, so enthält sie 50 % Lactoferrin und der Rest besteht hauptsächlich aus Immunqlobulinen. Die Reinheit des
Lactoferrins, das hauptsächlich als bakteriostatisches Mittel verwendet wird, reicht ganz und gar aus, es ist nicht
notwendig, sie von den Immunqlobulinen zu trennen. Tatsächlich hat es sich in vitro qezeigt, daß das Inhibierungsvermögen
für das Wachstum pathogener Bakterien durch Lactoferrin durch die Anwesenheit von Immunglobulinen angereot wurde.
Für den industriell besonders günstigen Fall, daß es sich
bei dem Träger um Siliziumdioxid handelt, findet man eine
Kapazität von diesem für das Lactoferrin von mehr als 2 0 mg pro Gramm Siliziumdioxid, was die industrielle Anwendung des
erfindungsqemäßen Verfahrens rechtfertigt.
.: ■
Unter den erfindungsgemäßen Arbeitsbedingungen erfahren die Immunglobuline, die das Lactoferrin begleiten, keine Denaturierunq
und können daher in der Nahrungsmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie und der veterinärmedizinischen
3807 B.254 - 9 -
Industrie verwendet werden, da sie alle ihre Eigenschaften
beibehalten.
Die verschiedenen Proteine, die nach dem erfindungsaemäßen
Verfahren abgetrennt werden können, lassen sich nach üblichen Methoden identifizieren, und insbesondere nach denen, die
beschrieben werden von J. Garnier in Ann. Biol. anim. Bioch.
Bioohys. 1964, 4 (2) 163-187. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken,
ίο
In eine Säule von 1 cm Innendurchmesser fügt man 5 g Siliziumdioxidkörner
mit einer Korngröße von 100 bis 2 00 μΐη. Dieses Ί5 Siliziumdioxid weist eine spezifische Oberfläche von 20 m2/g
und einen Porendurchmesser von 80 nm auf.
Das Siliziumdioxid wird mit einer 0,005 m Lösung von Dinatriumphosphat
Na-HPO. gewaschen.
In 1 1 der qleichen PhosDhat lösunq löst man 10g eines PuI-vers,
das erhalten wurde durch Trocknen der durch Ultrafil-'
tration eines Lactoserums gewonnenen Feststoffe (Retentat); dieses Pulver enthält 675 q Proteine. Der pH-Wert der erhaltenen
Lösunq wird auf 8,2 eingestellt.
Man läßt anschließend die Lösunq durch die Siliziumdioxidbeschickung
in der vorstehenden Säule mit einem Durchsatz von 60 ml/h laufen. Diese Beschickung wird anschließend mit
einer .0,005 m Dinatriumphosphatlösung vom pH-Wert 8,2 derart gewaschen/ daß sämtliche nicht am Siliziumdioxid fixierten
Proteine entfernt werden.
- 9 -
3öO7 B.254 - 10 -
Das fixierte Lactoferrin wird dann mittels einer 0,1 η Essigsäurelösunq,
die mit NaCl in einer Konzentration von 0,5 m versetzt wurde, gewaschen. Man erhält so eine Fraktion von
• 25 ml rosa gefärbter Flüssigkeit mit einem Gehalt von 40 mg Proteinen, die zu 66 % aus Lactoferrin bestehen, wobei der
Rest Imitmnqlobuline sind. Nach einer Wäsche der Beschickung
des Siliziumdioxids durch Hindurchleiten einer Lösung von
0,005 m Natriumphosphat ist die Säule für einen neuen Adsorptionszyklus
bereit.
Bei einer Arbeitsweise ähnlich der des Beispiels 1 wird die Beschickung der Säule mit einem tris-HCl-Puffer vom pH 9,
Ί5 der mit 0,5 m NaCl versetzt ist, nach dem Eluieren mit Essigsäure
und dem Wiedergewinnen der Lactoferrinfraktion gewaschen. Dies führt zu einer neuen Fraktion von 20 ml, die
30 mg Proteine enthält, die hauptsächlich aus Immunglobulinen, Lactoperoxidase und einer sehr geringen Menge an Lactoferrin
besteht.
Nach einer Wäsche des Siliziumdioxids in der Säule mit einer
0,005 m Dinatriumphosphatlösung ist die Säule für die erneute Verwendung bereit.
Man arbeitet wie in Beispiel 1, jedoch besteht die Lactoferringuelle
aus einem Liter Molke, die direkt von der Fabri-JO kation von Käse stammt, ohne Konzentrieren, wobei diese
Flüssigkeit mit 0,005 Mol Dinatriumphosphat pro Liter versetzt
wird.
Man erhält die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1.
- 10 -
mam«
3807 B.254 - 11 -
Die alkalische Wäsche des Beispiels 2 wird auf eine Arbeitsweise unter Verwendung der Molke gemäß Beispiel 3 anaewendet.
Man erhält die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel
- 11 -
Claims (9)
1. Verfahren zur Extraktion von Proteinen aus Milch, insbesondere von solchen, die dazu geeignet sind, Eisen zu
fixieren, ausgehend von einem wäßrigen Milieu, das im wesentlichen frei von Kaseinen ist, durch Adsorption an
einem festen Träger, anschließendes Eluieren der adsorbierten
Proteine mittels einer sauren Lösung , dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption in einem schwach
basischen Milieu bei einem pH-Wert über 7,5 stattfindet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH—Wert des der Adsorption unterzogenen Milieus
bei 7»7 t>is 8,8 und vorzugsweise bei 7j9 bis 8,5 liegt.
— Λ —
3Ö07 B.254 - 2 -
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution bei einem pH-Wert unter etwa 4 durchführt,
wobei das Eluiermittel vorzuasweise ein lösliches Salz enthält, das seine Ionenstärke erhöht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbens aus Siliziumdioxid
besteht, dessen spezifische Oberfläche etwa 5 bis 150 m2/g
und dessen Porendurchmesser 25 bis 250 nm beträgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Siliziumdioxid in Pulverform
arbeitet, dessen Granulometrie 5 μΐη bis 5 mm und vorzugsweise
10 bis 5 00 μπι beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens aus einem natürlichen
oder künstlichen Silikat und/oder aus einem aktivierten Aluminiumoxid besteht.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche unter Eluieren in saurem Milieu, dadurch qekennzeichnet, daß
man anschließend eine Behandlung mit einer basischen Lösuna vornimmt und die so freiqesetzten Immunglobuline
und Lactoferrin gewinnt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis Ί-, dadurch
gekennzeichnet, daß man es auf die Extraktion von Lactoferrin aus einem flüssigen Derivat von Milch, insbesondere
Lactoserum, gegebenenfalls vor dem Extrahieren konzentriert,
anwendet.
9. Vorfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
man es auf Immunglobuline und/oder andere Proteine anwendet, die man aus der nach der Adsorption von Lactoferrin
verbleibenden Flüssigkeit gewinnt.
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