DE3218348C2 - Verfahren zur Extraktion von Lactoferrin aus Lactoserum - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Extrak­ tion von Lactoferrin aus im wesentlichen caseinfreiem wäßri­ gem Lactoserum.

Das Interesse an verschiedenen Proteinen, die sich vom Kasein unterscheiden, die man in der Milch von Säugetieren findet, hat die Aufmerksamkeit zahlreicher Industrien und Forscher gewonnen. Es wurden auch Arbeiten bezüglich der Trennung der verschiedenen Proteine durchgeführt, insbesondere solcher, die sich in Molke finden, d. h. im Lactoserum, nach der Ab­ trennung der Kaseine. Unter den besonders interessanten Sub­ stanzen, die dieser Kategorie angehören, befinden sich α-Lactalbumin, Transferrin, Lactoferrin, Lysozym, Serum- Albumin, Immunglobuline, usw. Das Lactoferrin ist nicht nur vom Ernährungsstandpunkt her, sondern auch vom pharmakologi­ schen Standpunkt her interessant: Man weiß bisher, daß die­ ses Protein, das Eisen fixiert, nicht nur ein sehr nützlicher Nährstoff ist, sondern auch einen echten Schutz gegen ver­ schiedene Bakterieninfektionen bildet. Diese letztere Rolle drückt sich gerade in der chelatbildenden Wirkung dieses Pro­ teins gegenüber Eisen aus, wodurch dieses Element aus dem Milieu entzogen wird, und so die Entwicklung von Bakterien verhindert wird, für die dieses Element absolut notwendig ist. Die bakteriostatische Eigenschaft stellt offensichtlich einen bedeutenden Vorteil dar. Was die Immunglobuline IgA. IgM, IgG betrifft, so steigt deren Bedeutung täglich mit der fortschreitenden Entwicklung der Immunologie. Darüber hin­ aus sind die Nützlichkeit und die Anwendungszwecke von Lact­ albuminen, dem Serum-Albumin, von Lysozym und bestimmten anderen Proteinen sowie auch der Proteine, die Vitamin-B12 fixieren, oder des Ceruloplasmins, das die Eigenschaft besitzt, eine Kombination mit Rupfer einzugehen, bekannt. Es versteht sich daher, daß Arbeiten durchgeführt wurden, um die verschiedenen Proteine aus den Milchprodukten und insbesondere aus Molke, die sie im gelösten Zustand enthält und die allgemein einen Rückstand in der Milchindustrie dar­ stellt, abzutrennen. Der Hauptteil der verwendeten Verfah­ ren basiert auf der Anwendung von Ionenaustauschern oder auf der Chromatografie an Sephadex, bei pH-Werten, die 7 nicht überschreiten, und besonders häufig unter 6,3 liegen. Dies trifft beispielsweise auf die Methode der US-PSn 3 234 199 und 3 969 337 zu. Man hat auch auf die Elektro­ phorese oder die Ausfällung mit Salzen und das Zentrifugie­ ren zurückgegriffen, wobei die letztgenannte Methode von Montreuil und Mullet in C.R. 250, 1736-7 (1960) beschrie­ ben wird. In jüngerer Zeit wurden Arbeiten betreffend die Abtrennung von Proteinen aus Milch in den FR-PSn 2 390 906 und 2 399 214 beschrieben, bei denen die Proteine, die sich von Kasein unterscheiden, zunächst mit einem Anionenaustau­ scherharz und anschließend mit Siliziumdioxid oder umgekehrt extrahiert werden, wobei die Extraktion bei pH-Werten von 4 bis 7,5 stattfindet.

Die DE-OS 28 21 392 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung verschiedener Proteine aus Milch durch Inberührungbringung der Milch mit Anionenaustauscherharzen und Kieselsäure bei einem pH-Wert von oberhalb 4, vorzugsweise im Bereich von 5,5 bis 7,5. Als Proteine werden auf Seite 6 der Offenlegungs­ schrift Lactalbumine, Serumalbumine, Lactoglobuline und Immu­ noglobuline erwähnt. Lactoferrin befindet sich nicht darunter. Seine Bestätigung findet dieser Sachverhalt in Beispiel 1 der Offenlegungsschrift, wo beschrieben wird, daß in diesem Beispiel α-Lactalbumine, β-Lactoglobuline, Serumalbumin und ein geringer Teil der Immunoglobuline nach diesem Verfahren abgetrennt worden sind. Einen Hinweis, wie man Lactoferrin relativ selektiv und in hohen Ausbeuten aus der Milch abtren­ nen kann, enthält die Offenlegungsschrift nicht, und ebenso kommt ein Arbeiten bei einem pH-Wert oberhalb 7,5 nicht in Betracht.

Gordon et al. beschreiben in "Biochim. Biophys. Acta", 1962, Seiten 410-411, die Extraktion von Lactoperoxidase aus dem nicht-koagulierbaren Bestandteil der Milch mit Hilfe von Amberlite IRC-50 und die anschließende Ausfällung mit Ammo­ niumsulfat, anschließender Dialyse, Lyophylisierung und frak­ tionierter Chromatographie mit Hilfe von Phosphat bei einem pH-Wert von 6,8. Bei diesem Verfahren erhält man etwa die Hälfte der Gesamtproteine und den überwiegenden Teil der ursprünglich eingesetzten Lactoperoxidase-Aktivität. Einen Hinweis auf die Abtrennung von Lactoferrin enthält dieser Artikel nicht, sowie auch keinen Hinweis auf ein Arbeiten oberhalb eines pH-Wertes von 7,5.

Die verschiedenen Verfahren des Standes der Technik eignen sich wohl zur Trennung von Proteinen, wie den Lactalbuminen oder dem Serum-Albumin, jedoch ermöglicht keines die wirksame und praktische Abtrennung von Lactoferrin. Zwar bildet das Lactoserum ein wenig kostspieliges Material, es enthält nur etwa 6,5 g Proteine pro Liter, von denen ein geringer Anteil aus Lactoferrinen besteht, jedoch muß man große Volumenmen­ gen dieses Ausgangsmaterials behandeln, um ein geringes Gewicht an interessanten Proteinen zu extrahieren. Es ist daher wichtig, über ein Verfahren zu verfügen, das es ermög­ licht, diese Extraktion mit so guten Ausbeuten wie möglich durchzuführen. Dieses Ziel wird durch die vorliegende Erfin­ dung erreicht. Tatsächlich eignet sich das erfindungsgemäße neue Verfahren zur Erzielung von Lactoferrin, ausgehend von Milchserum (im folgenden als Molke bezeichnet), das nach der Abtrennung von Caseinen zurückbleibt.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Extraktion von Lactoferrin aus im wesentlichen caseinfreiem wäßrigem Lactoserum durch Adsorption an einen festen Träger und an­ schließendes Eluieren der adsorbierten Proteine mittels einer sauren Lösung, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Adsorption in einem schwach basischen Milieu bei einem pH-Wert über 7,5 stattfindet.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Feststellung, daß im Gegensatz zur bisherigen Technik die Abtrennung des Lactoferrins durch Adsorption am besten in einem leicht basischen Milieu bzw. Medium erfolgt.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, das Milieu, das Lactoferrin enthält, einer Fixierung an einem geeigneten Adsorbens in schwach basischem Milieu zu unterziehen, d. h. in einer Flüssigkeit von einem pH-Wert über 7,5. Vorzugs­ weise liegt der pH-Wert des Milieus bei 7,7 bis 8,8 und beson­ ders bevorzugt bei 7,9 bis 8,5.

Als erfindungsgemäß zu behandelndes Milieu kann jede wäßri­ ge Flüssigkeit dienen, die die verschiedenen Proteine der Milch enthält, und die zumindest zum größten Teil von Kaseinen befreit ist; die praktische Quelle ist die Molke, die gegebenenfalls konzentriert wurde oder bereits zur Extrak­ tion von Proteinen, die sich von Lactoferrin unterscheiden, behandelt wurde.

Nach der Adsorption in schwach basischem Milieu und dem Eliminieren der überstehenden Flüssigkeit werden die an dem Adsorbens fixierten Proteine durch Verringern des pH-Werts unter 7, vorzugsweise etwa 4, eluiert. Eine bevorzugte Arbeitsweise besteht darin, ein saures Eluiermittel zu ver­ wenden, dessen Ionenstärke durch Zusatz eines löslichen Salzes erhöht wurde.

Als Adsorbens kann man vorteilhaft ein Siliziumdioxid mit einer spezifischen Oberfläche von etwa 5 bis 150 m²/g ver­ wenden, das einen Porendurchmesser von 25 bis 250 nm (250 bis 2500 Å) aufweist. Das Siliziumdioxid kann in Pulverform verwendet werden mit einer ausreichend großen Granulometrie bzw. Korngröße, beispielsweise von 5 µm bis 5 mm. Zur Ver­ wendung in der Kolonne bzw. Säule ist es bevorzugt, sich sphärischen Rügelchen mit Durchmessern in der Größenordnung von 10 bis 500 µm zu bedienen.

Zwar bildet das Siliziumdioxid einen ausgezeichneten Träger zur bevorzugten Fixierung von Lactoferrin, jedoch können auch andere Träger verwendet werden, insbesondere verschie­ dene natürliche oder künstliche Silikate, wie Bimsstein, Diatomeenerden, Bentonit, usw., sowie aktivierte Aluminium­ oxide.

Das Fixieren in schwach basischem Milieu bietet den Vorteil einer großen Selektivität für das Lactoferrin, das nur von einem Teil der Immunglobuline begleitet wird. Die anderen Proteine, insbesondere Lactalbumine, Lactoglubiline, Serum- Albumin und der Rest der Immunglobuline, verbleiben in Lösung in der überstehenden Flüssigkeit.

Nach der Gewinnung des Lactoferrins und der Immunglobuline wird der Träger - insbesondere das Siliziumdioxid - in Kon­ takt mit einer leicht basischen Lösung, beispielsweise vom pH-Wert 8 bis 9, gebracht, wodurch er fähig wird, für eine neue Extraktion, ausgehend von einem Milchprodukt, zu dienen. Es ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren wesent­ lich einfacher ist als die des Stands der Technik. So genügt im Vergleich mit den vorstehend genannten FR-Patentschriften ein einziger mineralischer Träger anstelle von zwei Trägern, von denen einer ein Ionenaustauscher ist. Darüber hinaus erfolgt das Fixieren im basischen Milieu anstelle der Durch­ führung bei pH-Werten unter 7,5 und insbesondere unter 7, wie dies beim gesamten Stand der Technik der Fall ist.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wäscht man nach dem Eluieren des Trägers mit einer sauren Lösung den Träger mit einer basischen Lösung, wodurch die Fraktion der Immun­ globuline, die in saurem Milieu nicht eluiert wurde, extra­ hiert werden kann. In diesem Fall kann die basische Lösung auch die Gewinnung eines Rests des Lactoferrins ermöglichen. Die Wäsche gemäß dieser Ausführungsform kann beispielsweise mit einem pH-Wert von 8 bis 10 erfolgen. Die Kapazität eines Siliziumdioxidträgers gegenüber Lactoferrin wird durch eine solche Wäsche nicht beeinflußt; letztere kann daher weggelas­ sen werden, wenn nur Lactoferrin extrahiert werden soll.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf Lactoserum unabhän­ gig von der Entfernungsmethode für das Kasein, die zu diesem Lactoserum führte, angewendet werden: Mit anderen Worten unabhängig davon, ob das Kasein durch Ansäuern der ursprüng­ lichen Milch oder durch Einwirken eines Enzyms ausgefällt wurde. Das Verfahren ist geeignet für Molke, sowie auch für Flüssigkeiten, die erhalten wurden durch Auflösen von Fest­ stoffen des Lactoserums, die nach jedem bekannten Mittel er­ halten wurden, beispielsweise durch Ultrafiltration oder Trocknung.

Die Erfindung kann auch auf die Extraktion von Lactoferrin verschiedener Milchsorten angewendet werden, insbesondere auf solche von Schafen, Rindern, sowie auch menschliche Milch. Da die erstgenannten wesentlich weniger Lactoferrin als letztere aufweisen, ist ihre Behandlung nach bekannten Tech­ niken weniger wirksam und auf diesem Gebiet ist die Möglichkeit der vorliegenden Erfindung besonders zu spüren.

Die Erfindung kann unter den Bedingungen durchgeführt: werden, die vorgesehen sind von Gordon, Ziegler & Basch, Biochim. Biophys. Acta 60, 410-411 (1962). Bei dieser Ausführungs­ form erfolgt das Fixieren auf einem Adsorbensträger in leicht basischem Milieu an einer Flüssigkeit, die Lactoferrin ent­ hält, der vorher eine Eisenverbindung zugesetzt worden war, derart, daß das gesamte vorhandene Lactoferrin mit Eisen gesättigt wurde.

Der Extraktionsgrad des Lactoferrins nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren ist erhöht. Was die Zusammensetzung der nach diesem Verfahren erhaltenen Proteine anschließend an das Eluieren des Adsorbensträgers mit einer sauren Lösung betrifft, so enthält sie 50% Lactoferrin und der Rest besteht hauptsächlich aus Immunglobulinen. Die Reinheit des Lactoferrins, das hauptsächlich als bakteriostatisches Mit­ tel verwendet wird, reicht ganz und gar aus, es ist nicht notwendig, sie von den Immunglobulinen zu trennen. Tatsäch­ lich hat es sich in vitro gezeigt, daß das Inhibierungsver­ mögen für das Wachstum pathogener Bakterien durch Lactofer­ rin durch die Anwesenheit von Immunglobulinen angeregt wurde.

Für den industriell besonders günstigen Fall, daß es sich bei dem Träger um Siliziumdioxid handelt, findet man eine Kapazität von diesem für das Lactoferrin von mehr als 20 mg pro Gramm Siliziumdioxid, was die industrielle Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens rechtfertigt.

Unter den erfindungsgemäßen Arbeitsbedingungen erfahren die Immunglobuline, die das Lactoferrin begleiten, keine Denatu­ rierung und können daher in der Nahrungsmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie und der veterinärmedizinischen Industrie verwendet werden, da sie alle ihre Eigenschaften beibehalten.

Die verschiedenen Proteine die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren abgetrennt werden können, lassen sich nach üblichen Methoden identifizieren, und insbesondere nach denen, die beschrieben werden von J. Garnier in Ann. Biol. anim. Bioch. Biophys. 1964, 4 (2) 163-187. Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

In eine Säule von 1 cm Innendurchmesser fügt man 5 g Silizium­ dioxidkörner mit einer Korngröße von 100 bis 200 µm. Dieses Siliziumdioxid weist eine spezifische Oberfläche von 20 m²/g und einen Porendurchmesser von 80 nm auf.

Das Siliziumdioxid wird mit einer 0,005 m Lösung von Dinatrium­ phosphat Na₂HPO₄ gewaschen.

In 1 l der gleichen Phosphatlösung löst man 10 g eines Pul­ vers, das erhalten wurde durch Trocknen der durch Ultrafil­ tration eines Lactoserums gewonnenen Feststoffe (Retentat); dieses Pulver enthält 6,5 g Proteine. Der pH-Wert der erhal­ tenen Lösung wird auf 8,2 eingestellt.

Man läßt anschließend die Lösung durch die Siliziumdioxid­ beschickung in der vorstehenden Säule mit einem Durchsatz von 60 ml/h laufen. Diese Beschickung wird anschließend mit einer 0,005 m Dinatriumphosphatlösung vom pH-Wert 8,2 derart gewaschen, daß sämtliche nicht am Siliziumdioxid fixierten Proteine entfernt werden.

Das fixierte Lactoferrin wird dann mittels einer 0,1 n Essig­ säurelösung, die mit NaCl in einer Konzentration von 0,5 m versetzt wurde, gewaschen. Man erhält so eine Fraktion von 25 ml rosa gefärbter Flüssigkeit mit einem Gehalt von 40 mg Proteinen, die zu 66% aus Lactoferrin bestehen, wobei der Rest Immunglobuline sind. Nach einer Wäsche der Beschickung des Siliziumdioxids durch Hindurchleiten einer Lösung von 0,005 in Natriumphosphat ist die Säule für einen neuen Adsorp­ tionszyklus bereit.

Beispiel 2

Bei einer Arbeitsweise ähnlich der des Beispiels 1 wird die Beschickung der Säule mit einem tris-HCl-Puffer vom pH 9, der mit 0,5 m NaCl versetzt ist, nach dem Eluieren mit Essig­ säure und dem Wiedergewinnen der Lactoferrinfraktion gewaschen. Dies führt zu einer neuen Fraktion von 20 ml, die 30 mg Proteine enthält, die hauptsächlich aus Immunglobulinen, Lactoperoxidase und einer sehr geringen Menge an Lactoferrin besteht.

Nach einer Wäsche des Siliziumdioxids in der Säule mit einer 0,005 in Dinatriumphosphatlösung ist die Säule für die erneute Verwendung bereit.

Beispiel 3

Man arbeitet wie in Beispiel 1, jedoch besteht die Lacto­ ferrinquelle aus einem Liter Molke, die direkt von der Fabri­ kation von Käse stammt, ohne Konzentrieren, wobei diese Flüssigkeit mit 0,005 Mol Dinatriumphosphat pro Liter ver­ setzt wird.

Man erhält die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1.

Beispiel 4

Die alkalische Wäsche des Beispiels 2 wird auf eine Arbeits­ weise unter Verwendung der Molke gemäß Beispiel 3 angewendet. Man erhält die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 2.

Claims (8)

1. Verfahren zur Extraktion von Lactoferrin aus im wesent­ lichen caseinfreiem wäßrigem Lactoserum durch Adsorption an einen festen Träger und anschließendes Eluieren der adsorbierten Proteine mittels einer sauren Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption in einem schwach basischen Milieu bei einem pH-Wert über 7,5 statt­ findet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des der Adsorption unterzogenen Milieus bei 7,7 bis 8,8 und vorzugsweise bei 7,9 bis 8,5 liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution bei einem pH-Wert unter etwa 4 durch­ führt, wobei das Eluiermittel vorzugsweise ein lösliches Salz enthält, das seine Ionenstärke erhöht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Adsorbens aus Siliziumdioxid be­ steht, dessen spezifische Oberfläche etwa 5 bis 150 m²/g und dessen Porendurchmesser 25 bis 250 nm beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man mit Siliziumdioxid in Pulverform arbeitet, dessen Granulometrie 5 µm bis 5 mm und vorzugs­ weise 10 bis 500 µm beträgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Adsorbens aus einem natürlichen oder künstlichen Silikat und/oder aus einem aktivierten Aluminiumoxid besteht.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man anschließend an das Eluie­ ren im sauren Milieu eine Behandlung mit einer basischen Lösung vornimmt und die so freigesetzten Iminunglobuline und restliches Lactoferrin gewinnt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man das Lactoserum vor dem Extrahieren konzentriert.