DE3625266A1 - Mittel zur verwendung in einem zwei- oder mehrphasensystem - Google Patents

Mittel zur verwendung in einem zwei- oder mehrphasensystem

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    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Verwendung in einem Zwei- oder Mehrphasensystem (bzw. vielphasigem System) zur Extraktion, Reinigung, Konzentrierung und/oder Trennung biologischer Substanzen.
Zwei- oder Mehrphasensysteme werden in "Partition of Cell Particles and Macromolecules NY (1971)" von Professor Per-Åke Albertsson beschrieben. Diese Systeme sollen eine Flüssig-Flüssig-Extraktion biologischer Makromoleküle, z. B. von Proteinen und Nucleinsäuren und Partikeln, z. B. Zellmembranen, Zellorganellen, Zellen und Viren, ermöglichen.
Diese Systeme wurden erhalten durch Vermischen wässriger Lösungen von zwei oder mehreren polymeren Substanzen. Die unterschiedlichen Polymerlösungen wurden jeweils in einer Phase angereichert. Die Zusammensetzung und die Volumen der Phasen sind von der Art und dem Molekulargewicht der Polymere, der Konzentration der Polymere und der Temperatur abhängig.
Die Eigenschaften, die diese Systeme in einzigartiger Weise besitzen und sie zur Extraktion, Reinigung, Konzentrierung und/oder Trennung biologischer Materialien geeignet machen, sind der sehr hohe Wassergehalt der flüssigen Phasen, meist 85 bis 99%, und die Möglichkeit, lösliche, wie auch partikelbildende Substanzen einzusetzen.
Die Systeme, die früher die vorteilhaftesten Eigenschaften im Hinblick auf Trennzeiten und Verteilung von biologischem Material zwischen den Polymerphasen aufwiesen, bestanden aus den Polymeren Dextran und Polyethylenglykol (PEG). Das Dextranpolymer war so teuer, dass vom ökonomischen Standpunkt eine technische Verwendung in einem Zweiphasensystem unmöglich war. Ausserdem verursachte das Dextran in der dextranhaltigen Phase eine ziemlich hohe Viskosität. Dadurch ergaben sich verlängerte Arbeitszeiten.
Albertsson testete eine Anzahl zweiphasiger Polymersysteme, die auf anderen wasserlöslichen Polymeren als PEG und Dextran basierten. Diese anderen Polymersysteme wiesen mehrere Nachteile auf, wie z. B. schlechte Stabilität, schlechte Trenneigenschaften oder hohe Viskosität, begleitet von ungebührend langen Trennzeiten.
Die Anforderungen an ein Polymer, das in den vorstehend genannten Systemen anstelle von Dextran verwendet werden soll, bestehen im Falle einer Verwendung zur Aufarbeitung biologischer Substanzen in grossem Massstab darin, dass der Preis des Polymers entsprechend niedrig, die Viskosität niedrig und die Auftrennungs- bzw. Trenneigenschaften des gebildeten Systems ebenso gut oder besser sind wie die der dextranhaltigen Systeme.
In überraschender Weise konnten nun diese Anforderungen gemäss der Erfindung erfüllt und ein Mittel zur Verwendung in einem Zwei- oder Vielphasensystem zur Extraktion, Reinigung, Konzentrierung und/oder Trennung biologischer Substanzen zur Verfügung gestellt werden.
Das erfindungsgemässe Mittel ist dadurch gekennzeichnet, dass es Hydroxyalkylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxyalkylgruppen von mehr als durchschnittlich 0,02 pro Glucoseeinheit enthält und ein durchschnittliches Molekulargewicht von weniger als 800.000 aufweist.
Vorzugsweise beträgt das durchschnittliche Molekulargewicht von Hydroxyalkylstärke höchstens 400.000 und besonders bevorzugt beträgt es höchsten 250.000.
Ein niedrigerer Substitutionsgrad als durchschnittlich 0,02 Hydroxyalkylgruppen pro Glucoseeinheit ergibt Polymerlösungen mit schlechter Stabilität, d. h. Bildung eines Gels.
Wie vorstehend genannt, sollte vorzugsweise das Molekulargewicht von Hydroxyalkylstärke höchstens 250.000 betragen. Dann wird ein Zweiphasensystem mit besseren Eigenschaften in bezug auf die Verteilung der biologischen Substanzen zwischen den Phasen des Systems erhalten. Ausserdem ist es bei einem niedrigen Molekulargewicht der Hydroxyalkylstärke z. B. möglich, eine grössere Menge an Proteinen pro Volumen des in Wasser aufgelösten Polymers zu verarbeiten als bei einem hohen Molekulargewicht.
Die Verwendung von Hydroxyalkylstärke gemäss der Erfindung ergibt ein System mit einer Viskosität, die für die technische Verwendung niedrig genug ist. Die Polymerlösungen weisen auch eine gute Stabilität auf.
Das Mittel gemäss der Erfindung enthält vorzugsweise Hydroxypropylstärke (HPS).
Ausserdem enthält das erfindungsgemässe Mittel gewöhnlich auch mindestens ein Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Methoxypolyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Methylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Ficoll.
Bei Verwendung des erfindungsgemässen Mittels werden die Hydroxyalkylstärken und das zusätzliche Polymer bzw. Polymeren in geeigneter Weise in Wasser aufgelöst.
Häufig machen die Hydroxyalkylstärke und die anderen Polymere 1 bis 40% der wässrigen Lösung aus.
Dann wird das biologische Material, das aufgearbeitet werden soll, zugegeben, und es wird im folgenden gerührt.
Sobald man das Rühren einstellt, bilden sich zwei deutlich begrenzte Flüssigkeitsschichten (Phasen). Die unterschiedlichen Komponenten des biologischen Materials werden zwischen diesen Schichten aufgetrennt.
Schliesslich werden die unterschiedlichen Komponenten aus den spezifischen Phasen wiedergewonnen. Es ist dann möglich, die Komponenten im weiteren in geeigneter Weise zu reinigen.
Nach einer Ausführungsform gemäss der Erfindung ist es möglich, eine selektivere Verteilung der Komponenten des biologischen Materials zwischen den unterschiedlichen Phasen zu erhalten. In diesem Fall kann eine sogenannte Affinitätstrennung angewendet werden, worin mindestens ein substituierter Ligand zu der Polymerlösung zugegeben wird.
Die verwendeten Liganden können aus geladenen wie auch ungeladenen Gruppen bestehen. Als Beispiele positiv geladener Liganden sind zu nennen: Trimethylaminogruppen, Diethylaminoethylgruppen und quaternäre Aminoethylgruppen.
Negativ geladene Liganden können z. B. bestehen aus Carboxylgruppen, Sulfonatgruppen, Carboxymethylgruppen, Carboxyethylgruppen, Sulfatgruppen und Phosphatgruppen.
Weitere Beispiele geeigneter Liganden sind Fettsäuren oder Derivate von Fettsäuren, Triazin-Farbstoffe, wie Cibacron Blau und Procion Gelb, Lectine, Coenzyme, Analoge von Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat und Adenosinmonophosphat, Thiamin-Bindungsproteine, Glucoproteine, Flavin-Bindungsproteine und Biotin-Bindungsproteine.
Zur Durchführung einer Affinitätstrennung (partition) können die vorstehend genannten Liganden an mindestens ein Polymer in dem Zweiphasensystem gebunden werden, d. h. an Hydroxyethylstärke und/oder ein Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Methoxypolyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose und Ficoll.
Üblicherweise sind Ligand und Polymer mittels kovalenter Bindungen verbunden.
Die bei Verwendung von Liganden erzielten Vorteile bestehen darin, dass sie bestimmte Komponenten des biologischen Materials selektiv binden. Es wird dann ein grösserer Anteil der spezifischen Verbindung in eine bestimmte Phase gehen, wodurch natürlich die Ausbeute höher wird.
Eine andere Art und Weise, die Verteilung der biologischen Komponenten zwischen den Phasen zu steuern, besteht darin, ein wasserlösliches Salz zu der Polymerlösung zuzugeben. Diese Verteilung wird auch durch das Molekulargewicht der vorliegenden Polymere beeinflusst.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend in Verbindung mit den nachstehenden Ausführungsbeispielen und den anliegenden Figuren und Tabellen erläutert. Die Beispiele 1 bis 9, 18 bis 22, 24 bis 26, 28, 29 und 31 bis 47 erläutern die Erfindung, während die restlichen Beispiele Vergleichstests darstellen, die ausserhalb des erfinderischen Rahmens liegen.
Beispiel 1
In einem Becherglas wird Hydroxypropylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit und mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 in Wasser zusammen mit Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000 aufgelöst.
Die Anteile zwischen Hydroxypropylstärke und dem Polyethylenglykol wurden bei konstanter Wassermenge variiert. Die erhaltenen Gemische wurden kurze Zeit gerührt, daraufhin wurde das Rühren eingestellt. Es wurde dann festgestellt, ob zwei Phasen erhalten wurden oder nicht. Das Ergebnis ist in Fig. 1 in Form eines sogenannten Phasendiagramms wiedergegeben.
Beispiel 2
0,7 g Hydroxypropylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit und mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 wurde in Wasser, zusammen mit 0,25 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000 aufgelöst.
Natriumphosphat wurde zu der erhaltenen Polymerlösung bis zu einer Konzentration von 10 mM zugegeben. Die Gesamtmenge des Zweiphasensystems betrug 5 g.
96 Einheiten des Enzyms β-Galactosidase wurden unter Rühren zugegeben. Das Rühren wurde dann für eine kurze Weile fortgesetzt.
Bei Beendigung des Rührens bildete die Lösung zwei Phasen. Daraufhin wurde die Enzymmenge in den zwei Phasen gemessen und das Mass der Verteilung zwischen den Phasen berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
Beispiel 3
Das Verfahren gemäss Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass ein Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
Beispiel 4
Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,1 M zugegeben wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Beispiel 5
Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,1 M zugegeben wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
Beispiel 6
Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass als Enzym Catalase eingesetzt wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
Beispiel 7
Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass als Enzym Catalase eingesetzt wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
Beispiel 8
Das Verfahren nach Beispiel 4 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass als Enzym Catalase eingesetzt wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
Beispiel 9
Das Verfahren nach Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass als Enzym Catalase eingesetzt wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
Beispiel 10
Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde. Das Ergebnis geht aus Tabelle 1 hervor.
Beispiel 11
Das Verfahren nach Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
Beispiel 12
Das Verfahren nach Beispiel 4 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde. Das Ergtebnis geht aus Tabelle 1 hervor.
Beispiel 13
Das Verfahren nach Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde.
Beispiel 14
Das Verfahren nach Beispiel 6 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde. Das Ergebnis geht aus Tabelle 1 hervor.
Beispiel 15
Das Verfahren nach Beispiel 7 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde. Das Ergebnis geht aus Tabelle 1 hervor.
Beispiel 16
Das Verfahren nach Beispiel 8 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde. Das Ergebnis geht aus Tabelle 1 hervor.
Beispiel 17
Das Verfahren nach Beispiel 9 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde.
Das Ergebnis geht aus Tabelle 1 hervor; es zeigt sich deutlich, dass mehr als 60% des Enzyms in der Polyethylenglykolphase bei den Verfahren gemäss Beispiel 2, 6, 10 und 14 gefunden werden. In Beispiel 2 werden mehr als 95% des Enzyms in der Polyethylenglykolphase gefunden.
Ebenso geht aus Tabelle 1 hervor, dass mehr als 85% des Enzyms in der Bodenphase (jeweils Hydroxypropylstärke oder Dextran) bei den Verfahren gemäss Beispielen 5, 9, 13 und 17 gefunden werden.
Somit zeigen die Ergebnisse, dass Hydroxypropylstärke- Polyethylenglykol ein Zweiphasensystem ergibt, welches ebenso wirksam ist wie Dextran-Polyethylenglykol.
Beispiel 18
0,025 g Hydroxypropylstärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 800.000 und mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von 0,14 pro Glucoseeinheit wurden in 1 ml Wasser aufgelöst.
3,75 mg Gammaglobulin von Kaninchen wurden unter Rühren zu der Polymerlösung zugegeben.
90% des Gammaglobulins wurden in der Stärkelösung gefunden.
Das Experiment wurde fortgesetzt durch Zugabe einer zunehmenden Menge an Hydroxypropylstärke. Bei zunehmendem Hydroxypropylstärkegehalt nahm die Präzipitation des Gammaglobulins zu, wie dies in Fig. 2 gezeigt wird.
Beispiel 19
Das Verfahren nach Beispiel 18 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Hydroxypropylstärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 verwendet wurde.
In diesem Falle wurde das Gammaglobulin bei keiner Konzentration von Hydroxypropylstärke ausgefällt, wie dies aus Fig. 2 hervorgeht.
Ein Vergleich der Ergebnisse gemäss den Beispielen 18 und 19 zeigt, dass Hydroxypropylstärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht innerhalb des erfindungsgemässen Bereiches keine präzipitierende Wirkung auf Gammaglobulin bei zunehmender Polymerkonzentration hat. Dagegen ist die präzipitierende Wirkung bei Verwendung von Hydroxypropylstärke mit einem Molekulargewicht ausserhalb des erfindungsgemässen Bereiches nennenswert.
Beispiel 20
In einem Becherglas wurden 0,9 g Hydroxypropylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit und mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 in 7,5 g 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0, zusammen mit 0,6 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 und 0,06 g eines substituierten Liganden, bestehend aus Cibacron Blau-Polyethylenglykol, aufgelöst. Das Polyethylenglykol wies das vorstehend genannte Molekulargewicht auf.
1 g Bäckerhefe, die z. B. das Enzym Phosphofructokinase enthält, wurde unter Rühren zugegeben.
Das Rühren wurde für kurze Zeit fortgesetzt. Dann wurde das Rühren eingestellt, wodurch die Lösung zwei Phasen bildete. Die Bodenphase bestand aus Hydroxypropylstärke.
Das Ergebnis der Auftrennung des Enzyms zwischen den zwei Phasen geht aus Tabelle 2 hervor.
Beispiel 21
Das Verfahren nach Beispiel 20 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde. Das Ergebnis der Auftrennung des Enzyms zwischen den zwei Phasen geht aus Tabelle 2 hervor.
Beispiel 22
Das Verfahren nach Beispiel 20 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass das Enzym Glucose-6-phosphat-dehydrogenase anstelle des Extraktes aus Bäckerhefe verwendet wurde. Das Ergebnis der Auftrennung des Enzyms zwischen den zwei Phasen ist in Tabelle 2 gezeigt.
Beispiel 23
Das Verfahren nach Beispiel 22 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt.
Beispiel 24
Das Verfahren nach Beispiel 20 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass kein substituierter Ligand zugegeben wurde. Das Ergebnis wird in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 25
Das Verfahren nach Beispiel 21 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass kein substituierter Ligand zugegeben wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 26
Das Verfahren nach Beispiel 22 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass kein substituierter Ligand zugegeben wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 27
Das Verfahren nach Beispiel 23 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass kein substituierter Ligand zugegeben wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 wiedergegeben.
Beispiel 20 bis 27
Diese Beispiele zeigen, dass Zweiphasensysteme, bestehend aus HPS und PEG plus Ligand auf die gleiche Weise arbeiten wie Zweiphasensysteme, die auf Dextran und PEG plus Ligand basieren, und zwar im Hinblick auf die Reinigung der Enzyme Phosphofructokinase und Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Die Enzyme werden selektiv in der oberen Phase verteilt, wenn in dem System ein Ligand vorliegt.
Beispiel 28
0,7 g Hydroxypropylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit und mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 wurden in ein Becherglas gegeben und in 10 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,0, zusammen mit 0,25 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000 aufgelöst. Die Gesamtmenge des Zweiphasensystems betrug 5 g.
In einem zweiten Becherglas wurden Zweiphasensysteme gemischt, wie dies vorstehend angegeben ist, mit der Ausnahme, dass 0,5 bis 2,5% des Polyethylenglykols aus einem substituierten Ligand bestanden, der Cibacron Blau-Polyethylenglykol darstellte, worin das Polyethylenglykol das vorstehend genannte Molekulargewicht aufwies. Ausserdem wurden 3% der Hydroxypropylstärke durch einen substituierten Liganden ersetzt, welcher aus Procion Gelb-Hydroxypropylstärke bestand, worin die Hydroxypropylstärke die vorstehend genannte Spezifikation aufwies.
0,4 g eines Extraktes von Bäckerhefe, welcher unter anderem das Enzym Glucose-6-phosphat-dehydrogenase enthielt, wurde unter Rühren zugegeben. Das Rühren wurde für kurze Zeit fortgesetzt und dann beendet, wodurch sich zwei Phasen bildeten. Die obere Phase bestand aus Polyethylenglykol.
Durch Zugabe des Liganden Cibacron Blau-Polyethylenglykol wurd das Enzym mehr und mehr in der oberen Phase verteilt. Bei Zugabe von Procion Gelb-Hydroxypropylstärke wird das Enzym in ähnlicher Weise in der Bodenphase verteilt. Das Ergebnis ist in Fig. 3 wiedergegeben.
Beispiel 29
In einem Becherglas wurden 2,8 g Hydroxypropylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit und mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 in 20 ml Wasser, zusammen mit 1,0 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000 aufgelöst.
Nach dem Rühren bildeten sich zwei Phasen, wovon die untere aus Hydroxypropylstärke bestand. Die Viskosität der genannten Phase wurde ermittelt durch Messung der erforderlichen Zeit, die 5 ml Lösung zum Passieren einer 10 ml Pipette benötigen. Die Zeit betrug 21,6 Sekunden.
Beispiel 30
Das Verfahren nach Beispiel 29 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500.000 anstelle von Hydroxypropylstärke verwendet wurde.
Nach dem Rühren bildeten sich zwei Phasen, wovon die untere aus Dextran bestand. Die erforderliche Zeit zum Passieren der Pipette wurde mit 37,5 Sekunden ermittelt.
Ein Vergleich der Ergebnisse gemäss den Beispielen 29 und 30 zeigt, dass die Hydroxypropylstärke gemäss der Erfindung eine wesentlich niedrigere Viskosität als Dextran ergab. Dies bedeutet wiederum, dass die Arbeitszeit in einem Zweiphasensystem mit Hydroxypropylstärke-Polyethylenglykol kürzer wird als in einem Zweiphasensystem mit Dextran-Polyethylenglykol.
Beispiel 31
Enzyme wurden mit Hilfe einer sogenannten Gegenstromverteilung in Zweiphasensystemen getrennt. Als Puffer diente 0,25 M Natriumphosphat mit einem pH von 7,0, welcher 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA und 0,02 mM MgCl2 enthielt.
21 g Hydroxypropylstärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 und einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von 0,14 pro Glucoseeinheit wurden in 53 g des vorstehend genannten Puffers aufgelöst. Der Puffer plus HPS bilden Lösung Nr. 1. 7,1 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 und 0,37 g eines substituierten Liganden, Cibacron Blau-Polyethylenglykol, wurden in 69 g des vorstehend genannten Puffers aufgelöst. Der Puffer plus PEG plus Ligand bilden Lösung Nr. 2. Das Polyethylenglykol wies die vorstehend genannte Spezifikation auf.
Lösung Nr. 1 wurde in 55 Bechergläsern mit 0,87 ml jeweils verteilt. 1,13 ml der Lösung Nr. 2 und 0,27 g Extrakt von Bäckerhefe, welcher die Enzyme Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratkinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Enolase, Phosphoglyceratmutase und Alkoholdehydrogenase enthielt, wurden unter Rühren zu den ersten drei Bechergläsern zugegeben.
Wenn das Rühren eingestellt wurde, so bildeten sich zwei Phasen, wovon eine aus Hydroxypropylstärke und Wasser bestand. Es erfolgte eine erste Aufteilung der Enzyme. Um diese Aufteilung zu verbessern, wurde die obere Phase des ersten Becherglases zu der Lösung im zweiten Becherglas transferiert, woraufhin 1,13 ml der Lösung Nr. 2 zu dem ersten Becherglas zugegeben wurden.
Nach einem weiteren Rühren bildeten sich in dem ersten und in dem zweiten Becherglas zwei Phasen. Gleichzeitig wurden die Enzyme zwischen den Phasen aufgeteilt. Die obere Phase in dem zweiten Becherglas wurde zu der Lösung in dem dritten Becherglas transferiert. Gleichzeitig wurde die obere Phase des ersten Becherglases in das zweite Becherglas transferiert und weitere 1,13 ml der Lösung Nr. 2 zu dem ersten Becherglas zugegeben.
Das Verfahren wurde solange wiederholt, bis sämtliche 55 Bechergläser zwei Phasen enthielt. Auf diese Weise wurde eine Auftrennung der Enzyme erzielt, wonach Enzyme mit einer starken Verteilung in der oberen Phase in den Bechern mit hohen Ordnungszahlen und Enzyme mit einer starken Verteilung in der Bodenphase in den Bechergläsern mit niedriger Ordnungszahl gefunden wurde.
Die Ergebnisse gehen aus Fig. 4 hervor.
Beispiel 32
In einem Becherglas wurden 14 g Hydroxypropylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit und mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 in 81 g Wasser, zusammen mit 25 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000, aufgelöst.
Nach dem Rühren bildeten sich zwei Phasen.
Die Stabilität des Zweiphasensystems wurde durch Lagerung in einem Gefrierschrank mit einer Temperatur von +4°C kontrolliert. Nach 14 Tagen konnte keine Tendenz zur Gelbildung beobachtet werden.
Beispiel 33
Das Verfahren nach Beispiel 32 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Hydroxypropylstärke einen Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von 0,01 pro Glucoseeinheit und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 14.000 aufwies.
Nach 3 Tagen konnte eine Tendenz zur Gelbildung beobachtet werden.
Ein Vergleich der Ergebnisse gemäss den Beispielen 32 und 33 zeigt, dass der Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen die Stabilität der spezifischen Zweiphasensysteme beeinflusst.
Der Vorteil eines in der Kälte stabilen Zweiphasensystems besteht darin, dass bestimmte biologische Materialien in der Kälte aufbereitet werden müssen.
Beispiel 34
Es wurde die Fähigkeit unterschiedlicher Stärkederivate zur Bildung von Zweiphasensystemen, zusammen mit Polyethylenglykol, getestet. Wie aus Tabelle 3 zu ersehen ist, bilden nur Hydroxyalkylderivate von Stärke zusammen mit Polyethylenglykol geeignete Zweiphasensysteme.
Beispiel 35
Desoxyribonucleinsäure, DNA, Ribonucleinsäure, RNA, wurden unter Verwendung eines Zweiphasen-Gegenstrom- Verteilungssystems aufgetrennt, wie dies in Beispiel 31 beschrieben wurde.
10 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,0, welcher 0,1 mM Natriumchlorid enthielt, wurde als Puffer verwendet.
7,8 g Hydroxypropylstärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 und mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit, wurden in 22,2 g des Puffers aufgelöst. Diese Lösung wird als Lösung Nr. 1 bezeichnet. 3,0 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000 wurden in 27 g des vorstehend genannten Puffers aufgelöst. Diese Lösung wird als Lösung Nr. 2 bezeichnet.
3 g der Lösung Nr. 1 wurden jeweils in 10 Reagensgläser gegeben. 3 g von Lösung Nr. 2 wurden dem Reagensglas Nr. 1 zusammen mit 5 mg DNA und 5 mg RNA zugegeben. Das Reagensglas wurde für kurze Zeit geschüttelt. Nach Beendigung des Schüttelns bildeten sich zwei Phasen. Die obere Phase wurde zu der Lösung im zweiten Reagensglas transferiert. Dann wurden 3 g der Lösung Nr. 2 zu dem ersten Reagensglas zugegeben.
Dieses Verfahren wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 31 fortgesetzt, wobei jedoch nur 10 Reagensgläser eingesetzt wurden. Das Ergebnis der Abtrennung von DNA und RNA ist in Fig. 5 wiedergegeben.
Beispiel 36
In einem Becherglas wurden 0,65 g Hydroxylpropylstärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 und mit einem Substituionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen, von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit, 0,25 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000, in 10 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,0 bis zu einer Gesamtmenge von 5 g aufgelöst.
10 g Bäckerhefe wurden unter Rühren zugegeben. Das Rühren wurde kurze Zeit fortgesetzt. Bei Einstellung des Rührens bildeten sich zwei Phasen.
Die erhaltene Verteilung der Hefezellen ist Tabelle 5 zu entnehmen.
Beispiel 37
Das Verfahren gemäss Beispiel 36 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Puffer 12,5 mM Natriumchlorid enthielt. Die erhaltene Verteilung der Hefezellen geht aus Tabelle 4 hervor.
Beispiel 38
Das Verfahren gemäss Beispiel 36 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Puffer 25 mM Natriumchlorid enthielt. Die Verteilung der Hefezellen geht aus Tabelle 4 hervor.
Beispiel 39
Das Verfahren gemäss Beispiel 36 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Puffer 50 mM Natriumchlorid enthielt. Die erhaltene Verteilung der Hefezellen ist Tabelle 4 zu entnehmen.
Beispiel 40
Das Verfahren gemäss Beispiel 36 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Puffer 75 mM Natriumchlorid enthielt. Die erhaltene Verteilung der Hefezellen geht aus Tabelle 4 hervor.
Beispiel 41
Das Verfahren gemäss Beispiel 36 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Puffer 100 mM Natriumchlorid enthielt. Die erhaltene Verteilung der Hefezellen ist Tabelle 4 zu entnehmen.
Beispiele 36 bis 41 zeigen, dass die Auftrennung der Hefezellen durch variierende Salzgehalte gesteuert werden kann. Das Ergebnis ist in Fig. 6a bis 6d gezeigt.
Beispiel 42
In einem Becherglas wurden 0,65 g Hydroxypropylstärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 und mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von durchschnittlich 0,14 pro Glucoseeinheit und 0,25 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000 in 10 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,0, welcher 10 mM Natriumchlorid enthielt, bis zu einer Gesamtmenge von 4,75 g aufgelöst.
0,25 g synaptische Membranen aus Kälberhirn wurden unter Rühren zugegeben. Das Rühren wurde für kurze Zeit fortgesetzt. Bei Einstellung des Rührens bildeten sich zwei Phasen.
Die erhaltene Verteilung der Membranen ist Fig. 7 zu entnehmen.
Beispiel 43
Das Verfahren gemäss Beispiel 42 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Puffer 25 mM Natriumchlorid enthielt.
Die erhaltene Verteilung der Membranen geht aus Fig. 7 hervor.
Beispiel 44
Das Verfahren gemäss Beispiel 42 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Puffer 50 mM Natriumchlorid enthielt. Das Ergebnis der Verteilung der Membranen ist in Fig. 7 gezeigt.
Beispiel 45
Das Verfahren gemäss Beispiel 42 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Puffer 100 mM Natriumchlorid enthielt. Das Ergebnis der Verteilung der Membranen ist in Fig. 7 gezeigt.
Beispiele 42 bis 45 zeigen, dass die Membranen durch zunehmenden Salzgehalt von der oberen Phase zu der Grenzfläche (interphase) gesteuert werden können.
Beispiel 46
4.000 g Hydroxypropylstärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 125.000 und mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxypropylgruppen von 0,14 pro Glucoseeinheit, 1.520 g Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8.000 und 4.000 g Schweinemuskelextrakt, welcher Lactatdehydrogenase (LDH) enthielt, wurden in 40 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,9 bis zu einer Gesamtmenge von 20.000 g aufgelöst.
Das erhaltene Gemisch wurde in zwei Phasen unter Verwendung eines Alfa-Laval-Separators LAPX 202 aufgetrennt. Die Menge an Lactatdehydrogenase (LDH) in jeder Phase wurde bestimmt.
Das Ergebnis ist in Tabelle 5 wiedergegeben.
Beispiel 47
Das Verfahren gemäss Beispiel 46 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 1,5% Polyethylenglykol den Liganden Procion Gelb kovalent gebunden hatte. Dieser Ligand besitzt eine Affinität für LDH.
Das Ergebnis ist in Tabelle 5 wiedergegeben.
Beispiele 46 und 47 zeigen, dass im grossen Massstab das Enzym LDH in die obere Phase extrahiert wird, wenn ein Ligand an das Polymer der oberen Phase gebunden ist.
Die Erfindung ist nicht auf die Ausführungsbeispiele limitiert; diese können in verschiedener Weise innerhalb des Umfangs der Erfindung modifiziert werden.
TABELLE 1
Abhängigkeit des Trennungskoeffizienten vom Molekulargewicht des Polymeren in der oberen Phase und der Ionenzusammensetzung der Lösung
TABELLE 2
Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten von einem Liganden, Cibacron Blau, welcher an das Polymer der oberen Phase, Polyethylenglykol, gebunden ist
TABELLE 3
Fähigkeit unterschiedlicher Stärkederivate zur Bildung von Zweiphasensystemen mit Polyethylenglykol
TABELLE 4
Auftrennung von Hefezellen in einem Zweiphasensystem mit unterschiedlicher Natriumchloridkonzentration
TABELLE 5
Auftrennung von LHD in einem grosstechnischen Zweiphasensystem unter Verwendung eines Extraktes aus Schweinemuskel

Claims (7)

1. Mittel zur Verwendung in einem Zwei- oder Mehrphasensystem zur Extraktion, Reinigung, Konzentrierung und/oder Trennung biologischer Substanzen, dadurch gekennzeichnet, dass es Hydroxyalkylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxyalkylgruppen von mehr als durchschnittlich 0,02 pro Glucoseeinheit enthält und ein durchschnittliches Molekulargewicht von weniger als 800.000 aufweist.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyalkylstärke ein durchschnittliches Molekulargewicht von höchstens 400.000 aufweist.
3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyalkylstärke ein durchschnittliches Molekulargewicht von höchstens 250.000 aufweist.
4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ausserdem mindestens ein Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Methoxypolyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyethylcellulose, Methylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose und Ficoll, enthält.
5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ausserdem mindestens einen substituierten Liganden enthält.
6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand an Hydroxyalkylstärke und/oder mindestens ein Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Methoxypolyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Methylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Ficoll, gebunden oder an denselben substituiert ist.
7. Verwendung einer wässrigen Lösung von Hydroxyalkylstärke mit einem Substitutionsgrad in bezug auf Hydroxyalkylgruppen von durchschnittlich mehr als 0,02 pro Glucoseeinheit und mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von weniger als 800.000 in einem Zwei- oder Mehrphasensystem zur Extraktion, Reinigung, Konzentrierung und/oder Trennung biologischer Substanzen.
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