DE4217917A1

DE4217917A1 - Heparin-polymer conjugate used to inhibit coagulation in analytical tests - comprises heparin fragments bonded to amino-phenyl substd. polymer

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Publication number: DE4217917A1
Application number: DE4217917A
Authority: DE
Inventors: Job Prof Dr Med Harenberg; Reinhard Malsch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-05-30
Filing date: 1992-05-30
Publication date: 1993-12-02

Abstract

Heparin-polymer conjugates comprise heparin fragments having a terminal anhydromannose gp. bonded by reductive amination to the amino gp. of a polymer contg. amino-substd. phenyl gps. The polymer is a polysulphone, polyurethane, polyimide, polystyrene, polyisopropylene or polybutadiene contg. a terminal amino-substd. phenyl gp., which is present esp. on the surface of the polymer. The heparin fragments are obtd. by cleaving native heparin with HNO2 and opt. fractionating the mixt. obtd. USE/ADVANTAGE - The conjugates are used to inhibit coagulation in analytical tests, to coat implants, instruments, venous catheters, cardiac pacemaker conductors and medical probes, and to mfr. diagnostics and retard formulations.

Description

Heparin wird seit über 50 Jahren erfolgreich in der antikoa gulanten Therapie und der Thromboseprophylaxe eingesetzt.Heparin has been successfully used in antikoa for over 50 years gulant therapy and thrombosis prophylaxis.

Weitere Anwendungsgebiete sind durch das antiinflammatori sche und antiproliferative Potential von Heparin gegeben.Further areas of application are through the antiinflammatori and anti-proliferative potential of heparin.

Kunststoffmaterial induziert nach Kontakt mit Blut eine Ge rinnung. In der modernen Medizin besitzt der Einsatz von Kunststoffmaterialien eine große Bedeutung: Stellvertretend erwähnt seien nur die Systeme zur extrakorporalen Zirkula tion und die Implantate. Aufgrund der Blutgerinnung muß eine Gerinnungshemmung vorgenommen werden, damit die Kunststoff oberflächen bzw. die -lumina nicht verstopfen. Aufgrund der Gerinnungshemmung entstehen Blutungskomplikationen in einem relativ hohen Prozentsatz der Anwendungen. Eine Beschichtung von Kunststoffen mit einer gerinnungshemmenden Substanz ist daher eine Alternative.Plastic material induces a Ge after contact with blood coagulation. In modern medicine, the use of Plastic materials of great importance: Representative only the systems for the extracorporeal circula are mentioned tion and the implants. Due to blood clotting, a Anticoagulation can be made to keep the plastic do not block surfaces or lumens. Due to the Anticoagulation causes bleeding complications in one relatively high percentage of applications. A coating of plastics with an anticoagulant substance hence an alternative.

Eine Heparinisierung von Kunststoffoberflächen bietet man nigfaltige Vorteile in der Analytik und in der Therapie, in dem sie die Blutgerinnung hemmt, ohne das Blut insgesamt in seiner Gerinnungsfähigkeit zu verändern. Eine solche Immobi lisation von Heparin auf Oberflächen von Glas und Kunststof fen erfolgt bisher nur unspezifisch durch Adsorption und Ad häsion zum Beispiel durch Aufdampfen oder aber durch eine unspezifische Reaktion am Heparinmolekül zum Beispiel durch chemische Bindung an einer OH Gruppe am Molekül. Ebenso bekannt ist die spezifische Bindung von Heparin und anderen Glykosaminoglykanen durch "end point attachment" an Stoffe, die primäre Aminogruppen enthalten, wie zum Beispiel Albumin (Hoffmann, A.S., Larm, O, and Scholander, E. (1983): A new method for covalent coupling of heparin and other glycosami noglycans to substances containing primary amino groups, Carbohydrate Research 117, 328; Larm, O., Larson, R. and Olson, P. (1983): A new nonthrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified, reducing terminal residue, Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs 11, 161).Heparinization of plastic surfaces is offered manifold advantages in analysis and therapy, in which it inhibits blood clotting without the blood in total to change its ability to clot. Such a property lization of heparin on surfaces of glass and plastic fen has so far only been carried out unspecifically through adsorption and ad for example by vapor deposition or by a non-specific reaction on the heparin molecule, for example chemical bond to an OH group on the molecule. As well the specific binding of heparin and others is known Glycosaminoglycans through "end point attachment" to substances, which contain primary amino groups, such as albumin (Hoffmann, A.S., Larm, O, and Scholander, E. (1983): A new method for covalent coupling of heparin and other glycosami noglycans to substances containing primary amino groups, Carbohydrate Research 117, 328; Larm, O., Larson, R. and Olson, P. (1983): A new nonthrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified, reducing terminal residue, biomaterials, medical devices, and Artificial Organs 11, 161).

Die bisher beschriebenen Verfahren erfüllen nicht die erfor derlichen Kriterien der Effizienz und Haltbarkeit, da durch die unspezifische Adsorption mit der Zeit eine Desorption eintritt und damit die Wirksamkeit vermindert wird.The methods described so far do not meet the requ the criteria of efficiency and durability as a result of the unspecific adsorption with time a desorption occurs and thus the effectiveness is reduced.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Heparin dauerhaft an Kunststoffoberflächen zu fixieren, ohne seine Wirksamkeit zu verringern. Die Erfindung betrifft ferner die Anwendung der so modifizierten Kunststoffe.The object of the present invention is therefore heparin permanently attached to plastic surfaces without its Reduce effectiveness. The invention further relates to the Use of the modified plastics.

Diese Aufgabe wird durch die in den Hauptansprüchen enthal tenen Merkmale gelöst bzw. durch die Merkmale der Unteran sprüche gefördert.This task is contained in the main claims resolved characteristics or by the characteristics of the subordinate promoted sayings.

Das hier vorgestellte neue Verfahren benützt eine spezifi sche chemische Reaktion an einer einzigen einheitlichen reaktiven Stelle des Heparinmoleküls. Das Reaktionsprodukt bietet den Vorteil, daß das gesamte Heparinmolekül nur an einer Stelle modifiziert ist und daher in seiner gesamten Länge mit Antithrombin III reagieren kann.The new method presented here uses a speci chemical reaction on a single unit reactive site of the heparin molecule. The reaction product offers the advantage that the entire heparin molecule only is modified in one place and therefore in its entirety Length can react with antithrombin III.

Kunststoffe, die bislang nicht zur Bindung mit Heparin benutzt werden konnten, da sie keine primären Aminogruppen enthal ten, kann durch das neue Verfahren zur Heparinimmobilisa tion benutzt werden. Die Ausbeute der Reaktion ist hoch und das gebundene Heparin bleibt aktiv.Plastics that have not previously been used for binding with heparin could be, since they contain no primary amino groups ten, can by the new procedure for Heparinimmobilisa tion can be used. The yield of the reaction is high and the bound heparin remains active.

Die häufigste Disaccharidsequenz von Heparin ist ein α-1,4 L-Iduronsäure 2-sulfat-<D- Glucosamin-N,6-disulfat (IdoA- 25-<GlcNSO₃-6S). Heparin kann durch salpetrige Säure gespal ten werden und es werden so gerinnungshemmend wirkende Heparinfragmente erhalten. Diese Heparinfragmente enthalten an dem reduktiven Ende eine freie Anhydromanose (Casu B.: Structure of Heparin and Heparin Fragments, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 556, Heparin and related Polysaccharides, Structure and Activities, 1989, 1-18). Diese freie Anhydromanose wird erfindungsgemäß als reaktive Gruppe zur kovalenten Bindung des Heparins an den Kunststoff verwendet.The most common heparin disaccharide sequence is an α-1,4 L-iduronic acid 2-sulfate- <D-glucosamine-N, 6-disulfate (IdoA- 25- <GlcNSO ₃ -6S). Heparin can be split by nitrous acid and anticoagulant fragments of heparin are obtained. These heparin fragments contain a free anhydromanose at the reductive end (Casu B .: Structure of Heparin and Heparin Fragments, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 556, Heparin and related Polysaccharides, Structure and Activities, 1989, 1-18). This free anhydromanose is used according to the invention as a reactive group for covalently binding the heparin to the plastic.

Aryl-Polymere kommen sehr häufig als Kunststoffe vor, z. B. in Polysulfonen, Polyurethanen, Polyimiden und Polystyrol und Polyisopren und Polybutadien mit endständiger Phenyl gruppe. Diese Kunststoffe können mit Nitriersäure oder sal petriger Säure nitriert oder nitrosiert werden. Danach er folgt eine Reduktion z. B. mit Zink/HCl, wodurch Kunststoffe entstehen, die vorzugsweise am aromatischen Rest Aminogrup pen enthalten.Aryl polymers are very common as plastics, e.g. B. in polysulfones, polyurethanes, polyimides and polystyrene and polyisoprene and polybutadiene with terminal phenyl group. These plastics can be mixed with nitrating acid or sal petroleum acid nitrided or nitrosated. After that he follows a reduction z. B. with zinc / HCl, which makes plastics arise, preferably on the aromatic residue aminogrup pen included.

Heparinfragmente mit einer freien Anhydromanose am redukti ven Ende werden mit den freien Aminogruppen am Aromaten um gesetzt, indem man sie einer reduktiven Aminierung unter wirft. Auf diese Weise wird Heparin spezifisch an den Kunst stoff gekoppelt. Das Verfahren ist daher besonders für die Heparinisierung von Dialysemembranen und biegsamen Schläu chen geeignet. Heparin fragments with a free anhydromanosis at the reduct end are dealt with the free amino groups on the aromatic by undergoing reductive amination throws. In this way, heparin becomes specific to art fabric coupled. The procedure is therefore especially for the Heparinization of dialysis membranes and flexible sleep Chen suitable.

Erfindungsgemäß ist es möglich, eine fertige Kunststoffober fläche, die aromatische Reste enthält, nur an den freilie genden Gruppen zu nitrieren und nach Reduktion mit Heparin umzusetzen, wodurch eine nur monomolekulare Belegung erfolgt und die erforderlichen Heparinmengen äußert gering sind. Dieses Verfahren hat den besonderen Vorteil, daß die Stabi litäts- und Elastizitätseigenschaften des Kunststoffkörpers nicht verändert werden.According to the invention it is possible to have a finished plastic upper area containing aromatic residues, only on the free nitrating groups and after reduction with heparin to implement, whereby only monomolecular occupancy takes place and the required amounts of heparin are extremely low. This method has the particular advantage that the stabilizer lity and elasticity properties of the plastic body cannot be changed.

Alternativ kann man aber auch einen aromatische Reste ent haltenden Kunststoff in geeigneten organischen Lösungsmit teln lösen, nitrieren, zum Amin reduzieren und an die Amino gruppen Heparin binden, um mit diesem Produkt eine vorhan dene Kunststoff- oder Glas- oder Metalloberfläche dünn zu überziehen. Der so erhaltene Kunststoff-Film ist durchgehend heparinisiert und verhindert eine Blutgerinnung an der damit geschützten Oberfläche. Eine weitere Möglichkeit stellt die Überziehung des Kunststoffes mit dem Kunststoff-Aryl-Polymer dar. Nachfolgend wird das so überzogene Material wie oben nitriert bzw. nitrosiert, reduziert und mit LMW-Heparin um gesetzt. Der filmbildende überzogene Kunststoff ist dabei natürlich so auszuwählen, daß er eine feste Haftung auf der zu schützenden Oberfläche gewährleistet. Auf diese Weise können vorteilhaft bereits vorhandene Vorrichtungen dauer haft heparinisiert werden.Alternatively, an aromatic residue can also be ent holding plastic in suitable organic solutions Dissolve, nitrate, reduce to amine and to the amino bind groups of heparin in order to use this product thin plastic or glass or metal surface cover. The plastic film thus obtained is continuous heparinizes and prevents blood from clotting protected surface. Another possibility is the Covering the plastic with the plastic aryl polymer Below is the material so coated as above nitrided or nitrosated, reduced and with LMW heparin set. The film-forming coated plastic is included of course to be chosen so that it has firm liability on the surface to be protected. In this way can advantageously existing devices last be heparinized.

Die Aktivität des Heparins bleibt durch Bindung an den Kunststoff erhalten wie durch den Heptest und den chromoge nen Test mit S2222 gezeigt wurde. Insbesondere der chromo gene Test mit S2222 eignet sich zur Bestimmung der Antifak tor Xa Aktivität des Konjugats. Durch Neutralisation mit Protaminchlorid wurde ermittelt, daß 1 mg Polysulfone 8 Internationale Einheiten LMW-Heparin gebunden enthält. The activity of the heparin remains by binding to the Plastic received as by the heptest and the chromoge N2222 test was shown. In particular the chromo gene test with S2222 is suitable for determining the antifac tor Xa activity of the conjugate. By neutralizing with Protamine chloride was found to contain 1 mg of polysulfones 8 Contains international units bound to LMW heparin.

Durch die Kopplung verbessern sich auch die physikalischen Eigenschaften des Kunststoffs wie z. B. die Löslichkeit.The coupling also improves the physical ones Properties of the plastic such. B. solubility.

Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen heparinisierten Kunststoffe:
Zu analytischen Zwecken, um die Blutgerinnung zu hemmen.
Beschichtung von Dialysefiltern und -leitungen
Beschichtung von Implantaten
Beschichtung von Instrumenten
Beschichtung von Venenkathetern
Beschichtung von Kabeln der Herzschrittmacher
Beschichtung von Sonden zur medizinischen Anwendung
Herstellung von Diagnostika
Herstellung von Retardarzneiformen.Fields of application of the heparinized plastics according to the invention:
For analytical purposes to inhibit blood clotting.
Coating of dialysis filters and lines
Coating implants
Coating of instruments
Coating venous catheters
Coating pacemaker cables
Coating probes for medical use
Manufacture of diagnostics
Production of prolonged-release drug forms.

In den folgenden Beispielen werden die Herstellung und die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Produkte näher erläu tert, ohne daß die Erfindung soweit beschränkt werden soll.In the following examples, the preparation and the Properties of the products according to the invention explained in more detail tert, without the invention being so limited.

example 1 Production of the heparin conjugate with polysulfone

Polysulfon Nr. 18,245- 1 von Aldrich;
ineare Formel: (-C₆H₄-C(CH₃)₂C₆H₄-OC₆H₄-SO₂C₆H₄-O-)n, wobei die Phenyle über die para-Stellung verknüpft sind; durchschnittliches Molekulargewicht (Mw): 67 000.Polysulfone No. 18,245-1 from Aldrich;
Inear formula: (-C ₆ H ₄ -C (CH ₃ ) ₂ C ₆ H ₄ -OC ₆ H ₄ -SO ₂ C ₆ H ₄ -O-) n, where the phenyls are linked via the para position; average molecular weight (Mw): 67,000.

0,5 g Polysulfon werden im Ultraschallbad 1 Stunde in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird mit 0,2 ml Nitriersäure (67 % konz. Schwefelsäure und 33 % konz. Sal petersäure) tropfenweise unter Eiskühlung behandelt. Es fällt das nitrierte Polymer aus. Dieses wird anschließend abfiltriert. Nachfolgend wird das Polymer z. B. mit 0,3 g Zink versetzt und mit 5 ml in HCl angesäuert und somit die Reduktion ausgeführt. Alternativ kann das Polymer elektro chemisch oder mit anderen Reduktionsmitteln reduziert werden.0.5 g polysulfone in an ultrasonic bath for 1 hour in 20 ml Dimethylformamide dissolved. This solution comes with 0.2 ml Nitrating acid (67% conc. Sulfuric acid and 33% conc. Sal treated with drops of ice while cooling with ice. It the nitrided polymer precipitates. This will then filtered off. Subsequently, the polymer z. B. with 0.3 g Zinc added and acidified with 5 ml in HCl and thus the Reduction carried out. Alternatively, the polymer can be electro reduced chemically or with other reducing agents will.

Das gewonnene Produkt wird in wäßriger Lösung mit 33 mg niedermolekularem Heparin, das eine freie Anhydromanose gruppe enthält, durch eine reduktive Aminierung mit Natrium cyanoborhydrid bei pH = 7 umgesetzt (48 Stunden bei 50°C unter Rühren). Das Produkt wird abfiltriert, in Di-methyl formamid gelöst und mit Wasser ausgefällt. Man erhält ein feinkörniges weißes Pulver. Das Produkt wird bei 37°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.The product obtained is in aqueous solution with 33 mg low molecular weight heparin, which is a free anhydromanosis contains group, by a reductive amination with sodium cyanoborohydride reacted at pH = 7 (48 hours at 50 ° C with stirring). The product is filtered off, in dimethyl Formamide dissolved and precipitated with water. You get one fine-grained white powder. The product is at 37 ° C to dried to constant weight.

Weitere Möglichkeiten der Herstellung sind: Lösung in Dime thylformamid bzw. in Tetrahydrofuran und die Ausführung obi ger Reaktion mit lyophilisiertem niedermolekularem Heparin. Other manufacturing options include: Dime solution thylformamide or in tetrahydrofuran and the execution obi reaction with lyophilized low molecular weight heparin.

Example 2 Coagulation tests (for methodology see J. Harenberg et al., Haemostasis 1989, left, 13-20)

1) Heptest: (Antifaktor Xa-Bestimmung)
Eine unverdünnte Plasmaprobe wird mit demselben Volumen Fak tor Xa 120 Sekunden bei 37°C inkubiert. Danach erfolgt eine Recalcifizierung des Reaktionsgemisches durch Recalmix. Dann wird die Zeit in Sekunden gemessen, welche das Plasma zur Gerinnselbildung benötigt. Diese Zeit wird in Heparin einheiten pro ml Plasma umgerechnet. Dazu wird eine vorher angefertigte Standardkurve benutzt.1) Heptest: (antifactor Xa determination)
An undiluted plasma sample is incubated with the same volume factor Xa for 120 seconds at 37 ° C. The reaction mixture is then recalcified by Recalmix. Then the time is measured in seconds that the plasma needs to form a clot. This time is converted into heparin units per ml of plasma. A previously created standard curve is used for this.

Der Test wurde nun so abgewandelt, daß 1-2 mg Polysulfon - Heparin gemäß Beispiel 1 mit 90 µl Poolplasma versetzt wurde und dann der Test, wie oben beschrieben, ausgeführt wurde.The test has now been modified so that 1-2 mg polysulfone - 90 μl pool plasma was added to heparin according to Example 1 and then the test was carried out as described above.

2) Coagulation test with the chromogenic substrate S2222

Plasmaproben werden mit einer definierten Menge Faktor Xa versetzt. Gemäß der enthaltenen Menge Heparin katalysiert dieses durch die Proteaseaktivität die Spaltung des chromo genen Substrats S2222. Durch diese Spaltung tritt eine gelbe Färbung auf, die nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten photometrisch bestimmt wird.Plasma samples are analyzed with a defined amount of factor Xa transferred. Catalyzed according to the amount of heparin contained this by the protease activity the cleavage of the chromo gene substrate S2222. A yellow occurs through this split Coloring after a reaction time of 30 minutes is determined photometrically.

Anhand einer erstellten Standardkurve mit Heparinverdünnun gen kann die Antifaktor Xa - Aktivität einer Probe bestimmt werden. Der Test wurde so durchgeführt, daß die abgewogenen Mengen Polysulfon-Heparin anstatt der Heparinverdünnung zugesetzt wurden. Der weitere Test wurde wie oben durchge führt. Using a standard curve with heparin dilution can determine the antifactor Xa activity of a sample will. The test was carried out so that the weighed Amounts of polysulfone heparin instead of the heparin dilution were added. The further test was carried out as above leads.

3) Neutralization with protamine chloride

Heparin kann mit Protaminchlorid im Verhältnis 1 : 1 neutra lisiert werden. Die Neutralisation läßt sich durch Anferti gen einer Protaminverdünnungsreihe mit dem chromogenen Test S2222 bestimmen. Durch Bestimmung der Protaminmenge läßt sich die gekoppelte Heparinmenge auf dem Polysulfon berech nen.Heparin can be neutralized with protamine chloride in a 1: 1 ratio be lized. The neutralization can be done by Anferti protamine dilution series with the chromogenic test Determine S2222. By determining the amount of protamine the coupled amount of heparin is calculated on the polysulfone nen.

Results

A:
0,1 g Polysulfon-Pulver werden in 20 ml H₂O suspendiert, dann mit 33 mg gespaltenem Heparin, in 1 ml H₂O gelöst, ver setzt und 24 Stunden zur Reaktion gebracht und das dicht gebundene, gespaltene Heparin mit dem Lösungsmittel vom PS- Pulver durch Filtrieren getrennt.A:
0.1 g of polysulfone powder are suspended in 20 ml of H ₂ O, then dissolved in 33 ml of heparin, dissolved in 1 ml of H ₂ O, reacted and reacted for 24 hours and the tightly bound, split heparin with the solvent from PS powder separated by filtration.

B:
0,1 g Polysulfon-NH₂ in 20 ml H₂O werden mit 33 mg LMW-Hepa rin in 1 ml H₂O versetzt und mit 0,01 g Natriumcyanoborhydrid die reduktive Aminierung durchgeführt (24 h). Das nicht gebundene Heparin wird durch Filtration getrennt.
Lösung A:
Eingesetzte Menge an LMW-Heparin in anti-Xa-Einheiten: 3300
Wiedergefundene Menge im Filtrat 3320
Gebundene Menge LMW-Heparin 0,0%
Lösung B:
Eingesetzte Menge an LMW-Heparin in anti-Xa-Einheiten: 3300
Wiedergefundene Menge im Filtrat 460
Gekoppelte Menge Heparin 2840
Gekoppelte Menge an LMW-Heparin in %
anti-Xa-Einheiten: 86,1% B:
0.1 g of polysulfone-NH ₂ in 20 ml of H ₂ O is mixed with 33 mg of LMW heparin in 1 ml of H ₂ O and the reductive amination is carried out with 0.01 g of sodium cyanoborohydride (24 h). The unbound heparin is separated by filtration.
Solution A:
Amount of LMW heparin used in anti-Xa units: 3300
Amount recovered in filtrate 3320
Bound amount of LMW heparin 0.0%
Solution B:
Amount of LMW heparin used in anti-Xa units: 3300
Amount recovered in the filtrate 460
Coupled amount of Heparin 2840
Coupled amount of LMW heparin in%
anti-Xa units: 86.1%

1. Yep test

Pulver A: 2 mg Polysulfon-Pulver, welches gemäß A inkubiert war, erwiesen sich im Heptest als wirkungslos und verändern die Gerinnungszeit gegenüber der Kontrolle mit NaCl nicht.Powder A: 2 mg polysulfone powder, which is incubated according to A. was ineffective and changed in the heptest the clotting time compared to the control with NaCl was not.

Pulver B: 2 mg des Polysulfon-Heparin-Pulvers B erwiesen sich im Heptest als aktiv und verlängerten die Gerinnungs zeit gegenüber der NaCl-Kontrolle um 11 sec.Powder B: 2 mg of polysulfone-heparin powder B proved proved to be active in the heptest and prolonged coagulation time compared to the NaCl control by 11 sec.

S2222 Chromogener Test für Faktor Xa S2222 Chromogenic test for factor Xa

Auch dieser Test zeigt, daß mit Heparin inkubiertes Polysul fonpulver A keine Heparinwirkung aufweist, während das gebundene Heparin in Pulver B eine starke Wirkung besitzt.This test also shows that polysul fonpulver A has no heparin effect, while the Bound heparin in powder B has a strong effect.

3. Detection of coupled heparin using toluidine blue and acridine orange

200 µl einer Lösung von 1 mg/ml von Toluidinblau bzw. Acridin orange werden mit Polysulfon bzw. Polysulfon-Heparin ver setzt. Wegen der schlechten Benetzbarkeit ist der Zusatz von 100 µl einer 2%igen Tween 20 Lösung notwendig. Die Inkuba tion erfolgt bei Raumtemperatur 48 Stunden unter ständigem Schütteln. 200 µl of a solution of 1 mg / ml of toluidine blue or acridine orange are ver with polysulfone or polysulfone heparin puts. Because of the poor wettability, the addition of 100 µl of a 2% Tween 20 solution is necessary. The Inkuba tion takes place at room temperature for 48 hours with constant Shake.

Nach 48 Stunden zeigen sich nach intensivem Waschen mit Aqua dest. die Polysulfon-Partikel unverändert während Toluidin blau die Partikel blau und Acridinorange sie orange anfärbt.After 48 hours show up after intensive washing with aqua least the polysulfone particles unchanged during toluidine blue stains the particles blue and acridine orange stains them orange.

Das Ausmaß der Färbung bei Toluidinblau und der Färbung und Fluoreszenz bei Acridinorange sind der Beweis der Bindung von LMW-Heparin.The extent of staining with toluidine blue and staining and Fluorescence from acridine orange is proof of binding of LMW heparin.

4. Determination of the bound amount of heparin by Austitra tion with protamine chloride

Heparin läßt sich durch Protaminchlorid im Verhältnis 1 : 1 neutralisieren, wodurch die Konzentration von Heparinkonju gat mit Polysulfon ermittelt werden kann. Ergebnisse:
0,04 mg Protaminchlorid neutralisieren 0,04 mg Heparin = 4,8 IE.
1 mg LMW-Heparin hat 120 Internationale Einheiten.
0,6 mg Polysulfon-Heparin enthalten 4,8 Internationale Ein heiten gebundenes LMW-Heparin.
1 mg Polysulfon-Heparin enthalten 8,0 Internationale Ein heiten gebundenes LMW-Heparin.Heparin can be neutralized by protamine chloride in a ratio of 1: 1, whereby the concentration of heparin conjugate can be determined with polysulfone. Results:
0.04 mg protamine chloride neutralize 0.04 mg heparin = 4.8 IU.
1 mg of LMW heparin has 120 international units.
0.6 mg polysulfone heparin contain 4.8 international units bound LMW heparin.
1 mg polysulfone heparin contains 8.0 international units bound LMW heparin.

Example 3 Production of polystyrene LWM heparin

1 g Polystyrol werden in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst. Die Nitrierung erfolgt mit 1,5 ml Nitriersäure. Danach wird eine Reduktion durch Zugabe von 0,5 g Zink durchgeführt. Das Polystyrol-NH₂ wird mit Wasser ausgefällt. Dann wird es abfiltriert und bei 37°C getrocknet. 1 g of polystyrene are dissolved in 20 ml of tetrahydrofuran. The nitration is carried out with 1.5 ml of nitrating acid. A reduction is then carried out by adding 0.5 g of zinc. The polystyrene-NH ₂ is precipitated with water. Then it is filtered off and dried at 37 ° C.

Die reduktive Aminierung erfolgt durch Lösen von 74 mg LMW- Heparin in Wasser. Polystyrol-NH₂ wird als Pulver suspen diert und 0,05 g Natriumcyanoborhydrid zugegeben. Polysty rol-LMW-Heparin wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet.The reductive amination is carried out by dissolving 74 mg of LMW heparin in water. Polystyrene-NH ₂ is suspended as a powder and 0.05 g of sodium cyanoborohydride are added. Polystyrene-LMW heparin is filtered off, washed and dried.

Vom Filtrat werden die Faktor Xa-Einheiten bestimmt.
Ergebnisse:
Eingesetzte Xa-Einheiten von LMW-Heparin: 6600 Einheiten
Xa-Einheiten von LMW-Heparin im Filtrat: 4860 Einheiten
Gebundene Menge in Xa-Einheiten: 1740 Einheiten pro 1 g Polystyrol.The factor Xa units are determined from the filtrate.
Results:
Xa units of LMW heparin used: 6600 units
Xa units of LMW heparin in the filtrate: 4860 units
Amount bound in Xa units: 1740 units per 1 g polystyrene.

Claims

1. Heparin-plastic conjugates consisting of one Plastic containing phenyl residues, which by a Amino group, to which heparin question elements with terminal anhydromanose group by reduk tive amination are bound.

2. heparin-plastic conjugates according to claim 1, characterized characterized in that the plastic is a polysulfone, Polyurethane, polyimide and a polystyrene or Polyisoprene or polybutadiene with terminal Is phenyl group.

3. heparin-plastic conjugates according to claim 1 or 2, characterized in that the amino group by Nitration or nitrosation of the plastic polymer and subsequent reduction are introduced.

4. heparin-plastic conjugates according to one of the claims 1 to 3, characterized in that the plastic only is substituted on its surface.

5. heparin-plastic conjugates according to claim 1 or 2, characterized in that the nitro or amino group pen before polymerizing into the plastic monomers be introduced.

6. heparin-plastic conjugates according to claims 1 to 5, characterized in that the heparin fragments by cleaving native heparin with nitrous Acid and optionally fractionation of the result the mixture are made.

7. Process for the production of heparin plastic cone gaten according to any one of claims 1 to 6, characterized characterized in that one containing phenyl radicals Nitrided plastic or corresponding monomers or nitrosed, reduced to amine and reductive with Heparin fragments that have a terminal anhydromano contain group, couples and if necessary the Monomers polymerized to plastic.

8. The method according to claim 7, characterized in that the reaction is only shaped on the surface of a Plastic part or the inner wall of a plastic hose is done.

9. The method according to claim 7, characterized in that the plastic is released and the solution after coupling of heparin to heparize the surface of one the part or hose applied and to a film is dried.

10. Heparinized devices, characterized in that they are made of a plastic according to one of the claims 1 to 6 exist or are covered with it.