DE60024612T2

DE60024612T2 - Verfahren zur herstellung von konditionierten zellkulturmedium-zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60024612T2
Application number: DE60024612T
Authority: DE
Inventors: K. Gail NAUGHTON; L. David HORWITZ; A. Mark APPLEGATE; Joan Zeltinger; N. Jonathan MANSBRIDGE; Andreas Kern; K. Lee LANDEEN; Anthony Ratcliffe; Emmett R. PINNEY
Original assignee: SkinMedica Inc
Current assignee: SkinMedica Inc
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: AU4843000A; US20070077232A1; MXPA01011487A; WO2000069449A3; HUP0201887A2; ZA200109381B; CA2373302A1; CA2373302C; JP5138129B2; EP1178812B1; US8138147B2; US8476231B2; US20130217069A1; EP1178812A2; US8361485B2; RU2001133453A; US20130210076A1; JP2002544235A; ES2254176T3; AU772829B2

Description

1. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von Zusammensetzungen, die ein Zellkulturmedium aufweisen, das durch in zweidimensionaler Kultur (d.h. eine Monoschicht) gewachsene Zellen oder in dreidimensionaler Kultur gewachsene Zellen konditioniert wird. Die zur Konditionierung des Mediums verwendeten Zellen können genetisch zur Veränderung der Konzentration von Proteinen modifiziert sein, die in dem Medium angetroffen werden. Das konditionierte Zellmedium wird für Anwendungen verarbeitet, in die Wundaufträge, kosmetische Additive, Nahrungsmittelergänzungen, Tierfutterergänzungen, Kultivieren von Zellen, pharmazeutische Anwendungen einbezogen sind, sowie als Zusammensetzungen und Methoden zur Stimulation von Haarwuchs.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
2.1. KONDITIONIERTES ZELLMEDIUM
Kulturmedium-Zusammensetzungen schließen typischerweise essentielle Aminosäuren, Salze, Vitamine, Mineralien, Spurenmetalle, Zucker, Lipide und Nucleoside ein. Das Zellkulturmedium ist bestrebt, die Komponenten bereitzustellen, die für die Erfüllung des Nährstoffbedarfs benötigt werden, der zum Wachstum der Zellen in einer kontrollierten, künstlichen und in vitro-Umgebung erforderlich ist. Nährstoff-Formulierungen, pH-Wert und Osmolarität variieren in Abhängigkeit von Parametern, wie beispielsweise Zelltyp, Zelldichte und vom Kultursystem, das zum Einsatz gelangt. In der Literatur sind zahlreiche Formulierungen für ein Zellkulturmedium dokumentiert und es steht eine Reihe von Medien kommerziell zur Verfügung. Sobald das Kulturmedium mit Zellen inkubiert ist, wird dieses in der Fachwelt als "verbrauchtes" oder "konditioniertes Medium" bezeichnet. Ein konditioniertes Medium enthält zahlreiche Ursprungskomponenten des Mediums sowie eine Vielzahl von zellularen Metaboliten und ausgeschiedenen Proteinen und einschließlich beispielsweise biologisch aktive Wachstumsfaktoren, inflammatorische Mediatoren und andere extrazellulare Proteine. Zelllinien, die als eine Monoschicht oder auf Kügelchen wachsen im Gegensatz zu Zellen, die in dreidimensionaler Form wachsen, haben keine Zelle-Zelle- und Zelle-Matrix-Wechselwirkungen, die für das Gesamtgewebe in vivo charakteristisch sind. Dementsprechend scheiden derartige Zellen eine Vielzahl von zellularen Metaboliten aus, obgleich sie diese Metabolite nicht notwendigerweise ausscheiden, sowie ausgeschiedene Proteine in Mengen, die sich physiologischen Konzentrationen nähern. Ein konventionelles konditioniertes Zellkulturmedium, ein in Kultur genommenes Medium durch Zelllinien, die als eine Monoschicht oder auf Kügelchen aufgezogen werden, wird in der Regel verworfen oder gelegentlich in Kulturveränderungen verwendet, wie beispielsweise beim Reduzieren von Zelldichten.
2.2. GEWEBEKULTURSYSTEME
Die Mehrzahl von Vertebraten-Zellkultwen in vitro werden als Monoschichten auf einem künstlichen Substrat in einem Kulturmedium als Bad aufgezogen. Die Beschaffenheit des Substrats, auf dem die Monoschichten wachsen, kann die eines Feststoffes sein, wie beispielsweise Kunststoff, oder die von halbfesten Gelen, wie beispielsweise Kollagen oder Agar. Kunststoffe für den einmaligen Gebrauch sind zu den bevorzugten Substraten geworden, die in der gegenwärtigen Gewebe- oder Zellkultur verwendet werden.
Eine Reihe von Wissenschaftlern haben die Verwendung von natürlichen Substraten in Verbindung mit Basalmembran-Komponenten untersucht. Basahnembranen weisen eine Mischung von Glykoproteinen auf und Proteoglykanen, die die meisten Zellen in vivo umgeben. Beispielsweise haben Reid und Rojkund, 1979, In, "Methods in Enzymology", Bd. 57, "Cell Culture", Jakoby & Pasten, Herausg., New York, Acad. Press, S. 263–278; Vlodavsky et al., 1980, "Cell" 19:607–617; Yang et al., 1979, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA 76:3401, Kollagen zum Kultivieren von Hepatozyten, Epithelzellen und Endothelgewebe verwendet. Das Wachstum von Zellen auf schwimmendem Kollagen (Michalopoulos und Pitot, 1975, Fed. Proc, 34:826) und Cellulosenitrat-Membranen (Savage und Bonney, 1978, "Exp. Cell Res.", 114:307–315) sind in Versuchen verwendet worden, eine abschließende Differenzierung zu erleichtern. Allerdings ist bisher eine verlängerte Zellregeneration und die Kultur derartiger Gewebe in solchen Systemen noch nicht gelungen.
Es sind Kulturen von Maus-Embryofibroblasten zur Verstärkung des Wachstums von Zellen und speziell bei geringen Dichten verwendet worden. Man nimmt an, dass dieser Effekt zum Teil auf die Ergänzung des Mediums zurückzuführen ist, er kann jedoch auch eine Folge des Konditionierens des Substrats durch Zellprodukte sein. In diesen Systemen werden Wachstumsunterlagen von Fibroblasten auf konfluenten Monoschichten aufgezogen, wodurch die Oberfläche zur Anhaftung anderer Zellen gebracht wird. Beispielsweise ist das Wachstum von Glioma auf konfluenten Wachstumsunterlagen von normalem fötalem Darm veröffentlicht worden (Lindsay, 1979, "Nature", 228:80).
Obgleich das Kultivieren von Zellen in zwei Dimensionen einer einfachen Methode zum Herstellen, Beobachten und Untersuchen von Zellen in Kulturen ist, mit der eine hohe Rate der Zellproliferation möglich ist, fehlt ihm das Merkmal des Ganzgewebes in vivo. Um derartige funktionelle und morphologische Wechselwirkungen zu untersuchen, ist von einigen Wissenschaftlern die Verwendung dreidimensionaler Substrate untersucht worden, wie beispielsweise Kollagen (Douglas et al., 1980, "In Vitro", 16:306–312; Yang et al., 1979, "Proc. Natl. Acad. Sci.", 76:3401; Yang et al., 1980, "Proc. Natl. Acad. Sci.", 77:2088–2092; Yang et al., 1981, "Cancer Res.", 41:1021–1027); Celluloseschwamm, allein (Leighton et al., 1951, "J. Natl. Cancer Inst.", 12:545–561) oder beschichtetes Kollagen (Leighton et al., 1968, "Cancer Res.", 28:286–296); ein Gelatineschwamm, Gelschaum (Sorour et al., 1975, "J. Neurosurg.", 43:742–749).
Im Allgemeinen werden diese dreidimensionalen Substrate mit den aufzuziehenden Zellen beimpft. Von vielen der Zelltypen ist berichtet worden, dass sie die Matrix penetrieren und eine "zellähnliche" Histologie schaffen. Beispielsweise sind dreidimensionale Kollagen-Gele zum Kultivieren von Brust-Epithel genutzt worden (Yang et al., 1981, "Cancer Res.", 41:1021–1027) sowie sympathetische Neuronen (ebenda 1, 1976, "Exp. Cell Res.", 98:159–169). Darüber hinaus sind zahlreiche Versuche unternommen worden, die gewebeähnliche Architektur von dispergierten Monoschichtkulturen zu regenerieren. Kruse und Miedema (1965, "J. Cell Biol.", 27, 273) haben berichtet, dass übergossene Monoschichten zu mehr als einer Tiefe von zehn Zellen aufgezogen werden könnten und Organoidstrukturen in mehrlagigen Kulturen entwickelt werden könnten, wenn die Zufuhr eines geeigneten Mediums aufrechterhalten bleiben würde (siehe auch Schneider et al., 1963, "Exp. Cell. Res.", 30:449–459; Bell et al., 1979, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA 76:1274–1279; Green, 1978, "Science", 200:1385–1388). Es ist veröffentlicht worden, dass epidermale Human-Keratinozyten Dermatoglyphen bilden können (Friktionsriefen, wenn sie mehrere Wochen ohne Transfer gehalten werden); Folkman und Haudenschild (1980, "Nature", 288:551–556) haben über die Bildung von Kapillartubuli in Kulturen von endothelialen Gefäßzellen berichtet, die in Gegenwart von Endothelwachstumsfaktor und Medium aufgezogen wurden, das durch Tumorzellen konditioniert war; und Sirica et al. (1979, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA, 76:283–287; 1980, "Cancer Res.", 40:3259–3267) haben Hepatozyten in Primärkultur für etwa 10 bis 13 Tage auf Nylonnetzen gehalten, die mit einer dünnen Kollagenschicht überzogen waren. Allerdings ist eine langfristige Kultur und Proliferation von Zellen in derartigen Systemen nicht erreicht worden.
Es ist die Herstellung einer langfristigen Kultur von Geweben versucht worden, wie beispielsweise Knochenmark. Insgesamt waren die Ergebnisse enttäuschend insofern, dass, obwohl sich die Stromazellenschicht, die unterschiedliche Zelltypen enthielt, rasch bildete, die Blutbildung über irgendeine reale Zeitdauer nicht aufrechterhalten werden konnte. (Siehe hierzu Dexter et al., in "Long Term Bone Marrow Culture", 1984, Alan R. Liss, Inc., S. 57–96).
Eine Reihe von Gruppen haben versucht, Haut- und Bindegewebe in vitro zur in vivo-Transplantation aufzuziehen. In einem derartigen System bildet ein hydratisiertes Rinderkollagennetz das Substrat, auf dem Zellen, wie beispielsweise Fibroblasten, eingebaut werden, die zur Kontraktion des Gitters zu Gewebe führen (Bell et al., US-P-4 485 096). In einem anderen System ist ein poröser vernetzter Kollagenschwamm zum Kultivieren von Fibroblastzellen verwendet worden (Eisenberg, WO 91/16010). Es ist auch ein aus synthetischen Polymeren aufgebautes Grundgerüst zur Kontrolle des Zellwachstums und Proliferation in vitro beschrieben worden, so dass dieses, sobald die Fibroblasten zu wachsen begannen und an der Matrix hafteten, in den Patienten transplantiert wurde (Vacanti et al., US-P-5 759 830, 5 770 193, 5 736 372).
Ebenfalls sind synthetische Matrices, die aus biozersetzbaren, biokompatiblen Grundgerüstbildung für das Zellwachstum konzipiert worden (US-P-5 654 381, 5 709 854). Nicht biozersetzbare Grundgerüste sind in ähnlicher Weise in der Lage, das Zellwachstum zu unterstützen. Ebenfalls sind dreidimensionale Zellkultursysteme entwickelt worden, die aus einer Stromamatrix aufgebaut waren, die das Wachstum der Zellen von irgendeinem gewünschten Gewebe in einem erwachsenen Gewebe unterstützen sollten (Naughton et al., US-P-4 721 096 und 5 032 508). Eine andere Vorgehensweise umfasst das langsame Polymerisieren von Hydrogelen, die große Zahlen des gewünschten Zelltyps enthalten, die zu einer Matrix härten, sobald diese einem Patienten verabreicht werden (US-P-5 709 854). Es sind extrazelluläre Matrixpräparate aufgebaut worden, die sich aus Stromzellen zusammensetzten, die für einen gewünschten Zelltyp ein dreidimensionales Zellkultursystem bereitstellen, das in den Patienten zum präzisen Einbau des Biomaterials injiziert wird (Naughton et al., WO 96/39101).
2.3. ZELLULARE CYTOKINE UND WACHSTUMSFAKTOREN
Die Sekretion extrazellularer Proteine in konditionierte Zellmedien, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, Cytokine und Stressproteine, eröffnet neue Möglichkeiten in der Herstellung von Produkten zur Verwendung in einer großen Vielzahl von Bereichen, einschließlich Gewebereparatur, z.B. bei der Behandlung von Wunden und anderen Gewebedefekten, wie beispielsweise kosmetischen Defekten, sowie in Nahrungsmittelergänzungen für Mensch und Tier. Beispielsweise sind Wachstumsfaktoren dafür bekannt, dass sie eine bedeutende Rolle im Prozess der Wundheilung spielen. Im Allgemeinen wird es in der Behandlung von Wunden für wünschenswert gehalten, die Zuführung von Wachstumsfaktoren durch direkte Zugabe dieser Faktoren zu verstärken.
In einer Reihe von entscheidenden zellularen Prozessen sind zellulare Cytokine und Wachstumsfaktoren beteiligt, einschließlich Zellproliferation, Adhäsion, morphologisches Aussehen, Differenzierung, Migration, Entzündungsreaktionen, Angiogenese und Zelltod. Untersuchungen haben nachgewiesen, dass hypoxischer Stress und Verletzung an Zellen zu Reaktionen führen, einschließlich erhöhte Mengen an mRNA und Proteinen, die mit Wachstumsfaktoren korrespondieren, wie beispielsweise PDGF (aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor), VEGF (Gefäßendothel-Wachstumsfaktor), FGF (Fibroblasten-Wachstumsfaktor) und IGF (insulinähnlicher Wachstumsfaktor) (Gonzalez-Rubio, M. et al., 1996, "Kidney Int.", 50(1):164–73; Abramovitch, R. et al., 1997, "Int. J. Exp. Pathol.", 78(2):57–70; Stein, I. et al., 1995, "Mol. Cell Biol.", 15(10):5363–8; Yang. W. et al., 1997, FEBS Lett. 403(2):139–42; West, N. R. et al., 1995, "J. Neurosci. Res.", 40(5):647–59).
Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise der von transformierten Zellen gebildete Wachstumsfaktor β, auf dem Fachgebiet auch bekannt als TGF-β, werden durch bestimmte Stressproteine während der Wundheilung ausgelöst. Zwei bekannte Stressproteine sind GRP78 und HSP90. Diese Proteine stabilisieren Zellstrukturen und machen die Zellen gegenüber nachteiligen Bedingungen widerstandsfähig. Die TGF-β-Familie von dimeren Proteinen schließt TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 ein und reguliert das Wachstum und die Differenzierung zahlreicher Zelltypen. Darüber hinaus zeigt diese Familie von Proteinen einen Bereich von biologischen Wirkungen, die das Wachstum einiger Zelltypen stimulieren (Noda et al., 1989, "Endocrinology", 124:2991–2995) und das Wachstum anderer Zelltypen hemmen (Goey et al., 1989, "J. Immunol.", 143:877–880; Pietenpol et al., 1990, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA, 87:3758–3762). Von TGF-β wurde auch gezeigt, dass es die Expression von extrazellularen Matrixproteinen einschließlich Kollagen und Fibronektin erhöht (Ignotz et al., 1986, "J. Biol. Chem.", 261:4337–4345) und die Heilung von Wunden beschleunigt (Mustoe et al., 1987, "Science", 237:1333–1335).
Ein anderer derartiger Wachstumsfaktor ist PDGF. Von PDGF wurde ursprünglich festgestellt, dass er für Mesenchym-derivierte Zellen ein potentes Mitogen ist (Ross R. et al., 1974, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA, 71(4):1207–1210; Kohler N. et al., 1974, "Exp. Cell Res.", 87:297–301). Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass PDGF den Anteil der Zellularität und Granulation in der Gewebebildung erhöht. Mit PDGF behandelte Wunden haben das Aussehen eines Frühstadiums einer Entzündung einschließlich einer Erhöhung neutrophiler Zellen und makrophagen Zelltypen am Wundort. Diese Wunden zeigen auch eine erhöhte Fibroblastfunktion (Pierce, G. F. et al., 1988, "J. Exp. Med.", 167:974–987). In Tieruntersuchungen haben sowohl PDGF als auch TGF-β gezeigt, dass sie die Kollagenbildung, den DNA-Gehalt und die Proteinwerte erhöhen (Grotendorst, G. R. et al., 1985, "J. Clin. Invest.", 76:2323–2329; Sporn, M. B. et al., 1983, "Science", (Wash DC) 219:1329). Von PDGF wurde gezeigt, dass es in der Behandlung von Wunden beim Menschen wirksam ist. In Wunden des Menschen ist die PDGF-AA-Expression innerhalb von Druckgeschwulsten, die eine Heilung durchmachen, erhöht. Die Erhöhung von PDGF-AA entspricht einer Zunahme in aktivierten Fibroblasten, einer extrazellularen Matrixabscheidung und aktiven Gefäßneubildung der Wunde. Darüber hinaus wurde eine Zunahme in PDGF-AA nicht festgestellt in chronischen nichtheilenden Wunden (Principles of Tissue Engineering, R. Lanza et al. (Heraus.), S. 133–141 (R. G. Landes Co. TX 1997). Eine Reihe anderer Wachstumsfaktoren, die über die Fähigkeit zur Auslösung von Angiogenese und Wundheilung verfügen, schließen VEGF, KGF und basisches FGF ein.
Es gibt gegenwärtig keine einfachen wirksamen Methoden oder Zusammensetzungen zur Anwendung, die die Vielzahl von Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder anderen regulatorischen Proteine enthalten, wie sie in dem konditionierten Medium der Patentanmelder angetroffen werden.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben neuartige Methoden zur Herstellung von Zusammensetzungen konditionierter Zellkulturmedien entdeckt.
Die Methoden zum Reifen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen konditionierter Zellmedien können jedes beliebige, bekannte definierte oder undefinierte Medium umfassen und können unter Anwendung eines beliebigen eukaryotischen Zelltyps konditioniert werden. Das Medium kann konditioniert werden durch Stromazellen, Parenchymzellen, Mesenchym-Stammzellen, Leberreservezellen, neuralen Stammzellen, pankreatischen Stammzellen und/oder nichthumanen Embryo-Stammzellen. Es findet ein dreidimensionales Gewebekonstrukt Anwendung. Der Zelltyp wird die Eigenschaften des konditionierten Mediums beeinflussen. Beispielsweise wird ein mit Astrozyten und neuronalen Zellen konditioniertes Medium bestimmte charakteristische Metabolite und Proteine hervorbringen, so dass ein solches konditioniertes Medium für bestimmte Nerven-Reparaturanwendungen bevorzugt ist. Das Medium der Anmelder wird mit dreidimensionalen Zellen und Gewebekultur konditioniert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Medium mit Stromazellen konditioniert, die in der Herstellung von TransCyte^TM (Smith & Nephew PLC, Großbritannien) verwendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind Zellen der dreidimensionalen Gewebekultur Stromazellen, wobei das Konstrukt der Gewebekultur Dermagraft^® ist (Advanced Tissue Sciences, Inc., La Jolla, CA) und zwar mit oder ohne Zugabe spezieller Parenchymzellen. Ein derartiges konditioniertes Zellmedium gewährt eine einzigartige Kombination von Faktoren und vorgegebenen Anteilen, die anders sind als Monoschichtkulturen und diejenigen genauer repräsentieren, die in vivo angetroffen werden. Die dreidimensionale Stroma-Kultur kann ferner mit Parenchymzellen aufgezogen werden, wie beispielsweise Zellen der Haut, des Knochens, der Leber, der Nerven, Pankreas, usw., woraus ein konditioniertes Medium resultiert, das charakteristische extrazellulare Proteine und andere Metabolite dieses Gewebetyps enthält. Darüber hinaus kann jeder Zelltyp auch genetisch modifiziert werden. Die genetische Modifikation kann angewendet werden, um die Konzentration einer oder mehrerer Komponenten in dein Medium zu verändern, wie beispielsweise die Hochregulierung eines Proteins, um ein neues Protein einzuführen oder um die Ionenkonzentration zu regulieren.
Sobald das in der vorliegenden Erfindung erhaltene Zellmedium konditioniert ist, lässt es sich in jedem beliebigen Zustand verwenden. Physikalische Ausführungsformen des konditionierten Mediums schließen flüssig oder fest ein, tiefgefroren, lyophilisiert oder zu einem Pulver getrocknet, ohne auf diese beschränkt zu sein. Zusätzlich kann das Medium mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger als Vehikel für die innere Verabreichung formuliert werden, das direkt auf ein Nahrungsmittelartikel oder Produkt aufgebracht wird, mit einer Salbe oder Creme für topische Aufträge angesetzt wird oder beispielsweise in einen chirurgischen Leim eingearbeitet oder zugegeben wird, um die Heilung von Strukturen nach invasiven Prozeduren zu beschleunigen. Außerdem kann das Medium weiter verarbeitet werden, um einen oder mehrere Faktoren oder Komponenten, die in diesem Medium enthalten sind, zu konzentrieren oder zu reduzieren. Beispielsweise lässt sich das konditionierte Medium mit einem Wachstumsfaktor unter Anwendung der Immun-Affinitätschromatographie anreichern.
In einer der Ausführungsformen wird das in der vorliegenden Erfindung erhaltene konditionierte Medium in der Wundheilung verwendet. Beispiele schließen die Aufbringung des konditionierten Zellmediums auf die Gaze einer Bandage ein (klebend oder nichtklebend) und die Verwendung in topischen Aufträgen zur Förderung und/oder Beschleunigung der Wundheilung, ohne auf diese beschränkt zu sein. Wiederum lässt sich das konditionierte Medium weiter verarbeiten, um eine oder mehrere Komponenten zu konzentrieren oder zu reduzieren, um die Wundheilung zu beschleunigen. Zur Beschleunigung der Wundheilung können die Zusammensetzungen lyophilisiert/gefriergetrocknet und als Wundfüller zugegeben werden oder zu bestehenden Wund füllenden Zusammensetzungen zugegeben werden. Alternativ lässt sich das Medium einer Hydrogelzusammensetzung zusetzen und als Film für topische Wundbehandlungen und nichtklebende Aufträge verwenden. Die erfindungsgemäßen Mediumzusammensetzungen lassen sich mit Zellen konditionieren, welche Genprodukte mit verbesserten Wundheileigenschaften exprimieren, d.h. gentechnisch bearbeitete Zellen, die Genprodukte exprimieren, die über Eigenschaften gegen Narbenbildung verfügen.
In einer anderen Ausführungsform werden in der Erfindung erhaltene Zubereitungen des konditionierten Zellmediums verwendet, um angeborene Anomalien und erworbene physikalische Defekte zu korrigieren. Ferner lassen sich die Formulierungen in Form von Injektionslösungen oder Hydrogelen verwenden, um Falten, Runzeln, Narben zu eliminieren und andere Hauterkrankungen zur reparieren. In einer anderen Ausführungsform kann das konditionierte Zellmedium auch zu Lidschatten, Wangenrouge, Pressen oder anderen Kosmetika zugesetzt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform werden die in der Erfindung erhaltenen Formulierungen des konditionierten Zellmediums als Nahrungsmittelzusätze und diätetische Ergänzungsstoffe verwendet. Das konditionierte Medium enthält eine Vielzahl von Nährstoffen und einschließlich essentiellen Aminosäuren, Vitaminen und Mineralien. Das konditionierte Zellmedium der Erfindung kann beispielsweise konzentriert und/oder lyophilisiert werden und wird bevorzugt in Kapseln oder Tabletten zur Einnahme verabreicht. Darüber hinaus lassen sich die Zusammensetzungen auch direkt der Nahrung zusetzen, um den Nährstoffgehalt zu erhöhen.
In einer weiteren Ausführungsform können die Zusammensetzungen als Ergänzung in Tierfutter verwendet werden, da sie eine Vielzahl von Proteinen, Vitaminen, Antikörpern, Polysacchariden und andere Faktoren enthalten, die für das Kultivieren von Rind und andere Wiederkäuer vorteilhaft sind.
In einer noch anderen Ausführungsform der Erfindung lassen sich die in der Erfindung erhaltenen Zusammensetzungen zum Kultivieren von Zellen verwenden. Das konditionierte erfindungsgemäße Zellmedium enthält Faktoren, die zur Förderung der Zellhaftung und -wachstum nützlich sind. Darüber hinaus lässt sich das Zellmedium durch Zellen konditionieren, die genetisch bearbeitet worden sind und die beispielsweise erhöhte Konzentrationen an Fibronectin oder Kollagen enthalten, die zur Unterstützung der Zellhaftung an einem Grundgerüst oder einer Kulturoberfläche vorteilhaft sind.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Zusammensetzungen des konditionierten Zellmediums für pharmazeutische Anwendungen verwendet. Die Erfindung umfasst Zellmedien, die mit dreidimensionalen Gewebekonstrukten kultiviert wurden, so dass Wachstumsfaktoren und andere Proteine in das Medium mit Anteilen abgeschieden werden, die genau denen ähneln, wie sie in vivo angetroffen werden. Insofern ist das erfindungsgemäße konditionierte Medium für eine Reihe von pharmazeutischen Anwendungen nützlich.
Schließlich lassen sich die in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Zusammensetzungen für topische Aufträge zur Stimulierung des Haarwuchses formulieren.
3.1. DEFINITIONEN
Die hierin verwendeten Begriffe sollen die folgenden angegebenen Bedeutungen haben:
Haftende Schicht:
Zellen, die direkt an dem dreidimensionalen Träger haften oder indirekt über Haftung an Zellen mit diesen verbunden sind, die von sich aus direkt an dem Träger haften.
Konditioniertes Medium:
Eine Formulierung, die extrazellulares Protein/extrazellulare Proteine und Zellmetabolite enthält, die bereits das Wachstum irgendeines gewünschten eukaryotischen Zelltyps unterstützt haben, wobei diese Zellen entweder zweidimensional oder dreidimensional kultiviert worden sind. Ebenfalls gilt die Bezeichnung "konditioniertes Zellmedium" oder "konditioniertes Zell- und Gewebekulturmedium".
Stromazellen:
Fibroblasten mit oder ohne andere Zellen und/oder Elemente, die in losem Bindegewebe angetroffen werden und einschließlich in Endothelzellen, Perizyten, Makrophagen, Monozyten, Plasmazellen, Mastzellen, Adipozyten, Mesenchym-Stammzellen, Leberreservezellen, neurale Stammzellen, Pankreas-Stammzellen, Chondrozyten, Prechondrozyten, usw., ohne auf diese beschränkt zu sein.
Gewebespezifische oder Parenchym-Zellen:
Die Zellen, welche das entscheidende und charakteristische Gewebe eines Organs zum Unterschied von dessen Stützapparat bilden.
Dreidimensionaler Stützapparat:
Ein dreidimensionales Gerüst aus einem beliebigen Material und/oder Form, die (a) den Zellen ermöglicht, daran zu haften (oder modifiziert werden kann, um den Zellen die Haftung daran zu ermöglichen); und (b) den Zellen erlaubt, in mehr als nur einer Schicht zu wachsen. Dieser Träger wird mit Stromazellen beimpft, um das lebende dreidimensionale Stromagewebe zu bilden. Die Struktur des Stützapparats kann ein Netz, ein Schwamm einschließen oder kann aus einem Hydrogel geformt sein.
Dreidimensionales Stromagewebe oder lebendes Stromagewebe:
Ein dreidimensionaler Stützapparat, der mit Stromazellen beimpft wurde, die auf dem Träger aufgezogen wurden. Die sich von den Stromazellen ergebenden extrazellularen Matrixproteine werden auf dem Stützapparat abgeschieden und bilden auf diese Weise ein lebendes Stromagewebe. Das lebende Stromagewebe kann das Wachstum von gewebespezifischen Zellen unterstützen, die später geimpft wurden, um die dreidimensionale Zellkultur zu bilden.
Gewebespezifische dreidimensionale Zellkultur oder gewebespezifisches dreidimensionales Konstrukt:
Ein dreidimensionales lebendes Stromagewebe, das mit gewebespezifischen Zellen beimpft und kultiviert worden ist. Im Allgemeinen sollten in die gewebespezifischen Zellen, die zur Beimpfung der dreidimensionalen Stromamatrix verwendet werden, die "Stamm"zellen (oder ("Reserve"zellen) für dieses Gewebe mit einbezogen sein, d.h. solche Zellen, die Nervenzellen erzeugen, die in die spezialisierten Zellen wachsen, die das Parenchym für das Gewebe bilden. Diese Stammzellen werden nicht von einem menschlichen Embryo erhalten.
Die folgenden Abkürzungen sollen die angegebenen Bedeutungen haben:

BCS:: bovines Kälberserum
BFU-E:: burst-forming unit"-Erythroid
TFG-β:: von transformierten Zellen gebildeter Wachstumsfaktor β
CFU-C:: kolonniebildende Einheitskultur
CFU-GEMM:: koloniebildendes Einheitsgranuloid, Erythroid, Monozyt, Megakaryozyt
CSF:: kolonniestimulierender Faktor
DMEM:: Eagle-Medium nach Dulbecco
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
FBS:: fötales Rinderserum
FGF:: Fibroblast-Wachstumsfaktor
GAG:: Glykosaminoglykan
GM-CSF:: Granulozyt/Makrophagenkolonnie-stimulierender Faktor
HBSS:: gepufferte Kochsalzlösung nach Hank
HS:: Pferdeserum
IGF:: Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor
LTBMC:: langfristige Knochenmarkkultur
MEM:: Minimalmedium
PBL:: periphere Blutleukozyten
PBS:: phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PDGF:: von Blutplättchen derivierter Wachstumsfaktor
RPMI 1640:: Medium Nummer 1640 des Roswell Park Memorial Instituts (GIBCO, Inc., Grand Island, NY)
SEM:: Rasterelektronenmikroskop
VEGF:: Gefäßendothel-Wachstumsfaktor

4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Es zeigen:
1 eine graphische Darstellung der Kinetik der Abscheidung von Glykosaminoglykanen und Kollagen in Abhängigkeit von der Zeit, die durch die dreidimensionalen Gewebeprodukte Transcyte^TM und Dermagraft^® abgeschieden wurden. Das Abscheidungsvolumen der Glykosaminoglykane ist abhängig von der Wachstumsdauer, während die Abscheidung von Kollagen von der Wachstumsdauer nicht abhängig ist.
2 eine graphische Darstellung des Einflusses der extrazellulären Matrix (entfernt aus Transcyte^TM) und zugesetzt in Verdünnungen von 1:2, 1:5, 1:10 und 1:100, zu Monoschichtkulturen von Human-Fibroblasten und -Keratinozyten. Der ausgeprägteste Einfluss zeigt sich bei einer Verdünnung der Matrix von 1:10.
3 eine graphische Darstellung im Bezug auf die Proliferation von Human-Fibroblasten und -Keratinozyten, exponiert an konditioniertem Medium (Zellkulturmedium, das zuvor das Wachstum von Zellen in Transcyte^TM unterstützte). Eine Zunahme der Zellreaktion ergab sich bis herab zu drei Tagen.
4 eine graphische Darstellung des Einflusses von 1X-konditioniertem Medium (Zellkulturmedium, das zuvor das Wachstum von Zellen in Transcyte^TM unterstützte) auf die Kollagenabscheidung von Zellen, die in drei Dimensionen kultiviert wurden, und zwar im Vergleich zum basischen Medium DMEM (mit einem Gehalt von 10% BLS ergänztem Medium mit 2 mM L-Glutamin und 1X antibiotisch/antimykotisch) ergänzt mit einer 1X Endkonzentration von serumfreiem Medium und Medium. Eine statistisch signifikante (p = 0,05) Zunahme von fast 50% war in der Kollagenabscheidung von Kulturen festzustellen, die mit konditioniertem Medium für 10 Tage behandelt wurden, und zwar im Vergleich mit jeder Kontrolle.
5 eine graphische Darstellung der Antioxidans-Aktivität in konditioniertem Zellmedium (Zellkulturmedium, das zuvor das Wachstum von Zellen in Transcyte^TM unterstützte) auf epidermale Human-Keratinozyten in Kultur. Eine statistisch signifikante (p < 0,0003) Reduktion in der intrazellularen Oxidation von näherungsweise 50% war in Human-Keratinozyten festzustellen, die dem konditionierten Medium ausgesetzt waren, das zuvor für 3 Tage Transcyte^TM unterstützte.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von Zusammensetzungen, die irgendein definiertes oder undefiniertes konditioniertes Medium aufweisen, das unter Verwendung irgendwelcher eukaryotischer Zelltypen oder dreidimensionale Gewebekonstrukte kultiviert wurde, und betrifft Verfahren zur Anwendung der Zusammensetzungen. Die Zellen sind in drei Dimensionen kultiviert. Die Zellen sind bevorzugt zur Verringerung des Risikos einer Immunantwort humaner Herkunft und schließen Stromazellen ein, Parenchymzellen, Mesenchym-Stammzellen, Lebeneservezellen, neurale Stammzellen, Pankreas-Stammzellen und/oder nichthumane Embryo-Stammzellen. Medium, die durch Zellen und Gewebekulturen konditioniert sind, enthalten eine Vielzahl auf natürliche Weise abgeschiedener Proteine, wie beispielsweise biologisch wirksame Wachstumsfaktoren, wobei solche, die in drei Dimensionen kultiviert sind, diese Proteine in Anteilen haben werden, die sich physiologischen Konzentrationen nähern. Die Erfindung betrifft ebenfalls neuartige Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die Produkte aufweisen, welche von konditionierten Zellmedien deriviert sind, und betrifft Anwendungen für diese Zusammensetzungen.
Das "prekonditionierte" Zellkulturmedium kann jedes beliebige Zellkulturmedium sein, das den Nährstoffbedürfnissen der zu kultivierenden Zellen angemessen entspricht. Beispiele für Zellmedien schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham's F12, RPMI 1640, Iscove's, McCoy's und andere Medienformulierungen, die für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet leicht erkennbar sind, einschließlich solche, die entnommen werden können in "Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture"; Alan R. Liss, New York, (1984) und "Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures", John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England, 1996. Das Medium kann mit beliebigen Komponenten angereichert sein, die zur Unterstützung der gewünschten Zelle oder Gewebekultur benötigt werden. Zusätzliches Serum, wie beispielsweise Rinderserum, bei dem es sich um eine komplexe Lösung von Albuminen, Globulinen, Wachstumspromotoren und Wachstumsinhibitoren handelt, kann nach Bedarf zugesetzt werden. Das Serum sollte frei von Pathogenen sein und sorgfältig einem Screening auf Mykoplasma-bakterielle, fungale und virale Verunreinigung unterzogen werden. Außerdem sollte das Serum generell von den Vereinigten Staaten erhalten werden und nicht von anderen Ländern, in denen der einheimische Viehbestand übertragbare Mittel enthält. Eine Hormonzugabe zu dem Medium kann unter Umständen wünschenswert sein.
Andere Inhaltsstoffe, wie beispielsweise Vitamine, Wachstumsfaktoren, Haftungsfaktoren, Proteine, usw. lassen sich von dem Fachmann auf dem Gebiet entsprechend seinem oder ihrem speziellen Bedarf auswählen. In der vorliegenden Erfindung kann jeder beliebige Zelltyp verwendet werden, der angemessen ist, um das gewünschte konditionierte Medium zu erhalten. Zur Kultivierung des Mediums lassen sich gentechnisch bearbeitete Zellen verwenden. Diese Zellen können beispielsweise so modifiziert sein, dass sie ein gewünschtes Protein oder Proteine exprimieren, so dass die Konzentration des exprimierten Proteins oder der exprimierten Proteine in dem Medium für die spezielle gewünschte Anwendung optimal ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können die zur Konditionierung des Mediums verwendeten Zellen und Gewebekulturen so bearbeitet sein, dass sie ein Target-Genprodukt exprimieren, das eine große Vielzahl von Funktionen vermitteln kann, einschließlich die folgenden, ohne auf diese beschränkt zu sein: verbesserte Eigenschaften beim Exprimieren von Proteinen, die physiologischen Reaktionen ähneln, erhöhte Expression eines speziellen für eine spezielle Anwendung nützlichen Proteins, wie beispielsweise Wundheilung oder Hemmung bestimmter Proteine, wie beispielsweise Proteasen, Milchsäure, usw.
Die Zellen können so bearbeitet sein, dass sie ein Target-Genprodukt exprimieren, das biologisch aktiv ist und das eine ausgewählte biologische Funktion vermittelt, die als Reporter einer ausgewählten physiologischen Bedingung wirkt, womit eine defiziente oder defekte Expression eines Genproduktes verstärkt wird, oder das eine antivirale, antibakterielle, antimikrobielle oder antikanzerogene Aktivität vermittelt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Target-Genprodukt ein Peptid oder Protein sein, wie beispielsweise ein Enzym, Hormon, Cytokin, Antigen oder Antikörper, ein regulatorisches Protein, wie beispielsweise ein Transkriptionsfaktor, oder DNA-bindendes Protein, ein Strukturprotein, wie beispielsweise ein Zelloberflächenprotein, oder das Target-Genprodukt kann eine Nucleinsäure sein, wie beispielsweise ein Ribosom- oder Antisense-Molekül. In die Target-Genprodukte sind Genprodukte einbezogen, die das Zellwachstum verstärken, ohne auf diese beschränkt zu sein. Beispielsweise kann die genetische Modifikation ein endogenes Protein hochregeln, ein neues Protein einführen oder die Ionenkonzentration regulieren, indem ein heterologer Ionenkanal exprimiert wird, oder kann die endogene Ionenkanalfunktion verändern. Beispiele schließen verarbeitete Gewebe ein, die Genprodukte exprimieren, die systemisch zugeführt werden (z.B. abgeschiedene Genprodukte, wie beispielsweise Protein, einschließlich Wachstumsfaktoren, Hormone, Faktor VIII, Faktor IX, Neurotransmitter und Enkephaline), ohne auf diese beschränkt zu sein.
In der vorliegenden Erfindung werden die Zellen vorzugsweise auf einem dreidimensionalen Stromaträger aufgezogen und wachsen in Mehrfachschichten, die eine Zellularmatrix bilden. Dieses Matrixsystem nähert sich physiologischen Bedingungen, wie sie in vivo in einem größeren Maße angetroffen werden, als die bereits beschriebenen Systeme der Monoschichtgewebekultur. Dreidimensionale Kulturen, wie beispielsweise Dermagraft^® (Advanced Tissue Sciences, Inc., La Jolla, CA) "Dermagraft^®" und TransCyte^TM (Smith & Nephew, PLC, Großbritannien) "TransCyte^TM", erzeugen zahlreiche Wachstumsfaktoren und andere Proteine, die in das Medium mit physiologischen Anteilen und Konzentrationen abgeschieden werden. Dermagraft^® besteht aus allogenen neonatalen Fibroblasten, die auf biozersetzbarem Polylactin kultiviert werden. TransCyte^TM ist ein temporärer Ersatz für Lebend-Haut und weist ein dreidimensionales Stromagewebe auf, das an eine Übergangsabdeckung entsprechend der Beschreibung in der US-P-5 460 939 gebunden ist. Darüber hinaus können die dreidimensionalen Gewebekulturen, die das Zellmedium konditionieren, Mesenchym-Stammzellen enthalten, Leberreservezellen, neurale Stmmzellen, Pankreas-Stammzellen und/oder Embryo-Stammzellen und/oder Parenchymzellen und/oder Parenchym-Stammzellen, die in zahlreichen Gewebetypen angetroffen werden einschließlich Knochenmark, Haut, Leber, Pankreas, Niere, adrenales und neurologisches Gewebe sowie Gewebe des gastrointestinalen und urogenitalen Traktes und des Kreislaufsystems, ohne auf diese beschränkt zu sein. Siehe hierzu die US-P-4 721 096, 4 963 489, 5 032 508, 5 266 480, 5 160 490 und 5 559 022.
5.1. ZELLMEDIEN
Formulierungen von Zellkulturmedien sind in der Literatur gut bekannt und es sind viele kommerziell verfügbar.
Prekonditionierte Medienbestandteile schließen solche ein, wie sie nachfolgend beschrieben sind, ohne auf diese beschränkt zu sein. Darüber hinaus ist die Konzentration der Bestandteile in der Fachwelt gut bekannt. Siehe hierzu beispielsweise "Methods For Preparation Of Media, Supplements and Substrate for Serum-free Animal Cell Cultures, siehe oben". Die Bestandteile schließen ein: Aminosäuren (sowohl D-als auch L-Aminosäuren), wie beispielsweise Glutamin, Alanin, Arginin, Asparagin, Cystin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin sowie deren Derivate; säurelösliche Untergruppen, wie beispielsweise Thiamin, Ascorbinsäure, Eisen(III)-Verbindungen, Eisen(II)-Verbindungen, Purine, Glutathion- und einbasische Natriumphosphate.
Zusätzliche Inhaltsstoffe schließen ein: Zucker, Desoxyribose, Ribose, Nucleoside, wasserlösliche Vitamine, Riboflavin, Salze, Spurenmetalle, Lipide, Acetatsalze, Phosphatsalze, HEPES, Phenolrot, Pyruvatsalze und Puffersubstanzen.
Weitere Inhaltsstoffe, die oftmals in Medienformulierungen verwendet werden, schließen fettlösliche Vitamine ein (einschließlich A, D, E und K), Steroide und deren Derivate, Cholesterin, Fettsäuren und Lipide Tween 80, 2-Mercaptoethanolpyramidine, sowie eine Vielzahl von Ergänzungen, einschließlich Serum (fötales, Pferd-, Kalb-, usw.), Proteine (Insulin, Transferrin, Wachstumsfaktoren, Hormone, usw.), Antibiotika (Gentamicin, Penizillin, Streptomycin, Amphotericin B, usw.), Volleiultrafiltrat und Haftungsfaktoren (Fibronectine, Vitronectine, Kollagene, Laminine, Tenascine, usw.).
Selbstverständlich können die Medien unter Umständen mit Wachstumsfaktoren oder anderen Proteinen unterstützt sein, wie beispielsweise Haftungsfaktoren, da viele der Zellkonstrukte und speziell dreidimensionale Zell- und Gewebekulturkonstrukte, wie sie in der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben wurden, solche Wachstums- und Haftungsfaktoren hervorbringen sowie andere Produkte in die Medien, wie nachfolgend in Abschnitt 5.8. eingehender diskutiert wird.
5.2. DIE ZELLKULTUREN
5.2.1. DIE ZELLEN
Das Medium kann mit Hilfe von Stromazellen, Parenchymzellen, Mesenchym-Stammzellen (verzweigten, zweckgebundenen oder nichtzweckgebundenen Vorläuferzellen), Leberreservezellen, neurale Stammzellen, Pankreas-Stammzellen und/oder nichthumane Embryo-Stammzellen konditioniert werden. Die Zellen können einschließen, ohne auf diese beschränkt zu sein: Knochenmark, Haut, Leber, Pankreas, Niere, neurologisches Gewebe, Nebennierengewebe, mukosales Epithel und glatte Muskeln, um nur einige zu nennen. Die Fibroblasten und Fibroblast-ähnlichen Zellen und anderen Zellen und/oder Elemente, die das Stroma aufweisen, können vom Ursprung her fötal oder erwachsen sein und können deriviert sein von einfachen Quellen, wie beispielsweise Haut-, Leber-, Pankreas-, Mucosa-, Arterien-, Venen-, Nabelschnur- und Plazentageweben, usw. Diese Gewebe und/oder Organe lassen sich durch entsprechende Biopsie oder bei Autopsie erhalten. Um eine reichliche Versorgung von Stromazellen und Elementen zu schaffen, lassen sich effektiv Kadaverorgane verwenden. Nichthumane Embryo-Stammzellen und/oder andere Elemente, die das Stroma aufweisen, lassen sich unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden isolieren. Die Isolierung und Kultur von Mesenchym-Stammzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe hierzu Mackay et al., "Tissue Eng.", 4:415–428 (1988); William et al., "Am Surg.", 65:22–26 (1999). Die Beimpfung dieser Zellen wird in dem nachfolgenden Kapitel 5.3. beschrieben. In ähnlicher Weise lassen sich neurale Stammzellen in der Weise isolieren, wie sie in Flax et al., "Nature Biotechnol.", 16:1033–1039 (1998) und Frisen et al., "Cell. Mol. Life Sci.", 54:935–945 (1998), beschrieben wurden.
Die Zellen können in jeder beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Form kultiviert werden, einschließlich in Monoschichten, Kügelchen oder in drei Dimensionen sowie mit Hilfe beliebiger Mittel (z.B. Petrischale, Rollflasche, kontinuierliches Durchflusssystem, usw.). Methoden zum Kultivieren von Zellen und Gewebe sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und wurden beispielsweise beschrieben in "Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, siehe oben", Freshney (1987), "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, siehe nachfolgend".
Im Allgemeinen werden die genutzten Zelllinien einem sorgfältigen Screening auf humane oder veterinäre Pathogene unterzogen. In Abhängigkeit von der Anwendung kann ein solches Screening von entscheidender Bedeutung sein, wo ausschließlich pathogenfreie Zellen akzeptabel sind (z.B. bei der Wundheilung, bei Nahrungszusatzstoffen, usw.). Methoden zum Screening auf Pathogene sind in dein Fachgebiet gut bekannt. Der Zelltyp, ob zweidimensional oder dreidimensional kultiviert, wird die Eigenschaften des konditionierten Mediums beeinflussen. Bevorzugt ist ein dreidimensionales Konstrukt.
5.2.2. DREIDIMENSIONALE ZELLKULTUREN
Die in den dreidimensionalen Kulturen verwendeten Stromazellen weisen Fibroblasten auf, Mesenchym-Stammzellen, Lebeneservezellen, neurale Stammzellen, Pankreas-Stammzellen und/oder Embryo-Stammzellen mit oder ohne zusätzliche Zellen und/oder Elemente, wie sie hierin ausführlicher beschrieben werden.
Fibroblasten werden das Wachstum vieler unterschiedlicher Zellen und Geweben in dem dreidimensionalen Kultursystem unterstützen und können damit auf einer Matrix unter Erzeugung einer "generischen" Stroma-Stützmatrix zum Kultivieren einer beliebigen Vielzahl von Zellen und Geweben geimpft werden. Allerdings kann es in bestimmten Fällen vorzuziehen sein, eher eine "spezifische" als eine "generische" Stroma-Stützmatrix zu verwenden, wobei in einem solchen Fall die Stromazellen und Elemente von einem speziellen Gewebe, Organ oder Individuum erhalten werden können. Darüber hinaus lassen sich Fibroblasten und andere Stromazellen und/oder Elemente von dem gleichen Gewebetyp herleiten, der in dem dreidimensionalen System kultiviert werden soll. Dieses könnte dann von Vorteil sein, wenn Gewebe kultiviert werden, worin spezialisierte Stromazellen spezielle strukturbedingte/funktionelle Rollen spielen, z.B. glatte Muskelzellen von Arterien, Glialzellen von Nervengewebe, Kupffer-Zellen der Leber, usw.
Sobald die Stromazellen auf dem dreidimensionalen Träger geimpft sind, werden diese auf dem Stützapparat proliferieren und Bindegewebsproteine abscheiden, die auf natürlichem Weg von den Stromazellen abgeschieden werden, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, regulatorische Faktoren und extrazellulare Matrixproteine. Die Stromazellen und ihre natürlich abgeschiedenen Bindegewebsproteine umhüllen im Wesentlichen den Stützapparat und bilden auf diese Weise lebendes Stromagewebe, welches das Wachstum der gewebespezifischen Zellen stützt, die in das erfindungsgemäße dreidimensionale Kultursystem geimpft wurden. Tatsächlich erfährt das dreidimensionale Stromagewebe, wenn es mit den gewebespezifischen Zellen beimpft wurde, eine aktive Proliferation der Kultur über lange Zeitdauer. Was von Bedeutung ist, da Öffnungen in dem Netzwerk den Austritt von Stromazellen in die Kultur ermöglichen, konfluente Stromakulturen zeigen keine Kontakthemmung, so dass die Stromazellen fortfahren zu wachsen, sich zu teilen und funktionell aktiv bleiben.
Wachstums- und regulatorische Faktoren entwickeln sich durch das Stromagewebe in die Medien hinein. Wachstumsfaktoren (z.B. αFGF, βFGF, Insulin-Wachstumsfaktor oder TGF-Betas, ohne auf diese beschränkt zu sein) oder natürliche oder modifizierte Blutprodukte oder bioaktive biologische Moleküle (beispielsweise Hyaluronsäure oder Hormone, ohne auf diese beschränkt zu sein) verstärken die Koloniebildung des dreidimensionalen Stützapparates oder Gerüstes und konditionieren die Kulturmedien.
Der Umfang, in dem die Stromazellen vor der Verwendung der Kulturen in vivo wachsen, kann von dem Gewebetyp abhängen, der in der dreidimensionalen Gewebekultur kultiviert werden soll. Die Lebend-Stromagewebe, die das Medium konditionieren, lassen sich als korrigierende Strukturen verwenden, indem sie in vivo implantiert werden. Alternativ können die lebenden Stromagewebe mit anderem Zelltyp beimpft und in vivo implantiert werden. Die Stromazellen können genetisch bearbeitet werden, um die Menge der in das Kulturmedium abgeschiedenen Proteinprodukte einzustellen und die Konzentration des gewonnenen Produktes zu verbessern, das aus dem konditionierten Medium erhalten wird. Beispiele sind antiinflammatorische Faktoren, z.B. Anti-GM-CSF, Anti-TNF, Anti-IL-1, Anti-IL-2, usw. Alternativ können die Stromazellen genetisch zu einer "Knock-out"-Expression der nativen Genprodukte bearbeitet werden, die die Entzündung fördern. Z.B. GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2 oder "Knockout"-Expression von MHC, um das Risiko einer Abstoßung herabzusetzen.
Das Wachstum der Stromazellen in drei Dimensionen wird die aktive Proliferation sowohl der Stroma- als auch der gewebespezifischen Zellen in Kultur über eine sehr viel längere Zeitdauer unterstützen als Monoschichtsysteme. Darüber hinaus unterstützt das dreidimensionale System die Reifung, Differenzierung und Abscheidung von Zellen in Kultur in vitro unter Erzeugung von Komponenten erwachsener Gewebe, die zu den in vivo angetroffenen Gegenspielern analog sind und gewährleisten, dass die in das konditionierte Medium abgeschiedene Proteine den physiologischen Verhältnissen genauer ähneln.
Obgleich die Anmelder weder verpflichtet oder sonst veranlasst sind, den Mechanismus zu erläutern, mit dem die dreidimensionale Zelle und Gewebe wirken, können zu deren Erfolg eine Reihe von Faktoren beitragen, die dem dreidimensionalen Kultursystem innewohnen:

(a) der dreidimensionale Stütztapparat gewährt eine größere Oberfläche für die Proteinanhaftung und dementsprechend für die Haftung von Stromazellen, und
(b) aufgrund der Dreidimensionalität des Stützapparates wachsen Stromazellen aktiv im Gegensatz zu den Zellen in Monoschichtkulturen weiter, die zur Konfluens wachsen, eine Kontakthemmung zeigen und aufhören zu wachsen und sich zu teilen. Die Entwicklung des Wachstums und der regulatorischen Faktoren durch replizierende Stromazellen können zum Teil für die Stimulierung der Proliferation und der regulierenden Differenziation von Zellen in der Kultur verantwortlich sein;
(c) der dreidimensionale Stützapparat ermöglicht eine räumliche Verteilung der Zellularelemente, die in einem höheren Maß analog zu derjenigen ist, die in dem Gegenstück des Gewebes irr vivo angetroffen wird;
(d) die Erhöhung des potentiellen Volumens für das Zellwachstum in dem dreidimensionalen System kann die Herstellung lokalisierter Mikroumgebungen ermöglichen, die für die Zellreifung entscheidend ist;
(e) der dreidimensionale Stützapparat maximiert die Zell-Zell-Wechselwirkungen, indem ein größeres Bewegungspotential für die migratorischen Zellen gewährt wird, wie beispielsweise Makrophagen, Monozyten und möglicherweise Lymphozyten in der anhaftenden Schicht;
(f) es ist erkannt worden, dass die Erhaltung eines differenzierten zellularen Phänotyps nicht nur Wachstums-/Differenzierungsfaktoren erfordert sondern auch entsprechende zellulare Wechselwirkungen.

Die vorliegende Erfindung erzeugt wirksam diese Gewebe-Mikroumgebung, die zu einem überlegenen konditionierten Medium führt.
5.3. HERSTELLUNG VON DREIDIMENSIONALEM STROMAGEWEBE
Der dreidimensionale Träger oder Stützapparat kann aus jedem beliebigen Material und/oder in jeder beliebigen Form sein, die: (a) den Zellen die Anhaftung ermöglicht (oder modifiziert werden kann, um den Zellen die Anhaftung zu ermöglichen); und (b) den Zellen das Wachstum in mehr als nur einer Schicht erlaubt. Zur Erzeugung des Stützapparates kann eine Reihe unterschiedlicher Materialien verwendet werden, einschließlich die folgenden, ohne auf diese beschränkt zu sein: nichtbiozersetzbare Materialien, z.B. Nylon (Polyamide), Dacron (Polyester), Polystyrol, Polypropylen, Polyacrylate, Polyvinyl-Verbindungen (z.B. Polyvinylchlorid), Polycarbonat (PVC), Polytetrafluorethylen (PTFE; Teflon), Thermanox (TPX), Nitrocellulose, Baumwolle; sowie biozersetzbare Materialien, z.B. Polyglykolsäure (PGA), Kollagen, Kollagenschwämme, Catgut-Nahtmaterial, Cellulose, Gelatine, Dextran, Polyalkanoate, usw. Um einen dreidimensionalen Stützapparat zu erzeugen, kann jedes dieser Materialien gewebt, geflochten, gewirkt usw. zu einem Netz vorliegen. Der Stützapparat kann wiederum in jede beliebige Form gebracht werden, die für die korrigierende Struktur angestrebt wird, z.B. Schläuche, Seile, Filamente, usw. Bestimmte Materialien, wie beispielsweise Nylon, Polystyrol, usw. sind schlechte Substrate für die zelluläre Anhaftung. Bei Verwendung dieser Materialien als dreidimensionaler Stützapparat ist es ratsam, den Stützapparat vor der Beimpfung der Stromazellen vorzubehandeln, um die Anhaftung von Stromazellen an der Unterlage zu verstärken. Beispielsweise könnten vor der Beimpfung mit Stromazellen Nylon-Stützapparate mit 0,1 M Essigsäure behandelt und in Polylysin, FBS und/oder Kollagen inkubiert werden um das Nylon zu beschichten. In ähnlicher Weise sollte Polystyrol unter Verwendung von Schwefelsäure behandelt werden.
Wenn die Kulturen, die das Medium konditionieren, in vivo implantiert werden sollen, kann es zweckdienlich sein, biozersetzbare Matrices zu verwenden, wie beispielsweise Polyglykolsäure, Kollagen, Kollagenschwämme, gewebtes Kollagen, chirurgisches Catgut-Nahtmaterial, Gelatine, Polymilchsäure oder Polyglykolsäure und Copolymere davon als Beispiele. Wo die Kulturen über längere Zeitdauer gehalten werden sollen oder tiefgekühlt aufbewahrt werden sollen, können nichtzersetzbare Materialien bevorzugt sein, wie beispielsweise Nylon, Dacron, Polystyrol, Polyacrylate, Polyvinyle, Teflone, Baumwolle, usw. Ein einfaches Nylongeflecht, das gemäß der Erfindung verwendet werden könnte, ist Nitex, ein Nylon-Filtersieb mit einer mittleren Porenweite von 210 μm und einem mittleren Nylon-Faserdurchmesser von 90 μm (#3-210/36, Tetko, Inc., NY).
Auf den Stützapparat werden Stromazellen geimpft, die Fibroblasten aufweisen, Mesenchym-Stammzellen, Leberreservezellen, neurale Stammzellen, Pankreas-Stammzellen und/oder Embryo-Stammzellen mit oder ohne andere Zellen und Elemente, wie sie nachfolgend beschrieben werden. Auf den dreidimensionalen Träger können außerdem gemeinsam mit Fibroblasten auch Zellen geimpft werden, wie sie in losem Bindegewebe angetroffen werden. Diese Zellen schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: glatte Muskelzellen, Endothelzellen, Perizyten, Makrophagen, Monozyten, Plasmazellen, Mastzellen, Adipozyten, usw. Wie vorstehend ausgeführt wurde, können fötale Fibroblasten verwendet werden, um eine "generische" dreidimensionale Stromamatrix zu erzeugen, die das Wachstum einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen und/oder Gewebe unterstützt. Ein "spezifisches" Stromagewebe kann jedoch hergestellt werden, indem der dreidimensionale Stützapparat mit Fibroblasten beimpft wird, die vom gleichen Gewebetyp abgenommen sind wie dasjenige, das kultiviert werden soll, und/oder von einem speziellen Individuum, das später die Zellen und/oder Gewebe erhalten soll, die in dem erfindungsgemäßen dreidimensionalen System in Kultur genommen wurden.
So können in einer der Ausführungsformen der Erfindung Stromazellen, die für das spezielle Gewebe spezialisiert sind, kultiviert werden. Beispielsweise könnten Stromazellen von blutbildendem Gewebe und einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Makrophagen/Monozyten, Adipozyten und Retikulumzellen, ohne auf diese beschränkt zu sein, zur Erzeugung des dreidimensionalen, subkonfluenten Stroma für die langfristige Kultur von Knochenmark in vitro verwendet werden. Blutbildende Stromazellen lassen sich leicht aus der "Leukozytenmanschette" erhalten, die in Knochenmarksuspensionen durch Zentrifugieren bei geringen Kräften gebildet werden, z.B. 3.000 × g. In der Stromaschicht, die die Innenwand von Arterien auskleidet, kann ein hoher Anteil von undifferenzierten glatten Muskelzellen hinzugefügt werden, um dem Protein Elastizität zu vermitteln. Stromazellen der Leber lassen sich in Fibroblasten einbeziehen, Kupffer-Zellen und Gefäßzellen und Endothelzellen des Gallentraktes. In ähnlicher Weise könnten Glialzellen als das Stroma zur Unterstützung der Proliferation neurologischer Zellen und Gewebe verwendet werden, wobei Glialzellen für diese Aufgabe durch Trypsinisierung oder Kollagenaseabbau von embryonalem oder erwachsenem Hirn erhalten werden können (Ponten und Westermark, 1980, in Federof S. Hertz, L., Herausg., "Advances in Cellular Neurobiology", Bd. 1, New York, Academic Press, S. 209–227). Das Wachstum der Zellen in der dreidimensionalen Stromazellkultur könnte weiter verstärkt werden, indem dem Stützapparat hinzugefügt werden oder der Träger beschichtet wird mit Proteinen (z.B. Kollagenen, elastischen Fasern, Retikulumfasern), Glykoproteine, Glykosaminglykanen (z.B. Heparansulfat, Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Keratinsulfat, usw.), eine Zellularmatrix und/oder andere Materialien.
Darüber hinaus sind Mesenchym-Stammzellen (zweckgebunden oder nichtzweckgebunden verzweigte Vorläuferzellen) vorteilhafte "Stroma"-Zellen zur Beimpfung auf dem Stützapparat. Die Zellen können differenziert werden in Osteozyten, Fibroblasten der Sehnen und Bänder, Knochenmark-Stromazellen, Adipozyten und andere Zellen des Bindegewebes, Chondrozyten, was selbstverständlich von Endogenen oder unterstütztem Wachstum und regulatorischen Faktoren und anderen Faktoren abhängt, einschließlich Prostaglandin, Interleukine und natürlich auftretende Statine, die die Proliferation und/oder Differenzierung regulieren.
Fibroblasten lassen sich mühelos durch Zerlegen eines entsprechenden Organs oder Gewebes isolieren, die als Quelle für die Fibroblasten dienen sollen. Dieses kann mühelos unter Anwendung von Methoden erreicht werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise lässt sich das Gewebe oder das Organ mechanisch zerlegen und/oder mit Verdauungsenzymen und/oder Chelat bildenden Mitteln behandeln, die die Verbindungen zwischen benachbarten Zellen schwächen und ein Zerteilen des Gewebes zu einer Suspension von einzelnen Zellen ohne spürbares Aufreißen der Zelle ermöglichen. Ein enzymatischer Aufschluss kann durch Zerkleinern des Gewebes und Behandeln des zerkleinerten Gewebes mit einer beliebigen Zahl von aufschließenden Enzymen entweder allein oder in Kombination erreicht werden. Diese schließen Trypsin, Chymotrypsin, Kollagenase, Elastase und/oder Hyaluronidase, DNase, Pronase, Dispase, usw. ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die mechanische Zerteilung kann auch mit einer Reihe von Methoden erreicht werden, einschließlich die Verwendung von Mahlapparaten, Mischern, Sieben, Homogenisatoren, Druckzellen oder Insonatoren, ohne auf diese beschränkt zu sein und um nur einige wenige zu nennen. Eine Übersicht über die Methoden der Gewebezerkleinerung findet sich beispielsweise bei Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", 2. Ausg., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Kap. 9, S. 107–126.
Sobald das Gewebe zu einer Suspension von einzelnen Zellen zerkleinert worden ist, lässt sich die Suspension zu Subpopulationen fraktionieren, von denen die Fibroblasten und/oder anderen Stromazellen und/oder Elemente erhalten werden können. Dieses lässt sich auch unter Anwendung von Standardmethoden für die Zelltrennung erreichen, einschließlich die folgenden, ohne auf diese beschränkt zu sein: Klonieren und Selektion spezieller Zelltypen, selektive Zerstörung unerwünschter Zellen (negative Selektion), Trennung auf der Grundlage eines unterschiedlichen Agglutinationsvermögens in der gemischten Population, Gefrier/Tau-Prozedwen, unterschiedliche Haftungseigenschaften der Zellen in der gemischten Population, Filtration, konventionelle und Zonenzentrifugation, zentrifugierende Aufschlämmung (Gegenstromzentrifugation), Schwerkraftabscheidung, Gegenstromaufbereitung, Elektrophorese und fluoreszensaktiviertes Zellsortieren. Eine Übersicht über Methoden der klonalen Selektion und Zelltrennung findet sich bei Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques", 2. Ausg., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Kap. 11 und 12, S. 137–168.
Die Isolation von Fibroblasten lässt sich beispielsweise wie folgt ausführen: es werden frische Gewebeproben gründlich gewaschen und in einer gepufferten Salzlösung nach Hanks (HBSS) zur Entfernung von Serum zerkleinert. Das zerkleinerte Gewebe wird von 1 bis 12 Stunden in einer frisch angesetzten Lösung eines aufschließenden Enzyms inkubiert, wie beispielsweise Trypsin. Nach einer solchen Inkubation werden die dissoziierten Zellen suspendiert, durch Zentrifugieren pelletisiert und auf Petrischalen ausgestrichen. Alle Fibroblasten werden sich vor anderen Zellen anhaften, so dass entsprechende Stromazellen selektiv isoliert und kultiviert werden können. Die isolierten Fibroblasten können sodann bis zur Konfluens wachsen, werden von der konfluenten Kultur abgehoben und auf der dreidimensionalen Matrix geimpft (siehe hierzu Naughton et al., 1987, "J. Med.", 18(3 und 4), 219–250). Die Beimpfung des dreidimensionalen Stützapparates mit einer hohen Konzentration an Stromazellen, z.B. näherungsweise 10⁶ bis 5 × 10⁷ Zellen/ml, wird zur Herstellung des dreidimensionalen Stromagewebes in einer kürzeren Zeit führen.
Nach dem Beimpfen der Stromazellen sollte der dreidimensionale Stützapparat in einem entsprechenden Nährstoffmedium inkubiert werden. Wie bereits ausgeführt, sind zahlreiche Medien kommerziell verfügbar, wie beispielsweise RPMI 1640, Fisher's Iscove's, McCoy's und dergleichen, die zur Verwendung geeignet sein könnten. Um die proliferative Wirksamkeit zu maximieren, kommt es darauf an, dass die dreidimensionalen Stroma-Zellkulturen in dem Medium während der Inkubationsdauer suspendiert oder aufgeschlämmt sind. Die Kultur wird regelmäßig "zugeführt", wobei das erfindungsgemäße konditionierte Medium entsprechend der nachfolgenden Beschreibung in Kapiteln 5.6 und 5.7 gewonnen und verarbeitet wird. Auf diese Weise lassen sich in Abhängigkeit von dem zu kultivierenden Gewebe und den gewünschten Kollagentypen die entsprechende Stromazelle/entsprechenden Stromazellen selektieren, um die dreidimensionale Matrix zu beimpfen.
Im Verlaufe der Inkubation der dreidimensionalen Stroma-Zellkulturen können proliferierende Zellen von der Matrix freigesetzt werden. Diese freigesetzten Zellen können an den Wänden des Kulturgefäßes haften, wo sie weiter proliferieren und eine konfluente Monoschicht bilden. Dieses sollte beispielsweise dadurch verhindert oder auf ein Minimum herabgesetzt werden, dass man die freigesetzten Zellen während der Zuführung entfernt oder die dreidimensionale Stromakultur in ein neues Kulturgefäß bringt. Das Vorhandensein einer konfluenten Monoschicht in dem Gefäß wird das Wachstum der Zellen in der dreidimensionalen Matrix und/oder Kultur "abschalten". Die Entfernung der konfluenten Monoschicht oder die Übertragung der Kultur zu einem frischen Medium in einem neuen Gefäß werden die proliferative Wirksamkeit des dreidimensionalen Kultursystems wiederherstellen. Es sollte beachtet werden, dass die konditionierten Medien der Erfindung nach Erfordernis so bearbeitet werden, dass sie keinerlei ganze Zellen enthalten (sofern nicht selbstverständlich ganze Zellen für eine spezielle Anwendung gebraucht werden). Eine solche Entfernung oder Übertragung sollte in jedem Kulturgefäß erfolgen, das eine stromale Monoschicht hat, die eine Konfluens von 25% überschreitet. Alternativ ließe sich das Kultursystem bewegen, um zu verhindern, dass die freigesetzten Zellen anhaften, oder anstelle einer regelmäßigen Zuführung der Kulturen könnte das Kultursystem so angesetzt werden, dass kontinuierlich frische Medien durch das System strömen. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte sowohl darauf eingestellt sein, dass die Proliferation innerhalb der dreidimensionalen Kultur maximiert wird, als auch so, dass freigesetzte Zellen von der Kultur ausgewaschen und entfernt werden, so dass sie nicht an den Gefäßwänden haften und bis zur Konfluens wachsen.
Auf dem dreidimensionalen lebenden Stromagewebe können andere Zellen beimpft werden, wie beispielsweise Parenchymzellen.
5.4. IMPFUNG VON GEWEBESPEZIFISCHEN ZELLEN AUF DREIDIMENSIONALER STROMAMATRIX UND HALTUNG VON KULTUREN
Sobald die dreidimensionale Stroma-Zellkultur den entsprechenden Wachstumsgrad erreicht hat, können zusätzliche Zellen, wie beispielsweise gewebespezifische Zellen (Parenchymzellen) oder Oberflächenzellen, die kultiviert werden sollen, auf dem lebenden Stromagewebe geimpft werden. Die Zellen werden auf dem lebenden Stromagewebe in vitro unter Erzeugung eines kultivierten Pendans des nativen Gewebes aufgezogen und die Medien konditioniert, indem extrazelluläre Produkte in die Medien hinein in Mengen entwickelt werden, die den physiologischen Mengen ähneln. In hoher Konzentration an Zellen in dem Inokulum wird vorteilhaft sein, um in der Kultur sehr viel schneller eine erhöhte Proliferation zu ergeben, als dieses bei geringen Konzentrationen der Fall sein wird. Die für die Beimpfung ausgewählten Zellen hängen von dem zu kultivierenden Gewebe ab, worin die folgenden einbezogen sein können, ohne auf diese beschränkt zu sein: Knochenmark, Haut, Leber, Pankreas, Niere, neurologisches Gewebe, Nebenniere, Schleimhautepithel und glatte Muskeln, um nur einige wenige zu nennen. Diese Zellen werden charakteristische extrazelluläre Proteine, wie beispielsweise bestimmte Wachstumsfaktoren, in die Medien hinein entwickeln, woraus Medien resultieren, die im Bezug auf bestimmte gewebespezifische Anwendungen optimiert sind.
Beispielsweise und ohne Einschränkung kann eine Vielzahl von Epithelzellen auf dem dreidimensionalen lebenden Stromagewebe kultiviert werden. Beispiele für derartige Epithelzellen schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Keratinozyten, Mundschleimhaut und Zellen des gastrointestinalen (G.I) Traktes. Diese Epithelzellen lassen sich mit Hilfe einer enzymatischen Behandlung des Gewebes nach Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, isolieren, gefolgt von einer Expansion dieser Zellen in Kultur und Anwendung von Epithelzellen auf die dreidimensionale stromagestützte Zellmatrix. Das Vorhandensein des Stromaträgers liefert Wachstumsfaktoren und andere Proteine, die die normale Teilung und Differenzierung von Epithelzellen unterstützen.
Im Allgemeinen sollte dieses Inokulum die "Stammzellen" einschließen, die nicht von menschlichen Embryos erhalten wurden (auch bezeichnet als "Reservezelle") für dieses Gewebe, d.h. solche Zellen, die neue Zellen erzeugen und die zu spezialisierten Zellen reifen, die die verschiedenen Komponenten des Gewebes bilden.
Die Parenchymzellen oder anderen Zellen der Oberflächenschicht, die in dem Inokulum verwendet werden, lassen sich aus Zellsuspensionen erhalten, die durch Zerteilung des gewünschten Gewebes unter Anwendung der vorstehend in Kapitel 5.3 beschriebenen Standardmethoden zum Erlangen von Stromazellen hergestellt werden. Die gesamte Zellsuspension selbst kann zum Beimpfen des dreidimensionalen lebenden Stromagewebes verwendet werden. Als Ergebnis werden sich die regenerativen Zellen, die in dem Homogenat enthalten sind, vermehren, reifen und sich in geeigneter Weise auf der Matrix differenzieren, während das nicht der Fall ist bei nichtregenerativen Zellen. Alternativ lassen sich spezielle Zelltypen von entsprechenden Fraktionen der Zellsuspension unter Anwendung der vorstehend in Kapitel 5.1 beschriebenen Standardmethoden zum Fraktionieren von Stromazellen isolieren. Wo sich die "Stammzellen" oder "Reservezellen" mühelos isolieren lassen, können diese vorzugsweise zum Beimpfen des dreidimensionalen Stromaträgers verwendet werden. Beim Kultivieren von Knochemnark kann das dreidimensionale Stroma beispielsweise mit Knochenmarkzellen entweder frisch oder abgenommen von einer tiefgekühlt aufbewahrten Probe beimpft werden. Beim Kultivieren von Haut kann das dreidimensionale Stroma mit Melanozyten und Keratinozyten beimpft werden. Beim Kultivieren von Leber, kann das dreidimensionale Stroma mit Hepatozyten beimpft werden. Beim Kultivieren von Pankreas, kann das dreidimensionale Stroma mit endokrinen Pankreaszellen beimpft werden. Eine Übersicht über Methoden, die eingesetzt werden können, um Parenchymzellen von verschiedenen Geweben zu erhalten, findet sich bei Freshney, "Culture of Animal Cells", Handbuch für allgemeine Methoden, 2. Ausg., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Kap. 20, S. 257–288.
So können unterschiedliche Anteile der verschiedenen Typen von Kollagen, das auf der Stromamatrix vor der Beimpfung abgeschieden wird, das Wachstum der später beimpften gewebespezifischen Zellen beeinflussen. Beispielsweise sollte für ein optimales Wachstum von blutbildenden Zellen die Matrix vorzugsweise Kollagen Typen III, IV und I in einem ungefähren Verhältnis von 6:3:1 in der Anfangsmatrix enthalten. Bei den dreidimensionalen Haut-Kultursystemen werden die Kollagentypen I und III vorzugsweise in der Anfangsmatrix abgeschieden. Die Anteile der abgeschiedenen Kollagentypen können beeinflusst oder verstärkt werden, indem Fibroblasten ausgewählt werden, die den entsprechenden Kollagentyp entwickeln. Dieses kann unter Anwendung von monoklonalen Antikörpern eines geeigneten Isotyps oder Unterklasse erzielt werden, die in der Lage ist, das Komplement zu aktivieren und die spezielle Kollagentypen festlegt. Diese Antikörper sowie Komplement können zur negativen Auswahl der Fibroblasten verwendet werden, die den gewünschten Kollagentyp exprimieren. Alternativ können die Stromazellen, die zum Beimpfen der Matrix verwendet werden, eine Mischung von Zellen sein, die den entsprechenden angestrebten Kollagentyp synthetisch aufbauen. Die Verteilung und Herkunft der verschiedenen Kollagentypen sind in Tabelle I gezeigt.
Während der Inkubation sollte das dreidimensionale Zellkultursystem in dem Nährstoffmedium suspendiert oder aufgeschlämmt werden. Die Kulturen sollten regelmäßig mit frischen Medien versehen werden. Wiederum ist dafür Sorge zu tragen, dass eine Freisetzung von Zellen aus der Kultur von dem Anhaften an den Wänden des Gefäßes verhindert wird, wo sie sich weiterentwickeln könnten und eine konfluente Monoschicht bilden können. Die Freisetzung von Zellen aus der dreidimensionalen Kultur scheint leichter zu erfolgen, wenn ungeordnete Gewebe anstatt strukturierte Gewebe kultiviert werden. Beispielsweise ist die dreidimensionale Hautkultur gemäß der Erfindung histologisch und morphologisch normal und die unterscheidbaren dermalen und epidermalen Schichten setzen in die umgebenden Medien keine Zellen frei. Im Gegensatz dazu setzen dreidimensionale Knochenmarkkulturen gemäß der Erfindung voll entwickelte nichthaftende Zellen in das Medium in fast genau der gleichen Weise frei wie Zellen, die in vivo im Mark freigesetzt werden. Wie bereits ausgeführt, wird, sofern die freigesetzten Zellen an dem Kulturgefäß haften und eine konfluente Monoschicht bilden, die Proliferation der dreidimensionalen Kultur "abgeschaltet". Dieses kann durch Entfernung der freigesetzten Zellen während der Zuführung, während der Übertragung der dreidimensionalen Kultur in ein neues Gefäß, durch Bewegung der Kultur zur Verhinderung des Anhaftens freigesetzter Zellen an der Gefäßwand vermieden werden oder durch kontinuierliche Strömung von frischen Medien mit einer ausreichenden Geschwindigkeit, um die Nährstoffe in der Kultur aufzufrischen und freigesetzte Zellen zu entfernen. Wie bereits ausgeführt, werden die konditionierten Medien nach Erfordernis bearbeitet, so dass sie frei sind von ganzen Zellen und Zellbruchstücken.
Das Wachstum und die Aktivität der Zellen können in Kultur über eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren beeinflusst werden, wie beispielsweise Insulin, Wachstumshormon, Somatomedine, kolonniestimulierende Faktoren, Erythropoietin, epidermaler Wachstumsfaktor, hepatischer erythropoietischer Faktor (Hepatopoietin) und Leberzellwachstumsfaktor. Andere Faktoren, die die Proliferation und/oder Differenzierung regulieren, schließen Prostaglandine ein, Interleukine und natürlich auftretende Statine.
5.5. GENETISCH BEARBEITETE KONSTRUKTE
In einer anderen Ausführungsform können die dreidimensionalen Konstrukte, die die Medien konditionieren, als Vehikel zur Einführung von Genprodukten in die Medien fungieren, die die Reparatur und/oder Erneuerung von Gewebedefekten beispielsweise reparieren. Die Zellen lassen sich genetisch so bearbeiten, dass sie beispielsweise inflammatorische Mediatoren exprimieren, wie beispielsweise IL-6, IL-8 und G-CSF. Die Zellen könnten auch oder alternativ genetisch so bearbeitet werden, dass sie antiinflammatorische Faktoren exprimieren, z.B. Anti-GM-CSF, Anti-TNF, Anti-IL-1, Anti-IL-2, usw.
In einer anderen Ausführungsform können die Zellen genetisch so bearbeitet werden, dass sie ein Gen in die Medien hinein exprimieren, das eine therapeutische Wirkung ausüben könnte, z.B. in der Erzeugung von TGF-β zur Stimulierung der Knorpelgewebeerzeugung, oder andere Faktoren, wie beispielsweise BMP-13 zur Förderung der Chondrogenese, oder stimulatorische Faktoren, die die Migration von Stromazellen und/oder eine Matrixabscheidung unterstützen. Da die Konstrukte eukaryotische Zellen aufweisen, wird das Genprodukt entsprechend exprimiert und zur Erzeugung eines aktiven Produktes bearbeitet. Vorzugsweise werden Kontrollelemente der Exprimierung verwendet, um die regulierte Expression des Gens zu ermöglichen, so dass das Produkt in der Kultur "übersynthetisiert" wird. Der gewählte Transkriptionspromotor allgemein und Promotorelemente speziell hängen zum Teil von dem Typ des Gewebes und der Zellen ab, die kultiviert werden. Zellengewebe, die zur Abscheidung von Proteinen in der Lage sind, sind bevorzugt (z.B. solche mit übermäßig rauhem Endoplasmaretikulum und Golgi- Komplexorganellen). Das überproduzierte Genprodukt wird sodann durch die bearbeitete Zelle in die konditionierten Medien hinein abgeschieden.
Die zur Konditionierung der Medien verwendeten Zellen können genetisch so bearbeitet werden, dass sie eine oder mehrere Gene regulieren, oder die Regulierung der Genexpression kann kurzzeitig oder langfristig sein, oder die Genaktivität kann induzierbar sein oder nichtinduzierbar sein.
Die Zellen, die die Medien konditionieren, können außerdem genetisch zu einer "Knock-out"-Expression von Faktoren bearbeitet werden, die eine Entzündung fördern. Nachfolgend werden negative modulatorische Methoden zur Verringerung der Targetgen-Expressionsgrößen oder der Aktivität des Targetgenproduktes diskutiert. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "negative Modulation" auf eine Reduktion der Größe und/oder Aktivität des Targetgenproduktes in Bezug auf die Größe und/oder Aktivität des Targetgenproduktes unter Abwesenheit der modulatorischen Behandlung. Die Expression eines für eine Zelle nativen Gens kann unter Anwendung einer Reihe von Methoden verringert werden oder zum "Knock-out" gebracht werden wie beispielsweise die Expression durch vollständiges Passivieren des Gens (üblicherweise bezeichnet als "Knock-out") inhibiert werden kann, indem Standardmethoden der homologen Rekombination angewendet werden. In der Regel wird ein Exon, das einen wichtigen Bereich des Proteins kodiert (oder ein Exon 5' für diesen Bereich) durch einen positiv wählbaren Marker (z.B. "neo") unterbrochen, womit die Erzeugung einer normalen mRNA aus dem Targetgen verhindert wird und eine Inaktivierung des Gens das Ergebnis ist. Ein Gen kann auch durch eine Deletion oder inaktivierenden Insertion in einen Teil eines Gens inaktiviert werden oder durch eine Deletion des gesamten Gens. Unter Verwendung eines Konstruktes mit zwei Bereichen, die zu dem Targetgen homolog sind, das von dem Genom weit entfernt ist, können die Sequenzen, die in die zwei Bereiche eingreifen, deletiert werden. Siehe hierzu Mombaerts et al., 1991, "Proc. Nat. Acad. Sci", USA, 88:3084–3087. Alternativ kann ein Gen auch durch Deletion von vorgeschalteten oder nachgeschalteten Expressionselementen inaktiviert werden.
Antisense- und Ribozym-Moleküle, die die Expression des Targetgens hemmen, können im Sinne der Erfindung ebenfalls zur Verringerung der Stärke der Targetgenaktivität verwendet werden. Beispielsweise haben sich im Hinblick auf Immunantworten Antisense-RNA-Moleküle als besonders vielseitig erwiesen, die die Expression größerer Histokompatibilitätsgenkomplexe (HLA) hemmen. Darüber hinaus lassen sich geeignete Ribozymn-Moleküle konzipieren, wie beispielsweise beschrieben wurde von: Haseloff et al., 1988, "Nature", 334:585–591; Zaug et al., 1984, "Science", 224:574–578 und Zaug und Cech, 1986, "Science", 231:470–475. Darüber hinaus lassen sich Triplehelix-Moleküle zur Verringerung der Größe der Targetgenaktivität einsetzen. Diese Methoden wurden detailliert beschrieben von L. G. Davis et al., Herausg., "Basic Methods in Molecular Biology", 2. Ausg., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. 1994.
Methoden, die für die genetische Bearbeitung der erfindungsgemäßen Zellen nützlich sein könnten, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und detaillierter in den Gemeinschaftspatenten US-P-4 963 489 und 5 785 964 beschrieben. Beispielsweise lässt sich ein rekombinantes DNA-Konstrukt oder -Vektor, die eine exogene Nucleinsäure enthalten, z.B. die ein Genprodukt von Interesse kodiert, aufbauen und zur Umwandlung oder Transfektion der erfindungsgemäßen Stromazellen verwenden. Derartige transformierte und transfizierte Zellen, die exogene Nucleinsäure führen und die zur Expression dieser Nucleinsäure in der Lage sind, werden ausgewählt und in den erfindungsgemäßen dreidimensionalen Konstrukten durch Klonen weiter entwickelt.
Methoden zum Herstellen von DNA-Konstrukten, die das Gen von Interesse enthalten, um Zellen zu transformieren oder transfektieren und um Zellen zu selektieren, die das Gen führen und exprimieren, das von Interesse ist, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe hierzu beispielsweise die Methoden, die beschrieben wurden in Maniatis et al., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, "Current Protocols in Molecular Biology," Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY und Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausg., Cold Sprin Harbor Laboratory Press, Cold Sprin Harbor, NY.
Die Zellen können unter Verwendung einer Vielzahl von Vektoren bearbeitet werden, einschließlich die folgenden, ohne auf diese beschränkt zu sein: Integrieren viraler Vektoren, z.B. Retrovirus-Vektor oder Adeno-assoziierte virale Vektoren, oder nichtintegrierende replizierende Vektoren, z.B. Papilloma-Virusvektoren, SV40-Vektoren, adenovirale Vektoren oder replikationsdefektive virale Vektoren. Sofern man eine kurzzeitige Expression wünscht, können nichtintegrierende Vektoren und replikationsdefektive Vektoren bevorzugt sein, da entweder induzierbare oder konstitutive Promotoren in diesen Systemen verwendet werden können, um die Expression des Gens zu kontrollieren, das von Interesse ist. Alternativ können integrierende Vektoren verwendet werden, um eine kurzzeitige Expression unter der Voraussetzung verwendet werden, dass das Gen, das von Interesse ist, über einen induzierbaren Promotor kontrolliert wird. Andere Methoden zum Einführen von DNA in Zellen schließen die Verwendung von Liposomen ein, Lipofektion, Elektroporation, eine Partikelkanone oder durch direkte DNA-Injektion.
Die Zellen werden vorzugsweise mit einer Nucleinsäure transformiert oder transfiziert, z.B. DNA, beispielsweise kontrolliert durch, d.h. in operativem Zusammenhang mit einem oder mehreren geeigneten Kontrollelementen der Expression, wie beispielsweise einem Promotor oder Verstärkersequenzen, Transkriptionsabschlusseinheiten, Polyadenylierungsstellen u.A. und einem selektierbaren Marker. Nach der Einführung der Fremd-DNA ist eine Bearbeitung der Zellen möglich, um in angereicherten Medien zu wachsen, wonach auf selektive Medien umgeschaltet wird. Der selektierbare Marker in der Fremd-DNA vermittelt Widerstandsfähigkeit gegenüber der Selektion und ermöglicht den Zellen die Fremd-DNA beispielsweise auf einem Plasmid in ihre Chromosomen stabil zu integrieren und unter Erzeugung von Foci zu wachsen und kann wiederum geklont werden und in Zelllinien hinein expandiert werden. Diese Methode lässt sich vorteilhaft anwenden, um Zelllinien zu bearbeiten, die das Genprodukt in die Medien hinein exprimieren.
Es kann jeder beliebige Promotor verwendet werden, um die Expression des insertierten Gens anzutreiben. Beispielsweise schließen virale Promotoren den CMV-Promotor/Enhancer ein, SV40, Papillomavirus, Epstein-Barr-Virus, Elastin-Genpromotor und β-Globin, ohne auf diese beschränkt zu sein. Vorzugsweise sollten die zur Kontrolle der Expression des Gens, das von Interesse ist, verwendeten Kontrollelemente die regulierte Expression des Gens ermöglichen, so dass das Produkt lediglich dann synthetisiert wird, wenn in vivo ein Bedarf dafür besteht. Sofern eine transiente Expression angestrebt wird, werden vorzugsweise konstitutive Promotoren in einem nichtintegrierenden und/oder einem replikationsdefekten Vektor verwendet. Alternativ ließen sich induzierbare Promotoren verwenden, um die Expression des insertierten Gens anzutreiben, wenn dieses erforderlich ist. Induzierbare Promotoren lassen sich in integrierende und/oder replizierende Vektoren einbauen. Beispielsweise schließen induzierbare Promotoren Metallothionein und Wärmeschockprotein ein, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Nach einer der Ausführungsformen sind induzierbare Promotoren, die zum Exprimieren exogener Gene, die von Interesse sind, verwendet werden, solche, die die nativen Promotoren solche regulatorischen Proteine sind, wie sie hierin offenbart wurden, die als Resultat einer Gefrierkonservierung und nachfolgendem Auftauen induziert werden. Beispielsweise kann der Promotor von TGF-β, VEGF oder von verschiedenen bekannten Wärmeschockproteinen als das Expressionskontrollelement verwendet werden, d.h. kann operativ mit einem exogenen Gen, das von Interesse ist, verknüpft werden, um ein gewünschtes Genprodukt in den Gewebekonstrukten, die die Zellmedien konditionieren, zu exprimieren.
Um die konstitutive oder transiente Expression von Genprodukten, die in Zellen eingearbeitet werden, zu erhalten, lässt sich eine Vielzahl von Methoden anwenden. Beispielsweise lässt sich die von Seldon et al., 1987, "Science", 236:714–718, beschriebene transkaryotische Implantationstechnik verwenden. "Transkaryotisch", wie es hierin verwendet wird, besagt, dass die Kerne der implantierten Zellen durch Hinzufügung von DNA-Sequenzen mit Hilfe der stabilen oder transienten Transfektion verändert worden sind. Bevorzugt werden die Zellen so bearbeitet, dass sie derartige Genprodukte transient und/oder unter induzierbarer Kontrolle während der postoperativen Erholungsperiode exprimiert werden oder als ein chimäres Fusionsprotein, das mit den Stromazellen verankert ist, beispielsweise als ein chimäres Molekül, das sich aus einer intrazellulären und/oder Transmembran-Domäne eines Rezeptors oder Rezeptor-ähnlichen Moleküls zusammensetzt, das mit dem Genprodukt als extrazelluläre Domäne verschmolzen ist.
Darüber hinaus kann es wünschenswert sein, ein Konstrukt herzustellen, das über eine extrazelluläre Matrix verfügt, die ein Fremdgenprodukt enthält, Wachstumsfaktor, regulatorischen Faktor usw., die dann in den konditionierten Medien angetroffen wird. Diese Ausführungsform basiert auf der Entdeckung, dass während des Wachstums von Human-Stromazellen auf einem dreidimensionalen Träger oder Stützapparat die Zellen auf dem Stützapparat eine extrazelluläre Humanmatrix synthetisieren oder abscheiden, wie sie in normalem Humangewebe erzeugt wird. Die extrazelluläre Matrix wird lokal durch Zellen abgeschieden und verbindet nicht nur Zellen und Gewebe, sondern beeinflusst auch die Entwicklung und das Verhalten der Zellen, die sie berühren. Die extrazelluläre Matrix enthält verschiedene Bindegewebsproteine, z.B. faserbildende Proteine, die in einem wasserhaltigen Gel verflochten sind, das sich aus einem Netzwerk von Glykosaminoglykan-Ketten aufbaut. Die Glykosaminoglykane sind heterogene Gruppen aus langen, negativ geladenen Polysaccharidketten, die (mit Ausnahme der Hyaluronsäure) kovalent mit dem Protein unter Erzeugung von Proteoglykan-Molekülen gebunden sind. Nach dieser Ausführungsform der Erfindung können Stromazellen genetisch so bearbeitet werden, dass sie ein gewünschtes Genprodukt exprimieren oder Formen eines Genproduktes verändern, die in der extrazellulären Matrix und schließlich in dem Zellmedium vorhanden sein werden.
5.6. GEWINNUNG DER KONDITIONIERTEN MEDIEN
Diese Zellen können mit Hilfe jeder beliebigen, auf dem Fachgebiet bekannten Methode kultiviert werden. Vorzugsweise werden die Zellen in einer Umgebung kultiviert, die eine aseptische Bearbeitung und Handhabung ermöglicht. Konventionelle Methoden der Zell- und Gewebekultur waren in Folge der notwendigen Überwachung durch den Menschen und der Kontrolle der Medien beschränkt. Dieses begrenzt die Menge an Zellen und Gewebe, die mit nur einem Mal kultiviert werden können, und dementsprechend das Volumen der konditionierten Zellmedien, die mit nur einem einzigen Mal erhalten werden können. Aus diesem Grund werden die Medien vorzugsweise in einer solchen Weise konditioniert, dass ein Wachstum im großen Maßstab unter Verwendung beispielsweise eines Apparates für das aseptische Kultivieren im großen Umfange möglich ist (womit im großen Maßstab konditionierte Medien erhalten werden), wie er in dem Gemeinschaftspatent der US-P-5 763 267 (in dem '267-Patent) beschrieben wurde. Unter Verwendung des in dem '267-Patent beschriebenen aseptisch abgeschlossenen System werden vorkonditionierte Kulturmedien aus einem Flüssigkeitsbehälter in einen Einlassverteiler transportiert und gleichmäßig zu den Kulturen in einem kontinuierlichen Durchflusssystem verteilt, so dass dieser zum Kultivieren dreidimensionaler Zellen und Gewebekulturen, wie beispielsweise Dermagraft^®, anwendbar ist. Insbesondere schließt der in dem '267-Patent beschriebene Apparat eine Vielzahl von flexiblen oder halbflexiblen Behandlungskammern ein, die eine oder mehrere einzelne Kulturtaschen aufweisen, eine Vielzahl von starren Abstandshaltern und Flüssigkeits-Einlassverteilern, einen Flüssigkeits-Auslassverteiler, einen Flüssigkeitsbehälter und ein Mittel zum Transportieren von Flüssigkeit im Inneren des Systems.
Bei der Behandlung wird das flüssige Medium von dem Flüssigkeitsbehälter zu dem Einlassverteiler transportiert, der die Medien wiederum gleichmäßig zu den jeweils angeschlossenen Behandlungskammern und den inneren Kulturtaschen verteilt. Außerdem ist ein Auslass-Flüssigkeitsverteiler vorgesehen, um zu gewährleisten, dass jede Behandlungskammer gleichmäßig gefüllt ist, und um zu gewährleisten, dass etwaige, während der Behandlung gebildete Luftbläschen aus den Behandlungskammern entfernt werden. Die Behandlungskammern sind flexibel oder halbflexibel, um so eine leichte Handhabung für den Endanwender während des Spülens und der Anwendung der kultivierten Transplantate zu gewähren. Durch die Flexibilität der Behandlungskammern werden auch starre Abstandshalter vorgesehen, um eine gleichmäßige Flüssigkeitsverteilung im Inneren der Kammern während der Behandlung zu gewährleisten. Sofern erforderlich (d.h. sobald das Medium so konditioniert ist, dass extrazelluläre Proteine, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, die gewünschten Mengen in dem Medium erreicht haben), wird das "Konditionsmedium" aus dem System herausgepumpt und zur Verwendung weiter bearbeitet. Vorzugsweise wird das konditionierte Zellmedium aus dem Apparat in den letzteren Wachstumsstufen des Gewebes geerntet, wenn die Menge bestimmter Wachstumsfaktoren und die Abscheidung von Bindegewebsprotein ihren höchsten Stand erreicht haben (siehe 1). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das mit Hilfe der dreidimensionalen Zellkultur konditionierte Medium nach der Exponierung des Mediums an den Zellen an den Tagen 10 bis 14 des Kultivierens gesammelt.
In einer anderen Ausführungsform wird das dreidimensionale Gewebe in einem Apparat zum aseptischen Wachstum dreidimensionaler Gewebekulturen entsprechend der Beschreibung in der US-P-5 843 766 (das '766-Patent) kultiviert. Das '766-Patent offenbart eine Gewebekulturkammer, wonach die Kammer ein Gehäuse ist, das dem Wachstum des dreidimensionalen Gewebes dient, das wachsen kann, in tiefgefrorener Form konserviert wird und zum Endanwender in dem gleichen aseptischen Behälter versandt wird. In die Gewebekulturkammer ist ein Gehäuse einbezogen, das ein Substrat im Inneren des Gehäuses aufweist, das zur Erleichterung des Wachstums des dreidimensionalen Gewebes auf der Oberfläche des Substrats konzipiert ist. Das Gehäuse schließt eine Einlassöffnung und eine Auslassöffnung ein, die für den Zulauf und Auslauf des Mediums dienen. In das Gehäuse ist mindestens ein Strömungsverteiler einbezogen. In einer der Ausführungsformen ist der Strömungsverteiler ein Prallblech, das zur Verteilung der Strömung des Mediums im Inneren der Kammer verwendet wird, um eine kontinuierliche, gleichförmige Form des dreidimensionalen Gewebes zu schaffen. In einer zweiten Ausführungsform ist der Strömungsverteiler eine Kombination von Ableitplatten, Verteilerkanälen und Durchflusskanal. In jeder Ausführungsform enthält das Gehäuse ferner einen abdichtenden Verschluss, um im Inneren der Kammer während des Gewebewachstums und der Aufbewahrung eine aseptische Umgebung zu gewährleisten. Wiederum wird das Medium vorzugsweise von dem Apparat in den letzteren Wachstumsstufen des Gewebes geerntet, wenn die Menge an Wachstumsfaktoren und Abscheidung von Bindegewebsprotein den höchsten Stand haben (siehe 1). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das mit Hilfe der dreidimensionalen Zellkultur konditionierte Medium nach Exponierung des Mediums an den Zellen an den Tagen 10 bis 14 des Kultivierens gesammelt.
5.7. KONZENTRATION DES KONDITIONIERTEN MEDIUMS
Nach der Entnahme des Zell-konditionierten Mediums kann es notwendig werden, den resultierenden Überstand weiter zu bearbeiten. Eine derartige Verarbeitung kann ein Konzentrieren mit Hilfe einer Wasserdurchfluss-Filtrationsvorrichtung einschließen oder mit Hilfe einer Defiltration unter Anwendung von Methoden, die in "Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures", siehe oben, S. 29, D:0,1–29D:0,4, beschrieben wurden.
Darüber hinaus lässt sich das Medium unter Anwendung einer Überdruck-Konzentrationsvorrichtung mit einem Filter mit einer Rückhaltung von 10.000 ml (Amicon, Beverly, MA) um das 10- bis 20-fache aufkonzentriert werden.
Außerdem lässt sich das konditionierte Medium beispielsweise zur Produktisolierung und Reinigung zur Entfernung unerwünschter Proteasen weiter bearbeiten. Die Methoden die zur Produktisolierung und Reinigung angewendet werden, so dass eine optimale biologische Wirksamkeit aufrecht erhalten wird, sind für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet leicht offensichtlich. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, einen Wachstumsfaktor, regulatorischen Faktor, ein Peptidhormon, Antikörper, usw. zu reinigen. Diese Methoden schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Gelchromatographie (unter Verwendung von Matrices, wie beispielsweise Sephadex), Ionenaustausch, Metallchelat-Affinitätschromatographie mit einer unlöslichen Matrix, wie beispielsweise vernetzte Agarose, HPLC-Reinigung und Hydrophobchromatographie der konditionierten Medien. Diese Methoden wurden detaillierter beschrieben in "Cell & Tissue Culture; Laboratory Procedures", siehe oben. Selbstverständlich müssen in Abhängigkeit von der gewünschten Anwendung des konditionierten Mediums und/oder der davon derivierten Produkte geeignete Maßnahmen ergriffen werden, um eine Sterilität aufrecht zu erhalten. Andererseits kann eine Sterilisation erforderlich sein und mit Hilfe von Methoden ausgeführt werden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt sind, wie beispielsweise Wärme- und/oder Filtersterilisation, indem dafür Sorge getragen wird, dass die gewünschte biologische Wirksamkeit bewahrt wird.
5.7.1. ISOLIERUNG VON KOLLAGEN
Wie bereits ausgeführt, enthält das konditionierte Medium der Erfindung zahlreiche Produkte, die daraus isoliert und gereinigt werden können. Beispielsweise sind in die dreidimensionale extrazelluläre Matrix dermale Humanfibroblasten enthalten, die Kollagenpräkursoren und einen Anteil dieser Präkursoren synthetisieren und abscheiden. Dieser Einbau erfordert die Entfernung terminaler Peptide (N- und C-Peptide), die die Löslichkeit der Kollagen-Moleküle deutlich herabsetzen (der Rest des abgeschiedenen Kollagens bleibt in Folge einer fehlenden Proteolyse in Lösung). Im Allgemeinen kann lösliches Kollagen unter neutralen pH-Bedingungen bei hohen Salzkonzentrationen erhalten werden. Siehe hierzu Kielty, C. M., I. Hopkinson, et al. (1993), "Kollagen: The Collagen Family: Structure, Assembly and Organization in the Extracellular Matrix, Connective Tissue and Its Heritable Disorders: molecular, genetic and medical aspects", P. M. Royce und B. Steinmann, New York, Wiley-Liss, Inc.: 103–149). Die Anmelder der vorliegenden Erfindung stellen Daten bereit, welche den Einfluss des konditionierten Mediums (Medium, das zuvor das Wachstum von in drei Dimensionen kultivierten Zellen unterstützt hat) auf die Herstellung und Zusammensetzung von dreidimensionalen Geweben anhand der Messung der Kollagenmenge, die in die extrazellulare Matrix von Geweben abgeschieden wird, die in Gegenwart von serumfreiem Medium, Medium oder dreidimensional konditioniertem Medium kultiviert wurden (siehe Abschnitt 6.3). Das erfindungsgemäße konditionierte Medium erhöht deutlich die Kollagenabscheidung des Gewebes in vitro, wie in 4 gezeigt wird.
Darüber hinaus haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung überraschend entdeckt, dass Kollagen nicht in einer linearen Form abgelegt wird, sondern mit erhöhten Mengen während des Prozesses des Kultivierens abgeschieden wird (siehe 1). Dementsprechend haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung diese Entdeckung beim Ernten des Kollagens angewendet.
Es gilt als selbstverständlich, dass das folgende Protokoll als Beispiel präsentiert wird und unter Anwendung von Methoden modifiziert werden kann, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Zur Reinigung des Kollagens werden 240 ml mit Fibroblasten konditioniertes Medium zu 240 ml 5 M NaCl (Verhältnis von Medium zu Salz 1:1) gegeben und für 16 Stunden bei 4°C ausgefällt. Die Suspension wird für näherungsweise 20 min bei 4.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Die Pellets werden mit 10 ml einer Lösung aus 50 mMol Tris-HCl (pH 7,5) und 2,4M NaCl gewaschen. Es wird für 20 min bei 4.000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Pellets werden erneut in 10 ml 0,5M Essigsäure suspendiert. Zur Entfernung der Propeptide wird 1 ml Pepsin (100 mg/ml) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) zugesetzt und für 16 Stunden bei 4°C digeriert (damit werden die Peptide entfernt, die Triplehelix jedoch intakt lassen). Die Suspension wird für 20 min bei 4.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen und die Pellets verworfen. Sodann werden 2,1 ml 5M NaCl und 0,5M Essigsäure bis zu einem Endvolumen von 15 ml aufgefüllt (Endkonzentration des NaCl 0,7M). Es wird für näherungsweise 16 Stunden bei 4°C ausgefällt. die Suspension wird für 20 min bei 4.000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wird in 0,5 ml 0,5M Essigsäurelösung aufgelöst. Die Reinheit des Kollagens sollte mindestens 90% betragen und kann mit Hilfe von Standardmethoden analysiert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie beispielsweise SDS-PAGE.
5.8. ANWENDUNGEN UNTER NUTZUNG DER KONDITIONIERTEN MEDIEN
5.8.1. ANWENDUNGEN ZUR WUNDHEILUNG
Die durch die Erfindung erhaltenen konditionierten Medien können bearbeitet werden, um Wundheilung und Heilung von Brandwunden zu fördern. Wenn Gewebe verletzt ist, werden Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die eine Reihe biologischer Aktivitäten zeigen, in die Wunde freigesetzt, um die Heilung zu fördern. Die Wundheilung ist ein komplexer Vorgang, bei dem mehrere Stufen beteiligt sind und der in der Lage ist, Schadstellen an dem Integument in kontrollierter Form zu schließen und funktionell kompetentes Gewebe zu bilden. Der Prozess beginnt mit einer Hämostase, gefolgt von einer Entzündungsphase unter Beteiligung von Neutrophilen und Makrophagen. Der Prozess wird mit der Entwicklung von Granulationsgewebe und der Reepithelialisierung fortgesetzt und die Wunde geschlossen. Danach bildet sich Narbengewebe und wird im Verlaufe der nachfolgenden Monate zur Annäherung der ursprünglichen anatomischen Struktur umngeformt. Im Idealfall ist Narbengewebe so minimal, dass sich funktionell kompetentes Gewebe, das histologisch und physiologisch dem ursprünglichen normalen Gewebe ähnlich ist, gebildet werden kann.
Jede Stufe des Heilungsprozesses wird über zellulare Wechselwirkungen durch regulatorische Proteine gesteuert, wie beispielsweise Zytokine, Wachstumsfaktoren und inflammatorische Mediatoren, wie auch Zellkontaktmechanismen. Beispielsweise induzieren inflammatorische Mediatoren, wie beispielsweise IL-6, IL-8 und G-CSF, eine Lymphozytendifferenzierung und gute Phasenproteine sowie Neutrophilinfiltration, Reifung und Aktivierung, Prozesse, die in den inflammatorischen Stufen der Wundheilung von Bedeutung sind. Andere Beispiele für regulatorische Proteine, die in dem Prozess der Wundheilung von Bedeutung sind, sind VEGF, das während der Entzündung Angiogenese induziert und die Bildung von Granulationsgewebe, die BMPs, die die Knochenbildung einleiten, KGF, das Keratinozyten und TGF-β1 aktiviert, die die Abscheidung von extrazellulärer Matrix induzieren. In Tabelle 2 (nachfolgend) ist die Konzentration einer Reihe von mit Hilfe der ELISA (enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung) ermittelten Wachstumsfaktoren aufgeführt, die in dem erfindungsgemäßen konditionierten Medium enthalten sein müssen, das zuvor das Wachstum der Zellen unterstützt hat, die in einer Dermagraft^®-Gewebekultur aufgezogen wurden. Es sollte als selbstverständlich gelten, dass die nachfolgende Liste keine vollständige Liste von Faktoren ist und ausschließlich zur weiteren Charakterisierung des konditionieren Mediums geboten wird, indem die Konzentration einiger biologisch aktiver Faktoren angegeben ist, die in dem erfindungsgemäßen Medium vorhanden sind.
TABELLE 2 KONZENTRATIONEN VON WACHSTUMSFAKTOREN IN EINEM KONDITIONIERTEN MEDIUM, GEMESSEN MIT HILFE DER ELISA
In chronischen Wunden ist der Heilungsprozess an einer Stelle nach der Hämostasis und vor der erneuten Re-Epithelialisierung unterbrochen und kann offensichtlich nicht wieder gestartet werden. Der überwiegende Teil der Entzündung, den man in dem Wundbett sehen kann, betrifft eine Infektion, wobei die Entzündung jedoch zu einer an Proteasen reichen Umgebung führt, die die regulatorischen Proteine abbauen und damit den Prozess der Wundheilung stören.
Es ist eine Vielzahl von Methoden eingesetzt worden, um die molekularen Hauptkomponenten quantitativ zu bestimmen und zu charakterisieren, die von den Fibroblasten abgeschieden werden, die in den dreidimensionalen Gewebekulturen TransCyte^TM und Dermagraft^® angetroffen werden. Die Humanmatrixproteine und Glykosaminoglykane (GAGs), die in TransCyte^TM und Dermagraft^® vorhanden sind, schließen Kollagen I, III ein, Fibronektin, Tenascin, Decorin, Versican-Betaglykan, Syndecan sowie andere Komponenten (Daten nicht gezeigt), ohne auf diese beschränkt zu sein. Die abgeschiedenen Proteine und GAGs übernehmen die wichtigsten Strukturfunktionen und stimulieren außerdem die Zellteilung, die Migration, die Adhäsion und die Signalleitung. Die Abscheidung von Glykosaminoglykanen (Abscheidungsvolumen hängt von der Wachstumsdauer ab) und Kollagen (Abscheidungsvolumen ist nicht abhängig von der Wachstumsdauer) in den dreidimensionalen Wachstumssystemen sind in 1 dargestellt. Die Komponenten sind mit Hilfe der ELISA, der Western-Blot-Analyse, der Immunohistochemie und PCR gemessen worden. Beispielsweise schließen einige der in TransCyte^TM angetroffenen Komponenten Kollagen I, III und VII (RNA) ein, Fibronektin, Tenascin, Thrombospondin 2, Elastin, Proteoglykane, Decorin, Versican sowie andere Komponenten (Daten nicht gezeigt). Die Aktivität dieser Komponenten in der Gewebeentwicklung, beim Heilen und in der normalen Funktion sind ausreichend beschrieben worden. Darüber hinaus werden von den Anmeldern der vorliegenden Erfindung bestimmte Einflüsse der biogenetisch bearbeiteten Humanmatrix auf die Zellfunktion in vitro beschrieben. Beispielsweise haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die Zellproliferation durch Hinzufügung von biogenetisch bearbeiteter Matrix zunimmt. Um diese Einflüsse auf die Proliferation zu untersuchen, wurde Matrix physikalisch von TransCyte^TM und Dermagraft^® entfernt und zu unterschiedlichen Verdünnungen zu Monoschichtkulturen von Humanfibroblasten und Keratinozyten gegeben. Die Ergebnisse der erhöhten Zellproliferation sind in 2 gezeigt.
Darüber hinaus haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung, wie im Abschnitt 6.3 detailliert wird, den Einfluss des dreidimensionalen konditionierten Mediums auf die Herstellung und Zusammensetzung dreidimensionaler Gewebe festgestellt und durch Messung der Menge an Kollagen untersucht, die in die extrazelluläre Matrix von Geweben abgeschieden werden, die in Gegenwart von serumfreiem Medium, in Medium oder dreidimensionalem konditioniertem Medium kultiviert werden. Der Einfluss des dreidimensionalen konditionierten Mediums auf die Herstellung und Zusammenesetzung von dreidimensionalen Geweben wurde untersucht, indem die Mengen an Kollagen gemessen wurde, die abgesdchieden wurden in die extrazelluläre Matrix von Geweben, die in Gegenwart von serumfreiem Medium, Medium oder dreidimensionalem konditioniertem Medium kultiviert wurden. Das konditionierte Medium der Erfindung erhöht wesentlich die Kollagenabscheidung von Gewebe in vitro entsprechend der Darstellung in 4. Nach der vorliegenden Erfindung sind zahlreiche regulatorische Proteine enthalten, die für die Wundheilung als bedeutend angesehen werden und von denen es sich gezeigt hat, dass sie in in vivo-Modellen der Wundheilung abgereichert sind. Darüber hinaus sind bei einigen medizinischen Zuständen, wie beispielsweise Diabetes, einige der regulatorischen Proteine, die für die Wundheilung benötigt werden, nicht genügend vorhanden. Beispielsweise ist in einem Maus-Modell von Insulinunabhängigem Diabetes (z.B. der db/db-Maus) das die Abscheidung von VEGF und PDGF und die Expression des PDGF-Rezeptors in Wunden im Vergleich zu den Mengen in Wunden von einer normalen Maus herabgesetzt sind.
Außerdem sind die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten konditionierten Medien auch in der Behandlung anderer Arten von Gewebeschäden anwendbar, z.B. in traumatischen oder angeborenen, worin die Reparatur und/oder Erneuerung von Gewebedefekten oder Schäden gewünscht wird, da viele dieser Wachstumsfaktoren in den konditionierten Zellmedien der Anmeldung der vorliegenden Erfindung angetroffen werden, einschließlich beispielsweise Fibroblast-Wachstumsfaktoren (FGFs), Thrombozytenderivierte Wachstumsfaktoren (PDGFs), epidermale Wachstumsfaktoren (EGFs), Knochenmorphogenetische Proteine (BMP's) und von transformierten Zellen gebildete Wachstumsfaktoren (TGF's), wie auch solche, die die Gefäßbildung modulieren, wie beispielsweise Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) und basisches FGF; Angiogenesefaktoren sowie Antiangionesefaktoren. Stressproteine, wie beispielsweise GR 78 und MSP90 induzieren Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise TGF-β. TGF-β einschließlich TGF β-1, TGF β-2, TGF β-3, TGF β-4 und TGF β-5 regulieren das Wachstum und die Differenzierung und beschleunigen die Wundheilung (Noda et al., 1989, Endocrin, 124:2991–2995; Goey et al., 1989, "J. Immunol.", 143:877–880, Mutoe et al., 1987, "Science", 237:1333–1335). Mitogene, wie beispielsweise PDGF, erhöhen den Anteil der Zellularität und der Granulation in der Gewebebildung (Kohler et al., 1974, "Exp. Cell. Res.", 87:297–301). Wie bereits ausgeführt, sind die Zellen vorzugsweise human, um Probleme der Immunogenität auf ein Minimum herabzusetzen.
Da die konditionierten Medien der Erfindung einen solchen Umfang an wundheilenden Faktoren enthalten, sind die konditionierten Medien vorteilhaft bei der Behandlung von Wunden und zum Heilen von Verbrennungen angewendet worden, einschließlich Wunden der Haut, gebrochene Knochen, Magengeschwüre, Pankreas, Leber, Nieren, Milz, Verletzungen von Blutgefäßen und andere innere Wunden. Darüber hinaus lassen sich die konditionierten Medien mit anderen medizinischen Inhaltsstoffen kombinieren, wie beispielsweise Antibiotika und Analgetika. Ausführungsformen schließen Formulierungen der konditionierten Medien mit einer Salbe oder einer Creme zum topischen Auftrag ein. So ist von dem erfindungsgemäßen konditionierten Medium gezeigt worden, dass es die Proliferation von Humanfibroblasten und Keratinozyten einleitet. Ein erhöhtes Ansprechen von Zellen wurde von Zellen festgestellt, die dem konditionierten Medium mindestens drei Tage in vitro ausgesetzt waren (3).
Alternativ kann das konditionierte Medium mit einer Bandage kombiniert werden (klebend oder nichtklebend), um die Wundheilung zu unterstützen und/oder zu beschleunigen. Die konditionierten Medien können in einem beliebigen Zustand verwendet werden, d.h. flüssig oder fest, tiefgefroren oder getrocknet zu einem Pulver, als Film für topische Wundbehandlungen und für klebfreie Aufträge, als Injektionsmittel (siehe die PCT WO 96/39101).
Alternativ lässt sich das konditionierte Zellmedium der vorliegenden Erfindung mit polymerisierbaren oder vernetzenden Hydrogelen entsprechend der Beschreibung in den US-P-5 709 854, 5 516 532, 5 654 381 und WO 98/52543 formulieren. Beispiele für Materialien, die zur Erzeugung eines Hydrogels verwendet werden können, schließen modifizierte Alginate ein. Bei dem Alginat handelt es sich um ein Kohlenhydratpolymer, das isoliert wird aus Seegras, das unter Erzeugung eines Hydrogels durch Exponierung an einem zweiwertigen Kation vernetzt werden kann, wie beispielsweise Calcium. Siehe hierzu die Beschreibung beispielsweise in der WO 94/25080. Alginat wird in Gegenwart von zweiwertigen Kationen in Wasser bei Raumtemperatur unter Bildung einer Hydrogelmatrix ionisch vernetzt. Wie hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff "modifizierte Alginate" auf chemisch modifizierte Alginate mit modifizierten Hydrogeleigenschaften.
Darüber hinaus können Polysaccharide, die durch Exponierung an einwertigen Kationen gelieren, einschließlich bakterielle Polysaccharide, wie beispielsweise Gellane, und Pflanzenpolysaccharide, wie beispielsweise Irische Moose, unter Bildung eines Hydrogels vernetzt werden, indem Methoden angewendet werden, die zu denen analog sind, die für das Vernetzen von Alginaten verfügbar sind, wie sie vorstehend beschrieben wurden.
Besonders verwendbar sind modifizierte Hyaluronsäure-Derivate. Wie hierin verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Hyaluronsäuren" auf natürliche und chemisch modifizierte Hyaluronsäuren. Modifizierte Hyaluronsäuren lassen sich mit vorgewählten chemischen Modifikationsmitteln so konzipieren und synthetisieren, dass die Geschwindigkeit und der Grad des Vernetzens sowie der biologische Abbau eingestellt werden können.
Ebenfalls verwendbar sind kovalent vernetzende Hydrogel-Präkursoren. Beispielsweise lässt sich ein wasserlösliches Polyamin, wie beispielsweise Chitosan, mit einem in Wasser löslichen Diisothiocyanat vernetzen, wie beispielsweise Polyethylenglykoldiisothiocyanat.
Alternativ können Polymere eingesetzt werden, in die Substituenten einbezogen sind, die durch radikalische Reaktion bei Kontakt mit einem radikalischen Starter vernetzt werden. Beispielsweise können entsprechend der Offenbarung in der WO 93/17669 Polymere eingesetzt werden, in die ethylenisch ungesättigte Gruppen einbezogen sind, die sich photochemisch vernetzen lassen. In der vorliegenden Ausführungsform werden wasserlösliche Makromere bereitgestellt, in die mindestens ein wasserlöslicher Bereich einbezogen ist, ein biozersetzbarer Bereich und mindestens zwei freie radikalisch polymerisierbare Bereiche. Beispiele für diese Makromere sind PEG-Oligolactylacrylate, worin die Acrylat-Gruppen unter Verwendung von radikalischen Startsystemen polymerisiert sind, wie beispielsweise ein Eosin-Farbstoff, oder durch kurze Exponierung an ultraviolettem oder sichtbarem Licht. Zusätzlich lassen sich entsprechend der Offenbarung in Matsuda et al., ASAID, "Trans.", 38:154–157 (1992) wasserlösliche Polymere einsetzen, in die Cinnamoyl-Gruppen einbezogen sind, die sich photochemisch vernetzen lassen.
Die bevorzugten polymerisierbaren Gruppen sind Acrylate, Diacrylate, Oligoacrylate, Dimethacrylate, Oligomethacrylate und andere biologisch zulässige photopolymerisierbare Gruppen. Acrylate sind die am meisten bevorzugten aktiven Vertreter als polymerisierbare Gruppe.
Natürlich vorkommende und synthetische Polymere können unter Anwendung chemischer Reaktionen modifiziert werden, wie sie auf dem Fachgebiet verfügbar sind und beispielsweise beschrieben wurden in March, "Advanced Organic Chemistry", 4. Ausg., 1992, Wiley-Interscience Publication, New York.
Die Polymerisation wird bevorzugt unter Anwendung von Photo-Initiatoren eingeleitet. Verwendbare Photo-Initiatoren sind solche, die zum Start der Polymerisation der Makromonomere ohne Cytotoxizität und innerhalb eines kurzen Zeitbereichs von Minuten und am meisten bevorzugt Sekunden verwendet werden können.
Es können zahlreiche Farbstoffe für die Photopolymerisation verwendet werden. Geeignete Farbstoffe sind ebenfalls in der Fachwelt gut bekannt. Bevorzugte Farbstoffe schließen ein: Erythrosin, Phloxim, Bengalrot, Thionin, Campferchinon, Ethyleosin, Eosin, Methylenblau, Riboflavin, 2,2-Dimethyl-2-phenylacetophenon, 2-Methoxy-2-phenylacetophenon, 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon, andere Acetophenon-Derivate und Campferchinon. Geeignete Cokatalysatoren schließen Amine ein, wie beispielsweise N-Methyldiethanolamin, N,N-Dimethylbenzylamin, Triethanolamin, Triethylamin, Dibenzylamin, N-Benzylethanolamin, -Isopropylbenzylamin. Ein bevorzugter Cokatalysator ist Triethanolamin.
In einer anderen Ausführungsform werden die in der vorliegenden Erfindung erhaltenen konditionierten Medien oder alternativ spezielle extrazelluläre Matrixproteine, die sich in die Medien hinein entwickeln, verwendet, um eine hervonagende Substanz zur Beschichtung von Nahtmaterial bereitzustellen. Die natürlich abgeschiedene extrazelluläre Matrix liefert die konditionierten Medien mit Kollagenen vom Typ I und III, Fibronektin, Terascin, Glykosaminoglykane, saures und basisches FGF, TGF-α und TGF-β, KGF, Versican, Decorin und verschiedene andere abgeschiedene dermale Humanmatrixproteine. In ähnlicher Weise lassen sich die erfindungsgemäßen konditionieren Zellmedien oder die von den konditionierten Medien derivierten extrazellulären Matrixproteine zur Beschichtung konventioneller Implantationsmittel verwenden, einschließlich Gefäßprothesen, und zwar in chirurgischen Eingriffen, um die Defekte in dem Körper mit dem Resultat überlegener Implantationsmittel zu korrigieren. Die Implantate sollten aus biokompatiblen inerten Materialien hergestellt werden, die die fehlerhafte Funktion von entweder aus nichtbiozersetzbaren Materialien oder biozersetzbaren Materialien gefertigten Mitteln ersetzen oder ergänzen. Durch Beschichten von Implantationsmitteln mit dem Medium, das diese extrazellulären Proteine enthält, liefert das Implantat geeignete zellulare Anordnungen, die zu einem überlegenen Gewebe an der Implantationsstelle führen. Damit verstärken chirurgische Nahtmaterialien, Bandagen und Implantate, die mit den konditionierten Zellmedien überzogen sind, oder von den Medien derivierte Proteine die Wiederherstellung von Zellen, wie beispielsweise Leukozyten und Fibroblasten in dem beschädigten Bereich und lösen eine Zellproliferation und Differenzierung aus, die zu einer verbesserten Wundheilung führt.
In einer anderen Ausführungsform kann das konditionierte Medium mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger als ein Vehikel für die innere Verabreichung formuliert werden. Darüber hinaus kann das Medium in einer solchen Form weiter verarbeitet werden, dass einer oder mehrere Faktoren oder Komponenten, die in dem Medium enthalten sind, aufkonzentriert oder reduziert werden, z.B. eine Anreicherung eines Wachstumsfaktors unter Verwendung der Immunoaffmitätschromatographie, oder im Gegensatz dazu die Entfernung einer weniger wünschenswerten Komponente bei irgendeiner vorgegebenen Anwendung entsprechend der Beschreibung hierin.
Selbstverständlich können Wunden an spezialisierten Geweben ein Medium erfordern, das durch dieses spezialisierte Gewebe konditioniert wurde. Beispielsweise können Verletzungen an Nervengeweben Proteine erfordern, die in dem durch neuronale Zellkulturen konditionierten Medium enthalten sind. Es lassen sich spezielle Produkte ableiten oder das konditionierte Medium kann alternativ durch Immunoaffinitätschromatographie oder verstärkte Expression eines gewünschten Proteins aus dem speziellen Medium angereichert werden, wie beispielsweise NGF. NGF-gesteuerte Merkmale schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: die Funktion des cholinergen Neurotransmitters (Acetylcholinesterase (AChE) und das Acetylcholin-synthetisierende Enzym (ChAT)), neuronale Zellgröße und Expression von NGF-Rezeptoren vom Typ II; NGF wird in das konditionierte Medium hinein abgeschieden, das durch Glialzellen oder andere Nervenzellen konditioniert wurde, die auf einem dreidimensionalen Stromagewebe kultiviert wurden, so dass dann eine Anwendung in einer Zusammensetzung zur Heilung von Nerven folgen kann.
Defizite an endogener NGF erschweren bestimmte neurodegenerative Humanerkrankungen, und es gibt ein augenscheinliches Unvermögen von verletzten ausgewachsenen CNS-Neuronen, sich zu regenerieren. Speziell folgt der Verletzung eines Nerven die Degeneration der Nervenfasern distal zur Verletzung, was eine Isolation des Neuraxon vom Zellkörper zur Folge hat. In dem zentralen Nervensystem gibt es an der Verletzungsstelle kein signifikantes Wachstum, was im typischen Fall zum Absterben des beschädigten Neurons führt. NGF spielt eine entscheidende Rolle in den regenerativen Fähigkeiten von ausgewachsenen CNS-cholinergen Neuronen in der Ebene des Zellkörpers (z.B. Septum), der eingreifenden Gewebezwischenräume (z.B. Nervenzweig) und den Bereich der Re-Innervation (z.B. der Hippokampus-Bildung). Darüber hinaus kann NGF vorteilhaft zur Verbesserung von kognitiven Defekten sein. Medium, das mit Glialzellen konditioniert wurde, kann beispielsweise exogene NGF liefern sowie andere Nervenwachstumsfaktoren, so dass neue Neuraxone aus den abgetrennten Enden des verletzten Nervens wachsen können (z.B. die Entwicklung eines Wachstumskegels), der sich zur ursprünglichen Verbindungsstelle ausdehnt.
Oftmals ist eine Verletzung des Hirns oder des Rückenmarks begleitet von einer Glial-Reaktion zu der gleichzeitig erfolgenden Neuraxon-Degeneration, was zu Narbengewebe führt. Dieses Narbengewebe wurde anfangs als eine physikalische Barriere für das Nervenwachstum gehalten, jedoch ist von größerer Bedeutung das Vorhandensein oder Fehlen von neuronotropischen Faktoren in der extraneuronalen Umgebung. Astrozyten scheinen in der Lage zu sein, Laminin in Reaktion auf eine Verletzung synthetisch herzustellen (Laminin findet sich auch in den konditionierten Medien, wie sie detaillierter im Abschnitt 5.8.2 im Zusammenhang mit extrazellulären Matrixproteinen diskutiert werden). Kollagen und Fibronektin und speziell Laminin haben gezeigt, dass sie das Wachstum von Neuraxonen aus kultivierten Neuronen oder neuronalen Explantaten in vitro fördern. Diese extrazellulären Matrixproteine scheinen ein adhäsives Substrat zu liefern, das die Vorwärtsbewegung des Wachstumskegels und die Ausdehnung des Neuraxons erleichtert. So sind das Vorhandensein von neuronotropen Faktoren und einem stützenden Substrat für eine erfolgreiche Nervenregeneration erforderlich, da die Regeneration dem Anschein nach erfordert: dass der neuronale Zellkörper zum Aufbau der entsprechenden biosynthetischen Reaktion in der Lage ist, und dass die Umgebung, die die Stelle der Verletzung umgibt, in der Lage ist, die Ausdehnung zu unterstützen, sowie zur eventuellen funktionellen Wiederverbindung des Neuraxons. Medium, das mit Hilfe von Nervenzellen, wie beispielsweise Astrozyten und Glialzellen konditioniert wurde, enthält die neuronotropischen Wachstumsfaktoren und die extrazellularen Matrixproteine, die für die Regeneration des Nerven in Verletzungen des Hirns und des Rückenmarks erforderlich sind. Daher wird in einer der Ausführungsformen das konditionierte Medium für die Behandlung derartiger Verletzungen formuliert.
In anderen Ausführungsformen kann die Behandlung von Haut, Knochen, Leber, Pankreas, Knorpel und anderen spezialisierten Geweben mit Medien erfolgen, die mit Hilfe ihrer entsprechenden spezialisierten Zelltypen konditioniert wurden und vorzugsweise in drei Dimensionen kultiviert wurden, was zu einem konditionierten Medium führt, das charakteristische extrazellulare Proteine enthält und andere Metabolite dieses Gewebetyps, die zur Behandlung von Wunden des entsprechenden Gewebetyps verwendbar sind.
Das konditionierte Zellmedium kann auch anderen Mitteln zugesetzt werden, die in der periodontalen Chirurgie verwendet werden, um eine gleichförmige Gewebereparatur zu fördern; um biozersetzbare Kontaktlinsen, Hornhautschilde oder Knochentransplantate bereitzustellen, um chirurgische Zwischenraumfüller zu liefern, um eine Zunahme der Weichteile zu fördern, speziell in der Haut für die Aufgabe der Reduzierung von Hautfalten, und eine Verstärkung des Harnsphinkters für die Aufgabe der Kontrolle von Inkontinenz.
In einer anderen Ausführungsform können die Zusammensetzungen lyophilisiert/gefriergetrocknet werden und einem Wundfüllstoff zugesetzt werden (z.B. zum Ausfüllen von Löchern, die von Haarwurzeln bei der Implantation zurückgelassen wurden) oder zu bestehenden Zusammensetzungen zum Wundfüllen zugegeben werden, um die Wundheilung zu beschleunigen. In einer anderen Ausführungsform wird das Medium mit genetisch bearbeiteten Zellen konditioniert, um die Konzentration der Proteine der Wundheilung in dem Medium zu erhöhen. Beispielsweise können die Zellen so bearbeitet werden, dass sie Genprodukte exprimieren, wie beispielsweise die vorstehend aufgeführten Wachstumsfaktoren.
5.8.2 DIE REPARATUR UND KORREKTUR VON ANGEBORENEN ANOMALIEN, ERWORBENEN DEFEKTEN UND KOSMETISCHEN DEFEKTEN
Die Mediumzusammensetzungen können auch zur Reparatur und Korrektur einer Vielzahl von Anomalien sowohl angeborener als auch erworbener Art sowie kosmetischer Defekte verwendet werden, die sowohl oberflächlich als auch invasiv sind. Beispielsweis können die Zusammensetzungen in jeder beliebigen Form zugesetzt werden und können in einem Hydrogel verwendet werden, in Injektionsmitteln, Creme, Salbe, und können sogar Lidschatten, Wangenrouge, Kompressen oder anderen kosmetischen Mitteln zugesetzt werden, um die Haut topisch zu verstärken.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt ein topischer Auftrag oder eine Anwendung mit Hilfe einer beliebigen bekannten Methode, wie beispielsweise durch Injektion, oral, usw., des konditionierten Mediums, um Falten und eine Reihe nachteiliger Effekte zurückzubilden und/oder zu verhindern, die durch UV-Licht, Exponierung an einer Vielzahl von Schmutzstoffen und beispielsweise durch normales Altern hervorgerufen werden.
Zusätzlich wird in einer anderen Ausführungsform das Medium der Erfindung zur Verringerung des Zellalterns und zur Hemmung der Aktivität der Faktoren verwendet, die Hautkrebs hervorrufen. Das konditionierte Medium verfügt über eine antioxidative Wirksamkeit, wie sie in Abschnitt 7.1 gezeigt wird. Wiederum kann die Anwendung bei einem Säuger topisch sein oder kann mit Hilfe einer beliebigen bekannten Methode erfolgen, wie beispielsweise Injektion, oral, usw. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass eine statistisch signifikante (p < 0,003) Reduktion der intrazellulären Oxidation von näherungsweise 50% in Humankeratinozyten festgestellt wurde, die an dem konditionieren Medium der Anmelder der vorliegenden Erfindung exponiert wurden.
Zusätzlich zur Induzierung einer epidermalen und dermalen Zellproliferation und Kollagenabscheidung in vitro hat das erfindungsgemäße konditionierte Medium eine starke antioxidative Wirksamkeit (5). Außerdem sind die Faktoren verhältnismäßig stabil und der Gehalt an TGF β1, VEGF und Kollagen war nach einer Lagerung über 21 Tage bei 37°C bei pH 7,4 und 5,5 stabil. Mehr als 2 Jahre bei –20°C gelagerte Lösungen bewahrten stabile Werte für TGF β1 und VEGF.
Diese sterile angereicherte Nährstofflösung repräsentiert ein biotechnisch bearbeitetes Kosmetikum, das in großen Volumina leicht verfügbar ist und als ein Additiv bei einer Vielzahl von Haut-, Kosmetik- und dermatologischen Produkten zur Ergänzung der Mengen der Wachstumsfaktoren und Matrix-Moleküle in Humanhaut, Haar und Nägeln verwendet werden kann. Die Produkte sind zur Verwendung mit Alpha-Hydroxysäure-Exfoliaten vorgesehen, um potentiell die Einbringung der Wachstumsfaktoren und anderen Biomoleküle in die Haut zu optimieren, und mit chemischen Hautmitteln, um potentiell die Heilung zu beschleunigen und eine Entzündung herabzusetzen.
Das konditionierte Medium kann zum Eliminieren von Falten, Runzeln, Narben und anderen Hautfehlern anstelle der Verwendung von Silicon oder anderen Produlkten formuliert werden. Das konditionierte Medium enthält Wachstumsfaktoren und inflammatorische Mediatoren, wie beispielsweise VEGF, HGF, IL-6, IL-8, G-CSF und TFGβ₁ (siehe Tabelle 3, in Abschnitt 5.8.1) sowie extrazelluläre Matrixproteine, wie beispielsweise Kollagene vom Typ I und III, Fibronektin, Tenascin, Glykosaminoglykane, saure und basische FGF, TGF-α und TGF-β, KGF, Versican, Decorin, Betaglycene, Syndean und zahlreiche andere ausgeschiedene dermale Humanmatrixproteine, die zur Reparatur von physischen Anomalien und kosmetischen Defekten verwendbar sind. Wie in Abschnitt 6.3 detailliert wird, haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung den Einfluss des dreidimensionalen konditionierten Mediums auf die Herstellung und Zusammensetzung dreidimensionaler Gewebe festgestellt und mit Hilfe der Messung der in die extrazelluläre Matrix von Geweben abgeschiedenen Kollagenmenge gemessen, die in Gegenwart von serumfreiem Medium kultiviert wurden, in Medium oder in dreidimensional konditioniertem Medium. Das erfindungsgemäße konditionierte Medium erhöhte signifikant die Kollagenabscheidung von Gewebe in vitro entsprechend der Darstellung in 4. Der Einfluss von dreidimensionalem konditioniertem Medium auf die Herstellung und Zusammensetzung von dreidimensionalen Geweben wurde durch Messung der Kollagemnenge untersucht, die in die extrazelluläre Matrix von Geweben abgeschieden wurde, die in Gegenwart von serumfreiem Medium, von Medium oder dreidimensionalem konditioniertem Medium kultiviert wurden. Selbstverständlich lassen sich die zur Konditionierung des Mediums verwendeten Zellen genetisch bearbeiten, um verbesserte Konzentrationen derartiger Proteine in dem Medium zu exprimieren.
Die in der Erfindung erhaltenen konditionierten Medien lassen sich zu injizierbaren Präparaten formulieren. Andernfalls können von den konditionierten Medien derivierte Produkte formuliert werden. Beispielsweise lassen sich biologisch aktive Substanzen, wie beispielsweise Proteine und Arzneistoffe, in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Freisetzung oder zur kontrollierten Freisetzung dieser aktiven Substanzen nach Injektion der Zusammensetzung einbauen. Beispielhafte biologisch aktive Substanzen können Gewebewachstumsfaktoren einschließen, wie beispielsweise TGF-β und dergleichen, die das Heilen und die Gewebereparatur an der Stelle der Injektion fördern. Methoden zur Reinigung des Produktes schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Gelchromatographie unter Verwendung von Matrices, wie beispielsweise SEPHADEX^®, Ionenaustausch, Metallchelat-Affinitätschromatographie mit einer unlöslichen Matrix, wie beispielsweise vernetzte Agarose, HPLC-Reinigung, Hydrophobchromatographie der konditionierten Medien. Derartige Methoden wurden detaillierter beschrieben in "Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures", siehe oben: Sanbrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausg., Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, NY.
In der injizierbaren Ausführungsform wird eine wässrige Suspension verwendet, wobei die Formulierung der wässrigen Suspension im typischen Fall einen physiologischen pH-Wert hat (d.h. etwa pH 6,8 bis 7,5). Darüber hinaus wird in der Regel ein Lokalanästhetikum wie Lidocain (gewöhnlich bei einer Konzentration von etwa 0,3 Gew.%) zugesetzt, um den örtlichen Schmerz bei der Injektion zu vermindern. Die fertige Zubereitung wird außerdem im typischen Fall ein flüssiges Gleitmittel enthalten, wie beispielsweise Maltose, das vom Körper toleriert werden muss. Beispielhafte Gleitmittelkomponenten schließen Glycerin ein, Glykogen, Maltose und dergleichen. Als Gleitmittel können auch organische Materialien auf Polymerbasis wirken, wie beispielsweise Polyethylenglykol und Hyaluronsäure sowie nichtfibrilläres Kollagen und vorzugsweise succinyliertes Kollagen. Derartige Gleitmittel werden im Allgemeinen zur Verbesserung der Injizierbarkeit, der Intrudierbarkeit und Dispersion des injizierten Biomaterials an der Injektionsstelle verwendet sowie zur Verringerung der Spitzenbildung durch Modifizieren der Viskosität der Zusammensetzungen. Die fertige Formulierng ist per Definition das bearbeitete konditionierte Zellmedium in einem pharmazeutisch zulässigen Träger.
Das bearbeitete konditionierte Medium wird anschließend in einer Spritze aufgenommen oder in einem anderen Apparat zur Injektion für die genaue Platzierung des konditionierten Mediums an dem Ort des Gewebedefektes. Im Fall von Formulierungen für die dermale Unterstützung bedeutet der Begriff "injizierbar", dass die Formulierung aus Spritzen mit einem Maß von bis zu 25 unter Normalbedingungen und normalem Druck ohne eine wesentliche Spitzenwirkung gegeben werden kann. Für diese genaue Platzierung sind Nadeln mit einer Feinheit von 27 (200 μm Innendurchmesser) oder sogar 30 (150 μm Innendurchmesser) wünschenswert. Die maximale Partikelgröße, die aus derartigen Nadeln ausgestoßen werden kann, wird eine komplexe Funktion der folgenden Parameter sein: maximale Partikelabmessung, Längen-Breite-Verhältnis des Partikels (Länge:Breite), Partikelstarrheit, Oberflächerauhigkeit der Partikel und damit zusammenhängende Faktoren, die die Partikel/Partikel-Haftung beeinflussen, viskoelastische Eigenschaften des suspendierenden Fluids und die Durchflussrate durch die Nadel. Starre spherische Kügelchen, die in einer Newton'schen Flüssigkeit suspendiert sind, stellen den einfachsten Fall dar, während faserige oder verzweigte Partikel in einer viskoelastischen Flüssigkeit wahrscheinlich komplizierter sind.
Die vorstehend beschriebenen Schritte in dem Prozess zur Herstellung eines injizierbaren abgeschiedenen, konditionierten Humanmediums werden vorzugsweise unter sterilen Bedingungen unter Verwendung steriler Materialien ausgeführt. Das in einem pharmazeutisch zulässigen Träger verarbeitete konditionierte Medium kann intradermal oder subkutan zur Festigung von Weichteilen injiziert werden, um vererbte Anomalien, erworbene Defekte oder kosmetische Defekte zu reparieren oder zu korrigieren. Beispiele für derartige Krankheitsbilder sind vererbte Anomalien wie hemifacialer Kleinwuchs, malare und zygomatische Hypoplasie, einseitige Brust-Hypoplasie, Pectus excavatum, Pectoralis agenesis (Polenanomalie) und velopharyngeale Inkompetenz sekundär zu Spaltgaumenreparatur oder zur submukosalen Gaumenspalte (als ein retropharyngeales Implantat); erworbene Defekte (posttraumatisch, postchirurgisch, postinfektiös), wie beispielsweise vertiefte Narben, subkutane Atrophie (z.B. sekundär zu scheibenförmiger Lupus Erythematosus), keratotische Verletzungen, Enophthalmus im nichtnucleierten Auge (auch über Sulcus-Syndrom), Akne-Flecken des Gesichts, lineare Sklerodermie mit subkutaner Atrophie, Sattelnasenverformung, Romberg'sche Krankheit und einseitige Stimmbandparalyse; und kosmetische Defekte, wie beispielsweise Glabella-Furchen, tiefe nasolabiale Falten, zirkumorale geographische Falten, eingefallene Wangen und Brusthypoplasie. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch in innere Gewebe injiziert werden, wie beispielsweise der Körpersphinkter begrenzende Gewebe zur Verstärkung dieser Gewebe.
Andere Gewebearten, die zur Konditionierung der Medien verwendet werden, schließen Knochenmark ein, Haut, Epithelzellen und Knorpelgewebe, ohne auf diese beschränkt zu sein, wobei es jedoch ausdrücklich als selbstverständlich gilt, dass das dreidimensionale Kultursystem mit anderen Arten von Zellen und Geweben verwendet werden kann.
Alternativ lässt sich das in der vorliegenden Erfindung erhaltene konditionierte Zellmedium mit polymerisierbaren oder vernetzenden Hydrogelen formulieren, wie in dem vorangegangenen Abschnitt über Wundheilung beschrieben wurde.
5.8.3 NAHRUNGSMITTELZUSÄTZE UND DIÄTERGÄNZUNGEN
Die konditionierten Medien lassen sich als Nahrungsmittelzusätze verwenden und zu Diätergänzungen formulieren. Die in der vorliegenden Erfindung erhaltenen konditionierten Medien enthalten zahlreiche nützliche Nährstoffe, einschließlich essentielle Aminosäuren, Mineralien und Vitamine in reichhaltigem Umfang und einer Vielzahl, wie sie im einzelnen Nahrungsmittel oder Erzeugnisgruppen nicht angetroffen werden. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung kennen keine ausgewogeneren Lebensmittelerzeugnisse (außer Muttermilch), die eine solche umfangreiche Gruppe von Nährstoffen enthalten, obgleich solche Versuche in spezialisiert zubereiteten und aufwendigen flüssigen Rezepturen unternommen wurden, die sowohl für Erwachsene als auch für Kleinstkinder verfügbar sind. Die konditionierten Zellmedien und/oder davon abgeleiteten Produkte können als eine kostengünstige Quelle für ausgewogene Nährstoffergänzung für Gewichtsverlust oder alternativ zur Erhöhung des Nährstoffgehaltes von Lebensmitteln verwendet werden und speziell für solche in Ländern der dritten Welt. Das Medium ist steril und frei von Kontamination durch Humanpathogene (d.h. aseptisch). Das konditionierte Medium kann aufkonzentriert und/oder lyophilisiert werden und wird bevorzugt in Kapseln oder Tabletten zur Einnahme verabreicht. Alternativ können die Zusammensetzungen direkt der Erwachsenen- oder Babykost zugesetzt werden, um den Nährstoffgehalt zu erhöhen. Diese reiche Quelle von Nährstoffen kann relativ kostengünstig verarbeitet werden und kann für unterernährte ältere Menschen unschätzbar sein und speziell für Kinder in unterentwickelten Ländern, wo eine erhöhte Sterblichkeit in Folge von schwachen Reaktionen auf Infektion im Zusammenhang mit Unterernährung festzustellen ist.
Darüber hinaus sind zahlreiche Spurenelemente, die in den konditionierten Medien angetroffen werden, wie beispielsweise Eisen und Magnesium, für das Überleben der Mammalia und deren Reproduktion entscheidend sind, und es gibt Bedenken, dass ein Mangel an marginalen Spurenelementen ein Problem im Gesundheitswesen sein könnte. Es wurde die Einnahme zahlreicher essentieller Mikronährstoffe zur Verringerung von Infektion sowie Krebsrisiko durch Modifizierung spezieller Phasen der Karzinogenese vorgeschlagen. Mikronährstoffe verstärken außerdem die funktionellen Aktivitäten des Immunsystems und dessen Wechselwirkungsmechanismen von T-Zellen und B-Zellen, Mos- und NK-Zellen speziell durch verstärkte Produktion verschiedener Zytokine zur Erleichterung ihrer phagozytischen und cytotoxischen Wirkung gegenüber dem Angriff von Pathogenen und/oder zur Zerstörung aufkommender prämaligner Zellen in verschiedenen lebenswichtigen Organen. Siehe hierzu Chandra, R. K., Herausg., (1988), "Nutrition and Immunology: Contemporary Issues in Clinical Nutrition", Alan R. Liss, New York. Es besteht daher ein Bedarf nach relativ kostengünstigen Quellen für ausgewogene Nährstoffe. Ideale Lebensmittelprodukte zur Anreicherung mit den konditionierten Medien sind Brote, Cerealien und andere Getreideprodukte, wie beispielsweise Pastas, Crackers, usw. Darüber hinaus kann das Medium weiter verarbeitet werden, um einen oder mehrere Faktoren oder Komponenten anzureichern oder zu verringern, die in dem Medium enthalten sind, wie beispielsweise eine Anreicherung eines Wachstumsfaktors unter Anwendung der Immunaffmitätschromatographie oder im Gegensatz dazu eine Entfernung einer weniger wünschenswerten Komponente für irgendeine beliebige vorgegebene Anwendung, wie sie in diesem Kapitel beschrieben wurde.
5.8.4 TIERFUTTERERGÄNZUNG
Die Zusammensetzungen können als Ergänzung für Tierfutter verwendet werden. In einer der Ausführungsformen enthält das konditionierte Medium Rinderserum, das eine Quelle für Protein und andere Faktoren liefert, die für Mammalia nützlich sind, wie beispielsweise Nutzvieh und andere Wiederkäuer, wie beispielsweise Kühe, Rentiere und dergleichen. Das Medium wird auf Pathogene einem Screening unterworfen und ist frei von Rinderpathogenen und Mykoplasma. Das konditionierte Medium, das in der vorliegenden Erfindung erhalten wird, wird vorzugsweise von Kühen erhalten, die in den Vereinigten Staaten aufgezogen wurden, so dass die Wahrscheinlichkeit für Pathogene deutlich verringert ist.
5.8.5 ZELLKULTURMEDIUM
Die Mediumzusammensetzungen werden zum Kultivieren von Zellen und speziell von Zellen "wiederverwendet", die in vitro schwer zu kultivieren sind. Das konventionelle Wachstumsmedium ist im typischen Fall durch zahlreiche Faktoren ergänzt, die bereits in dem konditionierten Medium der Anmelder der vorliegenden Erfindung vorhanden sind. Darüber hinaus kann das konditionierte Medium auch Faktoren erhalten, die die Zellhaftung und das Wachstum fördern, wie beispielsweise die vorstehend beschriebenen extrazellulären Matrixproteine. Eine Erhöhung der Konzentrationen an Fibronektin oder Kollagen kann zur Förderung der Zellanhaftung an Gerüstsubstanz oder an der Kulturoberfläche nützlich sein. Eher als diese Faktoren dem Medium zuzusetzen, lässt sich das konditionierte Medium zum Kultivieren von Zellen und zum Herstellen dreidimensionaler Gewebekonstrukte verwenden, wie beispielsweise Dermagraft^®. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass das konditionierte Medium die Zellproliferation von Fibroblasten und Keratinozyten erhöht. Siehe hierzu 3. Zelltrümmer oder andere partikuläre Substanz sowie Proteasen, Milchsäure oder andere Komponenten, die für das Zellwachstum möglicherweise nachteilig sind, können aus dem Medium vor seiner Wiederverwendung als Zellkulturmedium entfernt werden. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, Serum in dem konditionierten Zellmedium für diese Anwendung zu verwenden. Serum enthält außerdem Adhäsionsfaktoren, wie beispielsweise Fibronektin und Serum-Hyaluronidase, die die Zellanhaftung an dem Substrat fördern können. Eine solche Anhaftung wird für das Wachstum einiger, wenn auch nicht aller, Zellen in vitro benötigt. Zusätzlich dazu, dass Substanzen bereitgestellt werden, die für ein Zellwachstum erforderlich sind, kann das Serum auch eine Rolle beim Stabilisieren und Entgiften des Kulturmilieus spielen. Beispielsweise verfügt das Serum über eine bedeutende Pufferkapazität und enthält spezifische Proteasehemmer, wie beispielsweise α₁-Antitrypsin und α₂-Makroglobulin. Serumalbumin, das in hohen Mengen in Medium mit beispielsweise einem Gehalt von 10% Serum vorhanden ist, kann als ein nichtspezifischer Hemmer für Proteolyse dienen sowie fettlösliche Vitamine und Steroidhormone binden, die in ihren drei freien Formen toxisch sein können. Serumkomponenten können auch Schwermetalle binden und entgiften sowie reaktionsfähige organische Substanzen, die in den Mediumkomponenten vorhanden sein können.
5.8.6 PHARMAZEUTISCHE ANWENDUNGEN
Das in der vorliegenden Erfindung erhaltene konditionierte Medium enthält eine Vielzahl verwendbarer pharmazeutischer Faktoren und Komponenten, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, regulatorische Faktoren, Peptidhonnone, Antikörper, usw. wie sie durchgehend in der Patentbeschreibung beschrieben wurden, weshalb sie für eine Reihe von pharmazeutischen Anwendungen verwendbar sind. Produkte, die ebenfalls zugesetzt werden können, schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Antikörper, antivirale Mittel, antifungale Mittel, Steroide, Analgetika, Antitumormedikamente, wissenschaftliche Arzneimittel oder irgendwelche Verbindungen, die zu einer komplementären oder synergistischen Kombination mit den Faktoren in den konditionierten Medien führen könnten. Wie vorstehend diskutiert, werden die Zellen unter aseptischen Bedingungen kultiviert und unter diesen Bedingungen die Medien gewonnen. Zusätzlich lassen sich die Medien auf Pathogene testen. Sofern eine Sterilisation erfolgt, muss diese in einer solchen Weise ausgeführt werden, dass die gewünschten biologischen Aktivitäten entsprechend der vorstehenden Beschreibung möglichst wenig beeinflusst werden. Das Medium kann außerdem bearbeitet werden, um einen oder mehrere Faktoren oder Komponenten, die in dem Medium enthalten sind anzureichern oder zu reduzieren, wie beispielsweise die Anreicherung eines Wachstumsfaktors unter Anwendung der Immununaffinitätschromatographie oder im Gegensatz dazu die Entfernung einer weniger wünschenswerten Komponente für irgendeine vorgegebene Anwendung, wie sie hierin beschrieben wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Formulierungen aus dem Medium erzeugt, das mit Hilfe des dreidimensionalen Zellkonstruktes konditioniert wurde. Die dreidimensionalen Kulturen erzeugen eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Proteinen, die in das Medium in optimalen physiologischen Anteilen und Konzentrationen abgeschieden werden. Siehe hierzu beispielsweise Tabelle 2 in Abschnitt 5.8.1. Das Medium gewährt daher eine einzigartige Kombination von Faktoren und spezifischen Verhältnissen, die nahe an solchen liegen, wie man sie in vivo antrifft. In der Regel wird in dieser Anwendung Rinderserum nicht bevorzugt. Es kann vorzugsweise zur Entfernung von Zelltrümmern oder anderen partikulären Substanzen sowie Proteasen, Milchsäure und anderen Komponenten verwendet werden, die das Zellwachstum nachteilig beeinflussen.
Die konditionierten Medien lassen sich zu Pharmazeutika in Form von Tabletten, Kapseln, Hautpflastern, Inhalationen, Augentropfen, Nasentropfen, Ohrtropfen, Suppositorien, Cremes, Salben, Injektionslösungen, Hydrogelen und zu jeder beliebigen anderen geeigneten Formulierung ansetzen, die in der Fachwelt bekannt ist. Bei oraler Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen beispielsweise die Form von Tabletten oder Kapseln haben, die mit Hilfe konventioneller Mittel mit pharmazeutisch zulässigen Trägersubstanzen hergestellt werden, wie beispielsweise Bindemitteln (z.B. vorgelatinierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Gleitmitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talkum oder Siliciumdioxid); Zerfallmitteln (z.B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglykolat); oder Benetzungsmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat). Tabletten können unter Anwendung von Methoden, die in der Fachwelt bekannt sind, beschichtet werden. Flüssige Präparate zur oralen Verabreichung können die Form beispielsweise von Lösungen haben, Sirupen oder Suspensionen oder sie können als ein trockenes Produkt zum Ansetzen mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor Gebrauch präsentiert werden. Derartige flüssige Präparate lassen sich mit Hilfe konventioneller Mittel mit pharmzeutisch zulässigen Additiven herstellen, wie beispielsweise Suspendiermitteln (z.B. Sorbitolsirupcellulose-Derivate oder gehärtete Speisefette); Emulgiermittel (z.B. Lecithin oder Gummi arabicum); nichtwässrige Vehikel (z.B. Mandelöl, ölige Ester, Ethanol oder fraktionierte Pflanzenöle); sowie Konservierungsmittel (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure). Die Präparate können auch Puffersalze enthalten, Geschmacksmittel, Farbmittel und Süßungsmittel nach Erfordernis.
Die pharmazeutischen Formulierungen der Erfindung können einem Patienten über eine Vielzahl von Wegen unter Anwendung von Standardprozeduren gegeben werden, die in der Fachwelt gut bekannt sind. Beispielsweise kann eine derartige Zustellung ortspezifisch sein, oral, nasal, intravenös, subkutan, intradermal, transdermal, intramuskulär oder als intraperitoneale Verabreichung. Außerdem lassen sie sich so formulieren, dass sie als kontrollierte Vehikel mit verzögerter Freisetzung fungieren.
Therapeutische Produkte, die in den konditionierten Medien enthalten sind, schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: Enzyme, Hormone, Zytokine, Antigene, Antikörper, Gerinnungsfaktoren und regulatorische Proteine. Therapeutische Proteine schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: inflammatorische Mediatoren, angiogene Faktoren, Faktor VIII, Faktor IX, Erythropoietin (EPO), α-1-Antitrypsin, Calcitonin, Glucocerebrosidase, Humanwachstumshormon und Derivate, Lipoprotein geringer Dichte (LDL) und Apolipoprotein E, IL-2-Rezeptor und dessen Antagonisten, Insulin, Globulin, Immunoglobuline, katalytische Antikörper, die Interleukine (IL's), Insulinähnliche Wachstumsfaktoren, Superoxiddismutase, Immunantwort-Modifikatoren, BMP's (knochenmorphogene Proteine), Parathyroidhormon und Interferon, Nervenwachstumsfaktoren, Gewebeplasminogenaktivatoren und kolonniestimulierende Faktoren (CSF's). Selbstverständlich lässt sich das Medium weiter verarbeiten, um einen oder mehrere Faktoren oder Komponenten anzureichern oder zu reduzieren, die in dem Medium enthalten sind, wie beispielsweise eine Anreicherung eines Wachstumsfaktors unter Anwendung der Immunaffmitätschromatographie oder im Gegensatz dazu die Entfernung einer weniger wünschenswerten Komponente für irgendeine vorgegebene Anwendung, wie sie hierin beschrieben wurde.
Zur Prüfung der Aktivität des speziellen Faktors oder der speziellen Faktoren können Assays eingesetzt werden, wie sie üblicherweise in der Fachwelt Anwendung finden, wodurch gewährleistet ist, dass ein akzeptables Niveau der biologischen Aktivität (z.B. eine therapeutisch wirksame Aktivität) durch das anhaftende Molekül oder das gekapselte Molekül erhalten wird.
Damit lassen sich die konditionierten Zellmedien und davon abgeleiteten Produkte, die in der vorliegenden Erfindung erhalten werden, beispielsweise verwenden, um in der Behandlung von Diabetes, Insulin bereitzustellen, bei der Behandlung von Alzheimerkrankheit einen Nervenfaktor bereitzustellen, Faktor VIII und andere Gerinnungsfaktoren für die Behandlung von Hämophilie, Dopamin für die Behandlung der Parkinson'schen Krankheit, Enkephaline über adrenale Chromaffinzellen für die Behandlung chronischer Schmerzen, Dystrophin für die Behandlung von Muskeldystrophie und Humanwachstumshormon für die Behandlung eines anomalen Wachstums.
Die Dosismengen für derartige therapeutische Proteinmittel sind in der Fachwelt gut bekannt und finden sich in pahrmazeutischen Werken, wie beispielsweise PHYSICIANS DESK REFERENCE, Medical Economics Data Publishers; REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co.; GOODMAN & GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, McGraw Hill Publ., THE CHEMOTHERAPY SOURCE BOOK, Williams and Wilkens Publishers.
Die therapeutisch wirksamen Dosismengen irgendwelcher Arzneimittel oder Mittel, wie sie vorstehend beschrieben wurden, lassen sich routinemäßig unter Anwendung von Methoden bestimmen, die in der Fachwelt gut bekannt sind. Eine "therapeutisch wirksame" Dosismenge bezieht sich auf diejenige Menge der Verbindung, die ausreichend ist, um eine Linderung mindestens eines der Symptome der Prozesse und/oder Erkrankungen zu ergeben, die behandelt werden.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der Arzneimittel können mit Hilfe von pharmazeutischen Standardprozeduren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z.B. zur Ermittlung der LD₅₀-Dosis (die lethale Dosis für 50% der Population) und die ED₅₀-Dosis (die in 50% der Population therapeutisch wirksame Dosis). Der Quotient der Dosismengen zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist der therapeutische Index und lässt sich ausdrücken als das Verhältnis von LD₅₀/ED₅₀. Verbindungen, die große therapeutische Indices zeigen, sind bevorzugt. Obgleich Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen zeigen, verwendet werden können, sollte darauf geachtet werden, ein System zur Zustellung zu konzipieren, welches derartige Verbindungen auf die betroffene Stelle des Gewebes richtet, um eine mögliche Schädigung nichtinfizierter Zellen auf ein Minimum herabzusetzen und dadurch Nebenwirkungen zu reduzieren.
Die aus den Zellkulturassays und Tieruntersuchungen erhaltenen Daten können zur Formulierung einer Reihe von Dosismengen für die Verwendung bei Menschen benutzt werden. Die Dosismenge derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, worin der ED₅₀-Wert mit geringer oder keiner Toxizität eingeschlossen ist. Die Dosismenge kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der Dosierungsform variieren, die zum Einsatz gelangt, sowie von dem angewendeten Weg der Verabreichung. Für eine beliebige, in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfangs aus den Zellkulturassays geschätzt werden. In der Zellkultur wird ein Bereich der zirkulierenden Plasmakonzentration bestimmt, indem der IC₅₀-Wert einbezogen ist (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung von Symptomen erreicht). Eine solche Information lässt sich verwenden, um die Dosismengen in Menschen exakter zu bestimmen. Die Mengen im Plasma können beispielsweise mit Hilfe der Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen werden.
Darüber hinaus können Zellen und Gewebe genetisch so bearbeitet werden, dass die Expression eines gewünschten Produktes verstärkt wird, wie beispielsweise Insulin, und/oder Nulceotidsequenzen und/oder Teile exprimiert werden, die vorstehend genannten Genprodukte zum Ziel haben, z.B. Ribozym, Antisense-Moleküle und Triple Helices, die eine inhibitorische Wirkung auf die Targetgenexpression und/oder Aktivität haben können. Dieses könnte dann von Vorteil sein, wenn die zu kultivierenden Gewebe, in denen spezialisierte Stromazellen in dem Medium eine spezielle strukturelle/funktionelle Rolle spielen, z.B. Glialzellen von Nervengewebe, Kupfferzellen von Leber, usw.
5.8.7. STIMULIERUNG VON HAARWUCHS
Das Medium kann unter Verwendung beispielsweise von Humanhaar-Papillarzellen konditioniert werden. Vorzugsweise wird das mit Hilfe solcher Zellen konditionierte Medium in drei Dimensionen aufgezogen. Haar-Papillarzellen sind eine Art von Mesenchym-Stammzelle, die eine entscheidende Rolle in der Haarbildung, dem Haarwuchs und der Wiederherstellung spielt (Matsuzaki et al., "Wound Repair Regen.", 6:524–530 (1998)). Das konditionierte Medium wird vorzugsweise konzentriert und als eine topische Formulierung aufgebracht. Die Zusammensetzungen der konditionierten Medien lassen sich für topische Anwendungen formulieren, indem ein Mittel verwendet wird, das das Eindringen der Verbindung in die Haut erleichtert, wie beispielsweise DMSO, und werden als topischer Auftrag zur Stimulierung des Haarwuchses aufgebracht.
Die in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Zusammensetzungen fördern oder restorieren den Haarwuchs bei topischer Aufbringung, indem sie Wachstumsfaktoren und andere Faktoren bereitstellen, welche die Epithelzellwanderung zu Haarfollikeln verstärken. Darüber hinaus können zusätzlich zu den Wachstumsfaktoren, die in den konditionierten Medien angetroffen werden, andere Verbindungen verwendet werden, wie beispielsweise Minoxidil und Antibiotika. Während des Haarwuchses gibt es eine Verringerung der Blutzufuhr während der Katagenphase (Übergangsphase des Haarfollikels zwischen Wachstums- und Ruhephasen) und Telogenphase (Ruhephase). Biologisch aktive Moleküle, die von dem konditionierten Zellmedium deriviert sind, lassen sich zur Verwendung während dieser Phasen des Haarwuchses ermitteln und optimieren, indem Assays angewendet werden, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich des stumpfschwänzigen Rhesusaffenmodells für männlich androgene Alopezie. Siehe hierzu beispielsweise Brigham, P. A., A. Cappas, und H. Uno, The Stumptailed Macaque as a Model for Androgenetic Alopecia: Effects of Topical Minoxidil Analyzed by Use of the Folliculogram, "Clin. Dermatol.", 1988, 6(4); S. 177–87; Diani, A. R. und C. J. Mills, Immunocytochemical Localization of Androgen Receptors in the Scalp of the Stumptail Macaque Monkey, a Model of Androgenetic Alopecia, "J. Invest Dermatol.", 1994, 102(4), S. 511–4; Holland, J. M., Animal Models of Alopecia, "Clip. Dermatol.", 1988, 6(4); S. 159–162; Pan, H. J., et al., Evaluation of RU58841 as an Anti-Androgen in Prostate PC3 Cells and a Topical Anti-Alopecia Agent in the Bald Scalp of Stumptailed Macaques, "Endocrine", 1998, 9(1), S. 39–43; Rittmaster, R. S. et al., The Effects of N,N-Diethyl-4-methyl-3-oxo-4-aza-5-alpha-androstane-17-beta-carboxamide, a 5-alpha-reductase Inhibitor and Antiandrogen, on the Development of Baldness in the Stumptail Macaque, "J. Clin. Endocrinol Metab", 1987, 65(1), S. 188–93. Weitere Modelle schließen das Messen von Unterschieden in der Haarfollikelproliferation von Follikeln ein, die von kahlen und Haarbereichen kultiviert wurden; das Modell von neugeborenen Ratten sowie ein Rattenmodell für Alopecia areata, siehe Neste, D. V., The Growth of Human hair in Nude Mice, "Dermatol. Clin.", 1996, 14(4); S. 609–17; McElwee, K. J., E. M. Spiers und R. F. Oliver, "In Vivo", Depletion of CD8 + T Cells Restores Hair Growth in the DEBR Model for Alopecia Areata, "Br J Dermatol", 1996, 135(2), S. 211–7; Hussein, A. M., Protection Against Cytosine Arabinowide-Induced Alopecia by Minoxidil in a Rat Animal Model, "Int. J. Dermatol.", 1995, 34(7), S. 470–3; Oliver R. F., et al., The DEBR Rat Model for Alopecia Areata, "J. Invest Dennatol.", 1991, 96(5), S. 978; Michie, H. J. et al., Immunobiological Studies on the Alopecic (DEBER) Rat, "Br. J. Dermatol.", 1990, 123(5), S. 557–67.
6. BEISPIELE
6.1. KONDITIONIERUNG DES MEDIUMS
Es wurden menschliche Dermalfibroblasten auf dem Substrat des Apparates geimpft, der in dem '766-Patent beschrieben wurde und detailliert vorstehend in den Abschnitten 5.3, 5.4 und 5.6 beschrieben wurde. Das Substrat befindet sich im Inneren des Gehäuses, das so bemessen ist, dass das dreidimensionale Gewebewachstum auf der Oberfläche erleichtert wird und die Zellen in einem geschlossenen System mit hohem Gehalt an Glucose-DMEM kultiviert werden (10% BCS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 50 mg/ml Ascorbinsäure) bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂. Nach 10 Tagen wurde die Zellkultur entnommen und frisches Medium zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 4 Tage entsprechend der vorstehenden Beschreibung kultiviert. Das resultierende konditionierte Medium das der Zell- und Gewebekultur für vier Tage (Tage 10 bis 14) exponiert war, wurde sodann aus den einzelnen Kammern entnommen und gepoolt. Das konditionierte Medium (näherungsweise 5 bis 10 l/Pool) wurde in 200 ml-Aliquots gegeben und weiter um das 10- bis 20-fache unter Verwendung einer Überdruck-Konzentrationsvorrichtung mit einem Filter mit einem Rückhaltevermögen von 10.000 MW konzentriert (Amicon, Beverly, MA). Die resultierenden 10 bis 20 ml des eingeengten konditionierten Mediums wurden in 1 ml-Aliquots gegeben und zur Analyse bei –20°C tiefgefroren. Eine 1-fach-Konzentration von konditioniertem Medium resultiert aus einem 10-fach konditionierten Medium, das einem Grundmedium als eine 10%-Lösung (Volumen/Volumen) zugegeben wurde. In ähnlicher Weise ergibt sich eine 1-fach-Konzentration von "Medium" oder "serumfreiem Medium" aus einem 10-fach Medium (d.h. Grundmedium) oder ein 10-fach serumfreies Medium (Grundmedium ohne Serum), das dem Grundmedium als eine 10%ige Lösung (Volumen/Volumen) zugegeben wird und dann für Kontrollen verwendet wird.
6.2. PROLIFERATIONSAKTIVITÄT VON DREIDIMENSIONAL KONDITIONIERTEM MEDIUM
6.2.1. EXPONIERUNG VON FIBROBLASTEN UND KERATINOZYTEN AN KONDITIONIERTEM MEDIUM
Das konditionierte Medium von Abschnitt 6.1. wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit zur Unterstützung der Proliferation von Humanfibroblasten und Keratinozyten untersucht. Es wurden Humanfibroblasten oder Human-Basalkeratinozyten in 96-Mikrotiterplatten geimpft (~5.000 Zellen/Mulde) und kultiviert in reicher Glucose-DMEM (10% BCS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 1-fach antibiotisch/antimykotisch), ergänzt mit 1-fach Konzentration von serumfreiem Medium, Medium oder dreidimensional konditioniertem Medium entsprechend der vorstehenden Beschreibung in Abschnitt 6.1. Die Kulturen wurden bei 37°C in angefeuchteter Atmosphäre mit 5% CO₂ für 3 Tage gehalten.
6.2.2. ZELLULARPROLIFERATION
Die Zellularproliferation wurde unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Farbstoffassays auf Fluoreszensbasis gemessen, bei dem der Gesamtgehalt an Nucleinsäure als eine Schätzung der Zellproliferation gemessen wird (CyQuant Cell Proliferation Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, Or).
Alle Assays wurden entsprechend den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Das Medium wurde durch Blotting entfernt und die Zellen unter Verwendung von Lysispuffer lysiert, der den grünen Fluoreszensfarbstoff enthielt, CyQuant GR-Farbstoff. Der Farbstoff zeigte eine starke Fluoreszensverstärkung bei Bindung an zellularen Nucleinsäuren, wobei der Fluoreszensbetrag proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen Nucleinsäure ist. Die Proben wurden für 5 min in Abwesenheit von Licht inkubiert und die Fluoreszens der Probe unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lasers mit Filtern für die entsprechenden Maxima der Erregung bei etwa 480 nm und Emission bei etwa 520 nm bestimmt. Die Menge der in jeder Probe vorhandenen Nucleinsäure wurde berechnet indem der Betrag der beobachteten Fluoreszens in jeder Mulde mit der Standardkurve verglichen wurde, die von bekannten Konzentrationen von Kälberthymus-DNA als Standard hergleitet wurde.
Wie in 3 gezeigt, ergaben die in dem Medium kultivierten Zellen, das das konditionierte Medium enthielt, eine erhöhte zellulare Proliferation sowohl von Fibroblasten als auch von Keratinozyten im Vergleich zu den zwei Kontrollen.
6.3. MODULATION DER KOLLAGENABSCHEIDUNG IN GEWEBE DURCH DREIDIMENSIONAL KONDITIONIERTES MEDIUM
6.3.1. ANWENDUNGEN ZUR WUNDHEILUNG
Der Einfluss von dreidimensional konditioniertem Medium auf die Herstellung und Zusammensetzung von dreidimensionalen Geweben wurde untersucht, indem die Menge von Kollagen gemessen wurde, die in die extrazellulare Matrix von Geweben hinein abgeschieden wurde, die in Gegenwart von serumfreiem Medium, Medium oder dreidimensional konditioniertem Medium kultiviert wurden.
Es wurden Nylongerüste mit Hilfe des Lasers zu Quadraten von 11 mm × 11 mm geschnitten, in 0,5 M Essigsäure gewaschen, ausgiebig in FBS gespült und mit 12 F klinischen Fibroblasten bei Passage 8 (etwa 38.000/cm²) geimpft. Die Kulturen wurden in 1 ml DMEM (10% BCS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 1-fach antibiotisch/antimykotisch), ergänzt mit 1-fach Endkonzentation von serumfreiem Medium, Medium oder dem dreidimensional konditionierten Medium entsprechend der vorstehenden Beschreibung in Abschnitt 6.1. unter Zugabe von 50 mg/ml Ascorbat zu jeder Beschickung kultiviert. Es wurde Kupfersulfat bis zu einer Endkonzentration von 2,5 ng/ml zugegeben und ein hoher Sauerstoffgehalt (40%, etwa zweifach atmosphärisch) aufrecht erhalten, indem das Begasen eines Standardinkubators reguliert wurde. Es wurden Kulturen (n = 3 oder größer) bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ für 10 Tage gehalten. Ebenfalls einbezogen war eine Ascorbat-Kontrolle.
6.3.2. KOLLAGENISOLATION
Kollagen wurde isoliert und bis nahezu Homogenität von dreidimensionalen Gewebekulturen gereinigt, die in Gegenwart von Grundmedium kultiviert wurden, ergänzt mit einer 1-fach Endkonzentation von serumfreiem Medium, Medium oder dreidimensional konditioniertem Medium entsprechend der vorstehenden Beschreibung. Die Reinheit der fertigen Probenpräparate wurde bestimmt, indem diese den gereinigten Kollagenproben zur Elektrophorese auf Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Gelen unterworfen wurden, die separaten Proteinbande unter Verwendung von Coomassie-blau sichtbar gemacht und der Betrag der Kollagen-spezifischen alpha-, beta- und gamma-Bande im Vergleich zum Gesamtprotein (nachfolgend) ermittelt. Die Reinigungsmethoden lieferten in allen Methoden ähnliche Muster.
Es wurden Proben in PBS, anschließend in sterilern Wasser, gefolgt von 0,5 M Essigsäure für 2 bis 6 Stunden gespült. Die Proben wurden sodann über Nacht in 1 mg/ml Pepsin (Worthington, Inc.) digeriert in 0,012 N HCl bei 4°C. Die Proben wurden durch Zentrifugieren bei 4°C mit 13.000 U/min geklärt. Das Kollagen wurde bei 4°C nach Zugabe von 5 M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,07 M für 30 bis 60 min ausgefällt. Das ausgefällte Kollagen wurde durch Zentrifugieren bei 4°C für 30 bis 60 min bei 13.000 U/min abgetrennt und erneut in 0,012 N HCl suspendiert.
6.3.3. ANALYSE
Das Gesamtprotein wurde unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren, kolorimetrischen Assay-Kits (Pierce, Inc. BCA Assay-Kit) bestimmt und Assays entsprechend den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Als Standard wurden Rinderhaut-Kollagene (In Vitrogen, Carlsbad, CA; Cohesion Technologies, Inc., Palo Alto, CA) verwendet, um das Gesamtprotein quantitativ zu bestimmen.
Sodann wurden die Proben (10 mg) einer SDS-PAGE-Analyse mit Elektrophorese auf 3 bis 8% – Gradientengelen unterzogen. Die Proben von isolierten Kollagenen wurden sodann bis 95°C in reduzierendem Probenpuffer erhitzt. Die Gele wurden mit Coomassie-blau gefärbt und zur Sichtbarmachung vie Computer gescannt.
Wie in 4 gezeigt wird, wurde eine statistisch signifikante (p < 0,05) Erhöhung der Kollagenabscheidung von etwa 50% für dreidimensionale Kulturen festgestellt, die mit dreidimensional konditioniertem Medium behandelt wurden, wobei mit jeder Kontrolle verglichen wurde. Die Aktivität ließ sich nicht dem Vorhandensein von Medium oder Serum allein zuordnen.
Eine derartige verstärkte Abscheidung von Kollagen in vivo findet eine Reihe von Anwendungen, einschließlich Wundheilung, die Behandlung von Falten und Konturlinien, die bei zunehmendem Alter in Erscheinung treten, so wie man auch in der Lage ist, die Matrixabscheidung über knochige Partien zu unterstützen, die in paralysierten oder bettlägrigen Patienten auf Druckgeschwulste anfällig sind.
7. ANTIOXIDATIVE AKTIVITÄT
7.1. EXPONIERUNG EPIDERMALER HAUTZELLEN AN DEM KONDITIONIERTEN MEDIUM
Antioxidansmittel haben die Möglichkeit demonstriert, Zellalterung und -malignität umzukehren/zu verhindern. Die antioxidative Wirksamkeit des dreidimensional konditionierten Mediums wurde an epidermalen Hautzellen des Menschen gemessen. Es wurden Basalkeratinozyten des Menschen (etwa 100.000/Mulde) in Petrischalen in Gegenwart von MCDB 153-Medium (KGM, Clonetics, Inc.), ergänzt mit 1-fach dreidimensionalem konditioniertem Medium, Medium oder serumfreiem Medium-Kontrollen für 3 Tage bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ kultiviert. Das Medium wurde von jeder Probe entfernt, die Zellen aus der Petrischale durch Inkubieren in Gegenwart von Trypsin isoliert (Sanbrook et al., 1989, "Molecular Clonig: A Laboratory Manual", 2. Ausg., Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, NY), gefolgt von einer Zentrifugation.
7.2. FACS-ANALYSE
Die isolierten Zellen wurden in Gegenwart von 1 mM Dihydrorhodamin-1,2,3 (Molecular Probes, Eugene, Or) bei 37°C für 30 min inkubiert und anschließend mit Hilfe der FACS (Fluoreszens-aktiviertes Zellsortieren)-Analyse unter Verwendung eines FACSCAN-Apparates nach Becton-Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey) entsprechend den Anweisungen des Herstellers analysiert. Der Betrag der intrazellulären Oxidation des reduzierten Dihydrorhodamin-Farbstoffes ist direkt proportional zum Betrag der nachweisbaren intrazellularen Fluoreszens des oxidierten Zustandes des Farbstofes.
7.3. ERGEBNISSE
Es wurden Humankeratinozyten an dem erfindungsgemäßen konditionierten Zellmedium exponiert und zeigten eine statistisch signifikante (p < 0,0003) 50%ige Verringerung der intrazellularen Oxidation im Vergleich zu den gleichen Zellen, die in Gegenwart von serumfreiem oder Serum enthaltendem Medium (siehe 5) inkubiert wurden. Die beobachtete Differenz schien nicht auf Serumfaktoren oder Ascorbinsäure zurückzuführen zu sein, die in den Kontrollproben vorhanden waren. Daher kann eine topische Verabreichung von durch dreidimensionale Kulturen konditioniertem Medium als ein Kosmetikum zur Behandlung oder Umkehrung der Einflüsse von alternden Zellen nützlich sein.
8. TEST MIT OKKLUSIVEM PFLASTER ZUR BEWERTUNG DER IN VIVO-WIRKUNGEN EINER BIOTECHNISCH BEARBEITETEN KOSMETISCHEN NÄHRSTOFFLÖSUNG FÜR MENSCHLICHE HAUT
8.1. VERSUCHSAUFBAU
Es hatten sich sechs erwachsene Frauen (im Alter von 30 bis 60 Jahren) in gutem Gesundheitszustand bereiterklärt. Die Ausschlusskriterien schließen Sensitivität auf Proteine, Hautkrankheiten, verletzte Haut in oder in der Nähe der Teststellen, Diabetes, Nieren-, Herz- oder immunologische Erkrankungen, die Verwendung von entzündungshemmenden, immunsuppressiven, Antihistamin- oder topischen Arzneimitteln oder Kosmetika und Schwangerschaft ein. Die Testobjekte wurden den Teststellen (2 Stellen, 3,8 cm²) auf dem rechten oder linken Unterarm jeder Versuchsperson nach einem Rotationsschema zugeordnet, um Positionswechsel oder Reihenfolge auf ein Minimum zu verringern. Die Stelle 1 erhielt eine Vehikelkontrolle und die Stelle 2 eine Behandlung (d.h. mit konditioniertem Medium). Die Okklusionspflaster bestanden aus einem Webril-Verbandswattebausch mit entweder 0,2 ml Vehikel oder Behandlungslösung. Die Pflaster wurden abgedeckt und von einem hypoallergenen Okklusionsverband aus Kunststoff von 3M gehalten. Die Okklusionspflaster wurden täglich auf den Unterarmen von drei Versuchspersonen für 5 aufeinanderfolgende 24-Stunden-Perioden in Position gebracht. Die übrigen drei Versuchspersonen wurden täglich für 12- und anschließend für 24-Stunden-Perioden mit Pflaster versehen (bei weitergeführter Behandlung). An dem Tag nach der letzten Aufbringung des Pflasters wurde eine 2mm-Biopsie von jeder Stelle entnommen. Dieses Protokoll wurde von der IRB für die wissenschaftliche Organisation des California Skin Research Institute (San Diego, Ca.) genehmigt und stand in Übereinstimmung mit Punkt 21 der CFR, Teile 50 und 56.
8.2. BEWERTUNGEN
Mikroskopische Untersuchungen wurden unterteilt in glasigwerden, sich schälend, verschorfen, rissbildend, Hyperpigmentation und Hypopigmentation. Die Reizung wurde visuell unter Verwendung einer 5-Punkte-Skala bewertet und numerisch unterteilt auf Erythem, Ödem, Papeln und Bläschen (> 25% der Pflasterstelle) und identifizierbare Reaktionen (< 25% der Pflasterstelle), d.h. blasenbildende Reaktion mit oder ohne Nässen, ausbreitung und Verhärtung. Die H & E histologische Bewertung durch ein zertifiziertes Gremium von Pathologen schloss Parameter für die entwicklungsfähige epidermale Dicke ein, für epidermale Hyperplasie (Acanthosis), Granularzellen-Schichtdicke, inflammatorisches Infiltrat, mitotische Zeichen, Auftreten von Kollagen und elastischen Fasern und Gefäßbildung.
8.3. ERGEBNISSE
Durch das konditionierte Medium oder die Kontrolle wurden in drei Versuchspersonen, die eine 5-tägige Behandlung erhielten, keine nachteiligen Ereignisse ausgelöst. Die Mittelwerte der Bewertungen für die tägliche Reizung für die Nährstofflösung (0,3) und die Kontrollen (0,2) zeigten für beide Stellen oftmals keine sichtbare Reaktion oder Erythema oder zeigten geringfügige, konfluente oder fleckige Erythema. Die Histologie (Trichrom-Kollagenfärbung) zeigte ein gesundes Gewebe bei allen gemessenen Parametern. Damit zeigte das konditionierte Medium annehmbare Wirkungen auf die menschliche Haut.
9. MODULATION DES HUMAN-ENDOTHELZELLVERHALTENS
Die Einflüsse des konditionierten Mediums und der Humanmatrix, die von Matrix gebundenen Fibroblasten bei Angiogenese und Endothelzellmotilität erzeugt wurden, wurden ermittelt. Das konditionierte Medium wurde durch eine Passage durch die hierin beschriebene dreidimensionale Fibroblastkultur erzeugt (beschrieben in den Abschnitten 5,3, 5,4 und 5,6) und wurde entweder konzentriert (10-fach) oder lyophilisiert. Nach der Erzeugung wurde die extrazellulare Humanmatrix physikalisch von dem Gewebe entfernt.
9.1. ASSAY DER ENDOTHELZELL-TUBULIBILDUNG
Zur Bewertung der Angiogenese wurde ein Assay auf Endothelzell-Tubulibildung mit Umbilikalvenen-Endothelzellen (HUVEC) verwendet. Die Co-Kultur von HUVEC mit lyophilisiertem konditioniertem Medium bewirkte eine Zunahme der Tubulibildung im Vergleich zu der Negativkontrolle (vorkonditioniertes Medium) von 4,9 ± 9,31 mm bzw. 0,00 ± 0,00 mm; konzentriertes Medium erhöhte die Tubulibildung auf 44,10 ± 1,75 mm; und die extrazelluläre Humanmatrix erhöhte die Tubulibildung auf 39,3 ± 5,6 mm.
9.2. WUNDHEILUNGSASSAY
Es wurde eine konfluente Schicht von Endothelzellen aufgekratzt und die Geschwindigkeit des Schließens der resultierenden "Wunde" gemessen und zur Bewertung der Zellmotivität verwendet. Der "Wundheilungs"-Assay wurde als die Geschwindigkeit der Schließung in mm/h (Millimeter/Stunde) gemessen. Endothelzellen, die mit lyophilisiertem Medium behandelt wurden, zeigten eine Geschwindigkeit von 25,59 ± 12,907 mm/h; das konzentrierte Medium zeigte eine Geschwindigkeit von 39,56 ± 15,87 mm/h. Die extrazelluläre Humanmatrix zeigte keine Zunahme der Geschwindigkeit im Vergleich zu der Negativkontrolle (vorkonditioniertes Medium) mit 0,00 mm/h bzw. 27,96 ± 10,01 mm/h für extrazelluläre Humanmatrix und Negativkontrolle.
Wie anhand der Änderungen der Angiogenese (Assay der Tubulibildung) und der Zellmotilität (bewertet unter Anwendung des "Wundheilungsassays") veranschaulicht wird, ist das konditionierte Medium der Erfindung in der Lage, das Verhalten von Human-Endothelzellen zu verändern.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend: (a) Kultivieren von Fibroblastenzellen in drei Dimensionen zur Bildung eines dreidimensionalen Stromagewebes in einem Zellkulturmedium, das zur Deckung der zum Züchten der Zellen in vitro erforderlichen Nährstoffbedürfnisse ausreichend ist, und worin die Stromazellen an einem sich aus einem zu einer dreidimensionalen Struktur geformten biokompatiblen, nicht lebenden Material zusammensetzenden Gerüst haften und es im Wesentlichen einhüllen; (b) Kultivieren der Zellen in vitro, bis das Zellkulturmedium eine gewünschte Menge extrazellulärer Produkte enthält, damit ein konditioniertes Medium gebildet wird; (c) Entfernen des konditionierten Mediums von zum Konditionieren des Mediums verwendeten Zellen; und (d) Kombinieren des konditionieren Mediums mit einem pharmazeutischen Träger.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das konditionierte Medium aus einem kontinuierlichen Durchflusssystem zurückgewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das konditionierte Medium in einem aseptischen Milieu kultiviert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das konditionierte Zellmedium in der Form oder verarbeitet in den Zustand einer Flüssigkeit, eines Feststoffs, eines Lyophilisats, eines Pulvers, Gels oder Films vorliegt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das konditionierte Medium weiter verarbeitet wird, um ein oder mehr im Medium enthaltene(s) Produkt(e) zu konzentrieren oder zu reduzieren.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Verfahren die Reduktion oder Anreicherung von einem oder mehr extrazellulären Produkten) umfasst, die aus den konditionierten Medien anhand von Proteintrennungsverfahren, einschließlich Immunaffmitäts-Chromatographie, Gelchromatographie, Ionenaustausch-, Metallchelat-Affinitätschromatographie, HPLC-Reinigungs- und hydrophober Interaktionschromatographie gewonnen werden.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das/die extrazelluläre(n) Produkt(e) ein extrazelluläres Matrixprotein darstellt/darstellen.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das/die extrazelluläre(n) Produkt(e) einen Wachstumsfaktor, einen antiinflammatorischen Mediator, ein Enzym, ein Cytokin, ein Hormon, ein Antigen, einen Antikörper, einen Gerinnungsfaktor, einen Regulationsfaktor, einen angiogenen Faktor oder einen antiangiogenen Faktor darstellt/darstellen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das dreidimensionale Gerüst ein Netz, einen Schwamm oder ein polymerisiertes Hydrogel umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Fibroblastenzellen genetisch manipulierte Zellen umfassen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die genetisch manipulierten Zellen mit einem exogenen Gen unter der Kontrolle eines Expressionselements transfiziert werden, damit das exogene Genprodukt in das konditionierte Medium exprimiert und sezerniert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin Parenchymzellen auf dem dreidmensionalen Stromagewebe zur Bildung einer gewebespezifischen dreidimensionalen Gewebekultur kultiviert werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Parenchymzellen Haut-, Leber-, Nieren-, Nerven-, Pankreas-, Darm-, Urogenital-, Nieren-, Milz-, Knochen-, Knochenmarks- oder Mukosazellen darstellen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Parenchymzellen genetisch manipulierte Zellen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die genetisch manipulieren Zellen mit einem exogenen Gen unter der Kontrolle eines Expressionselements transfiziert werden, damit das exogene Genprodukt in das konditionierte Medium exprimiert und sezerniert wird.
Verfahren zur Isolierung von Kollagen, umfassend: (a) Präzipitieren von Prokollagen aus dem durch eine dreidimensionale Kultur bei hohen Salzbedingungen unter neutralen pH-Bedingungen konditionierten Medium; (b) Entfernen der Propeptide unter sauren Bedingungen, damit die Tripelhelix des Kollagens intakt bleibt; und (c) Präzipitieren des Kollagens bei hohen Salzkonzentrationen.