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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Untersuchungen zum Nachweisen von Nucleinsäure-Markern
von Krebs mit hoher Nachweisspezifität und hoher Nachweisempfindlichkeit.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Man
glaubt, dass Krebs von einem vielschrittigen Prozess herrührt, der
typischerweise mehrere genetische Mutationen, die zu unkontrolliertem
Zellwachstum führen,
umfasst. Viele Krebsarten sind heilbar, wenn sie früh in ihrer
Entwicklung entdeckt werden. Kolorektale Krebsarten beispielsweise
entstehen typischerweise im Kolonepithel und sind während frühen Entwicklungsstadien
nicht umfangreich mit Blutgefäßen versorgt (und
daher nicht invasiv). Der Übergang
zu einem hochgradig mit Blutgefäßen versorgten,
invasiven und schließlich
metastatischen Krebs dauert üblicherweise
10 Jahre oder länger.
Wenn das Vorliegen von Krebs vor der umfangreichen Versorgung mit
Blutgefäßen nachgewiesen
wird, stellt eine chirurgische Entfernung typischerweise eine wirkungsvolle
Heilung dar. Kolorektaler Krebs wird jedoch oft erst beim Auftreten
klinischer Symptome, wie Schmerzen und blutiger Stuhl, nachgewiesen.
Im Allgemeinen liegen derartige Symptome erst vor, wenn die Krankheit
gut ausgebildet ist, und oft nachdem Metastase stattgefunden hat.
In ähnlicher
Weise sind, mit Ausnahme des Pap-Abstrichs zum Nachweis prämaligner
Cervixläsionen,
diagnostische Untersuchungsverfahren für andere Arten von Krebs zum
Nachweisen einer ausgebildeten Krankheit am besten.
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Die
meisten diagnostischen Untersuchungen auf Krebs sind invasiv oder
zumindest unangenehm. Invasive Prozeduren reichen von der Durchführung einer
Gewebebiopsie bis zum chirurgischen Eingriff. Krebsuntersuchungsverfahren
führen
häufig
zu beträchtlichen
Unannehmlichkeiten für
den Patienten. Beispielsweise erfordert eine Magnetresonanz-Abbildung
eine Beengung des Patienten, und eine Kolonoskopie erfordert eine
Sedierung. Die mit typischen invasiven Untersuchungsverfahren verbundene
Unannehmlichkeit verringert das Patienten-Einverständnis mit
Routine-Untersuchungsverfahren.
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Darüber hinaus
führt die
Untersuchung zur Früherkennung
von Krebs (d.h. vor dem Einsetzen von Symptomen und/oder Metastase)
oft zu einem unannehmbaren Anteil an falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen.
Die Wahrscheinlichkeit eines falsch-positiven Testergebnisses ist
eine Funktion der Spezifität des
Tests. Die Spezifität
eines Tests (ausgedrückt
als ein Prozentsatz) ist die Wahrscheinlichkeit, dass irgendein
Individuum, das krankheitsmäßig negativ
ist, im Test auf diese Krankheit negativ ist. Andererseits sind falsch-negative
Ergebnisse eine Eigenschaft der Empfindlichkeit des Tests. Die Empfindlichkeit
(ebenfalls ausgedrückt
als ein Prozentsatz) liefert die Wahrscheinlichkeit, dass ein Test
auf eine spezifische Krankheit ein Individuum, das die Krankheit
hat, als positiv identifiziert. So werden bei Verwendung einer Untersuchung
mit einer Spezifität
von 95% 5% der Individuen, bei denen bestimmt wurde, dass sie eine
Krankheit haben, die Krankheit tatsächlich nicht haben. In ähnlicher
Weise wird eine Untersuchung mit einer Empfindlichkeit von 95% ein
erkranktes Individuum zu 5% der Zeit fälschlich als krankheitsfrei
identifizieren.
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Die
Probleme der Empfindlichkeit und der Spezifität sind bei Untersuchungen zur
Früherkennung
von Krebs stark vergrößert, weil
Proben von Patienten, an denen eine derartige Früherkennung durchgeführt wird, typischerweise
relativ kleine Mengen an kanzerösem
zellulären
Materiel in Beziehung zu nicht-kanzerösem zellulären Material enthalten. In
vielen Fällen
sind Proben von Patienten ein heterogenes Gemisch großer Mengen
an normalen Zellen und kleiner Mengen an kanzerösen Zellen. Ein gutes Beispiel
für eine
derartige heterogene Probe ist Stuhl. Die typische Stuhlprobe enthält Zellen
und zelluläre
Bruchstücke,
die von dem Kolonepithel abgeschilfert wurden, Nebenprodukte der
Verdauung und Bakterien. Man geht davon aus, dass kolorektaler Krebs
in seinen frühen
Stadien nur etwa 1% der Kolonepithelzellen befällt. Jeglicher Versuch, Nucleinsäuren von
den 1% befallenen Zellen vor dem heterogenen Hintergrund der Stuhlprobe
nachzuweisen, könnte
Anlass zu sehr niedrigen Empfindlichkeiten geben. Versuche, das
Vorliegen der Indizien für
Krebs in anderen heterogenen Proben, wie Sputum, Eiter, Urin, Brustwarzenaspirat,
etc., zu identifizieren, werfen ähnliche
Probleme auf.
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Kürzlich wurde
eine Anzahl genetischer Mutationen mit Krebs in Verbindung gebracht.
Beispielsweise glaubt man, dass Veränderungen in dem Gen p53, dem
Onkogen Kras und dem Tumorsuppressorgen apc Beteiligte an dem vielschrittigen
Weg sind, der zu Krebs führt.
Es wurde vorgeschlagen, dass Mutationen in jenen Genen eine Basis
für molekulare
Untersuchungen auf die frühen
Stadien bestimmter Arten von Krebs darstellen könnten. Siehe z.B. Sidransky
et al., Science, 256: 102–105
(1992). Es wurden Versuche gemacht, Nucleinsäure-Marker, die ein Anzeichen
für Krebs
sind, zu identifizieren und zu verwenden. Selbst wenn solche Marker
gefunden werden, hat sich ihre Verwendung zur Untersuchung von Proben
für Patienten,
insbesondere heterogener Proben, jedoch entweder wegen einer Unmöglichkeit,
ausreichend Probenmaterial zu bekommen, oder wegen der niedrigen
Empfindlichkeit, die sich aus der Messung nur eines einzigen Markers
ergibt, als nicht erfolgreich erwiesen. Beispielsweise hat es sich
als schwierig erwiesen, einfach passende menschliche DNA aus einer
Art von heterogener Probe (Stuhl) zu erhalten. Siehe Villa et al.,
Gastroenterol., 110: 1346–1353 (1996)
(die berichten, dass nur 44,7% aller Stuhlproben und nur 32,6% der
Stühle
von gesunden Individuen ausreichend DNA für eine Mutationsanalyse erzeugten).
Andere Berichte, bei denen passende DNA erhalten wurde, haben eine
geringe Empfindlichkeit beim Identifizieren des Krankheitsstatus
eines Patienten auf der Basis einer einzigen, mit Krebs in Verbindung
stehenden Mutation berichtet. Siehe Eguchi et al., Cancer, 77: 1707–1710 (1996)
(unter Verwendung einer p53-Mutation als ein Marker für Krebs).
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Sidransky
et al. (Science 278, 7. November 1997, 1054–1058) offenbart Marker auf
Nucleinsäure-Basis
zur Verwendung beim Nachweis von Krebs, sowie Einschränkungen
ihrer klinischen Verwendung.
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Dementsprechend
gibt es in der Technik ein Bedürfnis
nach hochempfindlichen, hochspezifischen Untersuchungen zum Nachweisen
molekularer Indizien bzw. Anzeichen für Krebs, insbesondere in heterogenen Proben.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Verfahren
der Erfindung lösen
das Problem, genaue (hochempfindliche und hochspezifische) Ergebnisse
in einer Untersuchung bzw. einem Assay hinsichtlich Indizien für Krebs
oder eine Krebsvorstufe in einer heterogenen Probe zu erhalten.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Untersuchungen, die an Proben durchgeführt werden,
die von Körperausscheidungen
und Körperflüssigkeiten
erhalten wurden, auf Krebs oder eine Krebsvorstufe bereit, wobei
die Untersuchungen eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Krebs
oder einer Krebsvorstufe, wenn er (sie) in einer Patienten-Probe
vorhanden ist, und eine hohe Spezifität gegen falsch-positive Ergebnisse
haben. In einer bevorzugten Ausführungsform
ergeben Verfahren der Erfindung die Vorteile einer hohen Empfindlichkeit und
einer hohen Spezifität
bei einer Untersuchung zum Nachweisen einer kleinen Menge eines
Krebs-Markers (z.B.
einer Nucleinsäure)
in einer heterogenen Probe mit vorwiegend nicht-kanzerösen Zellen
und zellulären Bruchstücken. Dementsprechend
sind solche Verfahren insbesondere nützlich zur Früherkennung
von Krebs oder einer Krebsvorstufe. Verfahren der Erfindung erhöhen stark
die Genauigkeit molekularer Durchmusterungsuntersuchungen und diagnostischer
Untersuchungen zur Früherkennung
von Krebs oder einer Krebsvorstufe.
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Die
vorliegende Erfindung betrachtet es als einen Grund, dass nicht-invasive
Verfahren des Stands der Technik (d.h. Verfahren, die an Proben
durchgeführt
wurden, die nicht-invasiv oder minimal-invasiv erhalten wurden)
zum Nachweisen molekularer Indizien (insbesondere Nucleinsäure-Mutationen)
für Krebs
dabei versagt haben, zufriedenstellende Ergebnisse zu liefern, dass
derartige Verfahren sich nicht der Aufrechterhaltung einer hohen
Spezifität
und/oder einer hohen Empfindlichkeit bei der Untersuchung gewidmet
haben. Derartige Verfahren versagen auch dabei, die Vorteile der
Verbindung der Merkmale hoher Empfindlichkeit und hoher Spezifität in einer
Untersuchung zum Nachweisen früher
Indizien für
Krebs, insbesondere wenn der Nachweis in einer heterogenen Probe
durchgeführt
wird, zu erkennen. Die vorliegende Erfindung erkennt, dass Durchmusterungsuntersuchungen
auf Indizien für
Krebs, insbesondere Krebs im Frühstadium
(z.B. wenn Krebsindizien etwa 1% der Zellen und der zellulären Bruchstücke in ei ner
geeigneten Probe darstellen, wie unten diskutiert), durch Erhöhen der
Spezifität
und/oder der Empfindlichkeit des Assay verbessert werden. Wie unten
beschrieben, kann die Spezifität
und die Empfindlichkeit molekularer Untersuchungen auf mehrere Arten verbessert
werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen von Krebs oder einer
Krebsvorstufe bereitgestellt, aufweisend das Durchmustern bzw. Untersuchen
einer Probe eines Patienten, die nicht-invasiv oder minimal-invasiv
erhalten wurde, auf das Vorliegen eines oder mehrerer Nucleinsäure-Indizien,
die auf Krebs oder eine Krebsvorstufe hinweisen, dadurch gekennzeichnet,
dass die Nucleinsäure-Indizien ausgewählt werden
aus (a) der Länge
der Nucleinsäuren
in der Probe; und (b) dem Verhältnis
von Nucleinsäuren
mit einer Länge
von mehr als etwa 200 bp zu Nucleinsäuren mit einer Länge von
weniger als etwa 200 bp in der Probe; wobei sich die Länge und
das Verhältnis
bei Patienten mit Krebs oder einer Krebsvorstufe und Patienten,
die keinen Krebs oder keine Krebsvorstufe haben, unterscheiden,
und wobei die Probe von Körperausscheidungen
oder von Körperflüssigkeiten
erhalten wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
analysieren Durchmusterungsuntersuchungen der Erfindung mindestens
zwei, und bevorzugt zwischen etwa drei und etwa zwanzig, Marker
(z.B. Mutationen, Verlust an Heterozygosität, Sequenzlängenvariationen, Nucleinsäure-Molekulargewichtsvariationen,
Variationen der Mengen an amplifizierbarer Nucleinsäure) in
Patienten-Proben, um die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises
zu verbessern. Derartige „Mehrfachziel"-Untersuchungen erlauben
eine verbesserte Empfindlichkeit, weil die erhöhte Anzahl an Markern, die
analysiert werden, die Wahrscheinlichkeit verringert, dass ein Patient,
der Indizien für
Krebs oder eine Krebsvorstufe aufweist, fälschlich als negativ (d.h.
als krebsfrei) diagnostiziert wird.
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Verfahren
der Erfindung umfassen auch das Kombinieren eines Nachweises einer
Mutation, die dafür bekannt
ist oder von der vermutet wird, dass sie mit Krebs oder einer Krebsvorstufe
in Verbindung steht, mit dem Nachweis eines Verlusts an Heterozygosität an einem
relevanten genomischen Locus. Die Kombination des Analysierens sowohl
von Mutationen bei Krebs-assoziierten Nucleinsäuren, als auch eines Verlusts
an Heterozygosität
erhöht
die Spezifität
und die Empfindlichkeit einer beliebigen Durchmusterungsuntersuchung
für Krebs
oder eine Krebsvorstufe. In einer bevorzugten Ausführungsform
beträgt
die Empfindlichkeit der Untersuchung mindestens 50%, und die Spezifität der Untersuchung
beträgt
mindestens 85%.
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Verfahren
der Erfindung umfassen das Kombinieren von zwei oder mehr Untersuchungen
auf molekulare Indizien für
Krebs oder eine Krebsvorstufe, um ein gewünschtes Informationswert-Niveau
zu erreichen. Beispielsweise umfassen in einer bevorzugten Ausführungsform
Verfahren der Erfindung das Kombinieren von zwei oder mehr Untersuchungen,
die aus quantitativer PCR, multipler Mutationsanalyse, dem Nachweis
eines Verlusts an Heterozygosität
und einer Hybridisierungsbindung eines oder mehrerer mutierter Nucleinsäure-Marker
ausgewählt
werden. Dementsprechend wird eine erhöhte Empfindlichkeit und eine
erhöhte
Spezifität
beobachtet, wenn eine Untersuchung auf der Basis der Menge an amplifizierbarer
DNA mit einer Untersuchung hinsichtlich einer bestimmten Krebs-assoziierten
Mutation kombiniert wird. Beispiele für diese „Kombinationsassays" und ihre sich ergebenden
Empfindlichkeiten und Spezifitäten
sind in der genauen Beschreibung angegeben. Derartige Verfahren
sind insbesondere nützlich,
wenn sie auf eine heterogene Probe angewendet werden, in der die
nachzuweisende Nucleinsäure
relativ zu anderen Nucleinsäuren
(sowie anderen Molekülen)
in der Probe in einer sehr kleinen Menge vorliegt.
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Verfahren
der Erfindung machen auch vom „Informationswert" von hierin verwendeten
Markern Gebrauch. Der Informationswert eines Nucleinsäure-Markers
betrifft die Wahrscheinlichkeit, den Marker in einer positiven Probe
zu finden. So bedeutet es, wenn eine bestimmte Mutation, beispielsweise
eine Mutation im Codon 12 von Kras, einen Informationswert für Krebs
von 56% hat, dass 56% der positiven Patienten-Proben (d.h. jenen,
die von Patienten genommen wurden, die Krebs haben) die Kras-Mutation
haben. Verfahren der Erfindung kombinieren die Verwendung von informativen
Markern (z.B. Mutationen) und von Untersuchungen hoher Empfindlichkeit/Spezifität, um verlässliche
Durchmusterungsuntersuchungen zur Frühdiagnose von Krebs oder einer
Krebsvorstufe, insbesondere in heterogenen Proben, bereitzustellen.
Für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine Mutation eine Deletion,
eine Addition, eine Substitution, eine Umordnung oder eine Translokation
bei einer Nucleinsäure.
Ein Verlust an Heterozygosität
ist eine Mutationsform, bei der ein ganzes Allel oder ein Teil eines
Allels weggelassen wird. Ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung umfassen die Be griffe „Marker", „Ziele" und „Mutationen" Nucleinsäure (insbesondere
DNA)-Mutationen (Substitutionen, Additionen, Umordnungen, Translokationen,
Deletionen, etc.) sowie andere Nucleinsäure-Indizien, die bei Verfahren
der Erfindung brauchbar sind. Derartige Indizien umfassen die Menge
an amplifizierbarer Nucleinsäure
in einer Probe, die Länge
der Nucleinsäuren
in einer Probe, das Verhältnis
von langen Nucleinsäuren
(mehr als etwa 200 bp) zu kurzen Nucleinsäuren (weniger als etwa 200
bp) und irgendwelche anderen Nucleinsäure-Variationen, die sich bei
Patienten mit Krebs und krankheitsfreien Patienten unterscheiden.
Ebenfalls für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollen die Begriffe „gesund" oder „krankheitsfrei" einen Patienten
bedeuten, der keinen Krebs oder keine Krebsvorstufe hat.
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Stuhl
ist ein gutes Beispiel für
eine heterogene Probe, bei der Verfahren der Erfindung besonders brauchbar
sind. Eine typische Stuhlprobe enthält Patienten-Nucleinsäuren, enthält aber
auch heterologe Nucleinsäuren,
Proteine und andere zelluläre
Bruchstücke,
die mit der lytischen Funktion der verschiedenen Nucleasen, Proteinasen,
etc., die im Kolon zu finden sind, vereinbar sind. Stuhl wird (unter
normalen Umständen) fest,
wenn er sich vom proximalen Kolon zum distalen Kolon bewegt. Wenn
der sich verfestigende Stuhl durch das Kolon hindurch geht, werden
Kolon-Epithelzellen auf den Stuhl abgeschilfert. Wenn ein Patient
einen sich entwickelnden Tumor oder ein Adenom hat, werden Zellen
des Tumors oder des Adenoms ebenfalls auf den Stuhl abgeschilfert,
und sie (oder ihre Bruchstücke)
enthalten molekulare Krankheitsindizien (z.B. Mutationen oder Verlust
an Heterozygosität).
In den frühen
Entwicklungsstadien macht Nucleinsäure, die ein Adenom oder einen
Tumor anzeigt, nur etwa 1% der Nucleinsäure in einem entleerten Stuhl
aus. Wenn ein Patient unbehandelt bleibt, findet man im Lauf der
Zeit proportional mehr mit der Krankheit im Zusammenhang stehende
Nucleinsäuren.
Verfahren der Erfindung sind nützlich
zum Nachweisen von Läsionen
im Frühstadium
in heterogenen Proben wie Stuhl. Verfahren der Erfindung führen zu
einem hohen Grad an Empfindlichkeit und Spezifität zum Nachweis einer Krankheit
im Frühstadium.
Verfahren der Erfindung sind insbesondere nützlich zum Nachweisen von,
beispielsweise, Adenomen im Kolon. Adenome sind nicht-metastatische
Läsionen,
die oft das Potenzial zur Metastase haben. Wenn alle Adenome in
einem Patienten nachgewiesen und entfernt werden, ist die Wahrscheinlichkeit
einer völligen
Heilung praktisch sicher.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden Nucleinsäuren
oder Nucleinsäure-Mutationen mit einem
hohen Grad an Informationswert ausgewählt. Es wird (werden) eine
oder mehrere Untersuchung(en) durchgeführt, um eine oder mehrere informative
Nucleinsäuren
zuverlässig
nachzuweisen, und eine Diagnose wird auf der Basis des Vorliegens
irgendeiner der informativen Nucleinsäuren in einer Patientenprobe
erstellt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nucleinsäuren auf
der Basis ihrer Länge
und/oder Sequenz-Charakteristiken als Ziele zur Analyse in Verfahren
der Erfindung ausgewählt.
Beispielsweise wurde nun herausgefunden, dass die Menge und/oder
Länge von
Nucleinsäuren
in Stuhl (einer prototypischen heterogenen Probe) einen hohen Grad
an Informationswert bezüglich
des Krankheits-Status eines Patienten aufweist. Patienten, die beispielsweise
ein Adenom haben, erzeugen Stuhlproben, die mehr und längere DNA
enthalten als Proben, die von gesunden Patienten erzeugt wurden.
Darüber
hinaus ist eine Anzahl hochgradig informativer DNA-Mutationen in
Verfahren der Erfindung nützlich.
Dazu gehören
Mutationen in dem Onkogen, Kras (insbesondere Mutationen in den
Codonen 12 und 13); Mutationen in dem Zellzyklus-Regulator, p53;
Mutationen in dem Gen apc; Mutationen in dem Segment bat-26 des
Fehlpaarungs-Reparaturgens MSH2; und Verlust an Heterozygosität (typischerweise
durch einen massiven Verlust an DNA in einem Allel, aber nicht dem
anderen, angezeigt). Schließlich
sorgen Verfahren der Erfindung dafür, dass der Informationswert
einer Untersuchung erhöht
wird, indem sie mehrere Mutationen gleichzeitig oder in Folge durchmustern,
oder indem sie unterschiedliche Untersuchungen kombinieren.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
stellen Verfahren der Erfindung informative molekulare Untersuchungen
auf Krebs oder eine Krebsvorstufe bereit, indem sie Proben zur Analyse
liefern, die ausreichend amplifizierbare Nucleinsäure haben.
So umfassen Verfahren der Erfindung, in einer Ausführungsform,
das Durchmustern von Proben auf amplifizierbare DNA; das Klassifizieren
von Proben auf der Basis der Menge an DNA, die aus ihnen amplifiziert
werden kann; und das weitere Durchmustern der Proben mit einer vorbestimmten
Schwelle an amplifizierter oder amplifizierbarer DNA hinsichtlich
des Vorliegens einer Mutation, die Krebs oder eine Krebsvorstufe
anzeigt.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
umfassen Verfahren der Erfindung das Auswählen eines oder mehrerer Mutationsereignisse,
die Krebs oder eine Krebsvorstufe anzeigen, so dass der vereinigte Informationswert
des einen Ereignisses oder der mehreren Ereignisse einem vorbestimmten
oder gewünschten
Informationswert-Niveau entspricht oder es überschreitet. Der Informationswert
irgendeiner Mutation oder einer Kombination von Mutationen kann
durch eine akzeptierte invasive Durchmusterungstechnik bestätigt werden.
Beispielsweise kann in Verfahren zum Nachweisen von kolorektalem
Krebs der Informationswert einer molekularen Untersuchung durch
Identifizieren einer Läsion
unter Verwendung einer Kolonoskopie bestimmt werden.
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Eine
genaue Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung
ist unten angegeben. Andere Ausführungsformen
der Erfindung werden bei der Durchsicht der genauen Beschreibung,
die folgt, offenkundig.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Polyacrylamidgel, das beispielhaft Amplifizierungen „A", „B", „C" und „F" zur Verwendung in
Untersuchungen zur Bestimmung einer Menge an amplifizierbarer Nucleinsäure in einer
Probe zeigt. Die Bahnen 1, 4, 5, 6 und 7 zeigen eine Amplifizierung „A", Bahn 2 zeigt eine
Amplifizierung „C", Bahn 3 zeigt eine Amplifizierung „B", und Bahn 8 zeigt
eine Amplifizierung „F" (keine amplifizierbare
DNA).
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Verfahren
der Erfindung stellen nicht-invasive oder minimal-invasive Untersuchungen
zum Nachweis von Krebs oder einer Krebsvorstufe in frühen Stadien
der Krankheit bereit. Verfahren der Erfindung sind insbesondere
nützlich
zum Nachweisen von Krebs oder einer Krebsvorstufe in heterogenen
biologischen Proben. Bevorzugte Verfahren umfassen das Identifizieren
einer oder mehrerer Nucleinsäure-Mutation(en),
die eine hohe Empfindlichkeit und eine hohe Spezifität zum Nachweis
der Anzeichen für
Krebs oder eine Krebsvorstufe ergibt (ergeben), in einer Patienten-Probe.
Verfahren der Erfindung können
das Identifizieren von Mutationen mit einem bekannten Informationswert
für Krebs
oder eine Krebsvorstufe aufweisen, oder sie können auf einer Bestätigung ausgewählter Mutationen oder
Untersuchungen zu ihrem Nachweis hinsichtlich einer Standarduntersuchung
auf Krebs basieren. Durch Verwendung von Krebs- oder Krebsvorstufen-Markern mit einer
hohen Empfindlichkeit/Spezifität
zum Nachweis des Vorliegens von Krebs oder einer Krebsvorstufe schaffen
Verfahren der Erfindung Verbesserungen in nicht-invasiven oder minimal-invasiven
molekularen Durchmusterungsuntersuchungen. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung bedeutet nicht-invasiv oder minimal-invasiv, dass Proben
zur Analyse entweder von Körperausscheidungen
(z.B. Stuhl, Eiter, Sputum) oder von Körperflüssigkeiten wie Blutaspirat
oder Lymphe erhalten werden.
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Die
Erfindung wird beispielhaft mit Experimenten zum Nachweisen des
Vorliegens von Indizien für
kolorektalen Krebs oder eine kolorektale Krebsvorstufe in Proben,
die aus Patienten-Stuhlproben hergestellt wurden, veranschaulicht.
Der Fachmann erkennt jedoch, dass Verfahren der Erfindung unter
Verwendung einer Vielfalt unterschiedlicher Proben ausgeführt werden
können,
um eine Vielfalt von Krebsarten nachzuweisen.
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Ein
Grund, dass der Nachweis von kolorektalem Krebs oder einer kolorektalen
Krebsvorstufe (z.B. eines Adenoms) beispielhaft veranschaulicht
wird, ist, dass eine Stuhlprobe ein gutes Beispiel für eine heterogene
Umgebung ist, in der Verfahren der Erfindung insbesondere nützlich sind
(siehe oben). Darüber
hinaus ist die Kolonoskopie (und die Sigmoidoskopie, eine verwandte
Technik) ein wohlbekannter invasiver Standard, der eine hohe Empfindlichkeit
und eine hohe Spezifität
(wenn auch hohe Kosten und geringe Zustimmung der Patienten) hat,
womit Verfahren der Erfindung verglichen und bestätigt werden
können.
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Verfahren
der Erfindung umfassen das Durchmustern einer Probe, wie einer,
die aus einer Stuhlprobe hergestellt wurde, hinsichtlich des Vorliegens
eines Markers oder mehrerer Marker für Krebs oder eine Krebsvorstufe
(z.B. einen kolorektalen Tumor oder ein Adenom), so dass die Nachweisempfindlichkeit
zwischen etwa 50% und etwa 100% liegt und die Nachweisspezifität zwischen
etwa 85% und etwa 100% liegt. In einer bevorzugten Ausführungsform
kombinieren Verfahren der Erfindung verschiedene Arten von Untersuchungen, um
insgesamt eine Erhöhung
der Empfindlichkeit und der Spezifität zu erzielen. So umfassen
Verfahren der Erfindung das Durchführen einer Untersuchung auf
eine Mutation, von der bekannt ist, dass sie mit Krebs oder einer
Krebsvorstufe in Verbindung steht, und einer Untersuchung hinsichtlich
der Menge und/oder der Länge an
DNA, von der erwartet wird, dass sie bei Krebs oder einer Krebsvorstufe
auftritt, um die kombinierten Vorteile und die Empfindlichkeit und
Spezifität
beider Untersuchungen zu erhalten. Darüber hinaus ist in dem Konzept
der Verwendung multipler Nucleinsäure-Analysen zum Nachweisen
von Krebs oder einer Krebsvorstufe die Verwendung multipler genomischer
Ziele in jeder Untersuchung, um weitere Erhöhungen der Empfindlichkeit
und der Spezifität
zu schaffen, eingebettet. Jedoch ist zur Ausführung der Erfindung, wie unten
gezeigt, eine Einzelmarker-Untersuchung ausreichend, wenn ihre Empfindlichkeit
und Spezifität
innerhalb der hierin gelehrten Bereiche sind.
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Die
gemäß der Erfindung
verwendeten genomischen Ziele und Untersuchungsverfahren können in Abhängigkeit
von dem gewünschten
Grad an Empfindlichkeit und Spezifität, sowie von der Art des Krebses oder
der Krebsvorstufe, dessen (deren) Nachweis erwünscht ist, variieren. Genomische
Ziele (z.B. Mutationen) werden auf der Basis ihrer bekannten Empfindlichkeit
oder Spezifität
oder durch Bestimmen einer Grundlinien-Empfindlichkeit und -Spezifität ausgewählt. In
bevorzugten Ausführungsformen
umfassen Verfahren der Erfindung den Nachweis einer Mutation an
einem einzigen, informativen Locus. In anderen Ausführungsformen
werden Untersuchungen hinsichtlich informativer Loci kombiniert,
um eine verbesserte Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises, bezogen auf
invasive Techniken, zu erzielen. Dementsprechend erwägen Verfahren
der Erfindung eine Kombination von Untersuchungen, die ausgewählt werden
aus multiplem Mutationsnachweis, quantitativer Polymerasekettenreaktion
(d.h. zur Bestimmung der Menge an amplifizierbarer DNA in einer
Probe), sequenzspezifischer Hybridisierungsbindung, Oligo-Ligation,
Amplification Refractory Mutation System, Nachweis von Einzelstrang-Konformationspolymorphismus,
Sequenzieren, Fehlpaarungs-Nachweis und Einzelbasen-Extension. Zielorte
umfassen die Chromosome 1, 5, 8, 17 und 18, insbesondere Chromosom
5q, Chromosom 17p, Chromosom 8p, Chromosom 1q und Chromosom 18q.
Bevorzugte Orte bzw. Loci zur Verwendung bei Verfahren der Erfindung
umfassen p53, apc, bat-26 und andere, von denen vermutet wird, dass
sie auf Krebs oder eine Krebsvorstufe schließen lassen.
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Von
anderen Genen ist bekannt, dass sie mit kolorektalem Krebs in Verbindung
stehen, und ihre Empfindlichkeit und Spezifität werden, wenn sie nicht in
der Lite ratur bekannt sind, durch Bestimmen des Prozentsatzes der
Tumore, die die Mutation tragen, und des Prozentsatzes gesunder
Proben, die die Mutation tragen, aus einer ausreichend großen und
mannigfaltigen Population bestimmt. Dies kann empirisch oder mathematisch
unter Verwendung von Algorithmen, die die Wahrscheinlichkeit falsch-positiver
und falsch-negativer Durchmusterungsergebnisse auf der Basis von
Daten, die das Vorliegen einer Mutation mit dem Vorliegen von Krebs
oder einer Krebsvorstufe in Verbindung bringen, vorhersagen, gemacht
werden. Die Bestätigung
des klinischen Status eines Patienten kann durch einen Standardtest
wie eine Kolonoskopie im Falle von kolorektalem Krebs (die eine
typische Empfindlichkeit von 95% und eine typische Spezifität von 100%
hat) bewerkstelligt werden.
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Für die Analyse
von Stuhlproben umfassen bevorzugte Verfahren der Erfindung das
Erhalten mindestens eines Querschnitts- oder Umfangs-Bereichs eines
entleerten Stuhls, wie in dem US-Patent Nr. 5 741 650 gelehrt. Ein
Querschnitts- oder
Umfangs-Bereich von Stuhl ist zwar wünschenswert, aber hierin angegebene Verfahren
werden an von entleertem Stuhl erhaltenen Zufallsstichproben, wozu
Abstriche oder Abschabsel gehören,
durchgeführt.
Sobald die Stuhlprobe erhalten wird, wird sie homogenisiert. Ein
bevorzugter Puffer zur Homogenisierung ist einer, der mindestens
16 mM Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA) enthält.
Es wurde jedoch herausgefunden, dass die Verwendung von mindestens
150 mM EDTA die Ausbeute an Nucleinsäure aus Stuhl stark verbessert.
So weist ein bevorzugter Puffer zur Stuhlhomogenisierung phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 20–100 mM
NaCl oder KCl, mindestens 150 mM EDTA, und gewünschtenfalls ein Detergens (wie
SDS) und eine Proteinase (z.B. Proteinase K) auf.
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Nach
der Homogenisierung wird Nucleinsäure bevorzugt aus der Stuhlprobe
isoliert. Eine Isolierung oder Extraktion von Nucleinsäure ist
nicht bei allen Verfahren der Erfindung erforderlich, da bestimmte
Nachweistechniken im homogenisierten Stuhl ohne Isolierung von Nucleinsäuren angemessen
durchgeführt
werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird homogenisierter Stuhl jedoch geschleudert, um einen Überstand
zu erzeugen, der Nucleinsäuren,
Proteine, Lipide und andere zelluläre Bruchstücke enthält. Der Überstand wird mit einem Detergens
und Proteinase behandelt, um Protein abzubauen, und die Nucleinsäure wird
mit Phenol-Chloroform extrahiert. Die extrahierten Nucleinsäuren werden dann
mit Alkohol ausgefällt.
Es können
andere Techniken verwendet werden, um Nucleinsäure aus der Probe zu isolieren.
Zu derartigen Techniken gehören
Hybridisierungsbindung und Amplifizierung direkt aus dem homogenisierten
Stuhl. Nucleinsäuren
können
in dem Ausmaß,
das für
die zu verwendende Durchmusterungsuntersuchung erforderlich ist,
gereinigt und/oder isoliert werden.
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Zu
analysierende Nucleinsäuren
werden ausgewählt
auf der Basis bekannter oder vermuteter Beziehungen zwischen spezifischen
Mutationen und Krebs oder einer Krebsvorstufe. Gewünschtenfalls
wird eine sequenzspezifische Hybridisierungsbindung verwendet, um
spezifische Nucleinsäuren
aus der Probe zu isolieren. Ziel-Nucleinsäuren können nach irgendeinem Verfahren
des Stands der Technik analysiert werden. Zu Beispielen für bevorzugte
Verfahren gehören
die enumerative Analyse des Verlusts an Heterozygosität, wie in dem
US-Patent Nr. 5 670 325 gelehrt. Enumerative Verfahren erfordern
keine Kenntnis der Sequenz einer mutierten Nucleinsäure. Vielmehr
bestimmen derartige Verfahren, dass es eine Veränderung (Deletion, Substitution,
Addition, Umordnung oder eine andere Mutation) bei einer Nucleinsäure vom
Wildtyp gegeben hat. Die untersuchten Loci werden ausgewählt auf
der Basis der Wahrscheinlichkeit einer Veränderung, die mit Krebs oder
einer Krebsvorstufe in Verbindung steht. Enumerative Verfahren vergleichen
die Anzahl einer Nucleinsäure
vom Wildtyp, von der bekannt ist, dass sie bei Krebs oder einer
Krebsvorstufe nicht verändert
wird, mit der Anzahl einer Nucleinsäure vom Wildtyp, von der bekannt
ist oder vermutet wird, dass sie bei Krebs oder einer Krebsvorstufe
verändert
wird, in einer Probe. Ein statistisch signifikanter Unterschied
in den zwei Anzahlen zeigt ein positives Ergebnis an.
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Mutationen
in Ziel-Nucleinsäuren
können
auch durch Einzelbasen-Extensionstechniken gemessen werden, um eine
einzelne Nucleotid-Variante, die Krebs oder eine Krebsvorstufe anzeigt,
zu identifizieren. Bevorzugt werden Einzelbasen-Extensionsuntersuchungen
einem Zyklus unterzogen. Kurz gesagt, Einzelbasenextensions-Zyklusreaktionen
umfassen ein Binden bzw. Annealing eines Nucleinsäure-Primers
unmittelbar 5' an
einen Bereich, der eine nachzuweisende Einzelbase enthält. Die
nachzuweisende Einzelbase stellt einen Mutations-Marker dar. Die
Mutation kann eine Einzelpunktmutation sein oder kann eine größere Mutation,
für die
die Einzelbase ein Marker ist, sein. Es werden zwei getrennte Reaktionen
durchgeführt.
Bei der ersten Reaktion wird Primer an das Ziel bzw. Target gebunden,
und markierte (bevorzugt 32P) Nucleinsäuren, die
an der nachzuweisenden Einzelbase komplementär zu Nicht-Wildtyp (z.B. Mutanten,
die eine Krankheit anzeigen)-Varianten sind, und unmarkierte Dideoxy-Nucleinsäuren, die
zu der Wildtyp-Base komplementär
sind, werden vereinigt. Die Primerextension wird das erste Mal gestoppt,
wenn eine Wildtyp (Dideoxy)-Base zu dem Primer zugegeben wird. Das
Vorliegen einer Markierung in dem verlängerten Primer zeigt das Vorliegen
einer Mutation an. Ein zweites Röhrchen,
die positive Kontrolle, enthält
markierte, zu der Wildtyp-Base komplementäre Nucleinsäure in Anwesenheit des Primers.
Eine DNA-Polymerase, wie SequenaseTM (Amersham),
wird zur Primerextension verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine thermisch stabile Polymerase, wie Taq oder thermische
Sequenase, verwendet, um eine effizientere Zyklusreaktion zu erlauben.
Wenn eine Extensionsreaktion vollendet ist, wird die an Ziel-Nucleinsäuren gebundene
erste und zweite Sonde durch Erhitzen des Reaktionsgemisches auf über die
Schmelztemperatur der Hybride dissoziiert. Das Reaktionsgemisch
wird dann unter die Schmelztemperatur der Hybride abgekühlt, und
in einer weiteren Runde von Extensionsreaktionen lässt man
zusätzlichen
Primer sich mit Ziel-Nucleinsäuren
verbinden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 10 bis 50
Zyklen von Extensionsreaktionen durchgeführt. In einer am meisten bevorzugten
Ausführungsform
werden 30 Zyklen von Extensionsreaktionen durchgeführt. Nach
Vollendung aller Zyklen werden die Extensionsprodukte isoliert und
nachgewiesen. In alternativen Ausführungsformen können andere
Kettenbeendigungsverfahren als Dideoxy-Nucleotide verwendet werden.
Beispielsweise tritt eine Kettenbeendigung auf, wenn keine zusätzlichen
Basen zum Einbau an dem nächsten
verfügbaren
Nucleotid auf dem Primer verfügbar
sind.
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Verfahren
der Erfindung sind auch nützlich
zum Durchmustern von Populationen von Patienten, um charakteristische
Eigenschaften in Populationsproben zu identifizieren, die Krebs
oder ein Adenom anzeigen. Beispielsweise umfassen Verfahren der
Erfindung ein hochempfindliches, hochspezifisches Durchmustern von
Populationen von Patienten, um Nucleinsäure-Mutationen, die in einer
Untergruppe von Patientenproben vorliegen, mit dem Vorliegen einer
Krankheit bei jenen Patienten zu korrelieren. So umfassen Verfahren
der Erfindung das Nachweisen genomischer Variationen in Patientenproben,
das Korrelieren jener Variationen mit einer bestätigten Krankheit, und das Verwenden
der mit einer bestätigten
Krankheit im Zusammenhang stehenden Variationen als ein diagnostisches
Mus ter für
die Krankheit in nachfolgenden Patientenproben. Derartige Verfahren
werden bevorzugt an Proben aus einem Pool, wie Stuhlproben, von
identifizierten Patienten-Populationen (z.B. erkrankt, gesund) durchgeführt. Derartige
Verfahren basieren bevorzugt auf Variationen in polymorphen Einzelnucleotid-Loci.
Die Empfindlichkeit und Spezifität
des Nachweises von Varianten in jenen Loci als eine Funktion einer
Krankheit wird bestimmt. Jene Loci, die eine Krankheit in vordefinierten
Ausmaßen an
Empfindlichkeit und Spezifität
vorhersagen, werden zur Verwendung in Durchmusterungsuntersuchungen für unbekannte
Patientenproben ausgewählt.
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Die
folgenden Beispiele liefern eine spezifische beispielhafte Veranschaulichung
der oben diskutierten Konzepte. Die Beispiele benutzen eine Untergruppe
von Mutationsereignissen, von denen gezeigt wird, dass sie auf eine
Krankheit schließen
lassen. Bei anderen Mutationen wird davon ausgegangen, dass sie
in Untersuchungen der Erfindung als diagnostische oder Durchmusterungs-Marker
hoher Empfindlichkeit und hoher Spezifität wirken. Darüber hinaus
sind die unten beispielhaft veranschaulichten Untersuchungen lediglich
zu Illustrationszwecken. Die Erfindung betrachtet eine Vielfalt
von Untersuchungen als brauchbar zur Durchmusterung von Patientenproben
hinsichtlich Krebs oder einer Krebsvorstufe, solange die Untersuchungen
ein vorbestimmtes Niveau an Empfindlichkeit und Spezifität von mindestens
etwa 44% bzw. mindestens etwa 85% liefern.
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BEISPIEL 1: Multiplex-Durchmusterung
von Stuhlproben
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Es
wurde ein Experiment durchgeführt,
um die Wirkungen einer multiplen Mutationsanalyse alleine auf die
Empfindlichkeit und Spezifität
des Nachweises von Krebs oder einer Krebsvorstufe in den oben beschriebenen
Stuhlproben zu bestimmen. 15 Mutationen, die alle dafür bekannt
sind oder von denen vermutet wird, dass sie bei kolorektalem Krebs
oder einer Vorstufe von kolorektalem Krebs auftreten, wurden verwendet,
um die 40 Patientenproben durchzumustern. Die folgende Tabelle listet
die Mutationen, die untersucht wurden, auf.
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Gemäß Verfahren
der Erfindung ist eine multiple Mutationsanalyse ein bevorzugtes
Mittel zur Erhöhung
der Empfindlichkeit und Spezifität
des Nachweises von Krebs oder einer Krebsvorstufe. Beispielsweise gibt
es kumulative Vorteile des Kombinierens des Informationswerts (siehe
oben) einer Mutation an einem Allel (z.B. Kras, Codon 13, Position
2) mit dem Informationswert eines zweiten Allels (z.B. Kras, Codon
12, Position 1, oder apc, Codon 1450, Position 1), um die Gesamt-Empfindlichkeit
und -Spezifität
der Untersuchung zu erhöhen.
Dementsprechend werden die Vorteile eines Aspekts der Erfindung
unten angegeben.
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Von
40 Individuen, die sich in der Mayo-Klinik (Rochester, MN) mit Symptomen
oder einer Geschichte vorstellten, die anzeigte, dass eine Kolonoskopie
durchgeführt
werden sollte, wurden Stuhlproben gesammelt. Jede Stuhlprobe wurde
eingefroren. Unmittelbar nach dem Liefern einer Stuhlprobe wurde
an allen Individuen eine Kolonoskopie durchgeführt, um ihren Krankheits-Status
zu bestimmen. Kolonoskopie, ein invasiver Test, der eine Sedierung
des Patienten erfordert, hat eine Empfindlichkeit nahe an 95% und
eine Spezifität
von nahe an 100% für
die Diagnose von Kolonneoplasie. Auf der Basis der Kolonoskopie-Ergebnisse
und der nachfolgenden histologischen Analyse von Biopsieproben,
die während
der Kolonoskopie genommen wurden, wurden die Individuen einer von
drei Gruppen zugeordnet: normal, Krebs und Adenom. Ein Adenom oder
Polyp wird als klinisch relevant betrachtet, wenn es (er) einen
Durchmesser von 1 cm oder größer hat.
So hatten alle Individuen in der Adenomgruppe einen Polypen von
mindestens 1 cm Durchmesser. Patienten in der Krebsgruppe hatten
als Krebs diagnostizierte Tumore, und die krankheitsfreien Individuen
waren jene, für
die die Kolonoskopie kein Anzeichen für Krebs oder ein Adenom zeigte.
Auf der Basis der Kolonoskopie-Ergebnisse wurden 21 Patienten mit
Krebs diagnostiziert, 9 Patienten wurden mit einem Adenom von größer als
1 cm diagnostiziert, und 10 Patienten waren frei von Krebs oder
einem Adenom.
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Dann
wurde an jeder Probe eine multiple Mutationsanalyse auf Blindbasis
(d.h. die Wissenschaftler, die die Untersuchungen durchführten, kannten
die Ergebnisse der Kolonoskopie oder Histologie nicht) durchgeführt. Jede
gefrorene Stuhlprobe, mit einem Gewicht von 7 bis 33 g, wurde aufgetaut,
in einem Verhältnis von
Volumen zu Masse von etwa 3:1 in 500 mM m Tris, 16 mM EDTA und 10
mM NaCl, pH 9,0, homogenisiert. Die Proben wurden dann in demselben
Puffer auf ein endgültiges
Volumen-zu-Masse-Verhältnis
von 20:1 erneut homogenisiert und in Glas-Makrokügelchen bei 2356 × g geschleudert.
Der Überstand
wurde gesammelt und mit SDS und Proteinase k behandelt. Die DNA
wurde dann mit Phenol-Chloroform
extrahiert und mit Alkohol ausgefällt. Die Ausfällung wurde
in 10 mM Tris und 1 mM EDTA (1 × TE),
pH 7,4, suspendiert. Schließlich wurde
die DNA mit Rnase behandelt.
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Menschliche
DNA wurde aus der Ausfällung
durch sequenzspezifische Hybridisierungsbindung isoliert. Biotinylierte
Sonden gegen Abschnitte der Gene p53, K-ras und apc wurden verwendet.
Die K-ras-Sonde war 5'GTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGAC
3' (SEQ ID NO: 1).
Es gab zwei apc-Sonden: apc-1309 war 5'TTCCAGCAGTGTCACAGCACCCTAGAACCAAATCCAG
3' (SEQ ID NO: 2),
und apc-1378 war 5'CAGATAGCCCTGGACAAACAATGCCACGAAGCAGAAG
3' (SEQ ID NO: 3).
Es gab vier Sonden gegen p53, die erste (die an einen Abschnitt
von Exon 5 hybridisierte) war 5'TACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGG
3' (SEQ ID NO: 4),
die zweite (die an einen Ab schnitt von Exon 7 hybridisierte) war 5'ATTTCTTCCATACTACTACCCATCGACCTCTCATC
3' (SEQ ID NO: 5),
die dritte, die ebenfalls an einen Abschnitt von Exon 7 hybridisierte,
war 5'ATGAGGCCAGTGCGCCTTGGGGAGACCTGTGGCAAGC
3' (SEQ ID NO: 6);
und schließlich
hatte eine Sonde gegen Exon 8 die Sequenz 5'GAAAGGACAAGGGTGGTTGGGAGTAGATGGAGCCTGG
3' (SEQ ID NO: 7).
Eine aliquote Teilmenge von 10 μl
jeder Sonde (20 pMol/Bindung) wurde einer Suspension, die 300 μl DNA in
Anwesenheit von 310 μl
6 M GITC-Puffer enthielt, für
2 h bei Raumtemperatur zugegeben. Hybridisierungskomplexe wurden
unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Kügelchen
(Dynal) isoliert. Nach dem Waschen wurden Sonde-Kügelchen-Komplexe
bei 25°C
1 h lang in 0,1 × TE-Puffer,
pH 7,4, suspendiert. Die Suspension wurde dann 4 min lang bei 85°C erhitzt,
und die Kügelchen wurden
entfernt.
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Gebundene
DNA wurde dann unter Verwendung von PCR amplifiziert, im Wesentlichen
wie in dem US-Patent Nr. 4 683 202 beschrieben. Sieben getrennte
PCRs wurden unter Verwendung von Primern, die gegen Kras, apc und
p53 gerichtet waren, doppelt durchgeführt. Es wurden die unten aufgelisteten
Primer verwendet:
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Die
Proben wurden 5 min lang auf 94°C
erhitzt, und dann wurden 40 Zyklen zwischen 94°C, 60°C und 72°C (jeweils 1 min) durchgeführt, gefolgt
von einem Zyklus bei 72°C
für 5 min.
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Das
Vorliegen der in Tabelle 1 oben aufgelisteten 15 Mutationen wurde
durch Zyklus-Einzelbasenextension (Zyklus-SBE), im Wesentlichen
wie oben beschrieben, bestimmt. In Kürze, es wurden zwei Reaktionen durchgeführt. In
der ersten Reaktion wurde Primer der nachzuweisenden Einzelbase
benachbart hybridisiert. Zu der erwarteten mutierten Base komplementäres 32P-markiertes Nucleotid und zu der Wildtyp-Base
komplementäres
unmarkiertes Dideoxynucleotid wurden zugegeben. Der Primer wurde
verlängert,
und das Vorliegen von markiertem Produkt zeigte an, dass in der
Probe eine Mutation vorlag. Eine zweite Reaktion wurde als eine positive
Kontrolle, in der nur markiertes Wildtyp-Komplement zu dem Reaktionsgemisch
zugegeben wurde, durchgeführt.
Die Primerextension unter Einbau der markierten Base stellte sicher,
dass die Reaktion richtig ablief.
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Bei
der SBE verwendete Primer waren wie folgt:
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Die
Reaktionen wurden durchgeführt
unter Standard-Denaturierung, Bindung, Extension, wobei ein Zyklus
von 30 Zyklen durchgeführt
wurde, und auf einem 15%igen denaturierenden Polyacrylamidgel sichtbar gemacht.
Anzahlen pro Minute (CPM) von jeder Zyklusreaktion wurden in einen
Packard Instant-Abbilder (Draht-Raumzähler) eingegeben. Prozent Allel-Heterogenität wurde
bestimmt als:
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Eine
positive Probe wurde definiert als eine, in der mindestens eine
der zwei Kopien eine Mutation mit 1% Heterogenität für mindestens eine der Einzelbasen,
die analysiert wurde, besaß.
Jede Probe, in der mindestens eines der analysierten Gene eine Mutation
doppelt zeigte, wurde als positiv betrachtet. Die Ergebnisse sind
unten in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Gesamtzahlen an Patienten
in der Krebs/Adenom- und der normalen Gruppe sind unter der Spalte „Patientenstatus" gezeigt.
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Wie
in Tabelle 2 gezeigt ist, identifizierte die multiple Mutationsanalyse
unter Verwendung von SBE korrekt 11 von 21 kanzerösen Läsionen,
die durch Kolonoskopie identifiziert wurden, für eine Empfindlichkeit von
52%. Die multiple Mutationsanalyse offenbarte 4 von 9 Adenomen für eine Empfindlichkeit
von 44%. In beiden Fällen
identifizierte die multiple Mutationsanalyse unter Verwendung von
SBE korrekt alle krankheitsfreien Individuen, was zu keinen falsch-positiven
Ergebnissen führte
(Spezifität
von 100%).
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Ein
Test auf fäkales
okkultes Blut wurde an allen Proben von Patienten, bei denen ein
Adenom diagnostiziert wurde, parallel mit dem SBE-Test durchgeführt. Das
Testen auf fäkales
okkultes Blut versagte dabei, irgendeine der 9 Adenom-positiven Proben
zu diagnostizieren, und hatte so eine Empfindlichkeit von 0%. Dementsprechend
hatte die multiple Mutationsanalyse eine weit größere Empfindlichkeit und Spezifität als die üblichste
nicht-invasive Technik, die gegenwärtig verfügbar ist (fäkales okkultes Blut).
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Beispiel 2 – Quantitative
DNA-Analyse
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In
diesem Experiment wurden dieselben 40 Proben, die in Beispiel 1
beschrieben sind, unabhängig von
einander hinsichtlich ihres Gesamtgehalts an DNA analysiert, um
zu bestimmen, ob die Menge an amplifizierbarer DNA in Stühlen, die
von Individuen mit Krebs oder einer Krebsvorstufe erzeugt wurden,
von der Menge an amplifizierbarer DNA, die in Stühlen von krebsfreien Individuen
erzeugt wurde, verschieden war. Die Proben wurden "blind" analysiert und später wie
unten beschrieben mit Kolonoskopie-Ergebnissen korreliert.
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Aliquote
Mengen der DNA, die von den oben in Beispiel 1 beschriebenen 40
Patienten erhalten wurde, wurden unter Verwendung der oben beschriebenen
Primer amplifiziert. Jede Probe wurde durch 7 Loci doppelt amplifiziert
(für insgesamt
14 Amplifikationen für
jeden Locus). Die Produkte der PCR wurden auf ein 4%iges Nusieve
(FMC Biochemical)-Gel (3% Nusieve, 1% Agarose) gebracht und mit
Ethidiumbromid (0,5 μg/ml)
gefärbt.
Die sich ergebende amplifizierte DNA wurde auf der Basis der relativen
Intensität
der gefärbten
Gele eingestuft. Eine "A"-Amplifizierung ergab
die größte kumulative
Intensität
(und daher die größte Menge
an DNA) nach 40 Zyklen PCR, "B"- und "C"-Amplifizierungen ergeben proportional
weniger Gelintensität;
und "F"-Amplifizierungen
ergeben keine oder wenig Intensität. 1 zeigt
beispielhaft A-, B-, C- und F-Amplifizierungen. Es gibt eine ausreichende
Reproduzierbarkeit bei der PCR, um es dem Fachmann zu erlauben,
eine Menge an amplifizierbarer Nucleinsäure auf der Basis von Standards
für gesunde
Populationen und Krebspopulationen oder auf der Basis der Betrachtung
der Gelfotografie in 1 zu klassifizieren. Die Untersuchung
erfordert lediglich, dass man "A"-Amplifizierungen
von jeglicher der "B"-, "C"- und "F"-Amplifizierungen
unterscheidet. Eine "A"-Amplifizierung ist
eine, die eine Bandenintensität derjenigen
in Bahn 1 von 1, oder einer anderen Gelbande ähnlicher
Intensität
(z.B. Bahnen 4, 5, 6 oder 7 von 1) hat.
Die Marker an der rechten Seite von 1 zeigen
beispielhafte Mengen an DNA, die zu A-, B- und C-Amplifizierungen
führen.
So ergeben 200 pg DNA (Bahn 12 in der Figur) eine "A"-Amplifizierung, und 100 pg (Bahn 13
in der Figur) ergeben eine "B"-Amplifizierung,
und 50 pg (Bahn 14 in der Figur) ergeben eine "C"-Amplifizierung.
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Jegliche
DNA-Probe, die 9 "A"-Amplifizierungen
aus 14 möglichen
ergab, wurde als für
Krebs oder Adenom positiv eingestuft. Die Ergebnisse sind in Tabelle
3 unten gezeigt:
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Wie
in Tabelle 3 gezeigt ist, sagt die Menge an amplifizierbarer DNA
im Stuhl den Krankheits-Status eines Patienten hochgradig gut voraus.
Diese Ergebnisse passen mit der Idee zusammen, dass Patienten mit Krebs
oder einem Adenom im Kolon mehr Zellen (und daher mehr DNA) auf
den sich bildenden Stuhl abstoßen.
Darüber
hinaus ist die von Krebszellen oder Adenomzellen stammende DNA intakter
als von normalen Zellen stammende DNA, da Krebszellen und Adenomzellen
den apoptotischen Abbau von DNA vermieden haben.
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Beispiel 3 – kombinierte
multiple Mutationsanalyse und quantitative Analyse
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Die
in den Beispielen 1 und 2 oben erhaltenen Ergebnisse wurden kombiniert,
um zu bestimmen, ob weitere Erhöhungen
der Empfindlichkeit und der Spezifität beobachtet werden würden.
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Eine
positive Probe in diesem Experiment war eine, die eine "A"-Amplifizierung ergab und ein positives multiples
Mutationsergebnis (unter den in Beispiel 1 beschriebenen Kriterien)
ergab. Die Proben wurden auf "blinder" Basis (d.h. ohne
a priori die Kolonoskopieergebnisse zu kennen) wie oben beschrieben
hergestellt und analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten
gezeigt:
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Die
Ergebnisse der kombinierten quantitativen Analyse und multiplen
Mutationsanalyse zeigen eine Nachweisempfindlichkeit von 76% für Krebs
und 78% für
Adenome, wobei jede eine Spezifität von 100% hat. Diese Ergebnisse überschreiten
jene anderer nicht-invasiver oder minimal-invasiver Techniken (z.B.
Testen auf fäkales
okkultes Blut, was eine Empfindlichkeit von 0 hat) bei Weitem.
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Beispiel 4 – Diagnostische
Untersuchung unter Verwendung von Bat-26
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Der
Fehlpaarungs-Reparaturort Bat-26 (in SEQ ID NO: 37 gezeigt) wurde
als Nächstes
verwendet, um dieselben 40 oben beschriebenen Proben zu prüfen. Deletionen
in Bat-26 wurden mit kolorektalem Krebs oder Adenomen in Verbindung
gebracht. Die Proben wurden hergestellt wie oben beschrieben. Ein
Primer wurde an den Abschnitt des Bat-26-Locus unmittelbar stromauf
des Poly-A-Gebiets hybridisiert. Unmarkiertes Deoxythymidin, ein
Gemisch von markiertem und unmarkiertem Deoxycytosin, und unmarkiertes
Dideoxyadenin wurden zusammen mit Polymerase zugegeben. Der Primer
wurde durch den Poly-A-Bereich verlängert. Das markierte und unmarkierte
Cytosin wurde um die nächsten
drei Basen (Nucleotide 222–224,
in der intakten Sequenz alles Guanine) so verlängert, dass in jeden verlängerten
Primer eine Markierung eingebaut wurde. Nach dem Poly-A-Gebiet und den
drei Guaninen gibt es in der intakten Sequenz zwei Thymidine. So
beendet das Dideoxyadenosin die Primerextension durch Addition an
das Ende eines Primers, der durch den Poly-A-Bereich und den Triguanin-Bereich
verlängert
wurde. Die Stränge
wurden getrennt, und die Länge
der Stränge wurde
auf einem Polyacrylamidgel betrachtet, um Deletionen in dem Poly-A-Gebiet
nachzuweisen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 5 angegeben:
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Wie
oben gezeigt, lieferte Bat-26 alleine nicht die hohe Empfindlichkeit,
die unter Verwendung von multipler Mutation oder Quantifizierung
alleine erzielt wurde, zeigte aber eine hohe Empfindlichkeit im
Vergleich mit anderen Einzellocus-Nachweisuntersuchungen. Darüber hinaus
ergab Bat-26, wie unten gezeigt, in Kombination mit den anderen
oben beschriebenen Techniken eine Gesamterhöhung der Empfindlichkeit und
der Spezifität.
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Beispiel 5 – Kumulative
Wirkungen von Kras, multipler Mutation, Quantifizierung und Bat-26
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Die
oben für
Kras, multiple Mutationsanalyse, Quantifizierung und Bat-26 erhaltenen
Ergebnisse wurden kombiniert, um die kumulativen Wirkungen der Verwendung
von Kombinationen jener Techniken zu bestimmen, um in einer nicht-invasiven
Untersuchung für
Krebs oder eine Krebsvorstufe eine erhöhte Empfindlichkeit und Spezifität hervorzubringen.
Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 6 zusammengefasst:
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Wie
in der Zusammenfassung oben gezeigt ist, ergab die Kombination von
multipler Mutationsanalyse, quantitativer PCR und Bat-26 eine Empfindlichkeit,
die sich derjenigen der Kolonoskopie annäherte. Eine Kombination von
multipler Mutationsanalyse und Quantifizierung alleine ergibt auch
sehr hohe Empfindlichkeiten. Alle Untersuchungen führten zu
einer Spezifität
von 100% (keine falsch-positiven Ergebnisse), was mit der Kolonoskopie
vergleichbar ist.
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Die
vorstehenden Experimente zeigen, dass selbst eine einzige hochempfindliche,
hochspezifische, nicht-invasive oder minimal-invasive Untersuchung
diagnostische Ergebnisse ergibt, die nicht-invasiven/minimal-invasiven
Techniken des Stands der Technik überlegen sind, und sich den
Ergebnissen, die mit dem aner kannten invasiven diagnostischen Standardverfahren
(Kolonoskopie) beobachtet werden, annähern. Darüber hinaus führt eine
nicht-invasive Untersuchung, die mehr als eine hochempfindliche/hochspezifische
Technik verwendet, zu einer diagnostischen Genauigkeit, die sich
100% nähert.
Daher schaffen Verfahren der Erfindung eine signifikante Verbesserung
der Fähigkeit,
eine genaue nicht-invasive Krebsdiagnose durchzuführen.
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Die
im Sequenzprotokoll verwendeten englischen Begriffe haben folgende
deutsche Bedeutung:
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