DE60120295T2

DE60120295T2 - Fasergekoppelter Flüssigprobenanalysator mit Durchflusszelle

Info

Publication number: DE60120295T2
Application number: DE60120295T
Authority: DE
Inventors: Mark H. Morgan Hill Garrett
Original assignee: Thermo Finnigan LLC
Current assignee: Thermo Finnigan LLC
Priority date: 2000-08-22
Filing date: 2001-08-14
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2021-08-15
Also published as: CA2355453C; CA2355453A1; US6542231B1; JP3657900B2; DE60120295D1; EP1182443A2; EP1182443A3; EP1182443B1; JP2002156326A

Description

Kurze Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft einen fasergekoppelten Flüssigprobenanalysator mit einer Durchflusszelle, welche Licht durch Totalreflexion leitet (genannt Hohllichtleiter), und insbesondere einen Analysator, welcher für Lichtabsorptionsmessungen verwendet wird, die typischerweise in der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Kapillarflüssigchromatographie (μLC), Kapillarelektrophorese (CE), Kapillarelektrochromatographie (CEC), Überkritischen Flüssigchromatographie (SFC), Fließinjektionsanalyse (FIA), und damit in Verbindung stehenden Techniken durchgeführt werden.
Hintergrund der Erfindung
Die Flüssigchromatographie ist ein weithin anerkanntes Verfahren zur Bestimmung der Extinktion von Substanzen und deren Konzentrationen. Die Extinktion einer Lösung wird gemäß dem Beer'schen Gesetz bestimmt: A = εbc = log(1/T) = log(P0/P)
Das Symbol „A" stellt die Extinktion der Lösung dar, „ε" ist der molare Extinktionskoeffizient, „c" ist die Konzentration, „b" ist die Weglänge, „T" ist die Transmission, „P₀" ist Stärke des einfallenden Lichtes, und „P" ist die Stärke des transmittierten Lichtes. Je nach Art der Chromatographie, z. B. CE verglichen mit HPLC, können geringfügig unterschiedliche Entwicklungskriterien und funktionelle Anforderungen an das System bestehen. Im Allgemeinen sind jedoch bei allen Extinktionsmesssystemen für die verschiedenen Formen der Flüssigchromatographie eine Reihe gemeinsamer Leistungsmerkmale erwünscht, umfassend (1) eine hohe Empfindlichkeit oder ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/N), um auf diese Weise niedrige Konzentrationen eines Analyten zu beobachten, (2) eine niedrige Dispersion, um auf diese Weise die Auflösung zwischen allen von einem Trennmedium eluierten Analyten aufrechtzuerhalten, und gleichzeitig (3) einen großen linearen Dynamikbereich, so dass hohe und niedrige Konzentrationen mit einer einzigen Kalibrierung der Extinktion bestimmt werden können.
Typischerweise können HPLC-Systeme mit einem linearen Dynamikbereich von 10⁴ bis 10⁵ eine Extinktion von weniger als einhundert Mikro-AU (Extinktionseinheiten) messen. Die Rauschpegel liegen bei etwa 20–40 Mikro-AU. Die Auflösung wird andererseits durch die Leistungsfähigkeit der Trennsäule sowie die Dispersion innerhalb des Systems beeinflusst. Der Chromatographierende spezifiziert die Säule in Abhängigkeit von den zu analysierenden Materialien. Der andere Faktor, welcher die Auflösung beeinflusst, ist die Dispersion. Verbindungen, welche mit Hilfe der Säule getrennt wurden, treten durch den Detektor hindurch. Eine graphische Darstellung der Extinktion als Funktion der Zeit ergibt einen Peak von annähernd gaussförmiger Gestalt. Die Dispersion des Analyten innerhalb des Lösungsmittels bewirkt eine Verbreiterung der chromatographischen Peaks, wodurch sich das Extinktionssignal verringert. Zusätzlich kann es zu einer Überlappung des Abstandes zwischen den Grenzen zweier Peaks kommen. Aus diesem Grund ist es von Bedeutung, die Dispersion auf einem absoluten Minimum zu halten.
Im Allgemeinen sind schnelle Trennungen unter Verwendung hoher Flussraten erwünscht, um die Dauer der Datenaufnahme zu verringern. Dies kann jedoch auch die chromatographische Auflösung verringern. Daher ist es in manchen Fällen günstiger, die Menge des Analyten sowie die Flussrate zu verringern. Dies hat zu einer stetigen Reduzierung der Volumina und Flussraten in der Chromatographie, insbesondere auf dem Gebiet von Proteomics oder der Proteinauftrennung und -quantifizierung, geführt. Weiterhin bietet dies dort einen Anreiz, wo lediglich kleine Proben verfügbar sind.
Um eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung zu erzielen, ist es vom Standpunkt eines Systems aus betrachtet erforderlich, sowohl eine Erhöhung des Signals als auch eine Verminderung des Rauschens zu bewirken. Eine Flusszelle mit größerer Weglänge ist bei vorgegebener Probenkonzentration mit einem größeren Extinktionssignal gleichzusetzen. Weiterhin impliziert eine größere Weglänge, dass eine Lösung geringerer Konzentration bei gleicher Stärke des einfallenden Lichtes gemessen werden kann, wodurch sich die Empfindlichkeit eines HPLC-Verfahrens erhöht. Die Messung geringerer Konzentrationen ist für die Synthese von Wirkstoffen mit hoher Reinheit, die Reinheitsanalyse, sowie die chemische Qualitätskontrolle von Bedeutung.
Wird eine höhere Empfindlichkeit erzielt, so opfern handelsübliche Extinktonsmesssysteme hierfür in den meisten Fällen den Dynamikbereich, oder umgekehrt. Rauschquellen, welche die Detektion von Extinktionsänderungen beeinflussen, umfassen Kurzzeit- und Langzeitrauschquellen. Kurzzeitrauschen entsteht als Folge druckinduzierter Indexänderungen, Fluktuationen der Lichtstärke, elektronischem Rauschen des Sensors und der Sensorelektronik, Fluktuationen in Bezug auf die Lichtstreuung optischer Komponenten wie beispielsweise Linsen, Spiegeln oder Gittern, Hochfrequenzschwankungen in den optomechanischen Komponenten, welche zu einer Auf und Ab-Verschiebung des Spektrums über die Pixel des Arraysensors führen, und optischem Hintergrundrauschen aus externen Quellen. Langzeitrauschen entsteht als Folge von Temperaturfluktuationen, welche zur Veränderung optischer Ausrichtungen und Kopplungen, zu einer thermomechanischen Drift der optischen Komponenten, zu einer nicht kompensierten Drift der Detektionselektronik, sowie zu Grundlinienverschiebungen als Folge der Brechungsindexempfindlichkeit der Flusszelle führen. Je länger der Weg von der Trennsäule zur Flusszelle ist, desto größer ist eindeutig die Dispersion, was zu einer geringeren Signalamplitude, zu einem breiteren Signal, und zu einer geringeren Auflösung führt. Offensichtlich hat die durch eine Flusszelle mit längerem Weg bewirkte Erhöhung des Signals keinerlei Auswirkungen, wenn gleichzeitig eine ausgleichende Erhöhung des Rauschens erzielt wird.
Eine Erhöhung des Extinktionssignals wird eindeutig durch eine Flusszelle mit größerer Weglänge, welche eine geringe RI (Brechungsindex)-Empfindlichkeit aufweist, erzielt, was zu einer Drift der Grundlinienextinktion führt. Das Extinktionssignal erhöht sich weiterhin, wenn die Flusszelle oder der Hohllichtleiter in der Nähe der Trennsäule angeordnet sind, wodurch sich die Dispersion verringert. Kurzzeitrauschen, welches durch druckinduzierte Indexänderungen verursacht wird, lässt sich typischerweise durch Flussrestriktion oder mittels einer Impulsdämpfungsvorrichtung verringern. Langzeitrauschen als Folge von Temperaturdrift lässt sich durch passive oder aktive thermische Kontrolle verringern. Der erstere Fall ist üblicherweise der kostengünstigste, sofern er in die Tat umgesetzt werden kann. Um ein Signal und eine Referenz mit gleicher Drift zu erhalten, welche heraussubtrahiert wird, werden üblicherweise aufeinander abgestimmte Dioden verwendet. Häufig werden Kühlsensoren in hochempfindlichen Systemen verwendet, was jedoch zu zusätzlichen Kosten und zusätzlicher Komplexität führt, was sich für ein standardmäßiges HPLC-System üblicherweise verbietet. Häufig müssen Lichtquellen in HPLC-Systemen in vernünftiger Weise vom Polychromator isoliert werden, um die thermisch induzierte Drift der optischen Komponenten zu minimieren. In den meisten Fällen ist der Polychromator mit teuren Materialien und/oder engen Toleranzen ausgestaltet, um diesen thermomechanischen Sachverhalten Rechnung zu tragen.
Normalerweise werden LC-Detektorsysteme aus großoptischen Elementen, d. h. Linsen, Spiegeln sowie Gittern im makroskopischen Maßstab, hergestellt, bei welchen das Licht zwischen diesen Komponenten durch den freien Raum übertragen wird. Siehe hierfür beispielsweise die U.S.-Patente Nr. 4,375,163, Nr. 4,848,904, Nr. 4,568,185, Nr. 5,495,186, Nr. 4,687,917, und Nr. 4,637,041. Im Allgemeinen sind die Lichtquellen, die optischen Relaisysteme, sowie die Spektrometer in eine monolithische „optische Bank" integriert. Alternativ ist es möglich, das Licht durch Lichtleitfasern zu übertragen. Dieser Ansatz ist aus verschiedenen Gründen reizvoll, welche hier diskutiert werden. Faseroptische Extinktionssysteme sind kommerziell von Ocean Optics, Inc., Dunedin, FL, und von Carl Zeiss, Jena, Deutschland, erhältlich (siehe U.S.-Patent 5,159,404). Diese Systeme sind jedoch nicht für die hier beschriebenen HPLC-Anwendungen geeignet, da Ihnen der Dynamikbereich fehlt, sie typischerweise Werte von weniger als 10⁴ AU's besitzen, und/oder nicht mit einem einzelnen Gitter über die gewünschte spektrale Bandbreite, welche in der HPLC von 190–800 nm reicht, betreibbar sind. Zusätzlich sind die für derartige Systeme erhältlichen Extinktionszellen nicht für die Funktions- und Leistungsanforderungen der modernen HPLC konzipiert. Entscheidend für das Erzielen eines hohen Dynamikbereichs, einer hohen Empfindlichkeit, und einer hohen Auflösung ist die Integration des Systems für HPLC- und andere LC-Anwendungen. Es findet ein Zusammenspiel zwischen allen Komponenten des Systems, umfassend die Pumpe, den Entgaser, den Autosampler, die Injektionsventile, die Säule, die Flusszelle, das Spektrometer, sowie die Elektronik statt, welches optimiert werden muss.
Die Verwendung von Faseroptiken in HPLC-Systemen war bislang mit Schwierigkeiten verbunden, da die Faser bei Beleuchtung mit ultraviolettem (UV) Licht eine Solarisation oder Fotoverdunkelung erfahren würde. Seit kurzem ist eine „nicht-solarisierende" Faser auf Siliziumdioxidbasis in Form der High-OH-Faser erhältlich. In dieser Faser wird OH während der Herstellung eindiffundiert, wodurch Defekte der Faser, welche zu Solarisation führen, kompensiert werden. Das OH diffundiert mit der Zeit jedoch auch wieder heraus, weshalb die Solarisation erneut auftritt. Heraeus-Amersil, Deutschland, hat einen neuen, nicht-solarisierenden Vorförmling für Lichtleitfasern auf Siliziumdioxidbasis entwickelt, welcher seine UV-Transmission für wesentlich längere Zeiträume beibehält. Diese Faser, genannt UVM, ist über Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, erhältlich. Andere Kombinationen von UVM und High-OH sind ebenfalls erhältlich.
In Anbetracht der gegenwärtigen Verfügbarkeit einer stabilen, nicht-solarisierenden Lichtleitfaser besteht nunmehr die Möglichkeit, fasergekoppelte LC-Systeme zu konzipieren, welche sich mit einigen der Beschränkungen von Freiraum-LC-Systemen mit großoptischen Elementen befassen. Die Faserkopplung beseitigt auch das Bedürfnis nach mechanischen Komponenten mit hoher Toleranz, da die Toleranzen für die optische Ausrichtung mit massengefertigten, faseroptischen Konnektoren erzielt werden. Diese Konnektoren sind bei geringen Kosten weithin verfügbar, und können eine Ausrichtung der Verbindungen von Lichtleitfasern innerhalb von Mikrometern bewirken, so dass optische Verluste von weniger als 0.3 dB pro Verbindung resultieren.
In älteren LC-Systemen wird die Flusszelle durch großoptische Komponenten beleuchtet und war von der Säule durch mehrere Zentimeter an Schlauch getrennt, was zu einer erheblichen Menge an „Totvolumen" führte. Das Totvolumen ist das Flussvolumen, in welchem sich der Analyt im Lösungsmittel verteilen kann. Ein fasergekoppelter Hohllichtleiter würde es einem gestatten, den Hohllichtleiter fernab des Spektrometers und in enger Nähe zur Säule, oder direkt an der Säule befestigt, anzuordnen. Dies bedeutet, dass das Totvolumen minimiert wird. Offensichtlich erhöht dies die Signalstärke, wodurch die Empfindlichkeit gesteigert wird, und verringert die Verbreiterung der Peaks, wodurch eine höhere Auflösung resultiert. Dies ist insbesondere für Proteomics von Bedeutung, wo kleine Probenvolumina im Mikroliter- und Submikrolitermaßstab zur Verfügung stehen (Mikroliter oder weniger), wobei deren Dispersion eine Messung derselben unmöglich machen würde. Zusätzlich wird in Abwesenheit von Dispersion die Höhe der Peaks maximiert, wobei Hohllichtleiter mit langer Bohrung und geringem Volumen eine hohe Empfindlichkeit gestatten.
Eine Faserkopplung des Hohllichtleiters bedeutet darüber hinaus, dass er von der optischen Bank entfernt und an einer Stelle platziert werden kann, an welcher er, unbeeinflusst von der durch die Lichtquellen des Systems abgegebenen Wärme, in einfacher Weise thermisch stabilisiert wird. Zusätzlich kann die Lichtquelle selbst fernab der optischen Bank angeordnet sein, wodurch die Wärme der Lichtquelle nicht in die optische Bank übertragen wird. Dies ist von besonderer Bedeutung, da hierdurch die thermomechanischen Toleranzen des Spektrometers und die Größe der optischen Bank verringert werden. Hierdurch verringern sich wiederum die Kosten der optischen Bank außerordentlich, und die Herstellung des Systems wird vereinfacht. Die Komponenten werden in einfacher Weise mittels kostengünstiger, faseroptischer Konnektoren und Steckbuchsen, welche weithin verfügbar sind, miteinander verbunden. Ein fasergekoppeltes System gestattet es den Elementen des Systems, beispielsweise dem Hohllichtleiter, zur Optimierung einer bestimmten Analyse auf einfache Weise ausgetauscht zu werden. So könnte beispielsweise ein Hohllichtleiter mit großer Weglänge und/oder geringem Volumen in das System eingebunden werden, wenn die spezielle Analyse dies erfordert. Zusätzlich können dem System, falls dies erforderlich ist, optische Filter hinzugefügt oder entnommen werden.
Die Flüssigchromatographie (LC) wird typischerweise zum Analysieren von Probenvolumina von etwa 10 μl verwendet. Kleinere Probenvolumina, wie beispielsweise 3–5 Nanoliter, sind für Mikrosäulentechniken wünschenswert. Die Dimensionen derzeitiger LC-Flusszellen, etwa 1 cm Länge mit Volumina von ±10 μl, sind aufgrund des Bedürfnisses, eine Wechselwirkung des Lichtes mit der lichtabsorbierenden, typischerweise metallischen Wand der Flusszelle zu vermeiden, in ihrem Querschnitt, und damit in ihrer Weglänge, eingeschränkt. Wird die Weglänge einer typischen Flusszelle erhöht, so muss der Durchmesser und die Apertur des Lichteingangs verringert werden, um ein gleichgroßes Volumen aufrechtzuerhalten. Das Fokussieren einer ausgedehnten Lichtquelle auf einen Punkt geringerer Größe vermindert jedoch den Rayleigh-Bereich oder die Taillierung des Lichtstrahls, was zu einer raschen Brechung des Lichtes in die Wände der Zelle hinein führt, wodurch eine falsche Extinktion sowie Rauschen erzeugt werden. Alternativ vermindert ein größerer Rayleigh-Bereich bei gegebener gleicher Lichtquelle die Energiedichte. In Übereinstimmung mit dem Beer'schen Gesetz führt eine geringere Energiedichte zu einem geringeren Extinktionssignal. Gegen das zweite Gesetz der Thermodynamik kann grundsätzlich nicht verstoßen werden, was hier zutrifft und was durch das Gesetz von der Erhaltung der Leuchtdichte oder Strahlung, oder durch die LaGrange-Invariante, verkörpert wird.
In U.S.-Patent 3,954,341 beschreibt Uffenheimer einen Flüssigprobenanalysator mit verbesserten optischen Eigenschaften, in welchem eine Lichtleitung mit einer röhrenförmigen Wand beschrieben ist, deren Brechungsindex geringer ist als jener der strömenden Lösung. In diesem Lichtwellenleiter oder Hohllichtleiter wird eine geringere Apertur, welche eine geringere Größe der Ausleuchtungsstelle und begleitend einen geringeren Rayleigh-Bereich erfordert, durch eine nicht-absorbierende Wechselwirkung mit den Wänden der Zelle erzielt, welche das Licht in die Zelle zurückreflektieren, genannt Totalreflexion (TIR).
Es ist bekannt, dass der Hohllichtleiter (Mantel) eines Flüssigwellenleiters aus einem Material hergestellt sein muss, dessen Brechungsindex geringer ist als der Index der Probenlösung oder des Analyten, welche/welcher sich im Kern des Leiters befindet (n_Mantel < n_Kern). Typische Analyten, welche in der HPLC Verwendung finden, sind wässrige Lösungen (n = 1.333), methanolische Lösungen (n = 1.328), oder Lösungen in Acetonitril (n = 1.344) niedriger Konzentration. U.S.-Patent 4,867,559 beschreibt einen flüssigverkleideten Flüssigwellenleiter für Extinktionsmessungen, wobei Totalreflexion (TIR) zur Leitung des Lichtes verwendet wird. Tsunoda et al. beschreibt in Applied Spectroscopy 163, 1990, die Verwendung eines Teflonmantels (PTFE und FEP) für einen TIR-Flüssigwellenleiter. U.S.-Patent 5,184,192 beschreibt eine TIR-flüssigverkleidete Flusszelle für Fluoreszenz- und Extinktionsmessungen gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1.
Die vorliegende Erfindung lehrt die Verwendung von Teflon AF, eines aufgrund seines relativ geringen Brechungsindex (z. B. n = 1.294), seiner hohen Transparenz und seiner geringen Streuung für einen Hohllichtleiter besser geeigneten Materials. Teflon AF ist der Handelsname für Copolymere von 2,2-Bistrifluormethyl-4,5-difluor-1,3-dioxol (PDD) mit TFE Tetrafluorethylen-Copolymeren. In Abhängigkeit vom Anteil an PDD besteht eine Auswahl an Zusammensetzungen und Eigenschaften. Dies ist in W. N. Buck und P. R. Resnik, „Properties of Amorphous Fluoropolymers Based on 2,2-Bistrifluoromethyl-4,5-Difluoro-1,3-Dioxole", vorgestellt auf der 183sten Konferenz der Elektrochemischen Gesellschaft, Honolulu, HI, 17. Mai 1993, beschrieben. Teflon AF weist den niedrigsten Brechungsindex aller verfügbaren Teflonarten auf. Teflon AF besitzt darüber hinaus amorphe optische Eigenschaften, welche ihm verglichen mit anderen Teflonarten, umfassend FEP, PFA und PTFE, geringe optische Streueigenschaften verleihen.
Die U.S.-Patente Nr. 5,194,192 und Nr. 5,608,517 beschreiben die Konzeption und Herstellung von Flüssigwellenleitern mit Teflon AF-Mantel. Herstellungsverfahren, welche derzeit typischerweise für Kunststoffe verwendet werden, sind nunmehr für Teflon AF verfügbar, umfassend das Ausziehen aus einer Vorform, oder ein Extrusionsverfahren zur Herstellung von Kapillaren. Aufgrund der hohen Zugfestigkeit von Teflon AF sind dünnwandige Hochdruckkapillaren oder -schläuche für HPLC-Anwendungen verfügbar. Extinktionsmessungen unter Verwendung eines unverkleideten, extrudierten Teflon AF 2400 sind von R. Altkorn, I. Koev und A. Gottleib in „Waveguide Capillary Cell for Low-Refractive-Index Liquids", Applied Spectroscopy, Bd. 51, Nr. 10, 1554 (1997) beschrieben. Sie beschreiben eine Kopplung in den Flüssigwellenleiter unter Verwendung standardmäßiger PEEK (Polyetheretherketon)-LC-T-Stücke und Lichtleitfasern, welche in das T-Stück und in den Teflon AF-Wellenleiter eingebracht sind. Den optimalen Lichteinführungsbedingungen, Überlegungen hinsichtlich der Kopplungsausgestaltung, oder den Lichtsammelbedingungen zur Optimierung der Detektionsempfindlichkeit wird jedoch keinerlei Beachtung geschenkt. Es werden auch keine Bedingungen angeführt, um die Empfindlichkeit des Brechungsindex (RI) zu minimieren. Der numerischen Apertur (NA) der ausleitenden Faser und/oder den Moden innerhalb des Leiters wird keine Beachtung geschenkt. So findet beispielsweise eine Mischung der Moden statt, wenn das Teflon AF gebogen ist. Aus diesem Grund pflanzen sich auch Moden höherer Ordnung innerhalb des Flüssigwellenleiters fort, selbst wenn Moden niedrigerer Ordnung des Wellenleiters durch die einleitende Faser eingeführt werden. Diese Moden werden von einer ausleitenden Faser, welche die gleiche NA aufweist wie die einleitende Faser, nicht aufgenommen. Mantelmoden können auch durch Krümmung induziert werden, wobei diese als Rauschquelle in eine ausleitende Faser mit größerem Durchmesser eingekoppelt werden können. Der RI-Empfindlichkeit, welche mit einem flexiblen, gekrümmten Wellenleiter dort beeinflusst werden kann, wo die Krümmungsverluste in Abhängigkeit von der Wahl des Lösungsmittels variieren, wird keine Beachtung geschenkt. Zusätzlich wird auch der Konzeption der Zelle im Hinblick auf die Empfindlichkeit des RI aufgrund von Druck keine Beachtung geschenkt. Weiterhin werden rund um die Lichtleitfasern herum Presssitzbefestigungen verwendet, welche die optischen Verluste erhöhen können. Presssitzbefestigungen werden auch rund um den Teflon AF-Flüssigwellenleiter herum verwendet, was gleichzeitig die Fortpflanzung des Lichtes einschränken kann. In letzterem Fall ist ein Betrieb unter hohem Druck ausgeschlossen, es sei denn, es wird starres Teflon AF mit einem großen Durchmesser verwendet, oder es wird ein äußerer Stützschlauch rund um den Teflon AF-Flüssigwellenleiter herum angebracht, um auf diese Weise dem Druck durch die Ringdichtung standzuhalten. Wie in Xiaobing Xi und Edward S. Yeung, Appl. Spectro., 45, 7, 1199 (1991) beschrieben ist, verursacht eine Kompression rund um das Teflon herum eine Störung im optischen Wellenleiter. Schließlich wird der Temperaturempfindlichkeit oder der Langzeitdrift der Extinktion eines exponierten Teflon AF-Flüssigwellenleiters keine Beachtung geschenkt.
Verringerte Analytenvolumina können aufgrund kürzerer Analysezeiten und verringerter Analysekosten zu einer verbesserten Analyse führen. Mikrosäulenflüssigchromatographie (μLC)- und Kapillarelektrophorese (CE)-Systeme besitzen Zellvolumina in der Größenordnung von 3–15 Nanolitern bei Querschnitten von 25 bis 100 Mikrometer. Bisherige Mikroanordnungen verwendeten transparente Mikrokapillaren, in welchen das Licht orthogonal zum Fluss des Fluids übertragen wird. Diese Anordnung verringert die Länge, über welche das Licht mit dem Analyten wechselwirkt, erheblich. Gemäß dem Beer'schen Gesetz ist eine hohe Detektionsempfindlichkeit bei Wechselwirkungen geringer Länge schwer zu erzielen. Weiterhin besteht die Schwierigkeit, eine standardmäßige Flüssigchromatographiezelle hinsichtlich des Maßstabs auf die erforderlichen μLC-Dimensionen zu verkleinern. Je kleiner der Querschnitt des Lichteinlasses ist, desto schneller muss das Licht zusätzlich fokussiert werden, was zu Licht führt, das vom Brennpunkt aus rasch divergiert und von der Wand der Flusszelle absorbiert und gestreut wird.
Die Flüssigchromatographie wird sowohl unter isokratischen Lösungsmittelbedingungen als auch unter Gradientenlösungsmittelbedingungen durchgeführt. Während der Elution variiert die Konzentration des Analyten über ein Zeitintervall, was zu einer Extinktionsänderung führt, die annährend gaussförmig ist. Die Gesamtextinktion entspricht der Fläche unter der Extinktionskurve. Die Genauigkeit der berechneten Extinktion wird durch die Genauigkeit des berechneten Integrals der Extinktionskurve bestimmt. Verändert sich die Hintergrundextinktion während der Extinktionsmessung, so stellt die Fläche unter der Kurve eine weniger genaue Messung der Extinktion dar. Es ist daher wünschenswert, dass die Hintergrundextinktion so stabil wie möglich ist. In standardmäßigen Flusszellen werden Grundlinienänderungen durch Veränderungen des Brechungsindex hervorgerufen, welche während der Elution auftreten. Typische Quellen für die Grundliniendrift stellen die Fresnel'sche Reflexion, brechungsinduzierte Verluste gemäß dem Snell'schen Gesetz, oder Änderungen des Schlierenindex wie bei querverlaufenden Indexänderungen dar. Eine Indexänderung hat eine Veränderung der durch die Flusszelle übertragenen optischen Energie, und damit eine Veränderung der gemessenen Extinktion, zur Folge.
Wenn die Eignung einer Flusszelle oder eines Lichtleiters für die chemische Analyse bestimmt wird, definieren die Verfahren der Bezeichnung E 1657-94 der „American Standards on Testing and Materials" das Verfahren zur Bestimmung der scheinbaren Änderung der Extinktion am isobestischen Punkt, an welchem die Extinktionen zweier Lösungsmittel, Methanol und Cyclohexan, gleich groß sind. Diese Messung der Brechungsindex (RI)-Empfindlichkeit tritt als Folge von Effekten aus Brechungsindexunterschieden zwischen den beiden Lösungsmitteln als scheinbare Extinktion auf. Aufgrund der Brechung (z. B. Snell'sches Gesetz) kann sich die Effizienz des Einkoppelns von Licht in den Hohllichtleiter hinein oder des Auskoppelns von Licht aus dem Hohllichtleiter heraus verändern, wodurch eine Veränderung der Grundlinienextinktion hervorgerufen wird. Mantelmoden könnten ebenfalls induziert werden, was zu einer Veränderung der Transmission und der scheinbaren Extinktion führt. Da das Licht mit den Teflon AF-Wänden wechselwirkt, wird darüber hinaus das Leistungsverhalten des Hohllichtleiters durch die Qualität der Oberfläche und jeglicher anderer Faktoren, welche eine Abwandlung oder Veränderung des Teflon AF bewirken, beeinflusst. Andere physikalische Parameter von Bedeutung umfassen Temperatur, Druck und Gasdurchlässigkeit.
Aufgaben und Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine allgemeine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen fasergekoppelten Flüssigprobenanalysator bereitzustellen, welcher eine hohe Detektionsempfindlichkeit, eine hohe Auflösung, einen großen Dynamikbereich, eine geringe RI-Empfindlichkeit, und ein geringes thermomechanisch induziertes Rauschen aufweist, welcher unter hohem Druck betreibbar ist, und welcher auf kostengünstige Weise einfach hergestellt werden kann.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Flüssigprobenanalysator bereitzustellen, umfassend eine Durchflusszelle, welche bei geringer Streuung ein hohes Durchlassvermögen bereitstellt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Flüssigprobenanalysator bereitzustellen, welcher in Bezug auf Temperatur- und Druckänderungen eine geringe Empfindlichkeit aufweist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Probenanalysator mit Durchflusszelle bereitzustellen, welche in der Nähe der Quelle der flüssigen Probe und fernab der Lichtquelle sowie des Signalverarbeitungssystems angeordnet ist.
Die voranstehenden, und andere erfindungsgemäße Aufgaben werden mittels eines Flüssigprobenanalysators nach Anspruch 1 gelöst. Der Analysator kann fasergekoppelte Lichtquellen umfassen, welche mit einem faseroptischen Strahlenmischer verbunden sind, um einem Lichtleiterkabel oder einer Lichtleitfaser, welches/welche an eine Flusszelle oder an einen Flüssigwellenleiter gekoppelt ist, die fernab in der Nähe der Trennsäule angeordnet sein können, Licht zuzuführen. Ein weiteres Lichtleiterkabel koppelt Licht aus der Flusszelle oder dem Hohllichtleiter in einen Spektralanalysator. Die Flusszelle besitzt die Form eines Flüssigwellenleiters oder eines Hohllichtleiters mit röhrenförmigem Aufbau, welcher erste und zweite Enden aufweist, durch die die flüssige Probe hindurchströmt. Die ersten und zweiten Enden des Hohllichtleiters sind mit ersten und zweiten Abschlusskappen abgedichtet. In der ersten Abschlusskappe, welche vom ersten Ende des Hohllichtleiters einen Abstand aufweist, ist ein Durchlass für die eintretende Flüssigkeit ausgebildet. Das Lichtleiterkabel ragt mit seinem Ende in die erste Abschlusskappe hinein und ist zu diesem hin abgedichtet, wobei das Ende des Lichtleiterkabels mit dem einen Ende des Hohllichtleiters optisch gekoppelt ist, so dass alle faseroptischen Lichtmoden durch den Hohllichtleiter eingefangen werden, um sich in diesem fortzupflanzen. Ein ringförmiger Raum umgibt das Ende des Lichtleiterkabels und ragt zwischen den Eingangsdurchlass und das eine Ende des Hohllichtleiters hinein, wobei die eintretende Flüssigkeit rund um das Ende und entlang des Endes des Lichtleiterkabels in den Hohllichtleiter strömt, um einen gleichmäßigen laminaren Fluss der Probenflüssigkeit über das Ende des optischen Kabels hinweg bereitzustellen. Ein Ausgangsdurchlass ist in der zweiten Abschlusskappe ausgebildet, wobei diese vom zweiten Ende des Flüssighohllichtleiters einen Abstand aufweist. Ein lichtausleitendes Kabel ragt in die zweite Abschlusskappe hinein und ist zu dieser hin abgedichtet, wobei das Ende des lichtausleitenden Kabels mit dem zweiten Ende des Hohllichtleiters optisch gekoppelt ist, so dass alle optischen Moden, welche sich entlang des Hohllichtleiters fortpflanzen, von dem lichtausleitenden Kabel eingefangen und einem Verarbeitungssystem zugeführt werden. Ein ringförmiger Raum umgibt das Ende des lichtausleitenden Kabels zwischen dem Ausgangsdurchlass und dem zweiten Ende des Hohllichtleiters, wobei Flüssigkeit aus dem Hohllichtleiter rund um das Ende und entlang des Endes des lichtausleitenden Kabels strömt, um einen gleichmäßigen laminaren Ausgangsfluss der Probe über das Ende des ausleitenden Kabels hinweg bereitzustellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beschreibung, wenn diese in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird, besser verständlich werden, wobei:
1 ein schematisches Diagramm eines Flüssiganalysatorsystems in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist.
2 ein schematisches Diagramm des Flüssiganalysatorsystems ist, welches einen Referenzdetektor verwendet.
3 ein schematisches Diagramm des Flüssiganalysatorsystems ist, welches einen Monochromator verwendet.
4 eine vergrößerte Schnittdarstellung einer Flüssigdurchflusszelle ist, welche in den Flüssiganalysatorsystemen verwendet wird, die in den 1–3 dargestellt sind.
5 eine graphische Darstellung von θ₁– θ_c gegen θ_i für drei unterschiedliche flüssige Kerne ist.
6 eine vergrößerte Schnittdarstellung einer Flüssigdurchflusszelle mit konisch zulaufendem Hohllichtleiter ist, welche in Analysatorsystemen des in den 1–3 dargestellten Typs verwendet wird.
7 eine Schnittdarstellung des Eingangsbereichs einer Durchflusszelle mit einer unterschiedlichen Anordnung für das Einkoppeln von Licht in den Hohllichtleiter hinein ist.
8 ein schematisches Diagramm einer Flüssigdurchflusszelle ist, welche einen gewundenen Hohllichtleiter verwendet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Ein fasergekoppeltes Flüssigprobenanalysatorsystem mit einem Durchflussflüssigwellenleiter oder -hohllichtleiter, welcher in der Nähe der Quelle des Analyten angeordnet sein kann, ist in 1 veranschaulicht. Der Analysator umfasst eine Duallampenlichtquelle, umfassend beispielsweise eine Deuteriumquelle 11 und eine Wolframquelle 12, welche über den Spektralbereich von 190 nm bis 800 nm hinweg einen Lichtpegel hoher Intensität bereitstellen. Das Licht aus den Lichtquellen 11 und 12 wird durch die Linsen 8 und 9 fokussiert, durch die Dämpfer 13 und 14 abgeschwächt, und in die Lichtleitfasern oder Lichtleiterkabel 16 und 17 eingekoppelt. Licht aus der Wolframquelle wird durch den Filter 18 gefiltert, einem Modenregulierer 19 zugeführt, und über die Lichtleitfaser 17a mit dem Koppler 21 gekoppelt. Der Modenkoppler vereinigt das Licht aus beiden Quellen. Das kombinierte Licht bewegt sich entlang der Lichtleitfaser 22 zu einem Kollimator 23 fort, welcher einen Eingang zu den Filter- und Kalibrierungsmitteln 24 bereitstellt, und der wiederum über eine Linse 27 mit dem Lichtleiterkabel oder der Lichtleitfaser 26 gekoppelt ist. Ein Modenmischer oder Modenabstreifer 28 nimmt das Licht auf und stellt einen Eingang für eine Durchflusszelle 29 und einen Hohllichtleiter 31 bereit, welche in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die derzeit ausführlich beschrieben werden soll, konstruiert sind. Das aus der Durchflusszelle 29 austretende Licht ist mittels eines Lichtleiterkabels 34 an ein Spektrometer 33 gekoppelt, wobei die Fasern in der Form eines Fächers an der Eingangsapertur 35 angeordnet sind, um einen gefächerten Lichtstrahl bereitzustellen, der den Eintrittsspalt eines typischen Spektrometers simuliert. Das Spektrometer umfasst einen Spiegel 36, ein Gitter 37 und eine Detektoranordnung 38. Die Aufgabe des Spektrometers besteht darin, das Licht in die Frequenzbänder seiner Komponenten zu zerlegen und ein Ausgangssignal bereitzustellen, welches die Amplitude des Lichtes als Funktion der Wellenlänge darstellt.
In 1 ist ein Hochdruckflüssigchromatographiesystem 41 schematisch veranschaulicht, in welchem ein Analyt 13 einer Trennsäule 42 zugeführt wird, in der die Komponenten des Analyten voneinander getrennt werden. Die austretende Flüssigkeit wird als Eingang der Durchflusszelle 29 zugeführt, wobei die aus der Durchflusszelle austretende Flüssigkeit wiederverwertet, einem Massenspektrometer zugeführt, oder der Entsorgung zugeführt werden kann. Die die Säule verlassende und durch den Hohllichtleiter 31 der Flusszelle strömende Flüssigkeit schwächt das Licht proportional zur Extinktion der Probenbestandteile ab. Das austretende Licht wird dem Spektrometer zugeführt, welches ein Ausgangssignal bereitstellt, das der Intensität des Lichtes bei jeder Wellenlänge proportional ist. Das Ausgangssignal wird einem Datenverarbeitungs- und Datenaufnahmesystem 44 zugeführt, welches das Signal beispielsweise mit einem Referenzsignal vergleichen und einen Hinweis auf die Extinktion bei jeder Wellenlänge bereitstellen kann. Es wird beobachtet, dass durch die Verwendung von Lichtleiterkabeln die Durchflusszelle 29 in enger Nähe zur Hochdruckflüssigchromatographiesäule 42 angeordnet sein kann, wodurch aufgetrennte Proben keine Möglichkeit besitzen, sich während des Transports zur Flusszelle zu verteilen.
2 zeigt ein System, welches jenem von 1 im Wesentlichen identisch ist und welches für gleiche Teile gleiche Kennziffern umfasst. In diesem System wird ein Referenzsignal, welches der Intensität des eintretenden Lichtes entspricht, mittels eines Detektors 46 erhalten, welcher eine Ausgabe vom Koppler 21 empfängt und das Signal dem Datenverarbeitungs- und Datenaufnahmesystem 44 zuführt, wobei das Signal dazu verwendet wird, jegliche Fluktuationen der Lichtintensität zu korrigieren.
3 veranschaulicht ein weiteres Analysesystem, welches zusammen mit der erfindungsgemäßen Durchflusszelle verwendet werden kann, wobei die Zelle entfernt angeordnet sein kann. In diesem System wird das Licht, welches sich entlang des Lichtleiterkabels oder der Lichtleitfaser 26 fortbewegt, einem Monochromator 51 zugeführt, welcher einen Faserstrahlformer 52, einen Spiegel 53 sowie ein Abtastgitter 54 umfasst. Die Aufgabe des Monochromators besteht darin, dem Lichtleiterkabel oder der Lichtleitfaser 56, welche mit dem Eingang der Flüssigdurchflusszelle 29 verbunden ist, der Reihe nach Licht verschiedener Wellenlängen zuzuführen. In anderen Worten gesagt wird Licht bei verschiedenen Wellenlängen abgetastet, um durch die Durchflusszelle hindurchzutreten. Die Ausgabe wird mittels des Detektors 57 detektiert, dessen Ausgabe einem Datenverarbeitungs-/Datenaufnahmesystem zugeführt wird, welches, wie in der Ausführungsform von 2, ein Referenzsignal empfängt und das Signal verarbeitet, um einen Hinweis in Bezug auf die Extinktion bei jeder Wellenlänge des Lichtes bereitzustellen, welches durch die Durchflusszelle 29 hindurchgeführt wird.
Die Flüssigprobendurchflusszelle 29 ist in 4 ausführlich dargestellt. Die Zelle umfasst einen Hohllichtleiter 61, durch welchen die Flüssigkeit hindurchströmt. Licht wird entlang des Hohllichtleiters übertragen. Der Hohllichtleiter und die strömende Flüssigkeit bilden einen Wellenleiter aus, welcher das Licht entlang desselben leitet. Der Hohllichtleiter 61 besitzt eine röhrenförmige Konstruktion und ist aus einem Material hergestellt, dessen Brechungsindex kleiner ist als jener der flüssigen Probe, welche durch diesen hindurchströmt. Die Abschlusskappen 62 und 63 sind zu den Enden des Hohllichtleiters hin abgedichtet. Die Abschlusskappen 62 und 63 können aus Polyetheretherketon (PEEK) hergestellt sein, und umfassen die Abschlussstücke 66 und 67, welche in die Abschlusskappen hineinragen und die Enden des Hohllichtleiters zu den Abschlusskappen hin abdichten. Die lichteinleitende Faser oder das lichteinleitende Kabel 26, welches mit Teflon AF beschichtet sein kann, um die maximale Anzahl an Moden zu übertragen, ist in der Bohrung 69 der Abschlusskappe 62 durch Presssitz befestigt. Der Hohllichtleiter besitzt einen Innendurchmesser, welcher gleichgroß oder größer ist als der Durchmesser der einleitenden Faser oder des einleitenden Kabels, wodurch sämtliche Lichtausgangsmoden der Faser durch den Hohllichtleiter eingefangen werden. Der Hohllichtleiter 61 ist in einem Körper 71 eines Materials, welches eine geringe Gasdurchlässigkeit besitzt, enthalten und zu den Abschlusskappen 62 und 63 hin abgedichtet. Der Körper 71 verhindert darüber hinaus eine Aufweitung des Hohllichtleiters, wenn Flüssigkeiten unter hohem Druck durch die Flusszelle hindurchströmen. In der in 4 dargestellten Ausführungsform ragt das lichteinleitende Kabel in den Kern des Hohllichtleiters 61 hinein. Es versteht sich, wie hier erläutert wird, dass das Ende der Lichtleitfaser lediglich derart mit dem Hohllichtleiter gekoppelt werden muss, dass der Hohllichtleiter alle durch die Lichtleitfaser übertragenen Moden einfängt. Ein Flüssigprobeneingangsdurchlass 72 ist in der Abschlusskappe 62 ausgebildet und endet in dem ringförmigen Raum 73, welcher durch den Zwischenraum zwischen dem Ende der Faser und der vergrößerten Bohrung 74 der Abschlusskappe ausgebildet ist. Dies sieht vor, dass die Flüssigkeit gleichmäßig entlang des Endes und über das Ende der Faser hinweg strömt, d. h. dass ein im Wesentlichen laminarer Fluss der Flüssigkeit in den Hohllichtleiter hinein erfolgt. Die den Hohllichtleiter verlassende Flüssigkeit strömt durch den ringförmigen Raum 76 zwischen der ausleitenden Faser 77 und der Abschlusskappe 63, sowie durch den Durchlass 78, hindurch. Die ausleitende Faser 34 ist ebenfalls in der Bohrung 79 durch Presssitz befestigt, die in der Abschlusskappe 63 ausgebildet ist. Obwohl nicht in 4 dargestellt, welche in dieser Hinsicht lediglich als schematisch zu verstehen ist, besitzt die ausleitende Faser einen Durchmesser, welcher gleichgroß oder größer ist als jener des Hohllichtleiters, so dass sie sämtliche Lichtausgangsmoden einfängt, um auf diese Weise die Transmission zu maximieren.
Der Modenregler 28, 1 und 2, streift optische Moden ab, welche sich, ohne einer Führung zu unterliegen, in dem Hohllichtleiter befinden und Probleme in Bezug auf die Brechungsindex (RI)-Empfindlichkeit und das Grundlinienrauschen verursachen, und optimiert die in den Hohllichtleiter eingespeisten Moden, um eine hohe Empfindlichkeit zu erzielen. Ein geeigneter Modenregler kann von Newport Research Corporation, Irvine, Kalifornien bezogen und an eine Multimodenfaser angepasst werden. Das Licht wird vom Ende 81 der Faser 26 aus an die Flüssigkeit abgegeben, welche sich in dem Hohllichtleiterkern befindet. In dem in 4 veranschaulichten Beispiel ragt das Ende des Hohllichtleiters in den Hohllichtleiterkern hinein, wodurch alle Lichtmoden eingefangen werden und entlang des Hohllichtleiters strömen. Das durch den Flüssigwellenleiter, welcher aus dem Hohllichtleiter und der strömenden Flüssigkeit ausgebildet wird, übertragene Licht wird vom Ende 82 der lichtausleitenden Faser 43 aufgenommen und entlang der Faser zum Spektralfotometer oder Polychromator 33 übertragen, welches/welcher das Ausgangssignal, das die Lichtintensität als Funktion der Wellenlänge darstellt, bereitstellt.
Die nachfolgende ausführliche Beschreibung und Analyse ist auf Eigenschaften des Hohllichtleiters oder des Flüssigwellenleiters gerichtet, welche es dem Analysator ermöglichen, mit verbesserter Empfindlichkeit betrieben zu werden. Moden höherer Ordnung, welche in den Flüssigwellenleiter eingekoppelt werden, können zu Rauschquellen werden, d. h. sie bewegen sich nicht innerhalb des Analyten fort, sondern stattdessen als Hintergrundrauschen durch den Hohllichtleiter (Mantel) hindurch und in das Detektionssystem hinein. Dies trifft insbesondere bei verhältnismäßig kurzen Multimodenflüssigwellenleitern zu, da es vieler Meter bis hin zu Kilometern bedarf, um Moden, welche keiner Führung unterliegen, abzustreifen. Angesichts der Länge der in der Chromatographie verwendeten Hohllichtleiter werden die Moden, welche keiner Führung unterliegen, durch den Hohllichtleiter nicht abgestreift.
Ist ein Wellenleiter gekrümmt, so treten makroskopische Biegeverluste auf. Dies bedeutet, dass ein geradliniger Flüssigwellenleiter eine größere Anzahl an Moden unterstützt als ein gebogener Flüssigwellenleiter. Im Prinzip ist daher ein geradliniger Flüssigwellenleiter einem gekrümmten Leiter vorzuziehen. Um einen gekrümmten Flüssigwellenleiter für die LC effektiv zu nutzen, müssen Moden eingeführt werden, welche von der Konfiguration des Leiters (geradlinig oder gekrümmt) unterstützt werden, welche in effizienter Weise durch die Lichtleitfaser-in-Hohllichtleiter-Übergangsstellenverbindung gekoppelt werden, und welche von der Oberflächenqualität des Leiters unterstützt werden. Das Einführen und Erhalten von Moden, welche einer ordnungsgemäßen Führung unterliegen, besitzt ebenfalls Bedeutung, wenn die RI-Empfindlichkeit berücksichtigt wird.
Der Modenabstreifer kann dazu verwendet werden, die Mantelmoden zu entfernen. Die Beziehung des Wellenleiterindex ist nKern > nTeflon AF > nLuft.
Typische Lösungsmittel des Kerns in der Flüssigchromatographie (LC) sind Wasser (n_Kern = 1.333), Methanol (n_Kern = 1.328) oder Acetonitril (n_Kern = 1.344). Folglich können Teflon AF 2400 (n = 1.294) oder Teflon AF 1600 (1.31) für den Hohllichtleiter verwendet werden. Je geringer der Brechungsindex des Hohllichtleiters ist, desto größer sind die Akzeptanzwinkel des Hohllichtleiters. Dies gestattet es, mehr Licht in den Hohllichtleiter zu fokussieren (ein größerer Akzeptanzwinkel), wodurch der Extinktionsmessungsdynamikbereich und die Extinktionsempfindlichkeit des Hohllichtleiters erhöht werden.
Der Bereich an Moden, welche sich in einem Flüssigwellenleiter fortpflanzen können, ist von der Ausgestaltung des Hohllichtleiters sowie dem Winkel, unter welchem das Licht in den Hohllichtleiter eingeführt wird, abhängig. Die Ausgestaltung des Hohllichtleiters und die Lichteinführungsbedingungen sollten das Einführen und Leiten von Moden höherer Ordnung vorsehen, da Moden höherer Ordnung eine größere Entfernung in der Flüssigkeit zurücklegen, wodurch sich die Extinktionsempfindlichkeit erhöht. Besitzen die Moden höherer Ordnung eine ausreichende Energie, so erhöht sich die Extinktionsempfindlichkeit des Hohllichtleiters infolge Blockierung der Moden niedrigerer Ordnung vor Einspeisung in den Hohllichtleiter. Der halbe Akzeptanzwinkel (oder Anschnittwinkel) eines Flüssigwellenleiters wird durch den Ausdruck θAkzeptanz = arcsin[(1/next)√(n1 2 – n2 2)]bestimmt.
Hierbei stellen n₁ und n₂ den Brechungsindex des Kerns (Lösungsmittel) bzw. des Hohllichtleiters (Teflon AF) dar, und n_ext stellt das externe Medium oder das Material der Übergangsstelle dar. Üblicherweise wird der Akzeptanzwinkel eines Flüssigwelienleiters ohne n_ext angegeben, d. h. n_ext = 1 für eine Luftübergangsstelle. Bei einem Flüssigwellenleiter muss jedoch das Lösungsmittel innerhalb des Leiters durch eine Art von Fenster enthalten sein. Unter Verwendung des vorherigen Ausdrucks sind in Tabelle 1 die Akzeptanzwinkel für drei unterschiedliche Übergangsstellen angegeben.
TABELLE 1
Es kann beobachtet werden, dass sich (1) in Cyclohexan eine größere Anzahl an Lichtmoden fortpflanzt, und (2) die Anzahl an Moden umso größer ist, je kleiner der Brechungsindex des Übergangsstellenmaterials ist. Ersteres wird durch die Chromatographie vorgeschrieben, und Letzteres kann über die Ausgestaltung des Hohllichtleiters kontrolliert werden. Das Licht kann entweder mittels einer Linse, oder mittels einer Lichtleitfaser, welche zu einem optimalen Konuswinkel des Lichtes führt, in den Hohllichtleiter eingekoppelt werden.
Die vorliegende Erfindung befürwortet die Verwendung einer Lichtleitfaser, deren Spitze mit Teflon AF beschichtet ist, wobei die Faserspitze in engem Kontakt mit dem Lösungsmittel ist. Bei dieser Konfiguration werden die Lichteinführungsbedingungen in die Lichtleitfaser, der Ausbreitungswinkel des Lichtes innerhalb der Lichtleitfaser durch das Teflon AF hindurch und in den Hohllichtleiter hinein durch den Akzeptanzwinkel und das Snell'sche Gesetz nLuftsinθLuft = nFasersinθFaser = nAFsinθAkzeptanz wiedergegeben, wobei n_Luft der Index der Luft ist, n_Faser der Brechungsindex des Faserkerns ist, und n_AF der Index des Teflon AF-Hohllichtleiters ist. Die Lichteinführungs- und Lichtfortpflanzungsbedingungen sind in Tabelle 2 für eine Lichtleitfaser mit und ohne Teflon AF an der Spitze angegeben, welche in direktem Kontakt mit dem Methanol im Flüssigwellenleiter steht.
TABELLE 2. Lichteinführungswinkel θ_Luft und Lichtfortpflanzungswinkel für unterschiedliche Materialien der Übergangsstelle
Obwohl die Erhöhung des Akzeptanzwinkels von Glas zu Teflon AF gering erscheint, wird die Energiedichte (welche eine quadratische Funktion des Radius darstellt), welche in den Hohllichtleiter eingeführt werden kann, sowie die Anzahl an Moden höherer Ordnung erhöht. Dies gewinnt an Bedeutung, wenn Punkte geringer Größe benötigt werden, um ein Einkoppeln in die für einen LC-Hohllichtleiter verwendeten Fasern mit geringem Durchmesser zu bewirken. In diesem Fall wird eine schnellere Linse benötigt, um einen Punkt geringer Größe zu erzeugen. Zusätzlich fungiert die Teflon AF-Beschichtung auf der Faser als Antireflexions (AR)-Beschichtung, wodurch die in den Hohllichtleiter übertragene Energie weiter erhöht wird.
Offensichtlich sollte das Licht mittels der Linsen 8 und 9 bei dem geeigneten Akzeptanzkonuswinkel in die Lichtleitfaser eingeführt werden. Ein Mischen von Moden innerhalb des Flüssigwellenleiters sollte minimiert werden, um das Auskoppeln von Licht (Verlust) in den Hohllichtleiter zu vermeiden. Das Mischen von Moden in einer Faser mit hoher NA (numerische Apertur) oder hohem Akzeptanzwinkel würde eine Verschiebung des Lichtes in die erlaubten Moden höherer Ordnung der Faser bewirken. Es ist möglich, dass diese Moden höherer Ordnung im Hohllichtleiter keiner Führung unterliegen würden, wenn dieser mit Methanol gefüllt wäre, jedoch einer Führung unterliegen würden, wenn dieser mit Cyclohexan gefüllt wäre. Dies führt zur Empfindlichkeit des Brechungsindex oder RI, und begünstigt eine Grundliniendrift während der Umkehrphasenchromatographie. Falls nötig kann ein Modenabstreifer verwendet werden, um einige Moden höherer Ordnung zu entfernen, bevor das Licht in den Flüssigwellenleiter eingeführt wird. In der HPLC wird Licht mit Wellenlängen von 190 nm bis 800 nm verwendet. Das ultraviolette Licht (190 nm bis 400 nm) bewirkt gewöhnlich eine Fotoverdunkelung der Lichtleitfaser, wodurch diese eine für eine Verwendung zu stark absorbierende Wirkung, genannt Solarisation, erlangt. Nicht-solarisierende Lichtleitfasern sind von Polymicro Technologies in Phoenix, AZ, erhältlich. Sie werden mit einem Kern aus hochreinem Siliziumdioxid (gelegentlich mit Störstellen kompensiert) und einem Mantel aus entweder schwermetalldotiertem Siliziumdioxid oder Teflon AF hergestellt. Gegenwärtig sind drei Fasern erhältlich, welche bezüglich einer Luftübergangsstelle mit den in Tabelle 3 dargestellten Akzeptanzwinkeln NA's von 0.22, 0.33 und 0.66 aufweisen. Die Verwendung einer 0.33 NA-Faser gestattet es, eine größere Anzahl an Moden, welche einer Führung unterliegen, in den Hohllichtleiter mit Methanol als flüssigem Kern einzuführen.
TABELLE 3. Tabelle der Spezifikationen von Lichtleitfasern
Die Brechungsindex (RI)-Empfindlichkeit wird mittels der Transmission T des Hohllichtleiters bei 280 nm für einen Kern aus Methanol in HPLC-Qualität, und anschließend für einen Kern aus Cyclohexan bestimmt. Die Differenz in deren Extinktion (A = log[1/T]) ergibt den RI: RI = AMeOH – ACyclo = log[1/TMeOH] – log(1/TCycl].
Die Extinktion, die Fresnel'sche Reflexion, die Brechung, der Schlerien-Effekt, sowie andere Faktoren bestimmen für jedes Lösungsmittel die Transmission. Die Extinktion von Methanol und Cyclohexan ist bei 280 nm nahezu gleichgroß, so dass lediglich die indexabhängigen Faktoren eine Rolle bei der Bestimmung des Detektorssignals spielen. Annehmbare RI-Empfindlichkeitswerte betragen gewöhnlich weniger als 10 mAU der äquivalenten Grundlinienabweichung, je kleiner desto besser. Eine 2%-ige Differenz in der Transmission zwischen MeOH- und Cyclohexanwellenleitern erzeugt 8.7 mAU's des RI.
Die RI-Empfindlichkeit ist von den in den Hohllichtleiter eingeführten Moden abhängig, da der kritische Winkel eine Abhängigkeit vom Index aufweist. Das Snell'sche Gesetz kann an der Übergangsstelle vom flüssigen Kern zum Teflon AF-Mantel nicht erfüllt werden, wenn der Winkel des Lichtes in Bezug auf das normale θ₁ größer ist als der kritische Winkel θ_c, d. h. θ₁ > θ_c oder θ₁ – θ_c > 0. θ₁ wird mittels des Snell'schen Gesetzes bestimmt, wobei θ1 = 90 – θr = arccos(ni/n1sinθi).
θ_i stellt den zum Flüssigwellenleiter äußeren Einfallswinkel mit einem Brechungsindex n_i dar. Der kritische Winkel ist θkritisch = arcsin(n2/n1).
5 ist eine graphische Darstellung von θ₁ – θ_c gegen θ_i für drei unterschiedliche flüssige Kerne mit n_i = 1. Beträgt θ₁ – θ_c > 0, so erfährt das gesamte Licht eine Totalreflexion und Führung. Beträgt θ₁ – θ_c < 0, so erfährt das Licht eine Brechung und wird an der Übergangsstelle reflektiert, wobei sich der Transmissionsverlust für jene Strahlen erhöht. Dies erfolgt bei MeOH und H₂O bei einem geringeren Einfalls- oder Akzeptanzwinkel als bei Cyclohexan und jenseits dessen, was zu einer Erhöhung des RI führt.
Eine andere Art, die Unterschiede in den Kopplungsverlusten zweier unterschiedlicher Flüssigwellenleiter nachzuvollziehen, kann durch mangelnde Übereinstimmung ihrer numerischen Aperturen in Bezug auf die Lichtleitfaser erfolgen. Jedes Lösungsmittel erzeugt einen Flüssigwellenleiter mit einer einzigartigen NA = √(n₁ ² – n₂ ²). Die Transmission für gekoppelte Wellenleiter (Faser zu Flüssigwellenleiter) mit mangelnder Übereinstimmung des NA ist durch T = [NA₁/NA₂]² gegeben. Die Extinktion bei mangelnder Übereinstimmung des NA kann dann durch A = log[(NALösungsmittel/NAFaser)2]ausgedrückt werden.
Der Verlust oder die scheinbare Extinktion beträgt Null, wenn die NA der übertragenden Faser kleiner ist als die NA des Lösungsmittels. Vorzugsweise bewirkt der empfangende Wellenleiter mit der größeren NA eine Maximierung der Transmission. Darüber hinaus erzeugt jedes Lösungsmittel eine unterschiedliche NA des Flüssigwellenleiters, was zu RI-Empfindlichkeit führen kann. Die NA's eines Methanol- oder Cyclohexan-Teflon AF (2400)-Flüssigwellenleiters betragen 0.3 bzw. 0.6. Tabelle 4 gibt die effektive Extinktion und die daraus resultierende RI-Empfindlichkeit für diese Bedingungen an.
Tabelle 4: Effektive Extinktionen (A) und RI-Empfindlichkeit infolge mangelnder Übereinstimmung der numerischen Apertur
Diese Beobachtungen führen zu nachfolgenden Ausgestaltungsüberlegungen hinsichtlich einer Minimierung der RI-Empfindlichkeit und einer Maximierung der Lichtkopplung: NAEinOF ≤ NALW ≤ NAAusOF.
Hier stellen NA_EinOF, NA_LW und NA_AusOF die numerische Apertur der lichteinleitenden Faser, des Flüssigwellenleiters bzw. der lichtausleitenden Faser dar. Für eine maximale Kopplung sollte der Durchmesser d_EinOF der lichteinleitenden Faser darüber hinaus gleichgroß oder kleiner sein als die Bohrung d_LW des Flüssigwellenleiters, und der Durchmesser d_AusOF der lichtausleitenden Faser sollte gleichgroß oder größer sein als die Bohrung des Flüssigwellenleiters, dEinOF ≤ dLW ≤ dAusOF.
Ein anderer Faktor, welcher den RI bestimmt, ist die Nähe der Lichtleitfaser zur Bohrung des Teflon AF-Hohllichtleiters. In bisherigen Ausgestaltungen existiert ein Zwischenraum, welcher es dem Lösungsmittel gestattet, in den Hohllichtleiter und aus dem Hohllichtleiter zu strömen. Die Extinktion für einen Zwischenraum des Abstandes z mit dem Index n₀ zwischen zwei Fasern mit den numerischen Aperturen NA und den Radien r ist A = log[1/(1 – zNA/2rn0)].
Da der Zwischenraum entweder mit MeOH, n₀ = 1.328, oder Cyclohexan, n₀ = 1.426, gefüllt sein kann, kann, wenn ein Zwischenraum existiert, ein Unterschied in den optischen Verlusten auftreten, was zu RI-Effekten führt. Um annehmbare RI-Werte zu erzielen, wäre es wünschenswert, die Lichtleitfaser innerhalb von 254 μm (0.010 Zoll) (~6 mAU des RI) von der Hohllichtleiterbohrung zu halten, wenn die Durchmesser des Hohllichtleiters und der Lichtleitfaser, und deren numerische Aperturen, übereinstimmen.
Eine weitere Quelle des RI ist eine winkelförmige Fehlausrichtung, für welche die Extinktion durch A = log[1/(1 – (8n0sinθ)/(3πNA))]gegeben ist, wobei θ der Winkel der Faserachse in Bezug auf die optische Achse des Hohllichtleiters ist. Die winkelförmige Fehlausrichtung sollte unterhalb von einem Grad gehalten werden, um eine RI-Empfindlichkeit von unter 7 mAU zu erzielen.
Wird die Lichtleitfaser in den Hohllichtleiter eingeführt, so muss zum Hindurchtreten des Fluids ein Zwischenraum vorhanden sein. Der Zwischenraum ermöglicht eine gewisse winkelförmige Fehlausrichtung, so dass das Einsetzen der lichteinleitenden Faser in den Hohllichtleiter nicht notwendigerweise den Lichtverlust, welcher aus einer winkelförmigen Fehlausrichtung resultiert, oder die RI-Empfindlichkeit gegenüber einer winkelförmigen Fehlausrichtung eliminiert.
Eine Biegung verändert den Einfallswinkel des Lichtes auf die Kern-Mantel-Übergangsstelle und verändert die Bedingungen für die Totalreflexion, wodurch ein Auskoppeln oder Verluste erhöht werden. Die Biegeverluste verändern sich bei einem Flüssigwellenleiter auch in Abhängigkeit von der Flüssigkeit innerhalb des Leiters und haben eine RI-Empfindlichkeit zur Folge. Zusätzlich induziert ein Aufwinden des Flüssigwellenleiters das Auskoppeln von Moden höherer Ordnung, wodurch sich die Detektionsempfindlichkeit verringert. Darüber hinaus könnte sich Licht im Mantel fortpflanzen und möglicherweise durch die ausleitende Faser als Rauschen eingefangen werden. Mantelmoden sollten vermieden werden, da sie eine Quelle für Grundlinienrauschen darstellen, welches die Detektionsempfindlichkeit und den Dynamikbereich verringert. Ist der Flüssigwellenleiter gewunden, so müssen die Eingangsmoden mittels eines Modenreglers auf jene Moden reduziert werden, welche bei diesem Biegegrad und der daraus resultierenden Mischung von Moden nicht verlustbehaftet sind.
Die oben erwähnten indexabhängigen Extinktionsunterschiede, umfassend 1) Fresnel'sche Reflexion, 2) mangelnde NA-Übereinstimmung, 3) longitudinale Trennung, 4) winkelförmige Fehlausrichtung und 5) Biegeverluste, induzieren RI's, welche kumulativ sind. Sofern der Hohllichtleiter nicht konzipiert ist, diese indexabhängigen Verluste zu vermeiden, ist die RI-Empfindlichkeit (und somit die Grundlinienstörung) inakzeptabel hoch.
Die Verwendung der Gleichung für den halben Akzeptanzwinkel der Lichtleitfaser gestattet halbe Winkel von 12.90 Grad oder weniger. Größere Winkel werden jedoch von einer Multimodenlichtleitfaser unterstützt, werden jedoch möglicherweise vom Lichtwellenleiter nicht unterstützt. Zusätzlich besteht für die modellierten physikalischen Bedingungen eine Toleranz des RI für Durchmesser zwischen 508 μm (0.020 Zoll) und 559 μm (0.022 Zoll). Darüber hinaus ist das Ausrichten auf größere Durchmesser (508 μm) (> 0.02 Zoll) besser als auf kleinere Durchmesser (< 508 μm) (< 0.022 Zoll). Diese Toleranz zeigt darüber hinaus, dass es möglich und potentiell wünschenswert ist, den Hohllichtleiter konisch zulaufen zu lassen. Bezug nehmend auf 6, in welcher gleiche Teile mit den gleichen wie in 4 angegebenen Bezugzeichen bereitgestellt werden, würde beispielsweise der Eingangsdurchmesser des Hohllichtleiters 61 559 μm (0.022 Zoll), und der Ausgangsdurchmesser 508 μm (0.020 Zoll) betragen. Auf diese Weise könnten lichteinleitende und lichtausleitende Fasern 26 und 34 mit gleichgroßem Durchmesser verwendet werden.
Um Verwirbelungen zu vermeiden, welche eine Bandenverbreiterung sowie Lichtstreuung verursachen, ist es von Bedeutung, einen laminaren Fluss über den gesamten Hohllichtleiter hinweg aufrechtzuerhalten. Es ist ebenfalls von Bedeutung, dass die Einführung des Fluids keine Störung der Einführung des Lichtes bewirkt. In bisherigen Hohllichtleitern und Flusszellen trat das Fluid parallel zum Eingangsfenster oder senkrecht zum Strahlengang ein, und machte anschließend eine scharfe Wende in den Flüssigwellenleiter hinein.
Im Falle eines fasergekoppelten Rohres ist eine Öffnung entlang der Wand des Hohllichtleiters für den Prozess der Totalreflexion, welche den Durchtritt von Licht durch den Flüssigwellenleiter aufrechterhält, abträglich. Darüber hinaus betragen die Eingangsrohrdurchmesser für Hohllichtleiter mit Millilitervolumen typischerweise 254 μm (0.010), wobei ein Loch von 254 μm (0.010) in einem Hohllichtleiter des Durchmessers 508 μm (0.020) die Entfernung eines erheblichen Anteils der Wand erfordert.
Ein besserer Ansatz ist jener, welcher in 4 dargestellt ist. In der ersten Ausgestaltung wird durch den radialen Druck des Teflon AF auf die PEEK-Spitze eine Abdichtung zwischen der Abschlusskappe und dem Teflon AF-Hohllichtleiter erzeugt. Das Fluid tritt in den Flüssigwellenleiter ein, indem es zunächst rund um die Lichtleitfaser herum strömt. Das Fluid tritt in einen Verteiler oder einen ringförmigen Raum ein, so dass es vor symmetrischem Eintreten in den Flüssigwellenleiter die Lichtleitfaser vollständig umgibt. Diese Ausgestaltung, oder andere Ausgestaltungen, welche aufgrund der hier beschriebenen Lehre vorstellbar sind, bewirken eine Abdichtung sowie eine Fluid- und Lichteinführung, ohne die Kontinuität des Flüssigwellenleiters und den Prozess der Totalreflexion zu unterbrechen.
Die Pumpe eines HPLC-Systems wird meistens in einem Modus von konstantem Fluss betrieben, so dass sich der Ausgangsdruck verändert, sobald sich die Viskosität des Lösungsmittels ändert. Während der Gradientenelution verändert sich die Viskosität ebenfalls. Die Druckänderung ist direkt proportional zur Änderung der Viskosität. Da sich Teflon AF infolge von Druckänderungen ausdehnen kann, kann sich der Kerndurchmesser des Hohllichtleiters verändern. Diese Veränderungen werden durch den Körper 71 minimiert. Am Lichteingangsende des Hohllichtleiters kann eine druckinduzierte Ausdehnung die Apertur der Lichtakzeptanz erhöhen, am Lichtausgangsende kann die Ausdehnung jedoch zu einer Erhöhung des Lichtverlustes führen. Fängt das Lichteingangsende des Teflon AF zunächst alle in die Lichtleitfaser eingespeisten Moden ein, so hat die Ausdehnung geringe Auswirkungen. Allerdings könnte eine Kontraktion aufgrund einer Druckabnahme die Kopplung beeinflussen. Dort wo das Licht von dem Teflon AF-Hohllichtleiter in die lichtausleitende Faser gekoppelt wird, könnte ein Druckanstieg dazu führen, dass sich der Leiter stärker ausdehnt als die Lichtleitfaser. Die Erhöhung des Durchmessers des Leiters, welche während eines Umkehrphasengradienten auftreten könnte, würde eine mangelnde Übereinstimmung des Durchmessers zwischen der Bohrung des Teflon AF und der lichtauskoppelnden Faser zu Folge haben.
Eine geringe Kontraktion des Teflon AF-Hohllichtleiters am Lichtausgangsende würde zu einer geringen Veränderung des Lichtes führen, welches vom Hohllichtleiter in die Faser gekoppelt wird. Je nach Ausgestaltung des Hohllichtleiters und dem Bereich an Druckänderungen sind viele Kombinationen dieser Bedingungen möglich, wobei diese zu RI-Empfindlichkeit und druckabhängigem Kurzzeitrauschen führen können. Die Verwendung bisheriger Ungleichmäßigkeiten bei numerischen Aperturen und Durchmessern, welche angepasst sind, um Druckänderungen zu berücksichtigen, verhindert eine Druckempfindlichkeit des Hohllichtleiters. Zusätzlich bewirkt auch das Kontrollieren der Moden eine Kontrolle der Druckempfindlichkeit des Hohllichtleiters.
Das Kontrollieren der Moden ist ein wesentlicher Punkt, um die Leistung eines für chromatographische Anwendungen verwendeten Flüssigwellenleiters zu optimieren. Alle RI-Ausgaben können mittels eines Modenreglers angesteuert und kontrolliert werden. Dies bedeutet, dass durch das Kontrollieren des in die Lichtleitfaser eingespeisten Lichteingangskonuswinkels die Moden selektiert werden können, welche sich durch das System hindurch fortpflanzen. Dies wird durch ein verstellbares Linsensystem mittels einer verstellbaren Iris, räumlichen Sperrfiltern, einem beugenden Element, oder einer Kombination dieser Elemente bewirkt. Zusätzlich kann, nachdem das Licht in die Lichtleitfaser eingespeist wurde, ein Fasermodenabstreifer verwendet werden, um unerwünschte Moden höherer Ordnung zu entfernen.
Bei einigen Lichtquellen ist die Lichtenergie nicht gleichmäßig über das gesamte Modenspektrum hinweg verteilt. Ein Mischen oder Kombinieren von Moden kann innerhalb einer eng gewundenen Lichtleitfaser bewirkt werden, um eine räumlich gleichmäßige Lichtquelle zu erzeugen.
Das Mischen von Moden ist von Bedeutung, wenn die Lichtquelle nicht homogen ist. Dies ist gewöhnlich für die in der LC verwendeten Wolfram-Halogenlampen der Fall. Die Erzeugung eines homogenen Strahls ist bei der Vermeidung von Fotobleichung behilflich, welche durch Lichtpunkte hoher Intensität verursacht wird. Das Mischen von Moden wird typischerweise durch ein Aufwinden der Faser, wie in 19, 1–3, dargestellt, oder durch Einführen scharfer Biegungen entlang eines kurzen Abschnitts der Faser bewirkt.
Diffus gestreutes Licht addiert sich zum Rauschen des Systems hinzu, wenn es nicht durch den Analyten absorbiert wird und anschließend in das Detektionssystem eintritt. Durch Streuung, welche auftritt, wenn die Flüssig-Teflon AF-Übergangsstelle nicht „optisch glatt" ist, entsteht ein optischer Verlust. Wie von Altkorn et al. diskutiert, kann auch die Qualität der inneren Oberfläche in Abhängigkeit vom Lösungsmittel Verlustunterschiede hervorrufen. Diese Unterschiede haben einen RI-Effekt zur Folge. Beträgt beispielsweise der durch Streuverluste hervorgerufene Transmissionsunterschied zwischen zwei Lösungsmitteln 1.1%, so führt dies zu einer RI-Empfindlichkeit, welche äquivalent zu –5 mAU ist. Die Streuung ist proportional zur Rauigkeit geteilt durch die Wellenlänge im Quadrat. Kürzere Wellenlängen werden stärker gestreut. In der Ramextrusion von Teflon AF wird die Qualität der inneren Oberfläche durch die Oberflächenqualität des Extrusionsstempels und die Kontrolle des Extrusionsverfahrens bewirkt. Biogeneral, San Diego, CA haben von Oberflächenabweichungen von weniger als 0.0003 Zoll oder 7 Mikrometer berichtet. Diese Abweichung ist sehr viel größer als die kürzeste in der LC verwendete Lichtwellenlänge. Alternativ bewirkt das Ausziehen von Teflon AF aus einer Vorform eine Oberflächenqualität, welche von der Qualität der Vorform und den Herstellungsbedingungen abhängig ist. Da die in der Literatur beobachteten Streuverluste für Wellenlängen im UV-Bereich, insbesondere in einem Flüssigwellenleiter großer Länge, inakzeptabel sind, ist es vonnöten, das Herstellungsverfahren und das Bearbeiten, oder das Nachbearbeiten von Teflon AF, zu verbessern, wodurch sich die Rauigkeit der inneren Oberfläche verringert. Es stehen Verfahren zur Verfügung, um die Qualität der inneren Oberfläche des Teflon AF-Hohllichtleiters zu kontrollieren. Um die Rauigkeit der Oberfläche zu verringern, kann der Teflon AF-Schlauch auf einem ultraglatten Dorn extrudiert werden. Nachdem das Teflon AF ausgehärtet ist, kann es von dem Dorn durch Erwärmen entfernt werden, wobei sich das Teflon AF bezüglich des Dorns thermisch ausdehnt. Es ist auch möglich, die Rauigkeit der inneren Oberfläche nach Extrusion unter Verwendung eines Dorns zu verringern. In diesem Verfahren wird das Teflon AF zur Aufweitung der Bohrung zunächst erwärmt, und anschließend ein ultraglatter Dorn in die Bohrung eingebracht. Die Temperatur des Teflon AF wird herabgesetzt, so dass es sich leicht um den Dorn herum zusammenzieht. Es wird dem Teflon AF hinreichend Zeit zugestanden, um bei der erhöhten Temperatur ein Kaltfliessen zu vollziehen. Um das Fließen des Teflon AF zu unterstützen, so dass sich dieses an die Oberfläche des Dorns anpasst, kann darüber hinaus Druck ausgeübt werden. Der Dorn wird anschließend mittels des zuvor beschriebenen Erwärmungsverfahrens entfernt. Andere Verfahren zur Glättung einer Oberfläche gemäß Stand der Technik können das Polieren mit Verfahrensschlicker, welcher durch die Bohrung hindurchtritt, oder Plasmaätzen umfassen.
Die Dicke des Teflon AF-Hohllichtleiters sollte derart angepasst sein, dass sie dicker ist als die verschwindend geringe Eindringtiefe von Wellen in den Hohllichtleiter hinein. Das elektromagnetische Feld fällt gemäß E = E0exp(–δ/dp)in den Hohllichtleiter hinein ab, wobei δ der Abstand von der Oberfläche der Übergangsstelle ist. Die Eindringtiefe d_p stellt eine Funktion der Lichtwellenlänge λ und des Einfallswinkels θ dar, wobei dp = λ/[2·pi·(n2 Kern·sin2θ – n2 Mantel)]1/2 ist. Die Eindringtiefe erhöht sich mit der Wellenlänge und verringert sich mit zunehmendem Einfallswinkel. Bei λ = 589 nm, einem Einfallswinkel von 85°, und für n_Kern = 1.328 und n_Mantel = 1.294 fällt das elektrische Feld E bei einem Abstand von δ = d_p = 3.4 Mikrometer auf 1/e des Anfangswertes ab. Im Allgemeinen besitzen kürzere Wellenlängen und Moden höherer Ordnung geringere Eindringtiefen. Es ist ersichtlich, dass die erforderliche optische Dicke sehr gering ist. Typischerweise wird für den Mantel eines Hohllichtleiters eine Dicke verwendet, welche dem Zehnfachen der charakteristischen Eindringtiefe d_p entspricht dMantel ≥ 10 × dp.
Ohne einen Puffer oder einen äußeren Träger sollte die Dicke des Teflon AF-Mantels erhöht werden, um dem Betriebsdruckbereich Rechnung zu tragen. Beträgt der maximale Innendruck beispielsweise 3446 × 10³ N/m² (500 psi), und es ist eine Wanddicke erwünscht, welche dem Dreifachen des Berstdruckes entspricht, so sollte die Wanddicke in etwa 711 μm (0.028 Zoll) betragen. Zusätzlich können Druckänderungen, welche aufgrund von Viskositätsänderungen bei einem System mit konstanter Flussrate auftreten, dazu führen, dass sich der Durchmesser des Hohllichtleiters erhöht.
Die Übergangsstelle zur flüssigen Quelle muss der Flüssigkeit unter Aufrechterhaltung eines laminaren Flusses ein freies Strömen gestatten, und sollte den Fluss der optischen Energie durch die Übergangsstelle der Lichtleitfaser nicht stören. Im vorliegenden Beispiel, 1, wird all dies mittels einer Presspassung zwischen der Lichtleitfaser und dem benachbarten Material bewirkt. Im Falle, dass die Kompression zu hoch ist und hierdurch das optische Feld gestört wird, kann die Faser mit Teflon beschichtet werden, welches als Dichtung bei jedwedem Kompressionsverfahren fungiert. Die Flexibilität von Teflon minimiert die Kompression der Quarzglasfaser und verhindert somit eine Störung des optischen Feldes. Die Beschichtung kann der Puffer sein, oder aber als zusätzliche Schicht erfolgen.
Teflon AF besitzt eine sehr hohe Gasdurchlässigkeit. Tatsächlich wird Teflon AF 2400 nunmehr als Entgasungsmaterial für HPLC-Entgaser verwendet. Die Gasdurchlässigkeit von Teflon AF 2400 ist um mehr als zwei Größenordnungen höher als bei herkömmlichen Polymeren wie Polycarbonat. Poly-1-trimethylsilyl-1-propin, oder PTMSP, stellt das einzige Material dar, welches die Gasdurchlässigkeit von Teflon AF übertrifft. Das Eindiffundieren von Gas kann die Extinktionsmessungen verändern. Die durch das Eindiffundieren von Gas hervorgerufenen Effekte sind von der Flussrate des Lösungsmittels, dem Außendruck und der Länge des Teflon AF abhängig. Im Allgemeinen werden in der LC hohe Flussraten verwendet, weshalb der Hohllichtleiter sehr lang sein muss, um im Vakuum untergebracht werden zu müssen. Somit ist das Einbringen in Vakuum für die Messung sehr geringer Extinktionen geeignet.
Der Durchmesser des Wellenleiters kann für Anwendungen in der μLC, LC und CE angepasst werden. Einschränkungen hinsichtlich des Durchmessers ergeben sich lediglich aus der Verbindung zwischen der Lichtleitfaser und dem Flüssigwellenleiter. Dies bedeutet, dass der Durchmesser des Faserkerns das Licht der längsten zu verwendenden Wellenlänge fortpflanzen muss. In der LC liegt der typische Wellenlängenbereich beispielsweise zwischen 190 Nanometern und 800 Nanometern. Bei λ = 800 nm beträgt der minimale Kerndurchmesser einer Faser etwa 12.5 Mikrometer, und der Durchmesser des Hohllichtleiters etwa 25 Mikrometer. Somit wäre der minimale Innendurchmesser des Teflon AF für eine Faserkopplung etwa 10 Mikrometer. Für ein μLC-Volumen von 10 nL und einen Durchmesser von 10 Mikrometer würde die Länge 12.74 mm betragen, etwa zehnmal länger als bei bisherigen μLC-Extinktionsmesszellen. Das Einkoppeln eines breiten Lichtspektrums in einen kleinen Kern stellt selbst mit achromatischen Linsen eine Schwierigkeit dar, kann jedoch mittels geeigneten reflektierenden Oberflächen bewirkt werden. Für LC-Zellen betragen die üblichen Volumina zwischen 10 und 15 Mikroliter. Einschränkungen hinsichtlich der Teflon AF-Bohrung bei Verwendung eines Fasereingangs sind wiederum lediglich von der Lichtleitfaser abhängig. Wird anstelle einer Faser ein Fenster verwendet, so wird der Durchmesser der Teflon AF-Bohrung durch die numerische Apertur des Flüssigwellenleiters und durch die Punktgröße oder den Durchmesser der Teflon AF-Bohrung kontrolliert. Die Verwendung des gleichen Bohrungsdurchmessers von 10 Mikrometern und eines Volumens von 10 Mikrolitern würde eine Zelllänge von etwa 127 Metern ergeben. Eine derartige Zelle würde für die Detektion ultraniedriger Extinktionen Anwendung finden und zeigt die Skalierbarkeit eines Teflon AF-Extinktionsflüssigwellenleiters. Typischerweise besitzt eine Zelle mit einem Volumen von 11 Mikrolitern einen Durchmesser von 0.5 mm und eine Länge von 50 mm, wodurch die fünffache Empfindlichkeit einer Standardflusszelle erreicht wird.
Der Volumenkoeffizient der thermischen Ausdehnung für Teflon AF 2400 beträgt 301 ppm/°C. Die thermisch induzierte Ausdehnung von Teflon AF übt über die Betriebstemperatur eines LC-Gerätes hinweg keinen bedeutenden Effekt auf den Durchmesser des Hohllichtleiters aus. Es sind jedoch temperaturinduzierte Indexänderungen des Lösungsmittels, welche RI-Probleme verursachen, aus dem Stand der Technik bekannt (siehe U.S.-Patent 4,192,614). In analoger Weise zu U.S.-Patent 4,192,614 sollte der äußere Körper des Hohllichtleiters in einem thermisch leitfähigen Material, wie beispielsweise Stahl, Messing oder Aluminium, mit großer thermischer Masse enthalten sein, um dem Teflon AF beim schnellen Erreichen des thermischen Gleichgewichts behilflich zu sein. Da es jedoch erwünscht ist, dass der Flüssigwellenleiter keiner Spannung unterliegt, sollte das Teflon AF mittels eines thermisch leitfähigen Schmierfetts, oder Silikonklebstoff, oder Gel, oder mittels eines anderen geeigneten Materials mit dem Metallgehäuse in thermischen Kontakt gebracht werden. Wie in U.S.-Patent Nummer 4,192,614 angewiesen, sollte darüber hinaus das Rohr, welches das Fluid in die Flusszelle einleitet, aus einem thermisch leitfähigen Material hergestellt sein, wobei es mit dem äußeren Körper des Hohllichtleiters in Kontakt gebracht werden kann, so dass das Eingangsfluid im thermischen Gleichgewicht ist.
In der LC werden viele Chemikalien unterschiedlicher Härte verwendet, weshalb der Hohllichtleiter aus inerten Materialien hergestellt sein sollte. Zusätzlich erfordert die Quantifizierung von Proteinen mittels LC Materialien, welche keine Denaturierung derselben bewirken, wie z. B. Eisen. Teflon AF und PEEK stellen sehr bedachte Materialien dar, welche zur Herstellung des hier beschriebenen Hohllichtleiters verwendet werden. In einigen Fällen kann die aus schwermetalldotiertem Quarzglas hergestellte Lichtleitfaser durch die in einer bestimmten Anwendung verwendeten Lösungsmittel angegriffen werden. Die Lichtleitfaser kann jedoch mit Teflon beschichtet werden, um dieses potentielle Problem zu eliminieren.
Die lichteinleitende Faser muss nicht, wie in 4 dargestellt, in die Bohrung des Hohllichtleiters hineinragen. Sie muss lediglich innerhalb eines kritischen Abstandes sein, welcher vom niedrigsten Brechungsindex der Lösung sowie den Durchmessern der Lichtleitfaser und des Hohllichtleiterkerns abhängig ist, und in etwa 102 μm (0.004 Zoll) oder weniger beträgt. 7 zeigt einen Hohllichtleiter 61, wobei dessen Eingangsende vom Ende der Eingangsfaser 26 einen Abstand aufweist. Der Faserträger 86 ist zum Hohllichtleiter 31 hin mittels einer Dichtung 87 abgedichtet. Das Ende der Lichtleitfaser ist durch einen Abstand d_c beabstandet, um das Einströmen des Probenfluids in den Hohllichtleiter zu gestatten. Der Abstand d_c sollte nicht größer sein als der Innendurchmesser des Hohllichtleiters 31 und ist vom Brechungsindex des Lösungsmittels abhängig.
Der Hohllichtleiter kann gekrümmt sein oder Windungen aufweisen, um eine erhöhte Weglänge für das Licht bereitzustellen, während die physikalische Größe minimiert wird. Ein Flüssigprobenanalysesystem, welches einen mit Windungen versehenen Hohllichtleiter 88 aufweist, ist schematisch in 8 dargestellt, wobei die gleichen Bezugszeichen wie für die in 4 verwendeten gleichen Teile verwendet wurden. Wie oben beschrieben, müssen die Eingangsmoden zur Minimierung des RI angepasst werden.
Es wird ein fasergekoppeltes Analysesystem einschließlich einer Durchflusszelle bereitgestellt, welche einen Flüssigwellenleiter oder Hohllichtleiter, der in der Nähe der Analytenquelle und fernab der Lichtquelle angeordnet sein kann, optische Komponenten sowie eine Signalverarbeitungselektronik aufweist. Es wird ein neues Verfahren und eine neue Struktur für eine ungepufferte Flüssigdurchflusszelle mit hoher NA und flüssigem Kern gelehrt, welche Licht durch Totalreflexion zur Bestimmung der Extinktion eines Analyten leitet und in der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Kapillarflüssigchromatographie (μLC) und Kapillarelektrophorese (CE), Kapillarelektrochromatographie (CEC), in der Überkritischen Flüssigchromatographie (SFC), der Fließinjektionsanalyse (FIA), und damit in Verbindung stehenden Techniken Verwendung findet. Die Durchflusszelle umfasst einen Hohllichtleiter, welcher eine hohe Extinktionsempfindlichkeit, ein geringes Streuungsrauschen, eine hohe Transmissionseffizienz, eine geringe RI-Empfindlichkeit, sowie eine geringe Empfindlichkeit in Bezug auf Druckänderungen und Gasdurchlässigkeit aufweist, und welcher aus einem extrudierten oder einem aus einer Vorform ausgezogenen Teflon AF-Schlauch auf einfache Weise hergestellt wird. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Hohllichtleiter für Moden höherer Ordnung optimiert, welche die Extinktionsempfindlichkeit erhöhen, weist eine geringe RI-Empfindlichkeit auf, besitzt eine hohe Transmissionseffizienz und ein geringes Streuungsrauschen, ist in Bezug auf Temperatur- und Druckänderungen relativ unempfindlich, ist über einen großen Druckbereich hinweg betreibbar, weist eine geringe Empfindlichkeit in Bezug auf Druckänderungen und Gasdurchlässigkeit auf, und wird auf einfache Weise aus einem extrudierten oder einem aus einer Vorform ausgezogenen Teflon AF-Schlauch hergestellt. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können Fluoreszenzmessungen vorgenommen werden, da Teflon AF hochtransparent ist und keine streuenden Eigenschaften besitzt.

Claims

Flüssigprobenanalysator, umfassend: eine Durchflusszelle (29), welche einen Hohllichtleiter (61) umfasst, der aus einem Material mit niedrigem Brechungsindex besteht und einen Kerndurchmesser vorgegebener Größe aufweist, durch den eine flüssige Probe hindurchströmen kann, eine lichteinleitende Faser (26), welche einen Kerndurchmesser aufweist, der dem Kerndurchmesser des Hohllichtleiterkerns entspricht oder kleiner als dieser ist, zum Einbringen von Licht in den Hohllichtleiter (61), wobei das Ende der Lichtleitfaser (26) bezüglich des Hohllichtleiters (61) derart positioniert ist, dass gebrochenes Licht aus dem Kern der Lichtleitfaser vom Kern des Hohllichtleiters aufgenommen wird, eine lichtausleitende Faser (34), welche einen Kerndurchmesser aufweist, der dem Kerndurchmesser des Hohllichtleiterkerns entspricht oder größer als dieser ist, zum Aufnehmen von Licht, welches entlang des Hohllichtleiters (61) übertragen wurde, aus der einleitenden Faser (26), wobei die einleitende Faser (26) eine numerische Apertur aufweist, welche der numerischen Apertur des Hohllichtleiters (61) entspricht oder geringer als diese ist, wenn die flüssige Probe den Kern des Hohllichtleiters belegt, dadurch gekennzeichnet, dass die ausleitende Faser (34) eine numerische Apertur aufweist, welche der numerischen Apertur des Hohllichtleiters (61) entspricht oder größer als diese ist, wenn die flüssige Probe den Kern des Hohllichtleiters belegt.
Flüssigprobenanalysator nach Anspruch 1, wobei der Hohllichtleiter (61) aus Teflon AF hergestellt ist.
Flüssigprobenanalysator nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Hohllichtleiter eine solche Dicke besitzt, dass er den üblicherweise in der Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie verwendeten hohen Drücken standhält.
Flüssigprobenanalysator nach Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3, welcher ein Flüssigprobeneingangsrohr (72) umfasst, das in engem thermischen Kontakt mit einem Hohllichtleiterträgerkörper (71) steht, um die Probe rasch in das thermische Gleichgewicht zu bringen.
Flüssigprobenanalysator nach Anspruch 1, wobei die ringförmige Ausrichtung der lichteinleitenden Faser (26) und der lichtausleitenden Faser (34) in Bezug auf den Kern des Eingangs- und Ausgangshohllichtleiters minimiert ist, um die Empfindlichkeit des Brechungsindex unterhalb von ±7 Milli-Absorptionseinheiten (mAE) aufrechtzuerhalten.
Flüssigprobenanalysator nach Anspruch 1, wobei die laterale Ausrichtung der lichteinleitenden Faser (26) und der lichtausleitenden Faser (34) in Bezug auf den Kern des Eingangs- und Ausgangshohllichtleiters minimiert ist, um die Empfindlichkeit des Brechungsindex unterhalb von ±7 Milli-Absorptionseinheiten (mAE) aufrechtzuerhalten.
Flüssigprobenanalysator nach Anspruch 1, wobei zum Kontrollieren der Anfangsbedingungen des eingehenden Lichtes in die lichteinleitende Faser (26) ein Modenregler (28) und/oder ein Modenmischer verwendet wird/werden, um die Empfindlichkeit des Brechungsindex zu minimieren.
Flüssigprobenanalysator nach Anspruch 1, wobei die lichtausleitende Faser (34) während des Nieder- und Hochdruckbetriebs, oder wenn aufgrund von Viskositäts- oder Temperaturänderungen Drücke den Kerndurchmesser des Hohllichtleiters verändern, größer ist als der Kern des Hohllichtleiters.
Flüssigprobenanalysator nach Anspruch 1, wobei der Biegeradius des Hohllichtleiters (61) zur Vermeidung optischer Verluste, welche eine BI-Empfindlichkeit von mehr als ±7 Milli-Absorptionseinheiten (mAE) verursachen würden, minimiert ist.
Flüssigprobenanalysator nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtleitfasern eine Beschichtung aus Teflon AF aufweisen.
Flüssigprobenanalysator nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der konisch zulaufende Kerndurchmesser des Hohllichtleiterkerns an der lichteinleitenden Faser den größeren Durchmesser aufweist, und der Kegeldurchmesser an der lichtausleitenden Faser kleiner ist als die lichtausleitende Faser.