DE60120667T2

DE60120667T2 - Methoden und mittel zur behandlung von bandscheibenverschleiss

Info

Publication number: DE60120667T2
Application number: DE60120667T
Authority: DE
Inventors: William Jeffrey Austin MOEHLENBRUCK; Paul John Austin RANIERI
Original assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Current assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-09
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2021-04-10
Also published as: EP1707225A3; DE60120667D1; ES2263612T3; WO2001076654A1; CA2400826A1; US6723335B1; US20050002909A1; US7556649B2; JP2003530364A; EP1272236A1; CA2400826C; EP1272236B1; EP1707225A2; US20100021439A1; US20110256106A1

Description

Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Zusammensetzungen und Verwendungszwecke, die beim Behandeln von Bandscheibenbeeinträchtigungen bei Menschen und anderen Säugetieren nützlich sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die beim Wiederherstellen der hydrodynamischen Funktion und beim Stimulieren der Zellproliferation und der Herstellung einer extrazellulären Matrix bei Bandscheiben, die durch Verletzung, degenerative Erkrankung, angeborene Abnormalitäten und/oder durch den Alterungsprozess beeinträchtigt sind, nützlich sind.
Zusammensetzungen der Erfindung können injizierbar sein und können Wachstumsfaktoren, bioaktive Mittel und lebende Zellen umfassen. Die Zusammensetzungen sind nützlich, um die hydrodynamische Funktion der Bandscheibe wiederherzustellen, zu verbessern oder zu erhöhen, die Bandscheibenhöhe zu erhöhen und die Zellproliferation und/oder Herstellung einer extrazellulären Matrix bei Bandscheiben zu stimulieren.
Die Columna vertebralis (Wirbelsäule) des Menschen umfasst eine Mehrzahl von in Gelenkverbindung stehenden knöchernen Elementen (Wirbeln), die durch Bandscheiben aus weichem Gewebe getrennt sind. Die Bandscheiben sind flexible Gelenke, die eine Beugung, Streckung und Drehung der Wirbel relativ zueinander ermöglichen und dadurch zur Stabilität und Beweglichkeit der Wirbelsäule im axialen Skelett beitragen.
Die Bandscheibe besteht aus einem mittigen, inneren Abschnitt eines weichen, amorphen, mukoiden Material, dem Nucleus pulposus, der an der Peripherie von einem kreisförmigen Ring aus Schichten aus einem zähen, fasrigen Material umgeben ist, der als Annulus fibrosus bekannt ist. Der Nuc leus pulposus und der Annulus fibrosus sind zusammen an ihrem oberen und unteren Ende (d.h. kranial und kaudal) durch Wirbelendplatten verbunden, die an dem oberen und dem unteren Ende benachbarter Wirbel angeordnet sind. Diese Endplatten, die aus einer dünnen Schicht aus Hyalinknorpel bestehen, sind an ihrer Peripherie direkt mit den Lamellen der Innenabschnitte des Annulus fibrosus verbunden. Die Lamellen der äußeren Abschnitte des Annulus fibrosus sind an den Außenrändern der benachbarten Wirbel direkt mit dem Knochen verbunden.
Der weiche, mukoide Nucleus pulposus enthält Chondrozyten, die Kollagenfibrillen (vorwiegend Kollagen vom Typ II, aber auch vom Typ IX, XI und anderen) und große Moleküle negativ geladener, sulfathaltiger Proteoglykane erzeugen, wie in 1 gezeigt ist. Der Begriff „Matrix" bezieht sich gemäß seiner Verwendung in dem vorliegenden Dokument auf eine Zusammensetzung, die eine strukturelle Stütze für die Atmung und Bewegung von Nährstoffen und Wasser zu und von einer Bandscheibe liefert und die die besagte Atmung und Bewegung von Nährstoffen und Wasser zu und von einer Bandscheibe ermöglicht. Die kollagenhaltigen Komponenten der extrazellulären Matrix des Nucleus pulposus umfassen ein Gerüst, das eine Anhaftung von normalen Zellen (d.h. Chondrozyten) und eine Zellproliferation liefert. Die negativ geladene Proteoglykankomponente der extrazellulären Matrix des Nucleus pulposus zieht Wasser an, um ein hydrathaltiges Gel zu bilden, das die Kollagenfibrillen und Chondrozytenzellen einhüllt. Beim normalen, gesunden Nucleus pulposus macht Wasser zwischen 80 und 90% des Gesamtgewichts aus.
Der Nucleus pulposus spielt somit eine zentrale Rolle beim Aufrechterhalten der normalen hydrodynamischen Funktion der Bandscheibe. Die Proteoglykane einer großen relativen Molekülmasse sind durch den Annulus fibrosus und durch die Wirbelendplatten im Nucleus pulposus enthalten, und sie ziehen durch siebartige Poren in den Endplatten Wasser in den Nucleus an. Der resultierende osmotische Druck in jeder Band scheibe dehnt dieselbe tendentiell axial (d.h. vertikal) aus, wodurch die benachbarten Wirbel weiter auseinander getrieben werden. Dagegen üben mechanische Bewegungen, die zu einer Axialkompression, einer Biegung und einer Drehung der Wirbel führen, Kräfte auf die Bandscheiben aus, was dazu tendiert, Wasser aus dem Nucleus pulposus hinauszudrängen. Wasserbewegungen in eine und aus einer Bandscheibe unter dem kombinierten Einfluss von osmotischen Gradienten und mechanischen Kräften stellen hydrodynamische Funktionen dar, die für die Gesunderhaltung der Bandscheibe wichtig sind.
Eine Bewegung von gelösten Stoffen in dem Wasser, das während einer normalen hydrodynamischen Funktion zwischen Bandscheiben und Wirbeln wandert, ermöglicht eine Chondrozytenatmung und -ernährung in den Bandscheiben. Diese Funktion ist für das Überleben der Chondrozyten entscheidend, da Nucleus-pulposus-Gewebe von Bandscheiben avaskulär sind (die größten derartigen avaskulären Strukturen im menschlichen Körper). Das Aufrechterhalten eines ausreichenden Wassergehalts im Nucleus pulposus ist auch wichtig, um hohe mechanische Belastungen (Stöße) zu absorbieren, um einem Prolaps der Nucleus-pulposus-Substanz unter derartigen Belastungen Widerstand zu bieten, und um den Annulus fibrosus zu hydrieren, um die Flexibilität und Stärke aufrechtzuerhalten, die für eine Stabilität der Wirbelsäule benötigt werden.
Bei einer degenerativen Bandscheibenerkrankung (DDD – degenerative disc disease) sind normale hydrodynamische Funktionen beeinträchtigt. DDD beinhaltet eine Verschlechterung der Struktur und Funktion einer oder mehrerer Bandscheiben und ist üblicherweise mit dem Altern und einer Wirbelsäulenverletzung verbunden. Obwohl die Ätiologie von DDD nicht hinreichend untersucht ist, besteht eine durchgehende Veränderung, die man bei degenerativen Bandscheiben feststellt, in einer insgesamten Verringerung des Proteoglykangehalts im Nucleus pulposus und im Annulus fibrosus. Die Verringerung des Proteoglykangehalts führt zu einer gleichzeitigen Verringerung des Bandscheibenwassergehalts. Eine verringerte Hydrierung der Bandscheibenstrukturen kann den Annulus fibrosus schwächen, wodurch die Bandscheibe anfällig für einen Prolaps wird. Ein Prolaps führt oft dazu, dass extrudiertes Nucleus-pulposus-Material auf das Rückenmark oder Nerven trifft, was Schmerzen, Schwäche und in manchen Fällen eine dauerhafte Invalidität verursacht.
Da eine ausreichende Bandscheibenhydrierung für die Stabilität und normale Beweglichkeit der Wirbelsäule wichtig ist, stellt eine effektive Behandlung von DDD die natürliche, selbsterhaltende hydrodynamische Funktion der Bandscheibe wieder her. Eine derartige Bandscheibendegenerationstherapie kann eine beträchtliche Wiederherstellung der zellulären Proteoglykan-Synthese in der Bandscheibe erfordern, um die hydrierte extrazelluläre Matrix im Nucleus pulposus aufrechtzuerhalten. Eine verbesserte hydrodynamische Funktion in einer derartigen regenerierten Bandscheibe kann zur Wiederherstellung und einem erneuten Erreichen der Bandscheibenhöhe führen. Sie kann ferner eine verbesserte Hydrierung des Annulus fibrosus liefern, wodurch eine spätere Hernienbildung weniger wahrscheinlich wird.
Lösungsansätzen des Standes der Technik in Bezug auf Bandscheibenprobleme ist es nicht gelungen, die normale selbsterhaltende hydrodynamische Funktion wiederherzustellen, und somit können sie die normale Stabilität bzw. Mobilität der Wirbelsäule unter hohen Belastungen nicht wiederherstellen. Ein Lösungsansatz in Bezug auf eine Neubildung von Bandscheiben unter Verwendung einer Kombination von Bandscheibenzellen und eines bioaktiven, biologisch abbaubaren Substrats ist in der US-Patentschrift Nr. 5,964,807 an Gan et al., die durch Bezugnahme in das vorliegende Dokument aufgenommen ist, beschrieben. Das bei Gan et al. offenbarte biologisch abbaubare Substrat, das bioaktives Glas, Polymerschaum und mit bioaktivem Sol-Gel-Material beschichteten Polymerschaum umfasst, soll die Zellfunktion, das Zell wachstum und die Zelldifferenzierung verbessern. Das bioaktive Glas enthält Oxide von Silizium, Natrium, Kalzium und Phosphor. Der Polymerschaum ist als biokompatibel beschrieben und umfasst Polyglycolid (PGA), Poly(D,L-Lactid) (D,L-PLA), Poly(L-Lactid) (L-PLA), Poly(D,L-Lactidcoglycolid) (D,L-PLGA), Poly(L-Lactidcoglycolid) (L-PLGA), Polycaprolacton (PCL), Polydioxanon, Polyesteramide, Copolyoxalate und Polycarbonate. Gan et al. beschreibt eine Anwendung dieses Lösungsansatzes auf eine Bandscheibenneubildung bei voll ausgewachsenen Neuseeland-Kaninchen, wobei er mit einem Einwuchs von Zellen und einer gleichzeitigen qualitativen Verschlechterung von implantiertem Material mit geringer oder ohne Entzündung abschließt. Jedoch kann eine qualitativen Verschlechterung von Teilen des implantierten Materials, beispielsweise eine Säurezerlegung von PLAs, PGAs und PLGAs, das Zellwachstum, die Zellfunktion und/oder die Zelldifferenzierung negativ beeinflussen.
Eine etwa analoge Offenbarung, die sich auf Gewebe zum Pfropfen bezieht, beschreibt Matrixpartikel, die Wachstumsfaktoren aufweisen, die mit Zellen angeimpft werden können; siehe US-Patentschrift 5,800,537 an Bell, die durch Bezugnahme in das vorliegende Dokument aufgenommen ist. Die Matrix und die Zellen werden an Gerüste angelegt, die biologisch abbaubare Polymere, Mikropartikel und Kollagen umfassen, das durch Belichtung mit ultravioletter Strahlung vernetzt und dahin gehend gebildet wurde, um Feststoffe von Schaum, Faden, Stoff oder Film zu bilden. Die Matrixpartikel werden aus einem Gewebe gewonnen, aus dem Zellen und Zellreste entfernt wurden, ohne dass Faktoren entfernt werden, die für ein Zellwachstum, eine Zellmorphogenese und eine Zelldifferenzierung notwendig sind. Insbesondere vermeidet Bell die Verwendung von Reagenzien wie z.B. Reagenzien mit hohem Salzgehalt bzw. Deliysidationsreagenzien wie z.B. Butanol/Ether oder Reinigungsmitteln. Ungünstigerweise derartige Reagenzien dahin gehend beschrieben, dass sie dafür verantwortlich sind, Faktoren, die zum Stimulieren von Reparatur- und Neubildungsprozessen wesentlich sind, aus dem Quellengewebe zu beseitigen. Auf alternative Lösungsansätze, bei denen derartige Faktoren aus anderen Quellen gewonnen werden, statt im Gewebe beibehalten zu werden, wird nicht eingegangen.
Eine wieder andere Offenbarung, die auf eine Regeneration von Knorpel bezogen ist, findet sich in der US-Patentschrift Nr. 5,837,235 an Mueller et al., die durch Bezugnahme in das vorliegende Dokument aufgenommen ist. Mueller et al. beschreibt ein Zertrümmern kleiner Partikel von autologem Omentum oder anderem Fettgewebe zur Verwendung als Träger sowie ein Hinzufügen von Wachstumsfaktoren wie z.B. Transforming Growth Factor Beta und Bone Morphogenic Protein (Transformations-Wachstumsfaktor-Beta und knochenmorphogenes Protein) zu dem Träger. Mueller et al. lehrt nicht ein Vernetzen von Geweben, um eine vernetzte Matrix zu erzeugen.
Die obige Patentschrift von Gan et al. ist repräsentativ für bisher durchgeführte Versuche, eine im Wesentlichen natürliche hydrodynamische Bandscheibenfunktion bei Bandscheiben wiederherzustellen oder zu regenerieren, derartige Techniken haben sich jedoch in klinischen Versuchen nicht bewährt. Desgleichen stoßen die Lösungsansätze von Bell und Mueller et al. in Bezug auf eine Bandscheibenregeneration nicht auf breite Akzeptanz, und man benötigt immer noch bessere Lösungsansätze, da angeblich 60% bis 85% aller Menschen irgendwann in ihrem Leben unter so starken Lendenschmerzen leiden, dass sie nicht arbeiten können. In Ermangelung einer sichereren und wirksameren Behandlung werden jedes Jahr weltweit schätzungsweise 700.000 Dissektionen und 550.000 Wirbelsäulenversteifungen durchgeführt, um dieses Leiden zu behandeln. Ferner wurden bereits mehrere prothetische Vorrichtungen und Zusammensetzungen, die synthetische Komponenten verwenden, zur Ersetzung von degenerierten Bandscheiben oder Teilen derselben vorgeschlagen. Siehe beispielsweise US-Patentschriften Nrn. 4,772,287, 4,904,260, 5.047,055, 5,171,280, 5,171,281, 5,192,326, 5, 458, 643, 5, 514, 180, 5, 534, 028, 5, 645, 597, 5, 674, 295, 5,800,549, 5,824,093, 5,922,028, 5,976,186 und 6,022,376.
Ein Teil der oben erwähnten Bandscheibenprothesen umfasst Hydrogele, die eine hydrodynamische Funktion ermöglichen sollen, die in mancherlei Hinsicht der von gesunden natürlichen Bandscheiben ähnlich ist. Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 6,022,376 (Assell et al.). Diese prothetischen Hydrogele werden jedoch durch eine zelluläre Aktivität in den Bandscheiben nicht erneuert. Somit wäre jegliche Verbesserung der hydrodynamischen Funktion von Bandscheiben nicht selbsterhaltend und würde mit einer qualitativen Verschlechterung des prothetischen Hydrogels mit der Zeit abnehmen. Dagegen behalten gesunde Bandscheiben ihre Fähigkeit, axiale Druckkräfte in der Wirbelsäule hydrodynamisch abzufedern, über ausgedehnte Zeiträume bei, da lebende Zellen in den Bandscheiben die natürliche Hydrogelkomponente (d.h. die extrazelluläre Matrix) erneuern.
Eine Wiederherstellung eines klinisch sinnvollen Grades der normalen hydrodynamischen Funktion bei degenerierten Bandscheiben ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, und es wurde gezeigt, dass die hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen eine derartige Regeneration bewirken bzw. verbessern.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst Verwendungszwecke und Zusammensetzungen zur Regeneration von Bandscheiben. Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen umfassen die Zusammensetzungen eine dreidimensionale Fluidmatrix eines verdauungsresistenten, vernetzten Nucleus-pulposus-Gewebes von einem Spenderwirbeltier. Der Spender kann der Patient oder ein anderes Tier derselben oder einer anderen Spezies sein. Das Vernetzen von Nucleus-pulposus-Gewebe eines Spenders für die vorliegende Erfindung wird vorzugsweise durch Verwen dung eines oder mehrerer photooxidativer Katalysatoren erzielt, die sichtbares Licht selektiv absorbieren. Siehe US-Patentschriften Nrn. 5,147,514, 5,332,475, 5,817,153 und 5,854,397. Jedoch können auch andere Vernetzungslösungsansätze verwendet werden, ohne von dem Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Vor einem Vernetzen der Gewebe werden vorzugsweise Chondrozyten des Spenderwirbeltiers zerstört, fragmentiert bzw. entfernt (d.h. entzellularisiert). Ein bevorzugter Entzellularisierungsansatz beinhaltet ein Einweichen des Gewebes in einer Lösung, die hohe Konzentrationen an Salz (vorzugsweise NaCl) und Zucker (vorzugsweise Sucrose) aufweist. Derartige Lösungen mit hohem Salz- und hohem Zuckergehalt werden als HSHS-Lösungen bezeichnet. Es können jedoch auch andere Entzellularisierungsansätze verwendet werden. Nachdem die Gewebe entzellularisiert und vernetzt wurden, kann die resultierende Fluidmatrix zur Sterilisation und Aufbewahrung lyophilisiert und dann vor einer Verwendung rehydriert werden. 2 veranschaulicht einen Prozess zum Erzeugen eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Fluidmatrix der vorliegenden Erfindung.
Die Fluidmatrix der vorliegenden Erfindung ist biokompatibel, im Wesentlichen nicht-immunogen und resistent gegen eine qualitative Verschlechterung in vivo. Als solches ist sie in der Lage, eine wichtige innere strukturelle Stütze für eine Bandscheibe zu liefern, die während eines Zeitraums einer beschleunigten Proteoglykan-Synthese eine Regeneration durchläuft. Die vernetzte Matrix kann mittels Injektion durch eine Spritze (wie in 2 gezeigt ist), über einen Katheter oder andere in der Technik bekannte Verfahren an den Bandscheibenraum verabreicht werden.
Die dreidimensionale Fluidmatrix der vorliegenden Erfindung kann alleine oder in Kombination mit Wachstumsfaktoren und/oder lebenden Zellen verwendet werden, um eine Regeneration der Strukturen einer degenerierten Bandscheibe zu ermöglichen. Bei Patienten, die genügend lebensfähige endogene Bandscheibenzellen (Chondrozyten) und Zellwachstumsfaktoren aufweisen, kann die dreidimensionale vernetzte Matrix alleine wesentlich zur Regeneration der hydrodynamischen Funktion bei einer Bandscheibe in vivo beitragen, indem sie eine verbesserte mechanische Stabilität der Bandscheibe und eine günstigere Umgebung für ein Zellwachstum und/oder einen Zellstoffwechsel liefert. Dagegen kann bei einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung auch eine Kombination der dreidimensionalen Matrix und eines oder mehrerer gereinigter, vorzugsweise aus Knochen gewonnener Zellwachstumsfaktoren verwendet werden, um DDD in Bandscheiben zu behandeln, die lebensfähige Chondrozyten in einer an Proteoglykan verarmten Hydrogelmatrix enthalten. In diesem Fall liefert das vernetzte Kollagen eine erweiterte umformbare dreidimensionale Matrix für die vorhandenen (nativen) Chondrozyten in einer Bandscheibe, während die Zellwachstumsfaktoren eine beschleunigte Proteoglykanproduktion bewirken, um die Hydrogelmatrix des Patienten wiederherzustellen. Die Kombination der dreidimensionalen Matrix und eines oder mehrerer gereinigter Zellwachstumsfaktoren wird als Zellwachstumsmedium bezeichnet. Die vorliegende Erfindung kann auch ein injizierbares Zellwachstumsmedium umfassen. Einzelne gereinigte Zellwachstumsfaktoren können durch Rekombinationstechniken, die Fachleuten bekannt sind, erhalten werden, jedoch ist eine bevorzugte Mehrzahl von aus Knochen gewonnenen gereinigten Zellwachstumsfaktoren für die vorliegende Erfindung in den US-Patentschriften Nrn. 5,290,763, 5,371,191 und 5,563,124 offenbart. Aus Knochen gewonnene Zellwachstumsfaktoren, die gemäß diesen Patentschriften erzeugt werden, werden hiernach als „BP" bezeichnet.
Eine Bandscheibenregeneration erfolgt, da die vernetzte Kollagen- und Proteoglykan-Matrix lebende Zellen unterstützt (die exogene Zellen sowie native Bandscheiben- oder andere autologe Zellen umfassen können), die eine inhärente Fähigkeit aufweisen, Kollagenfibrillen vom Typ II und Pro teoglykane in vivo zu synthetisieren, neben anderen extrazellulären Matrixmolekülen. Dort, wo native Bandscheibenzellen des Patienten entfernt wurden oder auf andere Weise in Bezug darauf, eine derartige Proliferation zu bewirken, unzureichend sind, können lebende Zellen zu der dreidimensionalen Matrix aus vernetztem Nucleus-pulposus-Material hinzugefügt werden, um die Bandscheibenregeneration weiter zu fördern. Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung bei einem anderen Ausführungsbeispiel eine dreidimensionale Matrix aus vernetztem Nucleus-pulposus-Gewebe, zu dem exogene und/oder autologe lebende Zellen hinzugefügt wurden. Die injizierbare Kombination von Dreidimensionale-Matrix-Material und exogenen und/oder autologen lebenden Zellen wird in dem vorliegenden Dokument als injizierbare Zellmatrix bezeichnet. Geeignete Zellen für eine derartige injizierbare Zellmatrix können beispielsweise aus dem Nucleus pulposus einer Bandscheibe eines Säugetiers, aus Knorpel, aus Fettgewebe, aus Muskelgewebe, aus Knochenmark oder aus Knochenmaterial (d.h. Mesenchymstammzellen) erhalten werden, sind jedoch nicht auf diese Gewebetypen beschränkt. Diese Zellen werden vorzugsweise in vitro kultiviert, um ihre Lebensfähigkeit zu bestätigen und, optional, um die Proliferation und Synthesereaktionen der Zellen unter Verwendung von Zellwachstumsfaktoren zu erhöhen.
Optional können zu Zellkulturen Wachstumsfaktoren hinzugefügt werden, um die zelluläre Entwicklung und die Ausbildung von Kollagenfibrillen vom Typ II und von Proteoglykanen, die zum Aufrechterhalten einer effektiven Bandscheiben-Hydrogelmatrix in vivo geeignet sind, zu stimulieren. Ein injizierbares Fluid, das gereinigte Zellwachstumsfaktoren und eine Mehrzahl lebender Zellen kombiniert, wird als injizierbare Zellsuspension bezeichnet und ist zur Behandlung von DDD nützlich. Während eine injizierbare Zellmatrix alleine (d.h. ohne Wachstumsfaktoren) die hydrodynamische Funktion in einer Bandscheibe in vivo in hohem Maße regenerieren kann, falls in der Bandscheibe ausreichend Nativ-Zellwachstumsfaktoren vorliegen, können gereinigte (exoge ne) Zellwachstumsfaktoren zu einer injizierbaren Zellmatrix der vorliegenden Erfindung hinzugefügt werden, um ein wieder anderes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zu bilden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das Komponenten eines gesunden Nucleus-pulposus-Gewebes bei einem Wirbeltier veranschaulicht.
2 ist ein Diagramm, das einen Prozess zur Präparation und Verwendung einer vernetzten Matrix eines Nucleus-pulposus-Gewebes vom Schwein bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung veranschaulicht.
3 ist eine photographische Reproduktion einer SDS-PAGE-Analyse (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse), die die Menge an Proteinen, die aus einer vernetzten Matrix der vorliegenden Erfindung extrahiert wurden, mit einer nicht-vernetzten Kontrolle vergleicht.
4 ist ein photographischer Vergleich eines mit H & E (Hematoxylin und Eosin) gefärbten Abschnitts eines frischen Nucleus-pulposus-Gewebes vom Schwein mit einer vernetzten Matrix der vorliegenden Erfindung, beide bei einer dreihundertfachen Vergrößerung.
5 ist eine photographische Reproduktion einer gefärbten Nitrozellulosemembran, die die Reaktivität von Kollagen vom Typ II, das aus einer vernetzten Matrix der vorliegenden Erfindung digeriert ist, und einer nicht-vernetzten Kontrolle vergleicht.
6 ist ein Vergleichsgraph der hydraulischen/Quellkapazität einer vernetzten Matrix der vorliegenden Erfindung und einer nicht-vernetzten Kontrolle.
7 ist ein Diagramm eines experimentellen Prozesses, der dazu verwendet wird, eine Stimulation eines Einwuchses, einer Proliferation und einer Synthese einer neuen Matrix bei Schafszellen bei einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren, das eine mit Knochenprotein-Wachstumsfaktoren (BP) kombinierte vernetzte Matrix umfasst.
8 ist ein Graph und eine Photographie, die die Ergebnisse eines Alzianblau-Tests für eine Matrixproduktion bei Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf, die durch Wachstumsfaktoren stimuliert werden, zeigen.
9 ist ein Graph, der die Ergebnisse von Immunisierungskraft-Tests für eine vernetzte Matrix der vorliegenden Erfindung bei Kaninchen-Immunisierungen und Schaf-Serum zeigt.
10 ist ein Diagramm des Protokolls für eine in-vivo-Studie einer Kombination der vorliegenden Erfindung aus Matrix und Wachstumsfaktor.
11 ist ein Röntgenbild einer Wirbelsäule eines Schafes, das zwei Monate nach einer Injektion einer Kombination aus Matrix und Wachstumsfaktor in einer in-vivo-Studie eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung geopfert wurde.
12 ist eine photographische Reproduktion von Histologiepräparaten von Bandscheiben eines Schafes, das zwei Monate nach einer Injektion einer Kombination aus Matrix und Wachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung geopfert wurde.
13 ist ein Röntgenbild einer Wirbelsäule eines Schafes, das vier Monate nach einer Injektion einer Kombination aus Matrix und Wachstumsfaktor in einer in-vivo-Studie der vorliegenden Erfindung geopfert wurde.
14 ist eine photographische Reproduktion von Histologiepräparaten von Bandscheiben eines Schafes, das vier Monate nach einer Injektion einer Kombination aus Matrix und Wachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung geopfert wurde.
15 ist ein Graph, der die Ergebnisse eines ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay, heterogener Enzymimmuntest) darstellt, der durchgeführt wird, um die Synthese von Kollagen vom Typ II und von Chondroitin-6-Sulfat bei einer Wachstumsfaktorstimulation zu messen.
16a ist ein Graph, der die Ergebnisse eines Alzianblau-Tests für eine Proteoglykan-Synthese in menschlichen Bandscheibenzellen, die durch einen Wachstumsfaktor stimuliert wurden, anzeigt.
16b ist ein Graph, der die Ergebnisse eines Alzianblau-Tests für eine Proteoglykan-Synthese in weiteren menschlichen Bandscheibenzellen, die durch einen Wachstumsfaktor stimuliert wurden, anzeigt.
17 ist ein Graph, der die Ergebnisse eines Alzianblau-Tests für eine Proteoglykan-Synthese bei Pavian-Bandscheibenzellen, die durch einen Wachstumsfaktor stimuliert wurden, anzeigt.
18 ist ein SDS-PAGE-Gel der HPLC-Fraktionen 27-16 aus einer BP-Probe.
19 ist ein SDS-PAGE-Gel der HPLC-Fraktionen 27-16 mit identifizierten Bändern, die gemäß der Legende der 20 angegeben sind.
20 ist ein SDS-PAGE-Gel von BP mit angegebenen identifizierten Bändern.
21 ist ein 2D-(zweidimensionales)SDS-PAGE-Gel mit internen Standards, die durch Pfeile angegeben sind.
22 ist ein 2D-SDS-PAGE-Gel mit eingekreisten Proteinen (Wachstumsfaktoren), die gemäß der Legende identifiziert sind.
23A–23O sind Massenspektrometerergebnisse für tryptische Fragmente.
24 ist ein 2D-Gel-Westernblot mit Antiphosphotyrosin-Antikörpern.
25A–25D sind 2D-Gel-Westernblots mit Antikörpern für die angegebenen Proteine. Für 25A sind die Wachstumsfaktoren BMP-3 und BMP-2; für 25B sind die Wachstumsfaktoren BMP-3 und BMP-7; für 25C sind die Wachstumsfaktoren BMP-7 und BMP-2; und für 25D sind die Wachstumsfaktoren BMP-3 und TGF-β1.
26 ist ein mit PAS (periodic acid schiff, Periodsäure-Schiff) gefärbtes SDS-PAGE-Gel von HPLC-Fraktionen.
27 ist ein mit Anti-BMP-7 gefärbtes SDS-PAGE-Gel von mit PNGase F behandeltem BP.
28 ist ein mit Anti-BMP-2 gefärbtes SDS-PAGE-Gel von mit PNGase F behandeltem BP.
29A–29B sind Balkendiagramme, die eine Explantatmasse von glykosylierten BP-Proben (29A) und eine ALP-Punktzahlbewertung (29B) derselben Proben zeigen.
30 ist ein Diagramm, das eine Auflistung und die Reaktivität von Antikörpern zeigt.
31A–31B umfassen zusammen ein Diagramm, das Daten zur Sequenzierung von tryptischen Fragmenten zeigt.
32A–32F umfassen zusammen ein Diagramm, das Daten zur Massenspektrometrie von tryptischen Fragmenten zeigt.
33A–33B sind ein SDS-Gel von BP (33B) und eine Aufnahme eines DC-Scanners (33A).
34 ist ein Diagramm, das die relative Masse von Hauptkomponenten von BP veranschaulicht.
Bester Modus zum Durchführen der Erfindung
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst die Erfindung eine biologisch abbaubare Matrix, die als inkompressibles Fluid bereitgestellt wird, um eine Regeneration oder eine Rekonstruktion von Geweben in der Bandscheibe zu bewirken und/oder zu verbessern. Die biologisch abbaubare Matrix umfasst hydrophile Moleküle, die den Gehalt an „eingefangenem" Wasser von Bandscheibengeweben aufrechterhalten und/oder erhöhen. Die biologisch abbaubare Matrix kann auch als Trägersubstrat für hinzugefügte Wachstumsfaktoren und/oder geeignete Lebendzellentypen dienen.
Da die biologisch abbaubare Matrix der vorliegenden Erfindung ein viskoses Fluid ist, dient sie als inkompressibler Träger, wenn sie in einem geschlossenen, sicheren Bandscheibenraum bereitgestellt wird. Da sie gleichmäßig in einer Bandscheibe verteilt ist, weist die vorliegende Fluidmatrix außerdem einen Kraftverteilungseffekt auf, wobei in der Bandscheibe Kräfte auf gleichmäßige Weise hydraulisch übertragen werden. Die Matrix liefert somit einen Widerstand gegen eine axiale Kompression und einen Annuluskollaps, wohingegen andere Matrixmaterialien (beispielsweise Polymerschwämme und Kollagenschwämme) unter den axialen Druckkräften innerhalb der Bandscheibe rasch kollabieren. Im Gegensatz dazu konzentrieren feste Matrixmaterialien Kräfte von Endplatten direkt auf Implantate, was zu einer raschen Qualitätsverminderung von Implantaten und/oder Endplatten führt.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die biologisch abbaubare Matrix der vorliegenden Erfindung injizierbar. Eine klinische Verabreichung an einen Patienten kann somit unter Verwendung von minimalinvasiven Techniken bewerkstelligt werden, wodurch sowohl die Kosten der Behandlung als auch die Wahrscheinlichkeit von Komplikationen im Vergleich zu Verfahren wie z.B. der partiellen Dissektion oder Wirbelfusion bedeutend verringert werden. Desgleichen vermeidet die vorliegende Erfindung das Erfordernis, ein Loch in den Annulus zu bohren, um eine prothetische Nucleus-pulposus-Ersatzvorrichtung wie z.B. eine relativ feste biologisch abbaubare Matrix zu implantieren, oder Nucleus-Gewebe zu entnehmen, um Raum für ein implantiertes biologisch abbaubares Substrat zu schaffen.
Die Matrix der vorliegenden Erfindung ist ein natürliches Material, das vorzugsweise aus normalem, gesundem Nucleus-Gewebe von Tieren und/oder Menschen präpariert wird. Demge mäß besteht die Matrix aus Proteinen und Matrixmolekülen, die speziell für eine effiziente hydrodynamische Funktion in Bandscheiben ausgelegt sind. Eine derartige Matrix bleibt unter normalen Umständen bei Vorliegen spezifischer Zellenzyme biologisch abbaubar, wenn auch bei einer langsameren Rate als eine endogene Bandscheibenmatrix. Ein wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin, dass Matrixabbauprodukte, die mit der vorliegenden Erfindung in Verbindung stehen, durch Bandscheibenzellen aufschließbar sind. Im Vergleich dazu werden manche bisher gelehrte Matrixmaterialien (z.B. Polyvinylalkohol) nicht durch physiologische Prozesse abgebaut. Außerdem führen manche synthetische Polymersubstrate zu säurehaltigen Zersetzungsnebenprodukten, insbesondere PGA und PLA.
Eine unmittelbare (im Wesentlichen homogene) Dispersion von Zellen in der vorliegenden Matrix ist ein weiterer Vorteil der Erfindung. Die zur Injektion bevorzugte Formulierung aus viskosem Fluid kann direkt mit Zellen des entsprechenden Typs bzw. der entsprechenden Typen gemischt und anschließend unmittelbar verabreicht werden, um eine Bandscheibe zu behandeln. Bei der Matrix der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, Zellen und Matrix vor der Implantation über die Dauer einiger Tage oder Wochen miteinander zu kultivieren, wie dies bei bestimmten Matrixmaterialien wie z.B. PGA und Kollagenschwämmen der Fall ist.
Die Matrix der vorliegenden Erfindung ist ein geeignetes Substrat für Zellen, das sich auf einzigartige Weise für den Einwuchs, die Proliferation und das Verweilen von Bandscheibenzellen eignet. Im Vergleich zu Kollagenschwämmen des Typs I, die mit Formalin oder Glutaraldehyd fixiert werden, wachsen Bandscheibenzellen vorzugsweise in die Matrix der vorliegenden Erfindung hinein und überleben in derselben.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Präparation bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung und demonst rieren ihre nicht-immunogenen und bandscheibenregenerativen Eigenschaften.
BEISPIEL 1: Herstellung einer vernetzten Fluidmatrix, die sich zur Behandlung von degenerativen Bandscheibenerkrankungen eignet
Eine dreidimensionale Fluidmatrix aus vernetztem Nucleus-pulposus-Gewebe gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung kann aus Spenderwirbeltieren hergestellt werden. Obwohl bei einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel als Spender Schweine verwendet wurden, können auch Nucleus-pulposus-Gewebe von anderen Wirbeltieren verwendet werden, obwohl zu den Säugetieren zählende Wirbeltiere bevorzugt sind (z.B. Mensch, Schwein, Rind, Schaf usw.).
Obwohl Nucleus-pulposus-Gewebe mittels einer Vielzahl von Verfahren aus vielen Spender-Wirbeltieren gewonnen werden können, wurden bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel Nucleus-pulposus-Gewebe aus Wirbelsäule-Bandscheiben von Schweinen auf aseptische Weise präpariert. In einer sterilen Umgebung (d.h. einer Laminarbox) wurden der Annulus fibrosus von Spenderschweinen radial in Scheiben geschnitten und die Wirbelendplatten auseinander getrennt, um den Nucleus pulposus zu exponieren. Das letztgenannte Material wurde aus dem mittigen Abschnitt der Bandscheibe ausgeschabt, der keine Annulus- und Endplattengewebe aufweist.
Die auf diese Weise gewonnenen Nucleus-pulposus-Gewebe wurden in eine sterile Dialyse(Filter)schlauchanordnung eingefügt, die eine bevorzugte Molekulargewichtsgrenze von etwa 3.500 Daltons aufweist, um im Wesentlichen einen Verlust von Proteoglykanen einer niedrigen relativen Molekülmasse aus den Geweben zu verhindern und gleichzeitig eine bakterielle oder sonstige Verunreinigung im Wesentlichen zu verringern. Andere semipermeable Membranen oder Filtermembrantypen können zum Durchführen dieser Funktionen verwendet werden.
Die zu vernetzenden Nucleus-pulposus-Gewebe werden vorzugsweise auch dahin gehend behandelt, Spenderzellen und/oder -zellfragmente zu zerstören und zu beseitigen. Zu diesem Zweck wurde die Dialyseschlauchanordnung, die Nucleus-pulposus-Gewebe enthielt, etwa 48 Stunden lang in eine Lösung mit hohem Salz- und hohem Sucrosegehalt (HSHS) von etwa 2,2%:8,4% Gewicht/Volumen getaucht. Konzentrationsbandbreiten für die HSHS-Lösung können zwischen 1% und 50% liegen, eine bevorzugte HSHS-Lösung enthält jedoch 220 Gramm NaCl und 837,5 Gramm Sucrose in 10 l Wasser. Bevorzugte HSHS-Inkubationszeiten liegen zwischen etwa 24 und etwa 72 Stunden, obwohl vorteilhafterweise auch kürzere oder längere Zeiten verwendet werden können. Ein In-Kontakt-Bringen mit dieser HSHS-Lösung führt zu einer osmotischen Zerstörung und Fragmentierung nativer Chondrozytzellen (Entzellularisation) und führt weiterhin zu einer Denaturierung von löslichen Zellproteinen und Nucleinsäuren. Die HSHS-Lösung kann auch andere Reagenzien enthalten, die die Qualität von Nucleinsäuren (einschließlich, aber nicht ausschließlich, Sulfonen und Nucleasen) weiter verschlechtern, und andere Reagenzien, die Membranlipide extrahieren können (einschließlich, aber nicht ausschließlich, Alkohol, Chloroform und Methanol). Obwohl native Zellen des Spenders bei anderen Ausführungsbeispielen der Erfindung eventuell beibehalten werden, sind eine Entzellularisation und Denaturierung dort bevorzugt, wo exogene (vor allem xenogene) Gewebe verwendet werden, um das Potential für Immunogenreaktionen zu verringern. Zu diesem Zweck können auch andere Prozesse als ein In-Kontakt-Bringen mit HSHS-Lösungen verwendet werden.
Ein Vernetzen der Nucleus-pulposus-Gewebe wird vorzugsweise anhand eines mittels Licht bewirkten Prozesses gemäß den US-Patentschriften Nrn. 5,147,514, 5,332,475, 5,817,153 und/oder 5,854,397 bewerkstelligt. Bei einem solchen Prozess wurde ein photoaktiver Farbstoff (Methylenblau) bei einer bevorzugten Farbstoffkonzentration von etwa 20 mg/Liter in der HSHS-Lösung aufgelöst. Man ließ den photoaktiven Farbstoff während des anfänglichen Speicherungs-/Entzellularisationsprozesses in HSHS die Nucleus-Gewebe in der Dialyseschlauchanordnung durchdringen. Eine große Bandbreite von photoaktiven Farbstoffen und Konzentrationen, wie sie in den vorstehenden Patentschriften gelehrt werden, können verwendet werden, um vernetzte Fluidmatrizen zu erhalten, die sich zur Verwendung beim Regenerieren von Säugetier-Bandscheibengewebe eignen. Bevorzugte Farbstoffe umfassen Methylenblau und Methylengrün in Konzentrationen von etwa 0,001% bis etwa 1,0% Gewicht/Volumen.
Um das Kollagen in den Nucleus-Geweben zu vernetzen, wurde die Dialyseschlauchanordnung, die die von Farbstoff durchdrungenen Nucleus-Gewebe enthielt, in eine Photooxidationskammer platziert und 48 Stunden lang mit sichtbarem Licht einer großen Bandbreite belichtet. Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung können die Gewebe zwischen etwa 24 und etwa 72 Stunden vernetzt werden. Eine Lösung aus Methylenblau in phosphatgepufferter Saline (PBS – phosphate buffered saline) wurde unter einer gesteuerten Temperatur bei 10°C gehalten und um die Dialyseschlauchanordnung in der Photooxidationskammer im Kreis geführt, um eine im Wesentlichen konstante Temperaturregulierung der Nucleus-Gewebe zu liefern. Eine präzise Temperatursteuerung ist für die Praxis der Erfindung nicht kritisch; jedoch ist es bevorzugt, eine relativ kühlere Temperatur beizubehalten, um eine Beschädigung der Gewebe zu vermeiden. Im Anschluss an die Photovernetzung des Kollagens wurden die behandelten Nucleus-Gewebe gesammelt, in einem Vakuum unter Zentrifugierung lyophilisiert und in einer Gefriermühle unter flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver verarbeitet. Das auf diese Weise hergestellte vernetzte Matrixprodukt kann unter Verwendung von Gammastrahlung, Ethylenoxid (oder anderer Desinfektionsmittel) sterilisiert und bei –80°C aufbewahrt werden, bis es zum Zweck einer Verwendung rehydriert wird. Ein bevorzugter Prozess zum Herstellen einer Matrix gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 2 veranschaulicht.
Zusätzlich zur Herstellung der vernetzten Matrix wurden Kontrollgewebe (nicht-vernetzte Gewebe) gemäß den obigen Prozeduren hergestellt, mit der Ausnahme, dass sie nicht belichtet wurden. Diese nicht-vernetzten Kontrollgewebe wurden zu Vergleichszwecken verwendet.
Um die Quellfähigkeit einer vernetzten Matrix gegenüber einer nicht-vernetzten Kontrolle zu untersuchen, wurden lyophilisierte Proben einer vernetzten Matrix und einer nicht-vernetzten Kontrolle in Wasser suspendiert, und die Gewichtszunahme auf Grund einer Wasserabsorption wurde zu verschiedenen Zeiten von 0 bis 96 Stunden gemessen. Wie in 6 veranschaulicht ist, behielt die vernetzte Matrix 95% der hydraulischen Kapazität der nicht-vernetzten Kontrolle bei.
BEISPIEL 2: Testen der Fluidmatrix, um eine durch den Vernetzungsprozess bewirkte Proteinmodifikation auszuwerten
Ein halbes Gramm des vor dem Lyophilisierungsschritt des BEISPIELS 1 erhaltenen Matrixmaterials wurde in 15 ml einer Lösung aus 4 M Guanidinhydrochlorid platziert und 24 Stunden lang auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, um Proteoglykane löslich zu machen. Nach der Zentrifugierung wurde der Überstand verworfen, und das Pellet dreimal je fünf Minuten lang in destilliertem Wasser gewaschen. Das pelletierte Matrixmaterial wurde anschließend entfernt und auf Filterpapier trockengetupft.
Einhundert mg der trockengetupften Matrix wurden in eine 1,5 ml-Mikrozentrifugenschlauchanordnung mit 1.000 μl 1% Natriumdodecylsulfat (SDS – sodium dodecyl sulfate), das 5% Beta-Mercaptoethanol (BME) enthielt, platziert. Die Matrix in SDS/BME wurde eine Stunde lang gekocht, um Proteine (z.B. Kollagene) zu extrahieren. Anschließend wurden Proben eine Stunde lang bei 12.000 UpM zentrifugiert, und aliqoute Teile des Überstandes wurden in Polyacrylamid-Gradientengelen einer Elektrophorese unterworfen.
Gele wurden mit Coomassie-Blau oder Silber gefärbt, um Proteine, die durch die SDS/BME- und Wärmebehandlung extrahiert wurden, sichtbar zu machen. Wie in 3 veranschaulicht ist, färbten Kollagenbänder in nicht-vernetzten Kontrollgeweben deutlich, wiesen in einer vernetzten Matrix jedoch nur eine schwache Färbung auf. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass in dem vernetzten Matrixmaterial Kollagenproteine nicht ohne weiteres durch die obige Behandlung extrahiert wurden, was darauf hinwies, dass eine Vernetzung stattgefunden hatte. Im Gegensatz dazu demonstrierten gefärbte Gele der Kontrollgewebe, dass Kollagenproteine durch die obige Behandlung ohne weiteres aus nicht-vernetztem Material extrahiert wurden. Siehe 3.
BEISPIEL 3: Matrixhistologie, um Zellschmutz und restliches Membranmaterial auszuwerten
Vernetztes Matrixmaterial, das vor dem Lyophilisierungsschritt des Beispiels 1 erhalten wurde, wurde zur Gewebefixierung in 4% Paraformaldehyd platziert. Standardmäßige Histologieverfahren zum Einbetten, Unterteilen und Färben von Abschnitten mit Hematoxylin- & Eosinfarbstoffen wurden durchgeführt. Eine Sichtbarmachung der vernetzten Matrix in mit H & E gefärbten Abschnitten demonstrierte, dass der Matrixherstellungsvorgang eine Zerstörung von Zellmembranen und intrazellulären Elementen ermöglicht, wobei im Vergleich zu frischem Nucleus-pulposus-Material vom Schwein sowie im Vergleich zu einem nicht-vernetzten Gewebe, das durch eine HSHS-Behandlung, Frost/Tau-Zyklen und eine HSHS-Behandlung plus Frost/Tau-Zyklen entzellularisiert wird, minimales Membranmaterial verbleibt. Siehe 4.
BEISPIEL 4: Auswertung der Antigenreaktivität der Matrix unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Kollagen vom Typ II
Vernetztes Matrixmaterial, das vor dem Lyophilisierungsschritt des Beispiels 1 erhalten wurde, wurde ferner einem Pepsinaufschluss unterworfen, um Kollagenproteine vom Typ II zu spalten. Die Proteinauszüge wurden auf SDS/PAGE ausgeführt und anschließend zu einer Nitrozellulosemembran transferiert. Unter Verwendung von Kolloidgold wurde das gesamte zu der Membran transferierte Protein sichtbar gemacht.
Die sichtbar gemachten Nitrozellulosemembranen wurden mit einem monoklonalen Antikörper von Mäusen gegen Kollagen vom Typ II und mit einem sekundären Antikörper (Anti-Maus), der mit Alkalinphosphatase konjugiert war, intubiert. Die Antikörper-Reaktivität wurde durch Hinzufügung von Alkalinphosphatasesubstrat sichtbar gemacht. Wie in 5 gezeigt ist, reagierten die Antikörper gegen Kollagen vom Typ II mit Pepsinauszügen der vernetzten Matrix nicht so stark wie mit den Pepsinauszügen des nicht-vernetzten Kontrollgewebes. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Matrix der Erfindung eventuell verringerte Antigen-Epitope für Kollagen vom Typ II aufweist und somit eventuell eine geringere Immunisierungskraft aufweist als nicht-vernetzte Gewebe. Siehe 5.
BEISPIEL 5: Auswertung der Immunisierungskraft der Matrix bei der Herstellung von Kaninchen-Antiseren
Ein Gramm des gemäß BEISPIEL 1 präparierten lyophilisierten und pulverisierten Matrixmaterials wurde in PBS dispergiert (d.h. rehydriert) und zentrifugiert. Die Proteinkonzentra tion des Überstandes wurde anschließend unter Verwendung des BCA-Tests ermittelt, und der Überstand wurde mit PBS zu einer endgültigen Konzentration von 200 μg Protein pro ml PBS verdünnt. Der verdünnte Überstand wurde anschließend für Injektionsprotokolle sterilisiert. Drei Kaninchen wurden mit 100 μg Protein aus dem sterilisierten Überstand immunisiert. Jedes Kaninchen erhielt über einen Zeitraum von 14 Wochen hinweg neun Immunisierungen, und den Kaninchen wurden regelmäßig Seren entnommen.
Die Antiserumproduktion gegen das Proteinextrakt wurde unter Verwendung eines heterogenen Enzymimmuntests (ELISA) gemessen. Kollagen vom Typ II wurde als positive Kontrolle in den ELISA integriert. Eine kolorimetrische Auswertung von gegen das Matrixmaterial gerichteten Antiseren demonstrierte eine sehr niedrige Immunisierungskraft bei Kaninchen. Siehe 9.
BEISPIEL 6: Matrixformulierung, die Serum und andere Fluide für Injektionen und zur Verabreichung umfasst
Ein Gramm des gemäß BEISPIEL 1 präparierten lyophilisierten und pulverisierten Matrixmaterials wurde mit 70% Ethanol sterilisiert, und durch aufeinander folgende PBS-Spülungen wurde das Ethanol entfernt. Die dispergierte Matrix wurde zentrifugiert, und das Pellet wurde in einem Verhältnis von 0,5 g lyophilisierter Matrix zu 1 ml Serum in einem mittels Wärme inaktivierten Schafsserum suspendiert, um eine viskose Fluidmatrix herzustellen, die in eine Standardspritze eingebracht und über eine Nadel einer geringen Stärke verabreicht werden kann. Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung wird das Serum dem zu behandelnden Wirbeltier- oder menschlichen Patienten entnommen, mittels Wärme inaktiviert, um unerwünschte Proteinkomponenten (Komplementproteine) zu zerstören, und durch eine sterile 0,2 Mikrometer-Filtrierungseinheit geleitet. Es können auch andere Matrix/Serum-Verhältnisse auf vorteilhafte Weise verwendet werden. Verhältnisse zwischen 0,1 g und 2,0 g an lyophilisierter Matrix zu 1 ml Serum sind bevorzugt.
Ein Serum ist ein bevorzugtes Fluid zum Mischen und Verabreichen der vernetzten Matrix der vorliegenden Erfindung, da es verschiedene eigene Wachstumsfaktoren enthält, die für Bandscheibenzellen vorteilhaft sind. Ein Serum dient außerdem als geeigneter Träger für äußerliche Proteinwachstumsfaktoren und/oder kleine Moleküle. Die vorteilhaften Auswirkungen von äußerlichen Wachstumsfaktoren auf Bandscheibenzellen werden durch die Zugabe von Serum verstärkt.
Auch andere Fluide sind zur Mischung und Verabreichung der viskosen Fluidmatrix geeignet. Beispielsweise kann auch sterile Saline oder steriles Wasser verwendet werden. Die Beispiele des vorliegenden Dokuments sollen keine Einschränkung bezüglich der Vielfalt von Trägerfluiden darstellen, die zum Mischen und Verabreichen der Matrix bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
BEISPIEL 7: Injektion einer Matrixformulierung in Bandscheiben unter Verwendung einer mittels Druck arbeitenden Spritze
Matrixmaterial wurde gemäß BEISPIEL 6 präpariert (mit Serum gemischt), um ein viskoses Fluid zu bilden, und in eine Standardspritze gefüllt, an der eine Nadel einer geringen Stärke (z.B. Nr. 18-31) befestigt ist. Der Spritzeninjektionsdruck kann einfach durch die Finger der Hand gesteuert werden. Bei anderen Ausführungsbeispielen der Erfindung kann der Druck zum Injizieren des viskosen Fluids durch eine äußere Vorrichtung gesteuert werden, die gleichzeitig eine vorbestimmte Kraft misst (z.B. mittels eines Druckwandlers) und dieselbe auf den Presskolben der Spritze ausübt (z.B. mittels komprimierter Luft).
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel dieser Vorrichtung ist in der Nadel ein Thermoelement enthalten. Durch ein Bereitstellen einer Nadel, die ein Thermoelement aufweist, ist es möglich, am Ende der Behandlung und während des Entfernens der Spritzennadel den äußeren Schichten des Annulus fibrosus Wärme zuzuführen, um Kollagenfasern um die Nadel herum zum Schrumpfen zu bringen und die Stelle des Nadeleinstichs effektiv abzudichten.
Ferner wird beabsichtigt, dass die Matrix der vorliegenden Erfindung transpediculär (d.h. durch den Pediculus des Wirbels) in den Bandscheibenraum abgegeben werden kann. Insbesondere kann die vernetzte Matrix mittels einer Biopsiekanüle, die durch einen Kanal in den Pediculus eingeführt wird, perkutan verabreicht werden. Nach der Verabreichung der Matrix kann der Kanal anschließend mit Knochenzement oder einem anderen, ähnlichen Material gefüllt werden, um den Kanal abzudichten.
BEISPIEL 8: Isolierung von Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Menschen, von Schafen und von Pavianen
Menschliche Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Gewebe wurden während eines chirurgischen Eingriffs entnommen, in einem Gemisch F-12 (DMEM/F-12) aus Dulbeccos Modified Eagle Medium/Nährstoff in einem Gemisch mit einem Volumen/Volumen-Verhältnis von 1:1, dem Antibiotika zugefügt waren, suspendiert. Die Gewebe wurden bis zur Dissectio auf Eis gehalten, wobei sie zu diesem Zeitpunkt 2–3 Mal in steriler Dulbecco-Phosphatpuffersaline (DPBS) gespült wurden, um jegliches Blut zu entfernen. In einer Laminarbox wurden die Nucleus-Gewebe isoliert und in kleine (2 mm große) Würfel geschnitten und anschließend in ein Gewebekulturmedium (hiernach als „TCM" bezeichnet, TCM = Tissue Culture Medium) platziert, das DMEM/F-12-Kulturmedium umfasste, dem 10% mittels Wärme inaktiviertes fötales Rinderserum, 0,25% Penizillin, 0,4% Streptomycin, 0,001% Amphotericin B und 50 μg/ml Ascorbinsäure beigefügt waren. Es wurden lediglich Gewebe verwendet, an denen sich kein Blut oder andere anomale Elemente befanden. Die Gewebe wurden bei 37°C auf eine Rührmaschine platziert und zwei Stunden lang mit 0,01% Hyaluronidase (Calbiochem) in TCM, eine Stunde lang mit 0,01% Protease (Sigma) in TCM und über Nacht mit 0,1% Kollagenase vom Typ II (Sigma) in TCM aufgeschlossen, um eine Suspension von menschlichen Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen zu erhalten.
Die vorstehende Verfahrensweise wurde auch auf Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Gewebe vom Schaf bzw. vom Pavian angewendet, um Suspensionen von Schaf- bzw. Pavian-Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen zu erhalten.
BEISPIEL 9: Primärkultur und Expansion von menschlichen, Schaf- und Pavian-Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen
Menschliche Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen aus BEISPIEL 8 wurden expandiert, indem sie in TCM bei 37°C in 5% CO₂-Atmosphäre und bei 95% relativer Feuchtigkeit kultiviert wurden. Das TCM wurde alle zwei bis drei Tage gewechselt, und die Zellen wurden zum Zweck einer fortgesetzten Expansion mit Trypsin zu einem anderen Behälter transferiert, als sie zu 80–90% konfluierend waren.
Die vorstehende Verfahrensweise wurde auch auf Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Gewebe vom Schaf bzw. vom Pavian angewendet, um einen expandierten Vorrat von Schaf- bzw. Pavian-Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen zu erhalten.
BEISPIEL 10: Alzianblau-Test einer Bandscheibenzellmatrixherstellung bei menschlichen, Schaf- und Pavian-Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen
Menschliche Bandscheibenzellen aus BEISPIEL 9 wurden angeimpft und in der Gegenwart oder Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren in 24-Mulden-Platten in TCM zum Wachsen gebracht. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde TCM aus den Mulden herausgesaugt, und die Mulden wurden dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden anschließend zehn Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd (pH-Wert 7,4) fixiert. Die fixierten Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend über Nacht mit 0,5% Alzianblau in 0,1 N Chlorwasserstoffsäure (pH-Wert 1,5) gefärbt. Nach der über Nacht erfolgten Färbung wurde überschüssiges Färbemittel mit 3 PBS-Spülungen herausgespült. Die verbleibende Alzianblau-Färbung (die an Proteoglykane gebunden war) wurde über Nacht in 6 M Guanidinhydrochlorid aufgelöst, und die Absorbanz bei 630 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen, was einen Hinweis auf die Herbeiführung einer Matrixproduktion durch exogene Wachstumsfaktoren in menschlichen Nucleus-pulposus-Zellen lieferte.
Die vorstehende Verfahrensweise wurde auch auf Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf und vom Pavian aus BEISPIEL 9 angewendet, um einen Hinweis auf die Herbeiführung einer Matrixproduktion durch exogene Wachstumsfaktoren in Nucleus-pulposus-Zellen von Schafen und Pavianen zu erhalten.
BEISPIEL 11: Heterogener Enzymimmuntest (ELISA) an Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf
Um spezifische Antigen-Epitope in der synthetisierten Matrix zu erfassen, wurden Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf aus BEISPIEL 9, die angeimpft und in Monoschicht zum Wachsen gebracht wurden, eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 2% Glutaraldehyd fixiert. Die fixierten Zellen wurden dreimal jeweils fünf Minuten lang mit TBS gewaschen. Um eine nicht-spezifische Antikörperbindung zu hemmen, wurden die Zellen eine Stunde lang in einer Lösung aus Tris-gepufferter Saline (TBS), die 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,05% Tween-20 und 0,25% Rinder-Serumalbumin enthielt, inkubiert. Auf den Hemmschritt folgten drei jeweils 5-minütige Waschungen mit TBS. Die Zellen wurden 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur mit dem Primärantikörper inkubiert, und der überschüssige Primärantikörper wurde durch drei jeweils 5-minütige Waschungen mit TBS beseitigt. Eine zweite Inkubation mit einem Hemmpuffer wurde zehn Minuten lang durchgeführt, worauf drei Waschungen mit TBS folgten. Die Zellen wurden anschließend mit dem Sekundärantikörper, der mit alkalischem Phosphataseenzym konjugiert war, drei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die ungebundenen Sekundärantikörper wurden durch drei jeweils 5-minütige Waschungen mit TBS beseitigt. Die gebundenen Primär- und Sekundärantikörper wurden durch Hinzufügung eines enzymspezifischen Substrats, das eine gefärbte Reaktion erzeugte, erfasst. Die kolorimetrische Messung wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers durchgeführt, wobei eine quantitative Maßzahl des Vorliegens der gebundenen Antikörper geliefert wurde.
BEISPIEL 12: Auswirkung exogener Wachstumsfaktoren auf Proteoglykan-Synthese bei Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf
Ein transformierender Wachstumsfaktor-μl (TGFβ1) und ein Gemisch von aus Knochen gewonnenen Proteinwachstumsfaktoren (BP), das gemäß den US-Patentschriften Nrn. 5,290,763, 5,371,191 und 5,563,124 erzeugt wurde, wurden auf ihre Auswirkungen auf die Stimulation der Proteoglykan-Synthese bei Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf getestet. Bandscheiben-Nucleus-Zellen vom Schaf wurden gewonnen und gemäß der Beschreibung in den Beispielen 8 und 9 kultiviert. Schafzel len wurden in Mikromasse (200.000) in die Mulden einer 24-Mulden-Platte eingeimpft. Wachstumsfaktorverdünnungen wurden in TCM, das mit 0,5% mittels Wärme inaktiviertem fötalem Rinderserum versetzt war, hergestellt. TGFβ1 und BP wurden beide bei 10 ng/ml getestet; BP wurde auch bei einer Konzentration von 10 μg/ml getestet. Kontrollmulden ohne Wachstumsfaktoren enthielten TCM, das mit 0,5% und 10% mittels Wärme inaktiviertem fötalem Rinderserum versetzt war. Die Zellen wurden sieben und zehn Tage lang kontinuierlich mit den verschiedenen Wachstumsfaktoren in Kontakt gebracht. Zu diesen Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert, und der Umfang der Proteoglykan-Synthese wurde mittels des Alzianblau-Tests gemessen, wie in BEISPIEL 10 beschrieben ist.
Sowohl zum Zeitpunkt von sieben Tagen als auch zum Zeitpunkt von zehn Tagen war die Proteoglykan-Synthese bei den Kontrollkulturen mit 10% fötalem Rinderserum bedeutend höher als bei den Kontrollkulturen mit 0,5% fötalem Rinderserum. Zum Zeitpunkt von sieben Tagen führte BP in der höheren, 10 μg/ml betragenden Konzentration zu einem bedeutenden (93%) Zuwachs der Proteoglykan-Synthese gegenüber dem Niveau bei der Kontrollkultur mit 10% Serum, und zu einem größeren (197%) Zuwachs gegenüber der Kontrolle mit 0,5% Serum. Bei den Kulturen mit 10 ng/ml TGFβ1 und BP wurden leichte Zunahmen der Proteoglykan-Synthese gegenüber der Kontrolle mit 0,5% Serum beobachtet, diese Zunahmen waren jedoch nicht bedeutend.
Zum Zeitpunkt von zehn Tagen (8) bewirkten zehn μg/ml BP eine bedeutende Zunahme (132%) der Proteoglykan-Synthese gegenüber der Kontrolle mit 10% Serum, wohingegen 10 ng/ml TGFβ1 eine bedeutende Zunahme (52%) gegenüber der Kontrolle mit 0,5% Serum bewirkte. Bei 10 ng/ml wies BP einen bescheidenen Anstieg der Proteoglykan-Synthese von 20% gegenüber der Kontrolle mit 0,5% Serum auf, wohingegen BP bei der Konzentration von 10 μg/ml einen Anstieg von 890% gegenüber der Kontrolle mit 0,5% Serum erzeugte.
BEISPIEL 13: Auswirkung von exogenen Wachstumsfaktoren auf Kollagen vom Typ II und auf Chondroitin-6-Sulfat, das durch Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf erzeugt wird
TGFβ1 und BP wurden auf ihre Auswirkungen auf die Stimulation der Synthese von Kollagen vom Typ II und von Chondroitin-6-Sulfat bei Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf getestet. Die Zellen wurden gewonnen und gemäß der Beschreibung in den Beispielen 8 und 9 kultiviert und in Gewebekulturschalen eingeimpft. Die TGFβ1- und BP-Wachstumsfaktoren wurden in TCM, das mit 0,5% mittels Wärme inaktiviertem fötalem Rinderserum versetzt war, hergestellt. TGFβ1 wurde bei einer Konzentration von 10 ng/ml getestet; BP wurde bei einer Konzentration von 10 βg/ml getestet. Kontrollkulturen wurden in TCM, das lediglich mit 0,5% Serum versetzt war, inkubiert.
Nach einer siebentägigen Inkubation mit Wachstumsfaktoren wurden die Zellkulturen in 2% Glutaraldehyd fixiert, und die Quantität an in den Zellkulturen erzeugtem Kollagen vom Typ II und Chondroitin-6-Sulfat wurde gemäß der in BEISPIEL 11 beschriebenen Vorgehensweise mittels ELISA getestet. Die verwendeten Primärantikörper waren Anti-Human-Kollagen vom Typ II von Mäusen und Anti-Human-Chondroitin-6-Sulfat von Mäusen.
Bei sieben Tagen erzeugten Zellkulturen, die mit 10 μg/ml BP inkubiert worden waren, 324% mehr Kollagen vom Typ II und 1.780% mehr Chondroitin-6-Sulfat als Kontrollkulturen. 10 ng/ml TGFβ1 erhöhten die Produktion von Kollagen vom Typ II gegenüber der Kontrolle um 115% und von Chondroitin-6-Sulfat um 800%. Siehe 15.
BEISPIEL 14: Auswirkung von exogenen Wachstumsfaktoren auf die Proteoglykan-Synthese bei menschlichen Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen
TGFβ1 und BP wurden auf ihre Auswirkungen auf die Stimulation der Proteoglykan-Synthese bei menschlichen Nucleus-Zellen getestet. Menschliche Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen, die aus der Bandscheibe L5-S1 einer 40 Jahre alten Patientin gewonnen wurden, wurden gemäß der Beschreibung in den BEISPIELEN 8 und 9 kultiviert und in 24-Mulden-Platten eingeimpft. Nachdem die Zellen an der Muldenoberfläche anhafteten, wurden mehrere Verdünnungen unterschiedlicher Wachstumsfaktoren hinzugefügt. Die Konzentrationen der getesteten Wachstumsfaktoren betrugen 10 ng/ml TGFβ1 und 10 und 20 μg/ml BP. Die Verdünnungen wurden in TCM hergestellt. Die Zellen wurden nach einer fünf- und achttägigen kontinuierlichen Exposition mit Wachstumsfaktoren fixiert, und synthetisierte Proteoglykane wurden anhand des Alzianblau-Tests gemäß der Beschreibung im BEISPIEL 10 erfasst.
Bei nur fünf Tagen bewirkte BP eine bedeutende Zunahme der Alzianblau-Färbung gegenüber Kontrollen. Bei 10 μg/ml BP lag gegenüber der Kontrolle eine Zunahme von 34% vor, und bei 20 μg/ml lag gegenüber der Kontrolle eine Zunahme von 23% vor. Die Differenz zwischen den Durchschnitten von 10 und 20 μg/ml BP war nicht bedeutend.
Bei acht Tagen (16a) wiesen beide Wachstumsfaktoren eine bedeutende Zunahme der Alzianblau-Färbung im Vergleich zur Kontrolle auf. TGFβ1 wies bei 10 ng/ml eine Zunahme von 42% im Vergleich zur Kontrolle auf. BP wies bei 10 μg/ml eine Zunahme von 60% und bei 20 μg/ml eine Zunahme von 66% im Vergleich zur Kontrolle auf.
BEISPIEL 15: Auswirkung von exogenen Wachstumsfaktoren auf die Proteoglykan-Synthese bei menschlichen Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen
Ein zweites Experiment zum Testen der Auswirkungen von TGFβ1 und BP auf die Proteoglykan-Synthese wurde an einem anderen menschlichen Patienten als dem bei BEISPIEL 14 beschriebenen durchgeführt. Menschliche Bandscheibenzellen, die von einer anderen 40 Jahre alten Patientin gewonnen wurden, wurden gemäß der Beschreibung in den BEISPIELEN 8 und 9 kultiviert und in 24-Mulden-Platten eingeimpft. Nachdem man die Zellen über Nacht anhaften ließ, wurden Wachstumsfaktoren zugegeben. TGFβ1 wurde bei einer Konzentration von 10 ng/ml getestet; BP wurde bei 10 μg/ml getestet. Nach sechs und neun Tagen wurden die Zellen fixiert, und die Menge an synthetisierten Proteoglykanen wurde anhand des Alzianblau-Tests gemäß der Beschreibung in BEISPIEL 10 gemessen.
Bei sechs Tagen erzeugten Zellen, die mit 10 ng/ml TGFβ1 stimuliert wurden, 54% mehr Proteoglykane als die Kontrolle, und 10 μg/ml BP erhöhten die Produktion um 104% im Vergleich zur Kontrolle. Bei neun Tagen (16b) erhöhten 10 ng/ml TGFβ1 die Produktion um 74% im Vergleich zu Kontrollen, und 10 μg/ml BP erhöhten die Produktion um 171% im Vergleich zur Kontrolle.
BEISPIEL 16: Auswirkung von exogenen Wachstumsfaktoren auf die Proteoglykan-Synthese bei Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Pavian
TGFβ1 und BP wurden auf ihre Auswirkungen auf die Stimulation der Proteoglykan-Synthese bei Nucleus-Zellen von Pavianen getestet. Pavian-Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen wurden von einem sieben Jahre alten männlichen Pavian gewonnen, gemäß der Beschreibung in den BEISPIELEN 8 und 9 kultiviert und in eine 24-Mulden-Platte eingeimpft. Vor der Zugabe von Wachstumsfaktoren ließ man die Zellen an der Muldenoberfläche anhaften. Die Konzentrationen der getesteten Wachstumsfaktoren betrugen 10 μg/ml BP und 10 ng/ml TGFβ1. Die Verdünnungen wurden in TCM hergestellt. Die Zellen wurden nach vier und acht Tagen einer kontinuierlichen Exposition mit Wachstumsfaktoren fixiert, und die Proteoglykan-Synthese wurde anhand des Alzianblau-Tests gemäß der Beschreibung in BEISPIEL 10 erfasst.
Bei vier Tagen lag zwischen den verschiedenen Wachstumsfaktoren und der Kontrolle keine bedeutende Zunahme der Proteoglykan-Synthese vor. Bei acht Tagen (17) erhöhten TGFβ1 und BP die Proteoglykan-Synthese im Vergleich zur Kontrolle beträchtlich, die Zunahme war jedoch nur marginal. Insbesondere erzeugte TGFβ1 eine Zunahme von 21% im Vergleich zur Kontrolle, während BP eine Zunahme von 22% im Vergleich zur Kontrolle erzeugte.
BEISPIEL 17: Färben von eingeimpftem Matrixmaterial mit Phalloidin
Eine vernetzte Matrix, die mit Lebendzellen angeimpft war, wurde mit Phalloidin gefärbt, um das Wachstum und die Vermehrung von Lebendzellen in die Matrix anzuzeigen. Das Medium wurde mit drei PBS-Wäschen von jeweils fünf Minuten aus der Matrix herausgespült. Die Matrix wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 4%igem Paraformaldehyd fixiert. Das 4%ige Paraformaldehyd wurde mit drei PBS-Spülungen abgewaschen. Die Matrix wurde drei Minuten lang mit 0,1% Triton-X 100 behandelt und anschließend mit drei PBS-Spülungen gewaschen. Die Matrix wurde anschließend 45 Minuten lang mit mit Phalloidin konjugiertem Rhodamin, das in PBS zugesetzt wurde, gefärbt. Überschüssiges Phalloidin wurde mit PBS abgewaschen. Die Matrix wurde auf Objektträgern angebracht und unter Fluoreszenz mit einem Filter des λ-Bereichs 530–550 nm betrachtet.
BEISPIEL 18: Wachstum und Vermehrung von Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf in eine nicht-homogenisierte Matrix mit einem BP-Wachstumsfaktor
Der Einwuchs und die Vermehrung von mit einem Wachstumsfaktor stimulierten Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf in die Matrix der vorliegenden Erfindung wurde untersucht. Vernetztes Matrixmaterial, das vor dem Lyophilisierungsschritt des Beispiels 1 erhalten wurde, wurde in quadratische Stücke von 75 mm an jeder Seite geschnitten und drei Stunden lang in 70% Ethanol sterilisiert. Verbleibende Schritte in dem Protokoll wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
Mit zwei einstündigen Waschungen in steriler PBS wurde Ethanol aus der Matrix entfernt, woraufhin eine einstündige Waschung in TCM folgte. Die Matrixstücke wurden anschließend über Nacht in TCM, das BP-Konzentrationen von 20 ng/ml und 20 μg/ml aufwies, suspendiert. Die Kontrolle war eine vernetzte Matrix, die in 20 μg/ml BSA (Rinder-Serumalbumin) suspendiert wurde. Jedes Matrixstück wurde anschließend in eine Mulde einer 24-Mulden-Platte platziert und mit TCM angeimpft, das Schaf-Bandscheiben-Nucleus-Zellen bei 40.000 Zellen/ml enthielt. Man ließ die Zellen in die Matrix hineinwachsen, und das TCM wurde alle zwei bis drei Tage gewechselt. Als Stichprobe dienende Matrixstücke wurden bei drei, sechs und neun Tagen fixiert und mit Phalloidin gefärbt, wie in BEISPIEL 17 beschrieben wurde. Der Vorgang ist in 7 veranschaulicht.
Eine Infiltration von Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf in die Matrix wurde zu allen der Zeitpunkte von drei, sechs und neun Tagen beobachtet, wobei dies anzeigte, dass die Matrix biokompatibel ist. Die Anzahl von pro Feld beobachteten Zellen war bei sechs und neun Tagen höher, was darauf hinwies, dass sich die Zellen in die Matrix hinein vermehrten. In Matrixstücken, die in BP enthaltendem TCM suspen diert gewesen waren, wurden mehr Zellen beobachtet als in Kontrollen, die keinen Wachstumsfaktor aufwiesen. Bei 20 μg/ml bewirkte BP die höchste Infiltration und Vermehrung von Zellen in die Matrix hinein.
BEISPIEL 19: Wachstum und Vermehrung von Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf in eine homogenisierte Matrix mit einem BP-Wachstumsfaktor
Eine weitere Untersuchung des Einwuchses und der Vermehrung von mit einem Wachstumsfaktor stimulierten Bandscheiben-Nucleus-pulposus-Zellen vom Schaf in die Matrix der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung einer homogenisierten Matrix im Gegensatz zu der nicht-homogenisierten Matrix im BEISPIEL 18 durchgeführt. Vernetztes Matrixmaterial, das vor dem Lyophilisierungsschritt des Beispiels 1 erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines Gewebehomogenisators homogenisiert und drei Stunden lang in 70% Ethanol sterilisiert. Alle nachfolgenden Schritte in dem Protokoll erfolgten unter aseptischen Bedingungen.
Die homogenisierte Matrix wurde bei 3.200 UpM zehn Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die pelletierte Matrix wurde mit zwei einstündigen PBS-Waschungen gespült, worauf eine einstündige TCM-Waschung folgte. Zwischen jeder Waschung wurde die Matrix zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die pelletierte Matrix wurde anschließend über Nacht in TCM, das BP-Konzentrationen von 20 ng/ml und 20 μg/ml aufwies, suspendiert. Die Kontrolle war eine vernetzte Matrix, die in 20 μg/ml BSA suspendiert war.
Das Gemisch aus TCM und Matrix wurde anschließend zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Matrixpellet wurde erneut in TCM suspendiert, das Bandscheiben-Nucleus-Zellen vom Schaf enthielt und das gemäß der Vorgehensweise in den BEISPIELEN 8 und 9 gewonnen wurde. Die Matrix/Zell- Suspension wurde in Mulden einer 24-Mulden-Platte pipettiert. Das TCM wurde alle zwei bis drei Tage gewechselt. Die mit Zellen angeimpfte homogenisierte Matrix wurde bei vier Tagen fixiert und mit Phalloidin gefärbt, wie im BEISPIEL 17 beschrieben wurde. Der Prozess ist in 7 veranschaulicht.
Nach vier Tagen hatte sich die Schicht der vernetzten Matrix, die in 20 μg/ml BP eingeweicht war und mit Zellen angeimpft war, zu einem gerundeten Klumpen aus kompaktem Gewebe zusammengezogen. Dieses Gewebe bestand sowohl aus der ursprünglichen vernetzten Matrix als auch der durch die infiltrierten Zellen erzeugten neu synthetisierten Matrix. Sehr wenige Zellen hafteten an der Muldenoberfläche, was darauf hinwies, dass die meisten Zellen die Matrix infiltriert hatten. Diese Schlussfolgerung wurde durch die dichte Infiltrierung von Zellen in die Matrix, wie sie durch eine Färbung mit Phalloidin sichtbar gemacht wurde, bestärkt. Die Zellen hatten eine abgerundete Morphologie angenommen, die für chondrozytische Nucleus-Zellen charakteristisch ist und auf eine Rückkehr zu ihrer ursprünglichen Morphologie hinweist. Die Zellen waren nach vier Tagen auch in die in 20 ng/ml BP eingeweichte Matrix hineingewachsen, jedoch war der Einwuchs der Zellen nicht so dicht wie bei der in 20 μg/ml BP eingeweichten Matrix.
Die in BSA suspendierte Kontrollmatrix wurde ebenfalls von Zellen infiltriert, jedoch war sie unter den verschiedenen Verdünnungen die am wenigsten dicht besetzte.
BEISPIEL 20: In-vivo-Auswertung einer vernetzten Matrix und eines Knochenproteinwachstumsfaktors (BP-Wachstumsfaktors) für eine Nucleus-pulposus-Regeneration in/bei einem Modell einer Schafs-Lendenwirbelsäule
Es wurden Pilotstudien durchgeführt, um vorbereitende und chirurgische Verfahren zur Implantierung der BP- Wachstumsfaktoren enthaltenden vernetzten Matrix in den Bandscheibenraum der Schafs-Wirbelsäule auszuwerten, um über einen Zeitraum von sechs Monaten hinweg auszuwerten, ob eine Implantation der Matrix mit Wachstumsfaktoren eine Degeneration stoppt und/oder eine Regeneration von Nucleus pulposus bei einem Schafs-Bandscheibendegenerationsmodell stimuliert, und um die Antikörper- und durch Zellen vermittelte Immunantwort bei Schafen auf die Matrix/BP-Kombination zu beurteilen.
Studie Nr. 1
Ein halbes Gramm (0,5 g) einer gemäß der Beschreibung in BEISPIEL 1 hergestellten lyophilisierten und pulverisierten vernetzten Matrix wurde rehydriert und durch zwei vierstündige Spülungen in 70% Isopropanol sterilisiert. Die Matrix wurde zentrifugiert und pelletiert und anschließend dreimal jeweils zwei Stunden lang in steriler PBS gespült, um das Isopropanol zu entfernen. Die rehydrierte Matrix wurde erneut zentrifugiert und pelletiert.
Gemäß den US-Patentschriften Nrn. 5,290,763 und 5,371,191 hergestelltes Knochenprotein (BP) wurde in lyophilisierter Form von Sulzer Biologics, Inc. (Wheat Ridge, CO) erhalten. Zwei Milligramm (2 mg) BP wurden in 100 (1 verd. 0,01 M Chlorwasserstoffsäure suspendiert, um eine 20 mg/ml BP-Vorratslösung zu erhalten. Die BP-Vorratslösung wurde auf 100 μg/ml in Schafsserum verdünnt, und die BP/Serum-Suspension wurde durch ein Filter der Größe 0,2 Mikrometer sterilgefiltert. Als Nächstes wurde 1,0 ml der sterilen BP/Serum-Suspension zu 1,0 ml der oben beschriebenen rehydrierten Matrix hinzugefügt, um eine abschließende Konzentration von 50 μg BP pro ml einer Suspension aus vernetzter, rehydrierter Matrix/Serum zu erhalten. Zum Zeitpunkt des chirurgischen Eingriffs wurde ein aliquoter Teil (0,5 ml) der Suspension aus rehydrierter Matrix/BP/Serum in eine sterile, 3 ml fassende Drucksteuerungsspritze mit einer Nadel der Stärke 18 oder 20 zur Injektion eingefüllt.
Drei Schafe wurden anästhesiert, und der dorsolaterale lumbare Bereich für den chirurgischen Eingriff präpariert. Vor der Operation wurde jedem Schaf Blut entnommen, zentrifugiert, und für Immunologiestudien wurde Serum gesammelt. Durch die schrägen Bauchmuskeln wurde ein ventrolateraler, retroperitonealer Vorstoß zu der Ebene durchgeführt, die sich bauchseits der Querfortsätze der Lendenwirbelsäule befindet. Die Annuli fibrosi der Bandscheiben L3-4, L4-5 und L5-6 wurden lokalisiert, Weichteile zurückgezogen, und in beiden Bandscheiben L3-4 und L5-6 wurde ein diskreter 5 mm tiefer und 5 mm langer Einschnitt durchgeführt. Die dazwischen liegende, mittlere L4-5-Bandscheibe blieb intakt, um als intraoperative Kontrolle zu dienen. Im Anschluss an Annulus-Stich-Prozeduren wurden das Muskel- und das subkutane Gewebe mit einer absorbierbaren Naht geschlossen. Nach der postoperativen Erholung durften sich die Schafe auf der Weide frei bewegen.
Zwei Monate nach den chirurgischen Annulus-Stich-Prozeduren wurden die Schafe ein zweites Mal operiert. Nach der Anästhesie und der Vorbereitung auf den chirurgischen Eingriff wurden die drei operierten Ebenen der Lendenwirbelsäule erneut freigelegt. Zweihundert Mikroliter (200 μl) des präparierten Testmaterials (d.h. Suspension aus rehydrierter Matrix/BP/Serum) wurden in den innerhalb der Bandscheibe befindlichen Raum einer (L5-6) der experimentell beschädigten Bandscheiben injiziert. Die zweite operierte Bandscheibe (L3-4) diente als scheinbehandelte degenerative Bandscheibe; die Spritzennadel durchstach den Annulus, es wurde jedoch kein Material injiziert. Nach den Bandscheibenbehandlungen wurden das Muskel- und das subkutane Gewebe mit einer absorbierbaren Naht geschlossen. Im Anschluss an die postoperative Erholung durften sich die Schafe frei bewegen. Der Entwurf der Studie ist diagrammhaft in 10 dargestellt.
Zwei, vier und sechs Monate nach der zweiten Operation wurden die Schafe geopfert. Die Röntgenaufnahme von dem 2-Monats-Schaf zeigte ein degeneratives Erscheinungsbild der unbehandelten Bandscheibe, jedoch ein normales Erscheinungsbild bei der Kontroll- und der behandelten Bandscheibe (11). Eine histologische Analyse des 2-Monats-Schafs gemäß der Veranschaulichung in 12 bestätigte eine umfassende Degeneration in der scheinbehandelten, mit einem Stich versehenen degenerativen Bandscheibe. Sowohl in der Kontrollbandscheibe als auch in der mit Matrix/BP behandelten Bandscheibe wurde ein gelatineartiger Nucleus einer normalen Größe und ein regelmäßiger, kompakter Annulus beobachtet. Bei dem 4-Monats- und dem 6-Monats-Schaf waren in der Röntgenaufnahme der drei Bandscheiben keine offensichtlichen Veränderungen zu erkennen. Eine Röntgenaufnahme des 4-Monats-Schafs ist in 13 zu sehen. Bei einer groben Dissectio des 4-Monats-Schafs wies die scheinbehandelte Bandscheibe eine offensichtliche grobe Verschlechterung auf, wohingegen die Kontroll- und die behandelte Bandscheibe ein normales Erscheinungsbild aufwiesen (14). Bei dem 6-Monats-Schaf bestanden zwischen der scheinbehandelten, der Kontroll- und der behandelten Bandscheibe keine großen Unterschiede.
Obwohl bezüglich der Degenerationsrate bei Verwendung der Annulus-Stich-Technik eine gewisse Schwankung vorlag (d.h. das Nicht-Vorliegen einer deutlichen Degeneration bei dem 6-Monats-Schaf), legen diese Ergebnisse nahe, dass die Behandlung mit vernetzter Matrix/BP vor dem Fortschreiten einer durch einen Stich herbeigeführten Degeneration bei Schafbandscheiben schützen oder dasselbe hemmen kann.
Studie Nr. 2
Für die zweite Studie wurde Matrixmaterial rehydriert und mit BP und Serum kombiniert, um eine Suspension aus Mat rix/BP/Serum zu erzeugen, wie in Studie Nr. 1 beschrieben wurde.
Zwölf Schafe wurden anästhesiert, und der dorsolaterale lumbare Bereich für den chirurgischen Eingriff präpariert. Vor der Operation wurde jedem Schaf Blut entnommen, zentrifugiert, und für Immunologiestudien wurde Serum gesammelt. Durch die schrägen Bauchmuskeln wurde ein ventrolateraler, retroperitonealer Vorstoß zu der Ebene durchgeführt, die sich bauchseits der Querfortsätze der Lendenwirbelsäule befindet. Die Annuli fibrosi der Bandscheiben L1-2, L2-3, L3-4, L4-5 und L5-6 wurden lokalisiert, Weichteile zurückgezogen, und unter Verwendung einer Spritzennadel wurde in vier der fünf Bandscheiben durch den Annulus ein Loch eines kleinen Durchmessers gestochen. Eine kleine Kürette wurde anschließend durch das Loch in den innerhalb der Bandscheiben liegenden Raum platziert, um bei jedem Schaf einen diskreten Teil des Nucleus pulposus aus jeder der vier Bandscheiben zu entfernen. Bei 2 der 4 beschädigten Bandscheiben wurde 0,5 ml der Suspension aus Matrix/BP/Serum in die innerhalb der Bandscheiben liegenden Räume injiziert, und die Nadelstiche wurden mit Ligament, das über dieselben genäht wurde, abgedichtet. Die unmittelbare Injektion dieser Suspension wurde als „Akute"-Behandlung-Protokoll angesehen. Die zwei anderen beschädigten Bandscheiben wurden zu dieser Zeit nicht behandelt, wurden jedoch mit Ligament, das über die Nadelstiche genäht wurde, abgedichtet. Die dazwischenliegende, mittlere L3-4-Bandscheibe blieb bei den Wirbelsäulen aller Schafe intakt, um als intraoperative Kontrolle zu dienen. Im Anschluss an diese Prozeduren wurde das Muskulatur- und subkutane Gewebe mit einer absorbierbaren Naht geschlossen. Nach der postoperativen Erholung durften sich die Schafe frei bewegen.
Sechs Wochen nach der ersten Operation, um Teile des Nucleus pulposus zu entnehmen, wurden die Schafe ein zweites Mal operiert. Nach der Anästhesie und der Vorbereitung auf den chirurgischen Eingriff wurden die fünf operierten Ebe nen der Lendenwirbelsäule erneut freigelegt. Bei einer der zwei verbleibenden nicht-behandelten Bandscheiben, die sechs Wochen zuvor beschädigt worden waren, wurden 0,5 Milliliter des hergestellten Testmaterials (d.h. die Suspension aus rehydrierter Matrix/BP/Serum) in den innerhalb der Bandscheibe befindlichen Raum der Bandscheibe injiziert. Die Injektion dieser Suspension in eine beschädigte Bandscheibe sechs Wochen später wurde als „Verzögerte"-Behandlung-Protokoll angesehen. Die zweite, nicht-behandelte beschädigte Bandscheibe diente als scheinbehandelte degenerative Bandscheibe; die Spritzennadel punktierte den Annulus, es wurde jedoch kein Material injiziert. Das bei jeder der vier experimentell beschädigten Bandscheiben verwendete Behandlungsverfahren wurde bezüglich einer Lokalisierung in den Wirbelsäulen zufällig zugewiesen. Das heißt, dass mit Ausnahme der intakten Kontrollbandscheibe (L3-4) jeweils einer der vier unterschiedlichen Lumbarbandscheibenebenen willkürlich die Position einer „Akute"-Behandlung-Bandscheibe, einer „Verzögerte"-Behandlung-Bandscheibe bzw. einer nicht-behandelten, beschädigten Bandscheibe zugewiesen wurde. Nach den Bandscheibenbehandlungen wurden das Muskel- und das subkutane Gewebe mit einer absorbierbaren Naht geschlossen. Im Anschluss an eine postoperative Erholung durften sich die Schafe frei bewegen.
Zwei, vier und sechs Monate nach den Injektionen mit Matrix/BP/Serum wurden die Schafe geopfert, und die Wirbelsäulen wurden für die Histologie in Formalin fixiert. Den in Kunststoff eingebetteten Bandscheiben wurden Querschnitte entnommen, mit H & E und Saffranin-O gefärbt und in Bezug auf die Chondrozytenvermehrung (Klonung), auf die Intensität der Proteoglykaneinfärbung, auf den Fibrosegrad und auf den Verknöcherungsgrad ausgewertet. Eine Auswertung der „Akute"-Behandlung-Bandscheiben, der „Verzögerte"-Behandlung-Bandscheiben, der scheinbehandelten und der Kontrollbandscheiben wurde auf blinde Weise durchgeführt und für jeden oben aufgeführten Parameter als +1, +2 oder +3 (niedrig, mittel oder hoch) klassifiziert. Eine semiquantitative Auswertung der histologischen Ergebnisse wurden sowohl für die „akute" als auch die „verzögerte" (sechs Wochen) Behandlung in 2-Monats-, 4-Monats- und 6-Monats-Schafen verglichen.
Die Ergebnisse demonstrierten insgesamt, dass injizierte Matrix + BP das Klonen von Chondrozyten und eine Ansammlung einer Einfärbung von Glykosaminoglykanen mit Saffranin-O in der Nucleus-Matrix von beschädigten Bandscheiben stimulierte. Insbesondere war das Ausmaß einer regenerativen Reparatur sowohl bei Bandscheiben mit „akuter" Behandlung als auch bei Bandscheiben mit „verzögerter" Behandlung im Vergleich zu derjenigen, die bei nicht-behandelten, beschädigten Bandscheiben beobachtet wurde, viel höher. Dieser höhere Reparaturumfang bei mit Matrix/BP behandelten Bandscheiben war bei dem Vertrauensniveau von 0,01 statistisch bedeutend. Im Vergleich zu den nicht-behandelten Bandscheiben war bei den akut und verzögert behandelten Bandscheiben auch weniger Fibrose und Verknöcherung zu sehen.
Ein bedeutender Unterschied zwischen den Bandscheiben mit „verzögerter" Behandlung und den Bandscheiben mit „akuter" Behandlung war auch bezüglich des Grades der Proteoglykanfärbung zu erkennen. Beispielsweise war die Färbung mit Saffranin-O als Index bezüglich der Proteoglykan-Synthese und der Gehalt in der Nucleus-Matrix bei den Bandscheiben mit „verzögerter" Matrix/BP-Behandlung größer als bei den Bandscheiben mit „akuter" Matrix/BP-Behandlung. Zusätzliche Vorteile, die bei der histologischen Auswertung offensichtlich waren und die mit einer „verzögerten" Behandlung mit Matrix/BP in Verbindung standen, waren ein insgesamtes Fehlen einer knochigen Verformung (Verknöcherung) oder einer Ansammlung von fasrigem Gewebe (Fibrose) in den behandelten Bandscheiben im Vergleich zu den nicht-behandelten, beschädigten Bandscheiben. Allgemein stützen und erweitern die Ergebnisse in Studie Nr. 2 frühere Hinweise aus Studie Nr. 1, die besagen, dass eine Behandlung von beschädigten Bandscheiben mit der vernetzten Matrix/BP vor dem Fortschreiten einer Degenerierung bei experimentell beschädigten Schaf-Bandscheiben schützen oder dasselbe hemmen kann.
BEISPIEL 21: Charakterisierung von BP
Spezifische Wachstumsfaktoren, die in dem Gemisch von Wachstumsfaktoren vorliegen, das gemäß den US-Patentschriften Nrn. 5,290,763, 5,371,191 und 5,563,124 hergestellt wurde (d.h. BP), wurden identifiziert. BP wurde bereits teilweise wie folgt charakterisiert: HPLC-Fraktionen wurden denaturiert, mit DTT (Dithiothreitol) reduziert und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt. In 18 sind einminütige Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Fraktionen (HPLC-Fraktionen, HPLC = high performance liquid chromatography) gezeigt, die bei zwischen 27 und 36 Minuten genommen wurden. Größenstandards (ST) von 14, 21, 31, 45, 68 und 97 kDa wurden von BIORAD (Wz) als Low-Range-Größenstandards erhalten und sind an beiden Enden des mit Coomassie-Blau gefärbten Gels gezeigt (18 und 19). Bei dem üblichen Protokoll sind HPLC-Fraktionen 29 mit 34 zusammengenommen, um BP zu erzeugen (siehe Kästchen in 18 und 19), wie bei einem auf ähnliche Weise hergestellten SDS-PAGE-Gel in 33B gezeigt ist.
Ein SDS-PAGE-Gel aus BP wurde durch den Western-Immunoblot mit einer Serie von Antikörpern analysiert, wie in 30 aufgelistet ist. Die Antikörperreaktivität wurde durch Meerrettichperoxidase, die mit einem zweiten Antikörper konjugiert war, und unter Verwendung eines chemilumineszierenden Substrats sichtbar gemacht. Die Reaktivitäten lauten wie in 30 angegeben.
Das BP wurde ferner mittels einer 2D-Gelelektrophorese (einer zweidimensionalen Gelelektrophorese) charakterisiert, wie in 21 und 22 gezeigt ist. Die Proteine sind gemäß dem Verfahren von O'Farrell et al. in der horizontalen Richtung nach Beschickung (pI) und in der vertikalen Richtung nach Größe getrennt. (Cell, 12: 1133–1142, 1977). Interne Standards, im Einzelnen Tropomyosin (33 kDa, pI 5,2) und Lysozym (14,4 kDa, pI 10,5–11,0), sind enthalten, und das 2D-Gel wurde durch Färbung mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht. 21 zeigt das gefärbte 2D-Gel, wobei auf der linken Seite Größenstandards angegeben sind. Tropomyosin (linker Pfeil) und Lysozym (rechter Pfeil) sind ebenfalls angegeben.
Dasselbe Gel ist in 22 gezeigt, wobei mehrere identifizierte Proteine durch nummerierte Kreise angegeben sind. Die Proteine wurden mittels Massenspektrometrie und Aminosäuresequenzierung von tryptischen Peptiden identifiziert, wie nachfolgend beschrieben wird. Die Identität jedes der markierten Kreise ist in der Legende der 22 angegeben.
Die verschiedenen Komponenten des BP wurden mittels Massenspektrometrie und Aminosäuresequenzierung von tryptischen Fragmenten charakterisiert, wenn für eine Analyse ausreichende Proteinmengen vorlagen. Die Hauptbänder bei den 1D-Gelen (eindimensionalen Gelen) wurden herausgeschnitten, eluiert, einem tryptischen Aufschluss unterworfen, mittels HPLC gereinigt und anhand von in der Technik bekannten Verfahren sequenziert. Die Hauptbänder sind anhand der Bandnummer identifiziert, wie in 19 und 20 gezeigt ist. Die Sequenzdaten wurden mit bekannten Sequenzen verglichen, und die Fragmente sind gemäß der Darstellung in 31 identifiziert. In manchen Fällen ist die Identifizierung auf Grund einer möglichen Variation zwischen den menschlichen und Rindersequenzen und/oder auf Grund möglicher posttranslationeller Modifikationen vorläufig, wie nachstehend erörtert wird.
Dieselben tryptischen Proteinfragmente werden mittels Massenspektrometrie analysiert, und die Massenspektrogramme sind in den 23A–23O gezeigt. Die tabellarisch angeordneten Ergebnisse sind in der in den 32A–32F gezeigten Tabelle dargestellt, die Identifizierungsinformationen für jedes der angegebenen Bänder gemäß der Identifizierung in 19 und 20 liefert. Wie oben kann eine Zuweisung einer Bandidentität auf Grund von Differenzen zwischen den Spezies und posttranslationellen Modifikationen vorläufig sein.
Die identifizierten Komponenten von BP wurden gemäß der Darstellung in den 33A und 33B quantifiziert. 33B ist ein gefärbtes SDS-PAGE-Gel aus BP, und 33A stellt eine DC-Scanners-Spur desselben Gels dar. Die identifizierten Proteine wurden durch Messen des Bereichs unter der Kurve markiert und quantifiziert. Diese Ergebnisse sind in 34 als Prozentsatz des Gesamtspitzenbereichs dargestellt.
Wie 34 angibt, gibt es bei dem BP-SDS-PAGE-Gel 11 Hauptbänder, die etwa 60% des Proteins in BP darstellen. Ferner wurde TGF-β1 unter Verwendung von handelsüblich reinem TGF-β1 als Standard quantifiziert, und man hat ermittelt, dass es weniger als 1% des BP-Proteins darstellt. Die identifizierten Proteine lassen sich grob in drei Kategorien unterteilen: die Ribosomenproteine, die Histone und Wachstumsfaktoren, einschließlich aktiver Wachstumsfaktoren, die Angehörige der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren umfassen, die die morphogenen Knochenproteine (BMPs – bone morphogenic proteins) einschließt. Man glaubt, dass die Ribosomenproteine und Histonproteine ohne Aktivitätsverlust aus dem BP entfernt werden können, und man erwartet, dass die spezifische Aktivität entsprechend ansteigt.
Da mehrere der Proteine bei mehr als einer Größe migrierten (z.B. BMP-3, das als 5 Bänder migrierte), wurden Untersuchungen durchgeführt, um den Umfang der posttranslationellen Modifikation der BP-Komponenten zu untersuchen. Anhzand eines Anti-Phosphotyrosin-Immunoblots und anhand von Phosphatase-Studien wurde eine Phosphorylierung gemessen.
24 zeigt ein 2D-Gel, das mittels Elektroblot auf Filterpapier aufgebracht wurde und mit einem Phosphotyrosin-Mäuse-Monoklonal-Antikörper von SIGMA (Nr. A-5964) sondiert wurde. Somit wurde gezeigt, dass mehrere Proteine an einem oder mehreren Tyrosinresten phosphoryliert waren.
Ähnliche 2D-Elektroblots wurden mit für eine BP-Komponente spezifischen Antikörpern sondiert, wie in 25A–D gezeigt ist. Die Filter wurden mit BMP2, BMP-3 (25A), BMP-3, BMP-7 (25B), BMP-7, BMP-2 (25C) und BMP-3 und TGF-β1 (25D) sondiert. Jeder zeigt das charakteristische, eine einzige Größe aufweisende Band, das bei variierendem pI migriert, wie es für ein Protein, das in verschiedenen Phosphorylierungszuständen vorliegt, typisch ist.
Native und mit Phosphatase behandelte BP-Proben wurden ferner mittels Explantatmasse und ALP-Punktzahlbewertung (ALP = alkaline phosphatase, alkalische Phosphatase), auf ihre morphogene Aktivität hin untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass eine AcP-Behandlung die Explantatmasse- und ALP-Bewertung/Punktzahl von 100% auf etwa 60% reduziert.
Das BP wurde auch auf eine Glykosylierung hin analysiert. 26 zeigt ein SDS-PAGE-Gel, das mit Periodsäure-Schiff (PAS) gefärbt ist – einer nicht-spezifischen Kohlenhydratfärbung, wobei dies darauf hinweist, dass mehrere der BP-Komponenten glykosyliert sind (mit Sternchen bezeichnetes Protein als BMP-3 identifiziert). 27 und 28 zeigen zwei spezifische Proteine (BMP-7, 27 und BMP-2, 28), die mit zunehmenden Mengen an PNGase F (Peptid-N-Glykosidase F) behandelt und mit dem entsprechenden Antikörper immunogefärbt wurden. Sowohl BMP-2 als auch BMP-7 zeigen einen gewissen Glykosylierungsgrad, scheinen jedoch eine gewisse Proteinmenge aufzuweisen, die gegenüber PNGase F ebenfalls resistent ist (Pluszeichen weisen auf zunehmende Enzymmengen hin). Die funktionelle Aktivität von mit PNGase F und Sialadase behandelten Proben wurde mittels Ex plantatmasse und ALP-Punktzahlbewertung untersucht, wie in 29A und 29B gezeigt ist, wobei dies ein Hinweis darauf ist, dass zum Zweck einer vollständigen Aktivität eine Glykosylierung erforderlich ist.
Zusammengefasst werden BMPs 2, 3 und 7 durch eine Phosphorylierung (~33%) und eine Glykosylierung (50%) modifiziert. Diese posttranslationellen Modifikationen beeinflussen in der Tat die morphogene Proteinaktivität.
Matrixzusammensetzungen, die bei der Behandlung von Bandscheibenbeeinträchtigungen bei Wirbeltieren, einschließlich Menschen, nützlich sind, können gemäß den vorstehenden Beschreibungen und Beispielen hergestellt werden. Obwohl verschiedene Ausführungsbeispiele der Erfindungen ausführlich beschrieben wurden, werden Fachleuten angesichts der vorliegenden Offenbarung Modifikationen und Adaptationen dieser Ausführungsbeispiele einleuchten. Jedoch sind derartige Modifikationen und Adaptationen in dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindungen, wie er in den folgenden Patentansprüchen dargelegt ist, enthalten.

Claims

Eine Fluidmatrix, die ein vernetztes, entzellularisiertes Nucleus-pulposus-Gewebe eines Spender-Wirbeltiers aufweist.
Die Fluidmatrix gemäß Anspruch 1, die ferner einen Wachstumsfaktor aufweist.
Die Fluidmatrix gemäß Anspruch 2, die ferner eine Mehrzahl lebender Zellen umfasst.
Die Fluidmatrix gemäß Anspruch 3, bei der die Mehrzahl lebender Zellen Chondrozyten umfassen.
Die Fluidmatrix gemäß Anspruch 3, bei der die Mehrzahl lebender Zellen mesenchymale Stammzellen umfassen, die nicht von einem menschlichen Embryo stammen.
Die Fluidmatrix gemäß Anspruch 3, bei der die Mehrzahl lebender Zellen von einem Menschen, jedoch nicht von einem menschlichen Embryo stammen.
Die Fluidmatrix gemäß Anspruch 1, bei der das Nucleus-pulposus-Gewebe mit einem photooxidativen Katalysator vernetzt ist.
Die Fluidmatrix gemäß Anspruch 7, bei der der photooxidative Katalysator Methylenblau ist.
Die Fluidmatrix gemäß Anspruch 1, bei der das Spender-Wirbeltier ein Schwein, eine Kuh oder ein Mensch ist.
Verwendung der Fluidmatrix gemäß Anspruch 1 bei der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von Bandscheibenerkrankungen.