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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine für ein Temperaturzyklenverfahren
geeignete Vorrichtung und ein Verfahren zum Stabilisieren einer
einen Nah-Infrarot-Farbstoff
umfassenden Zusammensetzung in einem Temperaturzyklenverfahren,
das Zyklen zwischen etwa 50°C
und etwa 95°C
umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren
zur Durchführung
eines thermischen Verfahrens, und ein Verfahren zum Denaturieren
von über
Wasserstoffbrücken
verbundenen Molekülen.
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Viele
verschiedene chemische, biochemische und andere Reaktionen schließen Temperaturzyklen ein.
Beispiele für
thermische Verfahren auf dem Gebiet der genetischen Amplifikation
schließen
Polymerasekettenreaktion (PCR), Sanger-Sequenzieren usw. ein, sind
jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Reaktionen können
auf der Basis der Temperaturen des beteiligten Materials verbessert
oder gehemmt werden. Wenngleich es möglich sein kann, Proben einzeln
zu verarbeiten und genaue Ergebnisse von einer Probe zur anderen
zu erhalten, kann die Einzelverarbeitung zeitaufwendig und teuer
sein.
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Eine
Vorgehensweise zum Reduzieren der Zeit und der Kosten des thermischen
Verarbeitens von mehreren Proben ist es, eine Vorrichtung zu verwenden,
die mehrere Kammern einschließt,
in welchen unterschiedliche Anteile einer Probe oder unterschiedliche
Proben gleichzeitig verarbeitet werden können. Werden mehrere Reaktionen
in unterschiedlichen Kammern durchgeführt, kann jedoch die genaue
Steuerung der Temperatureinheitlichkeit von einer Kammer zur anderen
ein erhebliches Problem darstellen. Die Notwendigkeit der genauen
Temperatursteuerung kann sich als Notwendigkeit äußern, eine gewünschte Temperatur
in jeder der Kammern aufrechtzuerhalten, oder eine Veränderung
der Temperatur, z.B. eine Erhöhung
oder eine Senkung in jeder der Kammern auf einen gewünschten
Einstellpunkt umfassen. In Reaktionen unter Beteiligung einer Temperaturänderung
kann die Geschwindigkeit oder Rate, mit welcher sich die Temperatur
in jeder der Kammern ändert,
ebenfalls ein Problem aufwerfen. Zum Beispiel können langsame Temperaturübergänge problematisch
sein, wenn unerwünschte
Nebenreaktionen bei Zwischentemperaturen auftreten. Alternativ dazu können zu
schnelle Temperaturübergänge andere
Probleme verursachen. Infolgedessen handelt es sich bei einem anderen
anzutreffenden Problem um eine vergleichbare Temperaturübergangsrate
von einer Kammer zur anderen.
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Ein
anderes Problem das in denjenigen Reaktionen anzutreffen ist, in
welchen Temperaturzyklen erforderlich sind, ist die Gesamtgeschwindigkeit
des ganzen Verfahrens. Zum Beispiel können mehrere Übergänge zwischen
oberen und unteren Temperaturen erforderlich sein. Alternativ dazu
kann eine Vielfalt von Übergängen (nach
oben und/oder nach unten) zwischen drei oder mehr erwünschten
Temperaturen erforderlich sein. In einigen Reaktionen, z.B. in der
Polymerasekettenreaktion (PCR), müssen die Temperaturzyklen bis
zu dreißig
oder mehr Malen wiederholt werden. Typische Temperaturzyklenvorrichtungen
und -verfahren, die versuchen, die Probleme der Temperatureinheitlichkeit
von einer Kammer zur anderen vergleichbarer Temperaturübergangsraten
von einer Kammer zur anderen anzugehen, sind jedoch typischerweise
von einem Fehlen der Gesamtgeschwindigkeit in Mitleidenschaft gezogen – was zu
verlängerten
Verarbeitungszeiten führt,
die letztendlich die Kosten der Verfahren erhöhen.
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Eines
oder mehrere der vorstehenden Probleme kann in einer Vielfalt von
chemischen, biochemischen und anderen Verfahren eingeschlossen sein.
Beispiele für
einige Reaktionen, die eine genaue Temperatursteuerung von einer
Kammer zur anderen, vergleichbare Temperaturübergangsraten und/oder schnelle Übergänge zwischen
den Temperaturen erfordern, schließen z.B. die Manipulation von
Nukleinsäureproben
zum Unterstützen
des Dechiffrierens des genetischen Codes ein. Siehe z.B. J. Sambrook
und D.W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Aufl.,
Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Nukleinsäure-Manipulationstechniken
schließen
Amplifikationsverfahren, wie Polymerasekettenreaktion (polymerase
chain reaction, PCR); Targetpolynukleotid-Amplifikationsverfahren,
wie selbsterhaltende Sequenzreplikation (3SR); Verfahren auf der
Basis der Amplifikation von Sonden-DNA, wie Ligase-Kettenreaktion
(ligase chain reaction, LCR) und QB-Replikase-Amplifikation (QBR);
Verfahren auf Transkriptionsbasis, wie Ligations-aktivierte Transkription (LAT)
und Amplifikation auf Nukleinsäuresequenz-Basis
(nucleic acid sequence transcription based amplification, NASBA);
und verschiedene andere Amplifikationsverfahren, wie Reparaturkettenreaktion
(repair chain reaction, RCR) und Zyklussondenreaktion (cycling probe
reaction, CPR) ein.
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Ein
gängiges
Beispiel für
eine Reaktion, in welcher all die vorstehend erörterten Probleme eingeschlossen
sein können,
ist die PCR-Amplifikation. Eine traditionelle Temperaturzyklen-Apparatur
zum Durchführen
von PCR verwendet polymere Mikroküvetten, die einzeln in Bohrungen
in einem Metallblock eingesetzt werden. Die Probentemperaturen werden
dann einem Zyklus zwischen niedrigen und hohen Temperaturen, z.B.
55°C und
95°C für PCR-Verfahren
unterzogen. Unter Verwendung der traditionellen Apparatur gemäß den traditionellen
Verfahren führen
die hohe Wärmemasse
der Temperaturzyklenapparatur (die typischerweise den Metallblock
und einen erwärmten
Deckblock einschließt)
und die relativ niedrige Wärmeleitfähigkeit
der für
die Mikroküvetten
verwendeten polymeren Materialien zu Verfahren, die zwei, drei oder
mehr Stunden dauern können,
um eine typische PCR-Amplifikation zu vervollständigen.
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Ein
anderes Problem, das bei der Herstellung von fertigen Proben (z.B.
isolierten oder gereinigten Proben z.B. von Nukleinsäurematerialien,
wie DNA, RNA usw.) menschlichen, tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen
Ursprungs aus rohen Probenmaterialien (z.B. Blut, Gewebe usw.) anzutreffen
ist, ist die Anzahl von thermischen Verarbeitungsschritten und anderen
Verfahren, die durchgeführt
werden müssen,
um das gewünschte
Endprodukt (z.B. gereinigte Nukleinsäurematerialien) zu erhalten.
In manchen Fällen
muss eine Anzahl von unterschiedlichen thermischen Verfahren zusätzlich zum
Filtrieren und zu anderen Verfahrensschritten durchgeführt werden,
um die gewünschten
fertigen Proben zu erhalten.
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Ein
Beispiel ist die Herstellung einer fertigen Probe (z.B. von gereinigten
Nukleinsäurematerialien)
aus einer Ausgangsprobe (z.B. einer rohen Probe, wie Blut, Bakterienlysat
usw.). Zum Erhalt einer gereinigten Probe der gewünschten
Materialien in hohen Konzentrationen muss die Ausgangsprobe z.B.
für PCR
hergestellt werden, wonach das PCR-Verfahren durchgeführt wird,
um ein gewünschtes
PCR-Produkt zu erhalten. Das PCR-Produkt wird dann einer weiteren
Manipulation, wie Sequenzieren, Ligation, elektrophoretische Analyse usw.,
unterzogen.
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Ein
Verfahren des Verbesserns von herkömmlichen Temperaturzyklenverfahren
umfasst die Verwendung von elektromagnetischer Strahlung und Energie
absorbierenden Pigmenten und Farbstoffen zum Absorbieren der Strahlung
und deren Umwandeln zu Wärmeenergie.
Die Verwendung von elektromagnetischen Strahlungsabsorptionsmitteln,
wie Pigmenten und Farbstoffen, kann Reaktionen stören, die
die Verwendung eines Enzyms umfassen. Das Enzym kann deaktiviert
werden, wodurch die Bildung der gewünschten Produkte, z.B. PCR-Amplifikationsprodukte,
verhindert wird. Folglich besteht Bedarf nach Verfahren, die die
Verwendung von elektromagnetischer Strahlung und Absorptionsmitteln wie
Farbstoffen ohne nachteilige Wirkungen auf die Bildung der gewünschten
Reaktionsprodukte ermöglichen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Vorrichtungen und Verfahren bereit,
die die Verwendung eines Nah-Infrarot(Nah-IR-
oder NIR-)Farbstoffs umfassen. Derartige Vorrichtungen und Verfahren
werden vorzugsweise zum Verarbeiten von Probengemischen verwendet,
die biologische Materialien einschließen. Bevorzugte Verfahren umfassen
die Verwendung von Temperaturzyklen für ein ein biologisches Material
und ein Enzym einschließendes
Probematerial durch die Anwendung von elektromagnetischer Energie.
Ein Farbstoff wird verwendet, um die elektromagnetische Energie
in thermische Energie umzuwandeln, und ein Tensid wird verwendet,
um die Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Farbstoff zu hemmen
(d.h. zu reduzieren, zu verhindern und/oder umzukehren). Wie hier
verwendet, umfasst das Hemmen der Wechselwirkung zwischen dem Enzym
und dem Farbstoff das Reduzieren der Wechselwirkung im Vergleich
zu demselben System, wenn das Tensid nicht vorliegt. Vorzugsweise
umfasst das Hemmen der Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Farbstoff
das Verhindern des Stattfindens der Wechselwirkung und/oder das
im Wesentlichen vollständige Umkehren
einer derartigen Wechselwirkung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine für ein Temperaturzyklenverfahren
geeignete Vorrichtung bereit, wobei die Vorrichtung mehrere Verfahrenskammern
umfasst, wobei die Verfahrenskammern eine Probenzusammensetzung
umfassen; wobei die Probenzusammensetzung einen Nah-IR-Farbstoff,
der in einer Menge vorliegt, die zur Erwärmung der Zusammensetzung nach
Anwendung elektromagnetischer Energie wirksam ist, und mehr als
etwa 0,5 Gew.-% eines Tensids, ausgewählt aus der Gruppe eines nicht-ionischen
Tensids, eines zwitterionischen Tensids und eines Gemischs davon,
umfasst, wobei die Zusammensetzung in einem Temperatur zyklenverfahren
stabil ist, welches Zyklen (vorzugsweise mindestens etwa 10 Zyklen
und stärker bevorzugt
mindestens etwa 40 Zyklen) zwischen etwa 50°C und etwa 95°C einschließt, im Vergleich
zu derselben Zusammensetzung, die keinem Temperaturzyklenverfahren
ausgesetzt war. Vorzugsweise schließt die Zusammensetzung auch
ein Enzym ein, das eine Polymerase oder eine Ligase ist.
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Vorzugsweise
schließt
die Zusammensetzung mindestens 1 Gew.-% des Tensids ein und umfasst
ferner ein Polymeraseenzym und ein Dinukleotidtriphosphat. Vorzugsweise
ist der Nah-IR-Farbstoff ein Cyaninfarbstoff oder ein Diimminiumfarbstoff.
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Eine
bevorzugte in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Zusammensetzung
schließt
einen Nah-IR-Farbstoff
ausgewählt
aus der Gruppe eines Diimminiumfarbstoffs, eines Cyaninfarbstoffs
und eines Gemischs davon, mindestens etwa 1 Gew.-% eines nicht-ionischen
Tensids, ein Polymeraseenzym und ein Dinukleotidtriphosphat ein,
wobei die Zusammensetzung in einem Temperaturzyklenverfahren stabil
ist, welches Zyklen (vorzugsweise mindestens etwa 10 Zyklen, stärker bevorzugt
mindestens etwa 40 Zyklen) zwischen etwa 50°C und etwa 95°C einschließt.
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Eine
andere bevorzugte in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Zusammensetzung
schließt einen
Nah-IR ausgewählt
aus der Gruppe eines Cyaninfarbstoffs, eines Diimminiumfarbstoffs
und eines Gemischs davon; mindestens etwa 1 Gew.-% eines nicht-ionischen
Tensids ausgewählt
aus der Gruppe von Estern von Fettsäuren und mehrwertigen Alkoholen,
Fettsäurealkanolamiden,
ethoxylierten Fettsäuren,
ethoxylierten aliphatischen Säuren,
ethoxylierten Fettalkoholen, ethoxylierten aliphatischen Alkoholen,
ethoxylierten Sorbitfettsäureestern,
ethoxylierten Glyceriden, ethoxylierten Blockcopolymeren mit EDTA,
ethoxylierten cyclischen Etheraddukten, ethoxylierten Amid- und
Imidazolinaddukten, ethoxylierten Aminaddukten, ethoxylierten Mercaptanaddukten,
ethoxylierten Kondensaten mit Alkylphenolen, ethoxylierten Hydrophoben
auf Stickstoffbasis, ethoxylierten Polyoxypropylenen, polymeren
Siliconen, fluorierten Tensiden, polymerisierbaren Tensiden und
Gemischen davon; ein Polymeraseenzym; und ein Dinukleotidtriphosphat
ein, wobei die Zusammensetzung in einem Temperaturzyklenverfahren
stabil ist, welches Zyklen (vorzugsweise mindestens etwa 10 Zyklen,
stärker
bevorzugt mindestens etwa 40 Zyklen) zwischen etwa 50°C und etwa
95°C, umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Stabilisieren
einer einen Nah-IR-Farbstoff einschließenden Zusammensetzung in einem
Temperaturzyklenverfahren, das Zyklen (vorzugsweise mindestens etwa
10 Zyklen, stärker
bevorzugt mindestens etwa 40 Zyklen) zwischen etwa 50°C und etwa
95°C, einschließt, bereit.
Das Verfahren schließt
das Zugeben von mehr als 0,5 Gew.-% eines Tensids ausgewählt aus der
Gruppe eines nicht-ionischen Tensids, eines zwitterionischen Tensids
und eines Gemischs davon, zu der Zusammensetzung ein. Hier basieren
die Gewichtsprozentanteile auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Vorzugsweise schließt
die Zusammensetzung auch ein Enzym, vorzugsweise ein Polymeraseenzym, ein.
Vorzugsweise ist das Tensid ein nicht-ionisches Tensid.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Durchführung eines
thermischen Verfahrens bereit. Das Verfahren schließt die Bereitstellung
eines Probengemischs, das ein biologisches Material, einen Nah-IR-Farbstoff
und mehr als etwa 0,5 Gew.-% eines Tensids ausgewählt aus
der Gruppe eines nicht-ionischen Tensids, eines zwitterionischen
Tensids und eines Gemischs davon einschließt, bei einer ersten Temperatur
und die unmittelbare Erwärmung
des Probengemischs auf eine zweite Temperatur, die höher als
die erste Temperatur ist, ein; wobei der Nah-IR-Farbstoff unter
einem Temperaturzyklenverfahren stabil ist, das Zyklen (vorzugsweise
mindestens etwa 10 Zyklen, stärker
bevorzugt mindestens etwa 40 Zyklen) zwischen etwa 50°C und etwa
95°C einschließt, indem
der Farbstoff nicht mehr als eine etwa 20% Verringerung der Absorption
im Vergleich zu derselben Zusammensetzung zeigt, die keinem Temperaturzyklenverfahren
ausgesetzt war. Vorzugsweise schließt das Verfahren ferner das
Abkühlen
des Probengemischs und die unmittelbare erneute Erwärmung des
Probengemischs in einem Temperaturzyklenverfahren ein.
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Bei
noch einem anderen Verfahren handelt es sich um eines, das das Denaturieren
von über
Wasserstoffbrücken
verbundenen Molekülen
umfasst. Das Verfahren schließt
die Bereitstellung eines Probengemischs, das über Wasserstoffbrücken verbundene
Moleküle,
einen Nah-IR-Farbstoff
und mehr als etwa 0,5 Gew.-% eines Tensids ausgewählt aus
der Gruppe eines nicht-ionischen Tensids, eines zwitterionischen
Tensids und eines Gemischs davon einschließt, bei einer ersten Temperatur;
und unmittelbare Erwärmung
des Probengemischs auf eine zweite Temperatur, die höher als
die erste Temperatur ist, die zum Denaturieren der über Wasserstoffbrücken verbundenen
Moleküle
wirksam ist; ein; wobei der Nah-IR-Farbstoff in einem Temperaturzyklenverfahren
stabil ist, welches Zyklen (vorzugsweise mindestens etwa 10 Zyklen,
stärker
bevorzugt mindestens etwa 40 Zyklen) zwischen etwa 50°C und etwa
95°C einschließt.
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Wie
in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet, bedeutet „thermisches
Verarbeiten" (und Variationen
davon) das Steuern (z.B. Aufrechterhalten, Erhöhen oder Senken) der Temperatur
von Probenmaterialien unter Erhalt von gewünschten Reaktionen. Als eine
Form des thermischen Verarbeitens bedeuten „Temperaturzyklen" (und Variationen
davon) die sequenzielle Veränderung
der Temperatur von Probenmaterialien zwischen zwei oder mehreren
Temperatureinstellpunkten unter Erhalt von gewünschten Reaktionen. Temperaturzyklen
können
z.B. Zyklen zwischen unteren und oberen Temperaturen, Zyklen zwischen
unteren, oberen und mindestens einer Zwischentemperatur usw. umfassen.
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Wie
hier verwendet, bedeutet „unmittelbare" Erwärmung eines
Probengemischs, dass das Probengemisch im Gegensatz zu einer Erwärmung durch Übertragung
von Wärmeenergie
von einer äußeren Quelle (z.B.
einem erwärmten
Behälter)
von innen her erwärmt
wird.
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Eine
einen Farbstoff enthaltende Zusammensetzung ist in einem Temperaturzyklenverfahren
(aufgrund der Gegenwart eines Tensids) „stabil", wenn der Farbstoff eine nicht mehr
als etwa 20% Verringerung der Absorption im Vergleich zu einer Kontrolle,
d.h. derselben Zusammensetzung, die keinem Temperaturzyklenverfahren
ausgesetzt war, zeigt.
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Diese
und andere Merkmale und Vorteile der Verfahren und Zusammensetzungen
der Erfindung sind in Bezug auf veranschaulichte und bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung nachstehend beschrieben.
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1 ist
ein Diagramm der Temperatur gegen die Zeit eines Laserzyklenversuchs
unter Verwendung eines NIR-Farbstoffs
und eines Tensids.
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Die
vorliegende Erfindung stellt verschiedene Vorrichtungen und Verfahren
bereit, die die Verwendung eines Nah-Infrarot-Farbstoffs und eines
Tensids umfassen. Bestimmte Ausführungsformen
schließen
die Verwendung eines Enzyms in Kombination mit einem Farbstoff und
einem Tensid ein. Derartige Zusammensetzungen und Verfahren werden
vorzugsweise zum Verarbeiten von Probengemischen (vorzugsweise Fluidproben)
verwendet, die biologische Materialien einschließen. Die vorliegende Erfindung
stellt Verfahren, die das thermische Verarbeiten umfassen, z.B.
empfindliche chemische Verfahren, die die Verwendung eines Enzyms, wie
einer Polymerase oder einer Umkehrtranskriptase, umfassen, wie PCR-Amplifikation, Ligasekettenreaktion
(LCR), selbsterhaltende Sequenzreplikation, Enzymkinetikstudien,
homogene Ligandbindungsassays und komplexere biochemische oder andere
Verfahren, die ein Enzym verwenden und eine genaue Temperatursteuerung
und/oder schnelle Temerpaturvariationen erfordern, bereit. Die Verfahren
umfassen die Verwendung von Nah-Infrarot-Farbstoffen, die eine schnelle und genaue
thermische Verarbeitung auf der Basis von elektromagnetischer Energie
oder abgeleitet von Energie, von Probenmaterialien, ermöglichen.
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Typischerweise
sind absorbierende Farbstoffe, die zum Umwandeln von elektromagnetischer
Energie in Wärmeenergie
verwendet werden, in enzymatischen Reaktionen nicht inert. Vorteilhafterweise
können
ein nicht-ionisches oder zwitterionisches Tensid (oder Tensidgemisch)
und vorzugsweise ein nicht-ionisches Tensid zum Hemmen der Wechselwirkung
zwischen einem Enzym (oder einem Enzymgemisch) und einem Farbstoff
(oder einem Farbstoffgemisch) verwendet werden. Wie hier verwendet,
umfasst das Hemmen der Wechselwirkung zwischen einem Enzym und einem
Farbstoff das Reduzieren der Wechselwirkung im Vergleich zu demselben
System, wenn kein Tensid vorliegt. Vorzugsweise umfasst das Hemmen
der Wechselwirkung zwischen einem Enzym und einem Farbstoff das
Verhindern des Stattfindens der Wechselwirkung und/oder das im Wesentlichen
vollständige
Umkehren einer derartigen Wechselwirkung.
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Typischerweise
sind absorbierende Farbstoffe, insbesondere Nah-IR-Farbstoffe, die
zum Umwandeln der elektromagnetischen Energie in Wärmeenergie
verwendet werden, in thermischen Verfahren (z.B. Temperaturzyklenverfahren)
nicht stabil. Vorteilhafterweise können ein nicht-ionisches oder
zwitterionisches Tensid (oder Tensidgemisch) und vorzugsweise ein
nichtionisches Tensid zum Stabilisieren einer einen Nah-IR-Farbstoff enthaltenden
Zusammensetzung in einem Temperaturzyklenverfahren verwendet werden,
welches Zyklen (vorzugsweise mindestens 10 Zyklen, stärker bevorzugt
mindestens 40 Zyklen) zwischen etwa 50°C und etwa 95°C einschließt. Vorzugsweise
ist der Nah-IR-Farbstoff
ein Diimminiumfarbstoff oder ein Cyaninfarbstoff.
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Typische
Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die thermische Verarbeitung
eines Probengemischs, wie eines Fluid-förmigen (z.B. eines flüssigen)
Probengemischs, vorzugsweise eines, das ein biologisches Material
einschließt.
Die Verfahren schließen
im Allgemeinen die Bereitstellung eines Probengemischs bei einer
ersten Temperatur (vorzugsweise in einem Bereich von etwa 0°C bis etwa
50°C und
stärker bevorzugt
in einem Bereich von etwa 20°C
bis etwa 50°C),
die unmittelbare Erwärmung
des Probengemischs auf eine zweite Temperatur (vorzugsweise in einem
Bereich von etwa 50°C
bis etwa 95°C),
die höher
als die erste Temperatur ist, ein. Vorzugsweise schließen die
Verfahren ferner die Abkühlung
des Probengemischs und die unmittelbare erneute Erwärmung des
Probengemischs in einem Temperaturzyklenverfahren, das vorzugsweise
mindestens etwa 25 Zyklen einschließt, ein.
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Herkömmliche
Systeme erwärmen
ein Probengemisch durch Erwärmung
des den Behälter
umgebenden Mediums (z.B. Luft, Aluminiumblock, Fluid). Im Gegensatz
dazu stellen die Verfahren der vorliegenden Erfindung einen oder
mehrere der folgenden Vorteile bereit: kontaktlose Erwärmung, wobei
die Fluid-förmigen Gemische
unmittelbar ohne unbedingte Erwärmung
des umgebenden Behälters
erwärmt
werden; das Vermögen,
den Absorptionskoeffizienten zu modifizieren, um Temperaturgradienten
zu minimieren, keine Notwendigkeit von Trägerstrukturen oder Heizelementen
(z.B. Widerstandsheizelementen, thermoelektrischen Modulen usw.);
und keine Notwendigkeit eines guten Kontakts oder einer Passgenauigkeit
mit dem Heizblock, so dass die Eigenschaften des Blocks (z.B. die
Maße,
Materialeigenschaften, Leitfähigkeit,
Geometrie) nicht von erheblicher Bedeutung sind. Da das „Heizelement" in Lösung vorliegt,
kann auch eine lokalisierte Erwärmung schnell
ohne unbedingte Erwärmung
der umgebenden Struktur stattfinden. Da die umgebende Struktur nicht erwärmt wird,
erleichtert es zudem das Abführen
von Wärme
von der Fluidabteilung durch Diffusion. Ein zusätzlicher Vorteil liegt darin,
dass man die Erwärmungsrate
durch exaktes Anpassen der Konzentration des Nah-IR-Absorptionsmittels
in Lösung
steuern kann (was wiederum eine Einstellung der in der Fluidabteilung absorbierten
Energiemenge ermöglichen
würde).
In ähnlicher
Weise kann die Konzentration an Absorptionsmittel zum Minimieren
von in der Mulde auftretenden Temperaturgradienten eingestellt werden.
Da das Wellenlängenmaximum
des Farbstoffs spezifiziert werden kann, kann eine größere Auswahl
an Lichtquellen (weißes
Licht, UV-Licht, Nahr-IR-Laser) zum kontaktlosen Erwärmen verwendet
werden.
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Jüngste Veröffentlichungen
zeigten Prototypsysteme, die vermutlich unter Verwendung des Nah-IR-Gehalts
von Licht zum Erwärmen
von Wasserbanden weißes
Licht zum unmittelbaren Erwärmen
des Fluids verwenden. In diesen Systemen ist es aufgrund der Unfähigkeit,
Absorptionskoeffizienten zu spezifizieren, schwierig, die Erwärmung (schnell,
minimale Temperaturgradienten) zu optimieren.
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Typische
Enzyme, die durch große
Konzentrationen an absorbierenden Farbstoffen nachteilig beeinflusst
werden können,
schließen
Polymerasen, Restriktions endonukleasen und modifizierende Enzyme
(Agarasen, Glycolysasen, Kinasen, Ligasen, Methylasen, Nukleasen,
Proteasen, Phosphatasen, Umkehrtranskriptasen, Topisomerasen und
Transferasen) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise
ist das Enzym eine Polymerase oder eine Ligase und stärker bevorzugt
eine Polymerase, wobei Beispiele dafür dem Fachmann bekannt sind.
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Obwohl
viele der vorstehend beschriebenen Enzyme durch große Konzentrationen
an absorbierenden Farbstoffen nachteilig beeinflusst werden, werden
einige Enzyme nicht nachteilig beeinflusst. Für derartige Kombinationen,
in welchen das Enzym nicht nachteilig durch den Farbstoff beeinflusst
wird, ist die Verwendung eines wie hier beschriebenen Tensids nicht
unbedingt nötig,
um eine etwaige nachteilige Wechselwirkung zwischen dem Farbstoff
und dem Enzym zu reduzieren, zu verhindern und/oder umzukehren,
jedoch kann das Tensid in Bezug auf die thermische Zersetzung des
Farbstoffs (detaillierter nachstehend erörtert) immer noch einen Vorteil
bereitstellen.
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Geeignete
absorbierende Farbstoffe, die in den Verfahren der vorliegenden
Erfindung vorteilhaft verwendet werden können, schließen diejenigen
ein, die Energie vorzugsweise bei einer Wellenlänge von mindestens etwa 400
nm, stärker
bevorzugt bei einer Wellenlänge
von mindestens etwa 700 nm und besonders bevorzugt bei einer Wellenlänge von
mindestens etwa 780 nm absorbieren. Geeignete absorbierende Farbstoffe,
die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung vorteilhaft verwendet
werden können,
schließen
diejenigen ein, die Energie, vorzugsweise bei einer Wellenlänge von
nicht mehr als etwa 2000 nm, stärker
bevorzugt bei einer Wellenlänge
von nicht mehr als etwa 1300 nm, und besonders bevorzugt bei einer
Wellenlänge von
nicht mehr als etwa 1000 nm absorbieren. Diese Anteile des elektromagnetischen
Spektrums schließen die
sichtbaren und Nah-Infrarot (Nah-IR-)-Bereiche ein. Andere geeignete
absorbierende Farbstoffe schließen fluoreszierende
Farbstoffe ein. Der Farbstoff ist ein Nah-IR-Farbstoff (z.B. ein
Cyaninfarbstoff oder ein Diimminiumfarbstoff), wahlweise in Gemisch
mit einem Ultraviolett/Sicht-(UV/Sicht)-Farbstoff (z.B. Dichlorphenol,
Indophenol, Saffranin, Kristallviolett und im Handel erhältliche
Nahrungsmittelfarbstoffe), ein fluoreszierender Farbstoff (z.B.
Oligreen) oder Gemische davon. Der Nah-Infrarot (Nah-IR- oder NIR-)-Bereich beträgt typischerweise
etwa 700 nm bis etwa 2000 nm, wobei der Bereich von etwa 780 nm
bis etwa 1300 nm von besonderer Bedeutung ist.
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Klassen
von geeigneten absorbierenden Farbstoffen schließen Acridinfarbstoffe, Xanthenfarbstoffe, Chinoniminfarbstoffe,
Anthrachinonfarbstoffe, Cartenoidfarbstoffe, Nitrofarbstoffe, Diazoniumfarbstoffe,
Tetrazoliumfarbstoffe und Di- und Triarylmethanfarbstoffe ein. Klassen
von NIR-Farbstoffen
(d.h. NIR-Absorptionsmitteln) schließen Nitrosofarbstoffe, Cyaninfarbstoffe,
Nigrosinfarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe, Imminiumfarbstoffe,
Diimminiumfarbstoffe, Squariliumfarbstoffe, Croconiumfarbstoffe,
Nickeldithiolenfarbstoffe, Chinonfarbstoffe, Phthalocyaninfarbstoffe,
Azofarbstoffe, Indoanilinfarbstoffe, schwefelhaltige Farbstoffe, Vat-Farbstoffe und dergleichen
ein. Spezifische Beispiele für
geeignete Farbstoffe schließen
Methylenblau-Thiazinfarbstoffe,
Saffranin-Chinoniminfarbstoffe, Kristallviolett-Triarylmethanfarbstoffe,
Dichlorphenolindophenol-Chinoniminfarbstoffe sowie diejenigen, die
in Tabelle 1 aufgezählt
sind, usw. ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise ist der Farbstoff
ein Cyaninfarbstoff oder ein Diimminiumfarbstoff.
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In
den Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung wird ein Farbstoff
(oder ein Farbstoffgemisch) in einer Menge verwendet, die zur Erwärmung der
Zusammensetzung durch die Anwendung von elektromagnetischer Energie
wirksam ist. Diese Menge variiert je nach den anderen Komponenten
in der Zusammensetzung. Typischerweise können derartige Farbstoffe eine
enzymatische Reaktion nachteilig beeinflussen, falls sie in einer
Menge von 0,005 Milligramm/Milliliter (mg/ml) Farbstoff oder mehr
verwendet werden. Zur wirksamen Erwärmung liegt ein Farbstoff vorzugsweise
in einem Reaktionsgemisch mit einer Konzentration von mindestens etwa
0,1 mg/ml vor.
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Vorzugsweise
werden die Farbstoffe als wässrige
Gemische kurz vor der Verwendung hergestellt. In manchen Situationen
zeigen wässrige
Farbstofflösungen,
die für
eine Dauer von 1 Woche oder länger
gelagert werden, keinen Vorteil durch die Zugabe eines Tensids in
Bezug auf die Inaktivierung eines Enzyms, obwohl das Tensid die
thermische Zersetzung des Farbstoffs hemmen kann. Wird jedoch eine
wässrige
Farbstofflösung
einem Tensid zugesetzt und für
die gleiche Zeitdauer gelagert, zieht sie aus der Zugabe eines Tensids Vorteil.
Folglich ist es für
eine wirksame Hemmung der Inaktivierung eines Enzyms durch einen
Farbstoff häufig
erwünscht,
frisch hergestellte Lösungen
zu verwenden. Tabelle
1
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Geeignete
Tenside, die in bestimmten Ausführungsformen
der Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung einen
Vorteil bereitstellen, schließen
diejenigen ein, die die Wechselwirkung zwischen einem Farbstoff
und einem Enzym zumindest reduzieren, so dass ein gewünschtes
Produkt (z.B. ein PCR-Produkt) gebildet werden kann. Vorzugsweise
verhindert ein Tensid im Wesentlichen vollständig eine derartige Wechselwirkung
und/oder kehrt eine derartige Wechselwirkung um. Andere geeignete
Tenside, die einen Vorteil in bestimmten Ausführungsformen von Vorrichtungen
und Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitstellen, schließen diejenigen
ein, die den Farbstoff stabilisieren. Das Tensid ist ausgewählt aus
nicht-ionischen und zwitterionischen Tensiden und einem Gemisch
davon.
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Beispiele
für nicht-ionische
Tenside schließen
Ester von Fettsäuren
und mehrwertigen Alkoholen, Fettsäurealkanolamide, ethoxylierte
Fettsäuren,
ethoxylierte aliphatische Säuren,
ethoxylierte Fettalkohole, ethoxylierte aliphatische Alkohole, ethoxylierte
Sorbitfettsäureester,
ethoxylierte Glyceride, ethoxylierte Blockcopolymere mit EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), ethoxylierte
cyclische Etheraddukte, ethoxylierte Amid- und Imidazolinaddukte,
ethoxylierte Aminaddukte, thoxylierte Mercaptanaddukte, ethoxylierte
Kondensate mit Alkylphenolen, ethoxylierte Hydrophobe auf Stickstoff-Basis,
ethoxylierte Polyoxypropylene, polymere Silicone, fluorierte Tenside
und polymerisierbare Tenside ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele
für fluorierte Tenside
schließen
diejenigen ein, die unter den Marken FLUORAD-FS 300 (Minnesota Mining
and Manufacturing Co., St. Paul, MN) und ZONYL (DuPont de Nemours
Co., Wilmington, DE) erhältlich
sind. Beispiele für polymerisierbare
(reaktive) Tenside schließen
SAM 211 (Alkylenpolyalkoxysulfat-Tensid, erhältlich unter der Marke MAZON
(PPG Industries, Inc., Pittsburgh, PA) ein. Beispiele für zwitterionische
Tenside schließen
Alkylamidobetaine und Aminoxide davon, Alkylbetaine und Aminoxide
davon, Sulfobetaine, Hydroxysulfobetaine, Amphoglycinate, Amphopropionate,
ausgewogene Amphopolycarboxyglycinate und Alkylpolyaminoglycinate ein,
sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Protein können
je nach pH-Wert geladen oder ungeladen sein; dadurch könnte bei
dem richtigen pH-Wert ein Protein, vorzugsweise mit einem pI von
etwa 8 bis 9, wie modifiziertes Rinderserumalbumin oder Chymotrypsinogen,
als zwitterionisches Tensid fungieren. Spezifische Beispiele schließen diejenigen
ein, die in der nachstehenden Tabelle 2 aufgelistet sind. Verschiedene
Gemische von Tensiden können,
falls gewünscht, verwendet
werden.
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Ein
Tensid wird in einer Menge verwendet, die zum Herstellen des gewünschten
Ergebnisses (z.B. Hemmen der Inaktivierung eines Enzyms oder Stabilisieren
eines Farbstoffs) wirksam ist. Ein Tensid wird in einer Menge von
mehr als etwa 0,5 Gew.-%, vorzugsweise mindestens etwa 1 Gew.-%
und besonders bevorzugt mehr als etwa 1 Gew.-%, verwendet. Vorzugsweise
werden nicht mehr als etwa 20 Gew.-% und stärker bevorzugt nicht mehr als
etwa 4 Gew.-% Tensid benötigt,
um die Wechselwirkung zwischen dem Farbstoff und dem Enzym wirksam
zu reduzieren. Derartige Prozentanteile basieren typischerweise
auf dem Gewicht pro Volumen eines Probengemisches. Tabelle
2
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Wahlweise
und vorzugsweise können
auch Radikalfänger
vorteilhaft in den Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Typischerweise bewirken kontinuierliche
Zyklen, dass ein Farbstoff (z.B. infolge der Oxidation oder Zersetzung)
derart gebleicht wird, dass er seine Farbe und damit seine Wirksamkeit
beim Absorbieren von elektromagnetischer Strahlung verliert. Wenngleich
dies als Vorteil verwendet werden könnte (etwa wenn die Nah-IR-Absorption erwünschtermaßen zerstört wird,
was zur Fähigkeit des
Abfragens eines Fluoreszenzsignals aus mit Nah-IR-Markierungen markierter
DNA/RNA führt),
ist es im Allgemeinen unerwünscht.
Es wurde entdeckt, dass die Verwendung eines Radikalfängers, wie
eines Antioxidans, diese Photozersetzung (d.h. die optische Zersetzung)
des Farbstoffs hemmen kann.
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Geeignete
Antioxidantien schließen
Anoxomer, Ascorbinsäure,
Ascorbylpalmitat, Ascorbylstearat, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes
Hydroxytoluol, t-Butylhydrochinon, Calciumlactat, Citronensäure, Nelkenextrakt,
Kaffeebohnenextrakt, Dilaurylthiodipropionat, Dinatrium-EDTA, Dodecylgallat,
Edetinsäure,
Erythrombinsäure,
6-Ethoxy-1,2-dihydro-2,2,4-trimethylchinolin, Eucalyptusextrakt,
Fumarsäure,
Gallsäure,
Enzianextrakt, Guajakgummi, n-Heptyl-p-hydroxybenzoat, Heptylparaben,
Hesperstin, 4-Hydroxymethyl-2,6-di-t-butylphenol, Isopropylcitrat, Lecithin,
Nordihydroguajaksäure,
Octylgallat, Oryzanol, Phosphatidylcholin, Pimentextrakt, Kaliummetabisulfit,
Kaliumsulfit, Propylenglycol, Rapsöl, Reiskleienextrakt, Salbeiextrakt,
Natriumascorbat, Natriumsulfit, Natriumtartrat, Natriumthiosulfat,
Zinnchlorid, Saccharose, Tocopherol, Trihydroxybutyrophenen sowie Vitamin
A und Derivate davon, Vitamin C und Derivate davon, Vitamin E und
Derivate davon, Phenole und gehinderte Phenole, Pflanzenextrakte,
Gallsäure
und Derivate, Chinine und Lecithine ein, sind jedoch nicht darauf
beschränkt.
Vorzugsweise schützt
die Zugabe von mindestens etwa 5 Mikrogramm in einer Reaktion mit
25 Mikroliter (d.h. mindestens etwa 0,2 mg/ml) den Farbstoff vor
Ausbleichen.
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In
bestimmten Situationen können
das Tensid und der Farbstoff gleich sein. Zum Beispiel könnte ein Farbstoffmolekül an eine
hydrophile Kette, wie Polyethylenglycol, kovalent angelagert werden.
Dies würde
ein Molekül
mit Tensid-artigen Eigenschaften ergeben. Alternativ dazu könnte der
Farbstoff direkt an ein Tensidmolekül kovalent angelagert werden.
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In
bestimmten Situationen können
das Tensid und das Antioxidans gleich sein. Zum Beispiel kann ein Antioxidans
wie Vitamin E (hydrophob) an eine hydrophile Einheit, wie Polyethylenglycol,
angelagert werden. Ein Beispiel für eine derartige Verbindung
wäre Vitamin
E-TPGS (Tocopherolpolyethylenglycolsuccinat).
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Andere
Mittel, die in die Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden
Erfindung eingeschlossen werden können, schliefen einen Puffer,
einen Referenzfarbstoff und andere PCR-Reaktanden, die detaillierter nachstehend
erörtert
sind, ein. Geeignete Puffer weisen typischerweise einen pH-Wert
von etwa 4 bis etwa 9, wie tris-HCl mit einem pH-Wert zwischen 8
und 9, auf. Geeignete Referenzfarbstoffe schließen ROX (Carboxyrhodamin),
TAMRA (Carboxytetramethylrhodamin), FAM (Carboxyfluoreszien) und
Texas Red, die fluoreszierende Farbstoffe sind, ein. Derartige Referenzfarbstoffe
werden typischerweise mit niedrigeren Konzentrationen als die für Erwärmungszwecke
verwendeten Farbstoffe (z.B. die vorstehend erörterten NIR-Farbstoffe) verwendet.
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Wenngleich
die Verfahren in einer Vielfalt von Vorrichtungen verwendet werden
können,
ist eine Vielfalt von veranschaulichenden Ausführungsformen von bevorzugten
Vorrichtungen in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 60/214,508, eingereicht
am 28. Juni 2000, mit dem Titel THERMAL PROCESSING DEVICES AND METHODS,
beschrieben. Andere verwendbare Vorrichtungskonstruktionen sind
z.B. in der US-Patentschrift Nr. 6,627,159 zu finden.
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Ungeachtet
der spezifischen Vorrichtung kann eine Fluidprobe (z.B. eine Lösung) durch
elektromagnetische Energie von ausgewählten Wellenlängen (falls
gewünscht)
in einer Verfahrenskammer abgefragt werden. Eine geeignete elektromagnetische
Energie wird durch eine elektromagnetische Energiequelle zugeführt, die
das Fluid (z.B. die Lösung)
in der Verfahrenskammerquelle unmittelbar erwärmt und vorzugsweise von der Vorrichtung
entfernt liegt, d.h. sich nicht auf der Vorrichtung befindet. Beispiele
für einige
geeignete elektromagnetische Energiequellen können Laser, elektromagnetische
Breitband-Energiequellen (z.B. weißes Licht) usw. einschließen, sind
jedoch nicht darauf beschränkt.
Die elektromagnetische Energiequelle kann auf der Basis einer Vielfalt
von Faktoren, z.B. der gewünschten
Temperatur der Probenmaterialien, der Geschwindigkeit, mit welcher
Wärmeenergie
aus jeder Verfahrenskammer abgeführt
wird, der gewünschten
Geschwindigkeit der Temperaturänderung,
der Frage, ob die Verfahrenskammern eine reflektierende Komponente
einschließen,
usw. kontinuierlich oder intermittierend bereitgestellt werden.
Wird die elektromagnetische Energiequelle Zyklen unterzogen oder
auf andere Weise variiert, kann ein Erkennungssystem verwendet werden,
um eine ausgewählte
Menge an Energie zu ausgewählten
Verfahrenskammern abzugeben, und ein optionaler zusätzlicher
Temperatursteuermechanismus in Form einer Fluidquelle, z.B. Druckluft
oder eines anderen geeigneten Fluids kann auf die Oberfläche der
Vorrichtung gerichtet werden. Dies ist in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 60/214,508,
eingereicht am 28. Juni 2000 mit dem Titel THERMAL PROCESSING DEVICES
AND METHODS, erörtert.
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Der
Vorteil der Verwendung eines Aufnahmematerials f+r elektromagnetische
Energie, wie eines elektromagnetisch absorbierenden Farbstoffs (z.B.
Nah-Infrarot-, Sichtfarbstoff), liegt darin, dass die Probenmaterialien
in der Vorrichtung in Abwesenheit von physikalischem Kontakt mit
der Vorrichtung ohne unmittelbares Erwärmen des Behälters erwärmt werden
können.
Ist zum Beispiel das Aufnahmematerial für elektromagnetische Energie
für Radiofrequenz(RF-)Strahlung
empfänglich,
kann die Vorrichtung derart gedreht werden, dass die Verfahrenskammern
innerhalb eines RF-Feldes für
eine ausreichende Zeitdauer verweilen, um die gewünschte Erwärmung zu
erhalten. Gleichermaßen
kann ein kontaktloses Erwärmen
mit Mikrowellenstrahlung usw. erhalten werden. Es ist jedoch klar,
dass die Form, in welcher die elektromagnetische Strahlung bereitgestellt
wird, mit den Probenmaterialien und den gewünschten Reaktionen, die innerhalb
der Verfahrenskammern lokalisiert sind, verträglich sein sollte.
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Die
hier beschriebenen Verfahren können
in einer Vielfalt von unterschiedlichen Verfahren verwendet werden,
die Temperaturzyklen für
in Verfahrenskammern der Vorrichtungen enthaltene Proben erfordern.
Beispiele für
einige derartige Verfahren umfassen chemische Reaktionen von Proben,
z.B. Nukleinsäureamplifikation.
Zum Beispiel können
Proben mit einem Polynukleotid, einer Polymerase (wie Taq-Polymerase), Nukleosidtriphosphaten,
einem mit dem Probenpolynukleotid hybridisierbaren ersten Primer
und einem mit einer zu dem Polynukleotid komplementären Sequenz
hybridisierbaren zweiten Primer gemischt werden. Einige oder alle
der erforderlichen Reagenzien können
in der Vorrichtung wie hergestellt vorliegen, sie können nach Herstellung
der Vorrichtung in die Verfahrenskammern gefüllt werden, sie können direkt
vor der Einbringung der Probe in die Verfahrenskammern gefüllt werden
oder sie können
vor dem Befüllen
in die Verfahrenskammern mit der Probe gemischt werden.
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Wenngleich
eine Polynukleotidamplifikation durch PCR hier besonders detailliert
beschrieben ist, können
die Vorrichtungen und Verfahren ihrer Verwendung für eine Vielfalt
von anderen Systemen, die die Verwendung von Farbstoffen (und vorzugsweise
von Enzymen) in thermischen Verfahren umfassen, insbesondere denjenigen,
die Polynukleotidamplifikationsreaktionen, Ligandbindungsassays
oder denaturierende über Wasserstoffbrücken gebundene
Moleküle
umfassend, verwendet werden.
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Bevorzugte
Reaktionen können
zwischen abwechselnden oberen und unteren Temperaturen, wie PCR,
Temperaturzyklen unterzogen werden oder sie können bei einer einzigen Temperatur,
z.B. Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis
(NASBA), durchgeführt
werden. Die Reaktionen können
eine Vielfalt von Amplifikationsreagenzien und Enzymen, einschließlich DNA-Ligasen,
RNA-Polymerasen und/oder Umkehrtranskriptasen usw., verwenden. Polynukleotidamplifikationsreaktionen,
die unter Verwendung der Verfahren der Erfindung durchgeführt werden
können,
schließen
folgende ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt: a) Targetpolynukleotidamplifikationsverfahren,
wie selbsterhaltende Sequenzreplikation (3SR) und Strangverschiebungsamplifikation
(SDA); b) Verfahren auf der Basis der Amplifikation eines an das
Targetpolynukleotid angelagerten Signals wie „verzweigt-kettige" DNA-Amplifikation;
c) Verfahren auf der Basis der Amplifikation einer Sonden-DNA, wie
Ligasekettenreaktion (LCR) und QB-Replicaseamplifikation (QBR);
d) Verfahren auf Transkriptionsbasis, wie Ligation-aktivierte Transkription
(LAT) und Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA); und
e) verschiedene andere Amplifikationsverfahren, wie Reparaturkettenreaktion
(RCR) und Zyklensondenreaktion (CPR).
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Unter
den möglichen
Verwendungen der Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung
ist PCR eine wichtige derartige Verwendung, wenngleich es klar sein
sollte, dass die vorliegende Erfindung auf eine PCR-Amplifikation nicht
beschränkt
ist. PCR ermöglicht
die Analyse von äußerst kleinen
Mengen Targetnukleinsäure
(z.B. DNA) unter Verwendung eines Überschusses von zwei Oligonukleotidprimern,
die den Bereich des zu amplifizierenden denaturierten Moleküls eingrenzen
und das Nukleinsäuremolekül durch
Nukleotidaddition von den Primern durch die Wirkung eines Polymeraseenzyms
(wie Taq-DNA-Polymerase) in Gegenwart von freien Deoxynukleosidtriphosphaten
(dNTPs) verlängern
können,
was zu einer Doppelreplikation des Ausgangstargetnukleinsäuremoleküls führt. Die
Nukleinsäuremoleküle werden
zum Denaturieren erneut wärmebehandelt,
und das Verfahren wird wiederholt, um PCR-Amplifikationsprodukte
(auch bezeichnet als PCR-Amplicons) zu bilden.
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In
einigen Ausführungsformen
sind in den Verfahrenskammern während
der Herstellung der spezifischen Vorrichtungen DNA-Primer und -Sonden
bereitgestellt. Eine DNA-Targetprobe könnte dann in die Verfahrenskammern
eingebracht werden, um eine PCR-Amplifikation
des DNA-Targets durchzuführen.
Die Targetprobe kann z.B. Target-DNA, Puffer und Polymeraseenzym
einschließen.
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Nachdem
die Targetprobe in den Verfahrenskammern (enthaltend vor eingefüllte Primer
und Sonden) verteilt wurde, kann die Temperatur der Materialien
in jeder der Verfahrenskammern auf eine ausgewählte Grundtemperatur (z.B.
60°C) erhöht werden,
um mit der PCR-Amplifikation zu beginnen. Ein Laser oder eine andere
elektromagnetische Energiequelle kann zum Erhöhen der Temperatur der Probenmaterialien
in jeder der Verfahrenskammern auf eine obere Zieltemperatur, bei
welcher z.B. die Denaturierung der DNA stattfindet, verwendet werden.
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Nach
Erreichen der Zieltemperatur werden die Probenmaterialien zurück auf die
Grundtemperatur gebracht. Dies kann durch eine Vielfalt von Techniken
erfolgen. In einem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann bei
rotierender Vorrichtung die Grundtemperatur durch Konvektionskühlen erreicht
werden. Dieses Konvektionskühlen
allein oder in Verbindung mit Konduktionskühlen unter Verwendung einer
Grundplatte, auf welche Fluidstrahlen usw. auftreffen, stellt vorzugsweise
eine schnelle Abkühlung
der Probenmaterialien, gefolgt von einer schnellen Erwärmung zurück auf die
Zieltemperatur bereit. Das schnelle Erwärmen und Abkühlen ist dahingehend
vorteilhaft, dass eine gewünschte
Anzahl an Temperaturzyklen in einer relativ kurzen Zeitdauer vollendet
werden kann. Vorzugsweise schließt in den hier beschriebenen
Verfahren, egal ob für
eine PCR oder andere Techniken, ein Temperaturzyklenverfahren vorzugsweise
mindestens etwa 25 Zyklen ein und schließt vorzugsweise das Erwärmen auf
eine Temperatur zwischen etwa 50°C
und etwa 95°C
ein.
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Ein
bevorzugtes Verfahren umfasst die Verwendung einer Vorrichtung mit
einer Vielzahl von Verfahrenskammeranordnungen, wie diejenigen veranschaulicht
in der US-Patentanmeldung
Serien-Nr. 60/214,508, eingereicht am 28. Juni 2000, mit dem Titel
THERMAL PROCESSING DEVICES AND METHODS. Jede der Verfahrenskammeranordnungen
schließt
eine Anzahl an Kammern ein, die vorzugsweise im Allgemeinen radial
auf der Vorrichtung angeordnet sind (so dass Zentrifugalkräfte Flüssigkeiten
sequenziell von einer Kammer zur anderen bewegen können). Die
Kammern in jeder der Anordnungen befinden sich in Fluidkommunikation
unter Verwendung von Kanälen
oder anderen Leitungen, die in einigen Ausführungsformen Ventilstrukturen
zum Steuern der Bewegung, wenn gewünscht, einschließen können.
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Unter
Verwendung einer derartigen Vorrichtung wird Ausgangsprobenmaterial,
z.B. lysierte Blutzellen, in einer Befüllungskammer bereitgestellt.
Ein Filter ist vorzugsweise bereitgestellt, um das Ausgangsprobenmaterial
zu filtrieren, wenn es sich von der Befüllungskammer zu einer ersten
Verfahrenskammer bewegt. Die ersten Verfahrenskammern schließen vorzugsweise
geeignete PCR-Primer, in gelieferter Form, z.B. unten in jeder der
Kammern getrocknet, ein. Jede der Kammern kann je nach der Art der
Untersuchung, die von dem Ausgangsprobenmaterial durchgeführt wird,
den gleichen Primer oder unterschiedliche Primer einschließen. Eine
Alternative zum Bereitstellen der Primer in den Verfahrenskammern
vor dem Einfüllen
der Probe ist es, einen geeigneten Primer der Befüllungskammer
mit dem Ausgangsprobenmaterial zuzusetzen (mit der Maßgabe, dass
der Primer den Filter, falls vorliegend, durchlaufen kann).
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Nach
dem Lokalisieren des Ausgangsprobenmaterials und etwaiger erforderlicher
Primer in den Verfahrenskammern werden die Materialien in den Verfahrenskammern
unter zur PCR-Amplifikation des ausgewählten genetischen Materials
geeigneten Bedingungen Temperaturzyklen unterzogen.
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Nach
Beendigung des PCR-Amplifikationsverfahrens können die Materialien in jeder
der ersten Verfahrenskammern durch eine andere Filterkammer (eine
Filterkammer für
jede Verfahrenskammer) bewegt werden, um unerwünschte Materialien von den
amplifizierten Materialien, z.B. PCR-Primer, unerwünschte Materialien
in der Ausgangsprobe, die durch Filtrieren nicht entfernt wurden,
usw. zu entfernen. Die Filterkammern können zum Beispiel Größeausschlusssubstanzen,
wie Permeationsgele, Perlen usw. (z.B. MicroSpin oder Sephadex,
erhältlich
von Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) enthalten.
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Nach
dem Aufreinigen der Probenmaterialien in den Filterkammern werden
die filtrierten PCR-Amplifikationsprodukte
aus jeder der ersten Verfahrenskammern z.B. zum Sanger-Sequenzieren
der in den ersten Verfahrenskammern amplifizierten genetischen Materialien
durch eine geeignete Steuerung der in den zweiten Verfahrenskammern
anzutreffenden thermischen Bedingungen in ein Paar zweite Mehrfach-Verfahrenskammern
bewegt.
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BEISPIELE
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Aufgaben
und Vorteile dieser Erfindung sind weiter durch die folgenden Beispiele
veranschaulicht, jedoch sollten die jeweiligen Materialien und Mengen
davon, die in diesen Beispielen genannt sind, sowie andere Bedingungen
und Details diese Erfindung nicht in unangemessener Weise einschränken. Alle
hier verwendeten Farbstofflösungen
wurden frisch hergestellt (d.h. innerhalb eines Tages verwendet).
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Beispiel 1: Herstellung
eines einen NIR-Farbstoff und ein Tensid enthaltenden Gemischs
-
Typischerweise
wurde eine frische Stammlösung
von 5 Milligramm (mg) eines wasserunlöslichen Nah-Infrarot-Farbstoffs (NIR-Farbstoffs)
in 50 Mikroliter (μl)
Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst
und in Wasser auf ein Endvolumen von 1 Milliliter (ml) gebracht.
Dies wurde dann auf verschiedene Farbstoffkonzentrationen ausverdünnt. Der
verdünnte
Farbstoff (typischerweise 0,2 mg/ml) wurde dann unter Bildung eines
Komplexes einer Tensidlösung
(typischerweise 4 Gew.-%) zugesetzt. Der Komplex wurde dann einer
PCR-Reaktion zugesetzt.
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Die
getesteten Farbstoffe und Tenside sind in den Tabellen 1 bzw. 2
aufgelistet.
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Beispiel 2: Bildung eines
PCR-Produkts in Gegenwart eines Tensids
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PCR-Reaktionen
wurden für
eine bewahrte Sequenz (327 Bp) im Proteasebereich des Genoms des endogenen
Schweineretrovirus unter Verwendung eines das PERV-Proteasefragment,
einen Vorwärtsprimer und
einen Rückwärtsprimer
enthaltenden Plasmids unter Verwendung eines Primerexpressprogramms
von Applied Biosystems und eines AMPLITAQ-DNA-Polymerasecocktails
(im Handel erhältlich
von Applied Biosystems, Foster City, CA) angeordnet und in einer
Temperaturzyklenapparatur (Thermocycler 9700, Applied Biosystems)
Zyklen unterzogen. Die PCR-Reaktionen wurden typischerweise in Volumina
mit 25 μl
durchgeführt.
Das NIR-Farbstoff/Tensid-Gemisch wurde dem PCR-Cocktail zugesetzt,
um die gewünschte
Konzentration an Farbstoff und Tensid in einem Gesamtvolumen von
25 μl zu
erhalten. Ein typischer PCR-Cocktail enthält 2,5 μl 10x Puffer; 2,0 μl (jeweils
200 μM)
dNTPs; 0,5 μl
(200 nM) Vorwärtsprimer;
0,5 μl (200
nM) Rückwärtsprimer;
1,0 (1 ng/μl)
Templat-DNA; 0,25 μl
(1,25 Einheiten) Amplitaq; 18,25 μl
steriles Wasser.
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Die
Produkte der PCR-Reaktionen wurden über 1%igem Ethidiumbromid enthaltenden
Agarosegel geleitet und unter Verwendung eines ALPHA IMAGER (Alpha
Innotech Corp., San Leandro, CA) sichtbar gemacht. In anfänglichen
Versuchen wurde zum Beispiel gefunden, dass die PCR durch eine endgültige Farbstoffkonzentration
von 0,005 mg/ml oder höher
für den
Farbstoff 785 WS gehemmt wird. Jedoch wurde für eine wirksame Erwärmung eine
höhere
Konzentration an Farbstoff (0,1 mg/ml) benötigt. Folglich wurde für alle weiteren
PCR-Versuche eine Farbstoffkonzentration von 0,1 mg/ml oder höher verwendet.
Die Ergebnisse der PCR- Reaktion
mit Farbstoff/Tensid-Gemisch zeigten, dass die PCR durch den Farbstoff
allein gehemmt wird, während
die PCR-Aktivität
durch die Zugabe von Tensiden wiederhergestellt wurde. Taq-Polymerase
wurde von verschiedenen Herstellern getestet (Promega Corp., Madison,
WI; Roche Biochemicals, Indianapolis, IN; Eppendorf, Scientific
Inc., Westbury, NY; Sigma, St. Louis, MO), und sämtliche Taq-Polymerasen wurden
durch 785 WS und SDA 8080 gehemmt. Die Zugabe von Tensiden (PLURONIC
oder TWEEN) stellte die Aktivität
des Enzyms wieder her.
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Die
Ergebnisse einer quantitativen PCR unter Verwendung von TaqMan-Sonden
oder Sybr-Green für SDA
8080 (0,2 mg/ml) und 785 WS (0,1 mg/ml) wiesen darauf hin, dass
der Farbstoff allein den Assay hemmte, während die Zugabe der Tenside,
PLURONIC F127 oder TWEEN-20, die Aktivität des Assays in beiden Fällen wieder
herstellte. Dieser Versuch wies darauf hin, dass das Farbstoff/Tensid-Gemisch
die Fluoreszenzmessungen der TaqMan-Sonden und die Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase zusätzlich zur
Polymeraseaktivität
nicht störte.
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Um
die optimale Tensidkonzentration für eine PCR mit NIR-Farbstoff
(785 WS und SDA 8080) herauszufinden, wurde die Tensidkonzentration
in der PCR-Reaktion von 0,1 Gew.-% bis 4 Gew.-% variiert. Das gebildete
PCR-Produkt wurde
unter Verwendung des Kits des Typs DNA 7500 Labchip in einem Bioanalysator des
Typs Agilent 2100 (Agilent Inc., Palo Alto, CA) quantifiziert. Die
in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine
Zunahme der Tensidonzentration in Bezug auf den Farbstoff die Bildung
des PCR-Produkts unterstützt.
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Beispiel 3: Die Wechselwirkung
zwischen einem Enzym und einem Farbstoff ist unter Verwendung eines
Tensids umkehrbar
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Um
den Grund für
die Hemmung einer PCR durch einen NIR-Farbstoff zu verstehen, wurden zwei
getrennte Versuche durchgeführt.
In einem ersten Versuch (Beispiel 3A) ließ man Taq-Polymerase mit Farbstoff des
Typs 785 WS (40 Mikrogramm (μg))
bei Raumtemperatur für
eine Dauer von 25 Minuten wechselwirken. In einem zweiten Versuch
(Beispiel 3B) ließ man
Templat-DNA mit demselben Farbstoff unter denselben Bedingungen
wechselwirken. In beiden Versuchen wurde der Farbstoff von dem Enzym- oder DNA-Templat
entfernt, indem man die Lösung
durch eine CENTRISEP-Säule
(Princeton Separations, Adelphia, NJ) durchleitete. Die Taq-Polymerase
oder Templat-DNA wurde dann in getrennten Reaktionen (25 μl) zum Amplifizieren
von PERV-Proteasefragment, wie beschrieben in Beispiel 2, verwendet.
Die endgültige
Farbstoffkonzentration im PCR-Cocktail betrug 1,6 mg/ml. Die Ergebnisse
für das
PCR-Verfahren in Beispiel 3A zeigten, dass Taq-Polymerase durch
Aussetzen an den Farbstoff inaktiviert wurde, was zu keiner Amplifikation
führte.
Die Ergebnisse des PCR-Verfahrens in Beispiel 3B zeigten, dass der
Farbstoff keinerlei Wirkung auf das DNA-Templat aufwies, da die
Entfernung des Farbstoffs von dem Templat zur Amplifikation des
erwarteten Fragments führte. Aus
den vorstehenden Versuchen war es klar, dass das Enzym durch den
Farbstoff gehemmt wurde. In einem getrennten Versuch ließ man Taq-Polymerase
mit einem NIR-Farbstoff (0,2 mg/ml für 785 WS und 0,3 mg/ml für SDA 8080)
für eine
Dauer von 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren, und das Enzym/Farbstoff-Gemisch
wurde dem verschiedene Tenside (4 Gew.-%) enthaltenden PCR-Cocktail
zugesetzt. Die Reaktion würde
derart angeordnet, dass das PERV-Proteasefragment,
wie in Beispiel 2 beschrieben, amplifiziert wurde, und die Produkte
der Reaktion wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse
des PCR-Verfahrens zeigten, dass die Wirkung des Farbstoffs auf
das Enzym durch die Zugabe von Tensiden umkehrbar war. Die Menge
des hergestellten PCR-Produkts war mit den Kontrollen vergleichbar.
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Beispiel 4: Die RNA-Polymeraseaktivität wird durch
Zugabe eines Tensids wiederhergestellt
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RNA-Polymerasereaktionen
wurden unter Verwendung von T7- oder SP6-RNA-Polymerase (Epicentre
Technologies, Madison, WI) unter Verwendung eines den T7- oder SP6-Promotor enthaltenden
linearisierten Plasmidtemplats angeordnet. Die Reagenzien wurden
gemäß den Anweisungen
des Herstellers verwendet. Die Reaktionsprodukte befanden sich auf
1%igem Agarosegel, und die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass der
NIR-Farbstoff 785 WS (0,1 mg/ml) die Aktivität beider Enzyme hemmte, während die
Zugabe von Tensiden (PLURONIC 4 Gew.-%) die Enzymaktivität wiederherstellte.
Der Farbstoff SDA 8080 hemmte die Aktivität beider Enzyme mit 0,2 mg/ml
nicht.
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Beispiel 5: Die DNA-Ligaseaktivität wird durch
Zugabe eines Tensids wiederhergestellt
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DNA-Ligationsreaktionen
wurden unter Verwendung von T4-DNA-Lipase
(Life Technologies, Inc., Gaithesburg, MD) unter Verwendung eines
linearisierten Plasmidtemplats (pET21a, Novagen, Madison, WI) und einer
DNA-Einfügung
angeordnet. Die Reagenzien wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers
verwendet. Kompetente Zellen Escherichia coli DH10B wurden mit den
ligierten Produkten transformiert und die transformierten Zellen
auf Clondisc (Clontech, Palo Alto, CA) mit geeignetem Antibiotikum
(Ampicillin mit 50 μg/ml) aufgestrichen.
Nach der Inkubation der Platten bei 37°C für eine Dauer von 16 Stunden
bis 18 Stunden wurden die erhaltenen Kolonien gezählt und
durch Miniprep und Restriktionsverdau auf Plasmid analysiert. Die NIR-Farbstoffe 785 WS
(0, 1 mg/ml) und SDA 8080 (0, 2 mg/ml) hemmten die Ligaseaktivität, da keine
Kolonien auf den Platten, die mit dem den Farbstoff enthaltenden
Ligationsgemisch bestrichen waren, nachgewiesen werden konnten.
Die Zugabe von Tensiden (4 Gew.-% PLURONIC für 785 WS und 4 Gew.-% TWEEN-20 für SDA 8080)
stellte die Ligaseaktivität
wieder her, da eine ähnliche
Anzahl von Kolonien im Kontroll-Ligationsgemisch (mit oder ohne
Tenside) und im eine Farbstoff/Tensid-Kombination enthaltenden Ligationsgemisch beobachtet
wurde. Zudem enthielten, wie durch Restriktionsverdau und DNA-Sequenzieren nachgewiesen, sämtliche
aus diesen Platten isolierten Plasmide dieselbe Einfügung.
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Zusätzlich zur
Transformation und zum Bestreichen mit dem Ligationsgemisch wurden
die ligierten Produkte als DNA-Templat in einer PCR-Reaktion verwendet,
die die eingefügte
DNA auf dem Plasmid-Templat eingrenzende Primer (T7-Promotor- und
T7-Terminatorprimer, Novagen) enthielten. Nach der PCR wurden die
Reaktionsprodukte auf 1%iges Agarosegel geleitet, und die Ergebnisse
wiesen auf die Gegenwart des erwarteten DNA-Fragments aus dem Kontroll-Ligationsgemisch
und dem Farbstoff/Tensid-Kombination enthaltenden Ligationsgemisch,
jedoch nicht aus dem nur Farbstoff (785 WS oder SDA 8080) enthaltenden
Gemisch hin.
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Beispiel 6: Eine Vielfalt
an Farbstoffen profitieren von der Zugabe eines Tensids
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Eine
Vielfalt an Farbstoffen (NIR-Farbstoffe wie IR782, IR768, SDA 2141,
SDA8327, IR 830 WS, fluoreszierende Farbstoffe wie Oligreen und
Sichtfarbstoffe wie Dichlorphenol, Indophenol, Saffranin, Kristallviolett
und im Handel erhältliche
Nahrungsmittelfarbstoffe) mit typischen Konzentrationen von 0,1
oder 0,2 mg/ml ließ man
mit 4 Gew.-% PLURONIC F127 wechselwirken, und jedes Gemisch wurde
dem PCR-Cocktail zugesetzt. Die Reaktion war derart angeordnet,
dass das PERV-Proteasefragment, wie in Beispiel 2 beschrieben, amplifiziert
wurde, und die Produkte der Reaktion wurden durch Agarosegelelektrophorese
analysiert. Die Ergebnisse des PCR-Verfahrens zeigten, dass jeder dieser
Farbstoffe die PCR hemmte, während
die Zugabe von Tensiden wie PLURONIC F127 die Wirkung des Farbstoffs
auf die Reaktion hemmten.
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Beispiel 7: Ein Tensid
stabilisiert einen Farbstoff und unterstützt die Verhinderung der thermischen
Zersetzung
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Die
Farbstoffe SDA 8080 und 785 WS wurden mit einer Vielfalt von Tensiden,
wie PLURONIC F-127, TWEEN-20, TRITON X-100, NP-40, BRIJ-97, gemischt
und in einer Temperaturzyklenapparatur (Thermocylcer 9700, Applied
Biosystems) Zyklen unterzogen. Absorptionslesungen wurden zu Beginn
und am Ende der Temperaturzyklen unter Verwendung von HP Chem Station
(HP 8453, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) bei 785 nm für den Farbstoff
des Typs 785 WS und 1040 nm für
den Farbstoff des Typs SDA 8080 vorgenommen. Die Ergebnisse wiesen
darauf hin, dass der Farbstoff ohne das Tensid auf Grade, die kein
wirksames Erwärmen
bereitstellen, zersetzt wurde, während
das Farbstoff/Tensid-Gemisch eine deutlich geringeren Zersetzung durchmachte.
Folglich unterstützt
das Tensid den Schutz vor thermischer Zersetzung des Farbstoffs.
Die Daten sind in Tabelle 4 dargestellt.
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Beispiel 8: Ein NIR-Farbstoff
erwärmt
Wasser effizient mit einem Tensid
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Dieser
Versuch zeigt, dass das Farbstoff/Tensid-Gemisch mit PCR-verträglichen
Konzentrationen sehr effizient erwärmen kann. Eine Diodenlaserquelle
mit 813 nm und 1,2 W (1,9 A) (Opto Power Corp., Tucson, Arizona)
wurde zum Erwärmen
eines Volumens von 10 μl
eines Nah-IR-Farbstoffs
mit einer Konzentration (0,1 mg/ml für 785 WS, 0,2 mg/ml für SDA 8080)
zum Erhalt einer Temperaturerhöhung
von 35°C
verwendet. Der Laser wurde manuell lange genug eingeschaltet, um
die Temperatur in einer Mulde von 10 μl um 35°C (1-3 Sekunden) zu erhöhen und
wurde manuell abgeschaltet, als dieses Niveau erzielt wurde. Die
Temperaturdaten wurden unter Verwendung eines Wärmeelements in der Mulde erhalten
und die Transmissionsdaten wurden über einen Leistungsmesser erhalten,
dessen Signale digitalisiert und grafisch interpretiert wurden.
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Ein
PCR-Wärmezyklenverfahren
erfordert typischerweise eine schnelle Temperaturerhöhung von 60°C auf 95°C. In einer
Reihe von Versuchen wurde gezeigt, dass eine Temperaturerhöhung um
35°C von 60°C auf 94°C in weniger
als 5 Sekunden erhalten wurde. Dies zeigt, dass die thermischen
Anforderungen für PCR-Zyklen
bei Farbstoff- und
Tensidkonzentrationen erfüllt
werden können,
die eine DNA-Amplifikation ermöglichen.
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In
einem anderen Versuch wurde die Mulde mit 10 μl verwendet, um zu sehen, ob
das Farbstoff/Tensid-Gemisch Laserzyklen über eine Dauer von 30 Zyklen
widerstehen könnte.
Die Laserleistung wurde 30 Mal systematisch von 60°C bis 94°C variiert. 1 zeigt,
dass SDA 8080 wiederholt Zyklen unterzogen wurde.
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Die
Laserleistung änderte
sich während
des Verlaufs der Zyklen nicht sehr. Dies wies darauf hin, dass der
Farbstoff SDA 8080 nicht um einen beträchtlichen Grad über eine
Dauer von 30 Zyklen ausbleichte.
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Beispiel 9: Ein Antioxidans
reduziert das Photobleichen eines NIR-Farbstoffs
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Anders
als in Beispiel 8 machen einige Farbstoffe und Farbstoff/Tensid-Komplexe
eine Photozersetzung durch, wenn sie Laserstrahlen ausgesetzt werden.
Die Einbringung von PCR-verträglichen
Radikalfängern,
wie Ascorbinsäure,
kann die Photozersetzung für
einige dieser Farbstoffe deutlich reduzieren. Die Zugabe von Ascorbinsäure zu praktisch
sämtlichen
Tensiden, die mit 785 WS getestet wurden reduzierte das Photobleichen
deutlich. Insbesondere im Falle von 785 WS/BRIJ-97 unterstützte die
Zugabe von Ascorbinsäure (typischerweise
5 mg/ml) das Reduzieren der Menge des Photobleichens von 100% auf
20% nach 30 Zyklen. In einigen Fällen
kann ein schneller/kontrollierter Photoabbau erwünscht sein. Im Falle von SDA
8080 zerstörte die
Zugabe von Ascorbinsäure
die Absorption im sichtbaren und Nah-IR-Bereich des Farbstoffs.
Dies würde ermöglichen,
dass DNA-Markierungen (fluoreszierend oder Sicht/IR) am Ende der
PCR-Reaktion überwacht werden.
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Vitamin
E-TPGS weist sowohl oberflächenaktive
als auch antioxidierende Eigenschaften auf. Folglich zeigte eine
Zugabe von Vitamin E-TPGS (4 Gew.-%) zu 785 WS (0,1 mg/ml), dass
die antioxidierenden Eigenschaften deutlich wurden, in dem Maße, als
die Lichtstabilität
nach 30 Zyklen Laseraussetzung deutlich erhöht wurde beträchtlich
zunahm.
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Es
sollte klar sein, dass die vorstehende Beschreibung nur veranschaulichend
und nicht beschränkend
sein soll. Verschiedene Modifikationen und Abänderungen dieser Erfindung
werden dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung ohne Verlassen
des Umfangs dieser Erfindung verständlich, und es sollte klar sein,
dass diese Erfindung auf die veranschaulichten Ausführungsformen,
die hier dargelegt sind, nicht in unangemessener Weise beschränkt ist.
