DE60312717T2

DE60312717T2 - Vorrichtung und Verfahren zur Bilderzeugung

Info

Publication number: DE60312717T2
Application number: DE60312717T
Authority: DE
Inventors: Fedja Bobanovic; John Phillips; Shab Milton LADHA; Patrick Ealing COURTNEY
Original assignee: PerkinElmer Singapore Pte Ltd
Current assignee: PerkinElmer Singapore Pte Ltd
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2003-10-15
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2023-10-16
Also published as: US8289620B2; DE60312717D1; KR101160356B1; US20060124870A1; GB0324250D0; GB2395265B; EP1552333B1; KR20050083776A; EP1552333A2; WO2004036898A2; JP4829499B2; AU2003301487B2; GB0224067D0; WO2004036898A3; ATE357679T1; CA2502701A1; JP2006503283A; CA2502701C; AU2003301487A1; GB2395265A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Apparat, mit denen Leuchtelemente eines Probestücks oder Samples zur Analyse abgebildet werden können.
Hintergrund der Erfindung
Bekannt ist der Einsatz konfokaler Bilderzeugung per Lasererregung, eines Nipkow-Scheiben-Abtasters (bei dem es sich um einen Mikrolinsen-Scheibenabtaster handeln kann) und einer Digitalkamera zur Erzeugung von Bilddaten in zwei Dimensionen, und wenn auch eine gesteuerte Z-Achsen-Bewegung vorgesehen ist, sind dreidimensionale Bilddaten erzielbar. Wenn sich ein Leuchtelement mit der Zeit ändert, kann eine Reihe von Bildern hergestellt werden, um Daten in vier Dimensionen zu erhalten (Fläche, Tiefe und Zeit). Wo möglich, können auch andere Parameter geändert oder beobachtet werden, einschließlich Erregerwellenlänge, Emissionswellenlänge, Polarisation und/oder Emissionsdauer.
Ein System, das zum Erbringen solcher Daten über mikroskopische Probestücke – etwa Zellen und Gewebeproben – in der Lage ist, ist der UltraVIEW live Cell Imager der Perkin Elmer Life Sciences. Dieses System verwendet ein konfokales Lasermikroskop- und ein CCD-Kamera-Bilderzeugungssystem, wie es in einer Arbeit von Kawamura Negishi Otsuki und Tomosada mit dem Titel "Confocal Laser Mikroskop and CCD Camera", veröffentlicht im Yokogawa Technical Report No. 33 (2002), English Edition und im Yokogawa Patent Nr. EP 0539691 , WO 9804946 beschrieben ist.
Bekannt ist auch die Nutzung einer oder mehrerer linsenloser Scheiben zur Erzielung von Konfokalität, wie in US 6147798 an Atto beschrieben. Hier entspricht die Rotation der linsenlosen Scheibe oder Scheiben der Rotation der Nipkow Scheibe(n).
In US 5248876 und WO 03/019242 wird ein weiteres konfokales Abtastverfahren beschrieben, in dem ein festes Nadellochmuster zum linearen Abtasten verwendet wird. Ein vollständiger Abtastvorgang unter Anwendung des Nadellochfelds entspricht der Richtung der Nipkow-Scheibe(n).
In US 5034613 (Denk) wird ein weiteres Verfahren beschrieben, das als 2-Photonen-Verfahren bekannt ist und dazu dient, die fokale Aktivierungsebene zu begrenzen und Konfokalität zu erreichen. Hier entspricht ein Impuls von der Erregerquelle der Rotation der Nipkow-Scheibe(n).
Ein weiteres konfokales Abtastsystem auf Nadellochbasis ist in 1998 Opt-Leth 23(9): 655-657 in einem Bericht mit dem Titel "Multifocal Multiphoton Microscopy" von Beresdorf et al. beschrieben. Hier entspricht ein vollständiger Abtastvorgang unter Anwendung der Nadellöcher einer Rotation der Nipkow-Scheibe(n).
Ein anderes konfokales Abtastsystem ist in US 2002/024007, EP 0911667 , US 5,587,832 und US 6,483,641 / EP 1207415 beschrieben. Dieses System nützt ein steuerbares Feld aus Spiegeln zur Synthetisierung eines Nadellochfeldes. Erneut entspricht ein vollständiger Abtastvorgang der Nadellöcher der Rotation der Nipkow-Scheibe(n).
Sende- und Reflexionselemente, die in einem Zufalls- oder Quasizufalls-Muster angeordnet sind, können für das konfokale Abtasten wie in WO 97/31282 und WO 0043819 (Wilson et al) beschrieben verwendet werden. Wiederum entspricht ein vollständiger Abtastvorgang der Sende- und Reflexionselemente der Rotation der Nipkow-Scheibe(n).
Schließlich wird in US 2002/0097490 ein konfokales Mikroskop mit einer Rotationsscheiben-Abtastvorrichtung offenbart. Ein in 19 dargestelltes Ausführungsbeispiel ist mit einem Computer 86 ausgestattet, der an den Steuerkreis 78 angeschlossen ist. Ein Signal vom Steuerkreis wird in den Motorantriebskreis der Rotationsscheiben-Abtastvorrichtung eingegeben, und eine Auslösersignalerstellungsschaltung dient der Synchronisierung der Rotation des Motors und der Betätigung einer CCD-Kamera.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Bilderzeugungssystem zu schaffen, das eine Verbesserung gegenüber den zur Zeit in Verwendung stehenden Systemen darstellt, insbesondere gegenüber dem aktuellen UltraVIEW-System und jenem, das im oben erwähnten Yokogawa Technical Report Nr. 33 (2002) und den zugehörigen Patenten EP 0539691 und WO 9804946, EP 1245986 , US 5,633,751 und US 6,388,808 beschrieben ist.
Es ist zudem ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Steuersystem zur genaueren Steuerung des Bilderzeugungs- und Datenerfassungsverfahrens und eine Methode zur Bedienung eines solchen Systems bereit zu stellen.
Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Aufnahme des Lichts von Leuchtelementen in einem Sample oder Probestück und zur Umwandlung des aufgenommenen Lichts in Daten zur Verarbeitung zu Analysezwecken und/oder Anzeige und/oder Speicherung für die anschließende Anzeige und/oder Verarbeitung zur Analyse zu schaffen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Bilderzeugung aus dem Licht von einem Probestück unter Verwendung einer Apparatur, bei der Erregerlicht über ein konfokales Abtastsystem zum Probestück gelangt und das von der Lumineszenz des Probestücks abgegeben Licht über das Abtastsystem in eine andere Richtung zur einer Bilderfassungsvorrichtung geht, die einen Sensor aufweist, der diskrete, räumlich abgesetzte, lichtempfindliche Bereiche besitzt, wobei das Abtastsystem so betätigt wird, dass es die Gesamtheit eines interessanten Bereichs des Probestücks abtastet und die Apparatur Steuermittel besitzt, die einen Hostcomputer und ein Steuerelement umfassen, wobei das Steuermittel so programmiert wird, dass es als Zustandsmaschine funktioniert, und wobei das Abtastsystem und das Erregerlicht und/oder die Bilderfassungsvorrichtung vom Steuerelement gesteuert werden, so dass das vom Probestück ausgehende Licht nur eine bestimmte Dauer auf den Sensor der Bilderfassungsvorrichtung fällt, welche der Zeit entspricht, die zum n-maligen Abtasten des gesamten interessanten Bereichs erforderlich ist, wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist.
Der interessante Bereich kann der gesamte sichtbare Bereich des Probestücks oder ein Teil davon sein, und ein Fenster variabler Größe und Anordnung kann vom Abtastsystem geschaffen werden, damit ein Teil oder der gesamte Bereich abgetastet werden kann, und beispielsweise kann ein Teilfeld variabler Größe und Anordnung verwendet werden.
In einer bevorzugten Anordnung umfasst das Abtastsystem eine rotierende Nipkow-Scheiben-Abtastvorrichtung, in der Erregerlicht durch Öffnungen in der Scheibe in eine Richtung geht und Licht, das von der Lumineszenz des Probestücks abgegeben wird, durch die Öffnungen in die entgegengesetzte Richtung geht, um ein Bild an der Bilderfassungsvorrichtung zu erzeugen, und das Muster der Öffnungen ist so beschaffen, dass die Rotation der Scheibe durch A° das Abtasten des gesamten interessanten Bereichs ergibt, und die spezifische Zeitperiode ist so ausgewählt, dass sie nA° Scheibenrotationen entspricht (wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich eins ist).
Praktischerweise ist die Bilderfassungsvorrichtung eine CCD-Kamera.
Eine einzelne Nipkow-Scheibe kann verwendet werden, doch mehr bevorzugt wird eine 2-Scheiben-Anordnung verwendet, eine mit Öffnungen und die andere mit Mikrolinsen, wie im Yokogawa Technical Report Nr. 33 (2002) beschrieben. Bezugnahmen auf eine Scheibe (oder ein Scheibenmittel oder eine Scheibenanordnung) umfassen hier mehrere Scheibenanordnungen, so wie in dem genannten Bericht beschrieben, aber auch Einzelscheibenanordnungen, wenn der Zusammenhang dies zulässt.
Alternativ können eine oder mehrere linsenlose Scheiben verwendet werden (beispielsweise wie in US Patent 6147798 beschrieben). In diesem Fall entspricht die Rotation der linsenlosen Scheibe der Rotation der Nipkow-Scheibe.
Alternativ kann das Licht auch unter Anwendung eines linearen Verfahrens abgetastet werden, etwa einer Rasterabtastungstechnik mit einem oder mehreren Nadellöchern in einem festen Muster (beispielsweise wie in US Patent 5248876 und auch in WO 03/019242 beschrieben), wobei eine vollständige lineare Abtastung der Nadellöcher einer Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ kann auch ein Spalt-Abtaster verwendet werden (wie beispielsweise in US 6038076 beschrieben), bei dem ein Abtastvorgang des Spalts einer Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ dazu kann die Konfokalität auch in einem 2-Photonenverfahren gewonnen werden, bei dem die Fokus-Aktivierungsebene begrenzt wird (vgl. Beschreibung in US Patent 5034613) und wo ein Impuls der 2-Photonen-Erregerquelle der Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ dazu kann die Konfokalität durch ein zeitverzögertes Multiplex-Verfahren (gemäß Beschreibung durch Bewersdorf, Pick und Hell in einer Arbeit mit dem Titel "Multifocal Multiphoton Microscope", 1998 Opt. Lett. 23(9): 655-657) erreicht werden, bei dem eine vollständige Abtastung der Nadellöcher einer Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ dazu kann eine Anordnung unabhängig steuerbarer Spiegel zur Synthetisierung der Nadellöcher benutzt werden (vgl. beispielsweise EP 0911667 und US 2002,024007 ), wobei ein vollständiger Abtastvorgang unter Anwendung der Spiegel ein Bild oder Teilbild schafft und der Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ dazu kann ein Zufalls- oder Quasizufallsmuster auf Sende- und Reflexionselementen abgetastet werden (wie in WO 97/31282 und WO 0043819 beschrieben), wobei ein vollständiger Abtastvorgang der Sende- und Reflexionselemente der Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Die Erregerlichtquelle kann ein- und ausgeschaltet werden, um die Belichtungsdauer zu kontrollieren.
Alternativ oder zusätzlich können Verschlussmittel vorgesehen sein, um das Licht von der Erregerquelle zu unterbrechen, ausgenommen wenn das Probestück abzutasten ist, und die Erregerlichtquelle kann kontinuierlich oder über längere Zeitperioden als die spezifischen Zeitperioden in Betrieb sein.
Alternativ oder zusätzlich kann ein Intrinsic-Verschluss (elektronisch) verwendet werden.
Alternativ oder zusätzlich kann ein Lichtzerhacker zur Unterbrechung des Erregerlichts verwendet werden.
Alternativ kann ein akustisch-optisches Lichtunterbrechungselement verwendet werden.
Zwischen dem Abtastsystem und der Bilderfassungsvorrichtung können Verschlussmittel vorgesehen sein, um das Licht daran zu hindern, den gesamten oder einen Teil des Bilderfassungsvorrichtungssensors zu erreichen, ausgenommen in den spezifischen Zeitperioden, in denen das Erregerlicht auf das Probestück fällt, wodurch Fehler reduziert werden, die aus dem von Phosphoreszenz stammenden Licht, aus Nachglühen, Streureflexionen oder anderen auf die Vorrichtung treffenden Effekten entstehen könnten.
Wenn Verschlussmittel für die Erregerquelle und die Bilderfassungsvorrichtung vorgesehen sind, werden diese vorzugsweise synchron betätigt, etwa durch mechanische oder elektrische Mittel, oder es können elektronische Pseudo-Verschlussmittel oder Kombinationen derselben verwendet werden.
Wenn das Probestück weitgehend transparent ist, kann es abgetastet und auf unterschiedlichen, beabstandeten Ebenen abgebildet werden, die auch vorzugsweise parallel zueinander sind.
Mehrere Bilder können in kurzen Zeitperioden (z.B. 1 Minute – 60 Minuten) oder längeren Zeitperioden (z.B. 24-72 Stunden) sowie mittleren Perioden (z.B. 1-24 Stunden) gesammelt werden. Solche Bilder werden oftmals als Bilderstapel bezeichnet.
Das Verfahren kann somit eine relative Bewegung zwischen dem Probestück und der Abtastvorrichtung einschließen. Diese kann beispielsweise durch Versetzen der Abtastvorrichtung längs einer Achse (normalerweise die Z-Achse) erreicht werden, die normal auf der abzubildenden Abtastebene steht, so dass das einfallende Licht an unterschiedlichen Punkten entlang dieser Achse in einen Fokus gebracht werden kann, wobei jeder Punkt in einer anderen Fokusebene liegt (und diese begrenzt), da mit das Probestück in unterschiedlichen, parallel beabstandeten Ebenen abgetastet und abgebildet werden kann. Vorzugsweise ist die Bewegung auf Perioden begrenzt, in denen mindestens das Erregerlicht nicht auf das Probestück fällt, und/oder auf Perioden, in denen die Bilderfassungsvorrichtung auch unempfindlich auf Licht von der Probestück-Lumineszenz ist.
Alternativ kann der optische Weg modifiziert werden, um die unterschiedlichen Ebenen zu begrenzen, indem eine Objektivlinse oder das Probestück bewegt wird, in der Regel durch Bewegen einer Halterung, in der das Probestück enthalten ist.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird folglich ein Probestückträger versetzt, um die beabstandeten Bilderzeugungsebenen zu begrenzen.
Die Versetzungsebene kann in einem anderen Winkel als 90° zur Fokusebene liegen.
Typischerweise wird das Bewegen der Z-Achse am Ende jeder Zeitperiode oder nach N aufeinander folgenden Zeitperioden ausgeführt (wobei N eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist). Die Bewegung kann so sein, dass sie die Distanz zwischen der Abtastvorrichtung oder dem optischen Systemelement und dem Probestück vergrößert oder verkleinert.
Jede Z-Achsen-Bewegung zwischen Belichtungen kann von der selben Größe sein wie die vorangehende oder nachfolgende, oder sich von diesen unterscheiden.
Die Bewegung der Z-Achse erfolgt vorzugsweise in Einzelschritten, deren jeder eine bestimmte gleiche Größe hat; in diesem Fall kann jede Z-Achsen-Bewegung zwischen Belichtungen aus M Einzelschritten bestehen (wobei M eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist).
Alternativ kann die Bewegung der Z-Achse auch kontinuierlich sein. Dies erlaubt eine schnellere Bewegung zwischen Z-Positionen, ohne dass auf die Einrichtung des Z-Mechanismus gewartet werden muss. Der Nachteil liegt darin, dass die Z-Position während der Bilderzeugung variiert, mit dem Ergebnis, dass das Bild in Z verzerrt sein kann. Dies kann aber durch eine Entfaltung zur Bildschärfung ausgeglichen werden.
Wenn die für die Änderung des Z-Achsenabstands erforderliche Zeit größer ist als die zwischen den Belichtungen erforderliche Mindestzeit, umfasst das Verfahren vorzugsweise den Schritt der Anpassung der Zeit zwischen den Belichtungen oder der Kontrolle der Beleuchtung und der Belichtung der Bilderfassungsvorrichtung unter Bezugnahme auf die Z-Achsen-Bewegung, so dass die Erregungsbeleuchtung und Belichtung nur ausgelöst werden, nachdem eine ausreichend lange Zeit vergangen ist oder nachdem eine gewünschte Z-Achsen-Bewegung erreicht wurde.
Das Erregerlicht kann aus Licht bestehen, das zwei oder mehr unterschiedliche Wellenlängen aufweist.
Wenn das Verfahren eine Variation der Wellenlänge des Erregerlichts zwischen den Belichtungen vorsieht, ist vorzugsweise auch der Schritt einer Änderung der Erregerlicht-Wellenlänge zwischen dem Ende einer Belichtung und dem Anfang der nächsten eingeschlossen.
Wenn die Variation der Erregerlicht-Wellenlänge stattfinden soll, während das Licht auf die selbe Ebene des Probestücks fokussiert wird (d.h. es findet keine Z-Achsen-Bewegung zwischen den einzelnen Abfolgen zweier oder mehrerer Erregungs- und Belichtungsschritte statt, die eine Belichtungssequenz ausmachen, auch wenn jeder eine oder gleichzeitig zwei oder mehr unterschiedliche Wellenlänge(n) des Erregerlichts verwendet), findet die Bewegung der Z-Achse erst nach jeder vollständigen Belichtungsfolge statt, und die nächste Sequenz solcher Schritte wird erst ausgelöst, nachdem die einzelnen Z-Achsen-Bewegungen abgeschlossen sind.
Zusätzlich kann ein im System verwendeter Mikroskoptisch, der ein Probestück trägt, größere X oder Y-Bewegungen (10 Mikron bis 10 mm) bewirken, um andere Teile eines Samples in den Blick zu bringen, wie beispielsweise andere Zellen auf dem selben Objektglas oder andere Bereiche von Gewebe oder Sample.
Eine Anzahl von Samples kann in die Wells einer Multiwell-Platte eingelegt sein. Die Samples können sich alle gleichen, sich aber auch unterscheiden, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Bestandteile, Konzentrationen oder ihres Alters. Die Multiwell-Platte kann auf einem Mikroskop-Tisch montiert sein, der bewegt wird, um unter schiedliche Wells in Ausrichtung zu bringen oder um unterschiedliche Teile eines einzelnen Samples in einem der Wells in Ausrichtung zu bringen.
Zusätzlich kann die Z-Bewegung in eine Richtung erfolgen, und dann abwechselnd in eine andere, um Zeit zu sparen.
Wellenlängenvariationen können durch den Einsatz von zwei oder mehr Lichtquellen unterschiedlicher Spitzenwellenlängen und selektivem Einsatz der Quellen erreicht werden, oder durch selektive Lenkung des Lichts von den Quellen abwechselnd zu Abtastvorrichtung und Probestück, wie benötigt.
Die benützten Lichtquellen können komplexere Spektralcharakteristika haben (z.B. mehrere Spitzen von einem Argonionenlaser mit einer Hauptlinie bei 488 nm und zusätzlichen Linien bei 476 nm und 496 nm).
Wenn Licht von mehr als einer Wellenlänge gleichzeitig produziert wird, können die Wellenlängen durch einen Einzelcode ausgewählt werden (z.B. 2 Linien zur Auswahl einer von 4 Wellenlängen als Code 00, 01, 10, 11), oder als Gruppe individueller Signallinien (z.B. 4 Linien für 4 Wellenlängen). Auf diese Weise können mehrere Linien gleichzeitig aktiviert werden.
Nach einem bevorzugten Merkmal der Erfindung kann das Erregerlicht aus einer oder mehreren Laserlichtquellen bezogen werden.
Alternativ kann die Lichtquelle eine direkt betriebene Laserdiode umfassen.
In einer bevorzugten Anordnung kommt eine einzelne Lichtquelle zum Einsatz, die einen akustisch-optisch regelbaren Filter-(AOTF)-Kristall besitzt, und die Wellenlänge des abgegebenen Lichts wird durch Ändern des Frequenzregelsignals an den Kristall je nach Bedarf geändert. Eine solche Anordnung kann eine einzelne Laserquelle oder zwei oder mehrere Laserlichtquellen umfassen, deren Ausgaben optisch kombiniert werden können.
Vorzugsweise wird jede Frequenzänderung des Regelsignals zwischen den Belichtungen vollzogen.
Das Erregerlicht kann gepulst sein.
Das Erregerlicht kann polarisiert sein.
Als Quelle des Erregerlichts kann eine luminiszierende oder glühende Lichtquelle dienen, und zur Regelung der Wellenlänge des von der Quelle abgegebenen Lichts kann ein optischer Filter oder ein Monochromator verwendet werden.
Alternativ kann eine Leuchtdioden-(LED)-Quelle benützt werden, die ein oder mehrere lichtabgebende Elemente enthält.
Wenn die Intensität des auf das Probestück fallenden Erregerlichts von einer Belichtung zur nächsten einzustellen ist, umfasst das Verfahren vorzugsweise den Schritt der Einstellung der Intensität der einfallenden Beleuchtung zwischen den Belichtungen.
Dies kann beispielsweise durch Einsetzen von Filtern neutraler Dichte, Öffnen oder Schließen einer Irisblende im Lichtweg, Einstellen der Stromzufuhr zur Lichtquelle, Einsatz eines Dämpfungselements wie eines AOTF oder LCD-Verschlusses oder einer Kombination derselben erreicht werden.
Wenn die Intensität des auf das Probestück fallenden Erregerlichts sich bei einer Wellenlänge von jener bei einer anderen Wellenlänge unterscheidet, etwa aufgrund inhärenter Intensitätvariationen zwischen einer Quelle und einer anderen oder zwischen unterschiedlichen Betriebsmodi einer geregelten Erregerlichtquelle, kann die Intensität der Erregungsbeleuchtung zwischen einer Wellenlänge und einer anderen so eingestellt werden, dass am Probestück für jede Wellenlänge eine bestimmte Beleuchtungsintensität gegeben ist.
Typischer Weise – aber nicht ausschließlicher Weise – ist die Stromversorgungseinstellung von einer Belichtung zur nächsten mit wechselnden Wellenlängen so gestaltet, dass ein im wesentlichen gleiches Niveau (Intensität) der Beleuchtung am Probe stück während des die einzelnen Belichtungen ausmachenden Abtastens herrscht, unabhängig von der Wellenlänge.
Eine ähnliche Technik kann angewendet werden, wenn die Emission vom Sample sich nach der Wellenlänge der Lumineszenz ändert, und um das abgegebene Licht auf ähnliche Intensität zu bringen (unabhängig von der Wellenlänge), kann die Stromversorgungseinstellung und/oder Dämpfung von einer Belichtung zur nächsten auch – oder anstatt – so eingestellt werden, dass eine Lumineszenz von im wesentlichen konstanter Intensität entsteht, unabhängig von der Wellenlänge.
Vorzugsweise wird ein System, das ein die Erfindung verkörperndes Verfahren ausführt, von einem einzelnen Steuermittel gesteuert, etwa einem Steuerzentrum, das typischerweise einen programmierbaren Computer und eine oder mehrere Schnittstellen zur Konvertierung der vom Computer produzierten Signale in Signale umfasst, die zum Betreiben oder Steuern der Stromzufuhr zu Antrieben oder zum Steuern der Stromzufuhr zu Geräten geeignet sind, um damit die Bewegungen und Rotationen auszuführen, die von den unterschiedlichen Schritten des Verfahrens verlangt werden.
Eine bevorzugte Bilderfassungsvorrichtung ist eine CCD-Kamera. Eine solche Kamera kann ein Bildsignal in Analog- oder Digitalformat abgeben. Vorzugsweise wird eine Kamera ausgewählt, die ein Bildsignal im Digitalformat produziert.
Wenn die Bilderfassungsvorrichtung eine CCD-Kamera ist, wird sie vorzugsweise gekühlt, um den Signal/Rausch-Abstand der Kameraausgangssignale zu vergrößern.
Alternative Bilderfassungsvorrichtungen, die eingesetzt werden können, sind ein lichtempfindlicher Sensor, eine CMOS-Kamera, eine CID-Kamera (Schaltung mit lokaler Ladungsinjektion), eine verstärkte oder gattergesteuerte Kamera, ein Photoelektronenvervielfacher-Array, ein Photodioden-Array oder eine Bilderfassungsvorrichtung mit einem adressierbaren Mikrocolometer-Array oder eine Kamera mit chemischem Film.
Da das der Bilderfassungsvorrichtung präsentierte Licht geeignet ist, ein Bild zu erzeugen, kann das Licht statt dessen (oder: auch) auf ein Okular gelenkt werden, das ein Betrachten des Bildes mit dem menschlichen Auge erlaubt, oder auf eine optische Apparatur, die geeignet ist, das Bild zum Ansehen auf einen Bildschirm zu projizieren.
Der Lichtweg zur Bilderfassungsvorrichtung kann eine Strahlteiler- oder Strahllenkervorrichtung umfassen, mit denen das Licht zwischen der Bilderfassungsvorrichtung, einem Okular oder einem Projektionssystem gespaltet (oder geteilt) werden kann.
Eine Mehrzahl von Bilderfassungsvorrichtungen kann verwendet werden, von denen eine jede mit Licht vom Probestück versorgt wird, und die alle derselbe Gerätetyp sein oder sich von den anderen Gerätetypen unterscheiden können.
Kameras können durch Sensoren ersetzt werden.
Wenn eine oder mehrere Bilderfassungsvorrichtungen vorgesehen sind, kann der Lichtweg zu diesen je nach Eignung ein Strahlteilermittel oder Strahllenkungsmittel umfassen.
Das Lichtbild kann über ein Lichtwellenleiterbündel zu einer Bilderfassungsvorrichtung gesendet werden (die ein Sensor sein kann).
Die Signale von der Bilderfassungsvorrichtung können in Echtzeit verarbeitet und/oder analysiert werden, beispielsweise unter Anwendung eines entsprechend programmierten Computers.
Signale von der Bilderfassungsvorrichtung können beispielsweise in einem Rahmenspeicher zur nachfolgenden Analyse durch einen Computer gespeichert oder in Echtzeit zur Sichtinspektion und Analyse eines von den Signalen produzierten Bildes angezeigt werden (oder anschließend durch Ausgeben von Signalen aus dem Speicher).
Das System kann unter Anwendung einer Dunkelfeldbeleuchtung oder Rheinberg-Beleuchtung, Phasenkontrastbeleuchtung oder Differential Interference Contrast (DIC) Beleuchtung arbeiten.
Das System kann einen Hoffman Modulationskontrast verwenden.
Die Beleuchtung kann schräg oder axial erfolgen, und das Beleuchtungslicht kann polarisiert und/oder von einem nicht-sichtbaren Teil des Spektrums sein, wie beispielsweise Infrarotlicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Apparat, mit dem das von einem Probestück abgegebene Licht von einer Bilderfassungsvorrichtung abgebildet wird, um ein Videosignal zur Erzeugung eines Bildes in einer Anzeigevorrichtung oder zur Verarbeitung und Analyse zu produzieren. Dieser umfasst Mittel zur Anbringung des Probestücks, eine Lichtquelle zur Erzeugung von Erregerlicht, ein konfokales Abtastsystem, das geeignet ist, Erregerlicht in eine Richtung auf einen Bereich des Probestücks zu lenken und diesen damit abzutasten, und das zudem geeignet ist, vom Probestück infolge des darauf einfallenden Erregerlichts abgegebenes Licht in eine andere Richtung zu transportieren, das im Gebrauch dazu dient, einen interessanten Bereich des Probestücks (wiederholt) abzutasten; eine Bilderfassungsvorrichtung mit diskreten, räumlich abgesetzten lichtempfindlichen Bereichen, auf denen Licht, das vom Probestück abgegeben wird, fokussiert wird, um ein Bild auszubilden, nachdem es durch das Abtastsystem in die andere Richtung transportiert worden ist, und Steuermittel, die einen Hostcomputer und ein Steuerelement umfassen, wobei das Steuerelement geeignet ist, das konfokale Abtastsystem zu steuern.
Gemäß der Erfindung ist das Steuerelement so programmiert, dass es als Zustandsmaschine funktioniert und geeignet ist, die Erregerlichtquelle und/oder die Bilderfassungsvorrichtung zu steuern, so dass Licht vom Probestück nur während einer spezifischen Zeitperiode auf die Bilderfassungsvorrichtung fällt, gleich der Zeit, die das Abtastsystem benötigt, den interessanten Bereich n Mal abzutasten, wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist.
Der interessante Bereich kann der gesamte sichtbare Bereich des Probestücks sein. Alternativ kann mit dem Abtastsystem auch ein Fenster unterschiedlicher Größe und Lokalisierung geschaffen werden, um einen Teil des Bereichs (oder auf Wunsch den gesamten) abtasten zu können. So kann ein Teilfeld variabler Größe und Lokation verwendet werden.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst das Abtastsystem eine rotierende Nipkow-Scheiben-Abtastvorrichtung, in der Erregerlicht in eine Richtung durch Öffnungen in der Scheibe geht, und Licht, das per Fluoreszenz des Probestücks abgegeben wurde, durch die Öffnungen in entgegengesetzter Richtung geht, um auf der Bilderfassungsvorrichtung ein Bild zu erzeugen, und das Muster der Öffnungen so beschaffen ist, dass die Rotation der Scheibe durch A° das Abtasten des gesamten interessanten Bereichs ergibt, und die Zeitperiode so ausgewählt ist, dass sie nA° der Scheibenrotation entspricht (wobei n gleich eins oder eine Ganzzahl größer als eins ist).
Eine einzelne Nipkow-Scheibe kann verwendet werden, aber mehr bevorzugt wird eine 2-Scheiben-Anordnung angewendet, in der eine der Scheiben eine Mikrolinse in den Öffnungen umfasst, wie im Yokogawa Technical Report Nr. 33 (2002) beschrieben. Bezugnahmen auf eine Scheibe (oder Scheibenmittel oder Scheibenanordnungen) umfassen hier Mehrscheibenanordnungen, wie in dem zitierten Bericht beschrieben, sowie Einzelscheibenanordnungen, sofern der Zusammenhang dies zulässt.
Alternativ können eine oder mehrere linsenlose Scheiben verwendet werden (beispielsweise wie in US Patent 6147798 beschrieben). In diesem Fall entspricht die Rotation der linsenlosen Scheibe (oder Scheiben) der Rotation einer Nipkow-Scheibe.
Das Abtastsystem kann ein Nadelloch oder mehrere Nadellöcher in einem festen Muster umfassen (beispielsweise wie in US Patent 5248876 und WO 03/019242 beschrieben), wobei eine vollständige Abtastung des Nadellochs (oder Nadellochfelds) der Rotation einer Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ kann das Abtastsystem einen Spalt-Abtaster umfassen (wie beispielsweise in US 603 8076 beschrieben), bei dem ein Abtastvorgang des Spalts einer Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Die Konfokalität kann in einem 2-Photonenverfahren erreicht werden, das eine 2-Photonen-Erregerquelle umfasst und das die Fokus-Aktivierungsebene begrenzt (vgl. Beschreibung in US Patent 5034613) und wo ein Impuls der 2-Photonen-Erregerquelle der Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ dazu kann die Konfokalität durch ein zeitverzögertes Multiplex-Verfahren mit Nadellöchern (gemäß Beschreibung durch Bewersdorf Pick und Hell in einer Arbeit mit dem Titel "Multifocal Multiphoton Microscope", 1998 Opt. Lett. 23(9): 655-657) erreicht werden, bei dem eine vollständige Abtastung der Nadellöcher einer Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ dazu kann das Abtastsystem eine Anordnung unabhängig steuerbarer Spiegel und Mittel zur Einstellung derselben unter der Kontrolle der Steuermittel verwenden, so dass diese im Gebrauch ein Nadellochfeld synthetisieren (vgl. beispielsweise EP 0911667 und US 2002,024007 ), wobei ein vollständiger Abtastvorgang unter Anwendung der Spiegel ein Bild oder Teilbild schafft und der Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Alternativ dazu kann das Abtastsystem ein Zufalls- oder Quasizufallsmuster von Sende- und Reflexionselementen umfassen (wie in WO 97/31282 und WO 0043819 beschrieben), die abgetastet werden, um ein Bild zu erzeugen, wobei ein vollständiger Abtastvorgang der Sende- und Reflexionselemente einer Rotation der Nipkow-Scheibe entspricht.
Vorzugsweise sind Mittel vorgesehen, die das Licht am Erreichen des Probestücks hindern, ausgenommen von der Erregerquelle, und um Licht am Erreichen der Bilderfassungsvorrichtung zu hindern, ausgenommen vom Probestück über das Abtastsystem.
Vorzugsweise steuert das Steuermittel auch den Betrieb der Bilderfassungsvorrichtung, wobei es zum Ende jeder Zeitperiode abgelesen wird und vor Beginn der nächsten Zeitperiode zurück gesetzt wird.
Vorzugsweise sind Mittel vorgesehen, vermöge deren Licht von der Erregerlichtquelle auf das Probestück während einer exakt jeder einzelnen Zeitperiode entsprechenden Dauer fällt.
In einer Anordnung schaltet das Steuermittel die Erregerlichtquelle ein und aus, um die Belichtungsdauer zu kontrollieren, und die Belichtung der Bilderfassungsvorrich tung wird umgekehrt von der Zeit geregelt oder gesteuert, während der die Erregerlichtquelle aktiv ist.
Alternativ oder zusätzlich können Verschlussmittel bereit gestellt werden, die in der Praxis von Signalen vom Steuermittel betätigt werden, um das Licht von der Erregerquelle zu unterbrechen, ausgenommen wenn das Probestück beleuchtet werden soll.
Alternativ oder zusätzlich kann ein Intrinsic-Verschluss (elektronisch) verwendet werden.
Alternativ oder zusätzlich kann ein Lichtzerhacker zur Steuerung des Lichts verwendet werden.
Alternativ kann ein akustisch-optisches Element zur Ausführung der Verschlussfunktion verwendet werden.
Alternativ oder zusätzlich können zwischen dem Abtastsystem und der Bilderfassungsvorrichtung zweite Verschlussmittel vorgesehen sein, die von Signalen vom Steuermittel betätigt werden, so dass im Gebrauch das Licht daran gehindert wird, mindestens einen Teil des Bilderfassungsvorrichtungssensors zu erreichen, ausgenommen in den spezifischen Zeitperioden, in denen das Erregerlicht auf das Probestück fällt, wodurch Fehler reduziert werden, die aus dem von Phosphoreszenz stammenden Licht, aus Nachglühen, Streureflexionen oder anderen Effekten entstehen könnten, die die Erfassungsvorrichtung erreichen.
Wenn Verschlussmittel für die Erregerquelle und die Bilderfassungsvorrichtung vorgesehen sind, werden vorzugsweise solche Mittel eingesetzt, die in Gebrauch synchron betrieben werden.
Das Synchronisierungsmittel kann mechanisch oder elektrisch oder beides sein.
In der Praxis fokussiert das Abtastsystem das Erregerlicht vorzugsweise in einer Ebene, die den Bereich des Probestücks enthält oder umfasst, der vom Erregerlicht beleuchtet werden soll und im allgemeinen den interessierenden Bereich umfasst.
Wenn das Probestück weitgehend transparent ist, kann der Apparat auch Antriebsmittel umfassen, die geeignet sind, das Probestück, das Abtastsystem oder ein Element eines optischen Systems im Abtastsystem längs einer linearen Achse (der Z-Achse) zu bewegen, so dass im Einsatz die Ebene an unterschiedlichen Punkten längs der Z-Achse positioniert werden kann, um ein Abtasten des Probestücks in unterschiedlichen (normalerweise parallelen) beabstandeten Ebenen zu ermöglichen.
Vorzugsweise wird das Linearachsenantriebsmittel auch von Signalen vom Steuermittel gesteuert.
Vorzugsweise funktioniert das Steuersystem so, dass in der Praxis die Linearachsenbewegung auf Perioden beschränkt ist, während welcher zumindest Erregerlicht gehemmt (oder am Erreichen des Probestücks gehindert) wird und vorzugsweise auf Perioden beschränkt, während welcher die Bilderfassungsvorrichtung lichtunempfindlich gemacht ist.
Typischerweise steuert das Steuermittel den Linearachsenantrieb, um die lineare Achsbewegung am Ende jeder Zeitperiode oder nach N aufeinander folgenden Zeitperioden auszuführen (wobei N eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist). Die Bewegungen können so sein, dass sie die Distanz zwischen dem Probestück und dem Abtastsystem oder einem Element des Abtastsystems oder einem Element eines optischen Systems im Abtastsystem vergrößern oder verkleinern.
Das Steuersystem ist vorzugsweise geeignet, die Distanz zu steuern, die längs der linearen Achse zwischen den Belichtungen zurückgelegt wird.
Jede Linearachsenbewegung kann von der selben Größe sein wie die vorangehende oder nachfolgende, oder sich von diesen unterscheiden.
Vorzugsweise ist das Steuersystem geeignet, den Linearachsenantrieb in Einzelschritten zu steuern, deren jeder eine bestimmte gleiche Größe hat, und in diesem Fall kann jede Linearachsenbewegung zwischen Belichtungen aus einem oder mehr als einem Einzelschritt bestehen.
Alternativ kann die Bewegung an der linearen Achse auch kontinuierlich sein. Dies erlaubt eine schnellere Bewegung zwischen unterschiedlichen Bilderzeugungspositionen, ohne dass auf die Einrichtung des Mechanismus gewartet werden muss. Der Nachteil liegt darin, dass die Bilderzeugungsebene während der Bilderzeugung variiert, mit dem Ergebnis, dass das Bild verzerrt sein kann. Dies kann aber durch eine Entfaltung zur Nachschärfung des Bildes ausgeglichen werden.
Wenn die für die Änderung des Linearachsenabstands erforderliche Zeit größer ist als die zwischen den Belichtungen erforderliche Mindestzeit, ist das Steuermittel geeignet, die Zeit zwischen den Belichtungen zu steuern oder die Belichtung der Beleuchtungs- und Bilderfassungsvorrichtung unter Bezugnahme auf die Z-Achsen-Bewegung zu steuern, so dass die Erregungsbeleuchtung und Belichtung nur ausgelöst werden, nachdem eine ausreichend lange Zeit vergangen ist oder nachdem eine gewünschte Linearachsenbewegung erreicht wurde.
Mehrere Bilder können in kurzen Zeitperioden (z.B. 1 Minute – 60 Minuten) oder längeren Zeitperioden (z.B. 24-72 Stunden) sowie mittleren Perioden (z.B. 1-24 Stunden) gesammelt werden. Solche Bilder werden oftmals als Bilderstapel bezeichnet.
Wenn das Verfahren eine Variation der Wellenlänge des Erregerlichts zwischen den Belichtungen vorsieht, kann der Apparat zwei oder mehr Erregerlichtquellen umfassen, deren jede ein Licht erzeugt, dessen Wellenlänge sich von der (oder allen) anderen Quelle(n) unterscheidet, oder eine einzelne Quelle umfassen, die so eingestellt werden kann, dass sie Licht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt, und das Steuermittel ist geeignet, zwischen den Quellen zu unterscheiden oder die einzelne Quelle zu steuern, um die Erregerlicht-Wellenlänge vorzugsweise zwischen dem Ende einer Belichtung und dem Anfang der nächsten zu ändern.
Wenn die Variation der Beleuchtungswellenlänge stattfinden soll, während das Licht auf die selbe Ebene des Probestücks fokussiert wird (d.h. es findet keine Linearachsenbewegung zwischen den einzelnen Abfolgen zweier oder mehrerer Belichtungsschritte statt, die eine Schrittsequenz ausmachen, auch wenn jeder eine (oder gleichzeitig zwei oder mehr) unterschiedliche Wellenlänge(n) des Erregerlichts verwendet), kann das Steuermittel so angepasst werden, dass es das Linearachsenantriebs mittel steuert, so dass die Linearachsenbewegung erst nach jeder vollständigen Schrittfolge stattfindet, und die nächste Sequenz solcher Schritte wird erst ausgelöst, nachdem die einzelnen Linearachsenbewegungen abgeschlossen sind.
Normalerweise wird das Probestück von einem Mikroskoptisch getragen, und ein Tischantrieb zum Bewegen des Tisches (und des Probestücks) in X und Y ist vorgesehen, um andere Teile eines Samples in den Blick zu bringen, wie beispielsweise andere Zellen auf dem selben Objektglas oder andere Samples in einer Multiwell-Platte oder andere Gewebeteile eines einzelnen Samples. Zu diesem Zweck können die X und Y-Schritte im Bereich von 10 Mikron bis 10 nm betragen.
In den Wells oder einer Multiwell-Platte können mehrere Samples untergebracht sein. Diese können gleich sein, sich aber beispielsweise in ihren Bestandteilen, Konzentrationen oder in ihrem Alter unterscheiden.
Der Linearantrieb kann so gesteuert werden, dass er eine Linearbewegung abwechselnd in die eine Richtung und dann in die andere Richtung erzeugt, um Zeit zu sparen.
Wellenlängenvariationen können durch den Einsatz von zwei oder mehr Lichtquellen unterschiedlicher Spitzenwellenlängen und selektivem Einsatz der Quellen erreicht werden, oder durch selektive Lenkung des Lichts von den Quellen abwechselnd zu Abtastvorrichtung und Probestück, wie benötigt.
Es ist zu beachten, dass das Spektrum einer Lichtquelle (auch wenn diese zur Produktion von Licht einer Wellenlänge konzipiert ist) Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen umfasst, in dem die Intensität des Lichts bei oder nahe der bestimmten Wellenlänge wesentlich größer ist als andere Lichtkomponenten im Quellenspektrum. In diesem Fall wird gesagt, die Quelle erreiche den Gipfel bei der bestimmten Wellenlänge.
Folglich können die im Apparat zur Durchführung der Erfindung benützten Lichtquellen komplexere Spektralcharakteristika haben, z.B. mehrere Spitzen von einem Argonionenlaser mit einer Hauptlinie bei 488 nm und zusätzlichen Linien bei 476 nm und 496 nm.
Wenn die Erregerlichtquelle Licht von mehr als einer Wellenlänge gleichzeitig produziert, können einzelne (Spitzen)-Wellenlängen durch einen Einzelcode ausgewählt werden (z.B. 2 Linien zur Auswahl einer von 4 Wellenlängen als Code 00, 01, 10, 11), oder als Gruppe individueller Signallinien (z.B. 4 Linien für 4 Wellenlängen), so dass mehrere Linien gleichzeitig aktiviert werden können.
Nach einem bevorzugten Merkmal der Erfindung kann die Erregerlichtquelle eine Laserlichtquelle umfassen, die einen oder mehrere Laser umfassen kann.
Eine einzelne Erregerlichtquelle kann angewendet werden, deren abgegebene Wellenlänge geändert werden kann, und das Steuermittel kann im Gebrauch so angepasst werden, dass die Quelle auf die Erzeugung einer gewünschten Wellenlänge geändert wird.
Vorzugsweise wird eine Laserlichtquelle angewendet, die einen akustisch-optisch regelbaren Filter-(AOTF)-Kristall besitzt, und das Steuermittel ist geeignet, im Gebrauch Signale abzugeben, um das Frequenzregelsignal an den Kristall zwischen den Belichtungen zu ändern, um die Wellenlänge des abgegebenen Lichts zu steuern.
Die Lichtquelle kann eine direkt betriebene Laserdiode sein.
Vorzugsweise wird die Änderung der Frequenz des Steuersignals zwischen den Belichtungen durchgeführt.
Das Erregerlicht kann durch Pulsen der Quelle gepulst werden.
Das Erregerlicht kann polarisiert sein, entweder durch Verwendung einer polarisierten Lichtquelle oder eines Polarisierungsfilters.
Als Quelle des Erregerlichts kann eine luminiszierende oder glühende Lichtquelle dienen, und zur Regelung der Wellenlänge des von der Quelle abgegebenen Lichts kann ein optischer Filter oder ein Monochromator verwendet werden.
Alternativ kann als Erregerlichtquelle eine Leuchtdioden-(LED)-Quelle benützt werden, die ein oder mehrere lichtabgebende Elemente enthält.
Wenn die Intensität des auf das Probestück fallenden Erregerlichts von einer Belichtung zur nächsten anzupassen ist, kann das Steuermittel geeignet sein, im Gebrauch die Intensität der auf das Probestück fallenden Erregerbeleuchtung einzustellen, vorzugsweise zwischen den Belichtungen.
Diese Variation kann beispielsweise durch Einsetzen von Filtern neutraler Dichte im Lichtweg erreicht werden.
Der Apparat kann folglich eine Mehrzahl von Filtern neutraler Dichte und Mittel unter der Kontrolle der Steuerungsmittel umfassen, die im Gebrauch selektiv einen oder mehrere Filter im Lichtweg positionieren (vorzugsweise während der Zeitintervalle zwischen Belichtungen), um die Dichtevariation zu erreichen.
Alternativ kann der Apparat eine einstellbare Irisblende im Lichtweg und Antriebsmittel umfassen, die vom Steuermittel betätigt werden, um die Iris nach Bedarf zu öffnen oder zu schließen, vorzugsweise in den Zeitintervallen zwischen den Belichtungen.
Alternativ und vorzugsweise kann die Intensität des Erregerlichts durch Einstellen der Stromversorgung der Erregerlichtquelle gesteuert werden, und zu diesem Zweck können Steuermittel so angepasst werden, dass sie Signale zur Steuerung der Stromquelle für die Erregerlichtquelle oder der Übertragung der Stromversorgung auf dieselbe abgeben, je nach Bedarf.
Ein Dämpfungselement wie ein AOTF oder LCD-Verschluss kann verwendet werden, die Intensität des Erregerlichteinfalls auf das Probestück zu steuern, wobei der AOTF oder LCD-Verschluss von Signalen vom Steuermittel gesteuert wird.
Die Intensität des Erregerlichts kann durch Verwendung zweier oder mehrerer solcher Intensitätsvariationstechniken, die normalerweise in Serie kombiniert sind, gesteuert werden.
Wenn die Intensität des Erregerlichts sich bei einer Wellenlänge von jener bei einer anderen Wellenlänge unterscheidet, etwa aufgrund inhärenter Intensitätsvariationen zwischen einer Quelle und einer anderen, oder zwischen unterschiedlichen Betriebs modi einer gesteuerten Erregerlichtquelle, etwa eines AOTF-Kristall-Lasers, oder der Emission eines Kristalls infolge Erregung, kann das Steuermittel geeignet sein, im Gebrauch die Intensität der Beleuchtung zwischen einer Wellenlänge und einer anderen zu ändern, um am Probestück für jede Wellenlänge eine bestimmte Beleuchtungsintensität zu erzeugen, um die ansonsten möglicherweise auftretenden Intensitätsvariationen zwischen einer Wellenlänge und einer anderen im wesentlichen zu beseitigen.
Typischer Weise – aber nicht ausschließlicher Weise – ist das Steuermittel im Gebrauch geeignet, die Stromzufuhr zur Erregerlichtquelle von einer Belichtung zur nächsten mit wechselnden Wellenlängen so zu steuern, dass ein im wesentlichen gleiches Niveau (Intensität) der Erregungsbeleuchtung am Probestück während der einzelnen Belichtungen gegeben ist, unabhängig von der Wellenlänge.
Eine ähnliche Technik kann angewendet werden, wenn die Emission vom Sample sich nach der Wellenlänge der abgegebenen Lumineszenz ändert, und um das abgegebene Licht auf ähnliche Intensität zu bringen (unabhängig von der Wellenlänge), kann die Stromversorgungseinstellung und/oder Dämpfung bezüglich der Erregerlichtquelle von einer Belichtung zur nächsten auch – oder anstatt – so eingestellt werden, dass eine Lumineszenz von im wesentlichen konstanter Intensität gegeben ist, unabhängig von der verwendeten Wellenlänge.
Die Bilderfassungsvorrichtung kann jeden geeigneten lichtempfindlichen Sensor umfassen.
Eine bevorzugte Bilderfassungsvorrichtung ist eine CCD-Kamera. Vorzugsweise wird eine CCD-Kamera gewählt, die ein Bildsignal im Digitalformat, also nicht im Analogformat, produziert.
Wenn die Bilderfassungsvorrichtung eine CCD-Kamera ist, wird sie vorzugsweise gekühlt, um den Signal/Rausch-Abstand der Kameraausgangssignale zu vergrößern.
Alternative Bilderfassungsvorrichtungen, die eingesetzt werden können, sind eine CMOS-Kamera, eine CID-Kamera (Schaltung mit lokaler Ladungsinjektion), eine verstärkte oder gattergesteuerte Kamera, ein Photoelektronenvervielfacher-Array, ein Photodioden-Array oder eine Bilderfassungsvorrichtung mit einem adressierbaren Mikrocolometer-Array oder eine Kamera mit chemischem Film.
Da das der Bilderfassungsvorrichtung präsentierte Licht geeignet ist, ein Bild zu erzeugen, kann das der Bilderfassungsvorrichtung zuzuführende Licht statt dessen (oder auch) auf ein Okular gelenkt werden, das ein Betrachten des Bildes mit dem menschlichen Auge erlaubt, oder auf einen Projektionsapparat, der geeignet ist, das Bild zum Ansehen auf einen Bildschirm zu projizieren.
Der Lichtweg zur Bilderfassungsvorrichtung kann zu diesem Zweck eine Strahlteiler- oder Strahllenkervorrichtung umfassen, mit denen das Licht zwischen der Bilderfassungsvorrichtung und/oder einem Okular und/oder einem Projektionssystem gespaltet (oder geteilt) werden kann.
Eine oder mehrere Bilderfassungsvorrichtungen können verwendet werden, die alle derselbe Gerätetyp sein oder sich von den anderen Gerätetypen unterscheiden können. Wenn mehr als zwei Bilderfassungsvorrichtungen verwendet werden, kann mindestens eine sich im Typ von einer oder mehreren der anderen unterscheiden, und sie können alle unterschiedlich sein.
Kameras können durch Sensoren ersetzt werden.
Wenn eine oder mehrere Bilderfassungsvorrichtungen vorgesehen sind, kann der Lichtweg zu diesen je nach Bedarf ein Strahlteilermittel oder Strahllenkungsmittel umfassen.
Das Licht kann über ein Lichtwellenleiterbündel zu der oder einer Bilderfassungsvorrichtung gesendet werden.
Der Apparat kann ein Datenspeichermittel umfassen, das zum Speichern von Signalen von der Bilderfassungsvorrichtung zur nachfolgenden Analyse durch einen Computer in der Lage ist, oder zum Anzeigen derselben auf einem Bildschirm zur Sichtprüfung oder Analyse eines erzeugten Bildes durch Ablesen der gespeicherten Signale.
Der Apparat kann auch ein Computermittel umfassen, das geeignet ist, die Signale von der Bilderfassungsvorrichtung oder dem Datenspeichermittel zu empfangen, um eine Verarbeitung und Analyse der Bildsignale zu erlauben.
Ein Signalweg zu einer Anzeigevorrichtung von der Bilderfassungsvorrichtung oder dem Computer kann bereit gestellt werden, so dass vor und/oder nach der Verarbeitung ein Bild unter Anwendung der Ausgabe der Bilderfassungsvorrichtung oder der im Speichermittel gespeicherten oder der vom Computer kommenden Daten erzeugt werden kann.
Es ist zu beachten, dass anstatt eines Lasers und eines AOTF oder eines Verschlusses zur Steuerung des Erregerlichts eine Diodenlaserquelle mit eingebauter Strahlsteuerung verwendet werden kann. In diesem Zusammenhang kann die Bezugnahme auf einen Verschluss als Bezugnahme auf das Schalten oder Modulieren einer Diodenlaserquelle betrachtet werden.
Die Erfindung wird nachstehend exemplarisch und unter Bezugnahme auf die begeleitenden Zeichnungen beschrieben.
1 ist ein schematisches Diagramm eines konfokalen Mikroskopsystems;
2 ist ein Systemdiagramm mit Details über firmenspezifische Hardware, die an der computergestützten Steuerung der 1 angeschlossen werden kann, um die Ausführung des Verfahrens der Erfindung zu ermöglichen;
3 ist ein schematisches Diagramm eines AOTF-Laser-Steuerungsystems;
4 ist ein schematisches Blockdiagramm, in dem dargestellt ist, wie das System der 2 durch eine Abfolge unterschiedlicher Maschinenzustände geschaltet wird;
5 ist ein schematisches Blockdiagramm der Steuerelementkarte;
6A-6C sind Wellendiagramme, in denen Steuersignalprotokolle für unterschiedliche Betriebssysteme dargestellt sind;
7 ist ein Zustandsdiagramm eines als Phasenregelschleife bzw. PLL-Schaltung betriebenen Systems;
8A und 8B sind System- und Zustandsdiagramme eines Systems, in dem vom Steuerelement weitere Steuersignale erzeugt werden;
9A und 9b sind System- und Zustandsdiagramme eines Systems, in dem das Auslösen einer Kamera Bestätigungssignale zur Rückkopplung an das Steuerelement auslöst; und
10A und 10B sind System- und Zustandsdiagramme eines Systems, in dem das Steuerelement extern ausgelöst wird oder Eingaben für externe Geräte zulassen kann.
Für eine Beschreibung des Betriebs eines CSU10 konfokalen Abtastsystems wird verwiesen auf den Yokogawa Technical Report Nr. 33 (2002), insbesondere auf 1 bis 3 dieses Reports und die zugehörige Beschreibung.
In 1 kann das konfokale Abtastsystem 10 einen konfokalen Abtaster Yokogawa umfassen (der ein Modell CSU10 oder das neuere Modell CSU21 sein kann), der zur Ansicht eines (nicht dargestellten) Samples auf einem Tisch 12 und zur Zuführung von Licht zu einer Kamera 14 eingestellt ist, um darauf ein Bild aus Fluoreszenz zu erzeugen, die aus der Erregung des Samples durch Laserlicht von einer AOTF Laserquelle 16 stammt.
Ein Steuerelement 18 konvertiert Signale von einem Computer 20 in Steuersignale zur Betätigung oder Steuerung der Elemente 10, 12, 14 und 16 und kann bei Notwendigkeit seinerseits Daten von diesen Elementen auf den Computer 20 übertragen. Die Software 22 ist auf dem Computer geladen dargestellt, wodurch dieser in die Lage versetzt wird, zur Ausführung bestimmter Aufgaben oder zur Steuerung der Elemente 10 bis 16 auf unterschiedliche Weisen instruiert zu werden, abhängig von dem Sample oder dem auszuführenden Experiment. Als Alternative kann unterschiedliche Software geladen werden, je nach Notwendigkeit, so dass das System zur Durchführung unterschiedlicher Aufgaben oder Experimente in der Lage ist.
2 zeigt die unterschiedlichen Elemente proprietärer Hardware, die angeschlossen werden kann, um ein funktionierendes Beispiel des Systems der 1 zu schaffen. Das Steuerelement 18 der 1 besteht aus einer Synchronisierungsschaltung 18' und der Steuerkarte 18'' in 2, und der Computer 20 ist als Dell Dimension GX260 mit Windows 2000 als grundlegendes Betriebssystem mit einem 2.4 GHz Prozessor und 2GB RAM sowie einem WD Caviar^® Laufwerk mit Dualmonitorkarte zum Betrieb von zwei Displaymonitoren 21 und 23 identifiziert.
Das Mikroskop 12 ist normalerweise ein Nikon Eclipse Modell TE300, und wie bezüglich 1 erwähnt, umfasst die konfokale Abtasteinheit ein Yokogawa Modell CSU10 oder CSU21. Die Z-Achsen-Anpassung wird mit Hilfe eines Physik Instrument piezoelektrischen Treibers 22 erreicht, der mit einer eigenen Steuereinheit 24 gesteuert wird, die mit analogen Steuersignalen von 18 versorgt wird.
Die Laser-Erregerlichtquelle ist ein Omnichrome Serie 43 (Wellenlänge 3) Laser von der Melles Griot Laser Group aus Kalifornien, der mit einem AOTF-Kristall und Steuerelement von NEOS (Florida) betrieben wird. Die Lichtintensität des Lasers wird von der Steuerkarte 18'' aus gesteuert, die (wie oben erwähnt) zusammen mit der Synchronisierungseinheit 18' das Steuerelement 18 der 1 ausmacht. Ein Treiber 26 steuert die AOTF-Steuerung 28 für den Laser 16, dessen Stromversorgung unter 30 dargestellt ist.
Die Kamera 14 ist eine Hamamatsu Orca EP CCD-Kamera.
Eine Stromversorgung für den Treiber 26 ist unter Bezugszeichen 32 und eine Stromversorgung und Schnittstelle für die Kamera 14 ist unter Bezugszeichen 34 dargestellt.
Die Synchronisierungsschaltung 18' ist über einen USB-Anschluss 36 mit dem Computer 20 verbunden.
3 zeigt Details des AOTF-Lasers, der einen Argonionenlaser 38 und Zusatzlaser 40 umfasst. Eine AOTF-Kristall 42 steuert die Wellenlänge des über ein Faserbündel 44 und den CSU10-Wellenleiteranschluss abgegebenen Lichts.
Der Kristall 42 wird von einem RF-Signal vom Steuerelement 46 gesteuert, das seinerseits von den TTL und Analogsignalen vom Computer 20 über die Schaltung 18' und den Treiber 26 (vgl. 2) gesteuert wird.
Das Zustandsdiagramm der 4 zeigt, wie das 1-kHz-Taktsignal die unterschiedlichen für das System erforderlichen Arbeitsschritte steuert.
4 ist ein Zustandsdiagramm, das einen Satz von Ausgaberegistern mit den Markierungen Ein/Aus (48), Laserlinie (50), Z-Position (52), Kamera (54) und Head Sync (56); einen Dauer-Abwärtszähler (58); einen Zustandszähler (60) und einen Speicher 62 mit einer Mehrzahl von separaten Bitmustern enthält, wobei jedes Muster einen der erwünschten Maschinenzustände definiert. Die Bit-Ausgaben einiger der Ausgaberegister sind unmittelbar mit den Digitalanschlüssen auf Geräten verbunden, die von solchen Signalen gesteuert werden können, wie die Laserlinie EIN/AUS Wahlsysteme 48, die Kamera-Auslösung und die CSU Synchronisierungseingabe des Abtastscheibensystems. Die digitalen Signale von den Ausgaberegistern 50 und 52 werden von den DACs 64, 66 von digitalen in analoge Signale konvertiert, um Analogsignale an Analoganschlüsse im AOTF-System und den Piezo-Tischantrieb zu senden, der normalerweise den Tisch entlang zweier unterschiedlicher Achsen antreibt.
An den Dauer-Abwärtszähler 58 wird ein Taktsignal, in der Regel von 1 kHz, gesendet.
Typischerweise werden die Zustandsdaten im Hostcomputer 20 gespeichert und vom Hostcomputer aus in den Speicher 62 geladen.
Beim Start wird der Zustandszähler 60 mit der Anzahl der Zustände geladen. Der erste Zustand wird von der ersten Leitung im Speicher 62 zu den Ausgaberegistern 48 bis 56 transportiert, um die Zustände der Geräte einzustellen, die davon mit Steu ersignalen versorgt werden. Die beabsichtigte Dauer des ersten Zustands wird von einem Zustandsdauerspeicher 68 als Zahl in den Zustandsdauer-Abwärtszähler 58 geladen.
Beim nächsten Taktimpuls wird der im Dauerzähler 58 gehaltene numerische Wert um eins verkleinert, und der neue Wert mit Null verglichen. Wenn sie Nicht-Null sind, werden die Zustände der Ausgaberegister 48-56 beibehalten.
Wenn der numerische Wert im Dauerzähler 58 Null erreicht, wird der Zustandszähler 60 um eins getaktet und zeigt nun auf das Bitmuster des nächsten Zustands im Speicher 62. Dieser nächste Zustand wird von 62 auf die Ausgaberegister 48 bis 56 übertragen, um die Zustände der von ihnen gesteuerten Geräte auf die neue Bedingung einzustellen, die für die Maschine erforderlich ist, und die Dauer dieses nächsten Zustands wird von 68 auf den Dauerzähler 58 übertragen, um die Dauer dieses nächsten Zustands zu steuern, der vom Speicher 62 aus jedesmal, wenn der numerische Wert des Dauerzählers 58 Null erreicht, durch den nächsten Zustand ersetzt wird.
Der Systembetrieb schreitet von einem Zustand zum nächsten fort, bis der Zustandszähler 60 auf Null zurück gesetzt ist, wo der Betrieb anhält. An diesem Punkt kann ein Stoppsignal erzeugt werden, und das System kann nach Abgabe dieses Stoppsignals für einen Neustart bereit gemacht werden.
Nachstehend sind Meldungen mit Relevanz für unterschiedliche Operationen/Zustände aufgeführt.
USB Meldungstypen
Abfrage
Diese Meldung ist ein Hilfsmittel im Fall des anfänglichen Fehlens einer USB Anbieter ID. Der USB Master fragt die einzelnen Einheiten ab, um die Typen heraus zu finden.
Der Synchronisator antwortet:
Initialisierung
Diese Meldung wird vor Durchführung irgendwelcher Experimente gesendet, um den Standard-Ausgabezustand und die konfokalen Leitparameter einzustellen.
Z-Achsen-Antrieb
Die Position des Z-Achse-Antriebs ist gegeben durch:
Pz/(100μm/2¹⁶) oder
Pz/(1,526 nm)
wobei Pz die gewünschte Z-Position ist und eine Empfindlichkeit von 10μm/Volt und eine Ausgangsspannungsbereich von 10 Volt angenommen wird. Bis zu 16 Bit stehen für diesen Wert zur Verfügung, doch das beschriebene Ausführungsbeispiel reagiert nur auf die höchstwertigen 12 Bit, was eine Auflösung von 25 nm ergibt.
Sektorzeit-Synchronisation
Sync-Impulszeiten, Anzahl der Sektoren und Kamerabelichtungszeiten sind sämtlich durch die Notwendigkeit beschränkt, dass alle Ereignisse mit den Sektorzeiten synchronisiert werden müssen.
So könnte beispielsweise eine 12-Sektor-Platte folgende Parameter haben.
Die Systeme Yokogawa CSU10 und CSU21 wären im gegenständlichen Konzept auf 3 ms pro Sektor beschränkt.
Kopf- und Fußzeile von Zustandsdaten
Folgende Meldung wird vor (Kopfzeile) und nach (Fußzeile) der Liste der Zustandsdaten gesendet. Alle Zustandsdaten, die bereits gespeichert sind, werden gelöscht, wenn die Kopfzeile empfangen wird. Die Meldung wird ignoriert, wenn der Synchronisator läuft. Die Meldungen werden als Zustandslisten-Kopfzeilen Zustandslisten-Fußzeilen bezeichnet.
Zustandsdaten
Die Zustandsdaten sollten unmittelbar einer Zustandslisten-Kopfzeile folgen. Der Synchronisator wird so eingestellt, dass er prüft, ob die korrekte Anzahl an Zuständen empfangen wird, ehe es zu einer Ausführung kommt.
Experimentsteuerung
Nach dem Herunterladen der Zustandsdaten kann das System gesteuert werden, ein Experiment durchzuführen.
Unmittelbare Daten
Wenn die Erfassung im Livemodus gestartet wird, können die Digitalausgaben, AOTF-Leerung und Z-Schrittschalter nach Wunsch geändert werden. Das Kameraauslöser-Bit (Digitalausgabe-Bit 7) wird in allen unmittelbaren Daten ignoriert.
AOTF/DAC-Steuerung
Diese Meldung wird zur Einstellung der AOTF Kanalleistung verwendet. Es wäre nicht sinnvoll, die AOTF-Pegel während eines Experiments zu ändern, aus Gründen der Einfachheit reagiert der Synchronisator jedoch immer auf sie – dadurch können die Pegel im Livemodus feinabgestimmt werden.
Sample-Inhalt einer Zustandsmaschine
Das System führt einen bestimmten Zustand für 'Zähler'-Taktschläge aus und gibt bei einem bestimmten Wert für diese Zeit eine Beharrung aus.
Wie beschrieben, schafft die Erfindung ein Steuersystem oder einen Synchronisator zur Sequenzierung eines Nipkow-Scheiben-Laserabtastungs-Bilderzeugungssystems mit konfokalem Mikroskop mit Z-Achsenantrieb. Das System erfordert einen Hostcomputer (20) und ein Steuerelement (18) und ist programmierbar zur Ausführung einer großen Vielfalt an Aufgaben und ist über eine Kommunikationsleitung, etwa einen USB-Anschluss, an eine Nipkow-Scheibe mit konfokaler Mikroskop-Hardware anschließbar.
Das Steuerelement (18) kann unter Anwendung eines 8051 Mikrokontrollers, der zur Funktionsweise als Zustandsmaschine gemäß Beschreibung unter Bezugnahme auf 4 programmiert ist, so wie in 5 dargestellt konstruiert sein. Die Einheit (18) umfasst eine Takteingabe 69, die DACs 64 und 66 und die nachstehenden Ausgabeanschlüsse (obwohl zu beachten ist, dass jeder andere geeignete Mikroprozessor oder jedes programmierbare Logikgerät zur Steuerung des Subsystems verwendet werden könnte), namentlich

• USB-Anschluss 70 – ein Anschluss für Konfiguration, Zeitgabe und Versorgung.
• Sync-Ausgabe-Anschluss 72 – variable 0-3 Vpk-pk, programmierbare Hoch- und Tiefperioden in 1-ms-Inkrementen gemäß Beschreibung bezüglich Initialisierung.
• TTL-Ausgabeanschlüsse 74 – 8 Bit für AOTF-Schaltung; 67 mit bis zu 8 Bits für Kamera-Auslösung, Verschlusssteuerung und/oder allgemeine Zwecke; (beispielsweise kann ein Bit für Kameraauslösung vorgesehen sein, der Rest kann asynchron gesteuert werden, wenn im Livemodus); und 72 zur Synchronisierung der Geschwindigkeit der Plattensektoren.
• Analogausgabe von DAC 64 – 8 Kanäle, 0-5 Volt, 8-Bit-Auflösung. Für AOTF-Leistungseinstellung und/oder allgemeinen Gebrauch. Nicht synchronisiert, kann aber asynchron oder synchron gesteuert werden; und
• Eine Analogausgabe von DAC 66 – 0-10 Volt, 12-Bit-Auflösung. Typischerweise auf Geschwindigkeit der Plattensektoren synchronisiert, kann aber asynchron gesteuert werden, wenn in Livemodus.

In den Diagrammen für Steuersignalprotokolle der 6A, 6B und 6C sind die Werte der Steuersignale für ein typisches System dargestellt, wie mit Bezug auf 2-5 beschrieben.
Das Auslöse/Aktivierungs-Signal steuert die Aktivierung der Kamera, die zwischen den Zuständen aktiv "ein" und inaktiv "aus" alterniert.
Das "Ende Scan Sync" zeigt das Ende der Nadelloch-Abtastsequenz in Entsprechung zu einer vollständigen Scheibenrotation an, wobei jede Scheibe aus einer Anzahl von Sektoren besteht.
"Auswahl Wellenlänge" verweist auf die unterschiedlichen Wellenlängen, die zur Erregung ausgewählt werden.
"Stromversorgungspegel" zeigt an, ob die Stromversorgung EIN oder AUS ist. Wird normalerweise von AUS auf den Nennstromversorgungswert "p" geschaltet.
Die Wellenform "Z Position" der 6A zeigt an, wie das Steuersignal, das die unterschiedlichen Sample-Abtastebenen in der Z-Achse festlegt, in Schritten von Z1 bis Z2 und Z3 ansteigen kann, bevor es- in eine Position Z0 zurück kehrt, bereit für die nächste Abtastsequenz, während die Wellenlänge konstant bleibt.
In 6B steigt das Z-Position-Festlegungssignal mit konstanter Rate von Z0 auf einen Maximalwert für Z (d.h. X3) an und reduziert dann rasch den Wert zurück auf X0, bereit für die nächste Abtastung.
6C zeigt, wie das Z-Positionssignal während zweier aufeinanderfolgender Abtastungen zwischen Z1 und Z3 variiert, während deren jeder die Wellenlänge in einem Strom-AUS-Intervall von X1 auf X2 geändert wird.
7 zeigt die Zustände eines Systems, wie das der 2-5, wenn es als Phasenregelkreis um die natürliche Frequenz des Scheibenrotationsimpulses betrieben wird, wobei die Scheibenrotationsgeschwindigkeit vom CSU Steuerelement eingestellt wird. In diesem System wird das Verhältnis des Takts zum Zähler von der tatsächlichen Rate der Scheibenrotation bestimmt. Scheiben-Sync-Signale (Disk Sync) werden an einen Phasenregelkreis-Taktgeber 76 abgegeben, der den Dauerzähler 58 anstatt des 1-KHz-Taktgebers der 4 steuert.
8A und 8B betreffen eine Alternativanordnung, in der weitere Steuersignale vom Steuerelement 18 und dem Mikroskop 12 für andere Steuerfunktionen abgegeben werden, wie Tisch- und Objektivsteuerung, wie vom Bestätigungssignalweg 78 abgebildet.
9A und 9B betreffen andere Modifikationen des Systems der 2-5, in dem weitere Steuersignale von der Kamera 14 zum Steuerelement 18 gehen, um die Auslösung zu bestätigen, wie beispielsweise ein Bestätigungssignal am Weg 80.
10A und 10B zeigen, wie das Steuerelement 18 extern ausgelöst werden oder eine Aktivierungseingabe von einem äußeren Gerät auf dem Weg 82 empfangen kann.

Claims

Apparat, mit dem das von einem Probestück abgegebene Licht von einer Bilderfassungsvorrichtung abgebildet wird, um ein Videosignal zur Erzeugung eines Bildes in einer Anzeigevorrichtung oder zur Verarbeitung und Analyse zu produzieren, Folgendes umfassend: – Mittel (12) zur Anbringung des Probestücks, – eine Lichtquelle (16) zur Erzeugung von Erregerlicht, – ein konfokales Abtastsystem (10), das geeignet ist, Erregerlicht in eine Richtung auf einen Bereich des Probestücks zu lenken und diesen damit abzutasten, und das zudem geeignet ist, vom Probestück infolge des darauf einfallenden Erregerlichts abgegebenes Licht in eine andere Richtung zu transportieren, das im – typischerweise wiederholten – Gebrauch dazu dient, einen interessanten Bereich des Probestücks abzutasten, – eine Bilderfassungsvorrichtung (14) mit diskreten, räumlich abgesetzten lichtempfindlichen Bereichen, auf denen Licht, das vom Probestück abgegeben wird, fokussiert wird, um ein Bild auszubilden, nachdem es durch das Abtastsystem in die andere Richtung transportiert worden ist, und – Steuermittel, die einen Hostcomputer (20) und ein Steuerelement (18) umfassen, wobei das Steuerelement geeignet ist, das konfokale Abtastsystem (10) zu steuern, dadurch gekennzeichnet, dass – das Steuerelement so programmiert ist, dass es als Zustandsmaschine funktioniert und geeignet ist, die Erregerlichtquelle und/oder die Bilderfassungsvorrichtung zu steuern, so dass Licht vom Probestück nur während einer spezifischen Zeitperiode auf die Bilderfassungsvorrichtung fällt, gleich der Zeit, die das Abtastsystem benötigt, den interessanten Bereich n Mal abzutasten, wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist.
Apparat nach Anspruch 1, des weiteren ein Verschlussmittel umfassend, das im Gebrauch durch Signale vom Steuermittel betätigt wird, um Licht von der Erregerquelle zu unterbrechen, ausgenommen wenn das Probestück beleuchtet werden soll, wobei das Verschlussmittel ein akusto-optisches Element umfasst.
Apparat nach Anspruch 2, des weiteren ein zweites Verschlussmittel zwischen dem Abtastsystem und der Bilderfassungsvorrichtung umfassend, welches zweite Verschlussmittel durch Signale vom Steuermittel betätigt wird, so dass im Gebrauch das Licht daran gehindert wird, zumindest einen Teil des Sensors der Bilderfassungsvorrichtung zu erreichen, ausgenommen in den bestimmten Zeitperioden, in denen Erregerlicht auf das Probestück fällt, um Fehler zu reduzieren, die sich aufgrund von Licht ereignen könnten, das aus Phosphoreszenz, Nachleuchten, Streureflexionen oder anderen Effekten entsteht und auf die Erfassungsvorrichtung trifft.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, der des weiteren Antriebsmittel umfasst, die geeignet sind, das Probestück, das Abtastsystem oder ein Element eines optischen Systems im Abtastsystem an einer linearen Achse (der Z-Achse) so zu bewegen, dass im Gebrauch die Position der Ebene im Verhältnis zum Probestück angepasst werden kann.
Apparat nach Anspruch 4, wobei das Steuersystem im Gebrauch so funktioniert, dass die Bewegung entlang der linearen Achse auf Perioden beschränkt ist, während deren Licht daran gehindert wird, die Bilderfassungsvorrichtung zu erreichen.
Apparat nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Steuersystem so eingesetzt werden kann, dass es eine Bewegung entlang der linearen Achse nur während Perioden produziert, in denen das Erregerquellenlicht gehemmt oder am Erreichen des Probestücks gehindert wird.
Apparat nach Anspruch 4, wobei die lineare Achsbewegung des Probestücks oder des Abtastsystems oder eines Elements hiervon kontinuierlich ist und wobei der Apparat des weiteren Mittel umfasst, mit denen eine Dekonvolution ausgeführt wird, um das Bild an der Bilderfassungsvorrichtung oder ein von Signalen von der Bilderfassungsvorrichtung erzeugtes Bild, das andernfalls aufgrund der kontinuierlichen Bewegung verzerrt ist, nachzuschärfen.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei im Gebrauch die Wellenlänge des Erregerlichts von einer Belichtung zur nächsten variieren muss und der Apparat zwei oder mehr Erregerlichtquellen besitzt, die jeweils Erregerlicht unterschiedlicher Wellenlängen von der anderen oder allen anderen Quellen erzeugen, und wobei das Steuermittel im Gebrauch geeignet ist, die Quelle auszuwählen, um Licht passender Wellenlänge für die einzelnen Belichtungen zur Verfügung zu stellen.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei im Gebrauch die Wellenlänge des Erregerlichts von einer Belichtung zur nächsten variieren muss, der Apparat eine einzelne Erregerlichtquelle umfasst, die so angepasst werden kann, dass sie Licht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt, und wobei das Steuermittel geeignet ist, die Quelle so anzupassen, dass sie Licht mit der erforderlichen Wellenlänge für jede einzelne Belichtung erzeugt.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Erregerlichtquelle so betätigt werden kann, dass sie gleichzeitig Licht von mehr als einer Wellenlänge erzeugen kann.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine einzelne Erregerlichtquelle eingesetzt wird, die Wellenlänge bzw. Wellerlängen des davon abgestrahlten Lichts geändert werden können und das Steuermittel geeignet ist, die Quelle so anzupassen, dass sie Licht einer gewünschten Wellenlänge oder Wellenlängen erzeugen kann, wobei die Lichtquelle eine Laserlichtquelle ist, die einen akusto-optischen Filterkristall (AOTF) umfasst, und wobei das Steuermittel geeignet ist, Signale abzugeben, um das Frequenzsteuerungssignal zum Kristall zu ändern, um die Wellenlänge (oder die Wellenlängen) des abgegebenen Lichts zu steuern.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Erregerlichtquelle so betätigt werden kann, dass sie Lichtimpulse erzeugt.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Erregerlichtstärke mittels eines Dämpfungselements gesteuert wird und das Steuermittel geeignet ist, im Gebrauch das Dämpfungselement nach Bedarf zu steuern oder zu positionieren.
Apparat nach Anspruch 13, wobei das Dämpfungselement ein AOTF- oder LCD-Verschluss ist.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Steuermittel geeignet ist, die Intensität der Beleuchtung zu ändern, um am Probestück für jede Wellenlänge eine bestimmte Beleuchtungsstärke zu schaffen, um die Intensitätsvariationen von einer Wellenlänge zur anderen zu entfernen, die aufgrund der inhärenten Intensitätsvariation zwischen einer Quelle und einer anderen oder zwischen unterschiedlichen Betriebsmodi der Erregerlichtquelle stattfinden kann.
Apparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Steuermittel geeignet ist, von einer Belichtung zur nächsten die Leistung zur Erregerlichtquelle anzupassen und/oder die Dämpfung des Lichts von dieser zu steuern, um eine Lumineszenz mit im wesentlichen konstanter Intensität zu schaffen, die durch die unterschiedlichen Wellenlängen des Erregerlichts bedingte Variation in der Intensität des auf den Sensor der Bilderfassungsvorrichtung fallenden Lichts zu reduzieren oder das aufgrund von Lumineszenz gleicher Intensität abgegebene Licht unabhängig von der Wellenlänge zu machen, oder beides.
Methode der Bilderzeugung aus dem Licht von einem Probestück unter Verwendung des Apparats, bei der das Erregerlicht über ein konfokales Abtastsystem (10) zum Probestück gelangt und das von der Lumineszenz des Probestücks abgegebene Licht über das Abtastsystem in eine andere Richtung zu einer Bilderfassungsvorrichtung (14) geht, die einen Sensor aufweist, der diskrete, räumlich abgesetzte lichtempfindliche Bereiche besitzt, und wobei das Abtastsystem so betätigt wird, dass es die Gesamtheit eines interessanten Bereichs des Probestücks abtastet und der Apparat Steuermittel besitzt, die einen Hostcomputer (20) und ein Steuerelement (18) umfassen, wobei das Steuermittel so programmiert wird, dass es als Zustandsmaschine funktioniert und wobei das Abtastsystem und das Erregerlicht und/oder die Bilderfassungsvorrichtung vom Steuerelement gesteuert werden, so dass das vom Probestück ausgehende Licht nur eine bestimmte Dauer auf den Sensor der Bilderfassungsvorrichtung fällt, welche der Zeit entspricht, die zum n-maligen Abtasten des gesamten interessanten Bereichs erforderlich ist, wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist.
Methode nach Anspruch 17, wobei Verschlussmittel vorgesehen sind, die das Licht, welches zumindest einen Teil des Sensors der Bilderfassungsvorrichtung erreicht, ausgenommen in den bestimmten Zeitperioden, in denen das Erregerlicht auf das Probestück fällt, daran zu hindern, den Sensor der Bilderfassungsvorrichtung zu erreichen, um Fehler zu reduzieren, die sich aufgrund von Licht ereignen können, das aus Phosphoreszenz, Nachleuchten, Streureflexionen oder anderen Effekten entsteht.
Methode nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei das Probestück zumindest teilweise transparent ist und eine Mehrzahl von Bildern durch Abtasten des Probestücks in einer Mehrzahl unterschiedlicher, beabstandeter Ebenen geschaffen wird.
Methode nach Anspruch 19, wobei die unterschiedlichen Ebenen durch relative Bewegungen zwischen dem Probestück und einer Abtastvorrichtung erzeugt werden, die einen Teil des Abtastsystems bildet.
Methode nach Anspruch 19, wobei die unterschiedlichen Ebenen durch die Bewegung zumindest eines Teils eines optischen Systems erzeugt wird, das einen Teil des Abtastsystems ausmacht, so dass Licht im Probestück an unterschiedlichen beabstandeten Punkten zu einem Brennpunkt gebracht wird, wobei jeder Punkt folglich die Position einer fokalen Ebene des Abtastsystems begrenzt.
Methode nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, wobei die Bewegung auf Perioden beschränkt ist, während deren kein Erregerlicht auf das Probestück fällt.
Methode nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, wobei die Bewegung auf Perioden beschränkt ist, während deren die Bilderfassungsvorrichtung lichtunempfindlich gemacht ist.
Methode nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, wobei die Bewegung kontinuierlich ist, um das Abtasten eines Probestücks zu beschleunigen.
Methode nach Anspruch 24, wobei die kontinuierliche Bewegung während der Bilderzeugung ein Verzerren des Bildes auslöst und die Methode den Schritt einer Dekonvolution zum Nachschärfen des Bildes umfasst.
Methode nach einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei das Erregerlicht aus Licht mit zwei oder mehr unterschiedlichen Wellenlängen zusammengesetzt ist.
Methode nach Anspruch 26, wobei eine einzige Erregerlichtquelle eingesetzt wird, die einen akusto-optischen Filterkristall (AOTF) umfasst, und die Wellenlänge des abgegebenen Lichts durch Ändern des Frequenzsteuersignals zum Kristall nach Bedarf variiert wird.
Methode nach einem der Ansprüche 17 bis 27, wobei das Erregerlicht gepulst ist.
Methode nach einem der Ansprüche 17 bis 28, wobei die Intensität des einfallenden Erregerlichts von einer Belichtung zur nächsten angepasst wird, indem neutrale Dichtefilter eingesetzt werden oder eine Irisblende im Lichtweg geöffnet oder geschlossen wird, um die Leistung zur Lichtquelle anzupassen, oder durch Anwendung eines Dämpfungselements wie eines AOTF- oder LCD-Verschlusses, oder eine Kombination daraus.
Methode nach einem der Ansprüche 17 bis 29, wobei das Probestück durch Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen beleuchtet wird und die Intensität so eingestellt wird, dass für jede Wellenlänge ein bestimmter Grad an Erregungsintensität am Probestück erzeugt wird.
Methode nach Anspruch 30, wobei die Einstellung am Probestück ein im wesentlichen gleiches Intensitätsniveau für alle unterschiedlichen Wellenlängen erzeugt.