DE69133513T2 - Verfahren zur Verwendung von Nukleinsäureliganden - Google Patents

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Description

  • Diese Forschungsarbeit wurde durch eine finanzielle Unterstützung von der Regierung der Vereinigten Staaten, bereitgestellt von den National Institutes of Health, gefördert. Die US-Regierung hat somit bestimmte Rechte an dieser Erfindung inne.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder beschreiben hierin eine neue Gruppe von hochaffinen Nucleinsäureliganden, die sich spezifisch an ein erwünschtes Targetmolekül binden. Ein Verfahren wird zur Selektion eines Nucleinsäureliganden präsentiert, der jegliches erwünschte Targetmolekül spezifisch bindet. Das Verfahren wird als SELEX bezeichnet, ein Akronym für Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (Systematische Entwicklung von Liganden durch exponentielle Anreicherung). Das Verfahren der Erfindung (SELEX) ist nützlich, um einen Nucleinsäureliganden für ein erwünschtes Targetmolekül zu isolieren. Die Nucleinsäureprodukte der Erfindung sind für jeglichen Zweck geeignet, bei dem eine Bindungsreaktion eingesetzt werden kann, beispielsweise in Testverfahren, Diagnoseverfahren, Zellsortieren, als Inhibitoren von Targetmolekülfunktion, als Sonden, als Sequestrationsmittel und dergleichen. Darüber hinaus können die Nucleinsäureprodukte der Erfindung katalytische Aktivität aufweisen. Targetmoleküle umfassen neutrale und synthetische Polymere einschließlich Proteine, Polysaccharide, Glykoproteine, Hormone, Rezeptoren und Zelloberflächen und kleine Moleküle wie Wirkstoffe, Metabolite, Co-Faktoren, Übergangszustand-Analoga und Toxine.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die meisten Proteine oder kleinen Moleküle sind nicht dafür bekannt, sich spezifisch an Nucleinsäuren zu binden. Die bekannten Proteinausnahmen sind jene Regulationsproteine wie Repressoren, Polymerasen, Aktivatoren und dergleichen, die in einer Lebendzelle funktionieren, um den Transfer von genetischer Information, die in den Nucleinsäuren kodiert sind, in Zellstrukturen und die Replikation des genetischen Materials zu bewirken. Weiters binden sich kleine Moleküle wie GTP an manche Intron-RNAs.
  • Lebende Materie entwickelte sich so, dass die Funktion von Nucleinsäuren auf eine weitgehend informative Rolle eingeschränkt wurde. Das Zentrale Dogma von Crick schlägt, sowohl in der ursprünglichen als auch der erweiterten Version, vor, dass Nucleinsäuren (entweder RNA oder DNA) als Matrices für die Synthese anderer Nucleinsäuren über replikative Prozesse, die die Information in einer Matrix-Nucleinsäure „lesen" und somit komplementäre Nucleinsäuren ergeben, dienen können. Sämtliche experimentelle Paradigma im Bereich Genetik und Genexpression hängen von diesen Eigenschaften von Nucleinsäuren ab: im Wesentlichen sind doppelsträngige Nucleinsäuren bezüglich ihrer Information aufgrund des chemischen Konzepts von Basenpaaren und auch, da Replikationsprozesse in der Lage sind, diese Basenpaarung in einer relativ fehlerfreien Weise zu verwenden, redundant.
  • Die einzelnen Komponenten von Proteinen, die zwanzig natürlichen Aminosäuren, besitzen ausreichende chemische Unterschiede und Aktivitäten, um eine enorme Bandbreite an Aktivitäten sowohl für Bindung als auch für Katalyse bereitzustellen. Von Nucleinsäuren wird jedoch angenommen, dass sie enger gefasste chemische Möglichkeiten als Proteine aufweisen, jedoch auch eine Informationsrolle spielen, die es genetischer Information ermöglicht, von Virus zu Virus, Zelle zu Zelle und Organismus zu Organismus übertragen zu werden. In diesem Zusammenhang müssen Nucleinsäurekomponenten, die Nucleotide, nur Oberflächenpaare aufweisen, die Informationsredundanz innerhalb eines Watson-Crick-Basenpaars ermöglicht. Nucleinsäurekomponenten müssen keine chemischen Unterschiede und Aktivitäten aufweisen, die entweder für einen breiten Bereich von Bindung oder Katalyse ausreichend sind.
  • Manche Nucleinsäuren jedoch, die in der Natur zu finden sind, nehmen an der Bindung an bestimmte Targetmoleküle teil, und es wurde sogar von einigen wenigen Fällen von Katalyse berichtet. Der Aktivitätsbereich dieser Art ist im Vergleich zu Proteinen und insbesondere Antikörpern eng gefasst. Wo zum Beispiel Nucleinsäuren dafür bekannt sind, sich an manche Proteintargets mit hoher Affinität und Spezifität zu binden, hängt die Bindung von den exakten Nucleotidsequenzen ab, die den DNA- oder RNA-Liganden einschließen. Somit sind kurze doppelsträngige DNA-Sequenzen bekannt dafür, sich an Targetproteine zu binden, die die Transkription sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten unterdrücken oder aktivieren. Andere kurze doppelsträngige DNA-Sequenzen sind dafür bekannt, sich an Restriktionsendonucleasen zu binden, Proteintargets, die mit hoher Affinität und Spezifität selektiert werden können. Andere kurze DNA-Sequenzen dienen als Centromere und Telomere an Chromosomen, vermutlich durch Schaffen von Liganden für die Bindung spezifischer Proteine, die an der Chromosomenmechanik teilnehmen. Somit weist doppelsträngige DNA eine durchwegs bekannte Fähigkeit auf, sich innerhalb der Ecken und Ritzen von Targetproteinen zu binden, deren Funktionen auf DNA-Bindung ausgerichtet sind. Einzelsträngige DNA kann sich auch an manche Proteine mit hoher Affinität und Spezifität binden, wenn auch die Zahl der Beispiele hierzu eher gering ist. Aufgrund der bekannten Beispiele von doppelsträngigen DNA-Bindungsproteinen wurde es möglich, die Bindungswechselwirkungen als solche zu beschreiben, die verschiedene Proteinmotive einbinden, die Aminosäurenseitenketten aufweisen, die in die große Furche von doppelsträngiger B-Form-DNA vorstehen, was die Sequenzprüfung liefert, die Spezifität ermöglicht.
  • Doppelsträngige RNA dient gegebenenfalls als ein Ligand für bestimmte Proteine, beispielsweise die Endonuclease RNase III aus E. coli. Es gibt bekanntere Fälle von Targetproteinen, die sich an einzelsträngige RNA-Liganden binden, obwohl in diesen Fällen die einzelsträngige RNA häufig eine komplexe dreidimensionale Form annimmt, die lokale Regionen von intramolekularer Doppelsträngigkeit umfasst. Die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen binden sich eng an tRNA-Moleküle mit hoher Spezifität. Eine kurze Region innerhalb der Genome von RNA-Viren bindet sich fest und mit hoher Spezifität an die Virushüllenproteine. Eine kurze Sequenz von RNA bindet sich an die Bakteriophagen-T4-kodierte DNA-Polymerase, wiederum mit hoher Affinität und Spezifität. Somit ist es möglich, RNA- und DNA-Liganden, entweder doppel- oder einzelsträngig, zu finden, die als Bindungspartner für spezifische Proteintargets dienen. Die meisten bekannten DNA-Bindungsproteine binden sich spezifisch an doppelsträngige DNA, während die meisten RNA-Bindungsproteine einzelsträngige RNA erkennen. Diese statistische Vorgabe in der Literatur spiegelt zweifellos die vorliegende statistische Prädisposition der Biosphäre wider, DNA als ein doppelsträngiges Genom und RNA als eine einzelsträngige Einheit in den zahlreichen Rollen, die RNA über jene des Genoms hinaus spielt, zu verwenden. Chemisch gibt es keinen wichtigen Grund, einzelsträngige DNA als einen völlig fähigen Partner für spezifische Proteinwechselwirkungen fallen zu lassen.
  • Für RNA und DNA wurde auch erkannt, dass sie sich beide an kleinere Targetmoleküle binden. Doppelsträngige DNA bindet sich an verschiedene Antibiotika, wie Actinomycin D. Eine spezifische einzelsträngige RNA bindet sich an das Antibiotikum Thiostrepton; spezifische RNA-Sequenzen und -Strukturen binden sich vermutlich an bestimmte andere Antibiotika, insbesondere jene, deren Funktionen die Inaktivierung von Ribosomen in einem Targetorganismus ist. Eine Familie von evolutionär verwandten RNAs bindet sich mit Spezifität und dezenter Affinität an Nucleotide und Nucleoside (B. Bass & T. Cech, Nature 308, 820–826 (1984)) sowie an eine der zwanzig Aminosäuren (M. Yarus, Science 240, 1751–1758 (1984)). Katalytische RNAs sind nun auch bekannt, wenn auch diese Moleküle über einen eng gefassten Bereich chemischer Möglichkeiten Leistung zeigen und somit größtenteils mit Phosphodiestertransfer-Reaktionen und Hydrolyse von Nucleinsäuren entfernt zusammenhängen.
  • Trotz dieser bekannten Beispiele wird von der großen Mehrheit von Proteinen und anderen Zellkomponenten angenommen, dass sie sich an Nucleinsäuren unter physiologischen Bedingungen binden und dass solche Bindung, die beobachtet werden kann, nicht spezifisch ist. Entweder ist die Fähigkeit von Nucleinsäuren, sich an andere Verbindungen zu binden, auf die relativ wenigen Fälle, die zuvor genannt wurden, eingeschränkt, oder das chemische Repertoire der Nucleinsäuren für spezifische Bindung wird in den Strukturen, die in der Natur vorkommen, vermieden (es wird dagegen selektiert). Die vorliegende Erfindung basiert auf der grundlegenden Erkenntnis der Erfinder, dass Nucleinsäuren als chemische Verbindungen eine praktisch uneingeschränkte Reihe an Formen, Größen und Konfigurationen bilden kön nen und in der Lage sind, ein weit größeres Repertoire an Bindungs- und Katalysefunktionen aufzuweisen als jene, die in biologischen Systemen vorhanden sind.
  • Die chemischen Wechselwirkungen wurden in Fällen bestimmter bekannter Beispiele von Protein-Nucleinsäure-Bindung untersucht. Die Größe und Sequenz der RNA-Stelle von Bakteriophagen-R17-Hüllprotein-Bindung beispielsweise wurde von Uhlenbeck und Mitarbeitern identifiziert. Die minimale natürliche RNA-Bindungsstelle (21 Basen lang) für das R17-Hüllprotein wurde durch Untersuchen von markierten Fragmenten der mRNA variabler Größe durch Nitrocellulosefilter-Bindungstests, in denen Protein-RNA-Fragment-Komplexe an den Filter gebunden bleiben, bestimmt (Carey et al., Biochemistry 22, 2601 (1983)). Zahlreiche Sequenzvarianten der minimalen R17-Hüllproteinbindungsstelle wurden in vitro geschaffen, um die Beteiligung einzelner Nucleinsäuren an Proteinbindung zu bestimmen (Uhlenbeck et al., J. Biomol. Structure Dynamics 1, 539 (1983); und Romaniuk et al., Biochemistry 26, 1563 (1987)). Es wurde erkannt, dass die Erhaltung der Haarnadelschleifenstruktur der Bindungsstelle für Proteinbindung wesentlich war, darüber hinaus wurde jedoch auch erkannt, dass Nucleotidsubstitutionen an den meisten der einzelsträngigen Reste in der Bindungsstelle, einschließlich eines ausgeweiteten Nucleotids im Haarnadelstamm, die Bindung signifikant beeinflussten. In ähnlichen Studien wurde die Bindung von Bakteriophagen-Qβ-Hüllprotein an seinen translationalen Operator untersucht (Witherell & Uhlenbeck, Biochemistry 28, 71 (1989)). Die Qβ-Hüllprotein-RNA-Bindungsstelle wurde als eine erkannt, die jener von R17 bezüglich Größe und der vorhergesagten Sekundärstruktur darin ähnlich war, dass sie etwa 20 Basen mit einer 8-Basenpaar-Haarnadelstruktur, die ein ausgeweitetes Nucleotid und eine 3-Basen-Schleife einband, umfasste. Im Gegensatz zur R17-Hüllprotein-Bindungsstelle ist nur einer der einzelsträngigen Reste der Schleife für Bindung wesentlich, und die Gegenwart des ausgeweiteten Nucleotids ist nicht erforderlich. Die Protein-RNA-Bindungswechselwirkungen, die in translationale Regulation eingebunden sind, zeigen signifikante Spezifität.
  • Nucleinsäuren sind dafür bekannt, Sekundär- und Tertiärstrukturen in Lösung zu bilden. Die doppelsträngigen Formen von DNA umfassen die so genannte B-doppelhelikale Form, Z-DNA und Superhelixwindungen (A. Rich et al., Ann. Rev. Biochem. 53, 791–846 (1984)). Einzelsträngige RNA-Formen lokalisierten Regionen der Sekundärstruktur wie Haarnadelschleifen und Pseudoknotenstrukturen (P. Schimmel, Cell 58, 9–12 (1989)). Wenig ist jedoch bezüglich der Wirkungen von ungepaarten Schleifen-Nucleotiden auf die Stabilität von Schleifenstruktur, die Bildungs- und Denaturierungskinetik und Thermodynamik bekannt, und beinahe nichts ist von Tertiärstrukturen und dreidimensionaler Form oder von der Kinetik und Thermodynamik von Tertiärfaltung in Nucleinsäuren bekannt (C. Tuerk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1364–1368 (1988)).
  • Von einem Typ von In-vitro-Entwicklung wurde bei der Replikation des RNA-Bakteriophagen Qβ berichtet. D.R. Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58, 217–224 (1967); R. Levinsohn & S. Spiegelman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 866–872 (1968); R. Levisohn & S. Spiegelman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 805–811 (1969); R. Saffhill et al., J. Mol. Biol. 51, 531–539 (1970); D.L. Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3038–3042 (1972); D.R. Mills et al., Science 180, 916–927 (1973). Die Phagen-RNA dient als eine poly-cistronische Messenger-RNA, die Translation von phagenspezifischen Proteinen steuert, und auch als eine Matrix für ihre eigene, durch Qβ-RNA-Replikase katalysierte Replikation. Für diese RNA-Replikase wurde gezeigt, dass sie für ihre eigenen RNA-Matrices hoch spezifisch ist. Während des Ablaufs der Replikationszyklen in vitro wurden kleine RNA-Varianten isoliert, die auch durch Qβ-Replikase repliziert wurden. Geringe Veränderungen der Bedingungen, unter denen die Replikationszyklen durchgeführt wurden, resultierten, wie erkannt wurde, in der Akkumulierung verschiedener RNAs, wahrscheinlich, weil ihre Replikation unter den geänderten Bedingungen begünstigt war. In diesen Versuchen musste die selektierte RNA wirksam durch die Replikase gebunden werden, um Replikation zu initiieren, und musste als eine kinetisch begünstigte Matrix während der Verlängerung von RNA dienen. Kramer et al., J. Mol. Biol. 89, 719 (1974), berichteten von der Isolierung einer mutierten RNA-Matrix von Qβ-Replikase, deren Repli kation gegenüber Inhibierung durch Ethidiumbromid resistenter war als die natürliche Matrix. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Mutante in der anfänglichen RNA-Population nicht vorhanden war, jedoch durch sequenzielle Mutation während der Zyklen von In-vitro-Replikation mit Qβ-Replikase gebildet wurde. Die einzige Quelle für Variationen während der Selektion war die Grundfehlerhäufigkeit während der Verlängerung durch Qβ-Replikase. In diesen Untersuchungen trat das, was als „Selektion" bezeichnet wurde, durch präferenzielle Amplifikation von einer oder mehreren einer eingeschränkten Anzahl an spontanen Varianten einer anfänglich homogenen RNA-Sequenz auf. Es gab keine Selektion eines erwünschten Resultats, nur jene, die der Wirkungsweise von Qβ-Replikase zueigen war.
  • Joyce & Robertson (Joyce, in: RNA: Catalysis, Splicing, Evolution, Belfort & Shub (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam, 83–87 (1989); und Robertson & Joyce, Nature 344, 467 (1990)) berichteten von einem Verfahren zur Identifikation von RNAs, die einzelsträngige DNA spezifisch spalten. Die Selektion auf katalytische Aktivität basierte auf der Fähigkeit des Ribozyms, die Spaltung einer Substrat-ssRNA oder -DNA an einer spezifischen Position und den Transfer des 3'-Endes des Substrats zum 3'-Ende des Ribozyms zu katalysieren. Das Produkt der erwünschten Reaktion wurde unter Verwendung eines Oligodesoxynucleotidprimers selektiert, der sich nur an das vollständige Produkt über die Verbindung, die durch die katalytische Reaktion gebildet wurde, hinweg binden konnte und selektive reverse Transkription der Ribozymsequenz ermöglichte. Die selektierten katalytischen Sequenzen wurden durch Bindung des Promotors von T7-RNA-Polymerase an das 3'-Ende der cDNA, gefolgt von Transkription zu RNA, amplifiziert. Das Verfahren wurde verwendet, um aus einer geringen Anzahl an Ribozymvarianten die Variante zu identifizieren, die für die Spaltung eines selektierten Substrats am stärksten reaktiv war. Nur eine eingeschränkte Reihe von Varianten konnte getestet werden, da Variation von einzelnen Nucleotidänderungen, die während der Amplifikation auftraten, abhing.
  • Oliphant et al. (Molecular and Cellular Biology, 2944–2949 (Juli 1989)) beschreiben ein Verfahren zur Definition der Sequenzerkennungseigenschaften von doppelsträn gigen DNA-Bindungsproteinen durch Selektieren hochaffiner Bindungsstellen aus Zufallssequenz-DNA. Insbesondere untersuchten sie das Hefe-Transkriptionsaktivatorprotein GCN4.
  • Thiesen & Bach (Nucleic Acids Research, Bd. 18, Nr. 11, 3203–3209) beschreiben ein Verfahren, das als Target Detection Assay (TDA) bezeichnet wird, um DNA-Bindungsstellen für mutmaßliche doppelsträngige DNA-Bindungsproteine zu bestimmen.
  • Im Stand der Technik wurde bis heute nicht mehr als ein eingeschränkter Bereich chemischer Funktionen für Nucleinsäuren in ihren Wechselwirkungen mit anderen Substanzen gelehrt oder vorgeschlagen: als Targets für Proteinliganden, die in die Bindung bestimmter spezifischer Oligonucleotidsequenzen eingebunden sind; und in jüngerer Vergangenheit als Katalysatoren mit einem eingeschränkten Aktivitätsbereich. Frühere „Selektions"-Verfahren waren auf einen engen Bereich von Varianten einer bereits davor beschriebenen Funktion eingeschränkt. Nun wird das erste Mal verstanden, dass die Nucleinsäuren in der Lage sind, enorm viele Funktionen auszuüben, und die Methodik zur Realisierung dieser Fähigkeit ist hierin offenbart.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft nur das Verfahren, das die spezifische Bindung in vitro von einem Nucleinsäureliganden an ein Targetmolekül, wie es in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist, umfasst. Es betrifft auch die Verwendung eines Nucleinsäureliganden wie in den Ansprüchen definiert.
  • Das vorliegende Patent beschreibt auch eine Gruppe von Produkten, die Nucleinsäuremoleküle sind, wobei jedes eine einmalige Sequenz aufweist, die jeweils die Eigenschaft besitzt, sich spezifisch an eine erwünschte Targetverbindung oder ein Targetmolekül zu binden. Jede beschriebene Verbindung ist ein spezifischer Ligand eines bestimmten Targetmoleküls. Die Erfindung basiert auf der einmaligen Erkenntnis, dass Nucleinsäuren über ausreichende Kapazität verfügen, um zahlreiche ver schiedene zwei- und dreidimensionale Strukturen zu bilden, und über ausreichende chemische Vielseitigkeit verfügen, die innerhalb ihrer Monomere vorhanden ist, um mit praktisch jeglicher chemischen Verbindung, unabhängig davon, ob monomer oder polymer, als Liganden zu wirken (spezifische Bindungspaare zu bilden). Moleküle jeglicher Größe können als Targets dienen. Am üblichsten, und bevorzugt, für therapeutische Anwendungen findet Bindung in wässriger Lösung unter Bedingungen in Hinblick auf Salz, Temperatur und pH, die in der Nähe der annehmbaren physiologischen Grenzen liegen, statt.
  • Ebenfalls wird ein Verfahren beschrieben, das im Allgemeinen einsetzbar ist, um einen Nucleinsäureliganden für jegliches erwünschte Target zu bilden. Das Verfahren umfasst die Selektion aus einem Gemisch von Kandidaten und schrittweise Wiederholungen struktureller Verbesserung unter Verwendung desselben allgemeinen Selektionsthemas, um praktisch jegliches erwünschte Kriterium von Bindungsaffinität und -selektivität zu erreichen. Ausgehend von einem Gemisch von Nucleinsäuren, die vorzugsweise ein Segment einer randomisierten Sequenz umfassen, umfasst das Verfahren, das hierin als SELEX bezeichnet wird, Schritte des Kontaktierens des Gemisches mit dem Target unter Bedingungen, die für Bindung günstig sind, des Abtrennens von nicht gebundenen Nucleinsäuren von jenen Nucleinsäuren, die sich an Targetmoleküle banden, des Dissoziierens der Nucleinsäure-Target-Paare, des Amplifizierens der Nucleinsäuren, die von den Nucleinsäure-Target-Paaren dissoziiert wurden, um ein an Liganden angereichertes Gemisch von Nucleinsäuren zu erhalten, und anschließend das Wiederholen der Schritte der Bindung, Abtrennung, Dissoziation und Amplifikation in so vielen Zyklen wie erwünscht.
  • Während hier keine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie zur Herstellung beabsichtigt wird, basiert SELEX auf der Erkenntnis der Erfinder, dass es innerhalb eines Nucleinsäuregemisches, das eine große Anzahl an möglichen Sequenzen und Strukturen enthält, einen breiten Bereich an Bindungsaffinitäten für ein bestimmtes Target gibt. Ein Nucleinsäuregemisch, das beispielsweise ein randomisiertes Segment mit 20 Nucleotiden umfasst, kann 420 Möglichkeiten aufweisen. Jene, die die höheren Affinitätskonstanten für das Target haben, binden sich am wahrscheinlichs ten. Nach dem Trennen, der Dissoziation und der Amplifikation wird ein zweites Nucleinsäuregemisch gebildet, das an den Kandidaten mit höherer Bindungsaffinität angereichert ist. Zusätzliche Selektionsdurchgänge begünstigen schrittweise die besten Liganden, bis sich das resultierende Nucleinsäuregemisch vorwiegend aus nur einer oder einigen wenigen Sequenzen zusammensetzt. Diese können dann kloniert, sequenziert und einzeln auf Bindungsaffinität als reine Liganden getestet werden.
  • Selektions- und Amplifikationszyklen werden wiederholt, bis ein erwünschtes Ziel erreicht ist. Im allgemeinsten Fall wird Selektion/Amplifikation fortgesetzt, bis keine signifikante Verbesserung bezüglich der Bindungsstärke durch Wiederholen des Zyklus mehr erreicht wird. Das Selektions/Amplifikationsverfahren mit wiederholten Durchgängen ist empfindlich genug, um Isolierung einer einzelnen Sequenzvariante in einem Gemisch, das zumindest 65.000 Sequenzvarianten enthält, zu ermöglichen. Das Verfahren ist sogar in der Lage, eine geringe Anzahl an hochaffinen Sequenzen in einem Gemisch, das 1014 Sequenzen enthält, zu isolieren. Das Verfahren könnte im Prinzip verwendet werden, um bis zu etwa 1018 verschiedene Nucleinsäurespezies zu prüfen. Die Nucleinsäuren des Testgemisches umfassen vorzugsweise einen Anteil an randomisierten Sequenzen sowie an konservierten Sequenzen, die für wirksame Amplifikation erforderlich sind. Nucleinsäuresequenzvarianten können auf zahlreiche verschiedene Arten gebildet werden, einschließlich Synthese randomisierter Nucleinsäuresequenzen und Größenselektion aus nach dem Zufallsprinzip gespalteten zellulären Nucleinsäuren. Der Anteil an variablen Sequenzen kann vollständig oder teilweise Zufallssequenz enthalten; er kann auch Unterabschnitte konservierter Sequenz, inkorporiert in randomisierte Sequenz, enthalten. Sequenzvariation in Testnucleinsäuren kann durch Mutagenese vor oder während der Selektions/Amplifikations-Wiederholungen eingeführt oder gesteigert werden.
  • In einem beschriebenen Beispiel ist das Selektionsverfahren beim Isolieren jener Nucleinsäureliganden, die sich am stärksten an das ausgewählte Target binden, so wirksam, dass nur ein Selektions- und Amplifikationszyklus erforderlich ist. Solch eine wirksame Selektion kann beispielsweise in einem Verfahren vom Chromatographie-Typ auftreten, worin die Fähigkeit von Nucleinsäuren, sich mit Targets zu assoziieren, die an eine Säule gebunden sind, so funktioniert, dass die Säule ausreichend in der Lage ist, Trennung und Isolierung der Nucleinsäureliganden mit höchster Affinität zu ermöglichen.
  • In zahlreichen Fällen ist es nicht notwendigerweise wünschenswert, die Wiederholungsschritte von SELEX durchzuführen, bis ein einzelner Nucleinsäureligand identifiziert wird. Die targetspezifische Nucleinsäureligandenlösung kann eine Familie von Nucleinsäurestrukturen oder -motiven umfassen, die zahlreiche konservierte Sequenzen und zahlreiche Sequenzen aufweist, die substituiert oder zugesetzt werden können, ohne die Affinität der Nucleinsäureliganden zum Target signifikant zu beeinflussen. Durch Beenden des SELEX-Verfahrens vor Abschluss ist es möglich, die Sequenz zahlreicher Mitglieder der Nucleinsäureligandenlösungsfamilie zu bestimmen, was die Festlegung einer umfassenden Beschreibung der Nucleinsäureligandenlösung ermöglicht.
  • Nachdem eine Beschreibung der Nucleinsäureliganden-Familie durch SELEX festgelegt wurde, kann es in bestimmten Fällen wünschenswert sein, eine weitere Reihe von SELEX durchzuführen, die durch die Information, die während des SELEX-Versuchs gewonnen wurde, definiert ist. In einer Ausführungsform fixiert die zweite Reihe von SELEX jene konservierten Regionen der Nucleinsäureliganden-Familie, während alle anderen Teile in der Ligandenstruktur randomisiert werden. In einer alternativen Ausführungsform kann die Sequenz der repräsentativsten Mitglieder der Nucleinsäureliganden-Familie als Grundlage für ein SELEX-Verfahren verwendet werden, worin der ursprüngliche Pool an Nucleinsäuresequenzen nicht vollständig randomisiert ist, sondern Vorgaben bezüglich des nächsten Liganden enthält. Durch diese Verfahren ist es möglich, das SELEX-Verfahren zu optimieren, um die am meisten bevorzugten Nucleinsäureliganden zu erlangen.
  • Die Existenz zahlreicher verschiedener Nucleinsäure-Primär, -Sekundär- und -Tertiärstrukturen ist bekannt. Die Strukturen oder Motive, für die gezeigt wurde, dass sie am häufigsten in Nicht-Watson-Crick-Typ-Wechselwirkungen eingebunden sind, werden als Haarnadelschleifen, symmetrische und asymmetrische Ausweitungen, Pseudoknoten und als zahlreiche Kombinationen dieser Konformationen bezeichnet. Beinahe alle bekannten Fälle solcher Motive lassen darauf schließen, dass sie in einer Nucleinsäuresequenz von nicht mehr als 30 Nucleotiden ausgebildet sein können. Aus diesem Grund wird bevorzugt, dass SELEX-Verfahren mit zusammenhängenden randomisierten Segmenten mit Nucleinsäuresequenzen begonnen werden, die ein randomisiertes Segment von zwischen etwa 20–50 Nucleotiden enthalten. In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung daher ein Kandidatengemisch, das aus Nucleinsäuren besteht, worin sich diese Nucleinsäuren aus einem konservierten Nucleotidsegment und einem randomisierten Nucleotidsegment zusammensetzen. Vorzugsweise ist das randomisierte Segment ein zusammenhängender Strang von zumindest etwa 15 Nucleotiden, noch bevorzugter von zumindest etwa 25 Nucleotiden, und in den am meisten bevorzugten Ausführungsformen von zwischen 25 und 40 Nucleotiden. Diese Erfindung umfasst ein Kandidatengemisch von Ausgangslösung, die zumindest etwa 109 Nucleinsäuren, vorzugsweise zumindest etwa 1014 Nucleinsäuren, enthält. Insbesondere umfasst diese Erfindung Lösungen, die ein Gemisch von zwischen etwa 109 bis 108 Nucleinsäuresequenzen mit einer zusammenhängenden randomisierten Sequenz mit einer Länge von zumindest etwa 15 Nucleotiden umfasst. In der bevorzugten Ausführungsform ist der randomisierte Sequenzabschnitt durch fixierte oder konservierte Sequenzen, insbesondere jene, die die Amplifikation der Liganden erleichtern, flankiert.
  • Im Fall eines polymeren Targets, wie z.B. eines Proteins, kann die Ligandenaffinität durch Anwenden von SELEX an einem Kandidatengemisch, das eine erste selektierte Sequenz und eine zweite randomisierte Sequenz umfasst, gesteigert werden. Die Sequenz des ersten selektierten Liganden, der mit Bindung assoziiert ist, oder Unterabschnitte davon kann bzw. können in den randomisierten Abschnitt der Nucleinsäuren eines zweiten Testgemisches eingeführt werden. Das SELEX-Verfahren wird mit dem zweiten Testgemisch wiederholt, um einen zweiten Nucleinsäureliganden zu isolieren, der zwei für Bindung an das Target selektierte Sequenzen aufweist und im Vergleich mit dem ersten isolierten Nucleinsäureliganden erhöhte Bindungsstärke oder erhöhte Bindungsspezifität aufweist. Die Sequenz des zweiten Nucleinsäureliganden, der mit Bindung an das Target assoziiert ist, kann anschließend in den vari ablen Abschnitt der Nucleinsäuren eines dritten Testgemisches eingeführt werden, das nach SELEX-Zyklen zu einem dritten Nucleinsäureliganden führt. Diese Verfahren können wiederholt werden, bis ein Nucleinsäureligand mit einer erwünschten Bindungsstärke oder einer erwünschten Bindungsspezifität an das Targetmolekül erreicht wird. Das Verfahren wiederholter Selektion und Kombination von Nucleinsäuresequenzelementen, die sich an ein selektiertes Targetmolekül binden, wird hierin „Walking" genannt, eine Bezeichnung, die die optimierte Bindung an andere zugängliche Bereiche einer makromolekularen Targetoberfläche oder -spalte, ausgehend von einer ersten Bindungsdomäne, impliziert. Eine Steigerung des Bereichs von Bindungskontakt zwischen Liganden und Target kann die Affinitätskonstante der Bindungsreaktion steigern. Diese Walking-Verfahren sind besonders für die Isolierung von Nucleinsäure-Antikörpern nützlich, die für Bindung an ein bestimmtes Targetmolekül hochspezifisch sind.
  • Eine Variante des Walking-Verfahrens verwendet einen Nicht-Nucleinsäureliganden, der als „Anker" bezeichnet wird und sich an das Targetmolekül als eine erste Bindungsdomäne bindet (siehe 9). Dieses Ankermolekül kann im Prinzip jegliches Nicht-Nucleinsäuremolekül sein, das sich an das Targetmolekül bindet und das kovalent direkt oder indirekt an eine Nucleinsäure gebunden werden kann. Ist das Targetmolekül ein Enzym, so kann das Ankermolekül beispielsweise ein Inhibitor oder Substrat von diesem Enzym sein. Der Anker kann auch ein Antikörper oder Antikörperfragment sein, der bzw. das für das Target spezifisch ist. Das Ankermolekül ist kovalent an ein Nucleinsäureoligomer mit bekannter Sequenz gebunden, um ein Verbrückungsmolekül zu bilden. Das Oligomer besteht vorzugsweise aus zumindest etwa 3 bis 10 Basen. Ein Testgemisch aus Kandidaten-Nucleinsäuren wird dann hergestellt, das einen randomisierten Abschnitt und eine Sequenz, die zur bekannten Sequenz des Verbrückungsmoleküls komplementär ist, umfasst. Das Verbrückungsmolekül bildet mit dem Targetmolekül einen Komplex. SELEX wird dann angewandt, um Nucleinsäuren zu selektieren, die sich an den Komplex aus dem Verbrückungsmolekül und dem Targetmolekül binden. Nucleinsäureliganden, die sich an den Komplex binden, werden isoliert. Walking-Verfahren wie zuvor beschrieben können dann angewendet werden, um Nucleinsäureliganden mit erhöhter Bindungsstärke oder erhöhter Bindungsspezifität zum Komplex zu erhalten. Walking-Verfahren könnten Selektionen auf Bindung an den Komplex oder das Target selbst verwenden. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, um Nucleinsäureliganden zu isolieren, die sich an eine bestimmte Stelle innerhalb des Targetmoleküls binden. Die Komplementärsequenz im Testgemisch wirkt zur Sicherstellung der Isolierung von Nucleinsäuresequenzen, die sich an das Targetmolekül an oder in der Nähe der Bindungsstelle des Verbrückungsmoleküls binden. Wird das Verbrückungsmolekül von einem Inhibitor des Targetmoleküls abgeleitet, so resultiert dieses Verfahren wahrscheinlich in einem Nucleinsäureliganden, der die Funktion des Targetmoleküls inhibiert. Es ist beispielsweise zur Isolierung von Nucleinsäuren, die Proteinfunktion aktivieren oder inhibieren, besonders nützlich. Die Kombination von Ligand und Target kann eine neue oder gesteigerte Funktion aufweisen.
  • Die hierin beschriebenen Nucleinsäureliganden können zahlreiche Ligandenkomponenten enthalten. Wie zuvor beschrieben können Nucleinsäureliganden, die aus Walking-Verfahren abgeleitet werden, als welche betrachtet werden, die mehr als eine Nucleinsäureliganden-Komponente aufweisen. Auch werden in dieser Erfindung Nucleinsäure-Antikörper beschrieben, die basierend auf den Resultaten, die durch SELEX gewonnen werden, konstruiert werden, wobei sie jedoch nicht zu einem Nucleinsäureliganden, wie er durch SELEX definiert wird, identisch sind. Ein Nucleinsäure-Antikörper kann beispielsweise konstruiert werden, wobei zahlreiche identische Ligandenstrukturen Teile einer einzelnen Nucleinsäure bilden. In einer anderen Ausführungsform kann SELEX mehr als eine Familie von Nucleinsäureliganden zu einem bestimmten Target identifizieren. In solch einem Fall kann ein einzelner Nucleinsäure-Antikörper konstruiert werden, der zahlreiche verschiedene Ligandenstrukturen enthält. Auch SELEX-Versuche können durchgeführt werden, in denen fixierte identische oder unterschiedliche Ligandenstrukturen durch randomisierte Nucleotidregionen und/oder Regionen mit variierender Distanz zwischen den fixierten Ligandenstrukturen verbunden werden, um die besten Nucleinsäure-Antikörper zu identifizieren.
  • Screens, Selektionen oder Tests zur Bewertung der Wirkung von Bindung eines Nucleinsäureliganden auf die Funktion des Targetmoleküls können leicht mit den SELEX-Verfahren kombiniert werden. Insbesondere Screens zur Inhibierung oder Aktivierung von Enzymaktivität können mit den SELEX-Verfahren kombiniert werden.
  • In spezifischeren Beispielen liefert das SELEX-Verfahren ein rasches Mittel zur Isolierung und Identifizierung von Nucleinsäureliganden, die sich an Proteine binden, einschließlich Nucleinsäure-Bindungsproteine und Proteine, die nicht dafür bekannt sind, Nucleinsäuren als Teil ihrer biologischen Funktion zu binden. Nucleinsäure-Bindungsproteine umfassen unter anderem Polymerasen und Umkehrtranskriptasen. Die Verfahren können auch leicht an Proteinen angewandt werden, die Nucleotide, Nucleoside, Nucleotid-Cofaktoren und strukturell verwandte Moleküle binden.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit von einem Targetmolekül und/oder zum Messen der Menge eines Targetmoleküls in einer Probe bereit, worin das Verfahren einen Nucleinsäureliganden verwendet, der durch die hierin beschriebenen Verfahren isoliert werden kann. Detektion des Targetmoleküls wird durch seine Bindung an einen Nucleinsäureliganden, der für dieses Targetmolekül spezifisch ist, vermittelt. Der Nucleinsäureligand kann markiert, z.B. radioaktiv markiert, werden, um qualitative oder quantitative Detektion zu ermöglichen. Das Detektionsverfahren ist für Targetmoleküle, die Proteine sind, besonders nützlich. Das Verfahren ist insbesondere zur Detektion von Proteinen, die nicht dafür bekannt sind, als Teil ihrer biologischen Funktion Nucleinsäuren zu binden, nützlich. Somit können Nucleinsäureliganden der vorliegenden Erfindung in Diagnoseverfahren in ähnlicher Weise wie in herkömmlichen Antikörper-basierten Diagnoseverfahren verwendet werden. Ein Vorteil von Nucleinsäureliganden gegenüber herkömmlichen Antikörpern in solch einem Detektionsverfahren und Diagnoseverfahren ist, dass Nucleinsäuren in der Lage sind, leicht in vitro amplifiziert zu werden, beispielsweise unter Verwendung von PCR-Amplifikation oder ähnlichen Verfahren. Ein anderer Vorteil ist, dass das gesamte SELEX-Verfahren in vitro ausgeführt wird und die Immunisierung von Testtieren nicht erfordert. Weiters kann die Bindungsaffinität von Nucleinsäureliganden an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden.
  • Nucleinsäureliganden von niedermolekularen Targets sind als diagnostische Testreagenzien nützlich und weisen therapeutische Verwendungen als Maskierungsmittel, Wirkstoffzufuhrvehikel und Modifikatoren von Hormonwirkung auf. Katalytische Nucleinsäuren sind nachweisbare Produkte dieser Erfindung. Durch Selektieren auf Bindung an Übergangszustands-Analoga einer Enzym-katalysierten Reaktion beispielsweise können katalytische Nucleinsäuren selektiert werden.
  • In wiederum einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Modifikation der Funktion eines Targetmoleküls unter Verwendung von Nucleinsäureliganden bereit, die durch SELEX isoliert werden können. Nucleinsäureliganden, die sich an ein Targetmolekül binden, werden gescreent, um jene zu selektieren, die die Funktion des Targetmoleküls spezifisch modifizieren, beispielsweise um Inhibitoren oder Aktivatoren der Funktion des Targetmoleküls zu selektieren. Eine Menge des selektierten Nucleinsäureliganden, der zur Modifikation der Funktion des Targets wirksam ist, wird mit dem Targetmolekül kombiniert, um die erwünschte funktionelle Modifikation zu erreichen. Dieses Verfahren ist besonders auf Targetmoleküle anwendbar, die Proteine sind. Eine besonders nützliche Anwendung dieses Verfahrens ist die Inhibierung von Proteinfunktion, z.B. die Inhibierung von Rezeptorbindung an einen Effektor oder die Inhibierung von Enzymkatalyse. In diesem Fall wird eine Menge des selektierten Nucleinsäuremoleküls, die zur Targetprotein-Inhibierung wirksam ist, mit dem Targetprotein kombiniert, um die erwünschte Inhibierung zu erreichen.
  • Folglich wird in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, das die spezifische Bindung in vitro eines Nucleinsäureliganden an ein Targetmolekül, die nicht Bindung zwischen Nucleinsäuren ist, umfasst; worin, wenn das Targetmolekül ein Protein ist, es ein Protein ist, das sich nicht an Nucleinsäuren als Teil seiner biologischen Funktion bindet, und worin der Nucleinsäureligand durch ein Verfahren identifiziert wurde, das die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Kontaktieren eines Gemisches von Nucleinsäuren mit dem Target unter Bedingungen, die für Bindung günstig sind;
    • (b) Abtrennen ungebundener Nucleinsäuren von jenen Nucleinsäuren, die sich an Targetmoleküle gebunden haben;
    • (c) Dissoziieren der Nucleinsäure-Target-Paare;
    • (d) Amplifizieren der von den Nucleinsäure-Target-Paaren dissoziierten Nucleinsäuren, um ein an Liganden angereichertes Gemisch von Nucleinsäuren zu erhalten;
    • (e) Wiederholen der Schritte von Bindung, Abtrennung, Dissoziierung und Amplifikation in so vielen Zyklen wie erwünscht,
    um den/die Liganden) zu erhalten, der/die sich spezifisch an das Targetmolekül bindet/binden.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Nucleinsäureliganden bei der Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels für ein Therapie- oder Diagnoseverfahren bereitgestellt, das die spezifische Bindung in vivo des Liganden an ein Targetmolekül, die nicht Bindung zwischen Nucleinsäuren ist, umfasst; worin, wenn das Targetmolekül ein Protein ist, es ein Protein ist, das sich nicht an Nucleinsäuren als Teil seiner biologischen Funktion bindet, und worin der Nucleinsäureligand durch ein Verfahren identifiziert wurde, das die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Kontaktieren eines Gemisches von Nucleinsäuren mit dem Target unter Bedingungen, die für Bindung günstig sind;
    • (b) Abtrennen ungebundener Nucleinsäuren von jenen Nucleinsäuren, die sich an Targetmoleküle gebunden haben;
    • (c) Dissoziieren der Nucleinsäure-Target-Paare;
    • (d) Amplifizieren der von den Nucleinsäure-Target-Paaren dissoziierten Nucleinsäuren, um ein an Liganden angereichertes Gemisch von Nucleinsäuren zu erhalten;
    • (e) Wiederholen der Schritte von Bindung, Abtrennung, Dissoziierung und Amplifikation in so vielen Zyklen wie erwünscht,
    um den/die Ligand(en) zu erhalten, der/die sich spezifisch an das Targetmolekül bindet/binden.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Diagramm der Ribonucleotidsequenz eines Abschnitts der Gen-43-Messenger-RNA, die für die Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase kodiert. Gezeigt ist die Sequenz in der Region, die dafür bekannt ist, sich an gp43 zu binden. Die Großbuchstaben in Fettdruck bezeichnen das Ausmaß der Information, die für Bindung von gp43 erforderlich ist. Die 8-Basenpaar-Schleife wurde durch randomisierte Sequenz ersetzt, um eine Kandidatenpopulation für SELEX zu erhalten.
  • 2 ist ein schematisches Diagramm des SELEX-Verfahrens, beispielhaft für die Selektion von Schleifensequenzvarianten für RNAs, die sich an T4-DNA-Polymerase (gp43) binden, dargestellt. Eine DNA-Matrix zur Herstellung eines Testgemisches aus RNAs wurde, wie in Schritt a angegeben, durch Ligation von Oligomeren 3, 4 und 5, deren Sequenzen in Tabelle 1, siehe unten, angegeben sind, hergestellt. Korrekte Ligation in Schritt a wurde durch Hybridisierung mit den Oligomeren 1 und 2 sichergestellt, die Komplementärsequenz aufweisen (in Tabelle 1 angegeben), die die Oligomere 3 und 4 bzw. 4 und 5 verbrückt. Die resultierende, 110 Basen lange Matrix wurde gelgereinigt, an Oligo 1 anelliert und in In-vitro-Transkriptionsreaktionen verwendet (Miligan et al., Nucl. Acids. Res. 15, 8783–8798 (1987)), um ein Start-RNA-Gemisch zu bilden, das randomisierte Sequenzen der 8-Basen-Schleife enthält, Schritt b. Die resultierenden Transkripte wurden gelgereinigt und Selektion an Nitrocellulosefiltern auf Bindung an gp43 unterzogen (Schritt c), wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Selektierte RNAs wurden in einem Prozess mit drei Schritten amplifiziert: (d) cDNA-Kopien der selektierten RNAs wurden durch Umkehrtranskriptasesynthese unter Verwendung von Oligo 5 (Tabelle 1) als Primer gebildet; (e) cDNAs wurden unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerasekettenextension von Oligo 1 (Tabelle 1), das wesentliche T7-Promotorsequenzen trägt, und Oligo 5 (Tabelle 1), wie in Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9436 (1988), beschrieben, amplifiziert; und (f) doppelsträngige DNA-Amplifikationsprodukte wurden in vitro transkri biert. Die resultierenden selektierten amplifizierten RNAs wurden im nächsten Selektionsdurchgang verwendet.
  • 3 ist eine Zusammensetzung von Autoradiographen von Elektrophorese unterzogenen Chargensequenzierungsreaktionen der aus SELEX für Bindung von RNA-Schleifenvarianten an gp43 abgeleiteten In-vitro-Transkripte. Die Figur zeigt die Veränderung von Schleifensequenzkomponenten als eine Funktion der Anzahl an Selektionszyklen (für 2, 3 und 4 Zyklen) für Selektionsbedingungen von Versuch B, in dem die Konzentration von gp43 3 × 10–8 M und die Konzentration von RNA etwa 3 × 10–5 in allen Selektionszyklen betrug. Sequenzierung erfolgte wie in Gauss et al., Mol. Gen. Genet. 206, 24–34 (1987), beschrieben.
  • 4 ist eine Zusammensetzung von Autoradiographen von Chargen-RNA-Sequenzen von jenen RNAs, die aus dem vierten Durchgang von SELEX-Amplifikation für Bindung von RNA-Schleifenvarianten an gp43 unter Verwendung verschiedener Bindungsbedingungen selektiert wurden. In Versuch A betrug die gp43-Konzentration 3 × 10–8 M und die RNA-Konzentration etwa 3 × 10–7 M. In Versuch B betrug gp43 3 × 10–8 M und RNA etwa 3 × 10–5 M. In Versuch C betrug gp43 3 × 10–7 M und RNA etwa 3 × 10–5 M.
  • 5 ist eine Zusammensetzung von Autoradiographen von drei Sequenzierungsgelen für Schleifenvarianten, selektiert für Bindung an gp43 unter den Selektionsbedingungen aus Versuch B (siehe Beispiel 1). Das linke Sequenzgel ist die Chargensequenzierung selektierter RNAs nach dem vierten Durchgang von Selektion/Amplifikation. Die mittleren und rechten Sequenzgele sind doppelsträngige DNA-Sequenzierungsgele von zwei klonalen Isolaten, abstammend von den Chargen-RNAs. Die selektierte RNA-Charge setzt sich aus zwei Hauptvarianten zusammen, von denen eine die Wildtypsequenz ist (mittleres Sequenzgel) und die andere eine neue Sequenz ist (rechtes Gel).
  • 6 ist ein Diagramm der Prozentsätze an RNA, die an gp43 gebunden ist, als eine Funktion von gp43-Konzentration für verschiedene selektierte RNA-Schleifense quenzvarianten und für RNA mit einer randomisierten Schleifensequenz. Bindung der Wildtypschleifensequenz AAUAACUC wird als leere Kreise auf durchgehender Linie angegeben; die Hauptvarianten-Schleifensequenz AGCAACCU als „x" auf gepunkteter Linie; die Nebenvarianten-Schleifensequenz AAUAACUU als leere Kästchen auf durchgehender Linie; die Nebenvarianten-Schleifensequenz AAUGACUC als volle Kreise auf gepunkteter Linie; die Nebenvarianten-Schleifensequenz AGCGACCU als Kreuze auf gepunkteter Linie; und die Bindung des randomisierten Gemisches (NNNNNNNN) von Schleifensequenzen als leere Kreise auf gepunkteter Linie.
  • 7 ist eine in Bildern dargestellte Zusammenfassung der Resultate, die nach vier Runden von SELEX erreicht wurden, um eine neue gp43-Bindungs-RNA aus einer Kandidatenpopulation, die in der 8-Basenpaar-Schleife randomisiert ist, zu selektieren. SELEX ergab den „offensichtlichen" Consensus nicht, der aus den in 4 gezeigten Chargensequenzen erwartet wurde, ergab jedoch stattdessen Wildtyp und eine einzelne Hauptvariante in etwa gleichen Verhältnissen und drei einzelne Mutanten. Die Häufigkeiten von jeder Spezies aus zwanzig klonierten Isolaten werden zusammen mit den ungefähren Affinitätskonstanten (Kd) für alle Isolate gezeigt, wie sie aus Filterbindungstests, die in 6 gezeigt sind, gewonnen wurden.
  • 8 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Synthese von Kandidaten-Nucleinsäureliganden unter Verwendung der Enzyme terminale Transferase (TDT) und DNA-Polymerase (DNA-pol) zeigen. Ein 5'-Primer oder eine primäre Ligandensequenz wird mit einem Ende von randomisierter Sequenz durch Inkubieren mit terminaler Transferase in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) bereitgestellt. Das Zuschneiden von Homopolymer aus dem randomisierten Segment unter Verwendung desselben Enzyms in Gegenwart eines einzelnen Desoxynucleotidtriphosphats (z.B. dCTP) stellt eine Anellierungsstelle für Poly-G-geschnittene 3'-Primer bereit. Nach dem Anellieren wird das doppelsträngige Molekül durch die Wirkung von DNA-Polymerase vervollständigt. Das Gemisch kann weiter, sofern erwünscht, durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden.
  • 9 ist ein Diagramm, das ein Verfahren unter Verwendung von SELEX zur Selektion eines großen Nucleinsäureliganden mit zwei räumlich voneinander getrennten Bindungswechselwirkungen mit einem Targetprotein zeigt. Das Verfahren wird als „Walking" bezeichnet, da es zwei Phasen umfasst, wobei die zweite eine Verlängerung der ersten ist. Der obere Teil der Figur zeigt ein Target („Protein von Interesse") mit einem gebundenen Nucleinsäureliganden, der durch einen ersten Durchgang von SELEX selektiert wurde („entwickelter primärer Ligand"), der an das Protein an einer ersten Bindungsstelle gebunden ist. Eine durch terminale Transferase katalysierte Reaktion verlängert die Länge des entwickelten primären Liganden und bildet eine neue Reihe von Kandidaten mit randomisierter Sequenz, die eine konservierte Region aufweisen, die den primären Liganden enthält. Der untere Teil der Figur zeigt das Resultat eines zweiten Durchgangs von SELEX, basierend auf verbesserter Bindung, die aus der sekundären Ligandenwechselwirkung an der sekundären Bindungsstelle des Proteins resultiert. Die Bezeichnungen „primär" und „sekundär" sind ausschließlich praktische Bezeichnungen zur Unterscheidung, die nicht implizieren, dass der eine höhere Affinität als der andere aufweist.
  • Die 10 und 11 sind Diagramme eines Selektionsverfahrens unter Verwendung von SELEX in zwei Phasen. In 10 wird SELEX angewandt, um Liganden auszuwählen, die sich an sekundäre Bindungsstellen an einem Target binden, das mit einem Verbrückungs-Oligonucleotid, das an einen spezifischen Binder, z.B. einen Inhibitor des Targetproteins, gebunden ist, einen Komplex bildet. Das Verbrückungs-Oligonucleotid wirkt als ein Leitkörper, um Selektion von Liganden, die sich an zugängliche sekundäre Bindungsstellen binden, zu bevorzugen. In 11 wird ein zweiter SELEX eingesetzt, um Liganden zu entwickeln, die sich sowohl an die sekundären Stellen, auf die ursprünglich selektiert wurde, als auch die primäre Targetdomäne binden. Die Nucleinsäuren, die dadurch entwickelt werden, binden sich sehr fest und können selbst als Inhibitoren des Targetproteins wirken oder gegen Inhibitoren oder Substrate des Targetproteins konkurrieren.
  • 12 zeigt die Sequenz und Anordnung von Oligomeren, die verwendet werden, um das in Beispiel 2 verwendete Kandidatengemisch zu konstruieren. Die obere Li nie zeigt die Sequenzen der Oligomere 1b bzw. 2b von links nach rechts (siehe Tabelle 2, unten). Die zweite Linie zeigt, von links nach rechts, die Sequenzen der Oligomere 3b, 4b und 5b (Tabelle 2). Korrekte Ligation der Oligomere wurde durch Hybridisierung mit Oligomeren 1b und 2b, deren Sequenzen komplementär sind, sichergestellt. Die resultierende ligierte Matrix wurde gelgereinigt, an Oligomer 1b anelliert und in einer In-vitro-Transkriptionsreaktion verwendet (Milligan et al. (1987)), um ein RNA-Kandidatengemisch zu bilden, das in der letzten Linie der Figur gezeigt und als „In-vitro-Transkript" markiert ist. Das Kandidatengemisch enthielt ein 32 Nucleotid langes, randomisiertes Segment, wie gezeigt.
  • 13 zeigt eine hypothetische RNA-Sequenz, die zahlreiche sekundäre Strukturen enthält, die bekanntlich von RNA angenommen werden. Eingebunden sind: A Haarnadelschleifen, B Ausweitungen, C asymmetrische Ausweitungen und D Pseudoknoten.
  • 14 zeigt Nitrocellulosefilter-Bindungstests von Ligandenaffinität für HIV-RT. Gezeigt ist der Prozentsatz von Eingangs-RNA, die an den Nitrocellulosefilter mit variierenden Konzentrationen von HIV-RT gebunden ist.
  • 15 zeigt zusätzliche Nitrocellulosefilter-Bindungstests von Ligandenaffinität für HIV-RT.
  • 16 zeigt Informationsgrenzenbestimmung für HIV-1-RT-Liganden 1.1 und 1.3a.
    • a) 3'-Grenzenbestimmung. RNAs wurden 5'-endmarkiert, partieller alkalischer Hydrolyse und Selektion an Nitrocellulosefiltern unterzogen, an einem denaturierendem 8%igen Polyacrylamidgel getrennt und Autoradiographie unterzogen. Etwa 90 pmol von markierter RNA und 80 pmol von HIV-1-RT wurden in 0,5, 2,5 und 5 ml Puffer vermischt und vor dem Waschen durch ein Nitrocellulosefilter 5 min lang bei 37°C inkubiert. Die eluierten RNAs werden unter den Endkonzentrationen von HIV-1-RT, die in jedem Versuch verwendet wurden, gezeigt. Auch gezeigt werden die Produkte eines teilweisen RNase-T1-Verdaus, der die Identifikation der Informationsgrenze an der benachbarten Sequenz ermöglicht, wie durch die Pfeile angezeigt wird.
    • b) 5'-Grenzenbestimmung. Die 5'-Grenze wurde unter denselben Bedingungen wie zuvor in a) beschrieben bestimmt.
  • 17 zeigt die Inhibierung von HIV-1-RT durch RNA-Liganden 1.1. Eine Reihe von dreifachen Verdünnungen von 32N-Kandidatengemisch-RNA und Ligand-1.1-RNA im Bereich einer Endreaktionskonzentration von 10 μM bis 4,6 nM wurde vorgemischt mit HIV-RT und 5 min lang bei 37°C in 6 μl 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 10 mM Dithiothreit, 6 mM Mg(OAc)2 und 0,4 mM NTPS inkubiert. In einer separaten Röhrchen wurden RNA-Matrix (transkribiert aus einem PCR-Produkt eines T7-1, erhalten von U.S. Biochemical Corp., unter Verwendung der Oligos 7 und 9) und markiertes Oligo 9 vermischt und bei 95°C eine Minute lang erhitzt und auf Eis 15 min lang in 10 mM Tris-HCl, pH 7, 0,1 mM EDTA gekühlt. Vier μl dieser Matrix wurden zu allen 6 μl von Enzym-Inhibitor-Gemisch zugesetzt, um die Reaktion zu starten, die weitere 5 min bei 37°C inkubiert und dann gestoppt wurde. Die Endkonzentration von HIV-1-RT betrug 16 nM, von RNA-Matrix 13 nM und von markiertem Primer 150 nM in allen Reaktionen. Die Extensionsprodukte von jeder Reaktion sind gezeigt.
  • 18 zeigt einen Vergleich von HIV-1-RT-Inhibierung durch Liganden 1.1 mit den Wirkungen von MMLV-RT und AMV-RT. Versuche wurden wie in 17 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 5fache Verdünnungen mit den unten gezeigten resultierenden Konzentrationen hergestellt wurden. Die Konzentrationen von jeder RT wurden bezogen auf jene von HIV-RT durch Verdünnungen und Vergleich von Gelbandenintensität sowohl mit Coomassie-Blau- als auch Silberfärbungen, Biorad-Proteinkonzentrationstests und Aktivitätstests normalisiert.
  • 19 zeigt die Consensus-Sequenzen ausgewählter Haarnadelschleifen, die die R-17-Hüllproteinligandenlösung darstellen. Die Nucleotiddarstellung an jeder Position wird in den Gitternetzen angegeben. Die Spalte mit dem Titel „Bulge" zeigt die Anzahl der Klone mit einem extrahelikalen Nucleotid an einer oder beiden Seiten des Stamms zwischen den entsprechenden Stammbasenpaaren an. Die Spalte mit dem Titel „END" zeigt die Anzahl der Klone, deren Haarnadel am vorangehenden Basenpaar endet.
  • 20 zeigt eine Bindungskurve von 30N-Haupt-RNA für Bradykinin. Die Analyse erfolgte unter Verwendung von Zentrifugensäulen; 10 mM KOAc, 10 mM DEM, pH 7,5; RNA-Konzentration 1,5 × 10–8 M.
  • 21 zeigt Matrices zur Verwendung bei der Bildung von Kandidatengemischen, die in bestimmten strukturellen Motiven angereichert sind. Matrix A ist dafür entworfen, das Kandidatengemisch an Haarnadelschleifen anzureichern. Matrix B ist dafür entworfen, das Kandidatengemisch an Pseudoknoten anzureichern.
  • 22 ist ein schematisches Diagramm von Stamm-Schleifen-Anordnungen für die Motive I und II der HIV-rev-Ligandenlösung. Die gepunkteten Linien in den Stämmen 1 und 2 zwischen den Schleifen 1 und 3 bezeichnen potenzielle Basenpaare.
  • 23 zeigt die gefalteten Sekundärstrukturen von rev-Liganden-Unterdomänen der Isolate 6a, 1a und 8, um die Motive I, II bzw. III zu zeigen. Auch zu Vergleichszwecken gezeigt wird die vorhergesagte Faltung der Wildtyp-RRE-RNA.
  • 24 ist ein Diagramm der Prozentsätze von Eingangszählungen, gebunden an ein Nitrocellulosefilter, mit verschiedenen Konzentrationen von HIV-rev-Protein. Auch gezeigt sind die Bindungskurven der 32N-Ausgangspopulation (#) und der entwickelten Population nach 10 Durchgängen (P) und der Wildtyp-RRE-Sequenz, die aus einer aus den Oligos 8 und 9 bestehenden Matrix transkribiert wurde (W).
  • 25 ist ein Vergleich von Motiv-I(a)-rev-Liganden. Die Parameter sind wie in 24 gezeigt festgelegt. Auch eingebunden ist die Bindungskurve des „Consensus"-Konstrukts (C).
  • 26 ist ein Vergleich von Motiv-1(b)-rev-Liganden. Die Parameter sind wie in 24 gezeigt festgelegt.
  • 27 ist ein Vergleich von Motiv-II-rev-Liganden. Die Parameter sind wie in 24 gezeigt festgelegt.
  • 28 ist ein Vergleich von Motiv-III-rev-Liganden. Die Parameter sind wie in 24 gezeigt festgelegt.
  • 29 zeigt die Consensus-Nucleinsäureligandenlösung zu HIV-rev, bezeichnet als Motiv I.
  • 30 zeigt die Consensus-Nucleinsäureligandenlösung zu HIV-rev, bezeichnet als Motiv II.
  • 31 ist eine schematische Darstellung eines Pseudoknotens. Der Pseudoknoten besteht aus zwei Stämmen und drei Schleifen, die hierin als Stämme S1 und S2 und als Schleifen 1, 2 und 3 bezeichnet werden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die folgenden Bezeichnungen werden hierin gemäß den Definitionen verwendet.
  • Nucleinsäure bezeichnet entweder DNA, RNA, einzelsträngig oder doppelsträngig, und jegliche chemische Modifikation davon, vorausgesetzt, dass die Modifikation die Amplifikation von selektierten Nucleinsäuren nicht stört. Solche Modifikationen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Modifikationen an exozyklischen Cytosin-Aminen, Substitution von 5-Bromuracil, Hauptkettenmodifikationen, Methylierungen, unübliche Basenpaarungskombinationen und dergleichen.
  • Ligand bezeichnet eine Nucleinsäure, die sich an ein anderes Molekül (Target) bindet. In einer Population von Kandidaten-Nucleinsäuren ist ein Ligand einer, der sich mit größerer Affinität als jener der Hauptpopulation bindet. In einem Kandidatengemisch können mehr als ein Ligand für ein bestimmtes Target vorhanden sein. Die Li ganden können sich voneinander in ihren Bindungsaffinitäten für das Targetmolekül unterscheiden.
  • Kandidatengemisch ist ein Gemisch von Nucleinsäuren unterschiedlicher Sequenz, aus dem ein erwünschter Ligand selektiert wird. Die Quelle eines Kandidatengemisches kann in natürlich-vorkommenden Nucleinsäuren oder Fragmenten davon, chemisch synthetisierten Nucleinsäuren, enzymatisch synthetisierten Nucleinsäuren oder Nucleinsäuren, die durch eine Kombination der obigen Verfahren hergestellt werden, bestehen.
  • Targetmolekül bezeichnet jegliche Verbindung von Interesse, für die ein Ligand erwünscht ist. Ein Targetmolekül kann, ohne darauf eingeschränkt zu sein, ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Glykoprotein, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Virus, Substrat, Metabolit, Übergangszustands-Analogon, Co-Faktor, Inhibitor, Wirkstoff, Farbstoff, Nährstoff, Wachstumsfaktor usw. sein.
  • Abtrennung bezeichnet jegliches Verfahren, durch das Liganden, die an Targetmoleküle gebunden sind, was hierin als Liganden-Target-Paar bezeichnet wird, von Nucleinsäuren, die nicht an Targetmoleküle gebunden sind, getrennt werden können. Das Abtrennen kann durch verschiedene Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt werden. Nucleinsäure-Protein-Paare können an Nitrocellulosefilter gebunden sein, während ungebundene Nucleinsäuren dies nicht können. Säulen, die Liganden-Target-Paare spezifisch festhalten (oder gebundenen Liganden, der mit einem gebundenen Target einen Komplex bildet, spezifisch festhalten), können zum Abtrennen verwendet werden. Flüssig-Flüssig-Abtrennung kann auch verwendet werden wie auch Filtrationsgel-Retardierung und Dichtegradienten-Zentrifugation. Die Wahl des Abtrennungsverfahrens hängt von den Eigenschaften des Targets und von den Liganden-Target-Paaren ab und kann gemäß den Prinzipien und Eigenschaften durchgeführt werden, die Fachleuten bekannt sind.
  • Amplifikation bezeichnet jegliches Verfahren oder jegliche Kombination von Verfahrensschritten, das bzw. die die Menge oder Anzahl von Kopien eines Moleküls oder einer Klasse von Molekülen erhöht. Amplifikation von RNA-Molekülen in den offenbarten Beispielen wurde durch eine Abfolge von drei Reaktionen durchgeführt: Herstellen von cDNA-Kopien von selektierten RNAs unter Verwendung von Polymerasekettenreaktion, um die Kopienanzahl von jeder cDNA zu erhöhen, und Transkribieren der cDNA-Kopien, um RNA-Moleküle mit denselben Sequenzen wie die selektierten RNAs zu erhalten. Jegliche Reaktion oder Kombination von Reaktionen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, kann je nach Bedarf verwendet werden, einschließlich direkter DNA-Replikation, direkter RNA-Amplifikation und dergleichen, wie Fachleuten bekannt sein wird. Das Amplifikationsverfahren sollte in den Verhältnissen des amplifizierten Gemisches resultieren, die für die Verhältnisse unterschiedlicher Sequenzen im Ausgangsgemisch im Wesentlichen repräsentativ sind.
  • Spezifische Bindung ist eine Bezeichnung, die von Fall zu Fall unterschiedlich definiert wird. In Zusammenhang mit einer bestimmten Wechselwirkung zwischen einem bestimmten Liganden und einem bestimmten Target wird eine Bindungswechselwirkung von Liganden und Target mit höherer Affinität als jene, die zwischen dem Target und dem Kandidaten-Ligandengemisch vorhanden ist, beobachtet. Um Bindungsaffinitäten zu vergleichen, müssen die Bedingungen beider Bindungsreaktionen dieselben sein und sollten mit den Bedingungen des beabsichtigen Verwendungszwecks vergleichbar sein. Für die exaktesten Vergleiche werden Messungen durchgeführt, die die Wechselwirkung zwischen Liganden als Ganzes und Target als Ganzes widerspiegeln. Die Nucleinsäureliganden der Erfindung können selektiert werden, um so spezifisch wie nötig zu sein, entweder durch Festlegen von Selektionsbedingungen, die die erforderliche Spezifität während SELEX bedingen, oder durch Zuschneiden und Modifizieren des Liganden durch „Walking" und andere Modifikationen unter Verwendung der Wechselwirkungen von SELEX.
  • Randomisiert ist eine Bezeichnung, um ein Segment einer Nucleinsäure zu beschreiben, das im Prinzip jegliche mögliche Sequenz über eine bestimmte Länge aufweist. Randomisierte Sequenzen weisen verschiedene Längen auf, die, je nach Belieben, im Bereich von etwa 8 bis mehr als 100 Nucleotiden liegen. Die chemischen oder enzymatischen Reaktionen, durch die Zufallssequenzsegmente gebildet werden, können aufgrund von unbekannten Vorgaben oder Nucleotidpräferenzen, die vorhanden sein können, keine mathematisch zufälligen Sequenzen ergeben. Die Bezeichnung „randomisiert" wird anstelle von „zufällig" verwendet, um die Möglichkeit solcher Abweichungen vom Nicht-Idealfall auszudrücken. In den zur Zeit bekannten Verfahren, beispielsweise bei sequenzieller chemischer Synthese, ist nicht bekannt, dass große Abweichungen auftreten. Für kürzere Segmente von 20 Nucleotiden oder weniger würde jegliche geringfügige Vorgabe, die vorhanden sein könnte, Konsequenzen haben, die zu vernachlässigen wären. Je länger die Sequenzen einer einzelnen Synthese, desto größer die Wirkung irgendeiner Vorgabe.
  • Eine Vorgabe kann absichtlich in randomisierte Sequenz eingeführt werden, beispielsweise durch Verändern der Mol-Verhältnisse von Vorläufer-Nucleosid- (oder -Desoxynucleosid-) Triphosphaten der Synthesereaktion. Eine absichtliche Vorgabe kann erwünscht sein, beispielsweise um die Verhältnisse der einzelnen Basen in einem bestimmten Organismus anzunähern oder um die Sekundärstruktur zu beeinflussen.
  • SELEXION bezieht sich auf eine mathematische Analyse und Computersimulation, die verwendet wird, um die enorme Fähigkeit von SELEX darzustellen, Nucleinsäureliganden zu identifizieren, und vorherzusagen, welche Variationen im SELEX-Verfahren die größte Wirkung auf die Optimierung des Verfahrens haben. SELEXION ist ein Akronym für Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment with Integrated Optimization by Nonlinear Analysis (Systematische Entwicklung von Liganden durch exponentielle Anreicherung mit integrierter Optimierung durch nichtlineare Analyse).
  • Nucleinsäure-Antikörper ist eine Bezeichnung, die verwendet wird, um auf eine Klasse von Nucleinsäureliganden Bezug zu nehmen, die sich aus einzelnen Nucleinsäurestrukturen oder -motiven zusammensetzt, die sich selektiv an Targetmoleküle binden. Nucleinsäure-Antikörper können aus doppel- oder einzelsträngiger RNA oder DNA gebildet werden. Die Nucleinsäure-Antikörper werden synthetisiert und werden in einer bevorzugten Ausführungsform basierend auf einer Ligandenlösung oder -lösungen konstruiert, die für ein bestimmtes Target durch das SELEX-Verfahren erhalten wurde(n). In zahlreichen Fällen treten die Nucleinsäure-Antikörper der vorliegenden Erfindung nicht natürlich in der Natur auf, während sie in anderen Situationen signifikante Ähnlichkeit zu einer in der Natur vorkommenden Nucleinsäuresequenz zeigen können.
  • Die Nucleinsäure-Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen alle Nucleinsäuren, die eine spezifische Bindungsaffinität für ein Target aufweisen, während sie jene Fälle nicht einbinden, in denen das Target ein Polynucleotid ist, das sich an die Nucleinsäure durch einen Mechanismus bindet, der vorwiegend von Watson/Crick-Basenpaarung oder Tripelhelix-Mitteln abhängt (siehe M. Riordan et al., Nature 350, 442–443 (1991)); vorausgesetzt jedoch, dass, wenn der Nucleinsäure-Antikörper doppelsträngige DNA ist, das Target ein nicht in der Natur vorkommendes Protein ist, dessen physiologische Funktion von spezifischer Bindung an doppelsträngige DNA abhängt.
  • RNA-Motive ist eine Bezeichnung, die im Allgemeinen verwendet wird, um die Sekundär- oder Tertiärstruktur von RNA-Molekülen zu beschreiben. Die Primärsequenz einer RNA ist ein spezifischer Strang von Nucleotiden (A, C, G oder U) in einer Dimension. Die Primärsequenz gibt dem ersten Eindruck nach bezüglich der dreidimensionalen Konfiguration der RNA keine Information ab, wenn auch es die Primärsequenz ist, die die dreidimensionale Konfiguration festlegt. In bestimmten Fällen kann die Ligandenlösung, die nach Durchführung von SELEX an einem bestimmten Target erhalten wurde, am besten als eine Primärsequenz dargestellt werden. Obwohl Konformationsinformation in Bezug auf solch eine Ligandenlösung basierend auf den durch SELEX erhaltenen Resultaten nicht immer feststellbar ist, sollte die Darstellung einer Ligandenlösung als Primärsequenz nicht als ein Nicht-Anerkennung der Existenz einer integralen Tertiärstruktur verstanden werden.
  • Die Sekundärstruktur eines RNA-Motivs wird durch Kontakt in zwei Dimensionen zwischen spezifischen Nucleotiden dargestellt. Die am leichtesten zu erkennenden Sekundärstrukturmotive bestehen aus Watson/Crick-Basenpaaren A:U und C:G.
  • Nicht-Watson/Crick-Basenpaare, häufig mit geringerer Stabilität, wurden auch bereits erkannt und umfassen die Paare G:U, A:C, G:A und U:U. (Basenpaare sind einmal gezeigt; in RNA-Molekülen steht das Basenpaar X:Y per definitionem für eine Sequenz, in der X 5' zu Y steht, während das Basenpaar Y:X ebenfalls zulässig ist.) In 13 ist eine Reihe von Sekundärstrukturen, gebunden durch einzelsträngige Regionen, gezeigt; die herkömmliche Nomenklatur für die Sekundärstrukturen umfasst Haarnadelschleifen, asymmetrische ausgeweitete Haarnadelschleifen, symmetrische Haarnadelschleifen und Pseudoknoten.
  • Wenn Nucleotide, die in der Primärsequenz voneinander beabstandet sind und von denen nicht angenommen wird, dass sie durch Watson/Crick- und Nicht-Watson/Crick-Basenpaare wechselwirken, tatsächlich jedoch wechselwirken, so sind diese Wechselwirkungen (die häufig zweidimensional dargestellt sind) auch Teil der Sekundärstruktur.
  • Die dreidimensionale Struktur eines RNA-Motivs ist lediglich die räumliche Beschreibung der Atome des RNA-Motivs. Doppelsträngige RNA, vollständig basengepaart durch Watson/Crick-Paarung, weist eine reguläre Struktur in drei Dimensionen auf, wenn auch die exakten Positionen von allen Atomen der helikalen Hauptkette von der exakten Sequenz von Basen in der RNA abhängen könnten. Viel Fachliteratur befasst sich mit Sekundärstrukturen von RNA-Motiven, und von jenen Sekundärstrukturen, die Watson/Crick-Basenpaare enthalten, wird häufig angenommen, dass sie A-förmige doppelsträngige Helices bilden.
  • Ausgehend von A-förmigen Helices kann auf die anderen dreidimensionalen Motive übergegangen werden. Nicht-Watson/Crick-Basenpaare, Haarnadelschleifen, Ausweitungen und Pseudoknoten sind Strukturen, die innerhalb und auf Helices gebildet werden. Die Konstruktion dieser zusätzlichen Motive wird ausführlicher in der nachstehenden Beschreibung erläutert.
  • Die tatsächliche Struktur einer RNA umfasst alle Atome des Nucleotids des Moleküls in den drei Dimensionen. Eine vollständig aufgelöste Struktur würde Wasser und an organische Atome umfassen sowie binden, obwohl solch eine Auflösung von Forschern selten erreicht wird. Aufgelöste RNA-Strukturen in den drei Dimensionen umfassen alle Sekundärstrukturelemente (dargestellt als dreidimensionale Strukturen) und fixierte Positionen für die Atome von Nucleotiden, die nicht durch Sekundärstrukturelemente eingeschränkt sind; aufgrund von Basenschichtung und anderen Kräften können umfassende einzelsträngige Domänen fixierte Strukturen aufweisen.
  • Primärsequenzen von RNAs schränken die möglichen dreidimensionalen Strukturen ein, wie dies auch die fixierten Sekundärstrukturen machen. Die dreidimensionalen Strukturen einer RNA sind durch die spezifischen Kontakte zwischen Atomen in zwei Dimensionen eingeschränkt, und sie sind weiters durch Energieminimierung, die Kapazität eines Moleküls, alle frei rotierbaren Bindungen zu rotieren, sodass das resultierende Molekül stabiler ist als andere Konformere mit derselben Primär- und Sekundärsequenz und -struktur, eingeschränkt.
  • Am wichtigsten gilt festzuhalten, dass RNA-Moleküle dreidimensionale Strukturen aufweisen, die sich aus einer Reihe von RNA-Motiven, einschließlich jeglicher Anzahl an Motiven, die in 13 gezeigt sind, zusammensetzen.
  • Daher umfassen RNA-Motive alle Arten, in denen es möglich ist, allgemein die stabilsten Gruppen von Konformationen zu beschreiben, die eine Nucleinsäureverbindung bilden kann. Für ein bestimmtes Target kann die Ligandenlösung und der Nucleinsäure-Antikörper eines der hierin beschriebenen RNA-Motive oder eine gewisse Kombination von mehreren RNA-Motiven sein.
  • Ligandenlösungen sind definiert als die dreidimensionale Struktur, die sie gemeinsam aufweisen, oder als eine Familie, die die konservierten, durch SELEX identifizierten Komponenten definiert. Die für ein bestimmtes Target identifizierten Liganden beispielsweise können eine Primärsequenz enthalten, die sie gemeinsam haben (NNNCGNAANUCGN'N'N), die durch eine Haarnadel in zwei Dimensionen durch:
    Figure 00320001
    dargestellt werden kann.
  • Die dreidimensionale Struktur würde somit gegenüber der exakten Sequenz von drei der fünf Basenpaare und von zwei der fünf Schleifennucleotide unempfindlich sein und würde in allen oder in den meisten Versionen der Sequenz/Struktur ein geeigneter Ligand für die weitere Verwendung sein. Somit sollen Ligandenlösungen für eine potenziell große Sammlung an geeigneten Sequenz/Strukturen stehen, wovon jede durch die Familienbeschreibung, die ausschließlich für alle exakten Sequenz/Struktur-Lösungen sind, identifiziert wird. Weiters wird durch diese Definition erwogen, dass Ligandenlösungen nicht nur Elemente mit exakter numerischer Äquivalenz zwischen den verschiedenen Komponenten eines RNA-Motivs umfassen dürfen. Manche Liganden können Schleifen beispielsweise mit fünf Nucleotiden aufweisen, während andere Liganden für dasselbe Target weniger oder mehr Nucleotide in der äquivalenten Schleife enthalten können und dennoch in die Beschreibung der Ligandenlösung fallen.
  • Obwohl die durch SELEX hergeleitete Ligandenlösung eine relativ große Anzahl an potenziellen Elementen umfassen kann, sind die Ligandenlösungen targetspezifisch, und im Großteil der Fälle kann jedes Element der Ligandenlösungsfamilie als ein Nucleinsäure-Antikörper zum Target verwendet werden. Die Selektion eines spezifischen Elements aus einer Familie von Ligandenlösungen, das als ein Nucleinsäure-Antikörper zu verwenden ist, kann wie in der Beschreibung erläutert durchgeführt werden und kann durch zahlreiche praktische Überlegungen beeinflusst werden, die für Fachleute selbstverständlich ersichtlich sind.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird in Verbindungen mit Untersuchungen von Translationsregulation in Bakteriophagen-T4-Infektion entwickelt. Autoregulation der Synthese bestimmter viraler Proteine, wie der Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase (gp43), umfasst die Bindung des Proteins an seine eigene Nachricht, wodurch seine Translation blockiert wird. Das SELEX-Verfahren wurde verwendet, um die Sequenz- und Strukturerfordernisse der gp43-RNA-Bindungsstelle zu hinterleuchten. SELEX ermöglichte die rasche Selektion bevorzugter Bindungssequenzen aus einer Population zufälliger Nucleinsäuresequenzen. Während dies durch die Isolierung und Identifikation von Nucleinsäuresequenzen, die sich an Proteine binden, die sich bekanntlich an RNA binden, beispielhaft dargestellt wird, ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen auf die Selektion einer Nucleinsäure anwendbar, die in der Lage ist, jegliches gegebene Protein zu binden. Das Verfahren ist auf Selektion von Nucleinsäuren anwendbar, die sich an Proteine binden, die sich nicht (oder nicht bekanntlich) an Nucleinsäure als Teil ihrer natürlichen Aktivität oder biologischen Funktion binden. Das SELEX-Verfahren erfordert kein Wissen der Struktur oder Sequenz einer Bindungsstelle und kein Wissen der Struktur oder Sequenz des Targetproteins. Das Verfahren hängt nicht von gereinigtem Targetprotein für Selektionen ab. Im Allgemeinen reichert die Anwendung von SELEX Liganden des am häufigsten vorhandenen Targets an. Bei einem Gemisch von Liganden sind Verfahren zur Isolierung des Liganden eines bestimmten Targets verfügbar. Beispielsweise ein anderer Ligand (z.B. Substrat, Inhibitor, Antikörper) des erwünschten Targets kann verwendet werden, um spezifisch um Bindung an das Target zu konkurrieren, sodass der erwünschte Nucleinsäureligand aus Liganden von anderen Targets abgetrennt werden kann.
  • In der bevorzugten Ausführungsform bestehen Liganden, die durch SELEX hergeleitet werden, aus einzelsträngigen RNA-Sequenzen. Es ist ein maßgebliches Element dieser Erfindung, dass die Erfinder in der Lage waren, Schlussfolgerungen bezüglich RNA zu ziehen, die zu jenen Annahmen, die bisher auf dem Gebiet der Erfindung vorherrschten, konträr sind, und diese Schlussfolgerungen zu verwenden, um das SELEX-Verfahren zu verändern, um Nucleinsäure-Antikörper zu gewinnen, die aus Ligandenlösungen stammen.
  • RNA wurde zuerst als ein Informationsmessenger zwischen den DNA-Sequenzen, die die Gene sind, und den Proteinsequenzen, die innerhalb von Enzymen und anderen Proteinen zu finden sind, definiert. Von Beginn an, nachdem Watson und Crick die Struktur von DNA und die Verbindung zwischen DNA-Sequenz und Proteinsequenz beschrieben, wurden die Mittel, durch die Proteine synthetisiert wurden, in zahlreichen Bereichen der experimentellen Biochemie zu zentralen Elementen. Schließlich wurde Messenger-RNA (mRNA) als das chemische Zwischenprodukt zwischen Genen und Proteinen identifiziert. Die Mehrzahl von RNA-Spezies, die in Organismen vorhanden sind, sind mRNAs, und somit wird RNA weiterhin umfassend als ein Informationsmolekül betrachtet. RNA erfüllt seine Rolle als Informationsmolekül vor allem durch die Primärsequenz von Nucleotiden, in derselben Weise, wie DNA ihre Funktion als das Material von Genen durch die Primärsequenz von Nucleotiden erfüllt; das heißt, dass Information in Nucleinsäuren eindimensional dargestellt werden kann.
  • Als die Biochemie von Genexpression untersucht wurde, wurden mehrere RNA-Moleküle innerhalb von Zellen entdeckt, deren Rollen keine informativen waren. Ribosomen wurden als die Einheiten entdeckt, über die mRNAs in Proteine translatiert werden, und es wurde erkannt, dass Ribosomen essenzielle RNA (ribosomale RNAs oder rRNAs) enthielten. rRNAs wurden über zahlreiche Jahre hinweg als strukturell erachtet, eine Art von Gerüst, auf das die Proteinkomponenten des Ribosoms „aufgehängt" wurden, sodass die Proteinkomponenten des Ribosoms die proteinsynthetische Wirkung des Ribosoms darbringen konnten. Eine zusätzliche große Klasse von RNAs, die Transfer-RNAs (tRNAs), wurden vorausgesagt und gefunden. tRNAs sind die chemisch bifunktionellen Adaptoren, die Codons innerhalb von mRNA erkennen und die Aminosäuren tragen, die zu Protein kondensiert werden. Sehr interessant ist auch, dass, auch wenn eine tRNA-Struktur im Jahr 1974 durch Röntgenanalyse bestimmt wurde, die RNAs ein weiteres Jahrzehnt lang als primär eindimensionale „Stränge" betrachtet wurden. rRNA hatte unter der Forschungsgemeinschaft eine sonderbare Position eingenommen. Lange Zeit erahnte kaum jemand den Grund der umfassenden Ähnlichkeiten zwischen den rRNAs aus den verschiedenen Spezies und auch nicht die tatsächliche chemische Fähigkeit von RNA-Molekülen. Mehrere Forscher postulierten, dass RNA einst möglicherweise eine enzymatische und nicht eine informative Rolle spielte, doch diese Annahmen waren nie als Vorhersagen bezüglich der aktuellen Funktionen von RNA beabsichtigt.
  • Die Arbeit von Tom Cech über Ribozyme – eine neue Klasse von RNA-Molekülen – erweiterte das Wissen über die funktionelle Fähigkeit von RNA. Die Gruppe-I-Intronen sind in der Lage, autokatalytisch zu spleißen, und somit liegt zumindest eine gewisse eingeschränkte Katalyse im Bereich von RNA. Innerhalb dieses Bereichs von Katalyse liegt die Aktivität der RNA-Komponente von RNase P, eine Aktivität, die durch Altman und Pace entdeckt wurde. Cech und Altman erhielten der Nobelpreis für Chemie für ihre Arbeit, die die früheren Einschränkungen für RNA-Moleküle ausschließlich auf Informationsrollen revolutionierte. rRNAs werden nun, dank der Arbeit von Cech und Altman, von manchen als das katalytische Zentrum des Ribosoms betrachtet und werden nicht länger als ausschließlich strukturell gesehen.
  • Es ist eine zentrale Aussage dieser Erfindung, dass RNA-Moleküle in Hinblick auf Bindung und andere Fähigkeiten von der Forschungsgemeinschaft stets unterschätzt sind. Während das Interesse an Ribozymen zu einer beachtlichen Verstärkung der Forschung auf dem Gebiet der RNA-Funktionen führte, zieht die vorliegende Anmeldung in Betracht, dass die Formmöglichkeiten für RNA-Moleküle (und vielleicht auch für DNA) eine Gelegenheit bieten, SELEX zu verwenden, um RNAs mit praktisch jeder beliebigen Bindungsfunktion zu finden. Weiters wird angenommen, dass der Bereich von katalytischen Funktionen, der für RNA möglich ist, weit über das aktuelle herkömmliche Wissen hinausgeht, wenn er auch nicht notwendigerweise so breit wie jener von Proteinen ist.
  • Die dreidimensionalen Formen von manchen RNAs sind entweder direkt aus Röntgenbeugung oder aus NMR-Verfahren bekannt. Die bestehende Datenreihe ist eher spärlich. Die Strukturen von vier tRNAs konnten bisher aufgelöst werden, sowie drei kleinere RNA-Moleküle: zwei kleine Haarnadeln und ein kleiner Pseudoknoten. Die verschiedenen tRNAs, wenn sie auch verwandt sind, weisen Elemente einer einmaligen Struktur auf; beispielsweise sind die Anticodon-Basen der Verlängerungs-tRNAs in Richtung des Lösungsmittels ausgerichtet, während die Anticodon-Basen einer Initiator-tRNA eher weg vom Lösungsmittel zeigen. Manche dieser Unterschiede können aus Kristallgitter-Packungskräften resultieren, doch manche sind zweifellos auch ein Resultat von idiosynkratischer Energieminimierung durch verschiedene ein zelsträngige Sequenzen innerhalb homologer sekundärer und dreidimensionaler Strukturen.
  • Sequenzvariationen sind natürlich umfassend. Enthält eine einzelsträngige Schleife einer RNA-Haarnadel acht Nucleotide, so umfassen 65.536 verschiedene Sequenzen den gesättigten Sequenz-„Raum". Wenn hier auch keine Einschränkung auf die Theorie dieser Feststellung beabsichtigt ist, so nehmen die Erfinder dieser Erfindung doch an, dass jedes Element dieser Reihe durch Energieminimierung eine äußerst stabile Struktur aufweist und dass der Hauptteil jener Strukturen geringfügig unterschiedliche chemische Oberflächen gegenüber dem Lösungsmittel oder gegenüber potenziellen wechselwirkenden Targetmolekülen wie Proteinen aufweist. Wurden alle 65.536 Sequenzen innerhalb eines bestimmten strukturellen Motivs gegen die Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase getestet, so banden sich zwei Sequenzen dieser Reihe besser als alle anderen. Dies lässt darauf schließen, dass strukturelle Aspekte dieser zwei Sequenzen für dieses Target speziell sind und dass die übrigen 65.534 Sequenzen nicht so gut für Bindung an das Target geeignet sind. Es ist beinahe gewiss, dass innerhalb jener 65.536 Sequenzen auch andere einzelne Elemente oder Reihen von Elementen vorhanden sind, die für Wechselwirkung mit anderen Targets am besten geeignet sind.
  • Eine zentrale Idee in dieser Beschreibung von RNA-Strukturen ist, dass jede Sequenz ihre stabilste Struktur findet, auch wenn RNAs häufig in einer Form gezeichnet werden, die auf ein Zufallsknäuel oder ein schlappes unstrukturiertes Element schließen lassen würden. Für Homopolymere von RNA, die nicht in der Lage sind, Watson/Crick-Basenpaare zu formen, wird häufig erkannt, dass sie eine nicht-zufällige Struktur aufweisen, die dem „Stapeln" von Energie zuzuschreiben ist, die aus dem Fixieren der Positionen von benachbarten Basen übereinander gewonnen wird. Eindeutig können Sequenzen, die alle vier Nucleotide einbinden, lokale Regionen mit fixierter Struktur aufweisen, und sogar ohne Watson/Crick-Basenpaare kann eine nicht gleichförmige Sequenz mehr Struktur aufweisen, als vorerst angenommen wird. Das Auftreten fixierter Strukturen in RNA-Schleifen ist sogar noch häufiger. Die Anticodon-Schleifen von tRNAs weisen eine Struktur auf, und dies gilt – wahrschein lich – auch für die zwei gewinnenden Sequenzen, die sich am besten an T4-DNA-Polymerase binden.
  • Antiparallele Stränge von komplementärer Sequenz in RNA ergeben A-förmige Helices, aus denen Schleifensequenzen hervortreten und wieder zum Ausgangspunkt zurückkehren. Auch wenn die Schleifensequenzen kein starkes Potenzial aufweisen, wechselzuwirken, ist Energieminimierung eine energetisch freie Strukturoptimierung (das heißt, keine ersichtlichen Aktivierungsenergien blockieren Energieminimierung einer Schleifensequenz). Ein kinetisch wahrscheinlicher Ausgangspunkt für Optimierung kann das Schleifen-schließende Basenpaar eines RNA-Stamms sein, das eine flache Oberfläche aufweist, auf der optimale Stapelung von Schleifennucleotiden und -basen auftreten kann. Schleifen von RNA sind im Prinzip mit Schleifen von Proteinen, die antiparallele alpha-Helices oder beta-Stränge verbinden, gleichwertig. Obwohl diese Proteinschleifen häufig als Zufallsknäuel bezeichnet werden, sind sie weder zufällig noch gedreht. Solche Schleifen werden als „omega"-Strukturen bezeichnet, was zeigt, dass die Schleife an Positionen hervortritt und zurückkehrt, die in relativ großer Nähe zueinander liegen (siehe J. Leszczynski & G. Rose et al., Science 234, 849–855 (1986)); solche Positionen in einem Protein entsprechen konzeptuell dem Schleifen-schließenden Basenpaar einer RNA-Haarnadel.
  • Zahlreiche omega-Strukturen wurden durch Röntgenbeugung aufgelöst und als idiosynkratisch erkannt. Eindeutig jede Struktur ist das Resultat einer einmaligen Energieminimierung, die auf eine Schleife wirkt, deren Enden nahe beieinander liegen. Sowohl in Proteinen als auch in RNAs minimieren jene Schleifen Energie ohne Information aus der übrigen Struktur mit Ausnahme, nach einer ersten Annäherung, des Schleifen-schließenden Paars von Aminosäuren oder Basenpaaren. Sowohl im Fall von Protein-omega-Schleifen als auch von RNA-Haarnadelschleifen sind alle frei rotierbaren Bindungen am Versuch beteiligt, die freie Energie zu minimieren. RNA, so scheint es, reagiert eher auf Elektrostatik als Proteine, während Proteine viel mehr Freiheitsgrade aufweisen als RNAs. Somit ergeben Berechnungen von RNA-Strukturen durch Energieminimierung eher exakte Lösungsstrukturen als vergleichbare Berechnungen für Proteine.
  • Einzelsträngige Regionen sowohl von RNAs als auch von Protein können so gehalten werden, dass sie die mögliche Struktur verlängern. Das heißt, dass, wenn eine einzelsträngige Schleife in einer Proteinstruktur aus parallelen Strängen von alpha-Helix oder beta-Strängen hervortritt und zurückkehrt, die Punkte des Hervortretens und Zurückkehrens weiter voneinander entfernt sind als im Fall der omega-Strukturen. Weiters kann die Distanz, die vom Peptideinzelstrang überspannt wird, durch die Längen von paralleler/m alpha-Helix oder beta-Strang verändert werden.
  • Im Fall jener Proteinstrukturen, in denen der Einzelstrang über einer fixierten Proteinsekundärstruktur liegt, könnte die resultierende Energieminimierung im Prinzip Wechselwirkungen zwischen der einzelsträngigen Domäne und der zugrundeliegenden Struktur ermöglichen. Es ist wahrscheinlich, dass Aminosäureseitenketten, die Salzbrücken in Sekundärstrukturen bilden können, dasselbe in verlängerten Einzelsträngen machen könnten, die an der Spitze von regulären Sekundärstrukturen liegen. Somit sind die exakten Strukturen von solchen Proteinregionen wiederum idiosynkratisch und sehr stark sequenzabhängig. In diesem Fall umfasst die Sequenzabhängigkeit sowohl den Einzelstrang als auch die zugrundeliegende Sequenz der Sekundärstruktur.
  • Interessanterweise ist eine RNA-Struktur, die als ein Pseudoknoten bekannt ist, analog zu diesen verlängerten Proteinmotiven und kann dazu dienen, in Richtung Lösungsmittel oder Targetmoleküle verlängerte Einzelstränge von RNA aufzuweisen, deren Basen idiosynkratisch entweder in Richtung des Lösungsmittels/Targets oder in Richtung einer zugrundeliegenden RNA-Sekundärstruktur angeordnet sind. Pseudoknoten haben, wie Proteinmotive, die auf Schleifen zwischen Parallelsträngen basieren, die Fähigkeit, die Länge von Einzelstrang und die Sequenz der Helix, auf der er liegt, zu verändern.
  • Somit ist es, exakt wie in Proteinmotiven, durch Kovariation mit Sequenzen in der zugrundeliegenden Sekundärstruktur möglich, einzelsträngige Nucleotide und Basen entweder in Richtung des Lösungsmittels oder der zugrundeliegenden Struktur zu präsentieren und somit die Elektrostatik und die funktionellen chemischen Gruppen, die mit Targets wechselwirken, zu verändern. Es ist wichtig anzumerken, dass solche Strukturvarianten aus Energieminimierungen resultieren, doch nur eine Pseudoknotenstruktur ist bekannt, sogar bei geringer Auflösung. Nichtsdestoweniger entsteht der Wert dieser Erfindung aus der Erkenntnis, dass die Form und die funktionellen Displays, die aus Pseudoknoten möglich sind, bezüglich ihrer einmaligen Qualitäten als beinahe unendlich erkannt werden.
  • Sowohl Haarnadelschleifen als auch die einzelsträngige Domäne von Pseudoknoten werden auf antiparallele RNA-Helices aufgebaut. Helices aus RNA können Unregelmäßigkeiten aufweisen, die als Ausweitungen bezeichnet werden. Ausweitungen können in einem Strang einer Helix oder in beiden vorhanden sein und liefern idiosynkratische strukturelle Eigenschaften, die zur Targeterkennung nützlich sind. Darüber hinaus können Helix-Unregelmäßigkeiten winkelige Verbindungen zwischen regulären Helices liefern.
  • Eine große Ausweitung (siehe 13) an einem Strang von RNA kann mit Haarnadelschleifen verglichen werden, mit der Ausnahme, dass das Schleifen-schließende Basenpaar durch die zwei die Ausweitung flankierenden Basenpaare ersetzt ist.
  • Asymmetrische Ausweitungen (siehe 13) können eine verlängerte und unregelmäßige Struktur bereitstellen, die durch Nucleotidkontakte quer über die Ausweitung stabilisiert wird. Diese Kontakte können Watson/Crick-Wechselwirkungen oder jegliche andere stabilisierende Anordnung umfassen, einschließlich anderer Wasserstoffbindungen und Basenstapelung.
  • Schließlich ist es, wenn fixierte RNA-Formen oder -Motive in Betracht gezogen werden, sehr aufschlussreich zu berücksichtigen, welche grundsätzlichen Unterschiede zwischen RNA und Proteinen bestehen. Da von Protein angenommen wird, dass es im Laufe der Evolution RNA bezüglich jener Aktivitäten, die nun beinahe vollständig von Proteinen und Peptiden ausgeführt werden, einschließlich Katalyse und hochspezifische Erkennung, ersetzt hat, wird von den chemischen Eigenschaften von Proteinen angenommen, dass sie zur Konstruktion verschiedener Formen und Aktivi täten nützlicher als RNA sind. Die hauptsächliche Argumentation bezieht sich auf die Existenz von 20 Aminosäuren gegenüber nur vier Nucleotiden, die stark ionischen Qualitäten von Lysin, Arginin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, die in den RNA-Basen kein Gegenstück haben, die relative Neutralität der Peptidhauptkette im Vergleich zur stark negativen Zucker-Phosphat-Hauptkette von Nucleinsäuren, die Existenz von Histidin mit einem pK-Wert nahe der Neutralität, die Tatsache, dass die Seitenketten der Aminosäuren in Richtung des Lösungsmittels sowohl in alpha-Helices als auch in beta-Strängen zeigt, und die regulären Sekundärstrukturen von Proteinen. In den doppelsträngigen Nucleinsäuren, einschließlich RNA, sind in Basenpaaren die Basen gegeneinander ausgerichtet und verwenden viel der chemischen Information, die auf der eindimensionalen Ebene vorhanden ist. Aus jedem bis heute bekannten Betrachtungswinkel der möglichen Einbindung in Formdiversität und Funktion kann angenommen werden, dass Proteine den Nucleinsäuren, einschließlich RNA, stark überlegene chemische Bestandteil sind. Im Laufe der Evolution wurden Proteine, und nicht RNA, für Erkennung und Katalyse ausgewählt, was die zur Zeit weitverbreitete Betrachtungsweise untermauert.
  • Umgekehrt, was für diese Erfindung auch maßgeblich ist, ermöglicht die enorme Anzahl an Sequenzen und Formen, die für RNA möglich sind, denkbar jede erwünschte Funktion und Bindungsaffinität, insbesondere in Bezug auf Sequenzen, die während der gesamten Evolutionsgeschichte nie getestet wurden, auch wenn RNA aus nur vier Nucleotiden besteht und auch wenn die Hauptkette einer RNA so stark geladen ist. Das heißt, dass die zuvor beschriebenen RNA-Motive mit geeigneter Sequenzspezifizierung im Raum jene chemischen Funktionen ergeben, die erforderlich sind, um feste und spezifische Bindung an die meisten Targets bereitzustellen. Es mag vorgeschlagen werden, dass RNA so vielseitig wie das Immunsystem ist. Das heißt, dass, während das Immunsystem eine passende Antwort auf jegliches erwünschte Target liefert, RNA dieselben Möglichkeiten liefert. Die hierin beschriebene ausführbare Methodik kann 1018 Sequenzen verwenden und somit eine enorme Anzahl an Strukturen durchprobieren, sodass, welche innewohnenden Vorteile Proteine oder spezifische Antikörper auch gegenüber RNA aufweisen mögen, diese durch den Umfang des möglichen „Pools", aus dem RNA-Liganden selektiert werden, kompensiert werden. Darüber hinaus kann mit der Verwendung modifizierter Nucleotide RNA verwendet werden, die in sich chemisch stärker variiert ist als natürliche RNAs.
  • Das SELEX-Verfahren umfasst die Kombination einer Selektion von Nucleinsäureliganden, die sich an ein Targetmolekül, beispielsweise ein Protein, binden, mit Amplifikation jener selektierten Nucleinsäuren. Wiederholtes Zyklieren der Selektions/Amplifikationsschritte ermöglicht die Selektion einer oder einer geringen Anzahl von Nucleinsäure(n), die sich am stärksten an das Target aus einem Pool bindet/n, der eine sehr große Anzahl an Nucleinsäuren enthält.
  • Zyklieren des Selektions/Amplifikationsverfahrens wird fortgesetzt, bis ein selektiertes Ziel erreicht wurde. Beispielsweise kann das Zyklieren fortgesetzt werden, bis ein erwünschter Grad an Bindung der Nucleinsäuren im Testgemisch erreicht wurde oder bis eine Mindestanzahl an Nucleinsäurekomponenten des Gemisches erreicht wurde (im äußersten Fall, bis eine einzelne Spezies im Testgemisch verbleibt). In zahlreichen Fällen wird erwünscht, Zyklieren fortzusetzen, bis keine weitere Verbesserung von Bindung mehr erreicht wird. Es kann vorkommen, dass bestimmte Testgemische von Nucleinsäuren eine geringfügige Verbesserung von Bindung gegenüber Hintergrundniveaus während des Zyklierens von Selektion/Amplifikation aufzeigen. In solchen Fällen sollte die Sequenzvariation im Testgemisch gesteigert werden und mehr der möglichen Sequenzvarianten umfassen, oder die Länge der Sequenzrandomisierten Region sollte gesteigert werden, bis Verbesserungen von Bindung erreicht wurden. Verankerungs-Arbeitsvorschriften und/oder Walking-Verfahren können auch verwendet werden.
  • Insbesondere erfordert das Verfahren die anfängliche Herstellung eines Testgemisches von Kandidaten-Nucleinsäuren. Die einzelnen Test-Nucleinsäuren können eine randomisierte Region enthalten, die durch Sequenzen flankiert ist, die in allen Nucleinsäuren im Gemisch konserviert sind. Die konservierten Regionen werden bereitgestellt, um Amplifikation selektierter Nucleinsäuren zu erleichtern. Da es zahlreiche solche Sequenzen gibt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, ist die Sequenzauswahl von durchschnittlichen Fachleuten unter Berücksichtigung des er wünschten Amplifikationsverfahrens durchführbar. Die randomisierte Region kann eine vollständig oder teilweise randomisierte Sequenz aufweisen. Alternativ dazu kann dieser Abschnitt der Nucleinsäure Untereinheiten enthalten, die randomisiert sind, zusammen mit Untereinheiten, die in allen Nucleinsäurespezies im Gemisch konstant gehalten werden. Beispielsweise können die Sequenzregionen, die dafür bekannt sind, das Targetprotein zu binden, oder für Bindung an das Targetprotein ausgewählt werden, in randomisierte Regionen integriert werden, um verbesserte Bindung oder verbesserte Bindungsspezifität zu erreichen. Sequenzvariabilität im Testgemisch kann auch durch Bilden von Mutationen in den Nucleinsäuren im Testgemisch während des Selektions/Amplifikationsverfahrens eingeführt oder erhöht werden. Im Prinzip können die Nucleinsäuren, die im Testgemisch verwendet werden, jegliche Länge aufweisen, solange sie amplifiziert werden können. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird am praktischsten für Selektion aus einer großen Anzahl an Sequenzvarianten verwendet. Somit wird erwogen, dass das vorliegende Verfahren vorzugsweise verwendet wird, um Bindung von Nucleinsäuresequenzen zu bewerten, die eine Länge im Bereich von etwa vier Basen bis hin zu jeglicher erreichbaren Größe aufweisen.
  • Der randomisierte Abschnitt der Nucleinsäuren im Testgemisch kann auf zahlreiche Weisen hergeleitet werden. Beispielsweise kann vollständige oder teilweise Randomisierung leicht durch direkte chemische Synthese der Nucleinsäure (oder eines Teils davon) oder durch Synthese einer Matrix, aus der die Nucleinsäure (oder Teile davon) unter Verwendung von geeigneten Enzymen hergestellt werden kann, erreicht werden. Endhinzufügen, katalysiert durch Terminal-Transferase in Gegenwart von nicht einschränkenden Konzentrationen aller vier Nucleotidtriphosphate, kann eine randomisierte Sequenz zu einem Segment hinzufügen. Sequenzvariabilität in den Testnucleinsäuren kann auch durch Verwenden von größenselektierten Fragmenten von teilweise verdauten (oder anders gespalteten) Präparaten aus großen, natürlichen Nucleinsäuren, wie genomischen DNA-Präparaten oder zellulären RNA-Präparaten, erreicht werden. In diesen Fällen, in denen randomisierte Sequenz verwendet wird, ist es nicht erforderlich (oder aus langen randomisierten Segmenten möglich), dass das Testgemisch alle möglichen Sequenzvarianten enthält. Es wird im Allgemeinen bevorzugt, dass das Testgemisch eine so große Anzahl an möglichen Sequenzvarianten enthält, wie dies für Selektion praktisch ist, um sicherzustellen, dass eine maximale Anzahl an potenziellen Bindungssequenzen identifiziert wird. Eine randomisierte Sequenz von 30 Nucleotiden enthält berechnete 1018 verschiedene Kandidatensequenzen. Praktisch gesehen ist es besser, nur etwa 1018 Kandidaten in einer einzelnen Selektion zu prüfen. Praktische Überlegungen umfassen die Anzahl an Matrices an der DNA-Synthesesäule und die Löslichkeit von RNA und dem Target in Lösung. (Natürlich gibt es keine theoretische Einschränkung für die Anzahl an Sequenzen im Targetgemisch.) Daher enthalten Kandidatengemische, die randomisierte Segmente mit einer Länge von mehr als 30 aufweisen, zu viele mögliche Sequenzen, als dass alle auf praktische Weise in einer Selektion geprüft werden könnten. Es ist nicht erforderlich, alle möglichen Sequenzen eines Kandidatengemisches zu prüfen, um einen Nucleinsäureliganden der Erfindung zu selektieren. Es ist eine Grundlage des Verfahrens, dass die Nucleinsäuren des Testgemisches in der Lage sind, amplifiziert zu werden. Somit wird bevorzugt, dass jegliche konservierten Regionen, die in den Testnucleinsäuren verwendet werden, keine Sequenzen enthalten, die Amplifikation stören.
  • Die verschiedenen, zuvor beschriebenen RNA-Motive können fast immer durch ein Polynucleotid definiert werden, das etwa 30 Nucleotide enthält. Aufgrund der physikalischen Einschränkungen des SELEX-Verfahrens ist ein randomisiertes Gemisch, das etwa 30 Nucleotide enthält, auch etwa das längste zusammenhängende randomisierte Segment, das verwendet werden kann, wobei es in der Lage ist, im Wesentlichen alle der potenziellen Varianten zu testen. Es ist daher eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, eine randomisierte Sequenz von zumindest 15 Nucleotiden zu verwenden, die zumindest etwa 109 Nucleinsäuren enthält, und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform zumindest 25 Nucleotide enthält, wenn ein Kandidatengemisch mit einer zusammenhängenden randomisierten Region verwendet wird.
  • Diese Erfindung umfasst Kandidatengemische, die alle möglichen Varianten eines zusammenhängenden randomisierten Segments von zumindest 15 Nucleotiden ent halten. Jedes einzelne Element im Kandidatengemisch kann auch aus fixierten Sequenzen bestehen, die das randomisierte Segment flankieren, das die Amplifikation der selektierten Nucleinsäuresequenzen unterstützt.
  • Kandidatengemische können auch hergestellt werden, die sowohl randomisierte Sequenzen als auch fixierte Sequenzen enthalten, worin die fixierten Sequenzen zusätzlich zum Amplifikationsverfahren eine weitere Funktion erfüllen. In einer Ausführungsform der Erfindung können die fixierten Sequenzen in einem Kandidatengemisch selektiert werden, um den Prozentsatz von Nucleinsäuren im Kandidatengemisch zu steigern, das ein gegebenes Nucleinsäuremotiv oder eine gegebene Tertiärstruktur aufweist. Beispielsweise ermöglicht es die Einbindung der geeigneten fixierten Nucleotide, den Prozentsatz von Pseudoknoten oder Haarnadelschleifen in einem Kandidatengemisch zu steigern. Ein Kandidatengemisch, das einschließlich fixierter Sequenzen hergestellt wurde, die den Prozentsatz eines gegebenen strukturellen Nucleinsäuremotivs steigern, ist daher ein Teil dieser Erfindung. Fachleute werden auf Grundlage einer Routineuntersuchung zahlreicher verschiedener, hierin beschriebener Nuclein-Antikörper in der Lage sein, ohne übermäßiges Experimentieren solch ein Kandidatengemisch zu konstruieren. Die nachstehenden Beispiele 2 und 8 beschreiben spezifische Beispiele für Kandidatengemische, die verändert werden, um bevorzugte RNA-Motive zu maximieren.
  • Kandidatengemische, die verschiedene fixierte Sequenzen enthalten oder eine zweckvolle, teilweise randomisierte Sequenz verwenden, können auch eingesetzt werden, nachdem eine Ligandenlösung oder eine teilweise Ligandenlösung durch SELEX erhalten wurde. Ein neues SELEX-Verfahren kann dann mit einem Kandidatengemisch initiiert werden, das durch die Ligandenlösung Information enthält.
  • Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein beispielhaftes Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren. Beschreibungen von PCR-Verfahren sind beispielsweise in Saiki et al., Science 230, 1350–1354 (1985); Saiki et al., Nature 324, 163–166 (1986); Scharf et al., Science 233, 1076–1078 (1986); Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 9436–9440 (1988); und im US-Patent Nr. 4.683.195 (Multis et al.) und im US-Patent Nr. 4.683.202 (Multis et al.) zu finden. In seiner Grundform umfasst PCR-Amplifikation wiederholte Zyklen von Replikation einer erwünschten einzelsträngigen DNA (oder cDNA-Kopie einer RNA) unter Verwendung spezifischer Oligonucleotidprimer, die zu den 3'- und 5'-Enden der ssDNA komplementär sind, Primerextension mit einer DNA-Polymerase und DNA-Denaturierung. Produkte, die durch Extension aus einem Primer gebildet werden, dienen als Matrices für Extension aus dem anderen Primer. Ein verwandtes Amplifikationsverfahren, das in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 89/01050 (Burg et al.) beschrieben wird, erfordert die Gegenwart oder Einführung einer Promotorsequenz stromauf der zu amplifizierenden Sequenz, um ein doppelsträngiges Zwischenprodukt zu ergeben. Mehrfach-RNA-Kopien des doppelsträngigen Promotor enthaltenden Zwischenprodukts werden dann unter Verwendung von RNA-Polymerase produziert. Die resultierenden RNA-Kopien werden mit reverser Transkriptase behandelt, um zusätzliche, doppelsträngigen Promotor enthaltende Zwischenprodukte zu bilden, die dann einem weiteren Amplifikationsdurchgang mit RNA-Polymerase unterzogen werden können. Alternative Amplifikationsverfahren umfassen unter anderem das Klonieren selektierter DNAs oder cDNA-Kopien selektierter RNAs in einen geeigneten Vektor und das Einführen dieses Vektors in einen Wirtsorganismus, wo der Vektor und die klonierten DNAs repliziert und somit amplifiziert werden (J.C. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 1874 (1990)). Im Allgemeinen kann jegliches Mittel, das zuverlässige, wirksame Amplifikation selektierter Nucleinsäuresequenzen ermöglicht, im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es ist nur notwendig, dass die proportionale Darstellung von Sequenzen nach der Amplifikation zumindest ungefähr den relativen Proportionen von Sequenzen im Gemisch vor der Amplifikation entspricht.
  • Spezifische Verfahren zur Amplifikation der hierin beschriebenen RNAs wurden aufbauend auf Innis et al. (1988), s.o., entwickelt. Die RNA-Moleküle und Targetmoleküle im Testgemisch wurden so entworfen, dass sie nach Amplifikation und PCR wesentliche T7-Promotorsequenzen in ihren 5'-Abschnitten bereitstellen. VolllängencDNA-Kopien von selektierten RNA-Molekülen wurden unter Verwendung von reverser Transkriptase, geprimt mit einem Oligomer, das zu den 3'-Sequenzen der selektierten RNAs komplementär ist, gebildet. Die resultierenden cDNAs wurden durch Taq-DNA-Polymerasekettenextension amplifiziert, was die T7-Promotorsequenzen in den selektierten DNAs lieferte. Doppelsträngige Produkte dieses Amplifikationsverfahrens wurden dann in vitro transkribiert. Die Transkripte wurden im nächsten Selektions/Amplifikationszyklus verwendet. Das Verfahren kann gegebenenfalls geeignete Nucleinsäure-Reinigungsschritte umfassen.
  • Im Allgemeinen kann jegliche Arbeitsvorschrift, die die Selektion von Nucleinsäuren basierend auf ihrer Fähigkeit, sich spezifisch an ein anderes Molekül, d.h. an ein Protein oder ganz allgemein gesprochen an jegliches Targetmolekül, zu binden, ermöglicht, im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es ist nur erforderlich, dass die Selektion Nucleinsäuren abtrennt, die in der Lage sind, amplifiziert zu werden. Bei einer Filterbindungsselektion beispielsweise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wird, in der ein Testnucleinsäuregemisch mit Targetprotein inkubiert wird, wird dann das Nucleinsäure/Proteingemisch durch ein Nitrocellulosefilter filtriert und mit geeignetem Puffer gewaschen, um freie Nucleinsäuren zu entfernen. Protein/Nucleinsäure bleiben häufig am Filter gebunden. Die relativen Konzentrationen von Protein zum Testen von Nucleinsäure im inkubierten Gemisch beeinflusst die Stärke von Bindung, auf die selektiert wird. Ist Nucleinsäure im Überschuss vorhanden, so tritt Konkurrenz um freie Bindungsstellen ein, und jene Nucleinsäuren, die sich am stärksten binden, werden selektiert. Umgekehrt wird erwartet, dass, wenn ein Überschuss von Protein verwendet wird, jede Nucleinsäure, die sich an das Protein bindet, selektiert wird. Die relativen verwendeten Konzentrationen von Protein zu Nucleinsäure, um die erwünschte Selektion zu erreichen, hängt vom Typ des Proteins, der Stärke der Bindungswechselwirkung und dem Grad jeglicher vorhandener Hintergrundbindung ab. Die relativen Konzentrationen, die erforderlich sind, um das erwünschte Selektionsresultat zu erreichen, können empirisch leicht und ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. In ähnlicher Weise kann es erforderlich sein, das Filterwaschverfahren zu optimieren, um Hintergrundbindung zu minimieren. Solch eine Optimierung der Filterwaschverfahren liegt wiederum im Kompetenzbereich durchschnittlicher Fachleute.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung verwendeten eine mathematische Evaluierung von SELEX, die als SELEXION bezeichnet wird. Anhang A dieser Anmeldung umfasst einen kurzen Überblick zur mathematischen Analyse, die verwendet wurde, um allgemeine Feststellungen bezüglich SELEX, abgeleitet von SELEXION, zu erhalten.
  • Die aus SELEXION abgeleiteten Generalisierungen sind die folgenden: 1) Die Wahrscheinlichkeit, die best-bindende RNA in jedem Durchgang von SELEX zu erhalten, steigt mit der Anzahl solcher vorhandenen Moleküle, mit ihrem Bindungsvorteil gegenüber dem Haupt-RNA-Pool und mit der Gesamtmenge an verwendetem Protein. Obwohl es intuitiv nicht immer einfach ist, im Vorhinein zu wissen, wie die Bindungsdifferenz maximiert werden kann, kann die Wahrscheinlichkeit, die am besten bindende RNA zu finden, dennoch durch Maximieren der Anzahl an überprüften RNA-Molekülen und Target-Molekülen gesteigert werden; 2) die idealen Nucleinsäure- und Proteinkonzentrationen, die in den verschiedenen Durchgängen von SELEX zu verwenden sind, hängen von mehreren Faktoren ab. Die Versuchsparameter, die von SELEXION vorgeschlagen werden, gleichen jenen, die in den Beispielen hierin verwendet werden. Ist beispielsweise die relative Affinität der letztlichen Ligandenlösung nicht bekannt – was fast unumgänglich der Fall ist, wenn SELEX durchgeführt wird –, so wird bevorzugt, dass die Konzentrationen von Protein und Nucleinsäure-Kandidatengemisch so ausgewählt werden, dass eine Bindung zwischen etwa 3 und 7 % der gesamten Nucleinsäuren an das Proteintarget erreicht wird. Unter Einhaltung dieses Kriteriums kann erwartet werden, dass eine zehnfache bis zwanzigfache Anreicherung an hochaffinen Liganden in jeder Runde von SELEX erreicht wird.
  • Die Versuchsbedingungen, die verwendet werden, um Nucleinsäureliganden zu Targets in der bevorzugten Ausführungsform zu selektieren, werden so ausgewählt, dass die Umgebung, in der das Target in vivo gefunden wurde, nachgeahmt wird. Beispiel 10 unten zeigt auf, wie eine Veränderung der Selektionsbedingungen die Ligandenlösung, die zu einem bestimmten Target erhalten wird, beeinflusst. Obwohl die Ligandenlösung zu NGF signifikante Ähnlichkeiten unter hohen und niedrigen Salzbedingungen aufzeigte, wurden auch Unterschiede beobachtet. Veränderbare Bedingungen, die verändert werden können, um die In-vivo-Umgebung des Targets exakter widerzuspiegeln, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Gesamtionenstärke, die Konzentration an zweiwertigen Kationen und den pH der Lösung. Fachleute werden problemlos in der Lage sein, die geeigneten Trennungsbedingungen basierend auf der Kenntnis des gegebenen Targets auszuwählen.
  • Um zum Amplifikationsschritt überzugehen, müssen selektierte Nucleinsäuren aus dem Target nach dem Abtrennen freigesetzt werden. Dieses Verfahren muss ohne chemischen Abbau der selektierten Nucleinsäuren erfolgen und muss amplifizierbare Nucleinsäuren ergeben. In einer spezifischen Ausführungsform werden selektierte RNA-Moleküle aus Nitrocellulosefiltern unter Verwendung von frisch hergestellter Lösung, die 200 μl von 7 M Harnstoff, 20 mM Natriumcitrat (pH 5,0), 1 mM EDTA-Lösung, kombiniert mit 500 μl Phenol (äquilibriert mit 0,1 M Natriumacetat, pH 5,2) enthält, eluiert. Eine Lösung von 200 μl 7 M Harnstoff mit 500 μl Phenol wurde bereits erfolgreich verwendet. Die eluierte Lösung von selektierter RNA wurde dann mit Ether extrahiert, Ethanol-gefällt, und der Niederschlag wurde in Wasser resuspendiert. Zahlreiche verschiedene Pufferbedingungen zur Elution von selektierter RNA aus den Filtern können verwendet werden. Beispielsweise können, ohne darauf eingeschränkt zu sein, nicht-oberflächenaktive wässrige Protein-denaturierende Mittel wie Guanidiniumchlorid, Guanidiniumthiocyanat usw., die nach dem Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Die spezifische Lösung, die zur Elution von Nucleinsäuren aus dem Filter verwendet werden, kann von durchschnittlichen Fachleuten routinemäßig ausgewählt werden.
  • Alternativ dazu sind Abtrennungsarbeitsvorschriften zum Abtrennen von Nucleinsäuren, die an Targets, insbesondere Proteine, gebunden sind, auf dem Gebiet der Erfindung verfügbar. Zum Beispiel können Bindung und Abtrennung mittels Durchführung des Testnucleinsäuregemisches durch eine Säule, die das Targetmolekül, gebunden an ein festes Trägermaterial, enthält, erreicht werden. Jene Nucleinsäuren, die sich an das Target binden, werden an der Säule festgehalten, und nicht gebundene Nucleinsäuren werden von der Säule abgewaschen.
  • In dieser gesamten Anmeldung wurde das SELEX-Verfahren als ein sich wiederholender Prozess definiert, worin Selektion und Amplifikation wiederholt werden, bis eine erwünschte Selektivität erreicht wurde. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Selektionsverfahren ausreichend wirksam sein, um eine Ligandenlösung nach nur einem Abtrennungsschritt bereitzustellen. Theoretisch sollte beispielsweise eine Säule, die das Target trägt und durch die das Kandidatengemisch – unter den geeigneten Bedingungen und mit einer ausreichend langen Säule – eingeführt wird, in der Lage sein, Nucleinsäuren basierend auf Affinität zum Target ausreichend abzutrennen, um eine Ligandenlösung zu erhalten. In dem Maße, in dem der ursprüngliche Selektionsschritt ausreichend selektiv ist, um eine Ligandenlösung nach nur einem Schritt zu erhalten, ist solch ein Verfahren auch im Schutzumfang dieser Erfindung eingebunden.
  • In einer Ausführungsform wird SELEX wiederholt durchgeführt, bis ein einzelner Nucleinsäureligand oder eine eingeschränkte kleine Anzahl an Nucleinsäureliganden im Kandidatengemisch nach Amplifikation zurückbleibt/zurückbleiben. In solchen Fällen wird die Ligandenlösung als eine einzelne Nucleinsäuresequenz dargestellt und umfasst nicht eine Familie von Sequenzen, die vergleichbare Bindungsaffinitäten zum Target aufweisen.
  • In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die SELEX-Wiederholungen zu einem bestimmten Punkt unterbrochen, zu dem das Kandidatengemisch an Nucleinsäureliganden mit höherer Bindungsaffinität angereichert ist, jedoch stets eine relativ große Anzahl an unterschiedlichen Sequenzen aufweist. Dieser Punkt kann von Fachleuten durch periodisches Analysieren der Sequenzrandomisierung des Hauptteils des Kandidatengemisches oder durch Testen der Affinität des Hauptteils zum Target bestimmt werden.
  • Zu diesem Zeitpunkt wird SELEX bestimmt, und Klone werden hergestellt und sequenziert. Natürlich gibt es eine beinahe uneingeschränkte Anzahl an Klonen, die sequenziert werden könnten. Wie in den Beispielen unten gesehen werden kann, ist es jedoch nach dem Sequenzieren von zwischen 20 und 50 Klonen im Allgemeinen möglich, die am häufigsten vorhandenen Sequenzen nachzuweisen und die Eigenschaften der Ligandenlösung zu definieren. In einem theoretischen Beispiel wird nach dem Klonieren von 30 Sequenzen erkannt werden, dass 6 Sequenzen identisch sind, während bestimmte Sequenzabschnitte von 20 der anderen Sequenzen eng mit den Sequenzen innerhalb der „gewinnenden" Sequenzen verwandt sind. Wenn auch die am häufigsten vorkommende Sequenz als eine Ligandenlösung zu jenem Target betrachtet werden kann, ist es häufig geeigneter, eine Ligandenlösung zu konstruieren oder zu beschreiben, die aus einer Familie von Sequenzen besteht, die die allgemeinen Eigenschaften zahlreicher der klonierten Sequenzen umfasst.
  • In einem weiteren Beispiel kann eine Ligandenlösung, die als eine Familie von Sequenzen dargestellt wird, die zahlreiche definierende Eigenschaften aufweisen (z.B. wenn die Ligandenlösung AAGUNNGUNNCNNNN ist, worin N offensichtlich jedes der vier Nucleotide sein kann), verwendet werden, um ein zusätzliches SELEX-Verfahren zu beginnen. In dieser Ausführungsform würde sich das Kandidatengemisch aus teilweise fixierten und teilweise zufälligen Nucleotiden zusammensetzen, wobei die fixierten Nucleotide basierend auf der im anfänglichen SELEX-Verfahren erhaltenen Ligandenlösung selektiert werden. Auf diese Weise wird, wenn es eine einzelne Nucleotidsequenz gibt, die sich besser als die anderen Mitglieder der Ligandenlösungsfamilie bindet, diese rasch identifiziert werden.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird auch ein zweiter SELEX-Versuch basierend auf der in einem SELEX-Verfahren erhaltenen Ligandenlösung verwendet. In dieser Ausführungsform wird die einzelne, am häufigsten vorkommende Sequenz (z.B. AAGUCCGUAACACAC) verwendet, um das zweite SELEX-Verfahren zu informieren. In diesem zweiten SELEX-Verfahren wird das Kandidatengemisch hergestellt, um Sequenzen basierend auf dem ausgewählten Gewinner zu erhalten, während sichergestellt wird, dass es an jeder der Sequenzen ausreichende Randomisierung gibt. Dieses Kandidatengemisch kann unter Verwendung von Nucleotid-Ausgangsmaterialien gebildet werden, die eher durch Vorgabe bestimmt als randomisiert sind. Die A-Lösung enthält beispielsweise 75 % A und 25 % U, C und G. Obwohl der Nucleinsäure-Syntheseautomat so eingestellt ist, dass er das vorherr schende Nucleotid ergibt, führt die Gegenwart der anderen Nucleotide in der A-Lösung zu Nucleinsäuresequenzen, die vorwiegend A aufweisen, jedoch auch Variationen in dieser Position ergeben werden. Wiederum wird dieser zweite SELEX-Durchgang, informiert durch die im anfänglichen SELEX-Verfahren erhaltenen Resultate, die Wahrscheinlichkeit, die beste Ligandenlösung zu einem gegebenen Target zu erhalten, maximieren. Auch hier muss angemerkt werden, dass die Ligandenlösung aus einem einzelnen bevorzugten Nucleinsäureliganden bestehen kann oder dass sie aus einer Familie von strukturell verwandten Sequenzen mit wesentlich ähnlichen Bindungsaffinitäten bestehen kann.
  • In der Praxis kann gegebenenfalls bevorzugt werden, dass das SELEX-Verfahren nicht durchgeführt wird, bis eine einzelne Sequenz erhalten wird. Das SELEX-Verfahren enthält mehrere Vorgabepunkte, die das Überwiegen bestimmter Sequenzen in einem Kandidatengemisch nach mehreren SELEX-Durchgängen beeinflussen können, die mit der Bindungsaffinität von jener Sequenz zum Target nicht in Verbindung stehen. Eine Vorgabe für oder gegen bestimmte Sequenzen kann beispielsweise während der Herstellung von cDNA aus der nach der Selektion gewonnen RNA auftreten oder auch während des Amplifikationsverfahrens. Die Wirkungen von solchen nicht vorhersagbaren Vorgaben können durch das Anhalten von SELEX vor dem Zeitpunkt, zu dem nur eine Sequenz oder eine geringe Anzahl an Sequenzen, die im Reaktionsgemisch vorwiegend vorhanden ist bzw. sind, minimiert werden.
  • Wie zuvor erwähnt kann Sequenzvariation im Testnucleinsäuregemisch durch Mutation erreicht oder gesteigert werden. Es wurde beispielsweise ein Verfahren für wirksame Mutagenese von Nucleinsäuresequenzen während PCR-Amplifikation beschrieben (Leung et al., 1989). Dieses Verfahren oder funktionell äquivalente Verfahren können in der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls mit Amplifikationsverfahren kombiniert werden.
  • Alternativ dazu können herkömmliche Verfahren von DNA-Mutagenese in das Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren eingebunden werden. Anwendbare Mutagenese verfahren umfassen unter anderem chemisch induzierte Mutagenese und ortsgerichtete Oligonucleotidmutagenese.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch auf die Verwendung zusätzlicher interessanter Fähigkeiten von Nucleinsäuren und die Weise, in der sie bekanntlich mit Targets wie Proteinen wechselwirken, oder die Weise, die erst für die Wechselwirkungen dieser Nucleinsäuren erkannt werden muss, erweitert werden. Beispielsweise kann ein SELEX-Verfahren verwendet werden, um auf Liganden zu screenen, die Michael-Addukte mit Proteinen bilden. Pyrimidine, wenn sie an der korrekten Stelle innerhalb eines Proteins sitzen, üblicherweise benachbart zu einem maßgeblichen Cystein oder anderen Nucleophil, können mit diesem Nucleophil reagieren, um ein Michael-Addukt zu bilden. Der Mechanismus, durch den Michael-Addukte gebildet werden, bindet einen nucleophilen Angriff an der 6-Position der Pyrimidinbase ein, um ein vorübergehendes (jedoch sich langsam umkehrendes) Zwischenprodukt zu schaffen, das tatsächlich ein 5,6-Dihydropyrimidin ist. Es ist möglich, auf die Gegenwart solcher Zwischenprodukte durch Beobachten, ob Bindung zwischen einer RNA und einem Proteintarget eintritt, auch nachdem das Protein mit jeglichem geeigneten Denaturierungsmittel denaturiert wurde, zu testen. Das heißt, es wird nach einer kontinuierlichen kovalenten Wechselwirkung gesucht, wenn die Bindungstasche des Targets zerstört wurde. Michael-Addukte sind jedoch häufig reversibel, und manchmal so rasch, dass nicht stattgefundene Identifikation eines Michael-Addukts durch diesen Test kein Hinweis darauf ist, dass ein solches nicht zu einem früheren Zeitpunkt schon vorhanden war.
  • SELEX kann so erfolgen, dass von Michael-Adduktbildung profitiert wird, um Beinah-Suizidsubstrate für ein Enzym oder ein anderes Proteintarget mit sehr hoher Affinität zu schaffen. Man stelle sich vor, dass nach Bindung zwischen einem randomisierten Gemisch von RNAs und dem Target, vor dem Abtrennen an einem Filter oder durch andere Mittel, das Target denaturiert wird. Darauf folgendes Abtrennen, gefolgt von Umkehren des Michael-Addukts und cDNA-Synthese an der freigesetzten RNA, gefolgt vom übrigen SELEX-Zyklus, schafft eine Anreicherung an RNAs, die sich vor der Denaturierung an ein Target binden, sich jedoch weiterhin kovalent binden, bis das Michael-Addukt durch den Wissenschafter umgekehrt wird. Dieser Ligand würde in vivo die Eigenschaft permanenter Inhibierung des Targetproteins aufweisen. Die Protein-tRNA-Uracil-Methyl-Transferase (RUMT) bindet Substrat-tRNAs durch ein Michael-Addukt. Wird RUMT bei hohen Konzentrationen in E. coli exprimiert, so wird das Enzym hauptsächlich kovalent an RNA gebunden vorzufinden sein, was sehr stark darauf schließen lässt, dass annähernd irreversible Inhibitoren durch SELEX gefunden werden können.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung hat zahlreiche Anwendungsgebiete. Das Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um die Identifikation und Charakterisierung von jeglicher Proteinbindungsstelle für DNA oder RNA zu unterstützen. Solche Bindungsstellen funktionieren bei der Transkriptions- oder Translationsregulierung von Genexpression, beispielsweise als Bindungsstellen für Transkriptionsaktivatoren oder -repressoren, Transkriptionskomplexe an Promotorstellen, Replikationszusatzproteine und DNA-Polymerasen an oder in der Nähe von Replikationsursprüngen und Ribosomen und Translationsrepressoren an Ribosombindungsstellen. Sequenzinformation von solchen Bindungsstellen kann verwendet werden, um Regulationsregionen zu isolieren und zu identifizieren und dadurch arbeitsaufwendige Verfahren zur Charakterisierung solcher Regionen zu umgehen. Isolierte DNA-Regulationsregionen können beispielsweise in heterologen Konstrukten verwendet werden, um Genexpression selektiv zu verändern.
  • Es ist ein wichtiger und unerwarteter Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass die hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren, isolieren oder produzieren, die sich spezifisch an jegliches erwünschtes Targetmolekül binden. Somit können die vorliegenden Verfahren verwendet werden, um Nucleinsäuren zu produzieren, die für Bindung an ein bestimmtes Target spezifisch sind. Solch ein Nucleinsäureligand ist in vielerlei Hinsicht einem Antikörper ähnlich. Nucleinsäureliganden, die Bindungsfunktionen aufweisen, die jenen von Antikörpern ähnlich sind, können durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert werden. Solche Nucleinsäureliganden werden hierin als Nucleinsäure-Antikörper bezeichnet und sind im Allgemeinen in Anwendungen nützlich, in denen polyklonale oder monoklonale Antikörper zum Einsatz kommen. Nucleinsäure-Antikörper können im Allgemeinen anstelle von Antikörpern in jeglicher In-vitro- oder In-vivo-Anwendung eingesetzt werden. Es ist lediglich notwendig, dass unter den Bedingungen, unter denen der Nucleinsäure-Antikörper verwendet wird, die Nucleinsäure im Wesentlichen resistent gegenüber Abbau ist. Anwendungen von Nucleinsäure-Antikörpern umfassen die spezifische qualitative oder quantitative Detektion von Targetmolekülen aus jeder beliebigen Quelle; Reinigung von Targetmolekülen basierend auf ihrer spezifischen Bindung an die Nucleinsäure; und verschiedene therapeutische Verfahren, die auf dem spezifischen Richten eines Toxins oder anderen therapeutischen Mittels auf eine spezifische Targetstelle beruhen.
  • Targetmoleküle sind vorzugsweise Proteine, können jedoch unter anderem auch andere Kohlenhydrate, Peptidglycane und zahlreiche verschiedene kleine Moleküle umfassen. Wie im Fall von herkömmlichen proteinartigen Antikörpern können Nucleinsäure-Antikörper verwendet werden, um auf biologische Strukturen, wie z.B. Zelloberflächen oder Viren, durch spezifische Wechselwirkung mit einem Molekül, das ein integrativer Bestandteil dieser biologischen Struktur ist, gerichtet zu werden. Nucleinsäure-Antikörper sind darin von Vorteil, dass sie nicht durch Selbsttoleranz eingeschränkt sind, wie dies bei herkömmlichen Antikörpern der Fall ist. Auch erfordern Nucleinsäure-Antikörper keine Tier- oder Zellkulturen für die Synthese oder Produktion, da SELEX ein Verfahren ist, das vollständig in vitro durchgeführt wird. Wie bekannt ist, können sich Nucleinsäuren an komplementäre Nucleinsäuresequenzen binden. Diese Eigenschaft von Nucleinsäuren wurde bereits ausführlich für die Detektion, Quantifizierung und Isolierung von Nucleinsäuremolekülen verwendet. Somit ist es nicht beabsichtigt, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung diese durchwegs bekannten Bindungsfähigkeiten zwischen Nucleinsäuren umfassen. Insbesondere sollen die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die mit der Verwendung von Nucleinsäure-Antikörpern in Verbindung stehen, nicht bekannte Bindungsaffinitäten zwischen Nucleinsäuremolekülen umfassen. Zahlreiche Proteine sind dafür bekannt, dass sie über Bindung an Nucleinsequenzen funktionieren, wie z.B. Regulationsproteine, die sich an Nucleinsäure-Operatorsequenzen binden. Die bekannte Fähigkeit von bestimmten Nucleinsäure-Bindungsproteinen, sich an ihre natürlichen Stellen zu binden, wurde beispielsweise bereits zur Detektion, Quantifizierung, Isolierung und Reinigung solcher Proteine verwendet. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die mit der Verwendung von Nucleinsäure-Antikörpern in Zusammenhang stehen, sollen nicht die bekannte Bindungsaffinität zwischen Nucleinsäure-Bindungsproteinen und Nucleinsäuresequenzen, an die sie sich bekanntlich binden, umfassen. Neue, nicht natürlich vorkommende Sequenzen jedoch, die sich an dieselben Nucleinsäure-Bindungsproteine binden, können unter Verwendung von SELEX entwickelt werden. Es gilt anzumerken, dass SELEX sehr rasche Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen, die sich an ein Protein binden, erlaubt und somit leicht verwendet werden kann, um die Struktur von unbekannten Operator- und Bindungsstellensequenzen zu bestimmen, worin diese Sequenzen anschließend für hierin beschriebene Anwendungen verwendet werden können. Es wird angenommen, dass die vorliegende Erfindung die erste Offenbarung der allgemeinen Verwendung von Nucleinsäuremolekülen für die Detektion, Quantifizierung, Isolierung und Reinigung von Proteinen ist, die nicht dafür bekannt sind, Nucleinsäuren zu binden. Wie nachstehend erläutert wird, können bestimmte Nucleinsäure-Antikörper, die durch SELEX isoliert werden können, auch verwendet werden, um die Funktion von spezifischen Targetmolekülen oder -strukturen zu beeinflussen, beispielsweise zu inhibieren, zu steigern oder zu aktivieren. Insbesondere können die Nucleinsäure-Antikörper verwendet werden, um die Funktion von Proteinen zu inhibieren, steigern oder aktivieren.
  • Proteine, die eine bekannte Fähigkeit aufweisen, sich an Nucleinsäuren zu binden (wie DNA-Polymerasen, andere Replikasen und Proteine, die Stellen an RNA erkennen, jedoch nicht in weitere katalytische Wirkung einbinden), ergeben über SELEX hochaffine RNA-Liganden, die sich an die aktive Stelle des Targetproteins binden. Somit blockiert im Fall von HIV-1-Umkehrtranskriptase der resultierende RNA-Ligand (genannt 1.1 in Beispiel 2) cDNA-Synthese in Gegenwart einer Primer-DNA, einer RNA-Matrix und der vier Desoxynucleotidtriphosphate.
  • Die Theorie der Erfinder über RNA-Strukturen lässt darauf schließen, dass beinahe jedes Protein als ein Target für SELEX dient. Die anfänglichen Versuche gegen Nicht-Nucleinsäure-Bindungsproteine wurden mit drei Proteinen durchgeführt, von denen nicht angenommen wurde, dass sie mit Nucleinsäuren im Allgemeinen oder mit RNA im Besonderen wechselwirken. Die drei Proteine waren Gewebeplasminogenaktivator (tPA), Nervenwachstumsfaktor (NGF) und die extrazelluläre Domäne des Wachstumsfaktorrezeptors (gfR-Xtra). Alle diese Proteine wurden getestet, um zu erkennen, ob sie gemischte randomisierte RNAs an einem Nitrocellulosefilter zurückhalten würden. tPA und NGF zeigten Affinität für randomisierte RNA mit Kds knapp unter μM. gfR-Xtra band sich nicht mit messbarer Affinität, was darauf schließen lässt, dass, wenn ein RNA-Antikörper für dieses Protein existiert, sich dieser an einer Stelle binden muss, die keine Affinität für die meisten anderen RNAs aufweist.
  • tPA und NGF wurden dem strengen SELEX-Verfahren unter Verwendung von RNAs mit 30 randomisierten Positionen unterzogen. Sowohl tPA als auch NGF ergaben Ligandenlösungen im SELEX-Verfahren, was darauf schließen lässt, dass eine gewisse Stelle an jedem Protein die gewinnenden Sequenzen fester banden als jene Stelle (oder eine andere Stelle), die andere RNAs band. Die Gewinner-Sequenzen sind für die beiden Proteine verschieden.
  • Da tPA und NGF im SELEX-Verfahren so gut funktionierten, wurde eine zufällige Sammlung von Proteinen und Peptiden getestet, um zu sehen, ob sie irgendeine Affinität für RNA aufwiesen. Es wurde erörtert, dass, wenn ein Protein eine Affinität für RNA aufweist, das SELEX-Verfahren, durchschnittlich, Sequenzen mit höherer Affinität ergeben wird, die dieselbe Region des Targets kontaktieren, welche die geringe, verallgemeinerte Affinität bereitstellt. Eine Reihe von Proteinen und Peptiden wurde getestet, um zu sehen, ob randomisierte RNAs (die 40 randomisierte Abschnitte enthalten) an Nitrocellulosefiltern festgehalten werden würden. Etwa zwei Drittel der getesteten Proteine banden RNA, und einige wenige Proteine banden RNA sehr fest. Siehe Beispiel 9.
  • Proteine, die RNA nicht an Nitrocellulosefilter binden, können aus sehr banalen Gründen ausfallen, die nichts mit der Wahrscheinlichkeit zu tun haben, RNA-Antikörper hervorzubringen. Ein Beispiel, Bradykinin, kann sich nicht an Nitrocellulosefilter binden und würde somit im obigen Versuch seinen Zweck nicht erfüllen. Ein Bradykinin, das durch den Amino-Terminus des Peptids an eine feste Matrix gebunden ist, wurde hergestellt, und dann wurde erkannt, dass sich randomisierte RNA fest an die Matrix band (siehe Beispiel 7). Somit binden in den anfänglichen Versuchen zwei kurze Peptide, Bradykinin und Bombesin, randomisierte RNAs relativ fest. Jeglicher hochaffine RNA-Ligand, der durch SELEX mit diesen Peptidtargets erhalten wird, würde vielleicht ein Antagonist dieser aktiven Peptide sein und könnte therapeutisch nützlich sein. Es ist schwierig, sich eine RNA mit etwa 30 Nucleotiden vorzustellen, die sich an ein sehr kleines Peptid bindet, ohne dieses Peptid bezüglich praktisch jeglicher Aktivität zu deaktivieren.
  • Wie nachstehend in den Beispielen 4, 7, 9 und 10 beschrieben wird, wurde für Proteine, von denen nicht angenommen wurde, dass sie in der Natur mit Nucleinsäuren wechselwirken, erkannt, dass sie sich in einem nicht zu vernachlässigenden Ausmaß an ein zufälliges Gemisch von Nucleinsäuren binden. Es wurde weiters gezeigt, dass für solche Proteine, für die erkannt wurde, dass sie sich nicht-spezifisch an RNA-Gemische binden, eine Ligandenlösung nach SELEX gewonnen werden kann. Es ist daher vielleicht wertvoll, vor der Durchführung von SELEX einen Screen durchzuführen, um zu bestimmen, ob ein gegebenes Target irgendeine Art von Bindung an ein zufälliges Gemisch von Nucleinsäuren aufweist.
  • Ein zweiter wichtiger und unerwarteter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, dass die hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren, isolieren oder produzieren, die sich spezifisch an ein bestimmtes Targetmolekül binden und die Funktion dieses Moleküls beeinflussen. In diesem Aspekt sind die Targetmoleküle wiederum vorzugsweise Proteine, können jedoch auch, unter anderem, Kohlenhydrate und verschiedene kleine Moleküle umfassen, an die spezifische Nucleinsäurebindung erreicht werden kann. Nucleinsäureliganden, die sich an kleine Moleküle binden, können ihre Funktion durch Sequestrieren von ihnen oder durch Unterbinden einer Wechselwirkung von ihnen mit ihren natürlichen Liganden beeinflussen. Die Aktivität eines Enzyms kann beispielsweise durch einen Nucleinsäureliganden beeinflusst werden, der sich an das Substrat des Enzyms bindet. Nucleinsäureliganden, d.h. Nucleinsäure-Antikörper, von kleinen Mo lekülen sind besonders als Reagenzien für Diagnosetests (oder andere quantitative Tests) nützlich. Beispielsweise kann die Gegenwart gesteuerter Substanzen, gebundener Metabolite oder anormaler Mengen normaler Metabolite unter Verwendung von Nucleinsäureliganden der Erfindung nachgewiesen und gemessen werden. Ein Nucleinsäureligand mit katalytischer Aktivität kann die Funktion eines kleinen Moleküls durch Katalysieren einer chemischen Änderung im Target beeinflussen. Der Bereich möglicher katalytischer Aktivitäten ist zumindest so breit wie jener, den Proteine aufweisen. Das Durchführen von Selektion eines Liganden für ein Übergangszustands-Analogon einer erwünschten Reaktion ist ein Verfahren, durch das katalytische Nucleinsäureliganden selektiert werden können.
  • Es wird angenommen, dass die vorliegende Beschreibung zum ersten Mal die allgemeine Verwendung von Nucleinsäuremolekülen offenbart, um Proteinfunktion zu beeinflussen, inhibieren oder steigern. Die Bindungsselektionsverfahren der vorliegenden Erfindung können leicht mit sekundärer Selektion oder Screeningverfahren zur Modifikation von Targetmolekülfunktion auf Bindung an selektierte Nucleinsäuren kombiniert werden. Die große Population von verschiedenen Nucleinsäuresequenzen, die durch SELEX getestet werden können, steigert die Wahrscheinlichkeit, dass Nucleinsäuresequenzen gefunden werden können, die eine erwünschte Bindungsfähigkeit und -funktion aufweisen, um Targetmolekülaktivität zu modifizieren. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind zur Selektion von Nucleinsäureliganden nützlich, die die Funktion von jeglichem Targetprotein, einschließlich Proteine, die Nucleinsäuren als Teil ihrer natürlichen biologischen Aktivität binden, und von jenen Proteinen, die nicht dafür bekannt sind, Nucleinsäure als Teil ihrer biologischen Funktion zu binden, selektiv beeinflussen können. Die hierin beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um Nucleinsäureliganden zu isolieren oder bilden, die sich an jegliches Protein binden und dessen Funktion modifizieren, das sich an eine Nucleinsäure, entweder DNA oder RNA, entweder einzel- oder doppelsträngig; ein Nucleosid oder Nucleotid, einschließlich jener, die Purin- oder Pyrimidinbasen oder Basen, die davon abstammen, aufweisen, insbesondere einschließlich jener, die Adenin-, Thymin-, Guanin-, Uracil-, Cytosin- und Hyopxanthinbasen und Derivate, insbesondere methylierte Derivate, davon aufweisen; und Coenzym-Nucleotide, einschließlich u.a. Nicotinamid-Nucleotide, Flavin-Adenin-Dinucleotide und Coenzym A, bindet. Es wird erwogen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren, isolieren oder bilden, die die katalytische Aktivität von Targetenzymen beeinflussen, d.h. Katalyse inhibieren oder Substratbindung modifizieren, die Funktionalität von Proteinrezeptoren beeinflussen, d.h. Bindung an Rezeptoren inhibieren oder die Spezifität von Bindung an Rezeptoren modifizieren; die Bildung von Proteinmultimeren beeinflussen, d.h. Quartärstruktur von Proteinuntereinheiten zerstören; und Transporteigenschaften von Protein modifizieren, d.h. Transport von kleinen Molekülen oder Ionen durch Proteine stören.
  • Das SELEX-Verfahren wird hierin als die sich wiederholende Selektion und Amplifikation eines Kandidatengemisches von Nucleinsäuresequenzen, bis eine Ligandenlösung erhalten wurde, definiert. Ein weiterer Schritt in diesem Verfahren ist die Bildung von Nucleinsäure-Antikörpern gegen ein gegebenes Target. Auch wenn die Ligandenlösung, die für ein bestimmtes Verfahren abgeleitet wurde, eine einzelne Sequenz ist, muss der Nucleinsäure-Antikörper, der nur die Ligandenlösung enthält, synthetisiert werden. Ein SELEX-Versuch kann beispielsweise eine bevorzugte einzelne Ligandenlösung hervorbringen, die nur aus 20 der 30 randomisierten Nucleotidsequenzen, die im SELEX-Kandidatengemisch verwendet wurden, besteht. Der therapeutisch wertvolle Nucleinsäure-Antikörper würde vorzugsweise die 10 nicht maßgeblichen Nucleotide oder die fixierten Sequenzen, die für den Amplifikationsschritt von SELEX erforderlich sind, nicht enthalten. Nachdem die erwünschte Struktur des Nucleinsäure-Antikörpers basierend auf der Ligandenlösung bestimmt wurde, wird die tatsächliche Synthese des Nucleinsäure-Antikörpers gemäß zahlreichen verschiedenen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt.
  • Der Nucleinsäure-Antikörper kann auch basierend auf einer Ligandenlösung für ein bestimmtes Target konstruiert werden, das aus einer Familie von Sequenzen besteht. In solch einem Fall wird ein Routineversuch zeigen, dass eine bestimmte Sequenz aufgrund von Umständen, die mit der relativen Affinität der Ligandenlösung zum Target nicht in Verbindung stehen, bevorzugt wird. Solche Überlegungen sind für durchschnittliche Fachleute offensichtlich.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Nucleinsäure-Antikörper aus einer Vielzahl von targetspezifischen Liganden bestehen, von denen mehr als einer identische Liganden sein können. Vorzugsweise besteht er aus zumindest zwei unterschiedlichen targetspezifischen Liganden. Er kann eine Vielzahl von Nucleinsäureliganden für dasselbe Target enthalten. Beispielsweise kann SELEX zwei unterschiedliche Ligandenlösungen identifizieren. Da die zwei Ligandenlösungen das Target an verschiedenen Orten binden können, kann der Nucleinsäure-Antikörper vorzugsweise beide Ligandenlösungen enthalten. In einer anderen Ausführungsform kann der Nucleinsäure-Antikörper mehr als eine einzelne Ligandenlösung enthalten. Solche mehrwertigen Nucleinsäure-Antikörper weisen erhöhte Bindungsaffinität zum Target auf, die für einen äquivalenten Nucleinsäure-Antikörper, der nur einen Liganden aufweist, nicht verfügbar ist.
  • Darüber hinaus kann der Nucleinsäure-Antikörper auch aus einem Nicht-Nucleinsäure-Element, insbesondere aus einem targetspezifischen Liganden, bestehen. Somit kann er andere Elemente enthalten, die 1) unabhängige Affinität für das Target zum Nucleinsäure-Antikörper hinzufügen; 2) in unabhängiger Weise die Affinität des Nucleinsäureliganden zum Target steigern; 3) den Nucleinsäure-Antikörper auf die geeignete Stelle in vivo, wo Behandlung erwünscht ist, richten oder dort anordnen; oder 4) die Spezifität für den Nucleinsäureliganden für das Target verwenden, um eine gewisse zusätzliche Reaktion an dieser Stelle zu bewirken.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren sind für die Gewinnung von Nucleinsäuren nützlich, die die Funktion eines Targetproteins inhibieren, und sind besonders für die Gewinnung von Nucleinsäuren nützlich, die die Funktion von Proteinen inhibieren, deren Funktion Bindung an Nucleinsäure, Nucleotide, Nucleoside und Derivate und Analoge davon einbindet. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können Nucleinsäure-Inhibitoren, beispielsweise von Polymerasen, reversen Transkriptasen und an deren Enzymen, in denen eine Nucleinsäure, ein Nucleotid oder Nucleosid ein Substrat oder Co-Faktor ist, bereitstellen.
  • Sekundäre Selektionsverfahren, die mit SELEX kombiniert werden können, umfassen unter anderem Selektionen oder Screens auf Enzyminhibierung, Veränderung von Substratbindung, Verlust von Funktionalität, Störung von Struktur und dergleichen. Fachleute sind in der Lage, unter verschiedenen Möglichkeiten jene Selektions- oder Screeningverfahren auszuwählen, die mit den hierin beschriebenen Verfahren vereinbar sind.
  • Es wird Fachleuten leicht ersichtlich sein, dass es in manchen Fällen, d.h. für bestimmte Targetmoleküle oder für bestimmte Anwendungen, bevorzugt sein kann, eher RNA-Moleküle, und nicht DNA-Moleküle, als Liganden zu verwenden, während in anderen Fällen DNA-Liganden RNA-Liganden vorgezogen werden können.
  • Die hierin beschriebenen Selektionsverfahren können auch verwendet werden, um Nucleinsäuren auszuwählen, die sich spezifisch an einen Molekülkomplex, beispielsweise an einen Substrat/Protein- oder Inhibitor/Protein-Komplex, binden. Unter diesen Nucleinsäuren, die sich spezifisch an die Komplexmoleküle, jedoch nicht an die unvollendeten Moleküle, binden, gibt es Nucleinsäuren, die die Bildung des Komplexes inhibieren. Beispielsweise gibt es unter jenen Nucleinsäureliganden, die für spezifische Bindung an einen Substrat/Enzym-Komplex selektiert werden, Nucleinsäuren, die leicht selektiert werden können und die Substratbindung an das Enzym inhibieren und somit Katalyse durch dasselbe Enzym inhibieren oder stören.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die besonders zur Identifikation oder Isolierung von Nucleinsäuren, die sich an eine bestimmte funktionelle oder aktive Stelle in einem Protein oder einem anderen Targetmolekül binden, nützlich ist, verwendet ein Molekül, das für Bindung an eine erwünschte Stelle innerhalb des Targetproteins bekannt ist oder dafür selektiert wird, um das Selektions/Amplifikationsverfahren auf eine Untergruppe von Nucleinsäureliganden zu richten, die sich an der oder in der Nähe der erwünschten Stelle innerhalb des Targetmoleküls bin den. In einem einfachen Beispiel wird eine Nucleinsäuresequenz, die dafür bekannt ist, sich an eine erwünschte Stelle in einem Targetmolekül zu binden, in der Nähe der randomisierten Region aller Nucleinsäuren, die auf Bindung getestet werden, inkorporiert. SELEX wird dann verwendet (9), um jene Varianten zu selektieren, von denen alle die bekannte Bindungssequenz enthalten, die sich am festesten an das Targetmolekül bindet. Eine längere Bindungssequenz, von der angenommen wird, dass sie sich entweder fester an das Targetmolekül oder spezifischer an das Target bindet, kann somit selektiert werden. Die längere Bindungssequenz kann dann in der Nähe der randomisierten Region des Nucleinsäure-Testgemisches eingeführt und die Selektions/Amplifikationsschritte können wiederholt werden, um eine noch längere Bindungssequenz zu selektieren. Eine Wiederholung dieser Schritte (d.h. Inkorporation von selektierter Sequenz in Testgemische, gefolgt von Selektion/Amplifikation auf verbesserte oder spezifischere Bindung) kann wiederholt werden, bis ein erwünschtes Niveau von Bindungsstärke oder -spezifität erreicht wird. Dieses sich wiederholende „Walking"-Verfahren ermöglicht die Selektion von Nucleinsäuren, die für ein bestimmtes Targetmolekül oder eine bestimmte Stelle innerhalb eines Targetmoleküls hochspezifisch sind. Eine andere Ausführungsform solch eines sich wiederholenden „Walking"-Verfahrens verwendet ein „Anker"-Molekül, das nicht notwendigerweise eine Nucleinsäure ist (siehe die 10 und 11). In dieser Ausführungsform wird ein Molekül, das sich an ein erwünschtes Target bindet, beispielsweise ein Substrat oder ein Inhibitor eines Targetenzyms, chemisch modifiziert, sodass es kovalent an ein Oligonucleotid mit bekannter Sequenz (das „Führungs"-Oligonucleotid aus 10) gebunden werden kann. Das chemisch an das „Anker"-Molekül gebundene Führungs-Oligonucleotid, das sich an das Target bindet, bindet sich auch an das Targetmolekül. Das Sequenzkomplement von Führungs-Oligonucleotid wird in der Nähe der randomisierten Region des Test-Nucleinsäuregemisches inkorporiert. Anschließend wird SELEX durchgeführt, um auf jene Sequenzen zu selektieren, die sich am stärksten an den Targetmolekül/Anker-Komplex binden. Das sich wiederholende Walking-Verfahren kann dann verwendet werden, um längere und längere Nucleinsäuremoleküle mit gesteigerter Bindungsstärke oder Bindungsspezifität zum Target zu selektieren oder zu bilden. Von der Verwendung des „Anker"-Verfahrens wird erwartet, dass es eine raschere Isolierung von Nuclein säureliganden, die sich an oder in der Nähe einer erwünschten Stelle innerhalb des Targetmoleküls binden, ermöglicht. Insbesondere wird erwartet, dass das „Anker"-Verfahren in Kombination mit sich wiederholenden „Walking"-Verfahren zu Nucleinsäuren führt, die höher spezifische Inhibitoren von Proteinfunktion sind (11).
  • In bestimmten Ausführungsformen der Durchführung von SELEX ist es wünschenswert, plus/minus-Screening in Verbindung mit dem Selektionsverfahren durchzuführen, um sicherzustellen, dass das Selektionsverfahren nicht durch irgendeinen Faktor verzerrt wird, der in keiner Verbindung mit der Affinität der Nucleinsäuresequenzen zum Taget steht. Wird beispielsweise Selektion durch Protein-bindende Nitrocellulose durchgeführt, so wurde beobachtet, dass bestimmte Nucleinsäuresequenzen vorzugsweise durch Nitrocellulose zurückgehalten werden und während des SELEX-Verfahrens selektiert werden können. Diese Sequenzen können aus dem Kandidatengemisch durch Einbinden zusätzlicher Schritte entfernt werden, worin das oben genannte SELEX-Gemisch durch Nitrocellulose geführt wird, um jene Sequenzen selektiv zu entfernen, die ausschließlich für diese Eigenschaft selektiert wurden. Derartiges Screenen und derartige Selektion können durchgeführt werden, sobald das Target Unreinheiten enthält oder das Selektionsverfahren Vorgaben einführt, die mit Affinität zum Target nicht in Verbindung stehen.
  • SELEX wurde durch die Anwendung zur Isolierung von RNA-Molekülen demonstriert, die sich an Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase, auch als gp43 bezeichnet, binden und ihre Funktion inhibieren. Der neue RNA-Ligand von T4-DNA-Polymerase ist als ein spezifisches Testreagens für T4-DNA-Polymerase nützlich. Die Synthese von T4-DNA-Polymerase ist autogen reguliert. In Abwesenheit von funktionellem Protein werden Amber-Fragmente und mutierte Proteine im Vergleich zur Syntheserate von Wildtyp-Protein in replikationsdefizienten Infektionen überexprimiert (Russel, J. Mol. Biol. 79, 83–94 (1973)). In-vitro-Translation eines N-terminalen Fragments von gp43 wird durch den Zusatz von gereinigter gp43 spezifisch unterdrückt, und gp43 schützt einen einzelnen Abschnitt der mRNA in der Nähe ihrer Ribosombindungsstelle vor Nuclease-Angriff (Andrake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7942–7946 (1988)). Die Größe und Sequenz des RNA-Translationsoperators, an den sich gp43 bindet, und die Stärke dieser Bindung wurden bereits festgestellt. Die minimale Größe des gp43-Operators ist eine Sequenz von etwa 36 Nucleotiden, wie in 1 gezeigt, von der vorhergesagt wird, dass sie eine Haarnadelschleifenstruktur wie hierin angegeben aufweist. Die minimale Größe des Operators wurde durch Analyse von Bindung von endmarkierten Hydrolysefragmenten des Operators an gp43 bestimmt. Eine Analyse der Bindung von Operatormutanten in der Haarnadel- und Schleifensequenz weist darauf hin, dass gp43-Bindung an den Operator auf primäre Basenänderungen in der Helix empfindlich ist. Bindung an die Polymerase wurde durch Änderungen, die die Haarnadelstabilität signifikant reduzieren, sogar noch stärker reduziert. Operatorbindung wurde als sehr empfindlich gegenüber der Schleifensequenz erkannt. Es wurde auch erkannt, dass Replikation und Operatorbindung bei gp43 sich gegenseitig ausschließende Aktivitäten sind. Für den Zusatz von mikromolaren Mengen von gereinigten RNAs, die intakten Operator enthalten, wurde erkannt, dass er In-vitro-Replikation durch gp43 stark inhibierte.
  • Der Wildtyp-gp43-Operator, 1, wurde als Grundlage für den Entwurf eines anfänglichen Gemisches von RNA-Molekülen verwendet, die eine Region mit randomisierter Sequenz enthielten, um die Fähigkeit des Selektions/Amplifikationsverfahrens zu bewerten, Nucleinsäuremoleküle zu isolieren, die sich an ein Protein binden. Das RNA-Testgemisch wurde durch In-vitro-Transkription aus einer 110 Basen langen, einzelsträngigen DNA-Matrix hergestellt. Die Matrix wurde, wie in 1 gezeigt, hergestellt, um für den Großteil der Wildtyp-Operatorsequenz, mit Ausnahme der Schleifensequenz, zu kodieren. Die 8-Basen-Schleifensequenz wurde durch eine Region mit randomisierter Sequenz ersetzt, die synthetisiert wurde, um an jeder Base zur Gänze zufällig zu sein. Die Matrix enthielt auch Sequenzen, die für wirksame Amplifikation erforderlich waren: eine Sequenz an ihrem 3'-Ende, die komplementär zu einem Primer für reverse Transkription und Amplifikation in Polymerasekettenreaktionen ist, und eine Sequenz an ihrem 5'-Ende, das für T7-RNA-Polymerasetranskriptionsinitiation erforderlich ist, und eine ausreichende Sequenz, die zur cDNA des In-vitro-Transkripts komplementär ist. Die DNA-Matrix ist dieses eine Gemisch aus allen Schleifensequenzvarianten, das theoretisch 65.536 einzelne Spezies enthält.
  • Für die Dissoziationskonstante für die Wildtyp-Schleifen-RNA wurde ein Wert von etwa 5 × 10–9 M erkannt. Die Dissoziationskonstante für die Population von Schleifensequenzvarianten wurde auf etwa 2,5 × 10–7 gemessen. Randomisierung der Schleifensequenz reduzierte Bindungsaffinität um das 50fache.
  • In-vitro-Transkripte, die die Schleifensequenzvarianten enthielten, wurden mit gereinigter gp43 vermischt und inkubiert. Das Gemisch wurde durch ein Nitrocellulosefilter filtriert. Protein-RNA-Komplexe werden am Filter zurückgehalten, ungebundene RNA nicht. Selektierte RNA wurde dann aus den Filtern wie in Beispiel 1 beschrieben eluiert. Selektierte RNAs wurden mit AMV-Umkehrtranskriptase in Gegenwart von 3'-Primer, wie in Gauss et al. (1987), s.o., beschrieben, verlängert. Die resultierende cDNA wurde mit Taq-DNA-Polymerase in Gegenwart von 5'-Primer 30 Zyklen lang, wie in Innis et al. (1986), s.o., beschrieben, amplifiziert. Die selektierte amplifizierte DNA diente als Matrix für In-vitro-Transkription, um selektierte amplifizierte RNA-Transkripte herzustellen, die dann einem weiteren Durchgang von Bindungsselektion/Amplifikation unterzogen wurden. Das RNA/Protein-Verhältnis im Bindungsselektionsgemisch wurde über die gesamten Selektionszyklen hinweg konstant gehalten. Die sich wiederholende Selektion/Amplifikation wurde unter Verwendung mehrerer verschiedener RNA/Protein-Molverhältnisse durchgeführt. In allen Versuchen war RNA im Überschuss vorhanden: Versuch A verwendete ein RNA/gp43-Verhältnis von 10/1 (mol/mol); Versuch B verwendete ein RNA/gp43-Verhältnis von 1.000/1; und Versuch C verwendete ein RNA/gp43-Verhältnis von 100/1.
  • Der Fortschritt des Selektionsverfahrens wurde durch Filterbindungstests an markierten Transkripten von amplifizierter cDNA bei dem Abschluss jedes Zyklus des Verfahrens beobachtet. Chargen-Sequenzieren der RNA-Produkte aus jeder Runde für Versuch B erfolgte auch, um den Fortschritt der Selektion zu beobachten.
  • Autoradiogramme von Sequenzierungsgelen von RNA-Produkten nach 2, 3 und 4 Durchgängen von Selektion/Amplifikation sind in 3 gezeigt. Es ist eindeutig, dass es keine eindeutige Schleifensequenzvorgabe gab, die bis nach der dritten Selektion eingeführt wurde. Nach dem vierten Selektionsdurchgang ist eine offensichtliche Consensus-Sequenz für die 8-Basen-Schleifensequenz erkennbar als: A(a/g)(u/c)AAC(u/c)(u/c). Chargen-Sequenzierung von selektierter RNA nach dem vierten Selektionsdurchgang für die Versuche A, B und C wird in 4 verglichen. Alle drei unabhängigen SELEX-Verfahren unter Verwendung verschiedener RNA/Protein-Verhältnisse ergaben ähnliche offensichtliche Consensus-Sequenzen. Es gab jedoch manche sichtbare Vorgaben für Wildtyp-Schleifensequenz (AAUAACUC) in der selektierten RNA aus den Versuchen A und C.
  • Um zu bestimmen, welche zulässigen Sequenzkombinationen tatsächlich in den selektierten RNAs vorhanden waren, wurden einzelne DNAs aus selektierten RNAs nach dem vierten Selektionsdurchgang in Versuch B kloniert. Das Chargensequenzresultat aus Versuch B schien eine gleichmäßige Verteilung der zwei zulässigen Nucleotide anzugeben, die jeweils die vier variablen Abschnitte der Schleifensequenz bildeten. Einzelne wurden in pUC18, wie von J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Abschnitte 1.13; 1.85–1.86 (1989), beschrieben, kloniert. Zwanzig einzelne Klone, die durch Koloniefilterhybridisierung an den 3'-Primer identifiziert wurden, wurden sequenziert. Keiner der sequenzierten Klone war an irgendeiner Stelle in der Operatorsequenz außerhalb der Schleifensequenz mutiert. Es wurden, wie in 7 gezeigt, nur fünf variable Sequenzen wurden beobachtet, und überraschenderweise waren nur zwei Sequenzvarianten die Hauptkomponenten des selektierten Gemisches. Die Häufigkeiten von jeder Sequenz in den 20 einzelnen sequenzierten Isolaten sind ebenfalls in 7 angegeben. Die Wildtyp-Sequenz AAUAACUC und die Schleife AGCAACCU waren in etwa gleichen Mengen in der selektierten RNA von Versuch B vorhanden. Die anderen selektierten Varianten waren 1-Basen-Mutanten der zwei Hauptvarianten. Die Bindungsstärke der Sequenzvarianten wurde in Filterbindungstests unter Verwendung markierter In-vitro-Transkripte, die aus jedem der gereinigten klonalen Isolate stammten, verglichen. Wie in 6 gezeigt, wurde eine ungefähre Korrelation zwischen Bindungsaffinität einer RNA zu gp43 und der Häufigkeit der selektierten Sequenz beobachtet. Die zwei Haupt-Schleifensequenzvarianten zeigten etwa gleiche Bindungsaffinitäten zu gp43.
  • Die in 7 gezeigten, durch das Selektions/Amplifikationsverfahren isolierten Schleifensequenzvarianten-RNAs können alle als Inhibitoren von gp43-Polymeraseaktivität wirken, wie für die Wildtyp-Operatorsequenz gezeigt wurde.
  • Ein Beispiel für die Verwendung von SELEX wurde bereits durch Selektion eines neuen RNA-Liganden von Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase (gp43) bereitgestellt (Andrake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7942–7946 (1988)).
  • Die vorliegende Erfindung umfasst spezifische Ligandenlösungen, hergeleitet über das SELEX-Verfahren, für die gezeigt wurde, dass sie eine erhöhte Affinität zu HIV-1-Umkehrtranskriptase, R17-Hüllprotein, HIV-1-rev-Protein, HSV-DNA-Polymerase, E.-coli-Ribosomenprotein S1, tPA und NGF aufweisen. Diese Ligandenlösungen können von Fachleuten verwendet werden, um Nucleinsäure-Antikörper gegen die verschiedenen Targets zu synthetisieren.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben die erfolgreiche Anwendung von SELEX an einer breiten Palette an Targets. Die Targets können im Allgemeinen in zwei Kategorien eingeteilt werden: jene, die Nucleinsäure-Bindungsproteine sind, und jene Proteine, die nicht dafür bekannt sind, mit Nucleinsäuren wechselzuwirken. In jedem Fall wird eine Ligandenlösung erhalten. In manchen Fällen ist es möglich, die Ligandenlösung als ein Nucleinsäuremotiv wie z.B. eine Haarnadelschleife, eine asymmetrische Ausweitung oder einen Pseudoknoten darzustellen. In anderen Beispielen wird die Ligandenlösung als eine Primärsequenz dargestellt. In solchen Fällen soll jedoch nicht impliziert werden, dass die Ligandenlösung keine definitive Tertiärstruktur enthält.
  • Zusätzlich zur T4-DNA-Polymerase umfassen Targets, an denen SELEX erfolgreich durchgeführt wurde, Bakteriophagen-R17-Hüllprotein, HIV-Umkehrtranskriptase (HIV-RT), HIV-1-rev-Protein, HSV-DNA-Polymerase plus oder minus Co-Faktor, E.-coli-Ribosomenprotein S1, tPA und NGF. Die folgenden Versuche beschreiben auch eine Arbeitsvorschrift zum Testen der Hauptbindungsaffinität eines randomisierten Nucleinsäure-Kandidatengemisches zu zahlreichen verschiedenen Proteinen. Bei spiel 7 beschreibt auch die Immobilisierung von Bradykinin und die Resultate von Untersuchungen zur Bindung des Hauptteils randomisierter Nucleinsäuren an Bradykinin.
  • Die Beispiele und Veranschaulichungen sollen in keiner Weise als Einschränkung betrachtet werden. Die grundlegende Erkenntnis, die dieser Erfindung zugrunde liegt, ist, dass Nucleinsäuren als chemische Verbindungen eine praktisch grenzenlose Vielzahl an Größen, Formen und Konfigurationen bilden können und zu enorm vielen verschiedenen Bindungs- und Katalysefunktionen fähig sind, von denen jene, deren Existenz in biologischen Systemen bis heute bekannt ist, nur einen kleinen Einblick gewähren.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Materialien und Verfahren wurden in den gesamten Beispielen verwendet.
  • Der Transkriptionsvektor pT7-2 ist im Handel erhältlich (U.S. Biochemical Company, Cleveland, OH). Plasmid pUC18 wird von Norrander et al., Gene 24, 15–27 (1983), beschrieben und ist ebenfalls im Handel bei New England Biolabs erhältlich. Alle Manipulationen von DNA zur Schaffung neuer rekombinanter Plasmide erfolgten wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982), beschrieben, außer anders angemerkt. DNA-Oligonucleotide wurden wie von Gauss et al., Mol. Gen. Genet. 206, 24–34 (1987), beschrieben synthetisiert und gereinigt.
  • In-vitro-Transkriptionen mit T7-RNA-Polymerase und RNA-Gelreinigung erfolgten, wie es in Milligan et al., Nucl. Acids Res. 15, 8783–8798 (1987), beschrieben wird, mit der Ausnahme, dass in den Markierungsreaktionen die Konzentrationen von ATP, CTP und GTP jeweils 0,5 mM betrugen und die UTP-Konzentration 0,05 mM betrug. Das UTP wurde an der alpha-Position mit 32P mit einer spezifischen Aktivität von etwa 20 Ci/mmol markiert. Rohe mRNA-Präparate aus T4-Infektionen, Markieren von Oligos und Primerextension mit AMV-Umkehrtranskriptase waren bzw. erfolgten gemäß Gauss et al. (1987), s.o.
  • Verdünnungen von markierter, gelgereinigter RNA und gereinigter gp43 wurden in 200 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, bei 4°C hergestellt. In Nitrocellulosefilter-Bindungstests wurde gereinigte gp43 seriell verdünnt, und 30-μl-Aliquoten von jeder Proteinverdünnung wurden zu 30-μl-Aliquoten von verdünnter, markierter, gelgereinigter RNA zugesetzt. Die RNA-Verdünnung (50 μl) wurde auf ein frisches Nitrocellulosefilter aufgetragen, getrocknet und gezählt, um Eingangszählungen pro Röhrchen zu bestimmen. Die Konzentration von Protein in den Reaktionen lag im Bereich von 10–10 M bis 10–8 M, und die Konzentration der RNAs in jedem Versuch betrug etwa 10–12 M. Nach 30-minütiger Inkubation bei 4°C wurde jedes Röhrchen 3 min lang unter 37°C gesetzt, und 50 μl von jeder Probe wurden durch vorbenetzte Nitrocellulosefilter (Millipore #HAWP 025 00) filtriert und mit 3 ml von 200 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, gewaschen. Die Filter wurden getrocknet und in EcolumeTM-Szintillationsflüssigkeit (ICN Biomedicals, Inc.) gezählt. Kontrollen erfolgten in Abwesenheit von gp43, woraus der Hintergrund (stets weniger als etwa 5 der Eingangszählungen) bestimmt wurde. Von jeder Messungsreihe wurde der Hintergrund subtrahiert, und der Prozentsatz von Gesamteingangszählungen, die auf den Filtern verblieben, wurde berechnet. Aus jeder Reihe dieser Datenpunkte wurde eine theoretische bimolekulare Bindungskurve der besten Übereinstimmung („best fit") unter Verwendung einer Version eines veröffentlichten Programms (Caceci & Cacheris (1984), s.o.) gebildet, das modifiziert wurde, um eine Kurve zu konstruieren, die durch die Gleichung θ = A[gp43]/(Kd + [gp43])beschrieben wird, worin θ die Fraktion der Gesamt-RNA ist, die an den Filter gebunden ist, A der Prozentsatz von RNA ist, bei dem Bindung sättigt (etwa 60 % für diese Protein-RNA-Wechselwirkung), [gp43] die Eingangs-gp43-Konzentration ist und Kd die Dissoziationskonstante für die bimolekulare Reaktion ist. Diese Gleichung ist eine algebraische Neugestaltung der Gleichung [1–5] von Bisswanger, Theorie und Methoden der Enzymkinetik, Verlag Chemie, Weinheim, BRD, 9 (1979), mit der verein fachenden Annahme, dass die Konzentration des Proteins die Konzentration von RNA-Proteinkomplexen weitaus überschreitet, eine Annahme, die in den beschriebenen Versuchen richtig ist.
  • Beispiel 1: Selektion von RNA-Inhibitoren von T4-DNA-Polymerase
  • Eine 110 Basen lange, einzelsträngige DNA-Matrix für In-vitro-Transkription wurde wie in 2 gezeigt durch Ligation von drei synthetischen Oligonucleotiden (Tabellen 1, 3, 4 und 5) in Gegenwart von zwei Capping-Oligonucleotiden (Tabellen 1 und 2) geschaffen. Eines der Matrix-bildenden Oligos wurde auch als der 3'-Primer in reverser Transkription des In-vitro-Transkripts und der darauf folgenden Amplifikation in Polymerasekettenreaktionen (PCRs) verwendet (Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9436–9440 (1988)). Eines der Capping-Oligos (1) enthält die Information, die für T7-RNA-Polymerasetranskriptionsinitiation erforderlich ist, und ausreichende Sequenzkomplementarität zur cDNA des In-vitro-Transkripts, um als 5'-Primer in den PCR-Amplifikationsschritten zu dienen. Die DNA-Matrix kodierte für eine RNA, die die gesamte RNA-Erkennungsstelle für T4-DNA-Polymerase enthielt, mit der Ausnahme, dass eine vollständig zufällige Sequenz anstelle der Sequenz, die für die Wildtyp-Schleifensequenz AAUAACUC kodieren würde, eingesetzt wurde. Die zufällige Sequenz wurde durch herkömmliche chemische Synthese unter Verwendung eines handelsüblichen DNA-Syntheseautomaten (Applied Biosystems) eingeführt, mit der Ausnahme, dass alle vier dNTPs in äquimolaren Mengen im Reaktionsgemisch für jede Position, die in der Sequenz von Oligonucleotid Nr. 4 mit N bezeichnet ist (Tabelle 1), vorhanden waren. Die zufällige Sequenz wird durch Primeranellierungs-Sequenzinformation für die 5'- und 3'-Oligos flankiert, die in PCR verwendet wurden. Die DNA-Matrix ist somit ein Gemisch von allen Schleifensequenzvarianten, das theoretisch 65.536 einzelne Spezies enthält. Die Dissoziationskonstante für die Wildtyp-Schleifenvarianten-RNA-Sequenz beträgt etwa 5 × 10–9 M, und für die Population von Sequenzen wurde eine Kd von etwa 2,5 × 10–7 M gemessen, eine 50fach niedrigere Bindungsaffinität.
  • TABELLE 1
    Figure 00710001
  • In-vitro-Transkripte, die die Schleifensequenzvarianten enthielten, wurden in allen Selektionsdurchgängen mit gereinigter gp43 in drei verschiedenen RNA-Protein-Verhältnissen vermischt. (Für A und B betrug die Konzentration von gp43 3 × 10–8 M, „wenig Protein", und für C betrug die Konzentration von gp43 3 × 10–7 M, „viel Protein". Für A betrug die Konzentration von RNA etwa 3 × 10–7, „wenig RNA", und für B und C betrug die Konzentration von RNA etwa 3 × 10–5 M, „viel RNA".) Ein Durchgang bestand aus den folgenden Schritten:
  • 1) Selektion. Die RNA und das Protein wurden in den erwünschten Verhältnissen, wie zuvor beschrieben, vermischt, bei 37°C inkubiert, durch ein Nitrocellulosefilter gewaschen, und RNA wurde aus den Filtern wie zuvor beschrieben eluiert.
  • 2. Amplifikation. Die aus den Filtern eluierte RNA wurde mit AMV-Umkehrtranskriptase in Gegenwart von 50 pmol von 3'-Primer in einer 50-μl-Reaktion unter Bedingungen, wie sie von Gauss et al. (1987), s.o., beschrieben wurden, verlängert. Zur resultierenden cDNA-Synthese wurden 50 pmol von 5'-Primer in einem Reaktionsvolumen von 100 μl zugesetzt und wurden mit Taq-DNA-Polymerase wie in Innis (1988), s.o., beschrieben für 30 Zyklen amplifiziert.
  • 3. Transkription. In-vitro-Transkription erfolgt an den selektierten amplifizierten Matrices, wie von Milligan et al. (1987), s.o., beschrieben, wonach DNasel zugesetzt wird, um die DNA-Matrix zu entfernen. Die resultierenden selektierten RNA-Transkripte wurden dann in Schritt 1 des nächsten Durchgangs verwendet. Nur ein Zwanzigstel der Produkte, die in jedem Schritt des Zyklus gebildet wurden, wurde in den darauf folgenden Zyklen verwendet, sodass die Abfolge der Selektion zurückverfolgt werden konnte. Der Fortschritt des Selektionsverfahrens wurde durch Filterbindungstests von markierten Transkripten aus jeder PCR-Reaktion beobachtet. Nach dem vierten Selektions- und Amplifikationsdurchgang produzierten die markierten selektierten RNA-Produkte Bindung an gp43, die jener von Wildtyp-Kontroll-RNA entsprach. Die RNA-Produkte aus jedem Durchgang für einen Versuch (B) und aus dem vierten Durchgang für alle drei Versuche wurden gelgereinigt und sequenziert. In 3 zeigen die Erfinder die Sequenz der gereinigten In-vitro-Transkripte, abgeleitet aus den zweiten, dritten und vierten Durchgängen von Selektion und Amplifikation für Versuch B. Es ist eindeutig, dass es keine offensichtliche Schleifensequenzvorgabe gab, die bis nach der dritten Selektion eingeführt wurde. Zu diesem Zeitpunkt der Selektion gab es eine nachweisbare Vorgabe, die mit dem vierten Durchgang für die ersichtliche Consensus-Sequenz A(a/g)(u/c)AAC(u/c)(u/c) vollständig war. Chargen-Sequenzierung der RNA, die nach der vierten Selektion und Amplifikation für die Versuche A, B und C transkribiert wurde, ist in 4 gezeigt. Alle drei unabhängigen Versuche mit verschiedenen Protein/RNA-Verhältnissen ergaben ähnliche Resultate. Es gibt eine ersichtliche Vorgabe für Wildtyp-Sequenz an jeder der vier „variablen" Positionen in den Versuchen A und C.
  • Um herauszufinden, welche zulässigen Kombinationen tatsächlich existierten, verwendeten die Erfinder zwei „Klonierungs"-Oligonucleotide, die Restriktionsstelleninformation enthielten, um Sequenzen aus RNA aus dem vierten Durchgang von Versuch B zu amplifizieren, aus dem einzelne in pUC18 wie beschrieben (Sambrook et al. (1989), s.o.; Innis et al. (1988), s.o.) kloniert wurden. Die selektierten Chargen aus Versuch B wurden zur weiteren Untersuchung ausgewählt, da es eine ausgeglichene Verteilung der zwei zulässigen Nucleotide zu geben schien, die jeweils die vier „variablen" Positionen bildeten. Zwanzig einzelne Klone, die durch Koloniefilterhybridisierung an den 3'-Primer identifiziert wurden, wurden sequenziert. Keiner dieser einzelnen Klone waren an irgendeiner Stelle in der Operatorsequenz außerhalb der Schlei fensequenzpositionen, die absichtlich variiert waren, mutiert. Die Sequenzverteilungen sind in 7 zusammengefasst. Überraschenderweise bestand das selektierte RNA-Gemisch tatsächlich aus zwei Hauptschleifensequenzen. Eine war die Wildtyp-Sequenz, AAUAACUC, von der 9 von 20 isoliert wurden. Die andere, AGCAACCU, war an vier Positionen mutiert und in 8 der 20 Klone vorhanden (siehe 7). Die anderen drei detektierten Schleifensequenzen waren einzelne Mutationen dieser zwei Hauptsequenzen. Filterbindungsversuche mit markierten In-vitro-Transkripten, die aus jedem dieser klonalen Isolate abstammten, wiesen darauf hin, dass eine ungefähre Korrelation zwischen Bindungsaffinität einer RNA für gp43 und selektierter Häufigkeit bestand (siehe 7).
  • Beispiel 2: Isolierung eines spezifischen RNA-Liganden für HIV-Umkehrtranskriptase
  • Die Umkehrtranskriptasen-Aktivität von HIV-1 setzt sich aus einem Heterodimer aus zwei Untereinheiten (p51 und p66) zusammen, die Amino-Termini gemeinsam haben. Die zusätzliche carboxyterminale Region des größeren Peptids umfasst die RNaseH-Domäne von reverser Transkriptase; die Struktur dieser Domäne wurde erst jüngst in hoher Auflösung bestimmt.
  • Es wurde bereits davor gezeigt, dass diese HIV-1-Umkehrtranskriptase direkt und spezifisch mit ihrem zugehörigen Primer tRNALys3 wechselwirkt, mit dem sie in einem Versuch an der Anticodon-Schleife und dem Anticodon-Stamm vernetzt war. Auch wurde erkannt, dass nur das Heterodimer diese spezifische RNA-Erkennung aufwies; keine der homodimeren Spezies von reverser Transkriptase band sich mit Spezifität an diese tRNA.
  • Zwei Matrixpopulationen (mit etwa 1014 verschiedenen Sequenzen jeweils) wurden zur Verwendung in SELEX durch Ligation geschaffen. Eine Matrixpopulation wurde über 32 Nucleotidpositionen hinweg randomisiert, wobei fixierte Sequenzen an den Enden der randomisierten Region verwendet wurden, um cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation zu gewähren. Die zweite Matrixpopulation wies, als zusätzliche fixierte Sequenz am 5'-Ende der RNA, die Anticodon-Schleife und den Anticodon-Stamm von tRNALys3 auf. (Alle in dieser Arbeit verwendeten Oligos sind in Tabelle 2 gezeigt.) Es gab keinen Unterschied in der Affinität der zwei randomisierten Populationen zu HIV-1-Umkehrtranskriptase [RT] (und, wie gezeigt wird, die RNAs, die selektiert wurden, verwendeten auch keine 5'-Region zur spezifischen Bindung). Neun Durchgänge von SELEX mit jeder Population wurden unter Verwendung des Heterodimers HIV-RT als Targetprotein durchgeführt.
  • Der Mechanismus, durch den die randomisierte DNA unter Verwendung von Ligationen und Verbrückungs-Oligonucleotiden hergestellt wurde, wurde bereits zuvor beschrieben. Solch eine Vorgehensweise kann die Gesamtanzahl an verschiedenen Sequenzen in der Ausgangspopulation von der theoretischen Grenze weg, die durch DNA-Synthese mit μmol-Maßstab auferlegt wird, reduzieren.
  • In diesen Ligationsreaktionen wurde etwa 1 nmol von jedem Oligonucleotid verwendet. Das Ligationsprodukt wurde bei einer Ausbeute von etwa 50 % gelgereinigt. Diese gereinigte Matrix wurde mit T7-RNA-Polymerase wie zuvor beschrieben transkribiert. Es wurde erkannt, dass HIV-RT diese zufällige Population auf sättigungsfähige Weise binden konnte, wobei eine halbmaximale Bindung bei etwa 7 × 10–7 M eintrat, wie durch Nitrocellulosetests bestimmt wurde. Alle RNA-Protein-Bindungsreaktionen erfolgten in einem Bindungspuffer aus 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 10 mM Dithiothreit. RNA und Proteinverdünnungen wurden vermischt und auf Eis 30 min lang gelagert und anschließend auf 37°C für 5 min transferiert. (In den Bindungstests beträgt das Reaktionsvolumen 60 μl, von denen 50 μl getestet werden; in SELEX-Durchgängen beträgt das Reaktionsvolumen 100 μl.) Jede Reaktion wird durch ein (mit Bindungspuffer) vorbenetztes Nitrocellulosefilter gesaugt und mit 3 ml Bindungspuffer gespült, wonach sie getrocknet und für Tests gezählt oder Elution als Teil der SELEX-Arbeitsvorschrift unterzogen werden. Neun Durchgänge wurden durchgeführt. Die RNA-Konzentration für alle neun Durchgänge betrug etwa 3 × 10–5 M. HIV-RT betrug 2 × 10–8 M bei der ersten Selektion und 1 × 10–8 in den Selektionen 2–9.
  • Der Versuch unter Verwendung von RNA, die die tRNALys3-Anticodon-Schleife und den -stamm enthält, wurde zuerst abgeschlossen. Nitrocellulosefilter-Bindungstests, die im neunten Durchgang durchgeführt wurden, zeigten, dass die RNA-Population im Vergleich zum Ausgangskandidatengemisch um etwa das 100fache erhöhte Affinität zu NIV-1-RT aufwies, dass jedoch die Hintergrundbindung an Nitrocellulosefilter in Abwesenheit von Protein von etwa 2 % von Eingangs-RNA auf 15 % gestiegen war. Einzelne Sequenzen wurden aus dieser Population kloniert (nach Filtration durch Nitrocellulosefilter, um einen Teil des hohen Hintergrunds von potenziellen Sequenzen, die auf Zurückhaltung durch die Filter alleine selektiert wurden, zu zerstören) und sind in Tabelle 3 aufgelistet. Nitrocellulosefilter-Bindungstests zur Affinität von selektierten Sequenzen zu HIV-RT sind in 14 gezeigt. Manche der Sequenzen wurden als Liganden für HIV-RT selektiert, wie durch die Bindungskurven der Liganden 1.1 und 1.3a beispielhaft gezeigt wird, und weisen gewisse Sequenzhomologie auf, wie in den Tabellen 4 und 5 veranschaulicht wird. Manche der Ligandensequenzen weisen signifikante Zurückhaltung an Nitrocellulosefiltern in Abwesenheit von Protein auf, wofür Ligand 1.4 als Beispiel steht (14), und scheinen durch eine lange Helix mit einer Schleife aus Purin-Wiederholungselementen charakterisiert zu sein (wie in Tabelle 4 gezeigt). Trotz der geringen und späten Bemühungen der Erfinder, sie in diesem Versuch vor dem Klonieren zu zerstören, stellten diese Sequenzen einen signifikanten Teil von jenen dar, die aus diesem Versuch abgenommen wurden.
  • Folglich wurde Versuch 2 (der eine unterschiedliche 5'-fixierte Sequenz einband) durch Nitrocellulose vor dem ersten, dritten, sechsten und neunten Selektionsdurchgang vorfiltriert. Die aus diesem Versuch abgenommenen Sequenzen sind in Tabelle 6 gezeigt. Wiederum gibt es zahlreiche Sequenzen mit Homologie zu jenen mit hoher Affinität aus Versuch 1, wie in den Tabellen 4 und 5 gezeigt ist. Es gibt jedoch viel weniger, wenn überhaupt, Sequenzen, die mit dem Motiv von Sequenzen übereinstimmen, die durch Nitrocellulosefilter alleine zurückgehalten werden. Nitrocellulose-Bindungstests von selektierten Ligandensequenzen aus diesem Versuch, verglichen mit jenen von Ligand 1.1, sind in 15 gezeigt.
  • Hochaffine Liganden-RNAs mit der häufigsten Sequenz (1.1) und einer ähnlichen Sequenz (1.3a) wurden näher analysiert, um die Informationsgrenzen zu bestimmen, die für hochaffine Bindung an HIV-1-RT erforderlich sind. Die Resultate aus diesen Versuchen sind in 16 gezeigt. Diese Versuche stellen fest, dass das Motiv, das diese Sequenzen gemein haben, UUCCGNNNNNNNNCGGGAAA, innerhalb der Erkennungsdomäne ähnlich positioniert ist. Die Sequenzen UUCCG und CGGGA aus diesem Motiv können Basenpaare formen, um eine RNA-Helix mit einer 8-Basen-Schleife zu bilden. Um zu entdecken, was neben diesen fixierten Sequenzen zu hochaffiner Bindung an HIV-1-RT betragen könnte, wurde eine Kandidatengemischmatrix geschaffen, die zufällige Inkorporation an den Nucleotidpositionen enthielt, die sich von diesen zwei Sequenzen unterscheiden, wie in Tabelle 7 gezeigt ist. Nach acht SELEX-Durchgängen wurden einzelne Sequenzen kloniert und sequenziert. Die 46 Sequenzen sind in Tabelle 7 gezeigt. Eine Untersuchung dieser Sequenzen zeigt umfassende Basenpaarung zwischen der zentralen variablen 8n-Region und der variablen 4n-Stromab-Region und flankierenden Sequenzen; Basenpaarung, die in Kombination mit jener zuvor erläuterten auf einen RNA-Pseudoknoten hinweisen würde. Dass keine spezifischen Sequenzen in dieser entwickelten Population überwiegen, lässt darauf schließen, dass es keine Selektion auf primärem Sequenzniveau gibt und dass Selektion ausschließlich auf Grundlage von Sekundärstruktur stattfindet, das heißt, dass es zahlreiche Sequenzkombinationen gibt, die ähnliche Affinitäten zu HIV-1-RT ergeben und keine davon einen Konkurrenzvorteil aufweist. Eine Analyse der ersten und zweiten SELEX-Versuche zeigt, dass die einzelnen Sequenzen, die jene Populationen umfassen, die Homologie zum UUCCG...CGGGANAA-Motiv aufweisen, auch ein starkes Potenzial für diese Pseudoknoten-Basenpaarung aufzeigen.
  • 31 zeigt ein schematisches Diagramm davon, was hierin als Pseudoknoten bezeichnet wird. Ein Pseudoknoten besteht aus zwei helikalen Abschnitten und drei Schleifenabschnitten. Nicht alle Pseudoknoten enthalten alle drei Schleifen. Zur Interpretation der gewonnenen Daten wurden die verschiedenen Abschnitte des Pseudoknotens wie in 31 gezeigt markiert. In Tabelle 5 beispielsweise sind die in den Versuchen 1 und 2 gewonnenen Sequenzen gemäß der Pseudoknoten-Konfiguration aufgelistet, die von den verschiedenen Sequenzen eingenommen wird.
  • Die Resultate aus den Versuchen 1 und 2, wie in Tabelle 5 definiert, führten zu Versuch 3, worin die Sequenzen in S1(a), S1(b) und L3 fixiert waren. Wiederum wurden die aus SELEX abgeleiteten Nucleinsäuren beinahe ausschließlich zu Pseudoknoten konfiguriert. Eine Untersuchung der Resultate in jedem der Versuche zeigt, dass die Nucleinsäurelösung zu HIV-RT eine relativ große Anzahl an Elementen enthält, wobei der grundlegendste gemeinsame Nenner die Tatsache ist, dass alle als Pseudoknoten konfiguriert sind.
  • Andere allgemeine Feststellungen, die die Nucleinsäurelösung für HIV-RT definieren, sind die folgenden:
    • 1) S1(a) umfasst häufig die Sequenz 5'-UUCCG-3', und S1(b) umfasst häufig die Sequenz 5'-CGGGA-3'. Basenpaar-Drehungen sind jedoch zugelassen, und der Stamm kann gekürzt werden.
    • 2) L1 kann kurz oder lang sein, umfasst jedoch häufig zwei Nucleotide in den am besten bindenden Nucleinsäuren. Das 5'-Nucleotid in L1 ist häufig entweder ein U oder ein A.
    • 3) S2 besteht üblicherweise aus 5 oder 6 Basenpaaren und scheint sequenzunabhängig zu sein. Dieser Stamm kann Nicht-Watson/Crick-Paare enthalten.
    • 4) L2 kann aus keinen Nucleotiden bestehen, wenn er jedoch daraus besteht, so sind die Nucleotide vorzugsweise As.
    • 5) L3 besteht im Allgemeinen aus 3 oder mehr Nucleotiden, angereichert an A.
    • 6) In den meisten durch SELEX gewonnenen Sequenzen beläuft sich die Gesamtanzahl von Nucleotiden in L1, S2(a) und L2 auf 8.
  • Eine primäre Absicht bei der Durchführung dieses Versuchs war, Ligandenlösungen zu HIV-1-RT zu finden. Die Fähigkeit des erzeugten Ligandenklons 1.1 wurde mit der Fähigkeit der Ausgangspopulation für Versuch 1 verglichen, Aktivität von reverser Transkriptase zu inhibieren, und dies wird in 17 gezeigt. Sogar bei gleichen Kon zentrationen von Inhibitor-RNA und RT wird die reverse Transkriptase durch Ligand 1.1 signifikant inhibiert. Dahingegen gibt es erst bei 10 mM (oder einem 200fachen Überschuss) von Ausgangspopulation-RNA eine signifikante Inhibierung der HIV-1-RT. Somit blockiert der hochaffine Ligand zu HIV-1-RT entweder die katalytische Stelle des Enzyms oder er wechselwirkt direkt mit dieser Stelle.
  • Um die Spezifität dieser Inhibierung zu testen, wurden verschiedene Konzentrationen von Ligand 1.1 auf Inhibierung von MMLV, AMV und HIV-1-Umkehrtranskriptase getestet. Die Resultate aus diesem Versuch, die in 18 dargestellt sind, zeigen, dass die Inhibierung von Ligand 1.1 zu HIV-1-Umkehrtranskriptase spezifisch ist.
  • Beispiel 3: Isolierung von spezifischem RNA-Liganden für Bakteriophagen-R17-Hüllprotein
  • SELEX wurde am Bakteriophagen-R17-Hüllprotein durchgeführt. Das Protein wurde wie von Carey et al., Biochemistry 22, 2601 (1983), beschrieben gereinigt. Der Bindungspuffer war 100 mM Kaliumacetat plus 10 mM Dithiothreit plus 50 mM Tris-Acetat, pH 7,5. Protein und RNA wurden zusammen 3 min lang bei 37°C inkubiert und anschließend an Nitrocellulosefiltern filtriert, um proteingebundene RNA von freier RNA zu trennen. Die Filter wurden mit 50 mM Tris-Acetat, pH 7,5, gewaschen. Protein lag bei 1,2 × 10–7 M in den ersten vier SELEX-Durchgängen und bei 4 × 10–8 in den Durchgängen 5 bis 11.
  • Die Ausgangs-RNA wurde aus DNA wie zuvor beschrieben transkribiert. Die DNA-Sequenz umfasst eine Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, die es ermöglicht, dass RNA gemäß herkömmlichen Verfahren synthetisiert wird. cDNA-Synthese während der Amplifikationsphase des SELEX-Zyklus wird mittels einer DNA mit der Sequenz:
    cDNA-Primer (PCR-Primer 1):
    5'GTTTCAATAGAGATATAAAATTCTTTCATAG3'
    geprimt.
  • Die DNA-Primer, die zur Amplifikation der cDNA verwendet wurden, waren somit die Sequenz einschließlich des T7-Promotors, 32 randomisierte Positionen, ein AT-Dinucleotid und die fixierte, zu PCR-Primer 1 komplementäre Sequenz. Die RNA, die verwendet wurde, um den ersten Zyklus von SELEX zu beginnen, hat also die Sequenz:
    pppGGGAGCCAACACCACAAUUCCAAUCAAG-32N-AUCUAUGAAAGAAUUUUAUCUCUAUUGAAAC
  • Eine Reihe von Klonen von nach dem 11. Durchgang von SELEX wurde gewonnen und sequenziert. Innerhalb der 38 verschiedenen Sequenzen, die in den 47 Klonen erhalten wurden, wurden drei mehr als einmal gefunden: eine Sequenz wurde sechsmal gefunden, eine Sequenz viermal und eine weitere Sequenz zweimal. Die übrigen 35 Sequenzen wurden jeweils einmal gefunden. Zwei Sequenzen waren hinsichtlich der Primärsequenzen oder wahrscheinlichen Sekundärstrukturen den anderen nicht ähnlich und wurden nicht näher analysiert. Sechsunddreißig Sequenzen wiesen alle die Sequenz ANCA auf, die als eine Tetranucleotidschleife einer ausgeweiteten Haarnadel angeordnet war; das ausgeweitete Nucleotid war ein Adenin in allen 36 Fällen. Die Sequenzen der gesamten Reihe sind in Tabelle 8 angegeben, abgeglichen mit den vier Nucleotiden der Haarnadelschleife. Die zwei Nucleotide 3' zum randomisierten Abschnitt der Ausgangs-RNA (ein AU) können verändert oder deletiert werden, da der cDNA-Primer die komplementären zwei Nucleotide nicht umfasst; in zahlreichen Klonen ist eines oder beide dieser Nucleotide verändert.
  • Das Gewinner-RNA-Motiv, das in 19 gezeigt wird, weist eine direkte Beziehung zur Hüllbindungsstelle auf, die davor in Studien zu ortsgerichteter Mutagenese und Bindung identifiziert wurde. Siehe Uhlenbeck et al. (1983), s.o.; Ramaniuk et al. (1987), s.o. Manche der Sequenzen sind jedoch in dieser Reihe stärker konserviert als erwartet worden wäre. Die Schleifensequenz AUCH ist vorwiegend vorhanden, während frühere Bindungsdaten darauf schließen lassen hätten können, dass ANCA-Sequenzen alle äquivalent sind. Die natürliche Bindungsstelle des R17-Genoms umfasst die nachstehend gezeigte Sequenz und Struktur:
    Figure 00800001
  • Die natürliche Struktur umfasst die Sequenz GGAG, die dazu dient, Ribosomenbindung und Translationsinitiation der für R17-Replikase kodierenden Region zu erleichtern. Während SELEX kommt dieses Erfordernis nicht zu tragen, und die gewinnenden Sequenzen enthalten rund um die Schleife und die Ausweitung häufiger C:G-Basenpaare als G:C-Basenpaare. SELEX erleichtert daher die Einschränkungen, die durch Biologie und Entwicklungsgeschichte auferlegt werden, und führt zu Liganden mit höheren Affinitäten als der natürliche Ligand. In ähnlicher Weise ist das Schleifen-Cytidin, das in jeder der 36 Sequenzen zu finden ist, ein Uridin an der natürlichen Stelle, und es ist bekannt, dass C höhere Affinität als U liefert. Im Laufe der Entwicklungsgeschichte müssen natürliche Stellen eher eine geeignete Affinität und nicht die höchste Affinität aufgewiesen haben, da die festeste Bindung zu Nachteilen für die Organismen führen kann.
  • Beispiel 4: Isolierung eines Nucleinsäureliganden für eine Serinprotease.
  • Serinproteasen sind Proteinenzyme, die Peptidbindungen innerhalb von Proteinen spalten. Die Serinproteasen sind Elemente einer Genfamilie von Säugetieren und sind wichtige Enzyme im Leben von Säugetieren. Serinproteasen sind nicht dafür bekannt, sich an Nucleinsäuren zu binden. Beispiele für Serinproteasen sind Gewebeplasminogenaktivator, Trypsin, Elastase, Chymotrypsin, Thrombin und Plasmin. Zahlreiche Erkrankungszustände können mit Nucleinsäureliganden behandelt werden, die sich an Serinproteasen binden, beispielsweise Störungen der Blutgerinnung und Thrombenbildung. Proteasen, die keine Serinproteasen sind, sind in der Biologie von Säugetieren auch wichtig, und würden ebenfalls Targets für Nucleinsäureliganden mit geeigneten Affinitäten darstellen, die gemäß der Erfindung wie hierin beschrieben gewonnen werden.
  • Menschlicher Gewebeplasminogenaktivator (htPA), der bei handelsüblichen Quellen erhältlich ist, wurde als eine Serinprotease ausgewählt, die dem SELEX-Verfahren dieser Erfindung unterzogen werden soll. Das verwendete RNA-Kandidatengemisch war mit jenem identisch, das in Beispiel 11 unten im HSV-DNA-Polymeraseversuch beschrieben wird.
  • Bindung während SELEX erfolgte in 50 mM NaCl plus 50 mM Tris-Acetat, pH 7,5, 3 min lang bei 37°C. SELEX wurde in zehn Durchgängen durchgeführt. Das 30N-Kandidatengemisch band sich an tPA mit einer Affinität (Kd) von 7 × 10–8 M in 150 mM NaAc plus 50 mM Tris-Acetat, pH 7,5; die Affinität der nach neun Durchgängen von SELEX vorhandenen RNA war etwa dreifach stärker. Neun Klone wurden isoliert, sequenziert, und die meisten von ihnen wurden auf Bindung an tPA als reine RNAs getestet. Die Sequenzen der neun bei geringem Salzgehalt gewonnenen Klone waren die folgenden:
    Figure 00810001
  • Alle getesteten Sequenzen banden sich zumindest etwas besser als das Ausgangs-30N-Kandidatengemisch. Die A-Reihe band sich jedoch besser an Nitrocellulose in Abwesenheit von tPA als das Kandidatengemisch, als ob das gemeinsame Sequenzmotiv Zurückhaltung an der Nitrocellulosematrix durch sich selbst verursachen würde. Dieses Motiv ist in den oben gezeigten Sequenzen unterstrichen. In anderen SELEX-Versuchen wurden AGG-Wiederholungen isoliert, als versucht wurde, eine Ligandenlösung zu HIV-1-Umkehrtranskriptase, der extrazellulären Domäne von menschlichem Wachstumsfaktorrezeptor und sogar dem R17-Hüllprotein in einem ersten Walking-Versuch zu identifizieren. Bei der Durchführung des Tests zeigen diese Sequenzen bescheidene oder wesentliche Bindung an Nitrocellulosefilter, und dies ohne Gegenwart des Targetproteins. Es scheint, dass die AGG-Wiederholungen in Haarnadelschleifen gefunden werden können. Da SELEX ein sich wiederholendes Verfahren in den meisten Ausführungsformen ist, ist es nicht überraschend, dass solche Bindungsmotive entstehen würden.
  • Die Existenz von Nitrocellulose-Bindungsmotiven kann durch eine oder mehrere von einigen naheliegenden Vorgehensweisen vermieden werden. RNA kann vor SELEX durch die Nitrocellulosefilter filtriert werden, um solche Motive zu entfernen. Alternative Matrices können in alternativen Durchgängen von SELEX verwendet werden, z.B. Glasfaserfilter. Alternative Abtrennungssysteme können verwendet werden, z.B. Säulen, Saccharosegradienten usw. Es ist naheliegend, dass jegliches gegebene einzelne Verfahren zu Vorgaben im sich wiederholenden Verfahren führen wird, die Motive bevorzugen, die keine erhöhte Bindung zum Target aufweisen, jedoch durch das Selektionsverfahren selektiert werden. Es ist daher wichtig, alternierende Verfahren oder Screeningverfahren zu verwenden, um diese Motive zu entfernen. Es wurde gezeigt, dass die AGG-Wiederholungen, wie andere Motive, die als Vorgaben, die Target-unabhängig sind, isoliert werden, dazu neigen, am häufigsten aufzutreten, wenn die Affinitäten der besten Sequenzen für das Target eher gering sind oder wenn die Affinitäten der besten Sequenzen nur geringfügig besser sind als die Affinität des Ausgangskandidatengemisches für das Target.
  • Beispiel 5: Isolierung eines Nucleinsäureliganden für einen Säugetierrezeptor
  • Säugetierrezeptoren sind häufig Proteine, die innerhalb der zytoplasmatischen Membranen von Zellen liegen und auf Moleküle reagieren, die außerhalb solcher Zellen zirkulieren. Die meisten Rezeptoren sind nicht dafür bekannt, sich an Nucleinsäuren zu binden. Der menschliche Wachstumshormonrezeptor reagiert auf zirkulierendes menschliches Wachstumshormon, während der Insulinrezeptor auf zirkulierendes Insulin reagiert. Rezeptoren weisen häufig einen globulären Teil des Moleküls an der extrazellulären Seite der Membran auf, und dieser globuläre Teil bindet sich spezifisch an das Hormon (das der natürliche Ligand ist). Zahlreiche Erkrankungszustände können mit Nucleinsäureliganden behandelt werden, die sich an Rezeptoren binden.
  • Liganden, die sich an eine lösliche globuläre Domäne des menschlichen Wachstumshormonrezeptors (shGHR) binden, werden identifiziert und unter Verwendung des Kandidatengemisches aus Beispiel 4 gereinigt. Wiederum sind die Bindungspuffer frei von DTT. Die lösliche globuläre Domäne des menschlichen Wachstumshormonrezeptors ist im Handel und bei universitären Stellen erhältlich und wird üblicherweise durch DNA-Rekombinationsverfahren gebildet, die am gesamten Gen, das für ein membrangebundenes Rezeptorprotein kodiert, angewandt werden. SELEX wird wiederholt verwendet, bis Liganden gefunden werden. Die Liganden werden kloniert und sequenziert, und Bindungsaffinitäten für den löslichen Rezeptor werden gemessen. Bindungsaffinitäten werden für denselben Liganden für verschiedene lösliche Rezeptoren gemessen, um Spezifität zu ermitteln, auch wenn die meisten Rezeptoren keine starken Proteinhomologien zu den extrazellulären Domänen anderer Rezeptoren aufweisen. Die Liganden werden verwendet, um Inhibierung der normalen Bindungsaktivität von shGHR durch Messen kompetitiver Bindung zwischen dem Nucleinsäureliganden und dem natürlichen (Hormon-) Liganden zu bewerten.
  • Beispiel 6: Isolierung eines Nucleinsäureliganden für ein Säugetierhormon oder einen Säugetierfaktor
  • Säugetierhormone oder -faktoren sind Proteine, z.B. Wachstumshormon, oder kleine Moleküle (z.B. Epinephrin, Schilddrüsenhormon), die im Tier zirkulieren und ihre Wirkungen durch Kombinieren mit Rezeptoren, die innerhalb der zytoplasmatischen Membranen von Zellen liegen, ausführen. Das menschliche Wachstumshormon beispielsweise stimuliert Zellen zuerst durch Wechselwirken mit dem menschlichen Wachstumshormonrezeptor, während Insulin Zellen zuerst durch Wechselwirkung mit dem Insulinrezeptor stimuliert. Zahlreiche Wachstumsfaktoren, z.B. Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (GCSF), einschließlich mancher, die zelltypspezifisch sind, Wechselwirken zuerst mit Rezeptoren an den Targetzellen. Hormone und Faktoren sind dann natürliche Liganden für manche Rezeptoren. Hormone und Faktoren sind üblicherweise nicht dafür bekannt, sich an Nucleinsäuren zu binden. Zahlreiche Erkrankungszustände, beispielsweise Schilddrüsenüberfunktion, chronische Hypoglykämie, können mit Nucleinsäureliganden, die sich an Hormone oder Faktoren binden, behandelt werden.
  • Liganden, die sich an menschliches Insulin binden, werden unter Verwendung des Ausgangsmaterials aus Beispiel 3 identifiziert und gereinigt. Menschliches Insulin ist bei handelsüblichen Quellen erhältlich und wurde üblicherweise durch DNA-Rekombinationsverfahren gebildet. SELEX wird wiederholt verwendet, bis ein Ligand gefunden wurde. Die Liganden werden kloniert und sequenziert, und die Bindungsaffinitäten für menschliches Insulin werden gemessen. Bindungsaffinitäten werden für denselben Liganden zu anderen Hormonen oder Faktoren gemessen, um Spezifität festzustellen, auch wenn die meisten Hormone und Faktoren keine starken Proteinhomologien zu menschlichem Insulin aufzeigen. Es bestehen jedoch manche Hormon- und Faktor-Genfamilien, einschließlich einer kleinen Familie von IGF oder insulinähnlichen Wachstumsfaktoren. Die Nucleinsäureliganden werden verwendet, um Inhibierung der normalen Bindungsaktivität von menschlichem Insulin zu seinem Rezeptor durch Messen kompetitiver Bindung mit dem Insulinrezeptor und dem Nucleinsäureliganden in Gegenwart oder Abwesenheit von menschlichem Insulin, dem natürlichen Liganden, zu bewerten.
  • Beispiel 7: Herstellung von Säulenmatrix für SELEX
  • Nach den in Beispiel 9, unten, beschriebenen Verfahren wurde gezeigt, dass das Polypeptid Bradykinin durch Nitrocellulose nicht zurückgehalten wird. Um das SELEX-Verfahren für Bradykinin zu ermöglichen, wurde das Protein an Activated CH Sepharose 4B (Pharmacia LKB) als Trägermatrix gemäß herkömmlichen Verfahren gebunden. Die resultierende Matrix wurde durch den Ninhydrintest auf 2,0 mM Bradykinin bestimmt. Siehe CrestField et al., J. Biol. Chem., Bd. 238, S. 238, S. 622–627 (1963); Rosen, Arch. Biochem. Biophys. 67, 10–15 (1957). Die aktivierten Gruppen, die an der Trägermatrix zurückblieben, wurden mit Tris blockiert. Siehe Pharmacia, Affinity Chromatography: Principles and Methods, Ljungforetagen AB, Uppsala, Schweden (1988).
  • Zentrifugensäulentrennung wurde verwendet, um Lösungen von Kandidatengemischen mit Perlenmatrix zu kontaktieren. In einem allgemeinen Verfahren zur Durchführung eines Selektionsschrittes aus SELEX wurden 40 μl einer 50:50-Aufschlämmung von Targetsepharose in Reaktionspuffer in ein 0,5-ml-Eppendorf-Röhrchen übertragen. Das RNA-Kandidatengemisch wurde mit 60 μl Reaktionspuffer zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde 30 min lang bei 37°C äquilibrieren gelassen. In den Boden des Röhrchens wird ein Loch gebohrt, und das Röhrchen wird innerhalb eines größeren Eppendorf-Röhrchens platziert, beide Kappen werden entfernt, und die Röhrchen werden zentrifugiert (1.000 U/min, 10", 21°C), um das Eluat abzutrennen. Das kleine Röhrchen wird dann in ein neues größeres Röhrchen transferiert, und die Inhalte werden viermal durch Schichtung mit 50 μl des selektierten Waschpuffers und Zentrifugieren gewaschen. Um Bindungstests durchzuführen, wird das die radioaktive RNA enthaltende Röhrchen in ein neues Eppendorf-Röhrchen transferiert und bis zur Trockenheit zentrifugiert.
  • Ein Hauptteil-Bindungsversuch wurde durchgeführt, worin ein RNA-Kandidatengemisch, das aus einem 30 Nucleinsäuren langen, randomisierten Segment bestand, auf die Bardykinin-Sepharose-Matrix aufgetragen wurde. Unter Verwendung des Zentrifugensäulenverfahrens wurde die Bindung der Haupt-30N-RNA an verschiedene Matrices unter hohen Salzkonzentrationen bestimmt, um die besten Bedingungen zur Minimierung von Hintergrundbindung an Sepharose zu ermitteln. Hintergrundbindung von RNA an Sepharose wurde durch Blockieren von aktivierten Gruppen an der Sepharose mit Tris und Verwendung eines Bindungspuffers von 10 mM DEM und 10–20 mM KOAc minimiert. Bei dieser Pufferbedingung ergab eine Bindungskurve der randomisierten Hauptlösung von RNA eine Haupt-Kd von etwa 1,0 × 10–5. Siehe 20. Die Kurve wurde durch Verdünnen der Bradykininsepharose gegen blockierte, aktivierte Sepharose bestimmt.
  • Beispiel 8: Herstellung von Kandidatengemischen, die gesteigerte RNA-Motivstrukturen aufweisen
  • In der bevorzugten Ausführungsform besteht das in SELEX zu verwendende Kandidatengemisch aus einer zusammenhängenden Region von zwischen 20 und 50 randomisierten Nucleinsäuren. Das randomisierte Segment ist durch fixierte Sequenzen flankiert, die die Amplifikation der selektierten Nucleinsäuren ermöglichen.
  • In einer alternativen Ausführungsform werden die Kandidatengemische gebildet, um den Prozentsatz von Nucleinsäuren im Kandidatengemisch zu erhöhen, die die gegebenen Nucleinsäuremotive aufweisen. Obwohl hierin zwei spezifische Beispiele angegeben werden, ist diese Erfindung nicht darauf beschränkt. Fachleute werden in der Lage sein, äquivalente Kandidatengemische zu bilden, um dasselbe allgemeine Resultat zu erzielen.
  • In einem spezifischen Beispiel, das als Sequenz A in 21 gezeigt ist, wird das Kandidatengemisch so hergestellt, dass die meisten der Nucleinsäuren im Kandidatengemisch vorgegeben werden, um eine Helixregion von zwischen 4 und 8 Basenpaaren und eine „Schleife" mit entweder 20 oder 21 zusammenhängenden randomisierten Sequenzen zu bilden. Sowohl das 5'- als auch das 3'-Ende des Sequenzgemisches enthält fixierte Sequenzen, die für die Amplifikation der Nucleinsäuren wesentlich sind. Benachbart zu diesen funktionellen fixierten Sequenzen liegen fixierte Sequenzen, die ausgewählt werden, um mit fixierten Sequenzen an der anderen Seite der randomisierten Region Basenpaare zu bilden. Vom 5'- zum 3'-Ende der Sequenzen erstrecken sich 5 unterschiedliche Regionen: 1) fixierte Sequenzen zur Amplifikation; 2) fixierte Sequenzen zur Bildung einer Helixstruktur; 3) 20 oder 21 randomisierte Nucleinsäurereste; 4) fixierte Sequenzen zur Bildung einer Helixstruktur mit den Region-2-Sequenzen; und 5) fixierte Sequenzen zur Amplifikation. Das A-Kandidatengemisch aus 21 ist mit Haarnadelmotiven und symmetrischen und asymmetrischen ausgeweiteten Motiven angereichert. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Kandidatengemisch gleiche Mengen an Sequenzen, in denen die randomisierte Region 20 und 21 Basen lang ist.
  • Ein zweites Beispiel, das in 21 als Sequenz B gezeigt ist, wird entworfen, um das Kandidatengemisch an Nucleinsäuren anzureichern, die im Pseudoknotenmotiv gehalten werden. In diesem Kandidatengemisch flankieren die fixierten Amplifikationssequenzen drei Regionen von 12 randomisierten Positionen. Die drei randomisierten Regionen sind durch zwei fixierte Regionen aus vier Nucleotiden getrennt, und die fixierten Sequenzen sind ausgewählt, um vorzugsweise eine 4-Basenpaar-Helixstruktur zu bilden. Vom 5'- hin zum 3'-Ende der Sequenz sind 7 unterschiedliche Regionen zu finden: 1) fixierte Sequenzen zur Amplifikation; 2) 12 randomisierte Nucleotide; 3) fixierte Sequenzen zur Bildung einer Helixstruktur; 4) 12 randomisierte Nucleotide; 5) fixierte Sequenzen zur Bildung einer Helixstruktur mit den Region-3-Nucleotiden; 6) 12 randomisierte Nucleotide; und 7) fixierte Sequenzen zur Amplifikation.
  • In einem bevorzugten Kandidatengemisch sind die gentechnisch veränderten helikalen Regionen so entworfen, dass sie alternierende GC-, CG-, GC-, CG-Basenpaare ergeben. Für dieses Basenpaarmotiv wurde gezeigt, dass es eine besonders stabile Helixstruktur ergibt.
  • Beispiel 9: Hauptteil-Bindung von randomisierten RNA-Sequenzen an Proteine, die nicht für Bindung an Nucleinsäuren bekannt sind.
  • Nach den allgemeinen Nitrocellulose-Selektionsverfahren, wie sie in Beispiel 1 oben für SELEX beschrieben wurden, wurde eine Gruppe von zufällig selektierten Proteinen getestet, um zu bestimmen, ob sie irgendeine Affinität zu einem Hauptkandidatengemisch von RNA-Sequenzen zeigten. Das in jedem Versuch verwendete Kandidatengemisch bestand aus einer 40N-RNA-Lösung (ein randomisiertes Gemisch mit einem Segment mit 40 randomisierten Nucleinsäuresegmenten), die radioaktiv markiert war, um den Prozentsatz von Bindung nachzuweisen. Das Kandidatengemisch wurde in Bindungspuffer (200 mM KOAc, 50 mM TrisOAc, pH 7,7, 10 mM DTT) verdünnt, und 30 μl wurden in einer 60-μl-Bindungsreaktion verwendet. Zu jeder Reaktion wurden 20 μl, 10 μl oder 1 μl von jedem Protein zugesetzt. Bindungspuffer wurde zugesetzt, um ein Gesamtvolumen von 60 μl zu erreichen. Die Reaktionen wurden bei 37°C 5 min lang inkubiert und anschließend Filterbindung unterzogen.
  • Die getesteten Proteine waren Acetylcholinesterase (MG 230.000); N-Acetyl-β-D-glucosaminidase (MG 180.000); Actin (MG 43.000); Alkoholdehydrogenase (240.000); Aldehyddehydrogenase (MG 200.000); Angiotensin (MG 1297); Ascorbatoxidase (MW 140.000); Atrial Natriuretic Factor (MG 3.064); und Bombesin (MG 1.621). Die Proteine wurden bei Boehringer Ingelheim erworben und wurden in der Pufferzusammensetzung verwendet, in der sie verkauft wurden.
  • Das in jedem Versuch verwendete RNA-Kandidatengemisch enthielt 10.726 Counts von Radiomarkierung, und eine Hintergrundbindung von etwa 72 Counts wurde erkannt. Die Resultate sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Für alle getesteten Proteine unter Ausnahme von Acetylcholinesterase, N-Acetyl-β-D-glucosaminidase und Actin wurde erkannt, dass sie eine gewisse Hauptteil-RNA-Affinität ergaben. Aufgrund der geringen Konzentration von N-Acetyl-β-D-glucosaminidase in Lösung, wie es gekauft wurde, sind die Resultate für dieses Protein nicht definitiv. Bindet sich, darüber hinaus, eines der getesteten Proteine nicht an Nitrocellulose – was für Bradykinin der Fall ist –, so würde in diesem Versuch keine Affinität detektiert werden. Beispiel 7 oben, das den Fall von säulengetragenem Bradykinin erläutert, zeigt, dass nicht vorhandene Hauptteil-Bindung in diesem Versuch nicht automatisch bedeutet, dass Hauptteil-Bindung für ein gegebenes Protein prinzipiell nicht existiert.
  • Beispiel 10: Isolierung von RNA-Ligandenlösung für Nervenwachstumsfaktor.
  • Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist ein Proteinfaktor, der durch einen Rezeptor an den äußeren Oberflächen von Targetzellen wirkt. Antagonisten gegen Wachstumsfaktoren und andere Hormone können durch Blockieren eines Rezeptors oder durch Titrieren des Faktors oder Hormons wirken. Im SELEX-Verfahren wurde nach einer RNA gesucht, die sich direkt an NGF bindet.
  • Die Ausgangs-RNAs wurden exakt wie im Fall von HSV-DNA-Polymerase hergestellt (Beispiel 11).
  • Zwei verschiedene Versuche wurden mit NGF durchgeführt. Der erste war ein SELEX mit zehn Durchgängen unter Verwendung von Bindungspuffer mit geringer Salzkonzentration, Inkubation 3 min lang bei 37°C, und anschließend Filtration und Waschen mit demselben Puffer während des Ablaufs von SELEX. Der Bindungspuffer mit geringer Salzkonzentration war 50 mM NaCl plus 50 mM Tris-Acetat, pH 7,5. Der zweite Versuch verwendete als Bindungspuffer 200 mM NaCl plus 50 mM Tris-Acetat, pH 7,5, und dann, nach der Filtration, einen Waschschritt mit 50 mM Tris-Acetat, pH 7,5; dieser SELEX-Versuch durchlief nur sieben Durchgänge.
  • Der Versuch bei geringer Salzkonzentration ergab 36 klonierte Sequenzen. Fünfzehn der Klone waren beinahe identisch – Nr. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 19, 22, 28, 33 und 34 waren identisch. Die Nr. 15 und 25 wiesen einen einzigen Unterschied auf:
    Figure 00890001
    Eine zweite, häufig vorkommende Sequenz, die sechsmal gefunden wurde, war:
    CCUCAGAGCGCAAGAGUCGAACGAAUACAG (Nr. 12, 20, 27 und 31)
  • Aus dem SELEX mit hoher Salzkonzentration wurden zehn Klone sequenziert, wobei jedoch acht von diesen identisch waren und offensichtlich der häufig vorkommenden (jedoch unbedeutenderen) zweiten Klasse aus dem Versuch mit geringer Salzkonzentration angehörten. Die Gewinner-Sequenz lautet:
    ----CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA---
  • Zwischen den zwei Versuchen wurden insgesamt 14 verschiedene Sequenzen gewonnen (Sequenzen mit einem Unterschied werden in dieser Analyse zusammengefasst); sie sind hier aufgelistet, worin die Ähnlichkeiten darüber gekennzeichnet und die Häufigkeiten angeführt sind. ngf.a bis ngf.k stammen aus dem Versuch mit geringer Salzkonzentration, während hsngf.a bis hsngf.c aus dem Versuch mit hoher Salzkonzentration stammen:
    Figure 00900001
  • Während keine offensichtliche Sekundärstruktur innerhalb der ähnlichen Sequenzen eingebunden ist, ist es wahrscheinlich, dass die gewinnenden Sequenzen maßgebliche Nucleotide in eine Struktur platzieren, die durch eine NGF-Bindungsstelle gut angepasst ist.
  • Ein Bindungstest von Nucleinsäure hsngf.a an NGF wurde durchgeführt, und für diese Nucleinsäure wurde eine Kd erkannt, die etwa 20- bis 30fach höher als jene des Haupt-30N-Kandidatengemisches ist. Für dieselbe Nucleinsäure wurde auch erkannt, dass sie eine geringere oder gleiche Affinität zu R17-Hüllprotein und tPA als bzw. wie ein 30N-Kandidatengemisch aufweist. Somit ist der aus SELEX abgeleitete Nucleinsäureligand hsngf.a ein selektiver Ligand zu NGF.
  • Beispiel 11: Isolierung eines Nucleinsäureliganden für HSV-1-DNA-Polymerase.
  • Herpes-Simplex-Virus (HSV-1) ist ein DNA-hältiges Virus von Säugetieren. HSV-1, wie zahlreiche DNA-hältige Viren, kodiert für seine eigene DNA-Polymerase. Die HSV-1-DNA-Polymerase wurde in zwei Formen gereinigt, die verschiedene Qualitäten aufweisen, wovon jedoch jede Form DNA-Replikation in vitro katalysiert. Die einfache Form, die ein Polypeptid ist, wird aus Zellen, die das klonierte Gen exprimieren, gemäß T.R. Hernandez & I.R. Lehman, J. Biol. Chem. 265, 11227–11232 (1990), gereinigt. Die zweite Form von DNA-Polymerase, ein Heterodimer, wird aus HSV-1-infizierten Zellen gemäß J.J. Crute & I.R. Lehman, J. Biol. Chem. 264, 19266–19270 (1989), gereinigt; das Heterodimer enthält ein Peptid, das der Polymerase selbst entspricht, und ein anderes, UL42, für das auch HSV-1 kodiert.
  • SELEX wurde sowohl am einfachen Polypeptid als auch am Heterodimer durchgeführt. Der Bindungspuffer war in jedem Fall 50 mM Kaliumacetat plus 50 mM Tris-Acetat, pH 7,5, und 1 mM Dithiothreit. Filtration zu separater gebundener RNA erfolgte nach vier Minuten Inkubation bei 37°C; die Filter wurden mit Bindungspuffer minus Dithiothreit gewaschen.
  • Das RNA-Kandidatengemisch wurde aus DNA wie zuvor beschrieben transkribiert. Wie im Fall von anderen Ausführungsformen umfasst die DNA-Sequenz eine Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, die es ermöglicht, RNA gemäß herkömmlichen Verfahren zu synthetisieren. cDNA-Synthese während der Amplifikationsphase von SELEX wird durch eine DNA der folgenden Sequenz geprimt:
    cDNA-Primer (PCR-Primer 1): 5'-GCCGGATCCGGGCCTCATGTGAA-3'
  • Die DNA-Primer, die zur Amplifikation der cDNA in dieser Phase des SELEX-Zyklus verwendet wurden, umfassen, in einem von ihnen, den T7-Promotor; dieser PCR-Primer weist die folgende Sequenz auf:
    PCR-Primer 2: 5' CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA 3'
  • Die anfängliche randomisierte DNA umfasste die Sequenz mit dem T7-Promotor, 30 randomisierte Positionen und die fixierte Sequenz, die zu PCR-Primer 1 komplementär war. Die RNA, die verwendet wird, um den ersten Zyklus von SELEX zu beginnen, weist somit die folgende Sequenz auf:
    pppGGGAGCUCAGAAUAAACGCUCAA-30N-UUCGACAUGAGGCCCGGAUCCGGC
  • SELEX wurde sieben Durchgänge lang durchgeführt, wonach cDNA wie zuvor beschrieben hergestellt und kloniert wurde. Die Reihe von Sequenzen, die in ihrer Benennung „H" tragen, wurde mit der einfachen HSV-DNA-Polymerase als Target gewonnen, während die „U"-Reihe mit der heterodimeren Polymerase gewonnen wurde, die das UL42-Polypeptid enthält.
  • Etwa 25 % der Sequenzen aus der H-Reihe enthält eine exakte Sequenz von 12 Nucleotiden am 5'-Ende der randomisierten Region (die Großbuchstaben sind der randomisierten Region zuzuordnen). In manchen Sequenzen betrug die Länge zwischen den fixierten Primern nicht exakt 30 Nucleotide, und in einem Fall (H2) wurde eine große Deletion innerhalb der randomisierten Region gefunden. Die Mitglieder dieser H-Untergruppe umfassen:
    Figure 00930001
  • Zwei Elemente der U-Reihe haben dieses Primärsequenzmotiv gemeinsam:
    U9: --cgcucaaUAAGGAGGGCCACAGAUGUAAUGGAAACuucgaca--
    U13: --cgcucaaUAAGGAGGCCACAUACAAAAGGAUGAGUAAAAuucgaca--
  • Die verbleibenden Sequenzen aus den H- und U-Reihen zeigen keine deutliche gemeinsame Sequenz; darüber hinaus ließen sich in keiner der beiden Serien Sequenzen aus den sieben Durchgängen als gewinnende einzelne Sequenzen erkennen, was darauf schließen lässt, dass mehr SELEX-Durchgänge erforderlich sein würden, um die beste Ligandenfamilie zur Inhibierung von HSV-DNA-Polymerase zu finden.
  • Es scheint, dass die Primärsequenz
    --cgcucaaUAAGGAGGCCAC...
    ein Kandidat für eine Antagonistenspezies sein kann, doch jene Elemente der Serien müssen noch als Inhibitoren von DNA-Synthese getestet werden. Es scheint, dass die fixierte Sequenz genau 5' zu der UAAGGAGGCCAC am Auftreten dieser Untergruppe beteiligt sein muss, oder die gemeinsamen 12 Nucleotide würden variabel innerhalb der randomisierten Region positioniert worden sein.
  • Beispiel 12: Isolierung eines Nucleinsäureliganden für E.-coli-Ribosomenprotein S1
  • Das E.-coli-30S-Ribosomenprotein S1 ist das größte der 21 30S-Proteine. Das Protein wurde basierend auf seiner hohen Affinität zu Polypyrimidinen gereinigt, und es wird angenommen, dass es sich eher fest an einzelsträngige Polynucleotide bindet, die reich an Pyrimidin sind. Es wurde untersucht, ob die durch SELEX als eine Ligandenlösung identifizierte RNA in irgendeiner Weise reicher an Information ist als eine einfache einzelsträngige RNA, die reich an Pyrimidinen ist.
  • Die RNAs, DNAs, cDNA-Primer (PCR-Primer 1) und PCR-Primer 2 waren mit jenen identisch, die für HSV-1-DNA-Polymerase verwendet wurden (siehe Beispiel 11). Der Bindungspuffer enthielt 100 mM Ammoniumchlorid plus 10 mM Magnesiumchlorid plus 2 mM Dithiothreit plus 10 mM Tris-Chlorid, pH 7,5. Bindung erfolgte bei Raumtemperatur, und Komplexe wurden einmal mehr durch Nitrocellulosefilter getrennt. Das Protein wurde gemäß I. Boni et al., European J. Biochem. 121, 371 (1982), gereinigt.
  • Nach 13 SELEX-Durchgängen wurde eine Reihe von 25 Sequenzen erhalten. Mehr als zwanzig dieser Sequenzen enthielten Pseudoknoten, und jene Pseudoknoten enthalten gemeinsame Elemente.
  • Die allgemeine Struktur von Pseudoknoten kann in Diagrammform folgend dargestellt werden:
    STAMM 1a – SCHLEIFE 1 – STAMM 2a – STAMM 1b – SCHLEIFE 2 – STAMM 2b (siehe 31)
  • Die meisten der S1-Proteinliganden enthalten:
    STAMM 1 aus 4 bis 5 Basenpaaren, mit einem G gleich 5' zu SCHLEIFE 1
    SCHLEIFE 1 aus etwa 3 Nucleotiden, häufig ACA
    STAMM 2 aus 6 bis 7 Basenpaaren, direkt auf STAMM 1 gestapelt
    SCHLEIFE 2 aus 5 bis 7 Nucleotiden, häufig mit GGAAC am Ende
  • Eine vernünftige Interpretation dieser Daten ist, dass sich SCHLEIFE 2 über STAMM 1 erstreckt, sodass diese Schleife starr in einer Form gehalten wird, die die Bindung des einzelnen Strangs an die aktive Stelle von Protein S1 erleichtert und fördert. Eine zweidimensionale Darstellung des Consensus-Pseudoknoten würde wie folgt aussehen:
    Figure 00950001
  • In solchen Figuren sind die Basenpaare als Linien und Bindestriche gezeigt, die Selektionen von Basen aus der randomisierten Region sind in Großbuchstaben gezeigt, Y ist ein Pyrimidin, R ist ein Purin, N-N' bezeichnet jedes beliebige Basenpaar, N bezeichnet jedes beliebige Nucleotid, und die Kleinbuchstaben stehen für Elemente der fixierten Sequenz, die für PCR-Amplifikationen verwendet wird.
  • Es scheint, dass einzelsträngige Polynucleotid-Bindungsproteine und Domänen innerhalb der Proteine häufig, während SELEX, einen Pseudoknoten selektierten, der für den verlängerten, starren Einzelstrang, bezeichnet als SCHLEIFE 2, an der Bindungsstelle des Proteins in einer Weise steht, die die Wechselwirkungen mit dieser Stelle maximiert. Somit ist es, wenn sich der HIV-1-RT-Pseudoknoten bereits gebildet hat, vernünftig, anzunehmen, dass die einzelsträngige Domäne SCHLEIFE 2 innerhalb der Region von RT gebunden ist, die den Matrixstrang während der Replikation hält. Das heißt, es scheint vernünftig, dass die meisten Replikationsenzyme (DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, RNA-Replikasen, reverse Transkriptasen) eine Domäne zur Fixierung des Matrixstrangs aufweisen, die einen Pseudoknoten als ausgewählten Liganden aus dem SELEX-Verfahren bevorzugen könnte.
  • Beispiel 13: Isolierung eines Nucleinsäureliganden zu HIV-1-rev-Protein
  • Die RNA-Erkennungsstelle des HIV-1-rev-Proteins scheint komplex zu sein, und ihre Funktion ist für die produktive Infektion einer epidemischen Viruserkrankung wesentlich. Siehe Olsen et al., Science, Bd. 247, 845–848 (1990). Das SELEX-Verfahren an diesem Protein wurde durchgeführt, um mehr über das Erkennungselement zu erfahren und um einen Liganden zum Targetprotein zu isolieren.
  • Ein Kandidatengemisch wurde mit einer 32 Nucleotide langen Zufallsregion, wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben, gebildet. Es wurde erkannt, dass das rev-Protein das Ausgangskandidatengemisch mit einer halbmaximalen Bindung, die bei etwa 1 × 10–7 M auftrat, wie durch Nitrocellulosetests bestimmt wurde, auf sättigungsfähige Weise binden konnte. Alle RNA-Protein-Bindungsreaktionen erfolgten in einem Bindungspuffer von 200 mM KOAc, 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 10 mM Dithiothreit. RNA- und Proteinverdünnungen wurden vermischt und auf Eis 30 min lang gelagert und anschließend auf 37°C 5 min lang transferiert. (In Bindungstests beträgt das Reaktionsvolumen 60 μl, von denen 50 μl getestet werden; in SELEX-Durchgängen beträgt das Reaktionsvolumen 100 μl.) Jede Reaktion wird durch ein (mit Bindungspuffer) orbenetztes Nitrocellulosefilter gesaugt und mit 3 ml Bindungspuffer gespült, wonach sie getrocknet und für Tests gezählt oder Elution als Teil der SELEX-Arbeitsvorschrift unterzogen werden. Zehn Durchgänge von SELEX wurden durchgeführt, unter Verwendung einer RNA-Konzentration von etwa 3 × 10–5 M. Die Konzentration von rev-Protein betrug 1 × 10–7 im ersten Durchgang und 2,5 × 10–8 in allen darauf folgenden Durchgängen. Das anfängliche Kandidatengemisch wurde über ein Nitrocellulosefilter laufen gelassen, um die Anzahl an Sequenzen zu reduzieren, die eine hohe Affinität für Nitrocellulose aufweisen. Dieses Verfahren wurde ebenfalls nach den Runden 3, 6 und 9 wiederholt. Das cDNA-Produkt wurde nach jedem dritten Selektionsdurchgang gereinigt, um Spezies anormaler Größen, die typischerweise bei wiederholten Durchgängen von SELEX entstehen, zu vermeiden. Nach 10 Durchgängen war die Sequenz in der variablen Region der RNA-Population nicht zu fällig, wie durch Didesoxy-Kettenterminationssequenzierung bestimmt wurde. 53 Isolate wurden kloniert und sequenziert.
  • Alle klonierten Sequenzen sind in Tabelle 10 aufgelistet. Alle Sequenzen wurden durch das Zucker-RNA-Sekundärstruktur-Vorhersageprogramm analysiert. Siehe Zucker, Science 244, 48–52 (1989); Jaeger et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7706–7710 (1989). Auf der Grundlage von gemeinsamer Sekundärstruktur wurden alle Sequenzen drei gemeinsamen Motiven zugeordnet, wie in Tabelle 11 gezeigt wird. Die Motive I und II weisen eine ähnliche Konformation auf, einschließlich einer ausgeweiteten Schleife, die an jedem Ende durch eine Helix geschlossen ist. Diese allgemein dargestellte Struktur wurde schematisch in Tabelle 12 veranschaulicht, und die Domänen wurden zum leichteren Verständnis markiert; betrachtet von 5' zu 3' sind dies Stamm 1a (der mit dem 3'-Stamm 1b Basenpaare bildet), Schleife 1, Stamm 2a, Schleife 3, Stamm 2b, Schleife 2 und Stamm 1b. Die Sequenzen, die in die verschiedenen Domänen passen, sind für einzelne Sequenzen in Tabelle 12 aufgelistet. (Es gilt anzumerken, dass in Sequenz 3a der homologe Abgleich um 180° gedreht ist, sodass es Stamm 1 ist, der mit einer Schleife abgeschlossen ist.) Die Faltungsenergien des RNA-Moleküls (einschließlich der fixierten flankierenden Sequenzen) sind in Tabelle 13 gezeigt.
  • Das Wildtyp-rev-reaktive Element (RRE), für das bestimmt wurde, dass es zumindest minimal in Bindung von rev an HIV-1-Transkripte eingebunden ist, wurde auch mittels dieses Programms gefaltet und ist in den Tabellen 12 und 13 aufgenommen.
  • Die Sequenzen wurden durch ein Verfahren, das auf jenem basiert, das in Hertz et al., Comput. Appl. Biosci. 6, 81–92 (1990), beschrieben wird, auch auf verwandte Subsequenzen untersucht. Zwei signifikante Muster wurden identifiziert. Für jedes Isolat wurde auf Identität geprüft, um seine beste Übereinstimmung mit den Mustern zu identifizieren, und die zugehörigen Resultate sind in Tabelle 13 zu sehen. Die verwandten Subsequenzmotive sind durch die gemeinsamen Sekundärstrukturen in ähnlichen Konformationen dargestellt; das heißt, die erste Sequenz UUGAGAUACA wird üblicherweise als Schleife 1 plus das 3'-terminale CA gefunden, das mit dem UG am 5'-Ende der zweiten, an Information reichen Sequenz UGGACUC (üblicherweise Schleife 3) ein Paar bildet. Auch gibt es eine starke Vorhersage für Basenpaarung von der GAG von Sequenz I mit der CUC von Sequenz II. Motiv II ist Motiv I darin ähnlich, dass die Subsequenz GAUACAG als eine Schleife gegenüber CUGGACAC mit einer ähnlichen Paarung von CA mit UG überwiegt. Motiv II unterscheidet sich in der Größe der Schleifen und in einem Teil der Sequenz, insbesondere durch die Abwesenheit von vorhergesagter Basenpaarung über die Schleife hinweg. Eine Domäne der Wildtyp-RRE ist Motiv II sehr ähnlich. Motiv III ist allen anderen Sequenzen am wenigsten ähnlich, wenn es auch durch zwei ausgeweitete Us, die neben den basengepaarten GA-UC liegen, wie in Motiv I, gekennzeichnet ist. Unglücklicherweise sind weitere Vergleiche kompliziert, da das Faltungsmuster von Motiv III die 3'-fixierte Sequenzregion in maßgeblichen Sekundärstrukturen einbindet; da diese Sequenzen invariant sind, gibt es keinen Weg, die Bedeutung von einem von diesen zu analysieren. Die gefalteten Sequenzen von Beispielen von jedem Motiv sind in 23 mit der gefalteten Sequenz des Wildtyp-RRE gezeigt.
  • Die Sequenzen wurden weiter auf ihre Affinität zum rev-Protein analysiert. Matrices wurden ausgehend von zahlreichen Klonen PCR unterzogen, aus denen markierte In-vitro-Transkripte hergestellt und einzeln auf ihre Fähigkeit, sich an rev-Protein zu binden, getestet wurden. Diese Bindungskurven sind in den 24 bis 28 gezeigt. Markierte Transkripte aus den Oligonucleotidmatrices wurden ebenfalls synthetisiert, die das oben erläuterte Wildtyp-RRE enthalten, von dem angenommen wird, dass es das Consensus-Motiv in einer äußerst stabilen Konformation ist. Um auf Varianten in den Versuchen zu kontrollieren, wurde die am besten bindende Sequenz, Isolat 6a, als Standard in jedem Bindungsversuch getestet. Die RNA-Protein-Gemische wurden wie zuvor beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, dass verdünnte RNAs auf 90°C 1 min lang erhitzt und auf Eis vor dem Vermischen gekühlt wurden. Die durchschnittliche Ka für Isolat 6a betrug 8,5 × 10–8 M, und die Resultate aus diesem Versuch sind in Tabelle 13 gezeigt.
  • Die Bindungskurven aus 24 zeigen, dass die erzeugte Population (P) eine um etwa das 30fache verbesserte Bindung an rev-Protein im Vergleich zum Ausgangs kandidatengemisch aufwies. Die Bindung des Wildtyp-RRE ist jener des am häufigsten vorkommenden Klons, 1c, sehr ähnlich. Dieser Versuch veranschaulicht auch, wie empfindlich die rev-Bindungswechselwirkung auf Sekundärstruktur ist. Die Isolate 6a und 6b sind in den Regionen mit hohem Informationsgehalt identisch, sind jedoch auf der Ebene der Sekundärstruktur sehr unterschiedlich, was zu Änderungen an drei Nucleotidpositionen führt. Diese Änderungen, die die Basenpaarung von Stamm 1 vorhersagen, reduzieren die Affinität von 6b um das 24fache. Empfindlichkeit auf Sekundärstrukturanomalien wird durch die Bindung von Isolat 17 genauer veranschaulicht, wie in 25 gezeigt. Isolat 17 weist das maximale Ergebnis bezüglich Information auf, wie in Tabelle 12 gezeigt wird. Es gibt jedoch ein zusätzliches ausgeweitetes U am 5'-Ende von Schleife 1, wie in Tabelle 11 gezeigt wird. Dieses zusätzliche U resultiert in der reduzierten Affinität von Isolat 17 zu rev im Vergleich zu anderen Sequenzen mit Motiv I. Dahingegen werden einzelne Nucleotiddeletionen von Schleife-2-Sequenzen, auch jene, die die Aussicht auf Basenpaarung quer über die Aufweitung reduzieren, von der rev-Wechselwirkung gut toleriert.
  • Eine andere starke Gemeinsamkeit ist die Konservierung der Sequenz ACA gegenüber UGG, worin sich die CA mit dem UG paart, um Stamm 2 zu bilden. Diese Sequenz haben die Motive I und II sowie das Wildtyp-RRE gemeinsam. Die Sequenzen 11 und 12 weisen eine Basenpaarsubstitution an dieser Position auf (siehe Tabelle 12), und Sequenz 12 wurde getestet und wies reduzierte Affinität im Vergleich mit den meisten der anderen Motiv-I-Sequenzen auf.
  • Die RNA-Sequenzen, für die durch SELEX bestimmt wurde, dass sie rev-Liganden sind, können nach Primär- und Sekundärstruktur klassiert werden. Ein Consensus tritt aus einer asymmetrischen Ausweitung hervor, die durch zwei Helices flankiert ist, in denen spezifisch konservierte einzel- und doppelsträngige Nucleotide konfiguriert sind. Wenn auch Basenpaarung über die Ausweitung für zahlreiche der isolierten Sequenzen vorhersagt sind (Motiv I), kann diese nicht wesentlich oder maßgeblich für rev-Wechselwirkung sein. Optimale Größen für Schleife 1 scheinen 8 (Motiv I) oder 6 (Motiv III) zu sein, wobei es einen beobachteten Nachteil für Größen von 9 oder 3 gibt. Optimale Größen für Schleife 3 sind 5 und 4. Darüber hinaus kann die Wechselwirkung von rev mit den verschiedenen Domänen dieser Liganden additiv sein. Motiv II ist Motiv I primär in der Verbindung der Schleifen 1 und 3 an Stamm 2 ähnlich. Motiv III ist Motiv I an der Verbindung der Schleifen 1 und 3 an Stamm 1 ähnlich. Consensus-Diagramme der Nucleinsäurelösungen von Motiv I und II für HIV-rev sind in den 29 und 30 gezeigt.
  • Die Häufigkeit von Sequenzen in der klonierten Population steht nicht in enger Korrelation mit Affinität zu rev-Protein. Es ist möglich, dass die Konzentration von rev-Protein, die im SELEX-Verfahren verwendet wurde, ausreichend war, um einen signifikanten Prozentsatz von allen diesen Isolaten zu binden. Folglich kann eine Selektion für Replizierbarkeit von cDNA und DNA während PCR stattgefunden haben, die einer Selektion auf Bindung an rev unter geringer Stringenz hinzugefügt wurde. Die hochstrukturierte Beschaffenheit dieser Liganden und die möglichen Unterschiede der Wirksamkeit von cDNA-Synthese an diesen Matrices verstärkt diese potenzielle replikative Vorgabe. Auch gibt es eine gewisse Mutation, die während des SELEX-Verfahrens auftritt. Die Sequenz 6a ist 6b so ähnlich, dass die beiden einen gemeinsamen Vorgänger haben müssen. Dieses relativ späte Auftreten während der SELEX-Durchgänge kann die Knappheit dieser Sequenz, unabhängig von ihrer höheren Affinität zum Target, erklären. Auf dieselbe Weise können manche der Liganden, die aufgetreten sind, relativ spät während der Selektion der Vorläufersequenzen, die im Anfangskandidatengemisch existieren, jedoch nicht in der klonierten Population vorhanden sind, mutiert sein.
  • Die hierin offenbarte Erfindung ist in ihrem Umfang nicht auf die hierin offenbarten Ausführungsformen eingeschränkt. Wie offenbart kann die Erfindung von durchschnittlichen Fachleuten auf zahlreiche Nucleinsäureliganden und Targets angewandt werden. Geeignete Modifikationen, Anpassungen und Behelfe zur Anwendung der hierin enthaltenen Erläuterungen in individuellen Situationen können im Rahmen des Schutzumfangs der Erfindung, wie er hierin offenbart und beansprucht ist, von Fachleuten verwendet und verstanden werden. TABELLE 2
    Figure 01010001
    TABELLE 3
    Figure 01020001
    TABELLE 4
    Figure 01030001
    TABELLE 4 (Fortsetzung)
    Figure 01040001
  • Sekundärstrukturen, vorhergesagt gemäß dem Zucker-Programm, sind mit Pfeilen über den Buchstaben angegeben, die die umgekehrten Wiederholungen hervorheben, die ein Hinweis auf Basenpaarung sind. TABELLE 5
    Figure 01050001
    TABELLE 6
    Figure 01060001
    TABELLE 6 (Fortsetzung)
    Figure 01070001
    TABELLE 7
    Figure 01080001
    TABELLE 7 (Fortsetzung)
    Figure 01090001
    TABELLE 7 (Fortsetzung)
    Figure 01100001
    TABELLE 8
    Figure 01110001
    TABELLE 9
    Figure 01120001
    TABELLE 9 (Fortsetzung)
    Figure 01130001
    TABELLE 10
    Figure 01140001
    TABELLE 11 MOTIV 1
    Figure 01150001
    MOTIV II
    Figure 01150002
    TABELLE 11 (Fortsetzung) MOTIV III
    Figure 01160001
    TABELLE 12
    Figure 01170001
    TABELLE 13
    Figure 01180001
  • ANHANG
  • Selektion.
  • Ein einfacher kinetischer Mechanismus für reversible Protein-RNA-Komplexbildung in einer gut gemischten Lösung kann wie folgt dargestellt werden:
    Figure 01190001
    worin [Pf] die freie Proteinkonzentration ist, [RNAfi] die freie RNA-Spezies-i-Konzentration ist, [P:RNAi] die Protein-RNA-Spezies-i-Komplexkonzentration ist, k+i die Geschwindigkeitskonstante für Assoziation von freiem Protein und freier RNA der Spezies i ist, k–i die Geschwindigkeitskonstante für Dissoziation von Protein-RNA-Spezies-i-Komplexen ist und n die Anzahl von RNA-Sequenzen mit einer einmaligen Reihe von Geschwindigkeitskonstanten ist. Alternative Mechanismen, einschließlich mehrfacher Bindungsstellen oder Kooperativität, könnten in darauf folgenden Behandlungen mit geeigneten Extensionen in diesem einfachen Schema in Betracht gezogen werden.
  • Für jegliches System, das durch das obige Schema dargestellt werden kann, sind die grundlegenden chemisch-kinetischen oder Massenwirkungs-Gleichungen, die die Änderung der Konzentration von jedem Protein-RNA-Spezies-i-Komplex als eine Funktion der Zeit beschreiben, die folgenden:
    Figure 01190002
    worin [Pf], [RNAfi] und [P:RNAi] die Konzentrationen von freiem Protein, freier RNA der Spezies i und von Protein-RNA-Spezies-i-Komplex zum Zeitpunkt t sind.
  • Die freie Proteinkonzentration ist die Differenz zwischen der gesamten Proteinkonzentration und der Konzentration von allen Protein-RNA-Komplexen ([P]-Σ[P:RNAk]); in ähnlicher Weise ist die freie RNA-Spezies-i-Konzentration die Differenz zwischen der gesamten RNA-Spezies-i-Konzentration und der Protein-RNA-Spezies-i-Komplexkonzentration ([RNAi]-[P:RNAi]):
    Figure 01200001
  • Diese dynamischen Gleichungen können entweder für kinetische oder für Gleichgewichtsanalysen verwendet werden. Die kontinuierliche differenzielle Form ist gültig, wenn die mittlere Geschwindigkeit von jedem Vorgang im Vergleich zur Varianz in diesem Prozess relativ groß ist, oder anders ausgedrückt, Gleichung (3) trifft exakt für die Beschreibung eines Pools an RNA mit mehreren Molekülen zu, die jeweils eine einmalige Reihe von Geschwindigkeitskonstanten aufweisen. Immer wenn nur ein Molekül oder nur einige wenige Moleküle der am besten bindenden RNA vorhanden ist bzw. sind, wird eine statistische Beschreibung von Bindung verwendet, um die Bedingungen zu bestimmen, die eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Gewinnung der am besten bindenden RNA ergeben. Diese statistischen Formeln sind im folgenden Abschnitt basierend auf der Erfolgswahrscheinlichkeit abgeleitet.
  • Bei Gleichgewicht ist die Änderung der Konzentration von jedem Protein-RNA-Spezies-i-Komplex gleich null:
    Figure 01200002
    wobei die Symbole wie in Gleichung (3) definiert sind und worin Kdi die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante für Protein-RNA-Spezies-i-Komplex ist (Kdi = k–i/k+i).
  • Wird nur eine RNA-Spezies in Betracht gezogen (d.h. n = 1), so ist eine analytische Lösung für die Gleichgewichtskonzentration von Protein-RNA-Komplexen durch Auflösen der folgenden quadratischen Gleichung möglich:
    Figure 01210001
    die zwei reale Wurzeln hat, eine, die physikalisch umsetzbar ist:
    Figure 01210002
  • Natürlich gibt es zahlreiche klassische Annäherungen für Gleichgewichts- oder Quasi-Gleichgewichts-Konzentrationen von Komplexen, wie jene im Michaelis-Menten-Formalismus, doch keine ergibt ausreichende Exaktheit über den Bereich von Gesamt-RNA- und Protein-Konzentrationen, die in SELEX verwendet werden. (Aufschlussreiche Erörterungen zu gewissen Nachteilen und Einschränkungen von klassischer Annäherung sind in Savageau (1991); Straus & Goldstein (1943); Webb (1963) zu finden.) Obwohl eine analytische Lösung der quadratischen Gleichung für einfache reversible Assoziation einer einzelnen RNA-Spezies mit einer einzelnen Bindungsstelle am Protein für alle RNA- und Proteinkonzentrationen, die in SELEX verwendet werden, exakt ist und obwohl die gebundenen Konzentrationen der zwei konkurrierenden Spezies durch analytische Lösung einer Gleichung dritten Grades berechnet werden können, sind sich iterative numerische Verfahren erforderlich, um Gleichgewichtskonzentrationen von Protein-RNA-Komplexen zu berechnen, sobald drei oder mehr konkurrierende RNA-Spezies in Betracht gezogen werden.
  • Die Erfinder entwickelten ein Computerprogramm, um eine Lösung für die Gleichgewichtskonzentration von jedem Protein-RNA-Spezies-i-Komplex [P:RNAi], für jede mögliche Gesamt-Proteinkonzentration [P], jede mögliche Verteilung von RNA-Spezies-i-Konzentrationen [RNAi] und jede mögliche Verteilung von Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten, Kdi, zu finden. Die Jacobi-Matrix (siehe z.B. Leunberger (1973) für eine implizite Lösung von Gleichung (4) durch Newtonsches Verfahren (siehe z.B. Leunberger (1973); Press et al. (1988)) wird unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
    Figure 01220001
    worin aij das Element in Zeile i, Spalte j, der Jacobi-Matrix ist, wobei δjj = 1 und δij = 0 für i ≠ j.
  • Häufig hängt der Erfolg des Newtonschen Verfahrens von einer guten anfänglichen Schätzung für die Lösung ab (siehe z.B. Leunberger (1973); Press et al. (1988)), in diesem Fall von der Gleichgewichtskonzentration von jedem Protein-RNA-Spezies-i-Komplex [P:RNAi]. Unter Verwendung der Haupt-Kd für den gesamten RNA-Pool kann die Konzentration von Protein in allen Protein-RNA-Komplexen geschätzt werden:
    Figure 01220002
    worin [P:RNA] die Konzentration von allen Protein-RNA-Komplexen ist, [RNA] die Konzentration des gesamten RNA-Pools ist und <Kd> die Haupt-Gleichgewichtsdissoziationskonstante für den gesamten RNA-Pool ist, berechnet unter Verwendung der folgenden Formel:
    Figure 01220003
    worin [RNA][P]/2 die Gesamt-RNA-Konzentration ist, die die Hälfte des Proteins bindet, und F 0 / i = [RNAi]/[RNA] ist.
  • Mit dieser Schätzung der Konzentration von Protein in Komplexen kann eine anfängliche Annäherung für die Konzentration von jedem Protein-RNA-Spezies-i-Komplex unter Verwendung der folgenden Formel durchgeführt werden:
    Figure 01230001
    Lösungen für die Werte von [P:RNAi], die Gleichung (4) erfüllen, können durch wiederholte Anwendung des Newton-Verfahrens unter Verwendung von Gleichung (7) auf ein hohes Niveau der Exaktheit verfeinert werden. Bei dieser Ausführung erzielen die Erfinder Lösungen mit mehr als zwölf signifikanten Stellen in weniger als vier oder fünf Wiederholungen des Newton-Verfahrens. Diese rasche Annäherung an eine exakte Lösung ist auf die anfänglichen Annäherungen in Gleichung (10) zurückzuführen, die typischerweise eine oder mehrere signifikante Stellen zu Beginn ergeben – je nach dem Bereich der Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten und der Häufigkeit von jeder RNA-Spezies. Ein Grund für dieses Niveau der Exaktheit ist, dass Fehler in [P:RNA] dazu neigen, sich in Gleichung (10) aufzuheben, sobald [P] – [P:RNA] größer als Kdi ist, beispielsweise wenn [RNA] weniger als Kdi ist oder wenn Kdi weniger als <Kd> ist. Interessanterweise bedeutet dies, dass Exaktheit für jeglichen Protein-RNA-Spezies-i-Komplex mit besserer Bindung als der Haupt-RNA-Pool höher ist. Repräsentative Beispiele für die anfängliche Exaktheit von Anreicherungsberechnungen – definiert als die Steigerung des Anteils des Gesamt-RNA-Pools, der sich aus den am besten bindenden RNA-Spezies aus jedem Durchgang zusammensetzt, und angenähert durch Einsetzen von Gleichung (10) in Gleichung (20) –. Die gezeigte Gesamtexaktheit spiegelt die Exaktheit der Gleichgewichtskonzentrationen wider, die für jeden Protein-RNA-Spezies-i-Komplex unter Verwendung von Gleichung (10) berechnet wurden. Im folgenden Abschnitt profitieren die Erfinder von dieser Exaktheit, um die optimalen RNA- und Proteinkonzentrationen für maximale Anreicherung zu berechnen.
  • Abtrennen.
  • Jegliches Verfahren zur Abtrennung verschiedener Spezies von Nucleinsäuresequenzen – einschließlich Filterbindung (Tuerk & Gold, 1990), Gelmobilil tätsverschiebungen (Blackwell & Weintraub, 1990), Affinitätschromatographie (Ellington & Szostak, 1990); Green et al., 1990; Oliphant & Struhl, 1987; Oliphant & Struhl, 1988), Antikörperfällung, Phasentrennungen oder Schutz vor nukleolytischer Spaltung (Robertson & Joyce, 1990) – könnte zu seinem Vorteil mit SELEX verwendet werden. Bei Filterbindung beispielsweise haften die meisten Protein-RNA-Komplexe an einem Nitrocellulosefilter, während die meisten freien RNA-Moleküle durchgewaschen werden (Uhlenbeck et al., 1983; Yarus, 1976; Yarus & Berg, 1967; Yarus & Berg, 1970). Die tatsächliche Fraktion von Protein-RNA-Komplex, die anhaftet und dann vom Filter entfernt werden kann, wird im nächsten Abschnitt behandelt.
  • Da eine Fraktion freier RNA-Moleküle auch am Filter als nichtspezifischer Hintergrund anhaftet, wird die Gesamtmenge von jeder RNA-Spezies i, die am Filter abgenommen wird, unter Verwendung der folgenden Formel berechnet, die sowohl das erwünschte Signal aus den am besten bindenden RNA-Molekülen in Protein-RNA-Komplexen als auch das Rauschen von freien RNA-Molekülen, die als nichtspezifischer Hintergrund abgenommen werden, plus konkurrierender RNA-Moleküle in Protein-RNA-Komplexen berücksichtigt: RNAfilti = Vol·([P:RNAi] + BG·([RNAi] – (P:RNAi]))·6,02·1023, i = l, ... n, (11)worin RNA filt / i die Anzahl an Molekülen von abgenommener RNA-Spezies i, Vol das Volumen des Reaktionsgemisches, das durch den Filter geführt wird, [P:RNAi] die Gleichgewichtskonzentration von Protein-RNA-Spezies-i-Komplex, berechnet wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben, BG die Fraktion von freier RNA, abgenommen als nichtspezifischer Hintergrund, und [RNAi] die Gesamt-RNA-Spezies-i-Konzentration ist. Jegliches Verfahren zur Abtrennung ergibt typischerweise weniger als perfekte Abtrennung von gebundenen und ungebundenen Liganden und erfordert folglich ein Maß für die Fraktion freier Liganden, die als Hintergrund mit gebundenen Liganden in jedem Durchgang abgenommen wurden.
  • Wie bereits erwähnt können nicht alle Protein-RNA-Komplexe in Lösung am Filter abgenommen werden. Darüber hinaus kann RNA in fest gebundenen Komplexen besser am Filter zurückgehalten werden als RNA in schwach gebundenen Komplexen. Sobald dies eintritt, würde Anreicherung an RNA-Molekülen, die sich fest binden, in jedem Durchgang von SELEX weiter gesteigert werden. Andererseits würde ihre Anreicherung, wenn manche Moleküle nicht vom Filter eluiert werden könnten, auch reduziert werden.
  • Amplifikation und neuerliche Normalisierung.
  • Die Menge von jeder RNA-Spezies i, die aus dem Filter gewonnen wird, wird unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: RNApcri = FR·RNAfilti , i = l, ... n, (12)worin FR die Fraktion von RNA ist, die vom Filter gewonnen werden kann, und RNA filt / i die Anzahl an Molekülen von RNA-Spezies i ist, die an den Filtern abgenommenen wurden, berechnet mit Gleichung (11). In dieser Behandlung wird der Wert von FR als konstant angenommen und wird sowohl durch die Fraktion von Protein-RNA-Komplex, die am Filter anhaftet, als auch durch die Fraktion von RNA in diesen Komplexen, die durch reverse Transkriptase gewonnen und kopiert werden kann, um cDNA für PCR herzustellen, bestimmt. Die Annahme, dass FR für alle Spezies konstant ist, ist ein vernünftiger Ausgangspunkt, da unter Gewährung einer ausreichenden Dauer, wenn alle Moleküle dieselben Primerstellen für PCR aufweisen und ein Überschuss von Primermolekülen verwendet wird, jede Spezies – unabhängig davon, ob selten oder häufig vorhanden – praktisch dieselbe Wahrscheinlichkeit aufweist, mit einem Primermolekül zu anellieren. Auch gibt es keine unterschiedliche Amplifikationsgeschwindigkeit auf Grundlage der Größe, da jedes RNA-Molekül dieselbe Länge aufweist. Natürlich wird, wenn irgendeine RNA-Spezies eine Sekundärstruktur aufweist, die Primeranellierung für cDNA-Synthese stört, oder wenn die Primär- oder Sekundärstruktur der entsprechenden cDNA die Geschwindigkeit von DNA-Polymerase während PCR-Amplifikation herabsetzt, Anreicherung dieser Spezies reduziert. Die Erfinder nehmen diese Wirkungen nicht in die Erfindung auf, da es keine guten Regeln gibt, nach denen vorhergesagt werden kann, welche Strukturen tatsächlich einen Unterschied ausmachen. Wird mehr über diese Strukturen in Erfah rung gebracht, so können jegliche signifikante Wirkungen zur mathematischen Beschreibung von SELEX zugesetzt werden.
  • Die Gesamtmenge von RNA, die aus dem Filter gewonnen wird, wird durch Summieren der Anzahl an Molekülen von jeder Spezies, die abgenommen wurde, um cDNA-Kopien für PCR-Amplifikation herzustellen, berechnet:
    Figure 01260001
  • Jegliche „Träger"- oder „nichtspezifische Konkurrenz"-Moleküle sollten aus der Summe in Gleichung (13) ausgeschlossen werden, da ohne PCR-Primerstellen diese Moleküle nicht amplifizieren. Arbeitsvorschriften zu Affinitätsmessungen umfassen häufig diese nichtspezifischen Konkurrenz-RNA-Moleküle, und werden solche Moleküle auch in SELEX verwendet, so sollten sie eindeutig nicht-amplifizierbar sein. Interessanterweise ist, sobald nichtspezifische Konkurrenzmoleküle mit dem Protein an derselben Stelle wie das am besten bindende Ligandenmolekül wechselwirken, die hauptsächliche Konsequenz aus dem Zusatz von Konkurrenzmolekülen eine Reduktion der Anzahl spezifischer Stellen, die für Selektion verfügbar sind. Somit müssen, um die Proteinkonzentration zu bestimmen, die die erwünschte Menge von amplifizierbaren Ligandenmolekülen mit einer hohen Konzentration von vorhandenen nicht-spezifischen Konkurrenzmolekülen bindet, korrekte Bindungskurven durch Einbinden der geeigneten Konzentration von diesen Molekülen in jede Titrierung erstellt werden. Die Vorteile der Verwendung einer hohen Konzentration von nichtspezifischen, nicht-amplifizierbaren Konkurrenzmolekülen in jedem SELEX-Durchgang können eine Reduktion der Adsorption von amplifizierbaren Ligandenmolekülen an jeglichen nichtspezifischen Stellen an Laborgeräten, eine Reduktion der Bindung von amplifizierbaren Ligandenmolekülen an jeder nichtspezifischen Stelle am Targetprotein oder eine Reduktion der Fraktion von freien amplifizierbaren Molekülen, abgenommen als nichtspezifischer Hintergrund, an „falsch abtrennenden" Stellen umfassen, jedoch nur, wenn solche Stellen in einer signifikanten Anzahl vorhanden sind und durch die Menge an verwendeten nichtspezifischen Konkurrenzmolekülen wirksam gesättigt werden. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, so ist die Wirkung des Zusetzens von nichtspezifischen Konkurrenzmolekülen im Wesentlichen dieselbe wie jene einer Reduktion der Menge von verwendetem Protein.
  • Die Menge von jeder amplifizierbaren RNA-Spezies i, die nach einem Durchgang gewonnen wird, in Bezug auf die Summe aus Gleichung (13), wird wie folgt berechnet:
    Figure 01270001
  • Nach PCR-Amplifikation von cDNA-Kopien und neuerlicher Normalisierung des RNA-Pools zurück zu seiner ursprünglichen Konzentration durch In-vitro-Transkription (aus identischen Promotorstellen an allen cDNA-Molekülen) beträgt die Konzentration von jeder RNA-Spezies nach einem SELEX-Durchgang: [RNAi] = F1i ·[RNA], i = l, ... n, (15)worin [RNA] die Gesamtkonzentration des RNA-Pools ist. Für jeden zusätzlichen Durchgang von SELEX kann die Konzentration von jeder RNA-Spezies durch Iteration der Gleichungen (7)–(15) berechnet werden, worin F 1 / i für jede RNA-Spezies aus einem Durchgang die Ausgangsfraktion F 0 / i im nächsten Durchgang ist [siehe Gleichung (9)].

Claims (40)

  1. Verfahren, umfassend die spezifische Bindung in vitro eines Nucleinsäureliganden an ein Target-Molekül, die keine Bindung zwischen Nucleinsäuren ist; worin, sofern das Target-Molekül ein Protein ist, es ein Protein ist, das Nucleinsäuren nicht als Teil seiner biologischen Funktion bindet, und worin der Nucleinsäureligand durch ein Verfahren identifiziert wurde, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren eines Gemischs von Nucleinsäuren mit dem Target unter Bedingungen, die für Bindung günstig sind; (b) das Trennen ungebundener Nucleinsäuren von jenen Nucleinsäuren, die sich an Target-Moleküle gebunden haben; (c) das Dissoziieren der Nucleinsäure-Target-Paare; (d) die Amplifikation der Nucleinsäuren, die aus den Nucleinsäuren-Target-Paaren dissoziiert wurden, um ein an Liganden angereichertes Gemisch von Nucleinsäuren zu erhalten; (e) das Wiederholen der Schritte des Bindens, Trennens, Dissoziierens und Amplifizierens in so vielen Zyklen wie erwünscht, um den/die Liganden zu erhalten, der/die sich spezifisch an das Target-Molekül bindet/binden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren verwendet wird: – für die Detektion, Quantifizierung oder Reinigung von Target-Molekülen; – für die Detektion, Quantifizierung, Isolierung oder Reinigung eines Target-Proteins; – in einem Test; – in einem Diagnoseverfahren; – bei Zellsortierung; – als ein Inhibitor für Target-Molekülfunktion; – als eine Sonde oder ein Sequestrationsmittel; – um die Gegenwart oder Abwesenheit von einem Target-Molekül in einer Probe nachzuweisen und/oder die Menge dieses Target-Moleküls zu messen; – um eine Funktion des Target-Moleküls zu modifizieren; oder – um Proteinfunktion zu bewirken, zu inhibieren oder zu fördern.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Ligand ein Reagenz in einem Diagnosetest ist.
  4. Verwendung eines Nucleinsäureliganden bei der Herstellung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels für ein therapeutisches oder diagnostisches Verfahren, das die spezifische Bindung in vivo des Liganden an ein Target-Molekül einbindet, die keine Bindung zwischen Nucleinsäuren ist; worin, sofern das Target-Molekül ein Protein ist, es ein Protein ist, das Nucleinsäuren nicht als Teil seiner biologischen Funktion bindet, und worin der Nucleinsäureligand durch ein Verfahren identifiziert wurde, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren eines Gemischs von Nucleinsäuren mit dem Target unter Bedingungen, die für Bindung günstig sind; (b) das Trennen ungebundener Nucleinsäuren von jenen Nucleinsäuren, die sich an Target-Moleküle gebunden haben; (c) das Dissoziieren der Nucleinsäure-Target-Paare; (d) die Amplifikation der Nucleinsäuren, die aus den Nucleinsäuren-Target-Paaren dissoziiert wurden, um ein an Liganden angereichertes Gemisch von Nucleinsäuren zu erhalten; (e) das Wiederholen der Schritte des Bindens, Trennens, Dissoziierens und Amplifizierens in so vielen Zyklen wie erwünscht, um den/die Liganden zu erhalten, der/die sich spezifisch an das Target-Molekül bindet/binden.
  5. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Ligand oder das Mittel eine Funktion des Target-Moleküls modifiziert.
  6. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Ligand oder das Mittel die Funktion des Targets inhibiert.
  7. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Ligand oder das Mittel die Funktion des Targets aktiviert.
  8. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Target ein Protein ist und der Ligand oder das Mittel die Funktion des Proteins beeinflusst, inhibiert oder fördert.
  9. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Target ein Protein ist und der Ligand die Funktion des Proteins inhibiert.
  10. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Ligand oder das Mittel: (i) die katalytische Aktivität von Enzymen beeinflusst; (ii) die Funktionalität von Proteinrezeptoren beeinflusst; (iii) die Bildung von Proteinmultimeren beeinflusst; (iv) Bindung an Rezeptoren beeinflusst; (v) die Spezifität von Bindung an Rezeptoren modifiziert; (vi) Hormonwirkung modifiziert; oder (vii) die Transporteigenschaften von Proteinen modifiziert.
  11. Verwendung nach Anspruch 4, worin der Ligand oder das Mittel zur Verwendung: (i) bei der Detektion oder Quantifizierung eines Targetproteins; (ii) in einem Test; (iii) in einem Diagnoseverfahren; (iv) als ein Sequestrationsmittel; (v) als ein Wirkstoffzufuhrvehikel; oder (vi) als ein Modifikator von Hormonwirkung beabsichtigt ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 4, worin der Ligand ein Toxin oder ein anderes therapeutisches Mittel auf eine spezifische Targetstelle richtet.
  13. Verwendung nach Anspruch 4, worin der Ligand weiters ein Nicht-Nucleinsäure-Element umfasst, das in der Lage ist, die Nucleinsäure auf eine ausgewählte Stelle im Körper eines Patienten zu richten.
  14. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Nucleinsäureligand einzelsträngig ist.
  15. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin der Ligand einzelsträngige RNA umfasst.
  16. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin der Ligand einzelsträngige DNA umfasst.
  17. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Ligand chemisch modifizierte RNA oder DNA umfasst.
  18. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 17, worin die Modifikation am exozyklischen Cytosin-Amino angeordnet oder 5-Brom-Substitution von Uracil oder Methylierung ist.
  19. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, worin die Modifikation die Amplifikation der Nucleinsäure nicht stört.
  20. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Ligand zumindest 15 Nucleotide enthält.
  21. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Ligand eine Vielzahl an Target-spezifischen Ligandensequenzen umfasst.
  22. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Ligand eine Vielzahl an Nucleinsäuresequenzen umfasst, die sich an dasselbe Target binden.
  23. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Ligand weiters ein Nicht-Nucleinsäure-Element umfasst.
  24. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Ligand in Form einer Ligandenlösung vorliegt, die eine Vielzahl an Nucleinsäureliganden umfasst, die eine gemeinsam gehaltene dreidimensionale Struktur aufweisen, die konservierte Komponenten definiert.
  25. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Target-Molekül aus Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Polysacchariden, Glykoproteinen, Hormonen, Rezeptoren, Antigenen, Antikörpern, Viren, Substraten, Metaboliten, Inhibitoren, Wirkstoffen, Nährstoffen und Wachstumsfaktoren ausgewählt ist.
  26. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Target-Molekül aus Proteinen und Peptiden ausgewählt ist.
  27. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Target-Molekül ein Protein ist.
  28. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Target Bradykinin ist.
  29. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Target Protease ist.
  30. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Target eine Serinprotease ist.
  31. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 30, worin die Serinprotease menschlicher Gewebe-Plasminogenaktivator ist.
  32. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 30, worin die Serinprotease Trypsin ist.
  33. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 30, worin die Serinprotease Elastase ist.
  34. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 30, worin die Serinprotease Chymotrypsin ist.
  35. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 30, worin die Serinprotease Thrombin ist.
  36. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 30, worin die Serinprotease Plasmin ist.
  37. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Target ein Säugetierrezeptor ist.
  38. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Target menschliches Insulin ist.
  39. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Target ein Säugetierhormon oder -faktor ist.
  40. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 39, worin das Hormon oder der Faktor Epinephrin oder Schilddrüsenhormon ist.
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