DE69233657T2 - Drei Mikrosatelliten-Repeat-Polymorphe DNA-Marker mit hoher Informationsdichte - Google Patents

Drei Mikrosatelliten-Repeat-Polymorphe DNA-Marker mit hoher Informationsdichte Download PDF

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Description

  • Technisches Gebiet
  • Diese Anmeldung betrifft das genetische Testen mit polymorphen DNA-Marken mit Repeat-Sequenzen, um ein rasches und bequemes hochauflösendes Verfahren bereitzustellen zur Unterscheidung von Ziel-Nucleinsäure-Segmenten auf der Basis von Nucleotid-Differenzen gemäß menschlicher Individualisierung, worin die Nucleinsäure-Segmente sich in ihrer Größe unterscheiden.
  • Stand der Technik
  • Die genetische Wissenschaft hat in der Identifizierung der menschlichen Individualisierung und genetischen Verwandtschaft zwischen Individuen ein starkes Interesse gezeigt. Jedes Individuum weist Erbmaterial (DNA, "Nucleotide") auf, das für dieses Individuum einzigartig ist, und Erbmaterial, das mit dem von anderen verwandt ist. Es wurden Verfahren entwickelt, die auf der Identifizierung und Charakterisierung von Veränderungen in DNAs basieren, die Veränderungen in DNA (DNA-Polymorphismus) aufgrund von Nucleotid-Substitution, Insertion oder Deletion innerhalb der DNA-Ketten sind.
  • Auf dem Gebiet der forensischen Medizin besteht z.B. ein starkes Interesse an solchen Polymorphismen für Identifizierungszwecke. Forensische Genetiker haben viele Techniken entwickelt, um homologe Segmente von DNA zu vergleichen, um festzustellen, ob die Segmente identisch sind, oder ob sie sich in einem oder mehreren Nucleotiden unterscheiden. Praktische Anwendungen dieser Techniken gibt es auch auf anderen Gebieten als der forensischen Medizin, z.B. der genetischen Gen-Krankheitsdiagnostik und der menschlichen Genom-Kartierung.
  • Zur Zeit erfordert auf diesem Gebiet der genaueste und informativste Weg zum Vergleich von DNA-Segmenten ein Verfahren, das die vollständige Nucleotid-Sequenz jedes DNA-Segments bereitstellt. Es wurden besondere Techniken zur Bestimmung aktueller Sequenzen entwickelt, um eine Mutation in menschlichen Genen zu untersuchen. Siehe z.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 544-548 (1988), und Nature 330, 384-386 (1987). Aufgrund der übermäßigen Zeit und hohen Kosten zur Bestimmung, Interpretierung und dem Vergleich von Sequenzinformation ist es zur Zeit nicht praktisch brauchbar, eine ausgedehnte Sequenzierung zum Vergleich mehrerer als bloß einiger DNA-Segmente zu verwenden.
  • In der Genkartierung besteht das am häufigsten verwendete Screenen auf DNA-Polymorphismen, die aus Mutationen stammen, aus der Digestion des DNA-Stranges mit Restriktions- Endonucleasen und Analysieren der resultierenden Fragmente mittels Southern-Blot. Siehe Am. J. Hum. Genet. 32, 314-331 (1980), oder Sci. Am. 258, 40-48 (1988). Da Mutationen oft statistisch auftreten, können sie die Erkennungssequenz der Endonuclease beeinträchtigen und die enzymatische Spaltung an dieser Stelle verhindern. Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus-Mappings (RFLPS) basieren auf Veränderungen an der Restriktionsstelle. Sie sind genau aber nicht sehr informativ (PIC [0.3]). Das Hauptproblem mit RFLPs ist die Unfähigkeit eines Tests zur Bestimmung von Veränderungen, die eine Spaltung mit einer Restriktions-Endonuclease nicht beeinträchtigen. In vielen der Testmethoden auf dem DNA-Gebiet sind die zur Bestimmung von RFLPs verwendeten Methoden sehr arbeitsintensiv und kostspielig, insbesondere die Techniken, die eine Southern-Blot-Analyse umfassen.
  • Andere Techniken zur Bestimmung spezifischer Mutationen in bestimmten DNA-Segmenten umfassen das Hybridisieren von DNA-Segmenten, die analysiert werden (Ziel-DNA) mit einer komplementären markierten Oligonucleotid-Sonde. Siehe Nulc. Acids Res. 9, 879-894 (1981). Da DNA-Duplexe, die einen einzigen Basenpaar-Mismatch enthalten, eine hohe thermische Instabilität zeigen, kann die Differential-Schmelztemperatur verwendet werden, um Ziel-DNAs, die vollkommen komplementär zur Sonde sind, von Ziel-DNAs, die sich nur durch ein einziges Nucleotid unterscheiden, zu unterscheiden. Diese Methode wurde angepasst, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer spezifischen Restriktionsstelle zu bestimmen; US-Patent Nr. 4 683 194. Die Methode umfasst die Verwendung einer endmarkierten Oligonucleotid-Sonde, die eine Restriktionsstelle überbrückt, die zu einer Ziel-DNA hybridisiert wird. Der hybridisierte DNA-Duplex wird dann mit dem für diese Stelle geeigneten Restriktionsenzym inkubiert. Reformierte Restriktionsstellen werden durch Digestion in dem Duplexpaar zwischen der Sonde und dem Ziel unter Verwendung der Restriktions-Endonuclease gespalten. Die spezifische Restriktionsstelle ist in der Ziel-DNA vorhanden, wenn gekürzte Sondenmoleküle bestimmt werden.
  • Ein anderes Verfahren zur Untersuchung von Differenzen in der DNA-Struktur ist das Primer-Extension-Verfahren, das aus dem Hybridisieren eines markierten Oligonucleotid-Primers an eine Templat-RNA oder -DNA und nachfolgende Verwendung einer DNA-Polymerase und Desoxynucleosidtriphosphaten zur Verlängerung des Primers am 5'-Ende des Templats besteht. Eine Auflösung des markierten Primer-Extensions-Produkts wird dann durch Fraktionieren auf der Basis der Größe durchgeführt, z.B. durch Elektrophorese via ein denaturierendes Polyacrylamid-Gel. Diese Verfahren wird oft verwendet, um homologe DNA-Segmente zu vergleichen, und um Differenzen aufgrund von Nucleotid-Insertion oder -Deletion zu bestimmen. Unterschiede aufgrund von Nucleotid-Substitution werden nicht bestimmt, da die Größe das einzige angewandte Kriterium zur Charakterisierung des Primer-Extensions-Produkts ist.
  • Ein anderes Verfahren benützt die Tatsache, dass der Einbau einiger Nucleotid-Analoga in DNA einen Zuwachs an Mobilität verursacht, wenn DNA einem Größenfraktionsverfahren, wie z.B. einer Elektrophorese, unterworfen wird. Nucleotid-Analoga können verwendet werden, um Ver änderungen zu identifizieren, da sie eine elektrophoretische Mobilitätsverschiebung verursachen können. Siehe US-Patent 4 879 214.
  • Unglücklicherweise sind die zur Identifizierung von Polymorphismen verwendeten vorstehenden Techniken entweder nicht sehr informativ oder benötigen zu ihrer Durchführung einen langen Zeitraum. Techniken, die Veränderungen in individuellen Nucleotiden an einem bestimmten DNA-Strang identifizieren, benötigen z.B. oft 3 bis 4 Tage zu ihrer Durchführung. Solche Tests sind deshalb sehr arbeitsintensiv und teuer durchzuführen.
  • Außerdem sind feine genetische Unterschiede unter verwandten Individuen in Bezug auf Nucleotide, die in den DNA-Ketten substituiert sind, schwer zu bestimmen. VNTR- oder Jeffrey-Sonden (die das FBI verwendet, um DNA-Ketten zu testen und zu identifizieren) sind sehr informativ, aber arbeitsintensiv, zum Unterschied zu Mikrosatelliten, die gleich informative Polymorphismen auf PCR-Basis sind.
  • Die Verwendung bestimmter Nucleotid-Repeat-Polymorphismen zur Identifizierung oder zum Vergleich von DNA-Segmenten wurde von Weber & May 89 Am Hum Genet 44:388, Litt & Luthy'89 Am Hum Genet 44:397 beschrieben. Die erfindungsgemäßen bestimmten polymorphen genetischen Segmente und Primer, die zur Verwendung der Polymorphismen (zur Identifizierung und für Vergleichszwecke) verwendet werden, waren jedoch bisher nicht bekannt oder naheliegend.
  • EMBO J., Bd. 2, 1983, S. 757-761, Moos et al., beschreiben ein β-Actin-ähnliches Pseudo-Gen, HβAc-φ2, dem eine 230 bp-Region vorhergeht, in der die einzige Sequenz 5'-GAAA-3' mehr als 40 Mal wiederholt ist.
  • Es besteht deshalb auf diesem Gebiet ein Bedürfnis für eine rasche einfache nicht teure und genaue Technik, die einen sehr hohen Auflösungswert aufweist, um Verwandtschaften zwischen Individuen und Unterschiede im Grad der Verwandtschaften zu bestimmen. Es besteht auf diesem Gebiet auch ein Bedürfnis für ein sehr genaues genetisches Verwandtschafts-Testverfahren, das sehr kleine Mengen einer ursprünglichen DNA-Probe verwendet, und doch sehr genaue Ergebnisse liefert. Das ist insbesondere auf dem Gebiet der forensischen Medizin und Kriminologie vorhanden, da oftmals sehr kleine DNA-Proben zum Testen zur Verfügung stehen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines raschen und genauen Tests zur Messung der feinen Unterschiede in Individuen mittels genetischem Testen.
  • Eine weitere Aufgabenstellung der Erfindung betrifft polymorphe Marker, die für eine menschliche Individualisierung verwendet werden können.
  • Eine weitere Aufgabenstellung der Erfindung ist die Bereitstellung einer raschen und genauen Technik zur Messung der feinen Unterschiede in Individuen mittels genetischem Testen, das auf vielen Gebieten angewendet werden kann, z.B. bei einem forensischen Screening, einem Vaterschafts-Test und einem pränatalen Screening und genetischem Kartieren (Mapping).
  • Eine weitere Aufgabenstellung ist die Bereitstellung einer verbesserten Methode zur Durchführung eines PCR-Verfahrens unter Verwendung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Nucleotids und die Bereitstellung eines PCR-Assay-Kits, der eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Nucleotids und PCR-Hilfsreagentien aufweist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
  • 2 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
  • 3 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3.
  • 4 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4.
  • 5 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5.
  • 6 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6.
  • 7 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 7.
  • 8 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8.
  • 9 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 9.
  • 10 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10.
  • 11 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 11.
  • 12 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12.
  • 13 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 13.
  • 14 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 14.
  • 15 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 15.
  • 16 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 16.
  • 17 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 17.
  • 18 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 18.
  • 19 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 19.
  • 20 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20.
  • 21 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 21.
  • 22 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 22.
  • 23 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 23.
  • 24 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 24.
  • 25 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 25.
  • 26 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 26.
  • 27 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 27.
  • 28 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 28.
  • 29 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 29.
  • 30 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 30.
  • 31 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 31.
  • 32 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 32.
  • 33 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 33.
  • 34 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 34.
  • 35 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 35.
  • 36 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 36.
  • 37 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 37.
  • 38 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 38.
  • 39 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 39.
  • 40 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 40.
  • 41 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 41.
  • 42 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 42.
  • 43 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 43.
  • 44 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 44.
  • 45 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 45.
  • 46 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 46.
  • 47 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 47.
  • 48 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 48.
  • 49 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 49.
  • 50 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 50.
  • 51 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 51.
  • 52 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 52.
  • 53 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 53.
  • 54 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 54.
  • 55 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 55.
  • 56 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 56.
  • 57 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 57.
  • 58 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 58.
  • 59 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 59.
  • 60 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 60.
  • 61 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 61.
  • 62 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 62.
  • 63 bezieht sich auf eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 63.
  • Beste Art zur Durchführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen schnellen und genauen Test zur Messung feiner genetischer Unterschiede in Individuen mittels genetischem Testen bereit. Die Erfindung betrifft ferner polymorphe Marker (zwei Tetranucleotid- und einen Dinucleotid-Repeat-Polymorphismus(en), die zur menschlichen Individualisierung verwendet werden können. Anwendungen für die Techniken und Marker gemäß der Erfindung sind z.B. das forensische Screening, in Vaterschafts- und Pränatal-Screening sowie in genetischem Kartieren.
  • Die Erfindung betrifft ferner polymorphe Marker (zwei Tetranucleotid- und einen Dinucleotid-Repeat-Polymorphismus(en), die geeignet sind zur menschlichen Individualisierung bei forensischem Screening und in Vaterschafts- und Pränatal-Screening sowie in genetischem Kartieren verwendet zu werden. Die erfindungsgemäßen Marker weisen hohe Polymorphismus-Informationsgehalt (PIC)-Werte auf. Die Marker sind durch Sätze von folgenden Oligonucleotid-Primern charakterisiert:
    • 1. Satz 1, PIC 0,92 a. Eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 b. Eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2
    • 2. Satz 2, PIC 0,91 a. Eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 b. Eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4
    • 3. Satz 3, PIC 0,92 a. Eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 b. Eine Nucleotid-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6
  • Diese polymorphen Marker (zwei Tetranucleotid- und ein Dinucleotid-Repeat-Polymorphismus (Polymorphismen)), die auch durch beginnende und endende Nucleotid-Sequenzen begleitet sind), die für eine menschliche Individualisierung verwendet werden können, sind ferner durch die folgenden Marker-Sequenzen charakterisiert.
    • 1. Eine Nucleotid-Sequenz mit einem Repeat-Polymorphismus gemäß SEQ ID NO: 7.
    • 2. Eine Nucleotid-Sequenz mit einem Repeat-Polymorphismus gemäß SEQ ID NO: 8.
    • 3. Eine Nucleotid-Sequenz mit einem Repeat-Polymorphismus gemäß SEQ ID NO: 9.
  • Da ein polymorpher Marker und ein Index-Lokus als "Paar" auftreten, ermöglicht das Anheften eines erfindungsgemäßen Primer-Oligonucleotids an den polymorphen Marker eine PCR-Amplifikation des Segmentpaars. Das amplifizierte DNA-Segment kann dann durch Elektrophorese und Autoradiographie getrennt werden. Eine resultierende Autoradiographie kann dann auf ihre Ähnlichkeit zu einer anderen DNA-Segment-Autoradiographie analysiert werden. Nach dem PCR-Amplifikationsverfahren können die elektrophoretische Mobilität erhöhende DNA-Analoga gegebenenfalls verwendet werden, um die Genauigkeit der Elektrophorese-Stufe zu erhöhen.
  • Siebenundzwanzig andere primäre Paar-Sequenzen zur Bestimmung von einzigartigen Polymorphismen sind Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 10 bis SIQ ID NO: 63, die hier nur für Vergleichszwecke beschrieben sind und nicht einen Teil der Erfindung bilden.
  • Die beschriebenen Polymorphismen sind aufgrund ihrer hohen PIC-Werte für eine menschliche Probenindividualisierung brauchbar. Da die beschriebenen Polymorphismen auf der Polymerase-Kettenreaktion basieren, sind nur kleine Mengen an genomischer DNA für jeden Test erforderlich. Die Ziel-Sequenzen liegen im Bereich von 69 bis 260 bps Länge, wodurch eine DNA mit hohem Molekulargewicht nicht erforderlich ist, und allgemeine Probleme, wie z.B. Scheren von DNA, werden einen minimalen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit des Assays haben. Der Assay ist leicht durchzuführen, und Ergebnisse können innerhalb von 24 Stunden erhalten werden.
  • Mikrosatelliten-Repeat-Polymorphismen haben sich als brauchbare Werkzeuge in der DNA-Analyse gezeigt. Die hier beschriebenen 27 Vergleichspolymorphismen sind original und basieren auf vorher sequenzierten menschlichen Genen. Die am meisten verwendete Technik beim forensischen Screening basiert auf Minisatelliten-Markern im Unterschied zu den hier beschriebenen PCR-fähigen Mikrosatelliten.
  • Die 27 Vergleichsmarker sind durch Sätze der folgenden Oligonucleotid-Primer charakterisiert:
    Figure 00080001
  • Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Durchführung eines PCR-Verfahrens, das die Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einem erfindungsgemäßen wie vorstehend angegebenen Nucleotid umfasst, wobei das Nucleotid Teil eines Primer-Nucleotid-Paares ist, ausgewählt aus der Gruppe von Nucleotid-Paaren bestehend aus
    • a) einer Nucleotid-Sequenz mit einer Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, und einer Nucleotid-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt;
    • b) einer Nucleotid-Sequenz mit einer Sequenz, wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt, und einer Nucleotid-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 4 gezeigt; und
    • c) einer Nucleotid-Sequenz mit einer Sequenz, wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt, und einer Nucleotid-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
  • Die Erfindung betrifft deshalb ferner einen Assay zur Messung der feinen Unterschiede in genetischem Material in Bezug auf einen zusätzlichen oder fehlenden Satz von Dinucleotid- oder Tetranucleotid-Repeat-Polymorphismen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 7, einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 und einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 9, der umfasst
    • a. Erhalten eines Nucleotid-Segments, umfassend die Repeat-Polymorphismen in einer zum Testen wirksamen Menge,
    • b. Amplifizieren der DNA-Segmente durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung eines Oligonucleotid-Primerpaars, das die Polymorphismen-enthaltenden Segmente amplifizieren kann,
    • c. Auftrennen der amplifizierten Segmente unter Verwendung von Page-Gelelektrophorese; und
    • d. Vergleichen der aufgetrennten Segmente durch Autoradiographie, um die Unterschiede in den Migrationsmustern aufgrund einer Längenvariation zu beobachten.
  • Vorzugsweise betrifft die Erfindung ferner einen Assay zum Messen der feinen Unterschiede im genetischen Material in Bezug auf einen zusätzlichen oder fehlenden Satz von Dinucleotid- oder Tetranucleotid-Repeat-Polymorphismen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 7, einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 und einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 9, das umfasst
    • a. Erhalten von Nucleotid-Segmenten, die die Repeat-Polymorphismen in einer zum Testen wirksamen Menge aufweisen,
    • b. Amplifizieren der Segmente mittels eines PCR-Verfahrens unter Verwendung eines Oligonucleotid-Primerpaars, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2, einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3, einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4, einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6,
    • c. Auftrennen der amplifizierten Segmente unter Verwendung von Page-Gelelektrophorese und
    • d. Vergleichen der aufgetrennten Segmente durch Autoradiographie, um die Unterschiede in den Migrationsmustern aufgrund einer Längenvariation zu beobachten.
  • Die Erfindung betrifft ferner einen Assay-Kit zur Durchführung des PCR-Verfahrens, umfassend eine wirksame Menge von mindestens einem Nucleotid mit einer wie vorstehend angegebenen erfindungsgemäßen Sequenz, worin das Nucleotid Teil eines Primer-Nucleotid-Paars ist, ausgewählt aus der Gruppe von Nucleotid-Paaren bestehen aus:
    • a) einer Nucleotid-Sequenz mit einer Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, und einer Nucleotid-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt,
    • b) einer Nucleotid-Sequenz mit einer Sequenz, wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt, und einer Nucleotid-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 4 gezeigt,
    • c) einer Nucleotid-Sequenz mit einer Sequenz, wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt, und einer Nucleotid-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, wobei das Nucleotid in Kombination mit einer wirksamen Menge von PCR-Hilfsreagentien vorliegt.
  • Die vorstehend beschriebenen Polymorphismen sind deshalb aufgrund ihrer hohen PIC-Werte für eine menschliche Proben-Individualisierung brauchbar. Da die beschriebenen polymorphen Systeme auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basieren, sind nur geringe (40 Nanogramm) Mengen an genomischer DNA für jeden Test erforderlich. Die Ziel-Sequenzen reichen von 92 bis 310 Basenpaaren, wodurch eine DNA mit hohem Molekulargewicht nicht erforderlich ist, und übliche Probleme, wie z.B. ein Scheren von DNA, nur einen minimalen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit des Assays aufweist. Der Assay ist leicht durchzuführen, und die Ergebnisse können innerhalb von 24 Stunden erhalten werden. Es ist nicht unüblich, dass die Ergebnisse innerhalb von 3 bis 4 Stunden erhältlich sind. Zum Vergleich erfordern die Methoden des Standes der Technik eine Anzahl von Tagen, bevor Ergebnisse erhältlich sind, und üblicherweise sind 3 bis 4 Tage erforderlich.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Assay ist es ferner möglich, sehr kleine Unterschiede in Nucleotid-Sequenzen zu bestimmen. Eine einzige Auslassung oder Addition der Repeat-Sequenz wird die Mobilität aufgrund der elektrischen Natur und des Molekulargewichts der Repeat-Nucleotid-Sequenz ändern. Diese Differenzen sind auf den Autoradiogrammen nach Elektrophorese klar sichtbar.
  • Mikrosatelliten-Repeat-Polymorphismen erwiesen sich als brauchbare Werkzeuge in der DNA-Analyse. Die drei hier beschriebenen Polymorphismen sind original und basieren auf vorher sequenzierten Genen. Die zwei beschriebenen Tetranucleotid-Repeat-Marker können leicht bestimmt werden, da sich Allelgrößen durch vier Basenpaare unterscheiden. Die beim forensischen Screening am meisten verwendete Technik basiert auf Minisatelliten-Markern, zum Unterschied zu den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen PCR-fähigen Mikrosatelliten.
  • Die allgemeine PCR-Technik-Stufe wird im allgemeinen durchgeführt wie beschrieben im US-Patent Nr. 4 683 195 (Mullis et al.) und US-Patent Nr. 4 683 202 (Mullis et al.). Ferner können die elektrische Mobilität erhöhende DNA-Analoga gegebenenfalls während des Replikations- und Amplifikations-PCR-Verfahrens verwendet werden.
  • Der Polymorphismus-Grad in den erfindungsgemäßen genetischen Segmenten, deren Polymorphismen Identifikations-Testergebnisse mit hohem Informationsgehalt ergeben, ist überraschend und unerwartet. Der hohe PIC-Wert (ca. 0,9) ist vollkommen unerwartet.
  • Die Verwendung eines PCR-Verfahrens und von PCR-Primer-Paaren, wie den Primer-Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6, zur Bestimmung des erfindungsgemäßen Polymorphismus-DNA-Segments ergeben deshalb hervorragende Ergebnisse. Solche Ergebnisse sind ausreichend genau und informativ, um DNA-Segmente genau zu identifizieren, und um Verwandtschaftsgrade zwischen DNA-Segmenten von Individuen zu bestimmen. Darüber hinaus ergibt die Durchführung von drei Sätzen von PCR-Verfahren an den gleichen DNA-Segment-Proben unter Verwendung eines verschiedenen erfindungsgemäßen PCR-Primer-Paars für jedes der drei Verfahren außergewöhnlich genaue und informative Testergebnisse. Ein Vergleich der drei Sätze der Testergebnisdaten ergibt eine extrem genaue DNA-Segment-Identifizierung.
  • Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die Erfindung näher zu beschreiben, die aber keinesfalls auf die folgenden Beispiele beschränkt ist.
  • Die beschriebenen Oligonucleotid-Primer werden verwendet, um die Ziel-Sequenzen unter Verwendung von PCR unter den folgenden Bedingungen zu amplifizieren:
  • Beispiel 1
  • Die DNA-Proben werden wie folgt hergestellt.
  • 60 ng genomische DNA werden als Templat für PCR mit 80 ng jedes Oligonucleotid-Primers, 0,6 Einheiten Taq-Polymerase 50 mM KCl, 10 mM Tris (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, 200 μM von je dGTP, dATP, dTTP, 2,5 μM dCTP und 10 Mikrocurie α P32 dCTP in einem Endreaktionsvolumen von 15 μl verwendet. Die Proben werden mit 15 μl Mineralöl überschichtet, um eine Verdampfung zu verhindern.
  • Beispiel 2
  • PCR wird für jede der Proben und im obigen Beispiel 1 beschriebenen Primer durchgeführt.
  • PCR wird in einem Techne MW-1 Microplate-Thermocycler unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung bei 94°C während 1,4 Minuten, Annelieren bei 55°C während 2 Minuten und Extension bei 72°C während 2 Minuten. Der Zyklus wird 30 Mal mit einer Endextension bei 72°C während 10 Minuten wiederholt.
  • Beispiel 3
  • Die im vorstehenden Beispiel 2 beschriebenen amplifizierten DNA-Segmente für jede der Proben werden mittels Elektrophorese wie folgt aufgetrennt.
  • Zwei Mikroliter jeder PCR-Reaktionsmischungsprobe werden an 6% PAGE-Sequenziergel einer Elektrophorese unterworfen und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Belichtungszeiten für die Autoradiographie liegen im Bereich von 3 bis 16 Stunden.
  • Die vorstehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen beschreibt somit vollständig die allgemeine Natur der Erfindung, wodurch andere durch Anwenden der aktuellen Kenntnisse leicht solche spezifische Ausführungsformen modifizieren und/oder verschiedenen Anwendungen anpassen können, ohne das allgemeine Konzept zu verlassen, und deshalb sind solche Anpassungen als innerhalb der Bedeutung und des Bereiches von Äquivalenten einer beschriebenen Ausführungsform zu betrachten. Es ist deshalb verständlich, dass die hier verwendete Phraseologie oder Terminologie nur dem Zweck der Beschreibung dient und keine Beschränkung darstellt.

Claims (11)

  1. Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr.1, einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr.2, einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3, einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 4, einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 oder einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 6.
  2. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 ist.
  3. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 ist.
  4. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 ist.
  5. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 ist.
  6. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 ist.
  7. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz eine Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 ist.
  8. Verfahren zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion zum Ermitteln eines zusätzlichen oder fehlenden Satzes von Dinukleotid-oder Tetranukleotid-Repeat-Polymorphismen, wobei das Verfahren zu einem Polymorphismus- Informationsgehalt von etwa 0,9 führt, umfassend eine Verwendung einer wirksamen Menge eines Paars von Oligonukleotid-Primern, umfassend mindestens ein DNA-Fragment gemäß Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid-Primerpaar ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus a) einer Sequenz, wie in SEQ ID Nr.1 gezeigt und einer Sequenz, wie in SEQ ID Nr.2 gezeigt; b) einer Sequenz, wie in SEQ ID Nr.3 gezeigt und einer Sequenz, wie in SEQ ID Nr.4 gezeigt; und c) eine Sequenz, wie in SEQ ID Nr.5 gezeigt und einer Sequenz, wie in SEQ ID Nr.6 gezeigt.
  9. In vitro-Assay zur Messung von Unterschieden bei genetischem Material, um bei einem forensischen Screening, einem Vaterschaftstest, einem Prenatalscreening oder einem genetischen Mapping einen zusätzlichen oder fehlenden Satz von Dinukleotid- oder Tetranukleotid-Repeat-Polymorphismen zu ermitteln, wobei der Assay zu einem Polymorphimus-Informationsgehalt von etwa 0,9 führt und wobei das genetische Material ein DNA-Fragment umfaßt, das eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 7, einer Sequenz gemäß SEQ Nr. 8 und einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr.9, umfaßt, wobei der Assay umfaßt a. Bereitstellen eines DNA-Fragments, umfassend die Repeat-Polymorphismen in ausreichender Menge zum Testen, b. Amplifikation des DNA-Fragments durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primerpaars, die das DNA-Fragment amplifizieren, c. Auftrennen des amplifizierten DNA-Fragments durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese, und d. Vergleich des aufgetrennten DNA-Fragments mit Autoradiographie zur Beobachtung der Unterschiede in den Migrationsmustern aufgrund einer Längenvariation.
  10. Assay gemäß Anspruch 9, wobei das Oligonukleotid-Primerpaar ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einer Sequenz gemäß SEQ Nr. 1, einer Sequenz gemäß SEQ Nr. 2, einer Sequenz gemäß SEQ Nr. 3, einer Sequenz gemäß SEQ Nr. 4, einer Sequenz gemäß SEQ Nr. 5 oder einer Sequenz gemäß SEQ Nr. 6.
  11. Assay-Kit zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion zum Ermitteln eines zusätzlichen oder fehlenden Satzes von Dinukleotid-oder Tetranukleotid-Repeat-Polymorphismen, wobei der Assay zu einem Polymorphismus-Informationsgehalt von etwa 0,9 führt, der eine wirksame Menge eines Oligonukleotid-Primerpaars umfaßt, das mindestens ein DNA-Fragment mit einer Sequenz gemäß Anspruch 1 umfasst, wobei das Oligonukleotid-Primerpaar ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus a) einer Sequenz, wie in SEQ Nr. 1 gezeigt und einer Sequenz, wie in SEQ Nr. 2 gezeigt; b) einer Sequenz, wie in SEQ Nr. 3 gezeigt und einer Sequenz, wie in SEQ Nr. 4 gezeigt; c) einer Sequenz, wie in SEQ Nr. 5 gezeigt und einer Sequenz, wie in SEQ Nr. 6 gezeigt, in Kombination mit einer wirksamen Menge Polymerase-Kettenreaktionshilfsreagenzien.
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