DE69530148T2

DE69530148T2 - Analytisches Element, Zusammensetzung und Verfahren unter Verwendung von modifizierter Apo-Meerrettich-Peroxidase

Info

Publication number: DE69530148T2
Application number: DE69530148T
Authority: DE
Inventors: Roy Eugene Snoke
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1994-07-19
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2015-07-19
Also published as: AU697785B2; ATE236246T1; EP0693552A3; JPH08170961A; JP3715348B2; CA2154013C; CA2154013A1; AU2492695A; EP0693552A2; EP0693552B1; DE69530148D1; US5776714A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft analytische Elemente, Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Verwendung, um einen Analyten nachzuweisen, unter Verwendung von Peroxidase oder einem Peroxidase-markierten spezifischen Bindungsreagenz. Insbesondere betrifft sie die Verringerung einer Beeinflussung durch Hämoglobin beim Nachweis von solchen Analyten sowie die Verringerung der Beeinflussung durch andere bekannte störende Protein-Agentien.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt einen kontinuierlichen Bedarf in der medizinischen Praxis und Forschung und bei Analyse- und Diagnose-Prozeduren für rasche und genaue Bestimmungen chemischer und biologischer Substanzen, die in verschiedenen Flüssigkeiten, wie biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind. Zum Beispiel muß die Anwesenheit von Proteinen, Hormonen, Arzneien, Viren, Mikroorganismen, Narkotika und Steroiden für eine wirksame Forschung, Diagnose und Behandlung genau und rasch bestimmt werden.
Eine große Vielzahl von analytischen Verfahren ist in den jüngsten Jahrzehnten entwickelt worden, um die genannten Substanzen nachzuweisen. Die Verfahren sind sehr zuverlässig geworden und in einigen Fällen zur Automatisierung geeignet ebenso wie zur Verwendung in Kit-Form geeignet geworden. Die meisten solcher Verfahren gründen darauf, was auf dem Gebiet als "spezifische Bindungsreaktionen" zwischen einer nachzuweisenden Substanz (hierin als ein "spezifischer Bindungsligand" oder "Ligand" identifiziert) und einem entsprechenden "Rezeptor" bekannt ist, der spezifisch den Liganden erkennt und damit reagiert. Die meisten wohlbekannten spezifischen Bindungsreaktionen finden zwischen immunreaktiven Mitteln (in "Immunoassays"), wie etwa Antikörpern mit Haptenen oder Antigenen statt, aber andere sind ebenso bekannt (wie etwa Avidin mit Biotin und ein Zucker mit einem Lectin).
Im allgemeinen können spezifische Bindungsassays für eine qualitative oder quantitative Bestimmung (oder beides) der Anwesenheit oder Abwesenheit (oder Menge) eines interessie renden Analyten sorgen. In einer Form von Assay, die als "kompetitiver Bindungs-Immunoassay" bekannt ist, wird ein markiertes Analog des zu bestimmenden Liganden in Wettbewerb mit einer festen Menge eines geeigneten Antikörpers gebracht, der mit sowohl dem Liganden als auch dem Liganden-Analogen reagieren kann. Die Markierung auf dem Analog kann in seiner "freien" oder komplexierten (das heißt umgesetzten) Form in angemessener Weise nachgewiesen werden. Die Höhe des Signals wird dann dem Benutzer Auskunft darüber geben, wie viel Ligand in der zu testenden Probe ist.
In einem alternativen Immunassay-Format, bekannt als ein "Sandwich"-Immunassay oder immunometrischen Assay, wird der Ligand mit zwei oder mehreren Rezeptormolekülen in Kontakt gebracht, die an den Liganden an unterschiedlichen Epitopstellen binden. Ein Rezeptor ist normalerweise in geeigneter Form markiert, und der andere ist entweder auf einem festen Substrat immobilisiert oder in der Lage, darauf immobilisiert zu werden. Die Menge an Ligand ist direkt proportional zur Menge von zwischen dem Ligand und den beiden Rezeptoren gebundenen Komplex.
Immunoassays sind traditionellerweise in Lösung oder in Testvorrichtungen ausgeführt worden, bei denen Flüssigkeiten von den an dem Assay teilnehmenden Reagenzien in irgendeiner Weise entfernt wurden. Trockenanalyseelemente und ihre Verwendung für Immunoassays werden in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich US-A-4,258,001 (Pierce et al), US-A-4,670,381 (Frickey et al), WO 82/2601 (veröffentlicht am 5. August 1992), EP-A-0 051 183 (veröffentlicht am 12. Mai 1982) und EP-A-0 066 648 (veröffentlicht am 15. Dezember 1982).
Verbesserte Trockenanalyseelemente und ihre Verwendung in Immunoassays werden beschrieben in EP-A-0 587 222 , bei dem Enzymmarkierungen zum Nachweis verwendet werden. Peroxidase ist die bevorzugte Enzymmarkierung. Solche Elemente ermöglichen den Nachweis von in sehr geringen Konzentrationen vorhandenen Analyten.
Bei den Immunoassays, die in den Trockenanalyse-Elementen unter Verwendung von Peroxidase als Markierung durchgeführt werden, können die Ergebnisse durch das Vorhandensein von Materialien in Testproben verändert werden, die die Aktivität des Enzyms beeinflussen. Diese störenden Effekte können durch Einschluß von Materialien in dem Assay-System überwunden werden, die den Effekt der störenden Agentien blockieren.
WO 86/07462 (veröffentlicht am 18. Dezember 1986) beschreibt die Verwendung von bestimmten modifizierten Formen von Peroxidase, um den Effekt von störenden Agentien in Lösungsassays zu verringern. Diese Formen schließen Apo-Peroxidase aus Meerrettich, carboxymethylierte Meerrettich-Peroxidase und saure Formen von Meerrettich-Peroxidase ein.
Wenn jedoch Apo-Peroxidase aus Meerrettich in einem Überschuß (100-facher Überschuß der Meerrettich-Peroxidase-Markierung) zu beschichteten Elementen für Immunoassays zugegeben wurde, um den Effekt von störenden Agentien zu verringern, wurde eine signifikante Zunahme der Beeinflussung durch Hämoglobin beobachtet. Es wird geglaubt, daß dieser Effekt auf der Reaktivierung der Apo-Peroxidase aus Meerrettich durch Hämoglobin beruhte. Da die Apo-Peroxidase aus Meerrettich notwendigerweise in hohen Konzentrationen vorhanden ist, erzeugt die Aktivierung dieses Materials ein beträchtliches Signal und führt zu großen Fehlern in den Assays.
Daher existiert ein Bedarf für ein Mittel, um die Störung bei beschichteten Immunoassays bei Verwendung einer Peroxidase als Markierung zu reduzieren, ohne eine Beeinflussung der Resultate durch Hämoglobin in der Testprobe zu verursachen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die genannten Probleme sind durch ein analytisches Element zur Bestimmung eines Analyten in einer Hämoglobin-umfassenden Probe gelöst worden, umfassend eine poröse Verteilungsschicht und enthaltend, unabhängig davon, in derselben oder unterschiedlichen Schicht wie die poröse Verteilungsschicht,

a) eine Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindungsreagenz, und
b) eine modifizierte Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase, so daß die Apo-Peroxidase durch Hämoglobin nicht reaktiviert werden kann.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Hämoglobin-umfassenden Probe bereit, umfassend:
A) In-Kontakt-Bringen einer flüssigen Probe, von der angenommen wird, daß sie einen spezifischen Bindungsliganden und Hämoglobin enthält, mit einem analytischen Element, umfassend:
Eine poröse Verteilungsschicht, und
eine oder mehrere zusätzliche Schichten, die in flüssigem Kontakt mit der porösen Verteilungsschicht sind,
wobei das Element in wenigstens einer der Schichten enthält:
ein Peroxidase-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, oder
ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, und
wobei das Element weiterhin enthält, unabhängig, in wenigstens einer der Schichten,
eine modifizierte Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase, so daß die Apo-Peroxidase durch Hämoglobin nicht reaktiviert werden kann,
um eine Trennung der nicht-umgesetzten Form des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels von der umgesetzten Form des Peroxidase-markierten immunrekativen Mittels zu erreichen, und
B) Nachweisen von entweder der nicht-umgesetzten oder der umgesetzten Form des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels als ein Maß für den interessierenden spezifischen Bindungsliganden.
Weiterhin umfaßt eine analytische Zusammensetzung dieser Erfindung:

a) eine Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindungsreagenz,
b) eine modifizierte Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase, so daß die Apo-Peroxidase nicht durch Hämoglobin reaktiviert werden kann,
c) ein oder mehrere Reagenzien, die dahingehend reagieren, ein kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal in der Anwesenheit einer Peroxidase bereitzustellen, und
d) ein Phenol- oder Anilin-Coreagenz für c).

Die vorliegende Erfindung stellt ein genaues Verfahren zum Nachweis eines Analyten unter Verwendung einer Peroxidase oder eines Peroxidase-markierten spezifischen Bindungsreagenz bereit. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft, wenn ein trockenanalytisches Element bei dem Assay verwendet wird. Die Wirkungen von bekannten störenden Agentien auf Peroxidase-Markierungen werden, wie erwartet, minimiert und eine Beeinflussung aufgrund der Anwesenheit von Hämoglobin wird in unerwarteter Weise vermieden.
Diese Vorteile werden erzielt durch Verwendung einer Form von Apo-Peroxidase in dem Assay, die modifiziert worden ist, um die Histidin-Aminosäuren des Proteins zu blockieren, so daß das Enzym nicht durch Hämoglobin reaktiviert werden kann. Die Blockierung kann durch Substitution an wenigstens einem der Stickstoffatome der Histidin-Imidazolyl-Gruppen erreicht werden, wie in größeren Einzelheiten unten beschrieben.
Die modifizierte Apo-Peroxidase bleibt wirksam, um die störenden Effekte durch andere häufige störende Protein-Agentien im Serum zu verringern. Der Stand der Technik lehrt, daß nicht-modifizierte Apo-Peroxidase in gleicher Weise nützlich sein sollte, wie modifizierte Formen des Enzyms, wie etwa carboxymethylierte Peroxidase, um die störenden Agentien in Lösungsassays zu entfernen. Jedoch verursacht die nicht-modifizierte Apo-Peroxidase in dem Trockenassay-Format eine zusätzliche Beeinflussung in dem Assay, die aus der Anwesenheit von Hämoglobin resultiert. Die vorliegende Erfindung behandelt dieses Problem und stellt eine weitere Verbesserung bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist eine graphische Darstellung von Assay-Daten (Beeinflussung gegen Beschichtungskonzentrationen), die unter Verwendung von verschiedenen analytischen Elementen aus drei Patientenproben erhalten wurden, wie im Detail in Beispiel 3 unten beschrieben ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung kann vorteilhaft in jedem analytischen Verfahren ausgeübt werden, das darauf angelegt ist, ein kolorimetrisches, fluorometrisches oder chemilumineszierendes Signal in Antwort auf die Anwesenheit von Peroxidase zu erzeugen. Solche Assays können den Nachweis eines organischen oder anorganischen Peroxids (wie etwa Wasserstoffper oxid) oder Peroxidase (in ihrer freien Form) oder den Nachweis eines nicht-immunologischen Analyten, der nicht Peroxidase ist, unter Verwendung von Reaktions-Schemata beinhalten, die die Reaktion von Peroxidase einbeziehen. In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung die Ausübung spezifischer Bindungsassays.
Der Assay kann qualitativ, quantitativ oder semi-quantitativ sein, um einen oder mehrere Analyten aus einer großen Vielzahl von Analyten in wäßrigen Flüssigkeiten, wie etwa menschlichen und tierischen biologischen Flüssigkeiten, Abwasserflüssigkeiten, Nahrungsmitteln, Abwasser, chemischen Verarbeitungsflüssigkeiten und anderen Proben nachzuweisen, die für einen Fachmann offensichtlich sind. Biologische Flüssigkeiten, wie etwa menschliches oder tierisches Serum, Plasma oder Urin, werden bevorzugt mit dieser Erfindung getestet.
Wasserstoffperoxid (oder ein anderes Peroxid) kann mit dieser Erfindung ebenso bestimmt werden, wie Analyten, die in der Lage sind, Peroxid zu erzeugen. Das heißt, der Analyt kann in der Lage sein, an einer oder mehreren Reaktionen teilzunehmen, die Wasserstoffperoxid erzeugen, das dann nachgewiesen wird unter Verwendung von geeigneten Signalerzeugenden Reagenzien und einer Peroxidase.
Die vorliegende Erfindung ist besonders vorteilhaft bei Assays, bei denen die Peroxidase in einer geschwindigkeitsbestimmenden Weise verwendet wird. In den meisten Fällen sind solche Assays spezifische Bindungsassays, bei denen die Peroxidase als eine Markierung von einem der immunreaktiven Mittel verwendet wird, die benötigt werden, um einen spezifischen Bindungsliganden nachzuweisen. Jedoch würde ein geschickter klinischer Chemiker in leichter Weise verstehen, daß es ebenso Assays für Metaboliten, Enzyme oder andere nichtimmunreaktive Analyten gibt, bei denen Peroxidase ebenso in einer geschwindigkeitsbestimmenden Weise verwendet wird. Deshalb soll die vorliegende Erfindung nicht auf spezifische Bindungsassays beschränkt sein.
Analytische Zusammensetzungen dieser Erfindung, die bei Lösungsassays nützlich sind, können eine Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindungsreagenz, eine modifizierte Apo-Peroxidase (unten definiert), ein oder mehrere Reagenzien zum Erzeugen eines Signals (unten definiert), und fakultativ ein Phenol- oder Anilin-"Coreagenz" für diese Signalerzeugenden Reagenzien enthalten.
Coreagenzien, die auf diese Weise verwendet werden können, schließen Verbindungen ein, die in verschiedener Weise als "Elektronentransfermittel" zum Erzeugen von Farbsignalen, wie etwa die Phenole und Aniline, die zum Beispiel in US-A-4,828,983 (McClune) beschrieben sind, und als "Verstärker" zum Erzeugen von chemilumineszierenden Signalen bekannt sind, wie beschrieben zum Beispiel in US-A-4,729,950 (Kricka et al) und US-A-4,598,044 (Kricka et al). Andere nützliche Coreagenzien werden in EP-A-0 603 954 beschrieben.
Drei bevorzugte Coreagenzien sind 4'-Hydroxyacetanilid, 3'-Chlor-4-hydroxyacetanilid und 3',5'-Dichlor-4'-hydroxyacetanilid.
In den beschriebenen analytischen Zusammensetzungen können die Peroxidase oder das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz und Signal-erzeugende Reagenzien in jeder geeigneten Konzentration vorhanden sein, die für den Fachmann offensichtlich sein würde. Die modifizierte Apo-Peroxidase ist im allgemeinen in einer Menge von ungefähr 10^-9 bis ungefähr 10^-3 vorhanden, wobei 10^-7 bis ungefähr 10^-5 bevorzugt wird. Das Phenol- oder Anilin-Coreagenz kann in einer Menge von ungefähr 0,001 bis ungefähr 150 mmolar vorhanden sein, wobei ungefähr 0,01 bis ungefähr 50 mmolar bevorzugt ist. Es wäre einem Fachmann in leichter Weise offensichtlich, wie in einer gegebenen Zusammensetzung für einen gegebenen Analyten die verschiedenen Mengen eingestellt werden müßten.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Element und ein Verfahren zum Nachweisen von spezifischen Ziel-Bindungsliganden (hiernach als Liganden identifiziert), für die Rezeptormoleküle erhältlich oder herstellbar sind. Beispiele für Ligand-Rezeptor-Komplexe (d. h. ein Reaktionsprodukt von Ligand und dem entsprechenden Rezeptor) schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Antikörper-Antigen, Antikörper-Hapten, Avidin-Biotin, Zucker-Lectin, Gelatine-Fibronectin und Protein-A-IgG-Komplexe. Für die Zwecke dieser Erfindung werden komplementäre Nukleinsäuren (d. h. hybridisierte Produkte von komplementären Strängen) ebenso als Ligand-Rezeptor-Komplexe angesehen.
Liganden schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Peptide, Polypeptide, Proteine (einschließlich Enzymen, Antikörpern, immunogenen Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen und Avidin), Hormone (wie etwa Thyroxin, Triiodthyronin, menschliches Choriongonadotropin, Östrogen, ACTH und Substanz P), Vitamine, menschliche Immunsystem-Modulatoren (wie etwa Interleukin-6), Steroide, Kohlenhydrate (wie etwa Polysaccharide), Glycolipide, Arzneien (wie etwa Digoxin, Phenytoin, Phenobarbital, Morphin, Carbamazepin und Theophyllin), Antibiotika (wie etwa Gentamicin), Bestandteile von Zellen und Viren (wie etwa Streptococcus-Spezies, Herpes-Viren, Gonococcus-Spezies, Chlamydien-Spezies, Retroviren, Influenza-Viren, Prevotella-Spezies, Porphyromonas-Spezies, Actinobacillus-Spezies und Mycobacterium-Spezies), Nukleinsäuren (einschließlich einzel- und doppelsträngiger Oligonukleotide), Pharmazeutika, Haptene, Lectine, Biotin und andere Materialien, die Fachleuten in leichter Weise offensichtlich sind.
Jedoch ist diese Erfindung besonders vorteilhaft für die Verwendung von Trockenanalyse-Elementen, um Analyte nachzuweisen, bei denen das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz in dem Element in geschwindigkeitsbestimmenden Mengen vorliegt.
In den bevorzugten spezifischen Bindungsassays schließen Analyten, die so in Lösung oder Trocken-Formaten unter Verwendung von Peroxidase als einem geschwindigkeitsbestimmenden Reaktionsteilnehmer bestimmt werden können ein, sind aber nicht beschränkt auf Diphenylhydantoin (oder Phenytoin), Carbamazepin, Phenobarbital, C-reaktives Protein, Digoxin, ein Thyroninderivat (wie etwa Thyroxin und Triiodothrtonin), Morphin, Theophyllin, Gentamicin, Vancomycin, Tobramycin, TSH, hCG, verschiedene Proteine (wie etwa IgM-, IgG-, IgE- und IgA-Proteine), Creatinkinase-MB, Troponine T und I und Apoproteine A, A1 und B. Die verschiedenen anderen Reagenzien, die zum Nachweis des Analyten in solchen Assays benötigt würden, liegen innerhalb des Geschicksk d es normalen klinischen Chemikers. Daher würden zum Beispiel ein oder mehrere herkömmliche Reagenzien zusammen mit Peroxidase verwendet werden, um ein kolorimetrisches, fluoreszierendes oder chemilumineszierendes Signal nach einer oder mehreren Reaktionen zu erzeugen.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Antikörper" ganze Immunglobulin-Moleküle mit einer einzelnen Spezifität ein, wie es auf dem Gebiet herkömmlich ist. Zusätzlich soll der Begriff chemisch erzeugte Fragmente (wie etwa Fab, F(ab)', F(ab)₂-Fragmente) von solchen Molekülen und genetisch erzeugte Äquivalente davon (wie etwa "Einzelketten-Antikörper-Fragmente" oder ScFv-Fragmente) einschließen. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein.
Die vorliegende Erfindung wird bevorzugt durchgeführt unter Verwendung eines analytischen Elements, umfassend eine poröse Verteilungsschicht (gewöhnlich eine aufgetragene Schicht), die eine geeignete Porösität zum Unterbringen einer Testprobe, verdünnt oder unverdünnt, hat. Bevorzugt ist die poröse Verteilungsschicht isotropisch porös, was bedeutet, daß sie in jeder Dimension in gleicher Weise porös ist, so daß sich Flüssigkeiten in jeder Dimension einförmig verteilen, wie es durch miteinander verbundene Fasern, Partikeln und anderen Bestandteilen der Schicht ermöglicht wird. Materialien, die zum Herstellen von solchen Elementen nützlich sind, sind wohl bekannt. Die porösen Schichten können aus Cellulose-, Glas- oder polymeren Fasern, polymeren oder anorganischen partikulären Materialien oder einer Kombination von solchen Materialien zusammengesetzt sein. Details über herkömmliche Verteilungsschichten werden zum Beispiel in US-A-3,992,158 (Przybylowicz et al), US-A- 4,258,001 (Pierce et al), US-A-4,292,272 (Kitajima et al) und US-A-4,430,436 (Koyama et al) bereitgestellt. Die bevorzugten porösen Verteilungsschichten sind Verteilungsschichten mit Kügelchen ("beaded spreading layers"), wobei die Verteilungsschichten aus polymeren Partikeln und einem polymeren Klebstoff hergestellt sind, wie in dem Patent von Pierce et al beschrieben.
Das Element kann zusätzliche Schichten neben den porösen Verteilungsschichten enthalten, solange wie alle Schichten in flüssigem Kontakt stehen, was bedeutet, daß sich Flüssigkeiten in leichter Weise von einer Schicht zu einer anderen Schicht bewegen können, sogar wenn solche Reagenzien sich nicht in leichter Weise von einer Schicht zu einer anderen bewegen. Solche zusätzliche Schichten sind gewöhnlich aufgetragene Schichten von verschiedenen Bindematerialien und einem oder mehreren Reagenzien, die in dem Assay nützlich sind, und schließen ein, was in dem Gebiet als Unterschicht ("subbing layer"), Reagenzschicht, Aufzeichnungsschicht und Strahlungsblockierschicht ("radiation blocking layer") bekannt ist. Materialien, die als Bindemittel in solchen Schichten nützlich sind, sind wohlbekannt, wie in den in dem vorhergehenden Absatz aufgeführten Patenten beschrieben, und schließen bevorzugt Gelatine (gehärtet oder ungehärtet), hydrophile Acrylamid- und Vinylpyrrolidon-Polymere ein. Einige Schichte können wasserunlöslich sein, während andere wasserlöslich oder wasser-quellbar sind, so daß sie sich während eines Assays auflösen oder aufquellen. Es ist ebenso wahrscheinlich, daß sich einige Schichten während des Auftragens miteinander vermischen, so daß horizontale Zonen in einer einzelnen getrockneten Schicht aus unterschiedlichen Auftragungsformulierungen gebildet werden.
Die Schichten des Elements können selbsttragend sein, bevorzugt sind sie aber auf einem geeigneten dimensionsstabilen, nicht-porösen, chemisch-inerten Träger angeordnet. Nützliche Trägermaterialien schließen polymere Filme, Metallfolien, Papier und andere auf dem Gebiet wohlbekannte Materialien ein. Ein transparenter Polyesterträger wird bevorzugt.
Die Peroxidase oder das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz, das bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in einer oder mehreren Schichten des Elements eingeschlossen. Dieses Reagenz ist in der Lage, an entweder den spezifischen interessierenden Bindungsliganden oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden. Bei kompetitiven Bindungsimmunoassays ist das markierte Regenz gewöhnlich ein markiertes Analog des spezifischen Bindungsliganden (wie etwa markierte Haptenderivate des Liganden). In Sandwich-Assays kann das markierte immunreaktive Mittel ein markierter Rezeptor für den Liganden sein, oder es kann ein markiertes Molekül (wie etwa ein markierter Anti-Antikörper) sein, das an den Rezeptor (wie etwa einen Antikörper) bindet.
Markierte spezifische BindungsReagenzien können unter Verwendung von einer Anzahl von bekannten Prozeduren hergestellt werden, und viele solcher Reagenzien sind kommerziell erhältlich von einer Anzahl von Quellen. Herstellungsprozeduren schließen diejenigen ein, die von Yoshitake et al Eur.J.Biochem. 101, 395, 1979 und in US-A-5,106,732 (Kondo et al) beschrieben sind.
Mit "Peroxidase" wird in dieser Anmeldung jede peroxidierende Substanz (enzymatisch oder andersartig) gemeint, die die Oxidation eines Substrats, wie etwa eines Leukofarbstoffs, in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid oder einem anderen Oxidationsmittel katalysiert, um ein geeignetes Signal zu erzeugen. Mikrobielle, Pilz- oder Pflanzen-Peroxidasen werden bevorzugt, wobei Meerrettich-Peroxidase am bevorzugtesten ist.
Die Menge an Peroxidase-markiertem spezifischen Bindungsreagenz in einem Element dieser Erfindung kann in breiter Weise variieren aufgrund der Menge der in der Reaktion verwendeten anderen Bestandteile und der vermuteten Menge an Analyt in der Testprobe. Im allgemeinen beträgt die in dem Element vorhandene Menge wenigstens ungefähr 2 μg/m², wobei ungefähr 4 bis ungefähr 25 μg/m² bevorzugt wird.
Das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz, das bei dieser Erfindung nützlich ist, ist bevorzugt ein Peroxidase-markiertes Haptenderivat des Liganden oder ein Peroxidasemarkierter Antikörper. Jedoch kann ein Konjugat von Avidin oder einer anderen spezifischen Bindungsverbindung mit Peroxidase ebenso bei der Ausübung dieser Erfindung verwendet werden. Wenn die Markierung beispielsweise an einem Hapten erfolgt, kann sie eine Peroxidase-markierte Arznei, Hormon, Protein, Metabolit, Chelat oder Haptenderivat derselben sein. Beispiele für solche Materialien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Peroxidasemarkierte Haptenderivate von Digoxin, Diphenylhydantoin, Phenobarbital, C-reaktivem Protein, einem Thyroninderivat, wie etwa Thyroxin, Carbamazepin oder einem anderen Analyten der oben beschrieben ist.
Ein wesentliches Reagenz, das bei der Ausübung dieser Erfindung verwendet wird, ist eine modifizierte Apo-Peroxidase. Diese Proteine sind modifiziert worden, indem die Imidazolylgruppen in den Histidin-Aminosäuremolekülen in der Protein-Aminosäurenkette blockiert worden sind, so daß die Apo-Peroxidase durch Hämoglobin nicht reaktiviert werden kann. Die Imidazolylgruppen werden an wenigstens einem der Stickstoffatome des Rings durch Substitution mit einem alkylierenden Reagenz, Kondensationsreagenz oder Additionsreagenz blockiert, das in ausreichender Weise die Stereokonfiguration der Histidin-Aminosäuren zerstört, um eine Wiederherstellung der Peroxidaseaktivität in dem Apo-Peroxidasemolekül zu verhindern, aber die spezifische Immunizität des Proteins nicht verändert. Die Stickstoffatome werden durch das kovalente Anhängen einer Alkyl-, Aryl-, Alkanoyl-, Aroyl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Alkylaminocarbonyl- oder Arylaminocarbonyl-Gruppe daran durch ein geeignetes modifizierendes Additions-, Kondensations- oder Alkylierungsreagenz blockiert.
Beispiele für derlei nützliche modifizierenden Additionsreagenzien schließen aktive Halogenalkylierende Agenzien jeden Typs ein, wie etwa:

(1) Halogenmethylcarbonyl-Gruppen-enthaltende Verbindungen, wie etwa Chloressigsäure und ihre Amide und Ester, Iodessigsäure und ihre Amide und Ester, und Bromessigsäure und ihre Amide und Ester,
(2) Halogenethylcarbonyl- und Halogenethylsulfonyl-Gruppen-enthaltende Verbindungen, wie etwa 3-Chlorpropionsäure und ihre Ester, 3-Chlorpropiophenon und 3-Chlorpropionamid,
(3) Arylmethylhalogenide, wie etwa Benzylchlorid, 1-Chlormethyl-2-methylnaphthalen, 1-Chlormethylnaphthalen, 4-Chlormethylbiphenyl und 4-Chlormethylbenzoesäure, und
(4) Säurehalogenide, wie etwa Acetylchlorid, Propionylchlorid, Benzoylchlorid und Naphthoylchlorid.

Andere nützliche modifizierende Reagenzien schließen Anhydride (wie etwa Essigsäureanhydrid, Phthalsäureanhydrid, Diethylpyrocarbonat und Bernsteinsäureanhydrid), aktive Ester (wie etwa N-Acetoxysuccinimid, N-Proprionyloxysuccinimid und andere, wie beschrieben in GB 2,064,800A ), Vinylsulfonyl- und Vinylcarbonyl-Gruppen-enthaltende Verbindungen (wie etwa Vinylsulfonamid, Natriumvinylsulfonat, Natriumacrylat, Natriummethacrylat, Ethylacrylat und andere, die einem Fachmann in leichter Weise offensichtlich sind), Isocyanate (wie etwa Butylisocyanat, p-Bromphenylisocyanat und Phenylisocyanat), Aldehyde (wie etwa Benzaldehyd, Acetaldehyd und Propionaldehyd) und Epoxide (wie etwa Glycidol) ein.
Eine Technik zum Durchführen dieser Modifizierung ist es, die Apo-Peroxidase mit Diethylpyrocarbonat unter Verwendung einer im wesentlichen von Miles in Methods in Enzymology 47, Seiten 431-442 (1977) beschriebenen Prozedur umzusetzen. Spezifische Details für diese Prozedur werden in der Herstellung 1 unten bereitgestellt. Das Resultat ist eine modifizierte Apo-Peroxidase, die die Histidin-Aminosäuren mit Ethoxycarbonylgruppen substituiert hat.
Eine alternative und bevorzugte Technik umfaßt das Carboxyalkylieren der Apo-Peroxidase unter Verwendung eines geeigneten Reagenz, wie etwa Iodessigsäure, Chloressigsäure oder Bromessigsäure. Einzelheiten bezüglich einer solchen Technik werden von Gurd in Methods in Enzymology, 11, Seiten 532-541 (1967) bereitgestellt. Zum Beispiel kann die Apo-Peroxidase ein carboxyalkyliertes Derivat sein (das heißt mit carboxyalkylierten Histidin-Aminosäuren), wie unten in Herstellung 2 vor den Beispielen beschrieben.
Die modifizierte Apo-Peroxidase ist in dem Element dieser Erfindung in einer Menge von ungefähr 0,1 bis ungefähr 100 mg/m² vorhanden, und bevorzugt in einer Beschichtung von ungefähr 0,5 bis ungefähr 20 mg/m². Eine bevorzugte Beschichtung wird in dem Beispiel unten gezeigt.
Die Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindungsreagenz und die modifizierte Apo-Peroxidase sind, unabhängig, in derselben oder unterschiedlichen Schichten des Elements dieser Erfindung. Darüberhinaus können sie unabhängig in der porösen Verteilungsschicht oder in einer zusätzlichen Schicht des Elements oder in unabhängigen Zonen einer einzelnen Schicht (wie etwa der porösen Verteilungsschicht) sein.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein Vielschicht-Analyse-Element zur Bestimmung eines interessierenden spezifischen Bindungsliganden in einer Hämoglobinumfassenden Probe einen nicht-porösen Träger, der darauf in Flüssigkontakt hat:
Eine erste Reagenz- oder Pufferschicht,
eine Rezeptorschicht, umfassend ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den interessierenden spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet,
eine poröse Verteilungsschicht, enthaltend ein Reagenz, das ein kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und einer Peroxidase bereitstellt, und
an die poröse Verteilungsschicht angrenzend, eine zweite Reagenzschicht, enthaltend:
ein Peroxidase-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den
interessierenden spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, und
eine modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich, wie oben definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein Vielschicht-Analyse-Element zur Bestimmung eines interessierenden spezifischen Bindungsliganden in einer Hämoglobin-umfassenden Probe einen nicht-porösen Träger, der darauf in Flüssigkontakt hat:
Eine erste Reagenz- oder Pufferschicht, und
eine poröse Verteilungsschicht, enthaltend ein Reagenz, das ein kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und einer Peroxidase bereitstellt,
wobei die poröse Verteilungsschicht vielfache Zonen hat, einschließlich
einer ersten Zone, enthaltend ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder an den interessierenden spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, und
einer zweiten Zone, die ein Peroxidase-markiertes immunreaktives Mittel enthält, das spezifisch an entweder den interessierenden spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, und eine modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich, wie oben definiert.
Bei diesem Element können die Zonen der porösen Verteilungsschicht horizontale oder vertikale Regionen der Schicht sein. Bevorzugt sind sie horizontale Zonen, die durch separate Beschichtungen erzeugt worden sind, welche vor oder nach dem Aufbringen der porösen Verteilungsschicht-Bestandteile aufgetragen worden sind. Während des Beschichtungsprozesses, um das Element herzustellen, können sich die separaten Beschichtungen (zum Beispiel die Formulierungen, die für getrennte zweite Reagenz- und Rezeptorschichten verwendet werden) in der porösen Verteilungsschicht auflösen, wodurch sie eine einzelne getrocknete Schicht mit vielfachen Zonen bilden. Eine Technik hierfür mittels Gravur-Beschichtungstechnologie wird in größerem Detail in EP-A-0 517 338 beschrieben.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Element dem bevorzugten Element ähnlich, aber das nicht-markierte immunreaktive Mittel, Peroxidase-markierte immunreaktive Mittel und die modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich sind durch die gesamte poröse Verteilungsschicht verteilt.
Das Element dieser Erfindung kann ebenso ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel enthalten, das in der Lage ist, mit entweder dem interessierenden spezifischen Bindungsliganden oder seinem Rezeptor zu reagieren. Bei kompetitiven Bindungsimmunoassays ist dieses immunreaktive Mittel im allgemeinen ein Rezeptor (wie etwa ein Antikörper) für den Ligand. Bei Sandwich-Immunoassays kann das nicht-markierte immunreaktive Mittel ein Rezeptor für den Ligand oder ein Bindungsmolekül sein, das mit dem Rezeptor reaktiv ist (wie etwa ein Anti-Antikörper). In bevorzugten Ausführungsformen ist das immunreaktive Mittel ein für den Ligand spezifischer Antikörper.
Das nicht-markierte immunreaktive Mittel und das Peroxidase-markierte immunreaktive Mittel werden im allgemein in irgendeiner Weise in dem Element getrennt gehalten, bis der Assay begonnen hat. Sie können voneinander getrennt sein, indem man sie in unterschiedliche Schichten des Elements unterbringt, oder sie können in derselben Schicht sein, aber ein Bestandteil ist innerhalb eines Materials eingekapselt, das den Bestandteil freisetzt, wenn der Assay begonnen wurde, oder sie können sich in separaten Zonen derselben Schicht befinden.
Es wird ebenso bevorzugt, daß die nicht-markierten immunreaktiven Mittel auf geeigneten Partikeln immobilisiert sind, die in einer Schicht insgesamt des Elements dispergiert sind. Solche Partikel können aus jedem geeigneten Material zusammengesetzt sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glas, Eisenoxide, Keramik, organische synthetische oder natürlich vorkommende Polymere, und haben eine durchschnittliche Partikelgröße von ungefähr 0,01 bis 10 μm. Bevorzugt werden die Partikel aus synthetischen Polymeren hergestellt und haben geeignete Oberflächengruppen für die Adsorption oder kovalentes Anhängen der Moleküle des immunreaktiven Mittels. Eine große Vielzahl von solchen Materialien sind auf dem Gebiet bekannt, wie diejenigen, die in US-A-4,828,978 (Warren III et al), US-A-4,997,772 (Sutton et al), US-A-5,147,777 (Sutton et al), US-A-5,177,023 (Sutton et al) beschrieben sind.
Besonders nützliche polymere Partikel sind diejenigen, die aus ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren mit reaktiven Carboxy, 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonyl-Gruppen hergestellt sind, wie in den im vorhergehenden Absatz aufgeführten Patenten beschrieben.
Bei der Verwendung von Peroxidase als die Markierung bei dem Verfahren dieser Erfindung gibt es einen Bedarf, das Peroxidase-markierte immunreaktive Mittel in Kontakt mit Wasserstoffperoxid oder einem ähnlichen Oxidationsmittel und den geeigneten Reagenzien zu bringen, um ein kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal zu erzeugen. Nützliche Reagenzien zum Bereitstellen eines kolorimetrischen Signals schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Imidazol- oder Triarylmethan-Leukofarbstoffe, wie etwa diejenigen, die in US-A-4,089,747 (Bruschi) und den darin aufgeführten Angaben, US-A-4,670,385 (Babb et al), EP-A-0 122 641 (veröffentlicht am 24. Oktober 1984) und der japanischen Patentanmeldung 58(1983)-045557 beschrieben sind. Andere nützliche Reagenzien wären einem Fachmann im Hinblick auf die beträchtliche Menge an Literatur auf diesem Gebiet in leichter Weise offensichtlich. Die Triarylimidazol-Leukofarbstoffe des oben aufgeführten Bruschi-Patents werden bei der Ausübung dieser Erfindung bevorzugt. Solche Leukofarbstoffe sind entweder kommerziell erhältlich oder unter Verwendung von bekannten Prozeduren und Ausgangsmaterialien in leichter Weise herzustellen.
Diazonium- und Tetrazoliumsalze sind ebenso nützlich, solange sie einen Chromophor in der Anwesenheit von Peroxidase und einem Oxidationsmittel bereitstellen können. Ein Diazoniumsalz ist im allgemeinen ein organisches Salz einer Verbindung mit einem Diazoniumradikal. Tetrazoliumsalze sind organische Salze, bei denen der organische Teil ein oder zwei Tetrazolringe enthält, die im allgemeinen Arylsubstituenten an verschiedenen Positionen haben.
Viele nützliche Diazonium- und Tetrazoliumverbindungen werden zum Beispiel in US-A- 3,905,872 (Forgione), US-A-4,772,553 (Fujii et al), US-A-4,892,817 (Pawlak) und US-A- 4,892,833 (Weiss et al) beschrieben, von denen einige aus kommerziellen Quellen erhältlich sind oder unter Verwendung von bekannten Prozeduren und Ausgangsmaterialien leicht herzustellen sind.
Chemilumineszierende Signale können unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten Reagenzien erzeugt werden. Ein bevorzugtes chemilumineszierendes Signal-erzeugendes Reagenz ist ein 2,3-Dihydro-l,4-phthalazindionderivat (hierin identifiziert als "DPD"). Jedes freie oder konjugierte DPD, das in einen angeregten Zustand in einer chemilumineszierenden Reaktion umgewandelt werden kann und bei der Rückkehr zu einem nicht-angeregten Zustand Licht emittiert, ist bei der Ausübung dieser Erfindung nützlich. Eine beträchtliche Anzahl von solchen Verbindungen sind auf dem Gebiet bekannt, einschließlich denjenigen, die in US-A- 4,598,044 (Kricka et al) und Chemiluminescence in Organic Chemistry, Gundermann und McCapra, Springer-Verlag, Berlin, 1987, Seiten 204-207 beschrieben sind. Solche Verbindungen sind im allgemeinen als "Hydrazide vom Luminoltyp" bekannt und schließen Phthalsäurehydrazide, Naphthalen-l,2-dicarbonsäurehydrazide, Anthracen-2,3-Dicarbonsäurehydrazide, Phenanthren-l,2-dicarbonsäurehydrazide, Fluoren-l,2-dicarbonsäurehydrazide, Benzo[g,h,i]perylen-l,2-dicarbonsäurehydrazide, Coronen-l,2-dicarbonsäurehydrazide und andere ein, die Fachleuten leicht offensichtlich sind. Luminol ist ein bevorzugtes chemilumineszierendes Signal-erzeugendes Reagenz. Verschiedene Phenole und Aniline werden als Verstärker mit DPD-Verbindungen verwendet.
Die Elemente dieser Erfindung können ebenso eine Vielzahl von Zusatzstoffen enthalten, die für solche Elemente häufig sind, um bei der Herstellung, der Verteilung der Flüssigkeit, der Absorption unerwünschter Strahlung und der Rezeptorstabilität zu helfen.
Das Element kann unter Verwendung von herkömmlichen Beschichtungsprozeduren und ausrüstung hergestellt werden, die in umfangreichem Stand der Technik beschrieben sind (einschließlich Gravur-, Gießlackier- ("curtain techniques"), Trichter- ("hopper techniques") und anderen Beschichtungstechniken). Die Elemente können in einer Vielzahl von Gestaltungen und Formen konfiguriert sein, einschließlich verlängerter Bänder jeder beliebigen Breite, Blätter, Plättchen oder Chips.
Darüberhinaus kann das Verfahren dieser Erfindung manuell oder automatisiert sein, unter Verwendung von geeignetem analytischen Gerät und -Prozeduren. Im allgemeinen beinhaltet das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der Reagenzien in dem Element durch Aufträufeln einer Testprobe (z. B. 1 bis 200 μl) auf die poröse Verteilungsschicht ein. Die Bewegung der Flüssigkeit innerhalb des Elements mischt im Ergebnis die Reagenzien, so daß die Reaktionen stattfinden können. Nach der Probenauftragung wird das Element einer Bedingung ausgesetzt, wie etwa Inkubation, Heizen oder einer anderen Prozedur, die wünschenswert sein kann, um die Reaktionen im Element zu beschleunigen oder anderweitig zu erleichtern (sowie jegliche spezifische Bindungskomplexe in den Immunoassays).
Für die Immunoassays kann in einigen Fällen ein geeignetes Signal für ein quantitatives Ergebnis erhalten werden, ohne eine effektive Trennung der umgesetzten (gebundenen) und nicht-umgesetzten (ungebundenen) Formen des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels. Jedoch wird bevorzugt, daß die Formen innerhalb einer Zone des Elements getrennt werden, wie es typisch in solchen Tests ist, die als heterogene Immunoassays bekannt sind. Daher kann ein Signal in einer definierten Region der Zone bewertet werden.
Das Aufbringen einer Substratlösung (zum Beispiel 5 bis 200 μl) auf die Zone des Elements ist das bevorzugte Verfahren zum Beeinflussen dieser Trennung und zum Erhalt des geeigneten Signals. Jede erwünschte Rate und Weise der Aufbringung der Substratlösung kann verwendet werden. Diese Lösung kann ein Substrat für die Peroxidase oder andere Signalerzeugende Reagenzien enthalten, oder nur eine gepufferte Waschlösung sein. Wenn die bevorzugten Leukofarbstoffe (oben beschrieben) oder die Verbindungen vom Luminoltyp im Element verwendet werden, enthält die Substratlösung bevorzugt einen phenolischen Signalverstärker oder ein Elektronentransfermittel, von denen viele auf dem Gebiet bekannt sind. Eine bevorzugte Verbindung ist 4'-Hydroxyacetanilid. Die Menge der Reagenzien in der Substratlösung dürfte Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sollen nicht als beschränkend aufgefaßt werden. Alle prozentualen Angaben sind in Gewicht, sofern nichts anderweitig angezeigt.
Materialien und Verfahren für die Beispiele:
Herstellung 1:
Eine modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich wurde hergestellt durch Auflösen von Apo-Peroxidase (1,1 g) aus Meerrettich in Wasser (7 ml), Diethylpyrocarbonat (0,94 g) wurde unter Rühren zugegeben, und die resultierende Mischung wurde unter Mischen bei 24°C für 2 Stunden inkubiert. Die Inkubation wurde unter Rühren bei 4°C für 18 weitere Stunden fortgesetzt. Die resultierende Produktmischung (21,5 ml) wurde gegen zwei Austausche an Phosphatpuffer (3 Liter, 10 mmolar, pH 7) dialysiert. Die dialysierte Mischung enthielt eine Apo-Peroxidase (40 mg/ml) aus Meerrettich mit Ethoxycarbonylgruppen an den Imidazolylgruppen der Histidin-Aminosäuren.
Herstellung 2:
Eine alternative modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich wurde hergestellt durch Zugeben von Apo-Peroxidase (3%) aus Meerrettich zu einer gepufferten Lösung von Iodessigsäure (3%, pH 5,5) und bei 24°C für 24 Stunden gemischt. Die resultierende Produktlösung wurde gegen zwei Austausche von Wasser (3 Liter) bei 24°C für 24 Stunden dialysiert. Die Analyse der dialsysierten Mischung bestätigte das Vorhandensein von Apo-Peroxidase aus Meerrettich mit Imidazolylgruppen, die mit Carboxymethylgruppen substituiert waren, bei einer Ausbeute von ungefähr 85%.
Herstellung von Konjugat von Digoxin und Peroxidase:
Das bei den Elementen verwendete Peroxidase-markierte Digoxin-Analog wurde mit den Prozeduren und mittels Reagenzien hergestellt, die in EP-A-0 468 590 und EP-A-0 468 591 beschrieben sind.
Herstellung von Konjugat aus Diphenylhydantoin und Peroxidase:
Ein wasserlösliches Konjugat eines Diphenylhydantoin-Haptens und Amin-angereicherter Meerrettich-Peroxidase wurde wie folgt hergestellt. Diese Herstellung ist nur beispielhaft. Alternative Herstellungsverfahren existieren ebenso.
Das Hapten, 5,5-Diphenyl-3-{4-[4-(3-succinimidoxycarbonylpropionyl)-1-piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4-imidazolidinedion, wurde hergestellt mittels Prozeduren, die in in EP-A- 0 517 327 beschrieben sind (veröffentlicht am 5. Mai 1993).
Es wird in dieser Veröffentlichung als "HD-2" identifiziert. Eine Amin-angereicherte Meerrettich-Peroxidase wurde hergestellt unter Verwendung der allgemeinen Prozedur aus Beispiel 1 von US-A-5,162,219 .
Das Hapten wurde an eine Amin-angereicherte Meerrettich-Peroxidase durch Auflösen von "HD-2" (15,5 mg) in trockenem N,N-Dimethylformamid (1,031 ml), enthaltend 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar) konjugiert. Eine Lösung von Amin-angereicherter Meerrettich-Peroxidase (1 ml, 10 mg/ml) in N(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(3-propansulfonsäure)puffer (pH 8, 0,1 molar), wurde mit N,N-Dimethylformamid (500 μl), enthaltend 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar) unter Vortex-Mischen kombiniert und wurde dann in ein 42°C-Wasserbad gebracht. Die "HD-2"-Lösung (500 μl) wurde tropfenweise zur Enzymlösung unter Vortex-Mischen zugegeben, so daß das molare Verhältnis 50:1 war. Die Reaktionsmischung wurde für 1 Stunde bei 42°C unter leichtem Rühren inkubiert.
Das Reaktionsprodukt wurde wie folgt dialysiert:

a) Gegen eine Mischung von N,N-Dimethylformamid (1 Liter), enthaltend 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar) und den oben aufgeführten Puffer (pH 8, 0,1 molar) in einem 1 : 1-Verhältnis bei 42°C für eine Stunde.
b) Dialysebedingung a) wurde wiederholt.
c) Gegen den aufgeführten Puffer (1,5 Liter, 0,1 molar, pH 8), enthaltend bovines Seriumalbumin (0,1%) bei 8°C für 1,5 Stunden.
d) Gegen den aufgeführen Puffer (1,5 Liter, 0,1 molar, pH 8) bei 8°C für 18 Stunden. e) Gegen Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer (1,5 Liter, 0,04 molar, pH 7,5), enthaltend Natriumchlorid (0,15 molar) bei 8°C für 2 Stunden.
f) Dialysebedingung e) wurde für 4 Stunden wiederholt.

Die Produktlösung enthielt 1,48 mg/ml des Diphenylhydantoin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugats, bestimmt mittels Spektrophotometrie.
Andere Materialien:
Monoklonale Anti-Digoxin-Antikörper wurden an Poly[styrol-co-p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)styrol] (95 : 5 Gewichtsverhältnis, 1,0 μm durchschnittlicher Durchmesser)-Kügelchen unter Verwendung der in US-A-5,177,023 (Sutton et al) beschriebenen Prozeduren angehängt. In ähnlicher Weise wurden monoklonale Anti-Diphenylhydantoin-Antikörper an polymere Partikel zur Verwendung in Beispiel 3 unten angehängt.
TRITON^TM X-100 nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist von Union Carbide erhältlich. TETRONIC^TM 7908 nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist von BASF erhältlich, und Olin 10G nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist von der Olin Corporation erhältlich. Alle anderen Reagenzien und Bestandteile, die in den Elementen und Verfahren verwendet werden, sind entweder kommerziell erhältlich oder in leichter Weise unter Verwendung von herkömmlichen Ausgangsmaterialien und unter Verwendung von bekannten Prozeduren herstellbar.
Beispiele 1 & 2: Analytische Elemente zum Nachweis von Digoxin
Trockenanalyse-Elemente dieser Erfindung, die zum Nachweis von Digoxin nützlich sind, wurden unter Verwendung herkömmlicher Prozeduren und mit den folgenden Beschichtungsformulierungen hergestellt. Die Gravur- und Rezeptor-Beschichtungen diffundierten in die poröse Verteilungsschicht, um separate Zone nahe den Grenzen der getrockneten porösen Verteilungsschicht zu bilden.
Elementstruktur
Das als Beispiel 1 identifizierte Element enthielt eine modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich mit carboxymethylierten Histidin-Aminosäuren in der Gravur-Beschichtung. Das als Beispiel 2 identifizierte Element enthielt dieselbe modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich aus einer anderen Herstellungscharge.
Ein Kontroll-Element war in jeder Hinsicht identisch, außer daß nicht-modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich anstelle der modifizierten Apo-Peroxidase aus Meerrettich in der Gravur-Beschichtung verwendet wurde.
Die Rate der Signalbildung wurde bestimmt durch Aufbringen einer Testprobe (11 μl), enthaltend Digoxin in einer auf menschlichem Serum basierenden Matrix, auf das Element und Inkubieren des Elements für 5 Minuten bei 37°C. Eine Substratlösung (12 μl), enthaltend Wasserstoffperoxid (0,04%), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 μmolar) in einer Natriumphosphat-gepufferten Lösung eines oberflächenaktiven Mittels (0,01 molarer Puffer, pH 6,8), wurde dann aufgebracht.
Unmittelbar nach der Auftragung der Substratlösung wurde das Element bei 37°C gehalten, während die Messung der Rate der Farbstoffbildung über ungefähr 2,5 Minuten bei 670 nm durchgeführt wurde, unter Verwendung von herkömmlicher Reflexions-Densitometrie.
Jede Testprobe wurde sowohl mit einem Hämolysat, erzeugt durch Beschallen von Vollblut, um die in Tabelle I unten angezeigte Menge an Hämoglobin bereitzustellen, als auch mit Di goxin (2 ng/ml) versehen. Die Testproben mit 8 mg/dl Hämoglobin wurden getestet unter Verwendung einer herkömmlichen Radioimmunassay-Methode [Bayse et al, "Reference Method for Digoxin by Radioimmunoassay, Proposed Standard (1985)", National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Document I/LA9-P, NCCLS: Villanova, PA, 1986], um eine Richtwert-Messung für Digoxin bereitzustellen (1,87 ng/ml).
Die in Tabelle I unten gezeigten Resultate zeigen, daß eine beträchtliche Beeinflussung bei der Digoxin-Bestimmung bei Verwendung des Kontroll-Elements stattfindet, da die nicht-modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich reaktiviert wurde (das heißt ihre Enzymaktivität wiederhergestellt hatte), was zu einem unerwünschten Signal in der Anwesenheit von Hämoglobin führte. Da das bei den Assays erzeugte Signal umgekehrt proportional zur Menge des Analyten in den Testproben ist, sind die beeinflußten Resultate negativ. Die Beeinflussung wurde bei Verwendung der Elemente der vorliegenden Erfindung erheblich verringert. Das heißt, die Resultate waren nur geringfügig negativ oder geringfügig positiv.
Tabelle I
Beispiel 3: Analytisches Element zum Nachweis von Diphenylhydantoin (Phenytoin)
Analytische Elemente wurde in ähnlicher Weise zu den oben in Beispielen 1 und 2 beschriebenen hergestellt, außer daß sie Reagenzien hatten, die zum Nachweis von Diphenylhydantoin geeignet waren. Die Elemente wurden unter Verwendung von herkömmlichen Prozedu ren und -Gerät beschichtet und hatten die folgenden grundlegenden Beschichtungszusammensetzungen und Struktur:

Elementstruktur
Die Elemente wurden verwendet, um zwei Patienten Testproben auf Diphenylhydantoin zu testen, die vom Jackson Memorial Hospital (Miami, Florida) erhalten worden waren, wobei von den Proben bekannt war, daß sie verschiedene Mengen an Analyt sowie störende Blutprotein-Agentien enthielten, von denen bekannt ist, daß sie die Testresultate in der Abwesenheit von nicht-modifizierter Apo-Peroxidase aus Meerrettich beeinflussen. Die Testproben werden hierin als "Patient 1" und "Patient 2" identifiziert. Eine dritte Testprobe, identifiziert als "Patient 3", wurde von einem Angestellten der Eastman Kodak Company erhalten, wobei die Probe keine bekannte Menge an Analyt enthielt. Zu dieser dritten Testprobe wurden jedoch 20 μg/ml Analyt zugegeben.
Bezugsassays wurden an den Testproben unter Verwendung von HPLC durchgeführt, und dann wurden die oben beschriebenen Elemente verwendet. Die Resultate wurden bestimmt unter Verwendung eines EKTACHEM^TM E-250-Analyators (Eastman Kodak Company), und jegliche Beeinflussung wurde durch Vergleich des Analysator-Ergebnisses mit dem mittels HPLC erhaltenen Resultats bestimmt. Die Resultate der Assays werden in 1 zusammengefaßt, wobei die Beeinflussung auf der y-Achse und verschiedene Beschichtungsniveaus (mg/m²) von modifizierter oder nicht-modifizierter Apo-Peroxidase aus Meerrettich für die separaten Tests auf der x-Achse gezeigt werden.
Die Daten in dem ersten Satz an Balkendiagrammen aus 1 wurden erhalten unter Verwendung eines analytischen Elements, enthaltend 10 mg/m² von nicht-modifizierter Apo-Peroxidase aus Meerrettich in der Gravur-Beschichtung, das aber in einem unterschiedlichen Herstellungsprozeß als die anderen Elemente, enthaltend nicht-modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich hergestellt wurde. Die Daten in den letzten beiden Sätzen von Balkendiagrammen (Reihe B) aus 1 wurden unter Verwendung von Elementen der vorliegenden Erfindung erhalten, enthaltend modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich mit carboxymethylierten Histidin-Aminosäuren.
Das erste Balkendiagramm in jedem Satz Balkendiagramme zeigt die Resultate von der "Patient 1"-Testprobe, das zweite Balkendiagramm zeigt die Resultate von den "Patient 2"-Testproben, und das dritte Balkendiagramm zeigt die Resultate von den "Patient 3"-Testproben.
Die Daten in 1 zeigen, daß die ohne Apo-Peroxidase aus Meerrettich jeglichen Typs durchgeführten Assays beträchtlich mehr Beeinflussung als die anderen Assays aufwiesen. Mit der Erhöhung der Konzentration an nicht-modifizierter Apo-Peroxidase aus Meerrettich nahm der Umfang der Beeinflussung ab, aber die endgültige Verbesserung für die meisten Patientenproben wurde mit den Elementen der vorliegenden Erfindung, enthaltend modifiziertes Apo-Enzym, erzielt.

Claims

Ein analytisches Element zur Bestimmung eines Analyten in einer Hämoglobinumfassenden Probe, umfassend eine poröse Verteilungsschicht und enthaltend, unabhängig davon, in derselben oder unterschiedlichen Schicht wie die poröse Verteilungsschicht, a) eine Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindungsreagenz, und b) eine Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase, die so modifiziert ist, daß die Apo-Peroxidase durch Hämoglobin nicht reaktiviert werden kann.
Element nach Anspruch 1, wobei die modifizierte Apo-Peroxidase carboxyalkylierte Histidin-Aminosäuren hat.
Element nach Anspruch 1, wobei die modifizierte Apo-Peroxidase Histidin-Aminosäuren hat, die mit Ethoxycarbonylgruppen substituiert sind.
Element nach Anspruch 1, das weiterhin eine oder mehrere zusätzliche Schichten umfaßt, die in flüssigem Kontakt mit der porösen Verteilungsschicht sind, und wobei a) und b) sich unabhängig in einer oder mehreren Zonen der porösen Verteilungsschicht befinden.
Element nach Anspruch 1, wobei das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz ein Peroxidase-markierter Antikörper ist.
Element nach Anspruch 1, wobei das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz ein Peroxidase-markierter Arzneistoff, Hormon, Protein, Metabolit, Chelat oder Hapten-Derivat eines Arzneistoffes, Hormons, Proteins, Metaboliten oder Chelats ist.
Element nach Anspruch 6, wobei das Peroxidase-markierte spezifische Bindungsreagenz ein Peroxidase-markiertes Hapten-Derivat von Digoxin, Diphenylhydantoin, Phenobarbital, C-reaktives Protein, einem Thyronin-Derivat, Carbamazepin, Gentamicin, Vancomycin, Tobramycin, thyreotropem Hormon oder menschlichem Choriongonadotropin ist.
Ein vielschichtiges analytisches Element zur Bestimmung eines interessierenden spezifischen Bindungsliganden in einer Hämoglobin-umfassenden Probe, wobei das Element einen nicht-porösen Träger umfaßt, der darauf in flüssigem Kontakt hat: eine erste Reagenz- oder Pufferschicht, und eine poröse Verteilungsschicht, enthaltend ein Reagenz, das ein kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und einer Peroxidase bereitstellt, wobei die poröse Verteilungsschicht vielfache Zonen hat, einschließlich einer ersten Zone, enthaltend ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den interessierenden spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, und eine zweite Zone, enthaltend ein Peroxidase-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den interessierenden spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, und eine Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase aus Meerrettich, die so modifiziert ist, daß die Apo-Peroxidase nicht durch Hämoglobin reaktiviert werden kann.
Element nach Anspruch 8, wobei die modifizierte Apo-Peroxidase aus Meerrettich carboxyalkylierte Histidin-Aminosäuren oder Histidin-Aminosäuren, die mit Ethoxycarbonylgruppen substituiert sind, hat und die in einer Trockenbeschichtung von ungefähr 0,1 bis ungefähr 100 mg/m² vorhanden ist.
Element nach Anspruch 8, wobei das nicht-markierte immunreaktive Mittel ein gegenüber Digoxin, Diphenylhydantoin, Phenobarbital, C-reaktivem Protein, einem Thyronin-Derivat, Carbamazepin, Gentamicin, Vancomycin, Tobramycin, thyreotropem Hormon oder menschlichem Choriongonadotropin spezifischer Antikörper ist.
Element nach Anspruch 8, wobei die poröse Verteilungsschicht eine mit Kügelchen versehene Verteilungsschicht ist.
Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Hämoglobin-umfassenden Probe, umfassend: A) In-Kontakt-Bringen einer flüssigen Probe, von der angenommen wird, daß sie einen spezifischen Bindungsliganden und Hämoglobin enthält, mit einem analytischen Element, umfassend: eine poröse Verteilungsschicht, und eine oder mehrere zusätzliche Schichten, die in flüssigem Kontakt mit der porösen Verteilungsschicht sind, wobei das Element in wenigstens einer der Schichten enthält: ein Peroxidase-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, oder ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel, das spezifisch an entweder den spezifischen Bindungsliganden oder einen Rezeptor dafür bindet, und wobei das Element weiterhin enthält, unabhängig, in wenigstens einer der Schichten: eine Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase, die so modifiziert ist, daß die Apo-Peroxidase durch Hämoglobin nicht reaktiviert werden kann, um eine Trennung der nicht-umgesetzten Form des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels von der umgesetzten Form des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels zu erreichen, und B) Nachweisen von entweder der nicht-umgesetzten oder der umgesetzten Form des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels als ein Maß für den interessierenden spezifischen Bindungsliganden.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die nicht-umgesetzten und umgesetzten Formen des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels durch Aufbringen einer Substratlösung auf eine Zone des Elements getrennt werden, wobei die Substratlösung ein Substrat für Peroxidase enthält.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Substratlösung weiterhin 4-Hydroxyacetanilid enthält.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die umgesetzte Form des Peroxidase-markierten immunreaktiven Mittels in der Anwesenheit eines Imidazol-Leukofarbstoffs umgesetzt wird, um ein kolorimetrisches Signal zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die flüssige Probe eine menschliche oder tierische Serum-, Plasma- oder Urinprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 13, das ein kompetitiver Bindungsimmunassay ist, wobei das Element ein Peroxidase-markiertes immunreaktives Mittel enthält, das ein Peroxidasemarkiertes Haptenderivat von dem interessierenden spezifischen Bindungsliganden ist.
Verfahren nach Anspruch 13, das ein Sandwich-Assay ist, wobei das Element ein nicht-markiertes immunreaktives Mittel enthält, das mit dem interessierenden spezifischen Bindungsliganden spezifisch reaktiv ist, wobei das nicht-markierte immunreaktive Mittel in dem Element immobilisiert ist.
Eine analytische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Bestimmung eines Analyten in einer Hämoglobin-umfassenden Probe, umfassend: (a) eine Peroxidase oder ein Peroxidase-markiertes spezifisches Bindungsreagenz, (b) eine Histidin-Aminosäuren umfassende Apo-Peroxidase, die so modifiziert ist, daß die Apo-Peroxidase durch Hämoglobin nicht reaktiviert werden kann, (c) ein oder mehrere Reagenzien, die reagieren, um ein kolorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal in der Anwesenheit einer Peroxidase bereitzustellen, und (d) ein Phenol- oder Anilin-Coreagenz für c).
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei die modifizierte Apo-Peroxidase carboxyalkylierte Histidin-Aminosäuren oder Histidin-Aminosäuren hat, die mit Ethoxycarbonylgruppen substituiert sind.