DE69626423T2

DE69626423T2 - Verfahren und zusammensetzung zum rekonformieren multiepitopischer antigene zum anregen einer immunantwort

Info

Publication number: DE69626423T2
Application number: DE69626423T
Authority: DE
Inventors: Ragupathy Edmonton MADIYALAKAN; Antoine A. Edmonton NOUJAIM; Richard P. Baum; Birgit Schultes
Original assignee: ALTAREX CORP WALTHAM; Altarex Inc
Current assignee: Altarex Medical Corp
Priority date: 1996-05-15
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2016-05-16
Also published as: NO321511B1; EP1297846A1; US6241985B1; US20070036798A1; DK0910407T3; ES2193240T3; JPH11509558A; US20080131443A1; IL126803A; JP3565351B2; US20080206318A1; BR9612619A; SI0910407T1; HUP9903770A2; AU5658096A; EP0910407B1; AU711270B2; NZ332588A; US6086873A; NO985304L

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Anregen und/oder Verstärken einer invivo-Immunantwort.
Hintergrundtechnik
Alle Wirbeltiere weisen ein Immunsystem auf. Die Fähigkeit von Wirbeltieren, sich gegen infektiöse Mikroben, Toxine, Viren und andere fremde Makromoleküle zu schützen, wird als Immunität bezeichnet. Die Immunität ist höchst spezifisch, und eine derartige Spezifität ist ein grundlegendes Merkmal von Immunantworten. Viele der Antworten des Immunsystems regen die Zerstörung und Beseitigung von eindringenden Organismen und jedweder durch sie erzeugten toxischen Molekülen an. Da die Natur dieser Immunantworten von Natur aus zerstörerisch ist, ist es wesentlich, dass die Antwort genau auf die fremden Moleküle und nicht auf jene des Wirts selbst beschränkt ist. Diese Fähigkeit, zwischen fremden Molekülen und eigenen Molekülen zu unterscheiden, ist ein anderes grundlegendes Merkmal des Immunsystems.
Die Technik unterscheidet zwischen natürlicher und erlangter oder spezifischer Immunität. Die natürliche Immunität umfasst Abwehrmechanismen, die vor der Einwirkung durch Mikroben oder fremde Makromoleküle aktiv sind, durch eine solche Einwirkung nicht verstärkt werden, und nicht zwischen den meisten dem Körper fremden Substanzen unterscheiden. Effektoren der natürlichen Immunität sind physische Sperren wie die Haut oder Schleimhäute, Fresszellen wie Makrophagen oder Neutrophile, eine Klasse von Lymphozyten, die als natürliche Killerzellen bezeichnet wird, und das Komplementsystem. Das Komplement ist ein Serumproteinkomplex, der auf bestimmte Bakterien- und andere Zellen, die durch spezifische komplementfixierende Antikörper sensibilisiert sind, zerstörerisch wirkt; seine Aktivität wird durch eine Reihe von Wechselwirkungen beeinflusst, die zu einer proteolytischen Spaltung führen und die dem einen oder dem anderen von zumindest zwei Wegen folgen können.
In Wirbeltieren wirken die Mechanismen der natürlichen und der spezifischen Immunität innerhalb eines Systems der Wirtsverteidigung, dem Immunsystem, zusammen, um fremde Eindringlinge zu beseitigen. Zusätzlich zu Mikroben, Krebszellen, Parasiten und virusinfizierten Zellen erkennt und beseitigt das Immunsystem Zellen von Geweben, die von einem genetisch unterschiedlichen Einzelorganismus der gleichen Art (Allotransplantate) oder von einer unterschiedlichen Art (Xenotransplantate) in ein Subjekt verpflanzt werden.
Die erlangte oder spezifische Immunität umfasst Abwehrmechanismen, die durch Einwirkung von Fremdsubstanzen hervorgerufen oder angeregt werden. Die Ereignisse, durch die die Mechanismen der spezifischen Immunität in die Verteidigung gegen Fremdsubstanzen eingreifen, werden als Immunantworten bezeichnet. Wirbeltiere verfügen über zwei allgemeine Klassen von Immunantworten, Antikörperantworten oder die humorale Immunität und zellvermittelte Antworten oder die zelluläre Immunität. Die humorale Immunität wird durch B-Lymphozyten bereitgestellt, die nach einer starken Vermehrung und einer Differenzierung Antikörper (Proteine, die auch als Immunglobuline bekannt sind) herstellen, die im Blut und der Lymphflüssigkeit zirkulieren. Diese Antikörper binden spezifisch an das Antigen, das sie hervorgerufen hat. Das Binden durch den Antikörper inaktiviert die Fremdsubstanz, z. B. einen Virus, durch Blockieren der Fähigkeit der Substanz, an Rezeptoren auf einer Zielzelle zu binden. Die humorale Antwort verteidigt in erster Linie gegen die extrazellulären Phasen von Bakterien- und Virusinfektionen. Bei der humoralen Immunität kann das Serum alleine die Antwort übertragen, und die Effektoren der Antwort sind lösliche Proteinmoleküle, die Antikörper genannt werden.
Die zweite Klasse der Immunantworten, die zelluläre Immunität, umfasst die Herstellung spezialisierter Zellen, z. B. T-Lymphozyten, die mit fremden Antigenen an der Oberfläche von anderen Wirtszellen reagieren. Die zelluläre Immunantwort ist besonders gegen Pilze, Parasiten, intrazelluläre Virusinfektionen, Krebszellen und andere Fremdstoffe wirksam. Tatsächlich spielt die Mehrheit der T-Lymphozyten eine regulatorische Rolle bei der Immunität, indem sie entweder zum Verstärken oder zum Unterdrücken der Antworten von anderen weißen Blutzellen wirken. Diese Zellen, die Helfer-T-Zellen bzw. Suppressor-T-Zellen genannt werden, werden gemeinschaftlich als Regulatorzellen bezeichnet. Andere T-Lymphozyten, die zytotoxische T-Zellen genannt werden, töten virusinfizierte Zellen. Sowohl die zytotoxischen T-Zellen als auch die B-Lymphozyten sind direkt an der Abwehr gegen Infektionen beteiligt und werden gemeinschaftlich als Effektorzellen bezeichnet.
Der Zeitablauf einer Immunantwort wird in die kognitive oder Erkennungsphase, während der spezifische Lymphozyten das fremde Antigen erkennen, die Aktivierungsphase, während der spezifische Lymphozyten auf das fremde Antigen antworten, und die Effektorphase, während der antigenaktivierte Lymphozyten die Vorgänge vermitteln, die zur Beseitigung des Antigens benötigt werden, unterteilt. Lymphozyten sind Immunzellen, die auf die Vermittlung und Richtung spezifischer Immunantworten spezialisiert sind. T-Zellen und B-Zellen werden erst morphologisch unterscheidbar, nachdem sie durch ein Antigen angeregt wurden.
Das Immunsystem hat sich so entwickelt, dass es fähig ist, Oberflächenmerkmale von Makromolekülen zu erkennen, die nicht normale Bestandteile des Wirts sind. Wie oben erwähnt wird ein fremdes Molekül, das durch das Immunsystem erkannt wurde (z. B. durch Antikörper gebunden wurde), unabhängig davon, ob es selbst eine Antwort hervorrufen kann, ein "Antigen" genannt, und der Abschnitt des Antigens, an den ein Antikörper bindet, wird die "Antigendeterminante" oder das "Epitop" genannt. Manche Antigene, z. B. tumorverbundene Antigene wie Eierstockkrebsoder Brustkrebsantigene, weisen mehrere Antikörperbindungsstellen auf. Diese Antigene werden als "multiepitopische" Antigene bezeichnet. Wenn das Antigen ein Polypeptid ist, ist es gebräuchlich, Epitope als linear (z. B. aus einer fortlaufenden Folge von Aminosäuren bestehend, die entlang der Polypeptidkette wiederholt werden) oder nichtlinear (z. B. aus Aminosäuren bestehend, die als Ergebnis des Faltens der Polypeptidkette angenähert werden) einzustufen. Nichtlineare Epitope werden auch als "konformational" bezeichnet, da sie durch das Falten der Polypeptidkette in eine besondere Konformation, z. B. eine deutliche dreidimensionale Form, auftreten. Aufgrund der höchst spezifischen Natur der Antikörper-Antigen-Bindung ist die Unterscheidung durch die Antikörperbindeeigenschaften ein Hauptmittel des Unterscheidens zwischen Antigenen oder zwischen unterschiedlichen Epitopen auf dem gleichen Antigen.
Um mit der enormen Vielfalt an Epitopen fertig zu werden, denen begegnet wird, enthält das Immunsystem eines einzelnen Säugetiers ein äußerst großes Repertoire an Lymphozyten, annähernd 2 × 10¹². Jeder Lymphozytenklon des Repertoires enthält Oberflächenrezeptoren, die für ein Epitop spezifisch sind. Es wird geschätzt, dass das Säugetierimmunsystem zumindest 10⁸ unterschiedliche Determinanten unterscheiden kann. Sogar eine einzelne Antigendeterminante wird im Allgemeinen viele Klone aktivieren, von denen jeder eine Antigenbindungsstelle mit ihrer eigenen kennzeichnenden Affinität für die Determinante hergestellt. Antigene, die die Herstellung von Hunderten von Arten von Antikörpern anregen, von denen jeder durch einen unterschiedlichen B-Zellen-Klon hergestellt ist, werden eine polyklonale Antwort erzeugend genannt. Wenn nur wenige Klone antworten, wird die Antwort oligoklonal genannt; und wenn die gesamte Antwort durch einen einzelnen B- oder T-Zellen-Klon erfolgt, wird die Antwort monoklonal genannt. Die Antwort auf die meisten Antigene ist polyklonal.
Eine anfängliche oder primäre Immunantwort auf ein fremdes Antigen verstärkt die Fähigkeit des Immunsystems, wieder auf dieses Antigen zu antworten. Dieses Merkmal der spezifischen Immunität wird immunologisches Gedächtnis oder eine sekundäre Immunantwort genannt. Sekundäre Immunantworten sind oft wirksamer als primäre Antworten.
Die herkömmliche Definition eines Antigens ist eine Substanz, die in einem Wirbeltierwirt die Bildung eines spezifischen Antikörpers oder die Herstellung einer spezifischen Gesamtheit von Lymphozyten, die mit der Substanz reaktionsfähig sind, hervorrufen kann. Wie es in der Wissenschaft jedoch häufig vorkommt, ist nun bekannt, dass diese Definition, obwohl sie zutreffend ist, nicht vollständig ist. Beispielsweise ist nun bekannt, dass manche Krankheitszustände die Immunantwort des Wirts unterdrücken oder inaktivieren. Unter diesen Zuständen löst ein Tumorantigen keinen Antikörper aus oder erzeugt keine spezifischen Lymphozyten. Somit sind nicht alle Antigene fähig, eine menschliche Immunantwort auszulösen.
Bei diesem Fehler in der Definition steht ein zweiteiliger Gesichtspunkt der Immunantwort im Mittelpunkt: Der erste Schritt bei der Immunantwort ist die Erkennung der Anwesenheit einer fremden Einheit, und der zweite Schritt ist eine komplexe Anordnung oder Kettenreaktion von Reaktionen, d. h., die Antwort. Beim oben gegebenen Beispiel des Tumorantigens kann das Immunsystem die Anwesenheit eines fremden Antigens erkennen, kann jedoch nicht antworten. In einem anderen Beispiel scheint ein Versagen in der Fähigkeit des Immunsystems, zwischen Eigenem und Nichteigenem zu unterscheiden am Anfang vieler Autoimmunkrankheiten zu stehen. Dies ist erneut ein Versagen der Erkennung, nicht der Antwort.
So, wie hierin verwendet, wird daher ein Antigen antigenisch genannt, wenn es durch das Immunsystem erkannt werden kann, und wird es immunogen genannt, wenn das Immunsystem auch eine aktive Antwort auf das Antigen erstellen kann. Antigene, die immunogen sind, sind gewöhnlich Makromoleküle (wie etwa Proteine, Nucleinsäuren, Kohlehydrate und Lipide) mit einem Molekulargewicht von zumindest 5000 Dalton. Kleinere nicht immunogene Moleküle, z. B. Haptene und kleine antigenische Moleküle, können eine Immunantwort anregen, wenn sie einem Trägermolekül von ausreichender Größe beigeordnet sind.
Antikörper, die Effektoren der humoralen Immunität, werden durch Plasmazellen abgeschieden und gehören zu den am häufigsten vorhandenen Bestandteilen des Blutes. Plasmazellen sind voll entwickelte Endstadiumzellen, die eine kurze Lebensdauer aufzuweisen scheinen. Sie werden hergestellt, wenn ein Antigen in das menschliche Immunsystem eindringt und in einer komplexen Reihe von Zellwechselwirkungen B-Lymphozyten aktiviert. Die B-Lymphozyten vermehren sich dann stark und differenzieren, um Plasmazellen zu bilden. Jede B-Lymphozyte ist durch ihre DNA programmiert, ein Antikörpermolekül einer einzelnen Spezifität herzustellen. Die B-Lymphozyten stellen zwei spezielle Formen dieses Moleküls her, eine, die als ein Membranrezeptor, kennzeichnenderweise zum Binden des Antigens an die B-Zelle, an der äußeren Oberfläche der Zellmembran verankert bleibt, und eine, die abgeschieden wird.
Antikörper, die auch als Immunglobuline bekannt sind, sind Proteine. Sie weisen zwei Hauptfunktionen auf. Die erste ist, fremde Antigene zu erkennen (zu binden). Die zweite ist, andere Elemente des Immunsystems zu mobilisieren, um die fremde Einheit zu zerstören.
Die Antigenerkennungsstrukturen eines Antikörpers sind veränderliche Domänen und sind für die Antigenbindung verantwortlich. Die Immunsystemmobilisierungsstrukturen, die zweite Funktion des Antikörpers, sind konstante Domänen. Diese Bereiche sind mit den verschiedenen Effektorfunktionen beauftragt: Anregung von B-Zellen, um sich stark zu vermehren und sich zu differenzieren, Aktivierung des Komplementzellenlysissystems, Opsonisierung, Anziehung vom Makrophagen, um den Eindringling aufzunehmen, usw. Antikörper verschiedener Isotypen weisen unterschiedliche konstante Domänen und daher unterschiedliche Effektorfunktionen auf. Die am besten erforschten Isotypen sind IgG und IgM.
Der Antikörper selbst ist ein oligomeres Molekül, das je nach seinem Aufbau in eine Klasse (z. B. IgG) und eine Unterklasse (z. B. IgG1) eingeteilt wird. IgG-Moleküle sind die wichtigsten Bestandteile der humoralen Immunantwort und bestehen aus zwei schweren (langen) und zwei leichten (kurzen) Ketten, die durch Disulfidbindungen zu einer "Y"-Anordnung verbunden sind. Das Molekül weist zwei veränderliche Bereiche (an den Armen des "Y") auf. Die Bereiche sind so bezeichnet, da sich Antikörper einer bestimmten Unterklasse, die durch einen besonderen Einzelorganismus als Antwort auf verschiedene Antigene hergestellt wurden, im veränderlichen Bereich, doch nicht im konstanten Bereich unterscheiden werden. Die veränderlichen Bereiche selbst bestehen sowohl aus einem verhältnismäßig Invarianten Gerüst als auch aus hypervariablen Schleifen, die dem Antikörper seine Spezifität für ein besonderes Epitop verleihen. Ein Antikörper bindet als Ergebnis einer molekularen Komplementarität an ein Epitop eines Antigens. Der Abschnitt des Antikörpers, der direkt an der Wechselwirkung teilnimmt, wird "Antigenbindungsstelle" oder "Paratop" genannt. Die durch einen besonderen Antikörper gebundenen Antigene werden seine "verwandten Antigene" genannt.
Ein Antikörper eines Tiers wird durch das Immunsystem eines anderen Tiers als ein fremdes Antigen betrachtet werden und wird daher eine Immunantwort hervorrufen. Einige der sich ergebenden Antikörper werden für die einzigartigen Epitope (Idiotypen) des veränderlichen Bereichs des immunisierenden Antikörpers spezifisch sein und werden daher als anti-idiotypische Antikörper bezeichnet. Diese weisen oft immunologische Merkmale auf, die jenen eines Antigens, das dem immunisierenden Antikörper verwandt ist, ähnlich sind. Anti-isotypische Antikörper andererseits binden Epitope im konstanten Bereich des immunisierenden Antigens.
Wie oben erwähnt sind die Zellen, die die zellvermittelte Immunität regulieren, eine Klasse von Lymphozyten, die T-Lymphozyten genannt werden. Diese stammen letztendlich von denselben Stammzellen wie B-Lymphozyten, folgen jedoch einem sehr unterschiedlichen Entwicklungsweg, in dem der Thymus eine wichtige Rolle spielt. T-Lymphozyten drücken auch antigenspezifische Oberflächenrezeptoren aus, obwohl sich die Weise, in der sie Antigene erkennen, ziemlich von jener für B-Zellen unterscheidet. T-Zellen existieren in zwei funktionalen Kategorien, jene mit einer spezifischen Effektorfunktion (zytotoxische T-Lymphozyten oder "CTL") und jene mit einer regulatorischen Funktion. Regulatorische T-Zellen werden für die Entwicklung von Plasmazellen aus B-Zellen benötigt. T-Helferzellen (TH) erzeugen eine antigenspezifische Hinaufregulation der Immunantwort. Immunantworten können auch eine aktive antigenspezifische Herabregulation erleben. Eine große Menge an Nachweisen aus Untersuchungen mit Tieren und Gewebekulturen beschreibt das Vorhandensein einer Suppressor-T-Zellen-Population (TS), die diese Hemmregulierung bereitstellt.
Die Lymphozyten in einem Einzelorganismus antworten spezifisch auf fremde Antigene, sind jedoch gewöhnlich nicht fähig, auf die potentiell antigenischen Substanzen, die diesem Einzelorganismus eigen sind, zu antworten. Diese immunologische Unfähigkeit zur Antwort wird als Toleranz bezeichnet. Selbsttoleranz wird in einer frühen Entwicklungsstufe erlangt, wenn potentiell selbsterkennende Lymphozyten in Kontakt mit selbstantigenischen Substanzen gelangen und daran gehindert werden, sich zu einem Stadium zu entwickeln, in dem sie fähig wären, positiv auf Selbstantigene zu antworten.
Das Immunsystem weist zwei zytokinvermittelte regulatorische Wege auf, die bestimmen, ob die Antwort auf die antigenische Herausforderung hauptsächlich eine zelluläre Antwort (TH1-Weg) oder hauptsächlich eine humorale Antwort (TH2-Weg) sein wird. Der zelluläre Weg ist durch die T-Helfer-Zellen-Herstellung von Interleukin-2 (IL-2) oder Interferon-γ gekennzeichnet. Dieser Weg vermittelt die verzögerte Überempfindlichkeitsantwort (DTH), die Herstellung von zytotoxischen T-Zellen und die Makrophagenaktivierung. Die TH2-Antwort fördert die Herstellung einer Vielfalt von Zytokinen wie etwa Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-10 (IL-10) durch T-Zellen. Diese Antwort wird durch die Herstellung von spezifischen Antikörpern in hohem Titer identifiziert.
Die Tendenz des Vorherrschens entweder der zellvermittelten oder der humoralen Immunantwort ist vermutlich eine Folge der Kreuzregulierung. Somit würden TH1-Zellen das Hervorrufen von TH2-Antworten z. B. durch Absonderung von Interferon-γ hemmen. Umgekehrt könnten TH2-Zellen durch eine Erzeugung von Zytokinen wie etwa IL-4 und IL-10 die Erzeugung von TH1-Antworten hemmen.
TH2-Antworten könnten tatsächlich die Entwicklung von bestimmten Krankheiten verschlimmern. Es ist in der Technik wohlbekannt, dass Spritzungen von kleinen Mengen von immunisierenden Antigenen vorzugsweise verzögerte Überempfindlichkeitsantworten hervorrufen können, die eine zellvermittelte Immunität anzeigen, während eine Impfung mit größeren Mengen des Antigens zu einer ausgeprägteren humoralen Immunantwort führen wird, wie durch einen hohen Antikörpertiter gezeigt wird. Es ist jedoch schwierig, durch dieses Verfahren eine hohe IgG-Antwort zu vermeiden und eine hohe und anhaltende zelluläre Antwort zu erzielen, und je nach dem Antigen können geringe Dosen nicht ausreichend sein, um eine ausreichend starke CMI-Antwort auszulösen, um nützlich zu sein.
Normalerweise bewegt sich eine Immunantwort zu Effektormechanismen hin, die sowohl für B- als auch für T-Lymphozyten kennzeichnend sind. Im Verlauf der meisten Immunantworten übernehmen jedoch entweder B- oder T-Lymphozyten eine dominante Rolle mit einer geringeren wesentlichen Teilnahme der jeweiligen anderen Art von Lymphozyten. Immunantworten, deren Effektormechanismen überwiegend durch B-Zellen und Antikörper vermittelt werden, sind humorale Immunantworten. Die Antworten, bei denen T-Zellen die wichtigeren Effektorfunktionen vermitteln, sind zellvermittelte oder zelluläre Immunantworten.
Wie oben erwähnt sind die Zellen, die die humorale Immunität regulieren, eine Klasse von Lymphozyten, die B-Zellen genannt wird. Jeder Klon von B-Lymphozyten drückt Membranimmunglobuline (Membran-Igs, oberflächengebundene Antikörpermoleküle) aus, die als Antigenrezeptoren tätig sind, die ein einzigartiges Epitop für einen B-Lymphozytenklon aufweisen. Diese Membran-Ig-Moleküle sind die einzige Quelle der B-Zellen-Spezifität. Antigene, die ein Epitop enthalten, das zum Membran-Ig komplementär ist, werden an den Antigenrezeptor binden. Derartige Antigene werden auch als verwandte Antigene des Antikörpers bezeichnet. Das Binden an den Antigenrezeptor (Membran-Ig) wird zu einer Differenzierung und einer klonalen starken Vermehrung des B-Lymphozyten führen. Einige seiner Nachkommen werden in voll entwickelte Plasmazellen differenzieren, die auf die Synthese von Antikörpern spezialisiert sind, welche in der Epitopspezifität mit der Membran-Ig übereinstimmen, durch die der B-Lymphozyt ursprünglich das Antigen gebunden hat.
Das Binden eines Antigens an einen Antikörper ist umkehrbar. Es wird durch die Gesamtheit vieler verhältnismäßig schwacher nicht-kovalenter Kräfte einschließlich hydrophober und Wasserstoffbindungen, vander-Waals-Kräfte und ionischer Wechselwirkungen vermittelt. Diese schwachen Kräfte sind nur wirksam, wenn das Antigenmolekül nahe genug ist, um zu gestatten, dass einige seiner Atome in ergänzende Vertiefungen an der Oberfläche des Antikörpers eingepasst werden. Die komplementären Bereiche einer Vier-Ketten-Antikörpereinheit sind ihre zwei identischen Antigenbindestellen; der entsprechende Bereich des Antigens ist eine Antigendeterminante. Viele antigenische Makromoleküle weisen viele verschiedene Antigendeterminanten auf.
Viele Jahre lang wurden lebende abgeschwächte Impfstoffe verwendet, um Immunität gegen Virusinfektionen wie Grippe oder Polio zu bewirken. Diese Präparate enthalten lebende Virionen, die milde, subklinische Infektionen der geimpften Personen verursachen. Im Verlauf derartiger Infektionen werden die viralen Vektoren in bestimmte Wirtszellen eindringen und eine Codierung zur Synthese von virusspezifischen Proteinen vornehmen. Diese endogen hergestellten antigenischen Proteine werden zu kleineren Peptiden verarbeitet und im Kontext der MHC-Klasse-I- und -II-Antigene aufgezeigt, wodurch TH1-Zellen rekrutiert werden und zellvermittelte Immunantworten hervorgerufen werden.
Tumorzellen drücken bestimmte Zelloberflächenantigene ("tumorverbundene Antigene") aus. Tumorverbundene Antigene sind Antigene, die im Serum und in den Geweben von Krebspatienten vorhanden sind. Viele derartige Antigene sind auch in Embryonalgeweben und, in geringen Konzentrationen, im Gewebe und Serum von gesunden Einzelorganismen ausgedrückt. Viele der gewebeverbundenen Antigene sind Glykoproteine, Glykolipide oder Mucopolysaccharide. Die meisten Tumorantigene werden durch differenzierte Zellen hergestellt. Sie werden durch Tumorzellen in viel größeren Mengen hergestellt, als durch differenzierte normale Zellen. Das menschliche Immunsystem erkennt die Tumorantigene als eigene Antigene und antwortet nicht (Selbsttoleranz). Die Mechanismen, die zur Selbsttoleranz führen, werden nur teilweise verstanden, doch ist jetzt klar, dass sie weitgehend während der Entwicklung des Immunsystems festgelegt wird. Wenn unentwickelte B-Zellen oder T-Zellen durch ihre antigenspezifischen Rezeptoren in einem kritischen Stadium (z. B. gerade nachdem sie ihre Rezeptoren an der Zelloberfläche ausgedrückt haben, aber bevor sie voll entwickelt werden) angeregt. werden, werden sie eher zum Sterben veranlasst, als aktiviert zu werden. Dieses Stadium tritt für B-Zellen im Knochenmark und für T-Zellen im Thymus auf. Es wird daher eine Toleranz gegenüber in diesen Umgebungen ausgedrückten Selbstantigenen veranlasst, aber nicht gegenüber jenen, die nicht ausgedrückt sind. Es hat sich gezeigt, dass normale Einzelorganismen voll entwickelte B-Zellen aufweisen, die fähig sind, einige Selbstantigene zu erkennen, dass aber diese B-Zellen nicht aktiviert sind. Die entsprechenden T-Helferzellen (TH) scheinen zu fehlen.
Bei Tumoren, die Antigene aufweisen, gibt es zumindest vier Theorien, warum die Immunantwort versagen kann, einen Tumor zu zerstören; 1) gibt es keine B-Zellen oder zytotoxische T-Lymphozyten (CTL), die fähig sind, den Tumor zu erkennen; 2) gibt es keine TH-Zellen, die fähig sind, den Tumor zu erkennen; 3) werden die TS-Zellen vor den TH-Zellen aktiviert, wodurch die B-Zellen- und die CTL-Aktivierung verhindert wird; und 4) können die Gene, die die Tumorvermehrung regulieren, seit der Geburt vorhanden sein, so dass der Wirt die Generzeugnisse nicht als "fremd" behandelt.
Vorhandene Lösungen
Wo Tumorantigene mit einer ausreichenden Trennschärfe an einem Tumor erscheinen (z. B. die Tumorantigene an ihren normalen zellulären Gegenstücken fehlen oder nur in geringen Mengen vorhanden sind), kann das Tumorantigen als mögliches Ziel für ein immuntherapeutisches Mittel dienen.
Viele der selektiven Tumorantigene sind in ihrer Natur Kohlehydrate oder Glykoproteine (Muzine). Beispielsweise drücken die meisten Drüsengewebskrebszellen Muzine in hohem Maße aus und sondern diese ab. Dies liegt teilweise an Defekten bei der Glykosylierung in Krebszellen. Krebszellenoberflächenmuzine können Immuneffektormechanismen physisch daran hindern, die Tumorzellenoberfläche und daher das Tumorantigen zu erreichen. Das heißt, der Wirt versagt dabei, das Tumorantigen zu erkennen.
Bei vielen Krankheiten können die verursachenden Pathogene oder Toxine (z. B. Grippe-; Polio- oder Tollwutviren; Pneumokokkenbakterien; Diphtherie- und Tetanustoxine) in der extrazellulären Flüssigkeit durch die Mechanismen der humoralen Immunität durch Antikörper, die an die Pathogene oder Toxine binden und dadurch zu ihrer Inaktivierung der Zerstörung führen, wirksam erfasst und neutralisiert werden. In diesen Fällen ist eine Impfung mit Präparaten, die eine vermutlich durch TH2-Zellen vermittelte humorale Immunantwort hervorrufen, im Allgemeinen für einen Schutz ausreichend. Andererseits ist es bei vielen intrazellulären Infektionen, zur Erholung von Virusinfektionen und zum gezielten Töten von Krebszellen die zellvermittelte Immunität, die den Organismus vor den Eindringlingen schützt.
Gegenwärtig werden drei Klassen von Immuntherapien untersucht: 1) die passive Immuntherapie; 2) die aktive Immuntherapie mit Antigenen; und 3) die aktive Immuntherapie mit Antikörpern. Unglücklicherweise ist jede auf einen begrenzten Erfolg gestoßen. Der Immuntherapie wird jedoch in bestimmten Stadien des Krebses der Vorzug vor chemotherapeutischen Mitteln, die der Wucherung entgegenwirken, wie etwa Pyrimidin- oder Purinanalogen gegeben. Die Analoge stehen als Bausteine, die während eines Zellwachstumszyklus verwendet werden, mit Pyrimidin und Purin im Wettbewerb. Die Analoge sind unwirksam, wenn das Wachstum nicht zyklisch oder ruhend ist. Die Mehrheit der mikrometastasischen Zellen scheint nicht zyklisch oder ruhend zu sein. Die zytotoxische Wirkung der Immuntherapie ist unabhängig vom Zellzyklus tätig.
Die "passive Immuntherapie" umfasst die Verabreichung von Antikörpern an einen Patienten. Die Antikörpertherapie ist herkömmlich als passiv gekennzeichnet, da der Patient nicht die Quelle der Antikörper ist. Der Ausdruck "passiv" ist jedoch irreführend, da der Patient anti-idiotypische Antikörper erzeugen kann, die wiederum eine Immunantwort hervorrufen können, die mit dem ursprünglichen Antigen kreuzreaktionsfähig ist. Die "aktive Immuntherapie" ist die Verabreichung eines Antigens in der Form eines Impfstoffs an einen Patienten, um eine schützende Immunantwort auszulösen. Genetisch veränderte Tumorzellenimpfstoffe, die mit Genen, welche Zytokine und costimulierende Moleküle ausdrücken, transfiziert sind, wurden ebenfalls verwendet, um die Unzulänglichkeit der tumorspezifischen Immunantwort zu vermindern.
I. Passive Immuntherapie (mit Antikörpern)
Ein Tumorantigen kann als reaktionsfähige Stelle dienen, an die Antikörper gebunden werden können. Zahlreiche Antikörper wurden gegen Tumorantigene aufgestellt.
Herkömmliche Effektorverfahren beinhalten die komplementabhängige Zytolyse ("CDC"), die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität ("ADCC") und die Phagozytose (Beseitigung durch das retikuloendotheliale System, nachdem die Zielzelle mit Immunglobulin überzogen ist).
Zur Einleitung von CDC, ADCC und einer Opsonisierung ist eine verhältnismäßig große Antikörpermenge nötig. Darüber hinaus sind die Quellen von menschlichen Antikörpern auf Personen beschränkt, die bereits am Tumor leiden, der von Interesse ist; es ist unethisch, eine Krankheit in eine Person einzubringen, nur um die Herstellung von Antikörpern, die geerntet werden können, einzuleiten. Als Ergebnis dieser Schwierigkeiten wurden Antikörper nichtmenschlichen Ursprungs wie etwa Mausantikörper verwendet.
Da sie als "fremd" erkannt werden, kann die Verabreichung von Mausantikörpern an Menschen eine menschliche Antimaus-Antikörper-Antwort ("HAMA") hervorrufen, die gegen mausspezifische und mausisotypenspezifische Abschnitte des ursprünglichen Antikörpermoleküls gerichtet ist. Diese Immunreaktion tritt aufgrund von Unterschieden in den primären Aminosäuresequenzen in den konstanten Bereichen der Immunglobuline von Mäusen und Menschen auf. Sowohl IgG- als auch IgM-Unterklassen von HAMA wurden festgestellt. Die IgG-Antwort tritt später auf, ist langlebiger als die kennzeichnende IgM-Antwort, und ist beständiger gegenüber einer Entfernung durch Plasmapherese.
Klinisch jedoch erhöht HAMA 1) die Gefahr anaphylaktischer oder serumerkrankungsartiger Reaktionen auf eine nachfolgende Verabreichung von Mausantikörpern; kann HAMA 2) die immuntherapeutische Wirkung nachfolgend gespritzter Mausantikörper beeinträchtigen, indem sie mit diesen Antikörpern Komplexe bildet, die Beseitigung aus dem Körper erhöht, die Tumorlokalisierung verringert, die Aufnahme in der Leber und der Milz verstärkt, und/oder den Tumor vor den therapeutischen Mitteln verbirgt; und kann HAMA 3) immundiagnostische Mittel beeinträchtigen und dadurch das Überwachen des Fortschritts der Krankheit und des Verlaufs der Behandlung behindern.
Verschiedenste klinische Versuche haben Antikörper als therapeutische Mittel gegen solide Tumore verwendet. Es ist jedoch noch kein übereinstimmendes Ansprechmuster oder kein verbessertes Überleben zu Tage getreten. Im Gegenteil hat die Antikörpertherapie viel öfter völlige und langanhaltende Remissionen bei B-Zellen- oder T-Zellen-Lymphomen oder -Leukämien verursacht. Erklärungen für das Versagen bei soliden Tumoren beinhalten die antigenische Heterogenität und die unzureichende Zugänglichkeit von Epithelialzellen zu den gespritzten Antikörpern wie auch zu sekundären Effektormolekülen wie Komplement- oder Effektorzellen.
Als ein Beispiel für die passive Immunität wurden Mausmonoklonalantikörper 17-1A (Isotyp IgG2a) verwendet, um eine geringfügige Resterkrankung bei Patienten mit Duke'schem Stadium-C-Kolorektalkrebs zu erfassen, die sich einer heilenden Operation unterzogen hatten und frei von manifestem Resttumor waren. Obwohl die Behandlung das überleben verbesserte und zu verringerten Rückfallraten führte, waren die Ergebnisse weniger günstig als bei einer Behandlung nur mit Chemotherapie oder in Kombination mit Bestrahlung.
Es ist wichtig, zu bemerken, dass das Zielantigen 17-1A nicht von der Membran abgegeben wird und im Serum nicht feststellbar ist. Siehe Riethmuller, et al., "Randomized trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma", Lancet, 343: 1177–83 (1994).
II. Aktive spezifische Immuntherapie ("ASI") mit Tumorantigenen
ASI ist als Immunisierung mit einem definierten Antigen, das in einer passenden Weise aufgezeigt wird, um aktiv eine auf dieses Antigen spezifische Immunantwort hervorzurufen, definiert. Im Zusammenhang mit Krebs versucht ASI, eine menschliche Immunantwort sowohl humoral als auch zellvermittelt anzuregen, um das Tumorantigen anzugreifen.
Die humorale Antwort und die herkömmlichen Effektorverfahren von CDC, ADCC und Phagozytose (Beseitigung durch das retikuloendotheliale System, nachdem die Zielzelle mit Immunglobulin überzogen ist) wurden im Vorhergehenden besprochen.
Während der letzten fünf Jahre wurde bei der Charakterisierung des Molekularkomplexes, der durch den spezifischen Antigenrezeptor von T-Lymphozyten erkannt wird, ein beträchtlicher Fortschritt erzielt. Kristallstrukturen von Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexmolekülen ("MHC"-Molekülen) zeigten nicht nur eine vermeintliche Peptidbindungsfurche sondern auch die tatsächliche Anwesenheit eines Peptids in dieser Furche. Nach der Phagozytose werden Proteine, die in den Zellen synthetisiert werden, offenbar durch zelluläre Enzyme in Peptide zerlegt, in das endoplasmatische Retikulum transportiert, und verbinden sich dort mit den schweren Ketten eines Klasse-I-MHC-Moleküls. Derartige Peptid-MHC-Komplexe werden durch den Zusatz von β2-Mikroglobulin stabilisiert und zur Zelloberfläche transportiert, wo sie durch den Rezeptor von CTL erkannt werden können. In der Theorie kann ein antigenisches Peptid von jedwedem intrazellulären Protein abgeleitet werden, das spezifisch durch Tumorzellen ausgedrückt wird. Siehe beispielsweise Van Der Bruggen, Pierre, "The Long-Standing Quest for Tumor Rejection Antigens", Clinical Immunology and Immunopathology, 71; 3: 248–252 (1994).
III. Aktive spezifische Immuntherapie mit Antikörpern
Wenn ein spezifischer Antikörper von einem Tier als ein Immunogen in ein geeignetes zweites Tier gespritzt wird, wird der gespritzte Antikörper eine Immunantwort hervorrufen (z. B. hergestellte Antikörper gegen die gespritzten Antikörper – "Anti-Antikörper"). Einige dieser Anti-Antikörper werden für die einzigartigen Epitope (Idiotope) der veränderlichen Domäne der gespritzten Antikörper spezifisch sein. Diese Epitope sind gemeinschaftlich als der Idiotyp des primären Antikörpers bekannt; die sekundären (Anti-)antikörper, die an diese Epitope binden, sind als anti-idiotypische Antikörper bekannt. Die Gesamtheit aller Idiotope, die am veränderlichen Abschnitt eines Antikörpers vorhanden sind, wird als sein Idiotyp bezeichnet. Idiotypen sind serologisch definiert, da das Spritzen eines primären Antikörpers, der ein Epitop des Antigens bindet, die Herstellung von anti-idiotypischen Antikörpern hervorrufen kann. Wenn das Binden zwischen dem primären Antikörper und einem anti-idiotypischen Antikörper durch das Antigen, auf das der primäre Antikörper gerichtet ist, gehemmt wird, ist der Idiotyp bindungsstellen- oder epitopverwandt. Andere sekundäre Antikörper werden für die Epitope der konstanten Domänen der gespritzten Antikörper spezifisch sein und sind daher als anti-isotypische Antikörper bekannt. Wie sie hierin verwendet werden, werden die Ausdrücke "Anti-Idiotyp", "anti-idiotypischer Antikörper", "Epitop" oder "epitopisch" in ihrem in der Technik erkannten Sinn verwendet.
Die "Netzwerk"-Theorie behauptet, dass Antikörper, die anfänglich während einer Immunantwort hergestellt werden, einzigartige neue Epitope tragen werden, gegenüber denen der Organismus nicht tolerant ist, und daher die Herstellung von sekundären Antikörpern (Ab2) hervorrufen werden, die gegen die Idiotypen der primären Antikörper (Ab1) gerichtet sind. Diese sekundären Antikörper werden ebenfalls einen Idiotyp aufweisen, der die Herstellung von tertiären Antikörpern (Ab3) hervorrufen wird, usw. Ab₁ → Ab₂ → Ab₃
Die Netzwerktheorie deutet auch darauf hin, dass einige dieser sekundären Antikörper (Ab2) eine Bindungsstelle aufweisen werden, die der Komplement des Komplements des ursprünglichen Antigens ist, und somit das "innere Abbild" des ursprünglichen Antigens wiedererzeugen werden. Mit anderen Worten kann ein anti-idiotypischer Antikörper ein Ersatzantigen sein.
Ein traditioneller Zugang zur Krebsimmuntherapie war die Verabreichung von Anti-Tumor-Antikörpern, d. h., Antikörpern, die ein Epitop auf einer Tumorzelle erkennen, an Patienten. Die Entwicklung der "Netzwerk"-Theorie hat Forscher jedoch dazu geführt, die direkte Verabreichung von exogen hergestellten Anti-Idiotyp-Antikörpern, d. h., Antikörpern, die gegen den Idiotyp eines Anti-Tumor-Antikörpers aufgestellt wurden, vorzuschlagen. Ein derartiger Zugang ist in der US-Patentschrift 5,053,224 (Koprowski, et al.) offenbart. Koprowski nimmt an, dass der Körper des Patienten Anti-Antikörper herstellen wird, die nicht nur diese Anti-Idiotyp-Antikörper, sondern auch das ursprüngliche Tumorepitop erkennen werden.
Es gibt vier Hauptarten von anti-idiotypischen Antikörpern. Der Alpha-Typ bindet ein Epitop fern vom Paratop des primären Antikörpers. Der Beta-Typ ist einer, dessen Paratop stets das Epitop des ursprünglichen Antigens nachahmt. Der Gamma-Typ bindet nah genug am Paratop des primären Antikörpers, um die Antigenbindung zu stören. Der Epsilon-Typ erkennt eine idiotypische Determinante, die eine antigenische Struktur der konstanten Domäne nachahmt. Darüber hinaus können anti-isotypische Antikörper schwerkettenspezifisch oder leichtkettenspezifisch sein.
Aus der Netzwerktheorie entstanden zwei therapeutische Anwendungen: 1) Verabreichen von Ab1, das als ein Antigen einschließlich einer Ab2-Erzeugung durch den Wirt wirkt; und 2) Verabreichen von Ab2, das das Tumorantigen funktional nachahmt.
Von der aktiven Immunisierung von Patienten mit Eierstockkrebs mit wiederholter intravenöser Verabreichung der F(Ab')₂-Fragmente des monoklonalen Antikörpers OC125 wurde berichtet, dass in einigen der Patienten bemerkenswerte anti-idiotypische Antikörper (Ab2)-Antworten hervorgerufen wurden. Vorläufige Ergebnisse deuteten an, dass Patienten mit hohen Ab2-Serumkonzentrationen verglichen mit jenen, bei denen geringe oder keine Ab2-Serumkonzentrationen festgestellt wurden, bessere Überlebensraten aufwiesen. Siehe Wagner, U. et al., "Clinical Course of Patients with Ovarian Carcinomas After. Induction of Anti-Idiotypic Antibodies Against a Tumor-Associated Antigen", Tumor Diagnostic & Therapie, 11: 1– 4, (1990).
Es hat sich gezeigt, dass ein menschlicher antiidiotypischer monoklonaler Antikörper (Ab2) in Tieren zelluläre Anti-Tumor-Antworten hervorruft und bei Patienten mit metastatischem Kolorektalkrebs das Überleben verlängert. Siehe Durrant, L. G., et al., "Enhanced Cell-Mediated Tumor Killing in Patients Immunized with Human Monoclonal Anti-Idiotypic Antibody 105AD7", Cancer Research, 54: 4837–4840 (1994). Ein Überblick über die Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern (Ab2) für die Immuntherapie von Krebs wird auch durch Bhattacharya-Chatterje, et al., Cancer Immunol. Immunother., 38: 75–82 (1994) gegeben.
Offenbarung der Erfindung
Impfstoffe sind Präparate, die Tieren oder Menschen verabreicht werden, um durch das Hervorrufen einer spezifischen Immunität eine Vorbeugung, Heilung oder Linderung von Krankheitszuständen vorzunehmen. Vorbeugende Impfstoffe werden gesunden Einzelorganismen mit der Absicht gegeben, das Immunsystem auf eine wirksamere Verteidigung gegen Infektionen in der Zukunft vorzubereiten oder einzustimmen. Im Fall einer Infektion oder einem Befall kann das Immunsystem geimpfter Einzelorganismen eine sekundäre Immunantwort erstellen und die entsprechenden Pathogene schneller erkennen und beseitigen. Therapeutische Impfstoffe werden erkrankten Einzelorganismen mit der Absicht gegeben, das Immunsystem, das von selbst entweder eine unzureichend wirksame Immunantwort erstellt hat oder bei der Antwort gänzlich versagt hat, anzuregen oder anzupassen. Bei der Gestaltung vorbeugender oder therapeutischer Impfstoffe ist es wichtig, Präparate zu wählen, die jene Art von Immunantwort hervorrufen werden, welche am fähigsten ist, entweder einen primären Schutz bereitzustellen oder eine rasche Erholung zu bewirken.
Der erste Schritt bei der Einleitung einer Immunantwort ist das Hervorrufen einer Erkennung des Tumorantigens als fremdes Antigen durch den Wirt. Obwohl, beispielsweise, der CA125-Ausdruck mit Eierstockkrebs verbunden wird, versagt das Immunsystem des Patienten dabei, ihn als fremd zu erkennen. Die vorliegende Erfindung umfasst das Kontaktieren eines löslichen Antigens mit einer Zusammensetzung der Erfindung und das Reagieren eines bindenden Agens in der Zusammensetzung mit dem löslichen Antigen. Gemäß der Erfindung erzeugt das Binden des Antigens mit dem bindenden Agens eine Erkennung des Antigens durch den Wirt. Das Erzeugen der Erkennung durch den Wirt führt wiederum zur Einleitung einer Immunantwort gegen das Antigen.
Die vorliegende Erfindung ist mit der Entdeckung verbunden, dass das Binden eines bindenden Agens an ein vorherbestimmtes Epitop eines multiepitopischen tumorverbundenen Antigens das Antigen in einer solchen Weise verändert, dass das Immunsystem des Wirts das bisher unerkannte Antigen erkennen kann und eine Immunantwort darauf einleiten kann. In einer Ausführungsform der Erfindung bindet ein bindendes Agens an ein lösliches tumorverbundenes Antigen, wodurch dem Immunsystem des Wirts gestattet wird, eine Immunantwort gegen das Antigen zu erzeugen. Beispielsweise ist für die vorliegende Erfindung B43.13 veranschaulichend, ein bindender Agensantikörper, der am Epitop 43.13 spezifisch an das Eierstockkrebsantigen CA125 bindet. Wenn B43.13 an das Antigen CA125 bindet, wird entweder die Konformation des Antigens verändert oder das Antigen unterschiedlich verarbeitet und/oder geliefert, so dass es durch das Immunsystem des Wirts erkannt wird. Andere Beispiele beinhalten ohne Beschränkung darauf ein bindendes Agens, das spezifisch an CA19.9, ein mit Magen-Darm-Krebs verbundenes Magen-Darm-Antigen, bindet; und ein bindendes Agens das spezifisch an CA15.3, ein mit Brustkrebs verbundenes Antigen, bindet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die das bindende Agens B43.13 umfasst, wobei das bindende Agens selektiv an ein vorherbestimmtes lösliches Antigen bindet, und wobei ein derartiges Bindungsereignis zum Aufzeigen eines abweichenden Epitops auf dem Antigen führt, und das abweichende Epitop zu einer Immunantwort führt, die die Zellen, die das Antigen herstellten, hemmt oder tötet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung, die einen vorherbestimmten Antikörper umfasst, der spezifisch an ein vorherbestimmtes tumorverbundenes Antigen bindet, verwendet, um ein lösliches Antigen, das durch den Tumor erzeugt wurde, zu binden. Nachdem das lösliche Antigen gebunden ist, erkennt das Immunsystem das Antigen als "fremd" und stellt eine Immunantwort gegen das Antigen oder gegen das an das Antigen gebundene bindende Agens auf. Antigene, die immunogen gemacht werden können, sind potentiell nützlich, um eine Immunantwort hervorzurufen oder zu aktivieren, was zu therapeutischen und möglicherweise vorbeugenden Vorteilen führt.
Für Krankheiten, die teilweise dadurch gekennzeichnet werden können, dass sie ein tumorverbundenes Antigen aufweisen, das multiepitopisch ist, umfasst die vorliegende Erfindung das Kontaktieren eines löslichen Antigens mit einem bindenden Reagens, das spezifisch an ein einzelnes Epitop auf dem multiepitopischen tumorverbundenen Antigen bindet.
Das bindende Agens kann direkt gegen jedwedes Antigen von klinischer Bedeutung gerichtet werden, wird jedoch vorzugsweise gegen ein tumorverbundenes Antigen (TAA) gerichtet. Im Fall eines TAA kann der Krebs ohne Beschränkung darauf Lunge, Dickdarm, Mastdarm, Brust, Eierstöcke, Prostata, Kopf, Hals, Knochen, Immunsystem oder jede andere anatomische Stelle beinhalten. Das Subjekt kann ein menschliches oder ein tierisches Subjekt sein. Veranschaulichende Tumore oder Tumormarker sind in der US-Patentschrift 5,075,218 aufgelistet.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung umfasst jedweden Krebs, der ein lösliches multiepitopisches TAA erzeugt. Wie er hierin verwendet wird, wird der Ausdruck "löslich" verwendet, um jedwedes Antigen zu beschreiben, das in einer Körperflüssigkeit feststellbar ist, d. h., Blut, Serum, Aszites, Speichel o. ä. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten Tumore jene, die lösliche Tumorantigene abgeben, z. B. Tumorantigene, die in den Blutstrom abgegeben werden, im Gegensatz zu einem Oberflächenantigen oder einem intrazellulären Antigen; die ein multiepitopisches tumorverbundenes Antigen, vorzugsweise von Kohlehydrat- oder Glykoprotein- (z. B. Muzin)-Natur, zeigen; und die mit einer Konzentration in der Körperflüssigkeit des Patienten gefunden werden können, die höher als jene ist, die normalerweise in gesunden Kontrollen vorhanden ist, wobei eine solch hohe Konzentration eine nachteilige Prognose für den Patienten bedeutet, aber noch keine Immunantwort eingeleitet hat. Wie Fachleuten wohlbekannt ist, ist ein Verfahren, um zu bestimmen, ob die Konzentration des TAA größer als ein Wert ist, der ein Wiederauftreten der Krankheit vorhersagen lässt, ein Vergleich der Konzentration des Patienten mit einer gesunden Kontrolle. Wenn die Konzentration des TAA höher als die gesunde Kontrolle ist, lässt die Konzentration des Patienten eine nachteilige Prognose der Krankheit vorhersagen.
Ein bindendes Agens (BA), wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Mitglied in einem immunologischen Paar, z. B. einen bindenden Anteil, der fähig ist, an ein einzelnes Epitop, das auf dem Tumorantigen ausgedrückt ist, zu binden. Beispielhafte bindende Agentien beinhalten ohne Beschränkung darauf monoklonale Antikörper ("MAb"); chimärische monoklonale Antikörper ("C-MAb"); gentechnisch veränderte monoklonale Antikörper ("G-MAb"); Fragmente von monoklonalen Antikörpern (einschließlich, aber ohne Beschränkung auf "F(Ab)₂", "F(Ab)" und "Dab"); Einzelketten, die den reaktiven Anteil von monoklonalen Antikörpern darstellen ("SC-MAb"); tumorbindende Peptide; jedes der oben angeführten Beispiele verbunden mit einem Molekül, das eine Effektorfunktion vermittelt; und Nachahmungen eines jeden der oben angeführten Beispiele. Der Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper sein. Wenn das Subjekt ein menschliches Subjekt ist, kann der Antikörper durch Immunisierung eines jedweden Tiers, das fähig ist, eine verwendbare Immunantwort auf das Antigen aufzustellen, wie etwa eine Maus, eine Ratte, eine Ziege, ein Schaf, ein Kaninchen oder ein anderes geeignetes Versuchstier, erhalten werden. Im Fall eines monoklonalen Antikörpers können die, antikörpererzeugenden Zellen des immunisierten Tiers mit "unsterblichen" oder "unsterblich gemachten" menschlichen oder tierischen Zellen verschmolzen werden, um ein Hybridom zu erhalten, das den Antikörper erzeugt. Falls gewünscht, können die Gene, die eine oder mehrere der Immunglobulinketten codieren, geklont werden, so dass der Antikörper in verschiedenen Wirtszellen erzeugt werden kann, und falls gewünscht, können die Gene mutiert werden, um die Sequenz und somit die immunologischen Eigenschaften des erzeugten Antikörpers zu verändern. Fragmente, oder Fragmente von bindenden Agentien, können durch herkömmliche Techniken wie etwa durch proteolytischen Abbau des bindenden Agens unter Verwendung von Pepsin, Papain o. ä., oder durch DNA-Rekombinationstechniken, in denen DNA, die das gewünschte Fragment codiert, geklont und in einer Vielfalt von Wirten ausgedrückt wird, erhalten werden. Ein Bestrahlen der oben angeführten Einheiten z. B. durch ultraviolettes Licht wird die Immunantwort auf ein multiepitopisches Antigen unter ähnlichen Bedingungen verstärken. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Effektorfunktionen, die CDC oder ADCC vermitteln, nicht benötigt.
In einer Ausführungsform der Erfindung beinhaltet eine geeignete Zusammensetzung für ein eierstockkrebsverbundenes Antigen ein bindendes Agens, das das Antigen CA125 bindet. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung beinhaltet eine geeignete Zusammensetzung von Magen-Darm-Krebs ein bindendes Agens, das das Antigen CA19.9 bindet. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung beinhaltet eine geeignete Zusammensetzung für Brustkrebs ein bindendes Agens, das das Antigen CA15.3 bindet. Verschiedene bindende Agentien, Antikörper, Antigene und Verfahren zum Herstellen, Isolieren und Verwenden der Antikörper sind in der US-Patentschrift 4,471,057 (Koprowski) und in der US-Patentschrift 5,075,218 (Jette, et al.) beschrieben, die beide hier verweisend aufgenommen sind. Darüber hinaus sind viele dieser Antikörper von Centocor, Abbott Laboratories, Commissariat a L'Energie Atomique, Hoffman-LaRoche, Inc., Sorin Biomedica, und FujiRebio im Handel erhältlich.
Jede Zusammensetzung, die ein bindendes Agens gemäß der Erfindung beinhaltet, kann verwendet werden, um eine in-vivo-Immunantwort einzuleiten. Die Zusammensetzung kann ein oder mehrere Adjuvantien, einen oder mehrere Träger, einen oder mehrere Arzneimittelhilfsstoffe, einen oder mehrere Stabilisatoren, einen oder mehrere Bildgebungsreagentien und/oder eine physiologisch annehmbare physiologische Kochsalzlösung beinhalten. Im Allgemeinen sind Adjuvantien Substanzen, die mit einem Immunogen gemischt sind, um eine ausgeprägtere Immunantwort hervorzurufen. Kontrollimpfungen ohne das Adjuvans führten zu humoralen Immunantworten. Die Zusammensetzung kann auch pharmazeutisch annehmbare Träger beinhalten. Pharmazeutisch annehmbare Träger beinhalten ohne Beschränkung darauf eine physiologische Kochsalzlösung, steriles Wasser, eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung usw. Andere Puffermittel, Dispersionsmittel und inerte nichttoxische Substanzen, die zur Verabreichung an einen Patienten geeignet sind, können in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten sein. Die Zusammensetzungen können Lösungen sein, die zur Verabreichung geeignet sind, und sind kennzeichnenderweise steril und frei von unerwünschten partikulären Stoffen. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche Sterilisierungstechniken sterilisiert werden.
Gemäß der Erfindung muss das bindende Agens das tumorverbundene Antigen kontaktieren und binden und kann es dem Patienten durch jedweden immunologisch geeigneten Weg verabreicht werden. Beispielsweise kann das bindende Agens auf intravenösem, subkutanem, intraperitonealem, intradermalem, intramuskulärem oder intralymphatischem Weg, in Form einer Lösung, einer Tablette oder eines Aerosols in den Patienten eingebracht werden. Liposome, biologisch abbaubare Mikrosphären, Mizellen o. ä. können ebenfalls als Träger, Transportmittel oder Beförderungssystem verwendet werden. Darüber hinaus kann unter Verwendung von ex-vivo-Vorgangsweisen, die in der Technik wohlbekannt sind, Blut oder Serum des Patienten vom Patienten entnommen werden; optional kann es erwünscht sein, das Antigen im Blut des Patienten zu raffinieren. Das Blut oder Serum kann dann mit einer Zusammensetzung, die ein bindendes Agens gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, vermischt werden, und das behandelte Blut oder Serum wird in den Patienten zurückgeführt. Der Kliniker kann die mit diesen unterschiedlichen Wegen verbundenen anti-idiotypischen und anti-isotypischen Antworten vergleichen, um den wirksamsten Weg der Verabreichung zu bestimmen. Die Erfindung sollte nicht auf jedwedes besondere Verfahren des Einbringens des bindenden Agens in den Patienten beschränkt sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt die BA-Antigen-Wechselwirkung dem Immunsystem des Patienten die verbleibenden Epitope wirksam auf, um 1) eine humorale Antwort zu erzeugen, die zu menschlichen Anti-Tumor-Antikörpern führt, die durch den gespritzten Antikörper hemmbar oder nicht hemmbar sein können, aber zweifellos durch einen Antikörper, der an ein Epitop bindet, das sich von jenem Epitop unterscheidet, das mit dem gespritzten BA reaktionsfähig ist, hemmbar sind; und 2) eine zellvermittelte Antwort zu erzeugen, die zur Herstellung von antigenspezifischen zytotoxischen T-Zellen führt.
Das in der vorliegenden Erfindung umfasste bindende Agens bindet das multiepitopische Tumorantigen von Interesse, und das sich ergebende immunogene Paar kann verwendet werden, um eine Immunantwort auf ein anderes Epitop auf dem Antigen vorzubereiten oder einzuleiten. Wie in dieser Offenbarung anderswo ausführlicher bemerkt ist, wird angenommen, dass das Bindungsereignis zwischen dem bindenden Agens und dem multiepitopischen Antigen die Konformation des Antigens ausreichend verändert, um Zugang zu einem anderen vorher nicht erkennbaren Epitop auf dem Antigen zu bieten. Wenn es einmal durch Agentien des Immunsystems erkannt wurde, leitet das vorher nicht erkennbare Epitop die Immunsystemkettenreaktion ein, die zu einer Immunantwort auf das gesamte Antigen führt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Krebspatient mit einer Körperflüssigkeit, die ein endogenes lösliches multiepitopisches Antigen aufweist, durch Spritzen eines exogenen bindenden Agens behandelt, das sich an ein einzelnes Epitop des endogenen löslichen Antigens richtet. Nach dem Binden formt sich das Antigen um oder wird es unterschiedlich verarbeitet und/oder geliefert, was gestattet, dass dem Immunsystem des Patienten ein anderes Epitop auf dem Antigen aufgezeigt wird. Nach dem Aufzeigen beginnt und entwickelt das Immunsystem des Patienten eine humorale, zelluläre oder kombinierte humorale/zelluläre Antwort, die zum Abtöten und/oder Stillstand des Tumors führt. Der Beweis für den Erfolg der vorliegenden Erfindung ist in den Beispielen als verbesserte Überlebenszeiten gezeigt.
Ohne sich dadurch binden zu wollen, wird angenommen, dass ein handelnder Mechanismus für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Konformationsänderung von Seiten des durch ein bindendes Agens gemäß der vorliegenden Erfindung gebundenen löslichen Antigens umfasst. Es wird ferner angenommen, dass das Binden des Antigens mit einem bindenden Agens, das auf ein erstes Epitop auf dem Antigen gerichtet ist, die Konformation des Antigens ausreichend verändert, um ein zweites Epitop aufzuzeigen oder zu aktivieren. Es ist dieses zweite Epitop, gegen das das Immunsystem des Patienten antworten kann. Alternativ kann die Wechselwirkung des bindenden Agens und des Antigens zu einer differentiellen metabolischen Verarbeitung oder Lieferung an das Immunsystem in einer solchen Weise führen, dass ein zweites Epitop aktiviert wird.
Dosierung
Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Zusammensetzung, die ein bindendes Agens umfasst, in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, um das vorherbestimmte tumorverbundene Antigen zu erkennen und zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Dosierung ausreichend, um eine Immunantwort gegen das TAA zu erzeugen oder hervorzurufen. Eine immunologisch oder therapeutisch wirksame oder annehmbare Menge des bindenden Agens ist eine Menge, die ausreicht, um ein vorherbestimmtes Antigen in-vivo oder ex-vivo zu binden, und fähig ist, eine Immunreaktion auf das Antigen hervorzurufen. Die Antwort hemmt oder tötet Tumorzellen, die ein neu zugängliches Epitop tragen und aufzeigen, wodurch die Krankheit oder der Zustand, der das Antigen erzeugt, gebessert oder beseitigt wird. Die Immunantwort kann die Form einer humoralen Antwort, einer zellvermittelten Antwort, oder beide Formen annehmen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Dosierung des monoklonalen Antikörpers geringer als die Dosierung, die benötigt wird, um ADCC oder CDC hervorzurufen.
Die Konzentration oder Dosierung des bindendes Agens oder aktiven Agens in der Zusammensetzung kann sehr unterschiedlich sein, z. B. von weniger als etwa 0,01% bis etwa 15 bis 20% nach Gewicht. Wie oben erwähnt wurde, wird die Zusammensetzung in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um eine Immunantwort gegen das Antigen anzuregen. Für diese Verwendung wirksame Mengen werden teilweise von der Schwere der Krankheit und vom Zustand des Immunsystems des Patienten abhängen. Im Allgemeinen wird die Zusammensetzung etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg oder mehr des bindenden Agens pro Kilogramm Körpergewicht und gebräuchlicher Dosierungen von etwa 1 μg bis etwa 200 μg pro Kilogramm Körpergewicht enthalten. Die Konzentration wird normalerweise mindestens 0,5% betragen; und in erster Linie auf dem Flüssigkeitsvolumen, der Viskosität, der Antigenität usw. beruhend kann gemäß der besonderen Art der Verabreichung jedwedes Ausmaß gewählt werden.
Die Verabreichung kann mehr als ein Mal und vorzugsweise drei Mal über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgen. Da die Zusammensetzungen dieser Erfindung für Patienten mit einem ernsten Krankheitszustand, d. h., einem lebensbedrohenden oder möglicherweise lebensbedrohenden Zustand, verwendet werden können, kann ein Übermaß des bindenden Agens verabreicht werden, falls dies gewünscht ist. Tatsächliche Verfahren und Protokolle zur Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzung einschließlich Verdünnungstechniken für Spritzungen der vorliegenden Zusammensetzungen sind Fachleuten wohlbekannt oder werden ihnen offensichtlich sein. Einige dieser Verfahren und Protokolle sind in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co. (1982) beschrieben.
Ein bindendes Agens kann in Kombination mit anderen bindenden Agentien verabreicht werden oder kann in Kombination mit anderen Behandlungsprotokollen oder Agentien, z. B. chemotherapeutischen Agentien, verabreicht werden.
Die Wirksamkeit der bindenden Agentien der vorliegenden Erfindung kann in-vitro oder in-vivo überwacht werden. Humorale Antworten können durch herkömmliche Immunassays in-vitro überwacht werden, wobei die Anti-Tumor-Aktivität der Antwort durch komplementvermittelte zelluläre Zytotoxizitäts- und/oder antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizitäts(AD-CC)-Assays bestimmt werden kann. Die Assaymethodiken sind wohlbekannt und sind in Handbook of Experimental Immunology, Band 2, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1988) beschrieben. Andere Assays können darauf ausgerichtet sein, die Konzentration des Antigens im Patienten oder Gewebe zu bestimmen. Die zellvermittelte Immunität kann in-vivo durch die Entwicklung von verzögerten Überempfindlichkeitsreaktionen oder durch andere in-vivo- oder in-vitro-Mittel, die Fachleuten bekannt sind, einschließlich, aber ohne Beschränkung auf das Hauttestreaktionsprotokoll, Lymphozytenanregungsassays, Messen der Toxizität der Lymphozyten eines Subjekts hinsichtlich Tumorzellen unter Verwendung eines Standardradioaktivitätsfreisetzungsassays, durch ein beschränkendes Verdünnungsassay oder durch Messen der Plasmakonzentrationen von IL-2 unter Verwendung von Standard-ELISA-Assays überwacht werden.
Beispiele
Beispiel 1: Experimentelle Nachprüfung der Erzeugung einer Antikörperantwort gegen mehrere Epitope, die in einem Antigen vorhanden sind, durch Spritzen eines Antikörpers gegen ein einzelnes Epitop
Das Krebsantigen CA125, das auf mehr als 80% der Epitheleierstockkrebse ausgedrückt wird, wird als Beispiel verwendet, um die vorliegende Erfindung zu zeigen.
CA125 weist mehrere Epitope auf, die durch unterschiedliche Antikörper wie, unter anderem, OC125, M11, B43.13 und B27.1 erkannt werden. Bei der vorliegenden Erfindung wurde MAb-B43.13 verwendet um eine CA125-spezifische Immunantwort zu erzeugen, die die Erkennung des Epitops B27.1 beinhaltete.
Verfahren: 86 Eierstockkrebspatienten mit aktiver Krankheit wurden hinsichtlich des Vorhandenseins von Antikörpern gegen CA125 untersucht. Keiner der Patienten wies vor dem Spritzen von MAb-B43.13 Antikörper gegen CA125 auf. Den Patienten wurden in unterschiedlichen Zeitabständen 2 mg MAb-B43.13 gespritzt (siehe Tabelle 1 für einige der Patienten). Seren von diesen Patienten wurden durch ihre Fähigkeit, an CA125 zu binden, hinsichtlich des Vorhandenseins von menschlichen Anti-CA125-Antikörpern analysiert [R. Madiyalakan, et al., Hybridoma, 14: 199–203, 1995)]. Derartige Anti-CA125-Antikörper wurden ferner nach ihrer Fähigkeit, das Epitop B43.13 oder das Epitop B27.1 zu hemmen, als gegen das entsprechende Epitop auftretend klassifiziert. Das Grundprinzip für die Klassifizierung stammt aus der Tatsache, dass Anti-CA125-Antikörper in diesen Patienten durch einen der folgenden beiden Wege erzeugt worden wären:

1) Wenn die Anti-CA125-Antikörper auf die Weise erzeugt worden wären, die durch die oben erwähnte Netzwerktheorie vorgeschlagen wird, würde der Weg Ab1 → Ab2 → Ab3 folgen. Diesem Schema folgend würde MAb-B43.13 (Ab1) einen Anti-Idiotyp gegen MAb-B43.13 (Ab2) erzeugen, der wiederum einen Anti-Anti-Idiotyp gegen MAb-B43.13 (Ab3; oder Anti-Anti-CA125-Antikörper) erzeugen würde. Darüber hinaus würden die Ab3-Antikörper, die auf diesem Weg erzeugt worden wären, nur an MAb-B43.13 binden und dadurch gehemmt werden, da das Epitop B43.13 das einzige vorhandene Epitop ist.
2) Wenn die Anti-CA125-Antikörper auf eine Weise erzeugt worden wären, die durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagen wird, würde der Weg AB1 + lösliches Antigen → Ab3' folgen. Diesem Schema folgend würde MAb-43.13 (Ab1) das CA125-Serumantigen binden, das wiederum einen Anti-CA125-Antikörper (Ab3') erzeugen würde. Darüber hinaus würden die Ab3'-Antikörper, die auf diesem Weg erzeugt worden wären, BA27.1 Antikörper binden und dadurch gehemmt werden, da, wie oben erwähnt wurde, CA125 multitepitopisch ist und die Epitope B43.13 und B27.1 unterschiedlich sind. Ab3' wird auch nicht an Anti-MAb-B43.13-Antikörper binden.

Wenn das Serum des Patienten Anti-CA125-Antikörper enthielt, die durch MAb-B43.13 hemmbar waren, wurde es somit als Ab3-haltig klassifiziert, während die durch MAb-B27.1 hemmbaren Seren als Ab3' klassifiziert wurden.
Ergebnisse
Vierzehn Patienten entwickelten als Antwort auf die MAb-B43.13-Spritzung Anti-CA125-Antikörper in ihren Seren (Tabelle 1). Zehn dieser vierzehn Patienten wiesen Ab3' auf, während nur zwei Patienten Ab3-Antikörper in ihren Seren aufwiesen. Zwei Patienten wiesen beide Antikörper auf. Das Vorhandensein von Ab3 in ihren Seren wurde auch durch die Fähigkeit dieser Antikörper, an den raffinierten Kaninchen-Anti-MAb-B43.13-Antikörper zu binden, bestätigt. Es gab zwei Patienten (Nr. 2 und Nr. 7), die Anti-CA125-Antikörper aufwiesen, aber nicht durch MAb-843.13 oder MAb-B27.1 hemmbar waren, was darauf hindeutet, dass sie Antikörper gegen CA125 aufweisen können, die andere Epitope als B43.13 oder 827.1 erkennen.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich an, dass dann, wenn ein Antikörper gegen ein einzelnes Epitop (B43.13) in einen Patienten gespritzt wurde, eine Antikörperantwort gegen das gesamte Antigen erzeugt wird, die unterschiedliche Epitope, die im Antigen vorhanden sind, erkennt. Das Vorhandensein von Ab3 in manchen Patienten könnte durch das wahrscheinliche Vorhandensein von übermäßigem BA43.13-Epitop im CA125 aufgrund einer unzureichenden Bindung des Antikörpers an dieses Epitop oder Idiotypeninduktion durch den Weg I erklärt werden. Nichtsdestotrotz scheint der vorherrschende Mechanismus der Antwort über Weg II zu erfolgen. Mit anderen Worten erzeugt das Spritzen eines monoklonalen Antikörpers zu einem löslichen multiepitopischen Antigen in einen Patienten, der ein funktionierendes Immunsystem aufweist, einen Antikörper zum Antigen, wobei der erzeugte Antikörper durch Antikörper zu anderen Epitopen gehemmt wird.
TABELLE 1
Beispiel 2
In pharmazeutischen Untersuchungen wurden Blutproben vor und in ausgewählten Abständen nach der MAb-B43.13- Spritzung hinsichtlich der CA125-Konzentration analysiert. Bei Patienten mit erhöhten CA125-Konzentrationen vor der Spritzung konnte sofort nach der MAb-B43.13-Spritzung ein deutlicher Abfall bei den zirkulierenden CA125-Konzentrationen erkannt werden (Tabelle 2). Dies zeigte klar, dass das bindende Agens nach der Einbringung in den Körper in eine Wechselwirkung tritt und das zirkulierende CA125 entfernt.
TABELLE 2
Darüber hinaus wird ein Antigen, das mit einem Antikörper zusammengesetzt ist, dem Immunsystem wirksam aufgezeigt und erzeugt es eine bessere antigenspezifische humorale und zelluläre Antwort. Dies wurde durch die folgenden Versuche, die in Beispiel 3 und 4 gezeigt sind, veranschaulicht.
Beispiel 3
Balb/c-Mäuse wurden alle drei Wochen entweder mit 10 μg MAb-B43.13 in PBS, intravenös; 10.000 Einheiten CA125 in PBS, intravenös; oder 10 μg MAb-B43.13 und 10.000 Einheiten CA125 in PBS, intravenös, immunisiert, wobei insgesamt drei Spritzungen vorgenommen wurden. Das Verhältnis in der B43.13/CA125-Spritzung war jenem ähnlich, das bei Patienten mit erhöhten CA125-Konzentrationen beobachtet wurde, wie es auf Basis der in Tabelle 2 angegebenen pharmakokinetischen Daten bestimmt wurde. Bei einer Analyse der Mausseren hinsichtlich Anti-CA125-Antikörperkonzentrationen wiesen die Mäuse, denen der Antigen-Antikörper-Komplex gespritzt wurde, den höchsten Titer auf. Die Anti-Idiotypen-Induktionen in diesen Balb/c-Mäusen sind in 1 graphisch dargestellt. Dies unterstützt die Beobachtung, dass die Wechselwirkung des bindenden Agens und des Antigens verglichen mit nur dem bindenden Agens oder nur dem Antigen zu einer besseren antigenspezifischen humoralen Immunantwort führt.
Beispiel 4
In gleicher Weise wurde eine bessere zelluläre Immunantwort beobachtet, wenn das bindende Agens den T-Zellen in Verbindung mit dem Antigen aufgezeigt wurde. So wurden Makrophagen, die aus den Mausbauchfellhöhlen isoliert wurden, nur mit MAb-B43.13; nur mit CA125; einem MAb-B43.13-CA125-Komplex; oder Kontroll-MAb-CA125 angeregt und CA125-spezifischen Maus-T-Zellen (die aus Mäusen isoliert wurden, denen CA125 gespritzt wurde) aufgezeigt. Wenn der wie durch eine [³H]-Thymidinaufnahme überwachten starken Vermehrung der T-Zellen gefolgt wurde, wurde in Makrophagen, die mit dem Antikörper-Antigen-Komplex angeregt wurden, ein optimaler Anregungsindex beobachtet (2).
Beispiel 5
Die Schlussfolgerung in Beispiel 1 wurde ferner durch die Feststellung einer Korrelation zwischen den Serum-CA125-Konzentrationen in Patienten, denen MAb-B43.13 gespritzt wurde, und der menschlichen Anti-CA125-Antikörpererzeugung gestützt. Die Feststellungen sind in Tabelle 3 gezeigt und stützen die Schlussfolgerung, dass das Antigen im Serum für eine Wechselwirkung des bindenden Agens vorhanden sein sollte. Eine solche Wechselwirkung führt zu einer antigenspezifischen humoralen Antwort.
TABELLE 3
Beispiel 6
Die Rolle des Serumantigens beim Hervorrufen einer multiepitopischen Antikörperantwort als eine Folge einer Antikörperspritzung wurde ferner durch Untersuchungen an Kaninchen bestätigt. Kaninchen, die keinerlei Serum-CA125 enthielten, wenn ihnen MAb-B43.13 gespritzt wurde, erzeugten Anti-CA125-Antikörper, die durch B27.1 nicht hemmbar waren. Im Gegensatz dazu erzeugen Eierstockkrebspatienten mit hohen Serumantigen-CA125-Konzentrationen als Antwort auf eine MAb-B43.13-Spritzung Anti-CA125-Antikörper, die durch BA27.1 hemmbar sind.
Beispiel 7: Experimentelle Nachprüfung der Induktion einer antigenspezifischen Anti-Tumor-Antwort durch Antikörperspritzung
Der menschliche Anti-CA125-Antikörper erzeugt durch eine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität ("ADCC") einen Tumorzellenzerfall. Obwohl das gespritzte MAb-B43.13 nicht selbst einen ADCC und/oder komplementabhängigen zytolyse("CDC")vermittelten Zerfall von Eierstocktumorzellen verursacht, führt die Erzeugung von Anti-CA125-Antikörpern in Patienten, denen MAb-B43.13 gespritzt wurde, zu einem Tumorzellenzerfall (siehe 3). Dies wurde in einem ⁵¹Chromfreisetzungsassay durch Inkubieren der markierten Eierstocktumorzellen mit Effektorzellen und Seren von sechs Patienten, denen MAb-B43.13 gespritzt wurde, untersucht. Dies unterstützt die Schlussfolgerung, dass das Spritzen eines bindenden Agens zu seiner Wechselwirkung mit dem Antigen führt, wobei eine spezifische humorale Antwort zu Anti-CA125-Antikörpern führt, die durch ADCC einen Tumorzellenzerfall verursachen. Die Ergebnisse zeigten klar die Erzeugung einer antigenspezifischen Anti-Tumor-Antwort nach dem Spritzen des Antikörpers.
Beispiel 8: Erzeugung von CA125-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten in Patienten, denen MAb-B43.13 gespritzt wurde.
In gleicher Weise führt die Spritzung des bindenden Agens bei Krebspatienten, die CA125 enthalten, zu antigenspezifischen CTLs. Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) von acht Patienten, denen MAb-B43.13 gespritzt wurde, wurden in einem Chromfreisetzungsassay hinsichtlich der Zytotoxizität gegen CA125-positive oder CA125-negative Eierstocktumorzellen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Spezifität wurde durch die Fähigkeit des MAb-B43.13, einen solchen Zerfall zu hemmen, wie auch durch die Unfähigkeit, CA125-negative Tumorzellen zu töten, bestätigt. Von den acht Patienten, die MAb-B43.13 erhielten, wurden zumindest vier Patienten (Nr. 5 bis Nr. 8) als in ihrem Blut CA125-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) aufweisend bestimmt. Die Erzeugung von CA125-spezifischen CTLs tötet wahrscheinlich Eierstocktumorzellen in Patienten.
TABELLE 4
Die Ergebnisse sind der Mittelwert eines in dreifacher Ausführung durchgeführten Experiments
Beispiel 9
Das Töten des Tumors entweder durch einen anti-CA125-antikörpervermittelten ADCC-Mechanismus oder durch CA125-spezifische CTLs führt zu einem erhöhten Überleben bei Patienten, denen MAb-B43.13 gespritzt wurde. Obwohl hohe Konzentrationen von Serum-CA125 andeuteten, dass sie ein Anzeichen einer nachteiligen Prognose sind, scheinen sie bei derartigen Patienten in Kombination mit der Spritzung von Anti-CA125-Antikörpern eine vorteilhafte Wirkung aufzuweisen. Wenn die CA125-Konzentrationen beispielsweise höher als 100 Einheiten/ml betrugen, stieg die Immunantwort gegen CA125 um mehr als 20%, was wiederum das mittlere Überleben bei diesen Patienten von 39,1 Monaten auf 54,5 Monate erhöhte (Tabelle 5). Somit führt die Spritzung eines bindenden Agens bei einem Patienten, der erhöhte Konzentrationen eines multiepitopischen löslichen Antigens enthält, zu einer antigenspezifischen humoralen und zellulären Antwort, die wiederum zu einem Töten des Tumors gefolgt von einem verbesserten Überleben führt.
TABELLE 5
Beispiel 10
Einem Bauchspeicheldrüsenkrebspatienten, bei dem eine metastasische Krankheit diagnostiziert wurde, wurde wiederholt eine Zusammensetzung gespritzt, die einen Anti-CA19.9-Antikörper enthielt. Der Patient erhielt keine andere Behandlung und überlebte 22 Monate nach der ursprünglichen Diagnose (19 Monate nach der Operation und der Spritzung). Im Vergleich dazu steht die gegenwärtige Schätzung der Überlebensdauer von sechs Monaten nach der ursprünglichen Diagnose.
Beispiel 11
Fachleute erkennen, dass die verabreichte Dosierung beruhend auf einem weiten Satz von unterschiedlichen Umständen sehr unterschiedlich sein kann. Im Folgenden werden vorläufige Dosierungsrichtlinien bereitgestellt.
Eine rückblickende Analyse von mehr als einhundert Patienten, denen bis zu zehn Mal eine Dosis von 2 mg MAb-B43.13 gespritzt wurde, zeigte an, dass einige dieser Patienten a) einen ungewöhnlichen Verlauf ihrer Krankheit zeigten, der durch unerwartet lange Überlebenszeiten gekennzeichnet war; und b) keine bedeutende Nebenreaktion oder Toxizität erfuhren.
Es wurden immunologische Untersuchungen vorgenommen, um den in-vivo-Mechanismus der Wirkung von MAb-B43.13 zu verstehen und zu bewerten. Diese Untersuchungen zeigten an, dass das Ausmaß der anti-idiotypischen Induktion bei Patienten, denen eine Dosis von 2 mg MAb-B43.13 gespritzt wurde, in keiner Beziehung zur Anzahl der Spritzungen oder dem klinischen Stadium ihrer Krankheit stand. Die antiidiotypische Induktion ist jedoch von den Konzentrationen des zirkulierenden CA125, das in den Seren der Patienten vorhanden war, abhängig. Zusätzliche Experimente zeigten, dass die Spritzung von MAb-B43.13 in Patienten mit messbarem Serum-CA125 zur Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen führte, was zu einem Aufzeigen von Antigenepitopen und einer antigenspezifischen humoralen und zellulären Antwort auf den Tumor führte.
Diese Untersuchungen zeigen an, dass eine wirksame Dosis nur genügend Antikörper benötigt, um dem Immunsystem alle möglichen zirkulierenden CA-125-Antigene optimal zu liefern und aufzuzeigen. In-vitro-Untersuchungen zeigten an, dass 1 ng MAb-B43.13 zehn Einheiten von CA125 binden kann. Wenn 40 ml Plasma pro ein Kilogramm Körpergewicht angenommen werden, kann das Spritzen von 2 mg MAb-B43.13 in einen Patienten mit einem Gewicht von 80 kg annähernd 8333 U/ml CA125 im Serum binden. Da alle bis dato untersuchten Eierstockkrebspatienten weit weniger als 8333 U/ml CA125 im Serum aufwiesen, ist ein Spritzen von 2 mg MAb-B43.13 mehr als ausreichend, um die erforderliche Immunantwort auszulösen. Zusätzlich waren die Ergebnisse des Abbildens bei Patienten, die zur immunszintographischen Bestätigung der Krankheit radioaktiv markiertes MAb-B43.13 erhielten, trotz hoher Serum-CA125-Werte ausgezeichnet, was andeutet, dass übermäßiges MAb-B43.13 für eine spezifische Tumoraufnahme vorhanden ist.
Darüber hinaus scheinen mehrere Spritzungen in ausgewählten Abständen einen optimalen Nutzen für die Patienten bereitzustellen, da CA125 über den Verlauf der Krankheit hinweg erzeugt wird.
Schließlich zeigte die rückblickende Analyse, dass die Dosis von 2 mg eine therapeutische Wirksamkeit aufzuweisen scheint; keiner der Patienten (>100) entwickelte jedwede ernsten Nebenwirkungen oder Nebenreaktionen. Wenn die gesamte HAMA-Antwort ein Anzeichen einer anti-idiotypischen Induktion ist, erzeugt eine Dosis von 2 mg deutliche Konzentrationen von antiidiotypischen Antikörpern, um den gewünschten therapeutischen Nutzen zu erzeugen. Mehrere Spritzungen von 2 mg MAb-B43.13 in ausgewählten Abständen scheinen die anti-idiotypischen Antikörper bei der gewünschten therapeutischen Konzentration zu halten, ohne jedwede isotypische HAMA-induzierte Toxizität zu verursachen.
Ein Bereich wirksamer Dosen oder einer therapeutisch annehmbaren Menge von MAb-B43.13 beinhaltet daher 2 mg, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die hervorragenden Ergebnisse, die nach einem Immunisieren von Mäusen mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, verglichen mit anderen Zusammensetzungen.
2 zeigt die hervorragende Makrophagenanregung, die durch eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verursacht wurde, verglichen mit anderen Zusammensetzungen.
3 zeigt den Tumorzellenzerfall, der durch Verabreichen einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verursacht wurde.
Industrielle Anwendbarkeit
Die ein bindendes Agens umfassenden Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung sind insbesondere in Zusammensetzungen nützlich, die eine immunogene oder therapeutische Menge von zumindest einem der bindenden Agentien der Erfindung beinhalten. Eine immunogene oder therapeutische Menge ist eine Menge, die im Wirt eine Immunantwort von humoraler, zellulärer oder kombinierter humoraler und zellulärer Natur anregt. Die Immunantwort des Wirts umfasst eine erhöhte Aktivität gegen ein Epitop auf einem tumorverbundenen Antigen, das sich von jenem Epitop an das das bindende Agens bindet, unterscheidet. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden als Anti-Tumor-Impfstoffe an Subjekte, bei denen eine Gefährdung der Entwicklung einer Bösartigkeit besteht, oder an Subjekte, die eine Diagnose der Bösartigkeit zeigen, verabreicht. Diese Zusammensetzungen können verwendet werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen, die eine Immunantwort hervorruft.

Claims

Therapeutische Zusammensetzung mit einem bindenden Agens, das spezifisch für ein erstes Epitop auf einem multiepitopischen in-vivo-Antigen ist, welches im Serum des Wirts vorhanden ist, wobei das Antigen keine effektive Antwort im Immunsystem des Wirts hervorruft, dadurch gekennzeichnet, dass das in der Zusammensetzung vorhandene bindende Agens der monoklonale Antikörper B43.13 ist, der spezifisch an ein erstes Epitop auf dem Antigen bindet, wobei ein Paar aus dem bindenden Agens und dem Antigen entsteht, wodurch eine effektive Immunantwort des Wirts gegen ein zweites Epitop auf dem Antigen hervorgerufen wird.
Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das B43.13 in der Zusammensetzung in einer Menge von 0,1 μg bis 2 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Wirts, vorzugsweise 1 μg bis 200 μg pro Kilogramm Körpergewicht des Wirts, vorhanden sein soll.
Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Antigen um CA125 handelt, wobei die Konzentration des CA125 im Wirtsserum vorzugsweise größer als 100 E/ml ist.
Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das bindende Agens einer Strahlung, vorzugsweise einer ultravioletten Strahlung, ausgesetzt wurde.
Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein oder mehrere Adjuvantien, ein oder mehrere Träger, einen oder mehrere Arzneimittelhilfsstoffe, einen oder mehrere Stabilisatoren, ein oder mehrere Bildgebungsreagentien, einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder physiologische Kochsalzlösung umfasst.
Verwendung der therapeutischen Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs beim Menschen.
Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, die für die Verabreichung an den Wirt auf einem immunologisch geeigneten Weg geeignet ist, vorzugsweise auf intravenösem, subkutanem, intraperitonealem, intradermalem, intramuskulärem und/oder intralymphatischem Weg.
Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und 7, wobei die Zusammensetzung in Form einer Lösung, Tablette und/oder eines Aerosols verabreicht werden soll.