DE69632998T2 - Hochempfindliches, genaues und präzises automatisiertes Messverfahren und Vorrichtung zur Identifizierung und Quantifizierung von Blutplättchen und zur Bestimmung des Blutplättchenaktivitätszustands unter Verwendung von Ganzblutproben - Google Patents

Hochempfindliches, genaues und präzises automatisiertes Messverfahren und Vorrichtung zur Identifizierung und Quantifizierung von Blutplättchen und zur Bestimmung des Blutplättchenaktivitätszustands unter Verwendung von Ganzblutproben Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren der Plättchen-Analyse und von deren quantitativer Bestimmung mit automatisierten Hämatologie-Systemen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Hoch-Gewinnungsverfahren, das sowohl für normale als auch abnorme Blutproben anwendbar ist, um unter anderen Parametern die Plättchenzahl, das Plättchenvolumen, die Konzentration oder Dichte der Plättchenkomponenten und die Trockenmasse der Plättchen mit einem höheren Genauigkeits- und Präzisionsgrad im Vergleich mit anderen Verfahren zu bestimmen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Obwohl halb- und vollautomatisierte Analysiersysteme nun routinemäßig zur Bestimmung der Blutplättchenzahlen angewandt werden, ist es im Stand der Technik anerkannt, dass die geläufigen automatisierten Plättchenbestimmungs- und -messverfahren noch durch Probleme der Ungenauigkeit sowie des Fehlens der Präzision und Reproduzierbarkeit beeinträchtigt sind. Dies ist besonders auffällig bei der Analyse abnormer Blutproben, wie denjenigen, die von Personen oder Patienten erhalten werden, die an vielerlei Blutdyskrasien und thrombotischen Störungen, wie an Thrombozytopenie (einem Absinken der Anzahl der Blutplättchen), an Thrombozytosie und dergl. leiden. Mehrere Gründe für die Schwierigkeiten und Herausforderungen bei der Steuerung der Genauigkeit von Plättchen-Zählungen können 1) dem großen dynamischen Bereich der Plättchenzahl und -größe bei den Patienten, 2) der kleinen Größe der Plättchen, 3) der Gegenwart von mit der Plättchengröße interferierenden Partikeln in den Analysenproben und 4) dem Verhalten der Partikel bei einer in vitro-Alterung zugeschrieben werden.
  • Die Analyse und quantitative Bestimmung von Plättchen kann besonders schwierig im Fall von Personen mit Thrombozytopenie sein, die verringerte oder niedrige Anzahlen der Plättchen in ihren Blutproben aufweisen. Dieser Zustand resultiert häufig aus Behandlungen und Therapien, die gewöhnlich für Krebs-Patienten angewandt werden, die abgesenkte thrombotische Tendenzen aufweisen. Außerdem erleiden Personen, die an bestimmten immunologischen Krankheiten, insbesondere an Autoimmunkrankheiten, wie idiopathischem thrombozytopenischen Purpur (ITP), leiden, oft einen Schaden und eine Zerstörung der Plättchen, was zu abgesunkenen Plättchenzahlen führt. Ferner weisen Personen, die an aplastischer(n) Anämie(n) leiden, ebenfalls verrin gerte Zahlen der Blutplättchen auf. Beispielsweise betragen in Proben von Personen mit Thrombozytopenie die Plättchenzahlen oft weniger als 50.000/Tl, verglichen mit Plättchenzahlen im Normalbereich, die in der Größenordnung von ca. 150.000 bis 400.000/Tl liegen (J. C. Dacie und S. M. Lewis, 1989, Practical Haematology, 6. Ausgabe, Churchill Livingstome, London).
  • Tatsächlich wird die genaue Zählung der Plättchen sogar noch wichtiger mit dem Erscheinen breit verfügbarer Plättchenersatztherapien für Patienten mit Thrombozytopenie. Außerdem macht die Entwicklung und Anwendung einer Vielzahlausgeklügelterer Studien der Plättchen-Funktion, z. B. von Aktivierungs- und/oder Klebekraftbestimmungen der Plättchen, genaue und präzise Plättchen-Zählungen als integralen Bestandteil von Labor-Hämatologie-Tests erforderlich. Auch macht es die Qualitätssicherung von Plättchen-Packungen, die für eine Transfusion zubereitet sind, erforderlich, dass genaue Plättchen-Zählverfahren vor Ort verfügbar sind (R. K. Wertz und J. A. Koepke, 1977, Am. J. Clin. Path. 68 (1): 195–201).
  • Im Stand der Technik werden genauere, präzisere und empfindlichere Verfahren zum Nachweis, zur Unterscheidung, quantitativen Bestimmung und zur Charakterisierung der Plättchen-Parameter sowohl für normale als auch für abnorme Blutproben benötigt. Außerdem kann mit genauen und präzisen Plättchen-Analysenverfahren, die an Vollblutproben durchgeführt werden, die anfängliche Zubereitung von Plättchen-reichem Plasma mittels Differenzialzentrifugations-Sedimentationstechniken, die bei einigen Verfahren erforderlich sind, umgangen werden. Derartige Vollblut-Plättchen-Analysenverfahren können zur Diagnose unvermuteter Plättchenabnormitäten sowie zur Aufzeichnung und Verfolgung von Plättchen-Zählungen und -Parametern normaler Einzelpersonen und von Patienten beim Einsetzen einer Störung oder während des Behandlungsverlaufes oder dem Fortschreiten einer Krankheit zweckdienlich sein. Außerdem werden Verfahren zur Anwendung an automatisierten Systemen im Stand der Technik benötigt, die eine Signalauflösung und die Unterscheidung der Plättchen, insbesondere in Fällen niedriger Plättchenzahlen, zu verbessern vermögen. Die vorliegend beschriebene Erfindung zeigt und ergibt derartige Vorteile und Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik.
  • Zwei voll-automatisierte Plättchen-Zähl- und -Größenmessverfahren sind derzeit bekannt und werden im Stand der Technik angewandt. Das eine ist das Öffnung-Impedanzverfahren. Vollblut-Plättchen in wässriger Suspen sion werden nachgewiesen, während und wobei sie durch eine enge Öffnung zwischen zwei Elektroden gehen, wodurch die elektrische Impedanz (der elektrische Scheinwiderstand) in der Öffnung relativ zu derjenigen des Suspendiermediums in grobem Verhältnis zum Plättchenvolumen erhöht wird. Somit ergeben die Plättchen-Pulse die Plättchenzahl und das Plättchenvolumen. Die Plättchen werden von roten Blutzellen im Öffnung-Impedanzverfahren auf der Grundlage ihrer Größe unterschieden, da Plättchen als Gruppe kleiner als rote Blutzellen als Gruppe sind. In einigen Anwendungsfällen dieses Verfahrens werden Plättchen-Zähl- und Größenbestimmungen durch mathematische Analyse der Plättchengrößen-Verteilungen verfeinert. Diese Verteilungen werden log-normalen Kurven angepasst, und die Parameter der angepassten Kurven ergeben die Plättchenzahl und -größe. Obwohl es die Absicht dieser Vorgehensweise ist, Partikel-Müll und kleine rote Blutzellen auszuschließen, deren Vorliegen die log-normale Plättchenvolumen-Verteilung verzerrt, werden solche kontaminierenden Partikel und Zellen nicht immer ausgeschlossen.
  • Ein zweites halb-automatisiertes Verfahren ist das Laserlicht-Streuverfahren. In diesem Verfahren werden Vollblut-Plättchen in wässriger Suspension nachgewiesen, während und wobei sie einen Laserstrahl schneiden, wodurch das einfallende Licht unter charakteristischen Winkeln in Wege gestreut wird, in denen optische Detektoren vorliegen. Die Plättchen-Signalpulse ergeben eine Volumeninformation sowie Zählwerte, da das Plättchenvolumen als proportional zur Streuintensität erachtet wird. Beispiele automatisierter Fließ-Zytometriegeräte, die entworfen worden sind und angewandt werden, um solche Lichtstreuungsverfahren durchzuführen, sind die H·-System-Geräte (die im Handel unter der Handelsbezeichnung TECHNICON H·-Systeme, z. B. H·1, H·2, H·3 und dergl., erhältlich sind und von der hier auftretenden Anmelderin verkauft werden) und das ORTHO ELT-8 (Ortho Diagnostics).
  • Im ORTHO ELT-8-System werden die Plättchen von den roten Blutzellen ganz einfach durch die Unterschiede bei der Streuintensität über einem Einzelkegelwinkel unterschieden. In den TECHNICON H·-Systemen werden die Plättchen auch bezüglich ihrer Größe auf der Grundlage der Streuintensität über einem Einzelkegelwinkel erfasst und gemessen; allerdings werden sie von den roten Blutzellen auf der Grundlage der charakteristischen Streuintensitäten in einem Paar geeignet gewählter Detektoren unterschieden. Obwohl die Plättchen-Streuungsintensitätsverteilung log-normal ist, verfeinert das zweite Laserlicht-Streuverfahren die Zähl- oder Größenwerte nicht durch Anpassung der mit log-normalen Kurven erhaltenen Daten. Partikel-Müll ist in diesem Verfahren aus Signalen zusammengesetzt, deren Streuintensitäten unter einen ausgewählten Schwellenwert fallen.
  • Wie oben erwähnt, unterscheidet das Öffnung-Impedanzverfahren Plättchen von roten Blutzellen und Partikel-Müll auf der Grundlage der Plättchengröße sowie auf der Grundlage der log-normalen Verteilung der Plättchengrößen. In Fällen, in denen Plättchen und weitere Partikel eine sich überlappende Größe aufweisen, verschwimmen diese Unterscheidungen und das beste, was mit diesem Verfahren bewerkstelligt werden kann, ist es, dieses Versagen zu erkennen. Außerdem unterscheidet das Licht-Streuverfahren Plättchen von roten Blutzellen, bezogen auf zweidimensionale Grenzen, die sich kreuzen können, wenn rote Blutzellen klein werden oder sich fragmentieren, wodurch die Unterscheidung zwischen den disparaten Zellpopulationen ebenfalls verschwimmt.
  • Ein drittes halb-automatisiertes Verfahren zur Unterscheidung von Plättchen beinhaltet eine Kombination der Laserlichtstreuung und -fluoreszenz zur Unterscheidung der Plättchen von roten Blutzellen und Partikelmüll. Vollblut-Plättchen in wässriger Suspension werden mit Plättchen-spezifischen Antikörpern, wie mit CD42A, markiert. Die Antikörper werden ihrerseits an Fluorophore, wie an Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) gebunden. Die markierten Plättchen streuen einfallendes Licht und fluoreszieren, während und wobei sie durch ein Fluoreszenz-Fließzytometer, wie ein Becton Dickinson FACScan (Becton Dickinson), gehen. Die Plättchen und Partikel in Plättchengröße werden von den roten Blutzellen auf der Grundlage zweidimensionaler Streuungsmuster (Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung) unterschieden. Diese "versperrten" Zellen werden ferner auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität klassifiziert, wobei nur die Plättchen eine signifikante Fluoreszenz zeigen und ergeben (W. Groner et al., 1994, Blood, Nr. 10 Supplement, 687a; R. Dickerhof und A. von Ruecker, 1995, Clin. Lab. Hematol., 17: 163–172).
  • Obwohl die letzten beiden oben beschriebenen Verfahren eine Unterscheidung der Plättchen von weiteren Blutzell-Typen und von Müll ermöglichen, ergeben sie keine absoluten Plättchenzahlen. Ferner wird mit ihnen die Plättchengröße nicht bestimmt, da es keinen einfachen Weg gibt, die Verfahren und die Systeme zur Durchführung der Verfahren für diesen Zweck zu zeichen. Außerdem ist die Markierungstechnik Labor-intensiv und relativ teuer.
  • Zusätzlich zur Unterscheidung und quantitativen Bestimmung von Plättchen in Blutproben werden einfache, preiswerte, genaue und reproduzierbare Verfahren zur Bestimmung der Plättchen-Aktivierung (oder des Aktivierungszustands) im Stand der Technik benötigt. Der Aktivierungszustand von Plättchen ist ein wichtiger Parameter der Plättchen-Funktion, wie dies im folgenden beschrieben wird.
  • Die Aktivierung von Plättchen ist eine fundamentale Funktionseigenschaft der Plättchen, da aktivierte Plättchen eine integrale Rolle bei Hämostasis und Thrombose spielen. Bei einer Gefäßverletzung werden subendotheliale Oberflächen an der Verletzungsstelle dargelegt, was dazu führt, dass aktivierte Plättchen an der subendothelialen Oberfläche kleben. Darauf folgen eine Plättchenkernefreisetzung, Plättchenaggregation und eine Thrombusbildung. Thromben sind aus Fibrin, Plättchenaggregaten und roten Blutzellen zusammengesetzt.
  • Aktivierte Plättchen unterscheiden sich von restlichen Plättchen dadurch, dass die ersteren Oberflächenglycoproteine exprimieren, die mit dem Klebevorgang zusammenhängen. Auch setzen aktivierte Plättchen kernige Komponenten frei und unterliegen solchen Vorgängen, wie der Scheibe-zu-Kugel-Formänderung und der Aggregation. Eine Quellung ist ebenfalls mit der Formänderung verbunden.
  • Thrombose ist Teil der Normalreaktion auf eine Gefäßverletzung. Jedoch tritt auch eine gesteigerte thrombotische Aktivität auf, mit negativen Auswirkungen auf Krankheitsbedingungen, wie peripherale Gefäßkrankheiten (D. V. Devine et al., 1993, Arteriosclerosis and Thrombosis, 13: 857–62), Herzischämie (D. McTavish et al., 1990, Drugs, 40: 238; G. DiMinno et al., 1985, J. Clin. Invest., 75: 328), Diabetes mellitus (D. Toschoepe et al., 1991, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 17: 433–438) und Angina (R. C. Becker et al., 1994, Coronary Artery Dis., 5: 339). Es ist auch bekannt, dass Blutbank-Plättchen in Konzentraten während der Aufbewahrung und Lagerung aktiviert werden und als Ergebnis etwas ihrer Potenz verlieren (H. M. Rinder und E. L. Snyder, 1992, Blood Cells, 18: 445). Außerdem ist es bei Hämodialyse und chirurgischen Maßnahmen, die eine extrakorporeale Zirkulation von Blut beinhalten, bekannt, dass eine Aktivierung der Plättchen verursacht wird (z. B. J. C. Reverter et al., 1994, J. Lab. Clin. Med., 124: 79; Y. T. Wachtfogel et al., 1993, J. Thoracic and Cardiovascular Surg., 106: 1–10; R. E. Scharf et al., 1992, Arteriosclerosis and Thrombosis, 12: 1975–1487). Demzufolge ergibt die Befähigung zur Identifizierung und Verfolgung des Aktivierungszustandes von Plättchen ex vivo eine vorteilhafte und nützliche Rastertechnik, die durch die vorliegende Erfindung geleistet und erstellt wird.
  • Die Aktivierung von Plättchen ist mit Fluoreszenz-Fließzytometrie untersucht worden (z. B. S. J. Shattil et al., 1987, Blood, 70: 307; C. S. Abrams et al., 1990, Blood, 75: 128; L. Corash, 1990, Blood Cells, 16: 97–108). Mit Fluoreszenz-Technologie werden Plättchen mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern, die spezifisch zu Glycoproteinen sind, die exprimiert werden, oder Konformationsänderungen eingehen, auf der Plättchenoberfläche als Ergebnis der Plättchenaktivierung markiert. Die Anzahl Fluoreszenz-positiver Vorfälle, die an einem Fließ-Zytometer gezählt werden, stellt die Anzahl aktivierter Plättchen dar; die Fluoreszenzintensität pro Vorfall stellt die Anzahl markierter Stellen pro Zelloberfläche dar. Obwohl diese Technik spezifisch und empfindlich ist, ist sie auch in gewisser weise von Nachteil, sie ist nämlich teuer, die Zubereitung der Proben ist zeitaufwendig, und die Datenanalyse ist nicht automatisiert. Ferner ist kein Standardverfahren zur Festlegung Fluoreszenz-positiver Schwellenwerte erstellt worden, teilweise wegen der Beliebigkeitsnatur der Schwellenwertposition und teilweise wegen Unterschieden beim experimentellen Entwurf.
  • Plättchenaktivierung ist auch durch Dichte-Gradientanalyse untersucht worden (B. van Oost et al., 1983, Blood, 62: 433–38). Die Dichte von Plättchen sinkt, bei deren Aktivierung, erstens wegen Quellung und zweitens wegen der Freisetzung von α- und Dicht-Kernen ab (S. Holme et al., 1981, J. Lab. Clin. Med., 97: 610–22; S. Holme et al., 1988, J. Lab. Clin. Med., 112: 223–231), die dichter als das Plättchenzytoplasma sind. Als Folge davon weisen aktivierte Plättchenproben höhere Prozentsätze an Plättchen mit niedriger Dichte in Dichte-Gradienttrennungen auf, als dies bei nicht-aktivierten Proben der Fall ist. Die Dichte-Gradienttrenntechnik ist zeitaufwendig und bedarf fachmännischer Technologen. Ferner wird ein Zell-Zählgerät benötigt, um die Anzahl von Plättchen in jeder der Dichte-Gradientfraktionen zu ermitteln.
  • Demnach ergibt die vorliegende Erfindung, mit der eine neue, preiswerte und empfindliche Absorptions-Lichtstreuverfahrenstechnik zur Bestimmung der Plättchenaktivierung angeboten wird, einen Fortschritt und einen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik. Die vorliegende Erfindung zur Bestimmung der Plättchenaktivierung ist automatisiert und somit wirkungsvoll und zeitsparend bei klinischer Anwendung.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein empfindliches, genaues und präzises Verfahren zur quantitativen Bestimmung und Analyse von Plättchen in Vollblutproben bereit und eignet sich ganz besonders zur Analyse von Blut proben von Einzelpersonen, die abnorme Blutbedingungen aufweisen, die die Zahlen und/oder die Unterscheidung von Blutplättchen gegenläufig beeinflussen. Die Erfindung ergibt auch ein schnelles, einfaches und preiswertes Verfahren, System und Gerät zur Plättchenunterscheidung und -analyse. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Plättchenanalyse unter Anwendung automatisierter Hämatologie-Systeme zum Sammeln von Plättchendaten, einschließlich der Zahl, Größe, Komponentenkonzentration und der Trockenmasse der Plättchen, anzugeben und zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Hochgewinnungs- oder Hochvergrößerungsverfahren und die entsprechende Vorrichtung zur Plättchenzählungsgenauigkeit anzugeben und bereitzustellen, welche mehr Plättchen-Analysendaten anbieten und die Ergebnisse preiswerter und leichter liefern als Verfahren, bei denen Fluoreszenzintensität, Streuungsintensität und Öffnungsimpedanz zur Unterscheidung der Nicht-Plättchen von den Plättchen in einer Blutprobe angewandt werden.
  • Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Zählung, Signalauflösung und Unterscheidung von Plättchen anzugeben, welches empfindlich und genau für Blutproben mit Plättchenzahlen von ca. 1.000 bis weniger als ca. 50.000 Plättchen pro Mikroliter ist. Insbesondere ergibt die Erfindung eine verbesserte Plättchenzählgenauigkeit für thrombozytopenische Proben.
  • Noch eine Aufgabe der Erfindung ist es, Zytogrammresultate zu liefern, die gut entlinierte und detaillierte Darstellungen der Verteilung des Partikeltyps in der Region mit der Größenordnung der Plättchen ergeben.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mittel bereitzustellen, um derzeitige automatisierte Hämatologie-Analysiergeräte durch die Zufügung von mindestens zwei Kanälen zu modifizieren und zu verbessern, um das verbesserte Verfahren der Plättchenzählung und -analyse durchzuführen. Durch die Modifikation oder Verbesserung werden ein Niederstreuwinkel/Hoch-Gewinn-Vergrößerungskanal und ein Hochstreuwinkel/Hoch-Gewinn-Vergrößerungskanal derzeitigen Systemen plus Mie-Streu-Theorie-basierter Signalanalyse zugefügt, um das Leistungsvermögen des Verfahrens und der Vorrichtung der Erfindung zu bewerkstelligen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Identifizierung und quantitative Bestimmung mikrozytischer roter Zellen und roter Blutzellfragmente zu ermöglichen.
  • Noch eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Bestimmung des Ausmaßes der Plättchenaktivierung durch Messung der Plättchenkomponenten-Konzen tration (MPC) anzugeben. Gemäß der Erfindung werden MPC-Werte mit dem Plättchenaktivierungszustand korreliert.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Bestimmung der Plättchen-Trockenmasse anzugeben, die eine Vorhersage der Plättchenaktivierbarkeit darstellt.
  • Schließlich ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Bestimmung der Plättchenkomponenten-Konzentration anzugeben, die die Messung des in vitro-Blutprobenalters ermöglicht.
  • Weitere Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung, die nun folgt, erkennbar.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • Die beigefügten Zeichnungen der Figuren sind angegeben, um die Erfindung noch weiter zu beschreiben und zu ihrem Verständnis durch Klarstellung ihrer verschiedenen Gesichtspunkte bzw. Ausführungsformen beizutragen. Die unten beschriebenen Streu/Streu-Zytogramme wurden erhalten, als die vorliegende Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung zur Bestimmung und Analyse von Plättchen mit einem elektro-optischen Nachweissystem eines automatisierten Hämatologie-Analysiergeräts gemäß der Erfindung angewandt wurden. In den am Ende angegebenen Figuren gilt: RBC = rote Blutzellzahl in 106/Tl; PLT = Plättchenzahl in 103/Tl; MPV = mittleres Plättchenvolumen in Femtoliter (fL); MP + C ist gleichwertig mit MPC = mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration in g/dL; und MP + M ist gleichwertig mit MPM = mittlere Plättchen-Trockenmasse in Picogramm (pg).
  • 1 stellt eine Auftragung des Plättchenvolumens (V) gegen den Brechungsindex (n) (d. h. V/n) auf einem Streu/Streu-Zytogramm dar. Jede im Zytogramm gezeigte Linie stellt einen besonderen Partikel-Typ dar, wie bestimmt in der Analyse und wie identifiziert in der Beschreibung von 3.
  • 2A, 2B und 2C zeigen Streu/Streu-Zytogramme von n-Pentan-, n-Hexan- bzw. n-Heptan-Öltröpfchen. Jede im Zytogramm gezeigte Linie stellt einen besonderen Partikel-Typ dar, wie bestimmt in der Analyse und wie identifiziert in der Beschreibung von 3.
  • 3 zeigt die Orte verschiedener Partikel, d. h. von roten Blutzellen, großen Plättchen, roten Blutzellgeistern, Plättchen, roten Blutzellfragmenten und Ursprungsmüll in einem Partikel-Typ-Auftragungs-Streu/Streu-Zytogramm. Diese Beschreibung gilt auch für die in 4, 5, 6, 8 und 13 dargestellten Zytogramme.
  • 4 stellt ein repräsentatives Zytogramm und Histogramme dar, die eine Normalproben-Ergebnisausgabe unter Anwendung des Plättchenbestimmungsverfahren und -systems der Erfindung zeigen.
  • 5A stellt ein repräsentatives Zytogramm aus der Analyse von Plättchen in K3EDTA-antikoagulierten Blutproben dar, die in roter Blutzell-Verdünnung (z. B. in TECHNICON RBC Diluent) suspendiert sind. 5B stellt ein repräsentatives Zytogramm aus der Analyse von Plättchen in K3EDTA-antikoaguierten Blutproben dar, die in isotonischer Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert sind. Es sollte klar sein, dass die Proben bei Raumtemperatur analysiert wurden, auch wenn sie nicht bei Raumtemperatur gelagert und aufbewahrt worden sind.
  • 6A stellt ein repräsentatives Zytogramm aus der Analyse von ACD-antikoagulierten Blutproben dar, die in roter Blutzell-Verdünnung (z. B. in TECHNICON RBC Diluent) suspendiert sind. 6B stellt ein repräsentatives Zyptogramm aus der Anylse von ACD-antikoagulierten Blutproben dar, die in isotonischer Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert sind.
  • 7A ist ein repräsentatives Diagramm, worin die mittlere Plättchen-Trockenmasse (MPM) gegen die Zeit für Normalblut-Spenderproben aufgetragen ist. MPM wurde für 24 h alte Normalproben gegen 1 h alte Normalproben bestimmt, die bei Raumtemperatur aufbewahrt worden waren. 7B zeigt ein repräsentatives Diagramm, worin die mittlere Plättchen-Trockenmasse gegen die Zeit für abnorme Blutspenderproben aufgetragen ist. MPM wurde für 28 h alte abnorme Proben gegen 9 h alte abnorme Proben bestimmt, die bei Raumtemperatur aufbewahrt worden waren.
  • 8A, 8B und 8C stellen Plättchenvolumen (MPV)-Histogramme für eine abnorme Probe dar, die mit verschiedenen automatisierten Verfahren, d. h. mit dem PLT1-System der Erfindung (8A), dem TECHNICON H·Ô2-System (8B) und mit dem Coulter STKS-System (8C), erstellt wurden.
  • In 9A bis 9D ist das mittlere Plättchenvolumen (MPV) gegen abnorme Plättchen (PCT)-Zählbestimmungen (PLT-Zahl < 20.000/Tl) aufgetragen; die entweder mit dem TECHNICON H·Ô2-System oder dem Coulter-STKS-System erhalten wurden. 9A zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem TECHNICON H.Ô2-System mit 4 h alten abnormen Blutproben. In 9A gilt: r = 0,59; Syx = 0,88 (gemäß Definition von r und Syx); Steigung = 0,14; und Abschnitt = 4,5. 9B zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem TECHNICON H·Ô2-System mit 28 h alten abnormen Blutproben. In 9B gilt: r = 0,72; Syx = 0,54; Steigung = 0,13; und Abschnitt = 3,29. 9C zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem Coulter STKS-System mit 4 h alten abnormen Blutproben. In 9C gilt: r = 0,13; Syx = 0,95; Steigung = 0,02; und Abschnitt = 8,06. 9D zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem Couter STKS-System mit 28 h alten abnormen Blutproben. In 9D gilt: r = 0,66; Syx = 1,09; Steigung = 0,18; und Abschnitt = 6,31.
  • In 10A und 10B ist das mittlere Plättchenvolumen (MPV) gegen die Plättchen (PCT)-Zählbestimmung für abnorme thrombozytopenische Blutproben (PLT-Zahl < 20.000/Tl) aufgetragen, die mit dem neuen PLT1-System und -Verfahren der Erfindung erhalten wurden. 10A zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem PLT1-System mit 4 h alten abnormen Blutproben. In 10A gilt: r = 0,32; Syx = 0,89; Steigung = –0,06; und Abschnitt = 10,02. 10B zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem PLT1-System mit 28 h alten abnormen Blutproben. In 10B gilt: r = 0,32; Syx = 1; Steigung = –0,07; und Abschnitt = 11,79.
  • In 11A, 11B und 11C ist das mittlere Plättchenvolumen (MPV) gegen die Plättchen (PCT)-Zählbestimmungen aufgetragen, die an Normalblutproben durchgeführt und mit unterschiedlichen automatisierten Verfahren erhalten wurden, nämlich mit dem TECHNICON H·2-System, dem Coulter STKS-System und mit dem neuen PLT1-System der Erfindung. 11A zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem TECHNICON H·2-System mit 1 h alten Normalblutproben; 11B zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem Coulter STKS-System mit 1 h alten Normalblutproben; und 11C zeigt die Ergebnisse, erhalten aus dem PLT1-System der Erfindung mit 1 h alten Normalblutproben.
  • 12A und 12B zeigen die Genauigkeitsdaten der mittleren Plättchen-Trockenmasse (MPM) und der mittleren Plättchenkomponenten-Konzentrationen (MPC) für abnorme Blutproben mit dem PLT1-Verfahren und -System. In 12A sind die MPM-Genauigkeitsdaten für 24 h alte abnorme Proben gegen 4 h alte abnorme Proben aufgetragen, welche bei Raumtemperatur aufbewahrt worden waren und analysiert wurden. In 12A gilt: r = 0,75; Syx = 0,13; Steigung = 0,74; Abschnitt = 0,49; der 4 h-Mittelwert beträgt 2,04; und der 28 h-Mittelwert beträgt 1,99. In 12B sind die MPC-Genauigkeitsdaten für 28 h alte abnorme Proben gegen 4 h alte abnorme Proben bei Raumtemperatur aufgetragen. In 12B gilt: r = 0,35; Syx = 1,3; Steigung = 0,3; Abschnitt = 12; der 4 h-Mittelwert beträgt 22,1; und der 28 h-Mittelwert beträgt 18,7.
  • In 13A, 13B und 13C sind die Plättchenvolumen (MPV)-Histogramme dargestellt, die den Ergebnissen entsprechen, die in Tabelle 8 für die abnorme thrombozytopenische Probe #70 angegeben sind. 13A stellt die Histogramm-Ergebnisse dar, erhalten mit dem PLT1-Analysenverfahren der Er findung; 13B stellt die Histogramm-Ergebnisse dar, erhalten mit dem TECHNICON H·2-Analysensystem; und 13C stellt die Histogramm-Ergebnisse dar, erhalten mit dem Analysenverfahren des Coulter STKS-Systems.
  • 14A bis 14D zeigen einen Vergleich zwischen dem neuen Licht-Streuungsverfahren gemäß der Erfindung und einem Fluoreszenz-Verfahren zur Ermittlung der Plättchenaktivierung. 14A bis D legen dar, dass das neue Licht-Streuungsverfahren (14C und 14D) der Erfindung und das Fluoreszenzverfahren (14A und 14B) die Thrombindosis-bezogene Plättchenaktivierung in ähnlicher Weise für sowohl mit Natriumzitrat als auch mit EDTA-behandelte Blutproben darstellen. Die Dosis-Reaktion-Kurven für das Verfahren der Erfindung sind in Standard-Format, wobei MPC ansteigt (14C), und in einem „Oberseite-nach-unten"-Format dargestellt, wobei MPC absinkt (14D). Sowohl die Oberseite-nach-unten- als auch die Standard-Format-Kurven stellen identische Ergebnisse dar, die erstere Orientation ermöglicht aber einen direkteren visuellen Vergleich der Ergebnisse zwischen den zwei Verfahren (d. h., 14B direkt verglichen mit 14D).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein empfindliches und genaues Verfahren zur quantitativen Bestimmung und Charakterisierung von Plättchen zur Anwendung an automatisierten Hämatologie-Analysiersystemen bereit. Die Erfindung stellt ferner eine Vorrichtung zur Durchführung der beschriebenen quantitativen Bestimmungs- und Charakterisierungsverfahren von Plättchen bereit.
  • Wie hierin verwendet, werden die Plättchen häufig mit „PLT" abgekürzt. Weitere hierin häufig verwendete Abkürzungen sind die folgenden: RBC ist rote Blutzelle; MPM ist mittlere Plättchen-Trockenmasse; MPV ist mittleres Plättchenvolumen; MPC ist mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration; TCP ist thrombozytopenisch oder Thrombozytopenie; und TCPS ist die Bezeichnung für eine abnorme Blutprobe, erhalten von einem Patient mit Thrombozytopenie; MCV ist das mittlere Zellvolumen; MCHC ist die mittlere Zell-Hämoglobin-Konzentration; und HCT ist der Hämatokrit-Wert.
  • Häufige Typen automatisierter Hämatologie-Analysiersysteme, mit der Eignung zur Anwendung in der Erfindung sind beispielsweise die H·2-Systeme, die im Handel unter der Handelsbezeichnung TECHNICON H·1, H·2, H·3 und dgl. erhältlich sind und von der hier auftretenden Anmelderin verkauft werden. In solchen Systemen erfolgt der Nachweis der Plättchen (oder Partikel) elektrooptisch durch Messung der Lichtstreuung und elektrisch durch Messung der elektrischen Impedanz (des Scheinwiderstandes). Für die Fachleute wer den die Betriebsprinzipien der automatisierten TECHNICON H·TM-Analysiersysteme hierin bezüglich roter Blutzellen und der Plättchenanalyse dargelegt, um die Änderungen klar und deutlich zu beschreiben, die an solchen Systemen zur Erstellung der Erfindung durchgeführt wurden. In diesen Systemen werden rote Blutzellen und Plättchen gemeinsam in einem einzelnen optischen Messkanal analysiert, der eine Helium-Neon-Laserlichtquelle, eine Fließzelle und zwei optische Detektoren einschließt. Als Teil seines normalen Betriebsablaufes suspendiert das automatisierte System 2 Mikroliter (2 Tl) Vollblut in 1,25 mL TECHNICON H·-Systeme-RBC-Verdünnung, einer Reagens-Lösung, die rote Blutzellen isovolumetrisch zu Kugeln so bildet, dass sie mit der Mie-Streu-Theorie sauber analysiert werden können, wie dies hierin noch deutlicher erklärt wird. Reagenzien und Verdünnungsmittel für die Kugelbildung roter Blutzellen, welche sich zur Anwendung im Plättchen-Analysenverfahren und -system der Erfindung eignen, sind in US 5,284,771, 5,360,739 und 5,911,891 von S. S. Fan et al., in US 5,350,695 und 5,938,003 von G. Colella et al. und in US 9,575,490 und 9,412,004 von Kim und Ornstein beschrieben.
  • Ein Strom von ca. 10 Tl dieser Suspension wird dann in einer Reagensflüssigkeit von übereinstimmendem Brechungsindex, d. h. im TECHNICON H·-Systeme-RBC/Basophil-Oberflächenmittel-Schaft, als Schaft umhüllt. Der RBC/Basophil-Schaft ist ein "passives" Reagens, das mit Blutzellen nicht direkt wechselwirkt, aber stattdessen den Strom in der Fließzelle umgibt und zentriert. Es ergibt auch eine Prozession von Einzelpartikeln zur Analyse. Beispielsweise umfasst die RBC/Basophil-Oberflächenmittel-Schaft-Reagenszusammensetzung ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid, 7,7 g/L, Natriumphosphat, dibasisch, 2,9 g/L, Natriumphosphat, monobasisch, 0,3 g/L, das polyethoxylierte nicht-ionische, nicht-hämolytische oberflächenaktive Mittel Pluronic P-105, 1,0 g/L, ein anti-oxidierendes Reagens, wie 3,3-Thiodipropionsäure, 0,10 g/L, und ein anti-mikrobielles Reagens, wie Proclin 150, 0,40 g/L, bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5 und einer Osmolalität von ca. 285 bis 305 mOsmol/kg.
  • Die roten Blutzellen und Plättchen in der Suspension streuen ein wenig das einfallende Laserlicht, während und wobei der mit dem Schaft umhüllte Strom von Zellen durch die Fließzelle fließt. Die zwei Detektoren erfassen das gestreute Licht bei besonderen winkeligen Zwischenräumen relativ zur Einfallsachse. Die Detektorsignale werden so vergrößert, dass, für Normalproben, die durchschnittlichen Signale, die von roten Blutzellen erzeugt werden, in der Mitte des Signalamplitudenbereichs zu liegen kommen, der mit roten Blutzellen zusammenhängt. Gemäß der Erfindung wird die Lichtstreuungsintensität über zwei Kegelwinkelintervallen in zwei optischen Kanälen bei und mit gesteigerten ersten und zweiten optischen Kanalsignalgewinnen gemessen, um zwei Streuungsintensitätsmessungen zu erzeugen, die hinreichen, um die Plättchen von den Nicht-Plättchen in der Probe optisch aufzulösen. Der erste optische Kanalsignalwert stammt aus einem Zugewinn des Hochwinkel-Detektors, und der zweite optische Kanalsignalwert stammt aus einem Zugewinn des Niederwinkel-Detektors, woraus im Ergebnis eine neue Hochgewinnungsversion der Nieder- und Hochwinkel-Ausgabewerte entsteht. Auch gibt gemäß der Erfindung das System die Signale aufgrund einer Gradstreuung von annähernd 5 bis 20 Grad, bevorzugter von 7 bis 15 Grad und am meisten bevorzugt von 5 bis 15 Grad, entlang der X-Achse eines Streu/Streu-Zytogramms wieder. Auch gibt das System Signale aufgrund einer Gradstreuung von annähernd 1 bis 7 Grad, bevorzugt von 1 bis 5 Grad und am meisten bevorzugt von 2 bis 3 Grad, entlang der Y-Achse des Streu/Streu-Zytogramms wieder. Diese Signale werden zur Ermittlung und Bestimmung roter Blutzell-Parameter wie des Volumens und der Hämoglobin-Konzentration herangezogen, wie dies hierin noch weiter beschrieben wird.
  • Rote Blutzellen sind im Normalfall bikonkave Scheiben, deren Streueigenschaften empfindlich gegen Orientation sind, während und wobei sie durch die Fließzelle des oben beschriebenen optischen Systems fließen. Zur Beseitigung der Auswirkungen einer Partikel-Orientation auf die Signalintensität werden die roten Blutzellen wie in der TECHNICON H·TM-System-RBC-Verdünnung (z. B. US 9,575,490 und 9,912,004 von Kim und Ornstein) zu Kugeln gebildet. Ferner sagt die Mie-Streu-Theorie, mit der winkelförmige Streuungsintensitätsprofile für gekugelte Partikel (wie gekugelte rote Zellen) erstellt werden, voraus, dass die Streuungsintensität gegenüber dem Brechungsindex sowie dem Zellvolumen empfindlich ist. Somit weisen zwei Partikel mit gleichem Volumen, aber mit unterschiedlichen Brechungsindizes unterschiedliche Streuungsprofile auf. Da der Brechungsindex roter Blutzellen linear von der zellulären Hämoglobin-Konzentration abhängt (R. Barer und S. Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microscopical Science, 95: 399–423), welche von Zelle-zu-Zelle schwankt, ist es bei den Messungen der Streuungsintensität über einem einzelnen Kegelwinkelintervall nicht wahrscheinlich, dass das Zellvolumen sogar für gekugelte rote Blutzellen einzig und allein bestimmt wird. Daher ist es zur einzigartigen Bestimmung des Volumens einer roten Blutzelle notwendig, ihre Streuungsintensität über zumindest zwei getrennten Ke gelwinkelintervallen zu messen. Die zelluläre Hämoglobin-Konzentration wird als ein Nebenprodukt der Zwei-Winkel-Messung ermittelt und bestimmt.
  • Algorithmen unter Anwendung der Mie-Theorie ergeben die Winkel-Streuungsmuster, die mit Partikeln von gegebenem Volumen und Brechungsindex zusammenhängen. Über den Bereich von Interesse der Größen und Konzentrationen roter Blutzellen (d. h. von ca. 30 bis 180 fL bzw. von 19 bis 49 g/dL) ist ermittelt worden, dass eine Eins-zu-Eins-Korrespondenz besteht zwischen 1) dem Paar von Streuungsintensitäten bei 2 bis 3 Grad und 5 bis 15 Grad und 2) dem Volumen und der Konzentration roter Blutzellen ( US 4,735,504 von Tycko). Für die TECHNICON H·TM-Systeme ist der Satz von Korrespondenzen in der Form einer zweidimensionalen Matrix tabelliert. Die Indizes der Matrix sind aus den X- und Y-Kanalsignalwerten zusammengesetzt, und die Eingangswerte der Matrix sind die zusammenhängenden Volumina und Konzentrationen. Eine elektromagnetische Streuungstheorie für kugelförmige Partikel (d. h. die Mie-Theorie) ist im Detail, z. B., von M. Kerker, 1969, in The Scattering of Light, Academic Press, beschrieben worden.
  • Vor der automatischen Anwendung der Mie-Tabelle zählt das System als Blutzellen alle Partikel, die einen vorbestimmten Signal-Schwellenwert überschreiten. Es bringt dann die beiden oben genannten Kegelwinkel-Messungen zur Anwendung, um sie entweder als rote Blutzellen oder als Plättchen zu bezeichnen. Die zwei Partikel-Typen besetzen bestimmte Regionen des Volumen/Brechungsindex-Raums, wobei rote Blutzellen viel größer sind und deutlich höhere Brechungsindizes aufweisen. Allerdings ergeben die Signalgewinne, die geläufig in diesen Systemen zur Anwendung gelangen, eine nur schwache Unterscheidung der Plättchen von den Nicht-Plättchen, wie von roten Blutzellgeistern, roten Zellfragmenten und von zellulärem Müll. Außerdem werden mit den geläufigen Öffnung-Impedanzverfahren, das auf Größenunterschieden zur Unterscheidung der Plättchen von weiteren Partikeln beruht, Plättchen nicht von roten Zellfragmenten oder Müll unterschieden, die. Volumina ähnlich dem Volumen der Plättchen aufweisen.
  • Dagegen beruhen derzeitige elektro-optische Geräte auf Einzelwinkel-Intervall-Messungen zur Unterscheidung des Plättchenvolumens. In den geläufigen H·Ô-Systemen wird das Plättchenvolumen als proportional zur 5 bis 15 Grad Streuungsintensität angesehen. Tatsächlich sinkt, wie dies hierin beschrieben wird, diese Intensität mit dem in vitro-Probenalter wegen Quellung der Plättchen ab (siehe Beispiel 1). Als Ergebnis, fällt das ermittelte mittlere Plättchenvolumen in dem Maße, wie das wahre mittlere Plättchenvolumen ansteigt. Auch kann das Einzel-Winkel-Verfahren unterschiedliche Volumina für Plättchen ermitteln und angeben, die tatsächlich die gleichen Volumina, aber unterschiedliche Dichte-Werte (d. h. Brechungsindizes) aufweisen. Ferner geben sowohl elektro-optische als auch Öffnung-Impedanz-Geräte oft MPV-Werte für thrombozytopenische Proben zu niedrig an, weil Nieder-Signal-Müll in typischer Weise einen signifikanten Bruchteil des Gesamtpartikelzählwertes in diesen abnormen Proben ausmacht.
  • Als Teil der Anstrengungen der hier auftretenden Erfinder zur Erstellung empfindlicherer, genauerer und präziserer Plättchen-Analysen zur Durchführung an automatisierten Analysiersystemen, wie z. B. an den TECHNICON H·-Analysiersystemen, wurde eine Teststation unter Anwendung des TECHNICON H·1, wie hierin beschrieben, zum Sammeln von Plättchen-Daten unter Anwendung des durch die Erfindung beschriebenen Verfahrens und Systems angepasst und konfiguriert, das eine gesteigerte Vergrößerung sowohl der X- als auch der Y-Optikkanal-Signale (vergrößerte Signalgewinne) für die roten Blutzellen umfasst und ergibt.
  • Das neuartig konfigurierte automatisierte System zur Durchführung der Analysen der Erfindung zur Unterscheidung von Plättchen wird hierin als das PLT1-System und -Verfahren der Erfindung bezeichnet. Für die genaue Plättchen-Analyse wurde die Mie-Streutheorie angewandt, um die entsprechenden erhöhten Vergrößerungsfaktoren, wie sie hierin beschrieben sind, herauszufinden und zu ermitteln. Zuerst wurden die Volumen- und Brechungsindexbereiche zur Mie-Analyse ausgewählt. Der ausgewählte Volumenbereich betrug ca. 1 bis 60 fL (fL = Femoliter 10–15 Liter) und vorzugsweise 1 bis 30 fL. Dieser Bereich wurde ausgewählt, um Plättchengrößen für alle normalen und die meisten abnormen Proben abzudecken (J. M. Paulus, 1975, Blood, 46 (3): 321–336). Der ausgewählte Brechungsindexbereich betrug ca. 1,340 bis 1,400, vorzugsweise 1,350 bis 1,400. Die Untergrenze bezieht sich auf die Beobachtung, dass Plättchen höhere Brechungsindizes als ihre Plasmamedien aufweisen (andernfalls würden sie unsichtbar sein) und der Brechungsindex von Plasma in typischer Weise größer als ca. 1,345, gemäß Bestimmung mit Refraktometrie, ist. Die Obergrenze bezieht sich auf die Beobachtung, dass die meisten Plättchen weniger dicht (und somit niedrigere Brechungsindizes aufweisen) als rote Blutzellen sind, deren Brechungsindizes nur selten unter 1,390 fallen (zelluläre Hämoglobin-Konzentration von 23 g/dL). Die Grenze wurde vorzugsweise auf ca. 1,400 erweitert, um dem kleinen Bruchteil von Plättchen Rechnung zu tragen, die so dicht wie einige rote Blutzellen sind. Bezogen auf diese Volumen- und Brechungsindexbereiche und auf die Mie-Theorie, wurden die Standard H·TM-System-X-Kanal-Signale um das ca. 8- bis 15-Fache und vorzugsweise um das ca. 12-Fache, und die Y-Signale um das ca. 20- bis 35-Fache und vorzugsweise um das ca. 30-Fache gemäß der Erfindung erhöht oder vergrößert.
  • Bei diesen Signalgewinnsteigerungen waren die Lichtstreuungsintensitäten bei z. B. 2 bis 3 Grad und bei z. B. 5 bis 15 Grad angemessen und angepasst, um Plättchen gegenüber interferierenden Substanzen, wie Zellmüll, roten Blutzellfragmenten und roten Blutzellgeistern, optisch aufzulösen. Auch wurden rote Blutzellen im Verfahren bestimmt unterschieden, weil ihre Signale in Sättigungskanälen X = 99, Y = 99 auftraten. Daher ergeben die kombinierten Streuungsmessungen, die für die Erfindung beschrieben sind, genauere Plättchen-Zählwerte, als dies bei derzeit geläufigen automatisierten Verfahren der Fall ist, insbesondere für thrombozytopenische Proben, bei denen die Fraktion von Interferenzen typischerweise ansteigt. Ferner erlauben die Streu/Streu-Zytogramme, die gemäß der Erfindung erstellt werden, eine visuelle Bewertung der Zahl, der Durchschnittsgröße und des Durchschnittsbrechungsindex der in einer Probe enthaltenen Plättchen. Die Zytogramme ergeben auch eine visuelle Bewertung der Zahlen und Typen anderer in Plättchengröße vorliegender Partikel, die in der Probe vorhanden sein können.
  • Ferner werden, in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, mit den Zwei-Winkel-Streuungsmessungen, die die Erfindung einzigartig machen, Plättchen, in denen ihre Kerne freigesetzt sind (d. h. aktivierte Plättchen), von denjenigen unterschieden, worin dies nicht der Fall ist, da Plättchen in der aktivierten Form niedrigere Brechungsindizes als diejenigen in der unaktivierten Form aufweisen. Derzeit geläufige automatisierte Geräte treffen diese Unterscheidung nicht.
  • Darüber hinaus wird es durch die hohe Verstärkung ermöglicht, dass das System der Erfindung zur Bestimmung von Plättchen die Mie-Theorie-Analyse an den Plättchen zur Durchführung bringt, wodurch die Information über das Plättchenvolumen und den Brechungsindex vielmehr auf der Grundlage einer Theorie als auf empirischer Beobachtung erbracht wird. Im PTL1-Teststation-System waren die gemäß der Erfindung gemessenen fünf Parameter der rote Blutzell-Zählwert (RBC-Zahl, 106/Tl), der Plättchen-Zählwert (PLT-Zahl, 103/Tl), das mittlere Plättchenvolumen (MPV, fL), die mittlere Plättchen-Trockenmasse (MPM, pg) und die mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration oder -Dichte (MPC, g/dL).
  • Es sollte klar sein, dass vor dem neu erfundenen Verfahren zur Plättchen-Bestimmung und seiner Testung im automatisierten Testsystem, wie dies hierin beschrieben ist, die analytischen, gemessenen Parameter von MPM und MPC vorher in automatisierten Plättchen-Analysen- und -Messverfahren und -Systemen, die im Stand der Technik bekannt waren und angewandt wurden, nicht verfügbar waren. Somit wird durch das Verfahren und System der Erfindung eine genaue und vollständige Plättchen-Analyse einer Probe bereitgestellt, einschließlich von Plättchen-Zahl, mittlerem Plättchenvolumen, mittlerer Plättchen-Trockenmasse und mittlerer Plättchenkomponenten-Konzentration. Außerdem wird durch die Erfindung auch der Zählwert der roten Blutzellen der Probe bei gleichzeitiger Erstellung der kompletten Plättchen-Analyse bereitgestellt, wie dies noch weiter im folgenden beschrieben wird.
  • Das Hochvergrößerungsverfahren der Erfindung wurde mit anderen Verfahren bezüglich der Genauigkeit der Plättchen-Zählung und -Größenmessung, der Empfindlichkeit und der qualitativen und quantitativen Reproduzierbarkeit verglichen. Die anderen Vergleichsverfahren schlossen Streuungsintensität, z. B. das TECHNICON H·2-System, Bayer Corporation, Tarrytown, NY), Öffnung-Impedanz (z. B. das Coulter STKS-Modellsystem, Coulter Electronics, Dade, Fla.), Phasenkontrast-Mikroskopie und histologische Blutverschmierung-Schätzwerte ein.
  • Das Hoch-Vergrößerungssystem von PLT1
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird mit dem Verfahren und System der Erfindung zur Unterscheidung und quantitativen Bestimmung von Plättchen ein neu ermitteltes Hoch-Vergrößerungsverfahren angewandt. Die Messungen, die in einzigartiger Weise für die vorliegende Erfindung entwickelt wurden, wurden an einem modifizierten TECHNICON H·1-System durchgeführt, das das PLT1-Modell- oder -Paradigmensystem/verfahren genannt wurde, und zwar wegen der Befähigung zur Durchführung einer einzigartigen Messung und quantitativen Bestimmung von Parametern an Plättchen und wegen deren Unterschied zu derzeitigen automatisierten Systemen und Vorrichtungen des Standes der Technik. Bei der Analyse roter Blutzellen wurden das X-Kanalsignal des PLT1-Systems auf das ca. 12-Fache des Nominalwertes und das Y-Kanalsignal auf das ca. 30-Fache vergrößert.
  • Somit wurde, wie hier oben und gemäß der Erfindung beschrieben, eine Mie-Streu-Theorie-Tabelle für Kugeln von ca. 1 bis 30 fL und für Brechungsindizes von ca. 1,350 bis 1,400 erstellt. Die Tabelle weist das gleiche Format wie das zur Analyse roter Blutzellen angewandte auf. Die Volumen/Brechungsindex (V/n)-Auftragung, die der Tabelle entspricht, ist in 1 dargestellt. Die X- und Y-Kanalgewinne wurden mit Tröpfchen- Suspensionen von n-Pentan (n = 1,3577), von n-Hexan (n = 1,3776) und von n-Heptan (n = 1,3884) standardisiert. 50 mL jedes Kohlenwasserstoffs wurden mit 1 mL RBC/Baso-Schaft-Reagens 10 s lang Vortex-gerührt und eine Probe mittels Direkt-Zytometrie analysiert, d. h., die Probe wurde vor ihrem Durchgang durch die Fließzelle nicht weiter verdünnt. Die Volumen/Brechungsindex-Auftragung, unter Einschluss Tabellen-abgeleiteter Kurven von konstantem Brechungsindex für jeden der drei Kohlenwasserstoffe, wurde auf dem Anzeigeschirm zusammen mit den tatsächlichen Kurven wiedergegeben, die durch die Tröpfchen gebildet waren. Die Signalgewinne wurden angepasst und die Proben, nötigenfalls, erneut analysiert, bis die tatsächliche Kurve für jeden Kohlenwasserstoff über ihre zugehörige Tabellen-abgeleitete Kurve zu liegen kam. Beispiele der Muster, die erstellt wurden, sind in 2 dargestellt. Somit werden, gemäß der Erfindung, Plättchen in spezifischer Weise gegenüber Nicht-Plättchen durch ihr Vorliegen innerhalb der Volumen/Brechnungsindex-Auftragung und noch weiter auf der Basis der charakteristischen Gauss-Verteilung der Plättchenbrechungsindizes optisch aufgelöst.
  • Die RBC-Zählung, die mit dem PLT1-Verfahren durchführbar ist, wurde wie auf H·-Systemen mit einem TECHNICON-Kalibrator gemäß den Anweisungen des Herstellers geeicht. Der RBC-Zähleichfaktor, der Verdünnung in Rechnung stellt, wurde ebenfalls auf den Plättchen-Zählwert angewandt (z. B. wie auf H·-Systemen), da die Plättchen und die roten Blutzellen in einer Probe identischen Verdünnungsfaktoren unterliegen. Allerdings wurde, gemäß der Erfindung und im Gegensatz zu automatisierten Vergleichsverfahren, kein unabhängiger Plättchen-Zähleichfaktor im PLT1-System und -Verfahren angewandt. Daher würden Differenzen im Plättchen-Zählwert zwischen PLT1 und anderen Technologien nicht durch künstliche Eichfaktoren für Vergleichszwecke verdunkelt.
  • Das PLT1-System ist entworfen, um eine Vollblutprobe durch Anwendung der Hydraulik, Pneumatik, Chemie, Reaktionszeit und Zählzeit eines RBC/PLT-Kanals zu verarbeiten und zu analysieren. Auch werden die Plättchen-Kanalsignale vom gleichen Paar optischer Detektoren erfasst, die im RBC/PLT-Kanal zur Anwendung gelangen; allerdings sind die gesteigerten Signalzugewinne, die zur oben beschriebenen Messung und Bestimmung von Plättchen erfasst werden, einzigartig beim PLT1-System und kein Teil der Systeme und Verfahren, die gegenwärtig im Stand der Technik angewandt werden. Die erfassten Signale werden für das System analysiert, wie dies im folgenden beschrieben und beispielhaft angegeben wird: Signale stellen Nicht-Plättchen (d. h. RBCs oder "Andere") dar, falls 1) sie außerhalb der V/n-Auftragung liegen (diese stellen "Andere" dar); 2) sie die Detektoren sättigen (X = 99, Y = 99) (diese stellen RBCs dar); oder 3) sie in Kanälen X < 80, Y = 99 liegen (diese stellen "Andere" dar). Signale oberhalb und links von der Auftragung nahe dem Ursprungspunkt stellen zellulären Müll dar. Größere Signale, einschließlich derer in Kanälen X < 80, Y = 99, stellen rote Zellgeister dar. Sättigungssignale kommen von RBCs und sehr großen Plättchen. Signale unterhalb und rechts von der Auftragung kommen ebenfalls von RBC-Fragmenten (siehe 3).
  • Die verbleibenden Signale auf der Auftragung werden wie folgt analysiert: Zuerst berechnet das System den mittleren Brechungsindex und die Standardabweichung (SD) der Signale in Kanälen X = 18 und mehr, unter Anwendung der Mie-Umrechnungstabelle. Das System schließt Signale auf der V/n-Auftragung unterhalb Kanal X = 18 aus diesem Teil der Analyse wegen möglicher Kontamination durch Müll aus. Danach wird jedes Partikel-Signal mit einem Brechungsindexwert von ca. +2 bis –1,8 SD des Mittelwertes als Plättchen bezeichnet. Der Rest der Partikel-Signale wird als „Andere" bezeichnet. Dies ergibt Zählwerte für drei Typen von Partikeln, nämlich für PLTs (P), RBCs (R) und für "Andere" (0). Die Anzahl der vom System nachgewiesenen Partikel, die Vsig genannt wird, ist größer als die Anzahl analysierter Partikel. Daher stellen P, R und 0 vielmehr die Relativzahl eines jeden Partikel-Typs als den tatsächlichen Roh-Zählwert jeden Typs dar. Zum Erhalt der Roh-Zählwerte führt das System die folgenden Umrechnungen durch:
    Nr = (R/(R + P + O)) × Vsig; Np = (R/(R + P + O)) × Vsig;
    No = (O/(R + P + O)) × Vsig; worin gilt: Nr = Roh-Zählwert roter Blutzellen, Np = Roh-Plättchen-Zählwert; No = Roh-"Ander"-Zählwert; und Vsig = Gesamtzahl der nachgewiesenen Partikel. Die Roh-Zählwerte werden dann bezüglich einer "Koinzidenz", d. h. des gleichzeitigen Auftretens von zwei oder mehr Partikeln im Detektor-Kanal, korrigiert, wobei der Detektor diese als einen Einzelpartikel zählt. Bei den "Anderen" wird angenommen, dass sie sich wie PLTs bezüglich der Koinzidenz verhalten, und sie werden daher mit ihnen in den Koinzidenz-Korrektur-Berechnungen gruppiert. Die Häufigkeit von Koinzidenz wird durch Poisson-Statistiken genau vorhergesagt, wie dies von den Fachleuten anerkannt ist. Die korrigierten Roh-RBC-, -PLT- und -"Ander"-Zählwerte werden mit RBCc, PLTc und Andere c bezeichnet. Schließlich wird der RBC-Eichfaktor auf RBCc, PLTc und Andere c angewandt, um die folgenden Werte zu ergeben: RBC (106/Tl); PLT (103/T1); und Andere (103/Tl).
  • Es ist ersichtlich, dass die dynamischen Bereiche des Volumens und Brechungsindex des verbesserten automatischen PLT1-Verfahrens und -Systems effektiv erweitert werden können, um das gelegentliche Auftreten großer und dichter PLTs in den Sättigungskanälen X = 99, Y = 99 zu handhaben. PLT1 identifiziert diese als rote Blutzellen. Dies kann bewerkstelligt werden, indem die geläufige H·-System-Mie-Umrechnungstabelle nach unten auf V < 8 fL und n < 1,400 erstreckt wird. Die RBC/PLT-Kanal-Vergrößerung, die im PLT1-System zur Anwendung gelangt, ergibt eine angemessene optische Auflösung großer Plättchen-Signale für die Anwendung erweiterter Tabellen, um genaue V- und n-Werte zu ergeben.
  • Das PLT1-System der Erfindung berechnet das mittlere Plättchenvolumen (MPV, fL) und den mittleren Brechungsindex, bezogen auf die Mie-Tabellen. Das System leitet auch die mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration (MPC, g/dL) und die mittlere Plättchen-Trockenmasse (MPM, pg) aus den Mittelwerten des Brechungsindex und des Volumens ab, wie im folgenden dargelegt:
    MPC (g/dL) = (mittlerer Brechungsindex – 1,333)/(0,0018/(g/dL)), worin 1,333 = Brechungsindex von Wasser und 0,0018/(g/dL) = durchschnittlicher Brechungsindex (RI)-Beitrag. Wie von den Fachleuten anerkannt und unten weiter diskutiert, wird der RI-Beitragswert als Konstante in dieser Gleichung behandelt, um ihn als Variable von Zelle-zu-Zelle zu eliminieren:
    MPM(pg) = MPC(g/dL) × MPV(fL/100. (Merke, dass g/dL = 100 × pg/fL)
  • Der durchschnittliche Brechungsindex-Beitragswert ist, bezogen auf die Tatsache, dass die Hauptbestandteile von Plättchen-Trockenmasse Protein (57%), Lipid (19%) und Kohlenhydrat (8,5%) sind (Wintrobe's Clinical Hematology, 9. Ausgabe, 1993, Seite 515). Die Brechungsindex-Beiträge dieser Komponenten betragen 0,00187/(g/dL), 0,0017/(g/dL) bzw. 0,00143/(g/dL) (S. H. Armstrong et al., 1997, J. A. C. S., 69: 1797–1753; R. Barer und S. Joseph, 1954, Quarterly Jorunal of Microscopical Science, 95: 399–423). Mit den Relativkonzentrationen dieser Komponenten zur Zuordnung eines durchschnittlichen Brechungsindex-Beitrags zu den Plättchen ergibt sich ein Wert von 0,0018/(g/dL). Von den geringeren Bestandteilen weisen einige höhere Brechungsindex-Beiträge und einige niedrigere Beiträge auf. Der mittlere Beitrag dieser Komponenten wird nicht als signifikant erwartet, um den zugeordneten Wert zu verändern. Anzumerken ist, dass 0,0018/(g/dL) auch der Wert ist, der Protoplasma von der Literatur im Stand der Technik zugeordnet wird (R. Barer und S. Josph, 1954, Quarterly Journal of Microscopical Science, 95: 399–423). Außerdem gibt zur Angabe von RBC- und PLT-Zählwerten, von MPV, MPC und von MPM das System der Erfindung Frequenz-Histogramme des Plättchenvolumens, der Plättchenkomponenten-Konzentration und der Plättchen-Trockenmasse wieder (4).
  • Das PLT1-System und -Verfahren kann die gleichen chemischen Reagenzien wie im RBC/PLT-Kanal-Verfahren anwenden, worin das geläufige TECHNICON H·-System zur Anwendung gelangt; das verwendete Kugelbildungsreagens beeinflusst oder wirkt auf die Plättchen nicht gegenläufig. Darüber hinaus ist eine zusätzliche Kugelbildung für Plättchen nicht erforderlich, die in K3EDTA-Antikoaguliermittel gesammelt und gemäß der Erfindung analysiert worden sind. Beispielsweise ist in 5A ein PLT1-Streu/Streu-Zytogramm dargestellt, das mit dem PLT1-System und -Verfahren der Erfindung für Plättchen erzeugt wurde, die in K3EDTA antikoaguliert und dann in RBC-Verdünnungslösung resuspendiert worden sind. Wie im Stand der Technik berichtet, bildet K3EDTA Plättchen zu Kugeln, wenn auch unvollkommen (S. Home und S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 980–493; G. V. R. Born, 1970, J. Physiol., 209: 487–511). In 5B ist ein PLT1-Streu/Streu-Zytogramm für eine zweite Anteilsmenge der gleichen Probe dargestellt, die in isotonischer, mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert wurde. Wie durch Vergleich von 5A mit 5B ersichtlich, weisen die zwei Zytogramme aus dem Verfahren und System der Erfindung das gleiche Aussehen auf. Darüber hinaus sind die berichteten Parameterwerte ebenfalls gleich, innerhalb der Geräte-Fehlergrenzen. Diese Ergebnisse belegen, dass ein Kugelbildungsreagens für rote Blutzellen für das Verfahren der Erfindung nicht erforderlich ist, um genaue RBC-Zählwerte und Plättchen-Parameter-Ergebnisse anzugeben.
  • Außerdem zeigen 6A und 6B ein korrespondierendes Paar von PLT1-erstellten Streu/Streu-Zytogrammen zur Bewertung von Plättchen vom gleichen Spender, mit der Ausnahme, dass eine im Handel verfügbare Säure/Zitrat/Dextrose (acid/citrate/dextrose = (ACD))-Lösung als das Anti-Koaguliermittel verwendet wurde. Im Gegensatz zur Wirkung von K3EDTA ist es von ACD bekannt, dass es aus Plättchen keine Kugeln bildet (S. Home und S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 980–993; G. V. R. Born, 1970, J. Physiol., 209: 987–511; G. V. R. Born et al., 1978, J. Physiol., 280: 193–212; M. Frojmovic und R. Panjwani, 1976, Biophys. J., 16: 1071–1089). Wiederum weisen die Zytogramme das gleiche Aussehen auf, obwohl in ACD suspendierte Proben Zytogramme ergeben, die diffuser erscheinen als diejenigen, die für in K3EDTA suspendierte Proben erstellt wurden. Dieser diffuse Charakter kommt von der beliebigen Orientation der nicht-kugelförmigen Plättchen innerhalb der Fließzelle und beeinflusst die Empfindlichkeit und Genauigkeit der mit dem System und Verfahren der Erfindung erhaltenen Ergebnisse nicht gegenläufig. Diese Ergebnisse belegen, dass die Verdünnung für die roten Blutzellen Plättchen nicht zu Kugeln bildet; tatsächlich ist eine Kugelbildung der Plättchen für die Genauigkeit der Ergebnisse in der Erfindung nicht erforderlich.
  • Wie hierin beschrieben, wird durch die vorliegende Erfindung das erste Mal dargelegt, dass sich gekugelte Plättchen, wie rote Blutzellen, "effektiv" als homogene Kugeln unter den gewählten Messbedingungen verhalten, sogar wenn Plättchen nicht perfekt zu Kugeln gebildet werden und Kerne verschiedener Typen, Anzahlen und Brechungsindizes enthalten. Vor der Entwicklung der vorliegenden Erfindung ging man bei dem hier zur Rede stehenden Analysenverfahren davon aus, dass es nur für in die Kugelform überführte, homogene Partikel wirkungsvoll angewandt werden kann (siehe z. B. US 9,735,504 von D. H. Tycko).
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Anwendung der Mie-Streu-Theorie auf Zwei-Winkel-Streuungsmessungen zur Plättchenanalyse, wobei die gleichen oder ähnlichen Winkelintervalle angewandt werden, die sich zur Analyse roter Blutzellen eignen. Vor der Entwicklung der vorliegenden Erfindung waren sich die Fachleute bewusst, dass das ausgewählte Paar von Kegel-Winkelbereichen, das zur Analyse roter Blutzellen angewandt wird, spezifisch für diesen Zell-Typ war, da, sogar für rote Blutzellen, nicht alle Winkelpaare genaue Analysen ergaben (siehe US 4,735,504 von Tycko). Ferner erwies sich die Analyse von Tycko nur als wirkungsvoll für in die Kugelform überführte rote Blutzellen, die in typischer Weise um das ca. 10-Fache größer als Plättchen sind (d. h., MCV = 85 fL für rote Blutzellen gegenüber MC = 8,5 fL für Plättchen); daher ergeben rote Blutzellen viel größere Signale für die Analyse. Auch waren sich, bis zum Zeitpunkt der hier beschriebenen Erfindung, die Fachleute bewusst, dass 2 Winkelintervalle nur für die Analyse homogener und perfekt in die Kugelform überführter Partikel ausreichten, und es wurde angenommen, dass unvollkommen in die Kugelform überführte Partikel mindestens drei Winkelintervalle zur Analyse benötigten. Durch die vorliegende Erfindung wird zum ersten Mal dargelegt, dass die oben beschriebenen Parameter (d. h. das Paar aus Winkelkegeln und 2 Winkelintervallen), welches vorher nur zur Analyse roter Blutzellen angewandt wurde, ebenfalls wirkungsvoll für genaue und empfindliche Bestimmungen und Messungen von nur unvollkommen zu Kugeln gebildeten und nicht- homogenen Partikeln, wie von Plättchen, sind, die Normalvolumenbereiche von ca. 2 bis 20 fL aufweisen.
  • Derzeitige automatisierte Verfahren (wie die der TECHNICON H·-Systeme und die in US 4,735,504 von Tycko beschriebenen) sind nur für die Analyse roter Blutzellen, wie zur Bestimmung des Volumens und der zellulären Hämoglobin-Konzentration der roten Blutzellen, entworfen. Im Gegensatz dazu, wird durch das PLT1-Verfahren der Erfindung in vorteilhafter Weise die gleichzeitige Analyse von Plättchen und roten Blutzellen ermöglicht, wie dies hierin beschrieben und mit Beispielen belegt ist. Ganz allgemein wird durch das PLT1-Verfahren zum ersten Mal dargelegt, dass ein automatisiertes System, z. B. das H·-System, zu gleichzeitigen Bestimmungen und Analysen von Plättchen und von roten Blutzellen in einem üblichen optischen System konfiguiert werden kann, und zwar gemäß der neuen Methodologie der Erfindung, ohne die Genauigkeit und Präzision von einer der Bestimmungen zu opfern. Die separaten Mie-Theorie-Analysen von Plättchen und roten Blutzellen können an Signalen durchgeführt werden, die gemäß der Erfindung von einem Einzelpaar optischer Detektoren gesammelt werden, weil die Plättchen in einer Vollblutprobe unter den Signalvergrößerungsbedingungen und mit Mie-Theorie-Tabellen analysiert werden können, die für den Plättchen-Zelltyp im PLT1-System und -Verfahren besonders geeignet sind, während die roten Blutzellen in der Vollblutprobe unter Vergrößerungsbedingungen und mit Mie-Streu-Tabellen analysiert werden, die für rote Blutzellen geeignet sind.
  • Nur das PLT1-Verfahren und -System der Erfindung ergibt automatisierte Messungen der mittleren Plättchen-Trockenmasse (MPM), sei es auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis oder als Probendurchschnittswert. Im Prinzip, kann die MPM (aber nicht die Zelle-zu-Zelle-Trockenmesse oder ihre Verteilung) aus Messungen der mittleren Plättchenkomponenten-Konzentration, des MPV und des %-Plättchen-Wassers wie folgt bestimmt werden:
    MPM (pg) = mittlere Gesamt-Plättchenmasse (pg) × (100 – % Wasser)/100, worin gilt:
    Mittlere Gesamt-Plättchenmasse (pg) = mittlere Plättchendichte (g/mL pg/fL) × MPV (fL).
  • Allerdings machen diesen Bestimmungen sowohl Plättchen-Dichtemessungen (D. G. Penington et al., 1976, Br. J. Hematol., 34: 365–376; L. Corash et al., 1977, Blood, 99 (1): 71–85; C. B. Thompson et al., 1982, Br. J. Hematol., 50: 509–519; und L. Corash et al., 1984, Blood, 64 (1): 185–193) als auch %-Wasser-Messungen erforderlich (F. Gorstein et al., 1967, J. Lab. and Clin. Med., 70: 938–950); diese Messungen sind langwierig, Zeit-aufwendig und ungeeignet zur Automatisierung mit hohem Durchsatz.
  • Durchschnitts-MPM-Werte, die mit den PLT1-Systemen und Verfahren bestimmt wurden, können mit indirekten Schätzwerten auf der Basis eingeführter Durchschnittswerte für die Plättchendichte, das MPV und das %-Plättchen-Wasser verglichen werden. Es herrscht ganz allgemein im Stand der Technik Übereinstimmung, dass für Plättchen, die in ACD antikoaguliert und an Stractan-Gradienten getrennt wurden, die mittlere Plättchendichte annähernd 1,065 g/mL (D. G. Penington et al., 1976, Br. J. Hematol., 34: 365–376; L. Corash et al., 1977, Blood, 99 (1): 71–85; C. B. Thompson et al., 1982, Br. J. Hematol., 50: 509–519; und L. Corash et al., 1984, Blood, 64 (1): 185–193) und MPV annähernd 6,5 fL betragen (E. A. Trowbrdige et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–238; L. Corash et al., 1977, Blood, 49 (1): 71–85; C. B. Thompson et al., 1982, Br. J. Hematol., 50: 509–519). Allerdings beruhrt der aus dem Stand der Technik abgeleitete MPV-Wert auf Öffnung-Impedanzmessungen, die mit Vorrichtungen durchgeführt wurden, die mit kugelförmigen Polystyrol-Perlen geeicht werden. Daher sind die MPV-Schätzwerte für die nicht in die Kugelform überführten ADC-Plättchen routinemäßig niedrig (N. B. Grover et al., 1969, Biophys. J., 9: 1398; J. Hurley, 1974, Biophys. J., 10: 74). Alle anderen Dinge sind gleich, Öffnung-Impedanz-Messungen an K3EDTA-Plättchen (d. h. an in die Kugelform überführten Plättchen) sind genauer. Diese Typen von Messungen ergeben MPV-Werte von annähernd 8,5 fL für frische (ca. 1 h alte) Proben (E. A. Trowbridge et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–238).
  • Es gibt Widersprüche bei den Fachleuten, und zwar dahingehend, ob K3EDTA Plättchen quillt und außerdem diese in die Kugelform überführt (siehe z. B. S. Holme und S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 480–493; E. A. Trowbrdige et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–238; G. V. R. Born, 1970, J. Physiol., 209: 487–511; G. V. R. Born et al., 1978, J. Physiol., 280: 193–212). Es ist berichtet worden, dass Dichtegradient-Messungen von K3EDTA-Plättchen eine mittlere Dichte von 1,060 g/mL ergaben (H. H. K. Watson und C. A. Ludlam, 1986, Br. J. Hematol., 62: 117–124). Ein Vergleich dieser Werte mit dem Wert von 1,065 g/mL für ACD-Plättchen legt es nahe, dass K3EDTA die Plättchen um ca. 8% quellen lässt. Auf dieser Basis gilt, dass das MPV für „ungequollene" Plättchen = 7,8 fL (das in vernünftiger Weise gut mit veröffentlichten Werten auf Basis von Thrombokrit-Messungen (S. Krpatkin und A. Charmatz, 1969, J. Clin. Invest., 48: 1073–1082) und mit visueller Mikroskopie übereinstimmt (M. Frojmovic und R. Panjwani, 1976, Biophys., J., 16: 1071–1089)). Mit 7,8 bis 8,5 fL als der MPV-Bereich beträgt der mittlere Gesamt-Plättchenmassebereich 8,31 bis 9,05 pg. Schätzwerte des %-Plättchen-Wassergehalts liegen im Bereich von 74,6 bis 77% (F. Gorstein et al., 1967, J. Lab. Clin. Med., 70: 938–950; S. Karpatkin, „Composition of platelets", In: Hematology, 2. Ausgabe, 1977, McGraw-Hill, N. Y., S. 1176–1178). Dies ergibt einen MPM-Bereich von 1,91 bis 2,30 pg. Der mit PLT1 erhaltene Mittelwert von 2,02 pg liegt innerhalb dieses Bereichs. Im Gegensatz dazu, liegt der höchste veröffentlichte MPM-Wert, nämlich die 2,8 pg, (S. Karpatkin, „Composition of Platelets", In: hematology, 2. Ausgabe, 1977, McGraw-Hill, N. Y., S. 1176–1178) weit außerhalb dieses Bereichs. Außerdem ist dieser Wert aus physikalischen Gründen unwahrscheinlich, da er einem Komponenten-Konzentrationsbereich von 32,9 bis 35,9 g/dL gleichkommt, der mit dem Bereich der roten Zellkomponenten-Konzentration – 35 bis 38 g/dL – für MCHC = 32 bis 35 g/dL überlappt (J. W. Harris und R. W. Kellermeyxer, 1972, In The Red Cell, 2. Ausgabe, Harvard University Press, S. 282). Demzufolge sollten Plättchen durchschnittlicher Dichte innerhalb der Fraktion mit niedriger Dichte normaler roter Bluttzellpopulationen vorgefunden werden. Allerdings ist dies nicht der Fall, wie es durch übliche Praxis belegt ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind Messungen der Plättchen-Aktivität, wie sie durch das Verfahren und System der Erfindung angegeben und zur Verfügung gestellt werden, klinisch nützlich. Derzeit gelangen laufend Fluoreszenz-Fließzytometrie (G. I. Johnston et al., 1987, Blood, 69 (5): 1401–1403; J. N. George et al., 1986, J. Clin. Invest., 78: 340–398), Plättchen-Dichtemessungen (D. G. Pennington et al., 1976, Br. J. Hematol., 34: 365–376; L. Corash et al. 1977, Blood, 49 (1): 71–85; A. J. Friedhoff et al., 1978, Blood, 51 (2): 317–323; C. B. Thompson et al., 1982, Br. J. Hematol., 50: 509–519: L. Corash et al., 1984, Blood, 69 (1): 185–193) und MPV-Bestimmungen (C. B. Thompson et al., 1983, J. Lab. Clin. Med., 101: 205–213) zur Voraussage einer Plättchen-Aktivität zur Anwendung. Wie oben bereits erwähnt, ist das erste dieser Verfahren, die Fluoreszenz-Fließzytometrie, umständlich, Zeit-aufwendig und teuer. Das zweite Verfahren, die Dichtemessung von Plättchen, ist ebenfalls indirekt. Das dritte Verfahren, die MPV-Bestimmung, ist indirekt und wird durch die Sammel- und Aufbewahrungsbedingungen beeinflusst. Daher ist ein einfaches, schnelles, preiswertes und robustes Verfahren zur Voraussage einer Plättchen-Aktivität im Stand der Technik erwünscht.
  • Die potentielle Plättchen-Aktivität steigt zusammen mit der Anzahl und Messe von α- und Dicht-Kernen an (L. Corash et al., 1977, Blood, 49 (1): 71–85; und L. Corash et al., 1984, Blood, 69 (1): 185–193). Da die Plättchen-Trockenmasse mit dem Gehalt von Kernen korreliert (ibid.) steigt die potentielle Plättchen-Aktivität mit MPM an. Daher wird durch eine Ausführungsform des PLT1-Verfahrens der Erfindung ein einfaches, genaues und preiswertes Verfahren zur Voraussage einer Plättchen-Aktivität angegeben und zur Verfügung gestellt. Ferner ist MPM ein robuster Parameter, da er sich nur wenig in Proben verändert, die bis zu ca. 24 h lang vor Durchführung der Analyse, sogar bei Raumtemperatur, aufbewahrt worden sind. Außerdem verhält sich MPM im Zeitablauf vorhersagbar, bezogen auf die Korrelationskoeffizienten (siehe Tabelle 1). In Tabelle 1 sind MPM- und MPC-Bestimmungen normaler Blutspenderproben gegen die Zeit und Temperatur (8 h gegen 1 h bei Raumtemperatur (RT); 24 h gegen 1 h bei RT; 8 h bei RT gegen 8 h bei 4°C; und 24 h bei RT gegen 24 h bei 4°C) dargestellt, welche mit dem PLT1-System und -Verfahren durchgeführt wurden. In den relevanten Tabellen, die unten angegeben sind, gilt: "r" ist der Korrelationskoeffizient; "Syx" ist der Standardfehler des Schätzwertes; "Xmittel" ist der Mittelwert für die unabhängige Variable; und "Ymittel" ist der Mittelwert für die abhängige Variable. Somit sind sogar noch präzisere MPM-Werte als für frische Proben aus gealterten oder gelagerten Proben durch Extrapolation, bei gegebenem in vitro-Probenalter und gegebener Lagerungstemperatur, erhältlich. Beispielsweise würde, bei einer gegebenen Absinkrate um 4% pro 24 h bei Raumtemperatur und einer MPM von 2,00 pg bei 24 h, die MPM der frischen Probe 2,08 pg betragen. Es ist beachtenswert, dass das PLT1-System im wesentlichen die gleichen MPM-Werte für ACD- und für K3EDTA-antikoagulierte Blutproben angibt (Tabelle 2 und 5A und 5B). Dies ist im Lichte der Tatsache überraschend, dass Plättchen in ACD nicht, in K3EDTA aber zu Kugeln gebildet werden. Daher ist das PLT1-Verfahren der Erfindung vielseitig und liefert genaue und zuverlässige MPM-Ergebnisse für die Analyse von Plättchen, die in beiden Typen von Antikoagulanzien suspendiert sind.
  • Tabelle 1 Normalspender: mittlere PLT-Trockenmasse (MPM) Genauigkeitsdaten
    Figure 00270001
  • MPC steht in linearer Beziehung zum Plättchen-Brechungsindex, der seinerseits in linearer Beziehung zur Plättchendichte steht. Die Ergebnisse des unten angegebenen Beispiels 4, worin MPC-Werte, die gemäß den Verfahren der Erfindung erhalten wurden, mit Fluoreszenz-Fließzytometriedaten für die Dosisreaktion von Normalplättchen auf den Plättchen-Agonist Thrombin verglichen wurden, belegen, dass die MPC-Werte mit dem PLT-Aktivierungszustand korrelieren (14A bis 14D). Ganz deutlich, ist das Verfahren der Erfindung zur Untersuchung der PLT-Aktivierung preiswert, rasch und sehr einfach anzuwenden. Außerdem ist die Datenanalyse ganz leicht automatisiert durchzuführen. Darüber hinaus ist die Information, die durch Anwendung des Verfahrens der Erfindung erhältlich ist, im wesentlichen einheitlich von dem einen Gerät zu einem anderen Gerät, falls und wenn unterschiedliche Geräte zur Durchführung des Verfahrens angewandt werden.
  • Das Verfahren eignet sich ganz besonders zur Analyse von Blutproben, die in Natriumzitrat oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), vorzugsweise in K3EDTA, antikoaguliert worden sind. Wie die Fachleute wissen, können Lösungen von Natriumzitrat oder K3EDTA mit einer Blutprobe vermischt oder Natriumzitrat oder K3EDTA können in trockener Form (d. h. als Pulver) in der Blutprobe zur Verwendung als Antikoagulans aufgelöst werden. Als beispielhafte Richtlinie werden ca. 7 bis 14 mg K3EDTA in Pulverform pro 7 cc-Röhrchen verwendet. Natriumzitrat wird routinemäßig als Lösung mit 2,0 bis 5 g/dL und vorzugsweise mit 3,2 bis 3,8 g/dL pro Röhrchen und in einem endgültigen Verhältnis von 1 Teilen Natriumzitrat und 9 Teilen Vollblut verwendet. Wie die Fachleute ferner wissen, ist K3EDTA bei weitem das am üblichsten verwendete Antikoagulans für automatisierte Hämatologie-Analysen. In vorteilhafter Weise stellt diesbezüglich die vorliegende Erfindung eine wertvolle Alternative zu den vorherigen Verfahren zur Mischung von Plättchen und aktivierten Plättchen unter Verwendung von Antikörpern dar, bei denen EDTA-enthaltende Lösungen nicht angewandt werden können, und zwar wegen der nachteiligen Wirkung solcher Lösungen auf die Unversehrtheit epitopischer Bindungsstellungen zwischen Antikörpern und auf die Molekularstrukturen, an die sie gebunden werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung beruht darauf, dass ein Verfahren und automatisiertes System zur Bewertung der Beziehung zwischen MPM-Werten und Krankheitszuständen und/oder Krankheitsbehandlungsregimen angegeben und zur Verfügung gestellt werden (siehe Beispiel 2). Durch die Erfindung wird ein praktikables Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von z. B. Chemotherapie- oder Strahlungsbehandlungen auf den Gehalt von Plättchenkernen eines Patienten durch Messung von MPM angegeben und zur Verfügung gestellt. Derzeit wird davon ausgegangen, dass Thrombozytopenie, die mit einer peripheralen Zerstörung von Plättchen zusammenhängt, im Ergebnis zu Plättchen führt, die größer als normal sind, während die gleiche Bedingung wegen verringerter Thrombopoiesis im Ergebnis zu Plättchen mit normaler Größe oder zu kleinen Plättchen führt (J. D. Bessman et al., 1982, Am. J. Clin. Pathol., 78: 150–153; R. B. Nelson und D. Kehl, 1981, Cancer, 48: 954–956). Ferner wird eine erhöhte Plättchengröße mit Herzinfarkt in Zusammenhang gebracht (A. Eldor et al., 1982, Br. Med. J., 285: 397–900; H. A. Cameron et al., 1983, Br. Med. J., 287: 449–451; J. F. Martin et al., 1983, Br. Med. J., 287: 986–488). Im Hinblick auf die Korrelation zwischen dem MPV und der Plättchen-Trockenmasse (L. Corash et al., 1977, Blood, 99 (1): 71–85, und L. Corash et al., 1984, Blood, 64 (1): 185–193) würde man bei einem hohen MPM-Wert erwarten, dass dieser mit destruktiver Thrombozytopenie zusammenhängt, und bei einem niedrigen MPM-Wert würde man erwarten, dass dieser mit verringerter Thrombopoiesis zusammenhängt. Außerdem stellt eine hohe MPM wahrscheinlich eine Voraussage für ein thrombotisches Potential dar.
  • Tabelle 2 PLT1-System-MPM-Werte (pg), Wirkung antikoagulanter Normalspender: (1 h-Proben; RT)
    Figure 00290001
  • Die folgenden Beispiele dienen der Verdeutlichung der Erfindung. Sie sind zur weiteren Erleichterung des Verständnisses der erfinderischen Konzepte angegeben und sollen in keiner Weise dahingehend interpretiert werden, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel beschreibt das Leistungsvermögen des Hochgewinnungs-PLT1-Kanals und des Plättchen-Analysenverfahrens der Erfindung gemäß Test an ca. 75 Normalblutproben (erhalten von Bayer Corporation-Spendern). Für Bezugsvergleiche des PLT1-Verfahrens und -Systems der Erfindung mit Systemen und Verfahren des Standes der Technik wurden Blutplättchenproben mit dem automatisierten TECHNICON H·2-Analysiergerät, dem Coulter STKS-Analysiergerät und dem verbesserten, genaueren PLT1-System analysiert. Zum visuellen Bezug wurden Glasbilder gefärbter Blutverschmierungen für jede Probe ebenfalls zubereitet und hergestellt. Plättchen-Zählwerte, MPV-Werte und RBC-Zählwerte wurden unter den oben aufgezählten Analysenarten verglichen. Daten wurden auch für zwei Parameter, die für eine automatisierte Me thodologie neu sind, gesammelt und in den Stand der Technik durch das PLT1-System und -Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeführt, nämlich für die mittlere Plättchen-Trockenmasse (MPM) und die mittlere Plättchenkomponenten-Konzentration (MPC).
  • Alle Proben wurden in evakuierten Behältern gesammelt, die K3EDTA enthielten. Die Proben wurden nach 1 h Lagerung bei Raumtemperatur, nach 8 h Lagerung sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 4°C und nach 24 h Lagerung bei Raumtemperatur und bei 4°C analysiert.
  • Zur Durchführung der Plättchen-Analysen mit den TECHNICON H·2- und den Coulter STKS-Systemen wurden die Systeme gemäß den Anweisungen der Hersteller standardisiert und geeicht. Alle Proben wurden in Duplikaten durchgeführt und analysiert. Außerdem wurden Proben am PLT1-Testsystem, das, wie hierin oben beschrieben, standardisiert und geeicht wurde, in Duplikaten durchgeführt und analysiert.
  • Film-Glasbilder von Blut-Verschmierungen wurden in Duplikaten für alle Proben zubereitet. Wright-Giemsa-Färbung wurde dann an den Glasbildern mittels des im Handel erhältlichen Hema-Tek 2000-Slide Stainer (Bayer Corporation) durchgeführt. Die Glasbilder wurden zur Plättchen-Zählung und zum relativen Größenbezug aufbewahrt.
  • Die Ergebnisse der Normalblutanalyse und der PLT-Zähl-Vergleichsgenauigkeitsdaten sind in Tabelle 3 angegeben; MPV-Vergleichsgenauigkeitsdaten sind in Tabelle 4 angegeben; RBC-Zählwert-Vergleichsgenauigkeitsdaten sind in Tabelle 5 angegeben; und MPM- und MPC-Genauigkeitsdaten sind in Tabelle 1 angegeben.
  • Tabelle 3
    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Tabelle 4
    Figure 00310002
  • Tabelle 5
    Figure 00320001
  • PLT-Zählwerte: Die Plättchen-Zählwerte, erhalten aus dem PLT1-Verfahren der Erfindung, stimmten gut mit den Zählwerten aus den H·Ô2- und den STKS-Systemen überein, die beide weithin anerkannte Plättchen-Zählvorrichtungen aufweisen. Es sei angemerkt, dass kein Plättchen-Zähl-Eichfaktor in dem PLT1-Verfahren angewandt wurde, während die Eichfaktoren für H·Ô2 und STKS 0,85 bzw. 1,02 betrugen. Dies legt es nahe, dass die geläufige H·Ô2-System-Technologie signifikante Anzahlen von Nicht-Plättchen in ihrem Plättchen-Rohzählwert einschließt.
  • MPV: Kein geläufiges Verfahren zur MPV-Messung wird als Standard im Stand der Technik erachtet. Daher betreffen Vergleiche unter den Verfahren das qualitative Verhalten der Plättchen. 4 zeigt ein typisches Normalproben-Plättchenvolumen-Histogramm für das PLT1-Verfahren. Es stellt eine log-normale Verteilung der Plättchenvolumina dar, in Übereinstimmung mit veröffentlichten Ergebnissen (J. M. Paulus, 1975, Blood, 46 (3): 321–336). Typische Plättchenvolumen-Verteilungen für die H·Ô2- und STKS-Systeme sind ebenfalls log-normal.
  • Für Normalproben zeigten die MPV-Werte, erhalten mit dem PLT1-System der Erfindung und dem Vergleichs-Coulter STKS-System, bei beiden an, dass das MPV mit der Lagerungszeit ansteigt, wogegen die mit dem TECHNICON H·2-System erhaltenen Werte ein Absinken anzeigten (siehe Tabelle 4). Dieses Muster für H·2 gegenüber STKS und PLT1 stimmte mit dem Muster überein, das mit dem TECHNICON H6000-System gegenüber dem Coulter S+-System erhalten wurde, wie dies von Trowbridge et al. angegeben wird (E. A. Trowbridge et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–2382). Wie in dem Papier von Trowbridge et al. berichtet, ist in dem TECHNICON H6000-System (sowie im TECHNICON H·2-System) das Plättchenvolumen proportional zur Hochwinkel-Streuungsintensität (5 bis 15 Grad im H6000TM und 5 bis 15 Grad im H·2-System). Die Mie-Streu-Theorie zeigt, dass die Streuung in diese Winkel gegenüber dem Brechungsindex empfindlich ist, wie dies oben in der detaillierten Beschreibung der Erfindung bereits erläutert wurde. Da Plättchen ex vivo altern, quellen sie und werden wegen der Wasser-Aufnahme weniger brechend (S. Holme und S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 480–493). Diese Quellung verringert deren Hochwinkel-Streuungsintensität, wodurch verursacht wird, dass die H6000Ô- und die H·2-Systeme ein abgesenktes MPV angeben, obwohl das MPV tatsächlich angestiegen ist. Allerdings ist, gemäß Messungen mit dem Coulter S+-System und dem Coulter STKS-System und mit weiteren Öffnung-Impedanzvorrichtungen, das Plättchenvolumen proportional zur elektrischen Impedanz. Daher gaben diese letzteren Systeme ein gestiegenes MPV wegen Quellung korrekt an, da die Impedanz in dem Maße ansteigt, wie die Zellen quellen. Weil mit dem PLT1-System der Erfindung Nieder- und Hochwinkel-Streuungssignale in Volumina und Brechungsindizes mit der Mie-Streu-Theorie umgerechnet werden, wie hierin oben bereits beschrieben, geben das PLT1-System und -Verfahren das gestiegene MPV wegen Quellung ebenfalls korrekt an.
  • RBC-Zählwerte: RBC-Zählwerte, die mit dem PLT1-System der Erfindung bestimmt wurden, stimmten gut mit den RBC-Zählwerten überein, die mit TECHNICON H·2-System und dem Coulter STKS-System ermittelt wurden, die beide anerkannte und akzeptierte RBC-Zählvorrichtungen aufweisen.
  • MPM: 4 zeigt ein typisches und repräsentatives PLT1-Plättchen-Trockenmasse-Histogramm und zeigt an, dass die Plättchen-Trockenmasse innerhalb einer Probe log-normal verteilt ist. Dies stimmt mit den Ergebnissen elektronenmikroskopischer Untersuchungen (G. F. Bahr und E. Zeitler, 1965, Lab. Invest., 14 (6): 217–239) und mit Schlussfolgerungen auf Basis von Dichtegradient-Messungen überein (L. Corash und B. Shafer, 1982, Blood, 60 (1): 166–171). Gemäß PLT1-System-Messungen beträgt ein typischer MPM-Wert für eine Normalprobe, die 1 h lang bei Raumtemperatur gelagert wurde, 2,02 pg. Dieser Wert stimmt ausgezeichnet mit den meisten der veröffentlichten Werte überein, die 2,5, 2,8, 2,06, 2,1 bzw. 2,06 pg betragen (G. F. Bahr und E. Zeitler, 1965, Lab. Invest., 14 (6): 217–2393; F. Gorstein et al., 1967, J. Lab. Clin. Med., 70: 938–950; S. Karpatkin, 1977, „Composition pf platelets", In: Hematology, 2. Ausgabe, McGraw-Hill, N. Y., S. 1176–1178; T. C. Bithell, 1993, „Platelets and megakaryocytes", In: Wintrobe's Clinical Hematology, 9. Ausgabe, Band 1, Lea und Febiger, Philadelphia, PA., S. 511–529; und E. E. Woodside und W. Kocholaty, 1960, Blood, 16: 1173–1183). Der MPM-Wert sank nur geringfügig über 29 h, d. h. um 3,5%, als die Proben bei Raumtemperatur gelagert wurden, und um 1,5% ab, als die Proben bei 4°C gelagert wurden (Tabelle 1).
  • MPC: 4 zeigt ein typisches und repräsentatives PLT1-Plättchenkomponenten-Konzentration-Histogramm, das normal-verteilt (d. h., es zeigt eine Normal- oder Gauss-Verteilung) für frische Proben ist. Dies stimmt mit den Ergebnissen von Dichtegradient-Messungen überein (H. H. K. Watson und C. A. Ludlam, 1986, Br. J. Hematol., 62: 117–124; J. F. Martin et al., 1983, Br. J. Hematol., 54: 337–352). Der Durchschnitts-MPC-Wert, der mit dem PLT1-System für Proben erhalten wurde, die 1 h lang bei Raumtemperatur gelagert wurden, betrug 25,6 g/dL. Zum Vergleich dieses Wertes mit veröffentlichten Werten bezüglich der %-Feststoffe, ist es notwendig, die Dichten der nicht-wässrigen Komponenten zu ermitteln. Wie beschrieben, beträgt die relative Plättchen-Zusammensetzung aus Protein/Lipid/Kohlenhydrat 57/19/8,5, und die jeweiligen Dichte-Werte für diese Komponenten betragen 1,33 g/mL, 0,93 g/mL bzw. 1,50 g/mL (R. Barrer und S. Josph, 1954, "General Cytochemical Methods", Quarterly Journal of Microscopical Science, 95: 399–423); somit beträgt die Durchschnittsdichte der Feststoff-Komponenten 1,26 g/mL. Daher berechnet sich das Volumen, das von 25,6 g Plättchen-Komponenten in einem dL von Plättchen eingenommen wird, wie folgt: 25,6 g × (1 mL/1,26 g) = 20,3 mL oder 0,203 dL. Das verbleibende Volumen pro dL (d. h. für das Wasser) ist: 1,000 dL – 0,203 dL = 0,797 dL. Bei einer Dichte von 1 g/mL beträgt die Masse dieses Wasservolumen 79,7 g. Daher gilt:
    % Feststoffe = (25,6/(79,7 + 25,6)) × 100 = 24,3%. Bringt K3EDTA die Plättchen um 8% zur Quellung, wie oben beschrieben, gilt dann:
    % Feststoffe = 25,8%. Dieser Bereich von 24,3 bis 25,8% liegt nahe am Bereich veröffentlichter Werte, nämlich von 23 bis 25,4% (F. Gorstein et al., 1967, J. Lab. Clin. Med., 70: 938–950; S. Karpatkin, "Composition of Platelets", In: Hematology, 2. Ausgabe, 1977, McGraw-Hill, N. Y., S. 1176–1178).
  • Die MPC sank deutlich im Laufe von 24 h ab; sie sank um 14% für Proben, die bei 4°C gelagert wurden, und um 22% für Proben ab, die bei Raumtemperatur gelagert wurden (Tabelle 1). Die Statistiken für MPC, gemessen bei verschiedenen Zeiten und Temperaturen, sind in Tabelle 6 angegeben. Die Daten zeigen, dass bei Raumtemperatur die MPC-Werte für bei 1, 8 bzw. 24 h analysierte Proben, innerhalb 1,5 SD, nicht miteinander überlappen. So kann man mit 87%iger Zuverlässigkeit durch Messung ihrer MPC ermitteln, dass eine Probe 1, 8 oder 24 h alt ist. Somit können MPC-Werte angewandt werden, um das in vitro-Probenalter zu verfolgen und aufzuzeigen. Eine Vielzahl hämatologischer Parameter, wie MCV, MCHC, HCT und MPV, sind gegenüber dem Probenalter empfindlich. Als Folge davon können falsche Schlüsse bezüglich Bedingungen und Zuständen wie von Makrozytosis, Hypochromie, Anämie und des thrombotischen Potentials von Plättchen gezogen werden, falls die Auswirkungen des Probenalters ignoriert und genaue und zuverlässige Daten aus gealterten Proben nicht erhalten werden. Daher ist zu erwarten, dass die Verfolgung und Überwachung des Probenalters mittels der MPC-Werte mit den Plättchen-Analysen- und -Zählverfahren und -System der Erfindung von signifikantem klinischen Wert sind.
  • Beispiel 2
  • Dieses Beispiel beschreibt das Leistungsvermögen des Zugewinn-PLT-Kanals (PLT1) und des Plättchen-Analysenverfahrens der Erfindung, wie getestet an ca. 70 abnormen Blutproben (erhalten vom Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York). Alle Proben wiesen Plättchen-Zählwerte unterhalb 100.00/Tl auf und wurden wie in Beispiel 1 analysiert. Außerdem wurden Plättchen-Zählwerte mit Phasen-Kontrast-Mikroskopie ermittelt, da die Gültigkeit der automatisierten Plättchen-Zählwerte zum gegenwärtigen Zeitpunkt für alle thrombozytopenischen Proben nicht gut etabliert ist (K. Mayer et al., 1980, Am. J. Clin. Pathol, 79: 135–150; P. J. Cornbleet und S. Kessinger, 1985, Am. J. Clin. Pathol., 83: 78–80). Die Proben wurden an die Bayer Corporation ca. 4 h, nachdem sie gesammelt wurden, geliefert, und sie wurden bei Raumtemperatur bei ihrer Ankunft analysiert. Die Proben wurden erneut nach 28 h Lagerung bei Raumtemperatur analysiert. Die Ergebnisse sind unten und in Tabelle 7 und 12 angegeben.
  • PLT-Zählwerte: Die Plättchen-Zählwerte, erhalten mit dem PLT1-System und -Verfahren der Erfindung, stimmten mit den Plättchen-Zählwerten gut überein, die mit Phasen-Kontrast-Mikroskopie für 4 h lang bei Raumtemperatur gelagerte Proben erhalten wurden. Die PLT1-Plättchen-Zählwerte stimmten auch mit den TECHNICON H·2-System-Zählwerten und den Coulter STKS-System- Zählwerten überein, mit beachtenswerten Ausnahmen, von denen eine im nachfolgenden Beispiel 3 weiter beschrieben ist.
  • MPV: Für abnorme Proben stimmten die TECHNICON H·-System- und Coulter STKS-System-Ergebnisse besser miteinander als mit den mit PLT1 erhaltenen Ergebnissen überein, wenn auch das Gegenteil für Normalproben zutraf. Der Grund dafür wird klar, wenn repräsentative Plättchenvolumen-Histogramme verglichen werden. 8 zeigt, dass die mit dem TECHNICON H·2- und dem Coulter STKS-System erstellten Plättchenvolumen-Histogramme interferierende Partikel in Niederkanälen einschlossen. Diese Partikel verzerrten die log-normalen Plättchenvolumen-Verteilungen und verursachten, dass die Systeme die MPV-Werte zu niedrig angaben. Im Gegensatz dazu, schloss das PLT1-Verfahren der Erfindung die meisten dieser Typen interferierender Partikel aus, wie dies durch dessen log-normale Plättchenvolumen-Verteilung angezeigt wird. Daher gab PLT1 höhere MPV-Werte als die anderen Systeme an. Außerdem zeigen 9A bis 9D, dass, gemäß den H·Ô2- und Coulter STKS-System-Messungen, MPV direkt auf den PLT-Zählwert bezogen ist (bis zu 20.000/Tl), während 10A und 10B zeigen, dass, gemäß PLT1-Messungen, das MPV und der PLT-Zählwert in umgekehrter Beziehung zueinander stehen. Darüber hinaus sind, gemäß den Literaturangaben, das MPV und die PLT-Zählwerte umgekehrt zueinander bezogen für Normalproben und für die meisten thrombozytopenischen Proben (J. D. Bessman et al., 1982, Am. J. Clin. Path., 78: 150–153; J. Levin und J. D. Bessman, 1983, J. Lab. Clin. Med., 101: 295–307; J. D. Bessman et al., 1981, Am. J. Clin. Path., 76: 289–293; C. Giles, 1981, Br. J. Hematol., 48: 31–37). Somit stehen die Literaturberichte in Übereinstimmung mit den vom PLT1-System der Erfindung erzeugten Ergebnissen. Auch mikroskopische Relativ-Größenmessungen an gefärbten Blut-Glasbild-Filmen zeigten, dass die TCP-Proben relativ mehr große Plättchen als die Normalproben enthielten. Für Normalproben zeigten alle drei Systeme, dass das MPV und die PLT-Zählwerte in umgekehrter Beziehung standen (11), in Übereinstimmung mit den Ermittlungen, über die im Stand der Technik berichtet ist.
  • Derzeit ist das MPV ein weithin ignorierter Parameter in der Plättchen-Analyse, obwohl es sogar angewandt werden kann, unter verschiedenen hämatologischen Störungen zu unterscheiden (J. Zeigler et al., 1978, Blood, 51 (3): 979–486; M. Kraytman, 1973, Blood, 41 (4): 587–597; J. D. Bessman et al., 1982, Am. J. Clin. Path, 78: 150–153; J. Levin and J. D. Bessman, 1983, J. Lab. Clin. Med., 101: 295–307; C. Giles, 1981, Br. J. Hematol., 48: 31–37; A. Eldor et al., Br. Med. Journal, 1982, 285: 397–400; H. A. Cameron et al., Br. Med. Jorunal, 1982, 285: 397–400; H. A. Cameron et al., Br. Med. Journal, 1983, 287: 449–451; J. F. Martin et al., Br. Med. Journal, 1983, 287: 486–488; G. A. Threatte, Clin. Lab. Med., 1993, 13 (4): 937–950). Der Grund, warum MPV-Werte keine Beachtung im Stand der Technik finden, beruht darauf, dass, vor der Entwicklung der vorliegenden Erfindung, MPV-Werte als unzuverlässig (E. A. Trowbridge et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–238; G. A. Threatte et al., 1984, Am. J. Clin. Path., 81: 769–772) aus den folgenden möglichen Gründen angesehen wurden:
    • 1) Signifikante Unterschiede wegen der Blutproben-Lagerungsbedingungen werden häufig für MPV-Werte zwischen dem herkömmlichen TECHNICON H·-System und Öffnung-Impedanzgeräten erhalten (E. A. Trowbrdige et al., 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6 (3): 221–238; G. A. Threatte, 1993, Clin. Lab. Med., 13 (4): 937–950; U. Lippi et al., 1987, Am. J. Clin. Pathol., 87: 391–393);
    • 2) weder die herkömmlichen H·Ô2-Systeme noch die Öffnung-Impedanzvorrichtungen geben genaue MPVs für thrombozytopenische Proben an, wie oben dargelegt; und
    • 3) MPV ist empfindlich gegen Sammel- und Lagerungsbedingungen (C. B. Thompson et al., 1983, Am. J. Clin. Path., 80: 327–332; S. Murphy und F. H. Gardner, 1971, J. Clin. Invest., 50: 370–377; B. S. Full und M. B. Zucker, 1965, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 120: 296–301; J. G. White und W. Krivit, 1967, Blood, 30 (5): 625–635).
  • Im Gegensatz dazu, sind die mit PLT1 gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen MPV-Ergebnisse aus den folgenden Gründen gültig:
    • 1) Die qualitative und quantitative Übereinstimmung zwischen Ergebnissen, die für unter verschiedenen Bedingungen gelagerten Normalproben mit unabhängigen Verfahren, nämlich mit PLT1 und Öffnung-Impedanz, erhalten werden, legen sowohl die PLT1- als auch die Öffnung-Impedanz-MPV-Messungen auf eine solidere Grundlage;
    • 2) PLT1-MPV-Ergebnisse für thrombozytopenische Proben stimmen qualitativ mit angegebenen Literatur-Ergebnissen unter einer Vielfalt von Bedingungen überein; und
    • 3) PLT1 überwacht und zeigt die Auswirkung einer Probenalterung auf das MPV durch Messung der MPC auf, wie dies hierin oben bereits diskutiert wurde.
  • Tabelle 6
    Figure 00380001
  • RBC-Zählwerte: Die PLT1-System-Ergebnisse stimmten gut mit den Ergebnissen überein, die sowohl aus dem TECHNICON H·2- als auch dem Coulter STKS-Analysenmodus erhalten wurden.
  • MPM: Die Plättchen-Trockenmasse war für Krankenhaus-Proben log-normal verteilt, und diese Verteilung war sogar für Proben erkennbar, die so wenige wie 150 rohe Plättchen-Signale zur Analyse ergaben (8). Für Krankenhaus-Proben, die 9 h lang bei Raumtemperatur gelagert wurden, betrug der typische MPM-Wert 2,09 pg, der effektiv gleich dem Wert war, der für 1 h lang bei Raumtemperatur gelagerte Normalproben erhalten wurde. Somit zeigte, mit dem PLT1-System der Erfindung, MPM die gleiche Zeitstabilität für sowohl Krankenhaus- als auch Normalproben.
  • In 7 sind Diagramme dargestellt, in denen MPM-Werte für Normalproben unter verschiedenen Zeit- und Temperaturbedingungen (Y-Achse) gegen MPM für 1 h lang bei Raumtemperatur gelagerte Proben (X-Achse) aufgetragen sind. Einzelne Cluster von zentrierten MPM-Werten zeigen sich bei 2 pg (den Mittelwerten für Normalproben). 8 gibt das entsprechende Diagramm für den abnormen Probensatz wieder und zeigt das Vorliegen von 2 Clustern an – einer ist bei 2,0 pg und einer ist bei 2,3 pg zentriert. Die unterschiedlichen Cluster betreffen wahrscheinlich Unterschiede bei der potentiellen thrombotischen Aktivität. Der höhere MPM-Wert für die Krankenhaus-Proben, d. h. die abnormen Proben, zeigt an, dass die Plättchen in diesen abnormen Proben mehr potentielle Aktivität als diejenigen in Normalproben aufweisen. Wie hierin oben beschrieben, ergeben das Plättchen-Analysenverfahren der Erfindung und die daraus erhaltenen MPM-Werte ein Mittel zur Bewertung der Beziehung zwischen hohen MPM-Werten und Krankheitszuständen und/oder Krankheitsbehandlungsregimen.
  • MPC: Abnorme Proben, die 4 h lang bei Raumtemperatur gelagert wurden, wiesen einen typischen MPC-Wert von 22,1 g/dL auf (Tabelle 6), welcher um 0,7 g/dL unter dem Wert lag, der für Normalproben bestimmt wurde, die 8 h lang bei Raumtemperatur gelagert wurden. Die mit PLT1 erhaltenen MPC-Werte zeigten die gleiche Zeit-Abhängigkeit für Krankenhaus-Proben wie für Normalproben.
  • Tabelle 7
    Figure 00400001
  • Beispiel 3
  • Obwohl die meisten der in Beispiel 2 beschriebenen abnormen Proben ähnliche Plättchen-Zählwerte unabhängig vom angewandten Messverfahren erzeugten, erzeugte eine kleine Anzahl abnormer Proben Ergebnisse, die sich weitgehend in Abhängigkeit vom Analysenverfahren unterschieden. Eine derartige Probe von einem thrombozytopenischen Spender wird im vorliegenden Beispiel beschrieben. In Tabelle 8 sind die Vergleichs-Plättchen-Zähldaten angegeben (die Proben wurden in Duplikaten auf den automatisierten Systemen durchgeführt), und in 13 sind die Histogramme dargestellt, die von jedem der drei automatisierten Verfahren erzeugt wurden. Wie gezeigt, erzeugte nur das PLT1-System der Erfindung Plättchen-Zählwerte, die mit den Phasen-Konstrast-Mikroskopie-Zählwerten für beide Duplikat-Messungen übereinstimmten. Die TECHNICON H·2-Plättchen-Zählwerte waren annähernd doppelt so groß wie die Phasen-Kontrast-Mikroskopie-Zählwerte. Das Coulter STKS-System gab den Plättchen-Zählwert in nur einem der Duplikate korrekt an und war eine Leerprobe im anderen Duplikat. Auch waren die Coulter STKS- und TECHNICON H·2-Volumen-Histogramme nicht log-normal, weil sie eine Interferenz durch rote Blutzellfragmente einschlossen. Daher ergaben diese 2 Systeme MPV-Werte, die niedriger als der tatsächliche Wert waren, bezogen auf die mikroskopische Betrachtung der Blut-Verschmierung. Das vom PLT1-Verfahren und -System erzeugte Volumen-Histogramm war log-normal, und das angegebene MPV lag innerhalb des Bereichs für thrombozytopenische Proben und stimmte qualitativ mit der mikroskopischen Beobachtung überein. Ferner war die mit dem PLT1-System ermittelte Plättchenkomponenten-Konzentration grob normal verteilt, und die Plättchen-Trockenmasse war log-normal verteilt, was belegt, dass die Partikel, die als Plättchen in den abnormen Proben mit der vorliegenden Erfindung gezählt wurden, die physikalischen Charakteristika von Plättchen ebenso aufwiesen.
  • Tabelle 8
    Figure 00410001
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel beschreibt Versuche, die durchgeführt wurden, um die Dosisreaktion auf eine in vitro-Plättchen-Aktivierung durch Thrombin zu messen. Für diese Versuche wurde eine Blutprobe von einem normalen erwachsenen menschlichen Spender gezogen, der ein Nicht-Raucher war und nicht unter einer Aspirin-Therapie stand. Die Proben wurden sowohl in Natriumzitrat als auch in K3EDTA-Antikoagulanzien gesammelt. Der Vergleich der Ergebnisse, bezogen auf die Verwendung von Antikoagulanzien, die K3EDTA umfassen, mit denjenigen unter Verwendung von Natriumzitrat belegt die Nützlichkeit von K3EDTA für Plättchen-Aktivierungsstudien, bei denen die neuen Verfahren der Erfindung angewandt werden.
  • Die Thrombin-induzierte Plättchen-Aktivierung wurde mit Fluoreszenz-Fließzytometrie-Nachweis einer erhöhten Zelloberflächen-Exprimierung eines I-Kern-Proteins (GMP-140) mit dem Phycoerythrin-konjugierten monoklonalen Antikörper CD62-PE gemessen. Die Exprimierung von GMP-140 steht im Zusammenhang mit einer I-Kern-Freisetzung. Diese Analyse wird durch den Einschluss des Tetrapeptids Glycyl-L-Prolyl-L-Arginyl-L-Prolin (GPRP) ermöglicht, beschrieben von Michelson et al. (A. D. Michelson et al., 1991, Blood, 77: 770–779). GPRP inhibiert die Plättchen-Aggregation und Fibrin-Gerinnung und ermöglicht daher eine Zelle-zu-Zelle-Analyse.
  • Proben-Zubereitung
  • Vollblut wurde auf 1 : 10 in ergänztem PBS verdünnt, um 0,35% Rinderserumalbumin zu enthalten. Anteilsmengen von verdünntem Vollblut (300 Tl) wurden 5 min lang in der Gegenwart von 2,5 mM GPRP (End-Konzentration) inkubiert.
  • I-Thormbin wurde zu den Testproben mit End-Konzentrationen von 0,002 U/mL bis 0,087 U/mL gegeben, wie angezeigt in 14A bis D. PBS wurde zu den Vergleichsproben gegeben. Die Proben wurden 15 min lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann auf 1 : 1 in 1% Paraformaldehyd (in PBS) verdünnt und 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Sättigungskonzentrationen Plättchen-spezifischer monoklonaler Antikörper, die gegen den Oberflächen-Rezeptor GP1bIX (CD42a, FITC-konkugiert und CD62-PE) gerichtet waren, wurden zu allen mit Fluoreszenz-Fließzytometrie analysierten Proben gegeben, und die Proben wurden 15 min lang inkubiert. Diese Stufe wurde für Proben weggelassen, die mit dem gemäß der Erfindung durchgeführten Verfahren analysiert wurden. PBS wurde auf eine End-Verdünnung von 1 : 600 vor einer Analyse der Proben gegeben.
  • Proben-Analyse
  • Die Proben wurden mit einem FACScan-Fließzytometer mit einer FACStation-CellQuest-Erfassungs- und -Analysensoftware (Becton Dickinson, San Jose, CA) mit einem bei 488 nm betriebenen Argonion-Laser analysiert. Die Fluoreszenz von FITC und Phycoerythrin wurde mit 525 nm bzw. 575 nm Banden-Durchgangsfiltern nachgewiesen. Die Plättchen wurden mit ihrem Vorwärtsstreuungs-(Vorwärts-Scatter(FSC)-gegen-Seitenstreuungs-(side scatter = SSC)-Profil sowie mit ihrer FITC-Positivität (Grün-Fluoreszenz, FL1) identifiziert. Aktivierte Plättchen wurden mit ihrer PE-Positivität (Rot-Fluoreszenz, FL2), d. h. FSC vs. FL2, identifiziert.
  • Nach der Identifikation der Plättchen mit Licht-Streuungspforten und FITC-Positivität wurde die Bindung des Aktivierungsmarkers CD62 durch Analyse von 5.000 Plättchen-Vorfällen für die PE-Fluoreszenz ermittelt. Eine Hintergrund-Bindung, die mit dem isotypischen Antikörper IgG gemessen wurde, wurde von jeder Probe subtrahiert. Die Ergebnisse wurden als mittlere Fluoreszenzintensität (FI, willkürliche Einheiten) für alle Proben angegeben. FI ist für einen Vergleich mit MPC geeigneter als die %-Positivität, da weder FI noch MPC die Festlegung willkürlicher Schwellenwerte benötigte. Außerdem wurden die Proben mit dem Absorption/Licht-Streuverfahren der Erfindung innerhalb 2 h nach dem Sammeln analysiert.
  • Das Verfahren der Erfindung und die Fluoreszenz-Fließzytometrie-Methodologie wurden durch Messung der Plättchen-Aktivierung gegen zugefügtes Thrombin verglichen (14A bis 14D). Die Ergebnisse zeigen, dass das Licht-Streuverfahren der Erfindung die Thrombindosis-bezogene Plättchen-Aktivierung für Blutproben gut darstellt und aufzeigt, die sowohl mit Natriumzitrat (offene Kreise) als auch mit K3EDTA (offene Quadrate) antikoaguliert sind. Wie ersichtlich, sinkt mit steigenden Konzentrationen von Thrombin die MPC ab.
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel beschreibt Versuche, die durchgeführt wurden, um eine in vitro-Plättchen-Autoaktivierung in K3EDTA zu messen. Für diese Versuche wurde ein Blutspecimen von einem normalen erwachsenen menschlichen Spender hinein in K3EDTA-Antikoagulans gezogen. Die Proben wurden wie für Beispiel 4 zubereitet und analysiert, aber ohne die Thrombin-Aktivierung und mit Paraformaldehyd, das mit den angegebenen Mengen zugegeben wurde. In Tabelle 9 sind die Ergebnisse des Zeitverlaufs der Plättchen-Autoaktivierung in der Gegenwart von K3EDTA angegeben:
  • Tabelle 9
    Figure 00440001
  • Tabelle 9 zeigt, dass Plättchen in Proben, die in EDTA aufbewahrt wurden, eine Autoaktivierung eingehen, die über die Zeit ansteigt. Daher müssen sowohl Fluoreszenz-, als auch Lichtstreuungs-basierte Messungen der Plättchen-Aktivierung dem in vitro-Probenalter Rechnung tragen.
  • Beispiel 6
  • Dieses Beispiel beschreibt Versuche, die durchgeführt wurden, um den Aktivierungszustand von Plättchen ex vivo zu messen. Für diese Versuche wurden Blutspecimen von einem normalen menschlichen Spender und von drei Diabetiker-Spendern gezogen. Die Proben wurden hinein in K3EDTA-Antikoagulans gezogen. Die Proben wurden wie im obigen Beispiel 4 zubereitet, mit der Ausnahme, dass weder Thrombin noch Paraformaldehyd zugegeben wurden. Die Proben wurden 7 h nach dem Sammeln analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Tabelle 10 angegeben:
  • Tabelle 10
    Figure 00440002
  • Tabelle 10 zeigt an, dass sowohl die MPC- als auch die FI-Messungen zwischen Blutproben, die eine Plättchen-Aktivierung ex vivo zeigen (Diabetiker 1 und 2), und denjenigen unterscheiden, die dies nicht tun (Diabetiker 3). Es ist ersichtlich, dass die FI höher und die MPC niedriger als erwartet sind, bezogen auf eine Untersuchung der 14A bis 14D. Dies legt es nähe, dass alle drei der Diabetiker-Proben aktiviert sind, aber dass die dritte Probe weniger aktiviert als die ersten ist. MPC für eine Normalblutprobe ist ebenfalls eingeschlossen, um zu zeigen, dass sogar für Normalproben die MPC, die 7 h nach dem Sammeln in EDTA-Lösung gemessen wurde, niedriger als für frische Proben ist. ND besagt, dass dieser Wert nicht bestimmt wurde. Der Grund für das Absinken beim MPC-Wert und den Anstieg bei FI ist es, dass in EDTA aufbewahrte Plättchen im Zeitverlauf fortschreitend autoaktiviert werden, wie dies im obigen Beispiel 5 gezeigt ist. Dennoch unterscheiden MPC wie auch FI zwischen Proben, die eine in vivo-Plättchen-Aktivierung erfahren, und denjenigen, bei denen dies nicht der Fall ist.

Claims (25)

  1. Automatisiertes Verfahren zur genauen Plättchen-Unterscheidung von weiteren Zellen auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis in einer normalen oder einer abnormen Vollblutprobe und zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Blutplättchen-Parametern, welches die Stufen umfasst: a) Analyse einer Anteilsmenge der genannten Probe mit im wesentlichen 1 Zelle zu einem Zeitpunkt durch eine fokussierte Lichtquelle, um ein Vorwärts-Lichtstreuungsmuster zu erzeugen, das die gestreute Lichtintensität pro Streuungswinkel-Einheit als Funktion des Streuungswinkels darstellt, wobei die genannte Lichtstreuungsintensität über 2 Kegelwinkelintervallen in zwei optischen Kanälen bei gesteigerten ersten und zweiten optischen Kanal-Signalwerten gemessen wird, um 2 Streuungsintensitätsmessungen zu erzeugen, die hinreichen, Plättchen von Nicht-Plättchen in der genannten Probe optisch aufzulösen, worin der genannte erste optische Kanal-Signalwert aus einem Zugewinn eines Hochwinkel-Detektors und der genannte zweite optische Kanal-Signalwert aus einem Zugewinn eines Niederwinkel-Detektors stammen; und b) optische Auflösung der genannten Plättchen von den genannten Nicht-Plättchen in der genannten Probe und Bestimmung der genannten Plättchen-Parameter durch das Vorliegen von Lichtstreuungs-stämmigen Plättchen-Signalen innerhalb einer Volumen-gegen-Brechungsindex-Auftragungsdarstellung.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die genannten Plättchen von den genannten Nicht-Plättchen auf Basis einer Normalverteilung der Brechungsindizes der genannten Plättchen optisch aufgelöst werden.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Parameter des Plättchenvolumens, der Plättchenkomponenten-Konzentration und der Plättchen-Trockenmasse bestimmt werden, und wobei das Verfahren die Stufen umfasst: c) Umrechnung der genannten ersten und zweiten optischen Kanal-Lichtstreuungs-Signalwerte zu einem Plättchen-Volumenwert und einem Brechungsindexwert der genannten Plättchen; d) Umrechnung des genannten Plättchen-Brechungsindexwertes zu einem Plättchenkomponenten-Konzentrationswert; und e) Berechnen eines Plättchen-Trockenmassewertes als Produkt des genannten Plättchenkomponenten-Konzentrationswertes und des genannten Plättchen-Volumenwertes aus den Stufen c) und d).
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Parame ter des Plättchen-Zählwertes bestimmt werden und wobei das Verfahren ferner die Stufen umfasst: f) Darstellung von Histogrammen der genannten Plättchenvolumina, Plättchenkomponenten-Konzentrationen und Plättchen-Trockenmassen; und g) Bestimmung des genannten Plättchen-Zählwertes auf Basis des Partikelvolumens und -brechungsindex durch Anordnung der genannten Plättchen innerhalb der genannten Volumen-gegen-Brechungsindex-Auftragungsdarstellung.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der genannten Plättchenkomponenten-Konzentrationswert der genannten Umrechungsstufe d) bestimmt wird, indem der Brechungsindex von Wasser vom berechneten Brechungsindex der Partikelsignale subtrahiert und das Ergebnis der genannten Subtraktion durch einen Durchschnitts-Brechungsindexbeitrag dividiert wird.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die genannten Plättchen nicht in eine Kugelform überführt sind und/oder annähernd isovolumetrisch bleiben.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei rote Blutzell-Zählwerte durch Zählung von Signalen in Hochgewinnungskanälen X = 99, Y = 99 als rote Blutzellen erhalten und ferner die Plättchenanalyse und die Analyse der roten Blutzellen gleichzeitig durchgeführt werden.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Volumen- und Brechungsindexbereiche ausgedehnt werden, um einen Fehler durch Sättigung der genannten ersten und zweiten optischen Kanäle durch große und dichte Plättchen durch nach unten gerichtete Ausdehnung der angewandten Tabellen unter Standard-Signalgewinnungsbedingungen zu vermeiden, um Analysen des Volumens und Brechungsindex großer Plättchen unter normalen Gewinnungsbedingungen zu ergeben.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 8, worin in Stufe a) der genannte Zugewinn des genannten Hochwinkel-Detektors das ca. 8- bis 15-Fache und der genannte Zugewinn des genannten Niederwinkel-Detektors das ca. 20- bis 35-Fache betragen.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, worin die genannten 2 Lichtstreuungsmessungen dazu dienen, den Aktivierungszustand von Plättchen zu ermitteln, und worin die aktivierten Plättchen einen messbar niedrigeren Brechungsindex und eine messbar niedrigere Komponenten-Konzentration (MPC) als unaktivierte Plättchen aufweisen und ferner die genannten Plättchen in vivo oder ex vivo aktiviert sind.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin der genannte Aktivierungszustand der Plättchen eine Funktion der in vitro-Alterung einer Plättchenprobe ist und ferner mit dem in Stufe d) erhaltenen Plättchenkomponenten-Konzentrationswert die in vitro-Alterung von Blutproben bestimmt wird, die von ca. 1 h bis ca. 24 h bei Raumtemperatur oder bei 4°C gelagert wurden.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, worin die genannte Blutprobe mit EDTA oder mit Natriumzitrat antikoaguliert ist.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin der genannte, in Stufe e) erhaltene Plättchen-Trockenmassewert, der genannte Plättchen-Zählwert und der Gehalt von Plättchenkernen oder von Kombinationen davon die Auswirkungen einer Krebs-Therapie oder Krebs-Behandlung bei einem Patienten bestimmen, der unter der genannten Therapie oder Behandlung steht.
  14. Automatisierte Vorrichtung zur genauen Unterscheidung von Plättchen von weiteren Zellen auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis in einer normalen oder einer abnormen Vollblutprobe und zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Blutplättchen-Parametern, umfassend: a) Mittel zur Analyse einer Anteilsmenge der genannten Probe von im wesentlichen 1 Zelle zu einem Zeitpunkt durch eine fokussierte Lichtquelle, umfassend Mittel zur Erzeugung eines Vorwärts-Lichtstreuungsmusters, das die gestreute Lichtintensität pro Einheit des Streuungswinkels als Funktion des Streuungswinkels darstellt, und Mittel zur Messung der genannten Lichtstreuungsintensität über 2 Kegelwinkelintervallen in zwei optischen Kanälen bei ersten und zweiten optischen Kanal-Signalzugewinnen, um 2 Streuungsintensitätsmessungen zu erzeugen, die hinreichen, Plättchen von Nicht-Plättchen in der genannten Probe optisch aufzulösen, worin der genannte erste optische Kanal-Signalwert aus einem ersten Zugewinn eines Hochwinkel-Detektors und der genannte zweite optische Kanal-Signalwert aus einem Zugewinn eines Niederwinkel-Detektors stammen; und b) Mittel zur optischen Auflösung der genannten Plättchen von den genannten Nicht-Plättchen in der genannten Probe und Bestimmung der genannten Plättchen-Parameter durch Anordnung innerhalb einer Volumen-gegen-Brechungsindex-Auftragungsdarstellung.
  15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, welche ferner Mittel zur weiteren optischen Auflösung der genannten Plättchen von den genannten Nicht-Plättchen auf Basis einer Normalverteilung der Brechungsindizes der genannten Plättchen umfasst.
  16. Vorrichtung gemäß Anspruch 14 oder 15, worin die Parameter des Plättchenvolumens, der Plättchenkomponenten-Konzentration und der Plättchen-Trockenmasse bestimmt werden und die Vorrichtung ferner umfasst: c) Mittel zur Umrechung der genannten ersten und zweiten optischen Kanal-Lichtstreuungs-Signalwerte zum Plättchenvolumenwert und zum Brechungsindexwert der genannten Plättchen; d) Mittel zur Umrechung des genannten Plättchen-Brechungsindexwertes zu einem Plättchenkomponenten-Konzentrationswert, wobei der genannte Plättchenkomponenten-Konzentrationswert durch Subtraktion des Brechungsindex von Wasser von dem berechneten Brechungsindex der Partikelsignale und durch Division des genannten Subtraktionsergebnisses durch einen Durchschnittsbrechungsindexbeitrag ermittelt wird; und e) Mittel zur Berechnung eines Plättchen-Trockenmassewertes als Produkt des genannten Plättchenkomponenten-Konzentrationswertes und des genannten Plättchenvolumenwertes aus den Stufen c) und d).
  17. Vorrichtung gemäß Anspruch 16, worin der Parameter des Plättchen-Zählwertes bestimmt wird und die Vorrichtung ferner umfasst: f) Mittel zur Darstellung von Histogrammen der genannten Plättchenvolumina, der Plättchenkomponenten-Konzentrationen und Plättchen-Trockenmassen; und g) Mittel zur Bestimmung des genannten Plättchen-Zählwertes auf Basis des Partikelvolumens und -brechungsindex durch Anordnen der genannten Plättchen innerhalb der genannten Volumen-gegen-Brechungsindex-Auftragungsdarstellung.
  18. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, worin die genannten Plättchen nicht in eine Kugelform überführt sind und/oder annähernd isovolumetrisch bleiben.
  19. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, ferner umfassend Mittel zum Erhalt roter Blutzell-Zählwerte durch Zählung von Signalen in Hochgewinnungskanälen X = 99, Y = 99 als rote Blutzellen und Mittel zur gleichzeitigen Durchführung der Plättchenanalyse und der Analyse roter Blutzellen.
  20. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, ferner umfassend Mittel zur Ausdehnung der genannten Volumen- und Brechungsindexbereiche, um Fehler durch Sättigung der genannten ersten und zweiten optischen Kanäle durch große und dichte Plättchen durch nach unten gerichtete Ausdehnung der angewandten Tabellen unter Standard-Signalgewinnungsbedingungen zu vermeiden, um Analysen des Volumens und Brechungsindex großer Plättchen unter Normalgewinnungsbedingungen zu ergeben.
  21. Vorrichtung gemäß Anspruch 14 oder 20, worin in a) der genannte Zugewinn des genannten Hochwinkel-Detektors das ca. 8- bis 15-Fache und der genannte Zugewinn des genannten Niederwinkel-Detektors das ca. 20- bis 35-Fache betragen.
  22. Vorrichtung gemäß Anspruch 14 oder 16, worin die genannten 2 Lichtstreuungsmessungen als Mittel zur Bestimmung des Aktivierungszustands von Plättchen dienen, worin aktivierte Plättchen einen messbaren niedrigeren Brechungsindex und eine messbar niedrigere Komponenten-Konzentration als unaktivierte Plättchen aufweisen und ferner die genannten Plättchen in vivo oder ex vivo aktiviert sind.
  23. Vorrichtung gemäß Anspruch 22, worin der genannte Aktivierungszustand von Plättchen eine Funktion der in vitro-Alterung einer Plättchenprobe ist und mit dem genannten durch Mittel d) erhaltenen Plättchenkomponenten-Konzentrationswert die in vitro-Alterung von Blutproben bestimmt werden, die von ca. 1 h bis ca. 24 h bei Raumtemperatur und bei 9°C gelagert wurden.
  24. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 23, worin die genannten Plättchen in EDTA oder in Natriumzitrat gesammelt werden.
  25. Vorrichtung gemäß Anspruch 16, worin der durch Mittel e) erhaltene Plättchen-Trockenmassewert, der genannte Plättchen-Zählwert und der Gehalt an Plättchen-Kernen oder Kombinationen davon die Auswirkungen einer Krebs-Therapie oder Krebs-Behandlung bei Patienten bestimmen, die unter der genannten Therapie oder Behandlung stehen.
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