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Die
vorliegende Erfindung betrifft den Bereich von bioartifiziellen
Pankreas, bioartifiziellen Implantaten im Allgemeinen und Verfahren
zu ihrer Herstellung. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung
die Herstellung von dünnen
Blättern,
die Zellen einschließen,
die über
einen längeren
Zeitraum vollkommen biokompatibel sind und die keine Fibrose induzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Zellen enthaltende dünne Blätter, die
leicht vollständig
wiedergewonnen werden können
und Abmessungen aufweisen, die durch rasche Diffusion von Nährstoffen
und Sauerstoff die Aufrechterhaltung von optimaler Gewebe-Lebensfähigkeit ermöglichen
und außerdem
als Reaktion auf physiologische Veränderungen rasche Änderungen
in der Sekretionsgeschwindigkeit von Insulin und/oder anderen bioaktiven
Wirkstoffen ermöglichen.
Diese bioartifiziellen Implantate können eingepflanzt werden. Die
vorliegende Erfindung kann zur Einpflanzung von lebenden Zellen,
Gewebe, Arzneimittel, Medikamenten und/oder Enzymen verwendet werden,
die in den bioartifiziellen Implantaten enthalten sind.
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Das
US-Patent 5.429.821 beschreibt ein Transplantat, das einen Kern
aus lebensfähigen,
physiologisch aktiven Gewebezellen umfasst, die mit einem nichtfibrinogenen
Erdalkalialginat beschichtet sind, das Calcium- und/oder Magnesiumalginat
umfasst. Die Beschichtung ist frei von fibrinogenen Mengen an Fucose, Sulfat,
Phloroglucinol und Proteingruppierungen. Die Beschichtung weist
eine ausreichend niedrige Durchlässigkeit
und eine ausreichend große
Dicke auf, um das Transplantat nach der Transplantation vor Rezipienten oder
immunologischen Wirkstoffen des Wirts zu schützen, und ist außerdem ausreichend
durchlässig
und dünn,
um die Diffusion von ausreichenden Zellnährstoffen und Zellprodukten
durch die Beschichtung zu erlauben, was für die Lebensfähigkeit
der Zelle erforderlich ist. Die Beschichtungsdicke beträgt vorzugsweise 20–200 μm.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein lebensfähiges, physiologisch
aktives und biokompatibles Zell- oder Gewebeimplantat bereitgestellt,
umfassend ein biokompatibles geliertes Alginat, das so gereinigt
ist, dass es keine Fibrose induziert, eine Konfiguration eines dünnen Blatts
mit einer Dicke zwischen 10 μm
und 400 μm
aufweist und einen Kern aus lebendem Gewebe oder Zellen um fasst,
der zumindest 100.000 Zellen in einer ersten Alginatschicht umfasst
und von einer Hülle
aus einem zweiten Alginat umgeben ist, das dasselbe oder ein anderes
als das erste Alginat sein kann, wobei das Implantat eine Durchlässigkeit
aufweist, die ausreicht, um Diffusion und Freisetzung von Proteinen
mit mittlerer Größe aus dem
Implantat in den Wirtskörper
zu ermöglichen.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung
eines biokompatiblen Implantats bereitgestellt, das ein biokompatibles
geliertes Alginat umfasst, das so gereinigt ist, dass es keine Fibrose
induziert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
das
Kombinieren von lebendem Gewebe oder Zellen, das bzw. die zumindest
100.000 zu implantierende Zellen umfasst bzw. umfassen, mit einer
Alginatlösung,
wobei die Alginatkonzentration ausreicht, um in Gegenwart eines
Vernetzers ein Gel zu bilden;
das Kontaktieren des resultierenden
Gemischs in Form einer dünnen
Schicht mit einer Lösung
des Vernetzers in ausreichender Konzentration, um das Alginat zu
gelieren;
und das Ausbilden einer Beschichtungsschicht darauf,
die ein biokompatibles Alginatgel umfasst;
um ein Implantat
in Form eines dünnen
Blatts mit einer Dicke zwischen 10 μm und 400 μm zu bilden, das eine Durchlässigkeit
aufweist, die ausreicht, um Diffusion und Freisetzung von Proteinen
mittlerer Größe aus dem Implantat
in den Wirtskörper
zu ermöglichen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein bioartifizielles Implantat und
Verfahren zu dessen Herstellung. Die Abmessungen des bioartifiziellen
Implantats sind so gewählt,
dass die Zell-Lebensfähigkeit
durch passive Diffusion von Nährstoffen
aufrechterhalten werden kann, und vorzugsweise so, dass eine hohe
Zelldichte aufrechterhalten werden kann. Außerdem sind die Dimensionen
des bioartifiziellen Implantats so gewählt, dass das bioartifizielle
Implantat makroskopisch und leicht aus dem Wirt wiedergewinnbar
ist und groß genug
ist, um einen entscheidenden Teil des Gewebes zu enthalten, das
zum Erreichen der gewünschten
therapeutischen Wirkung erforderlich ist. Die Durchlässigkeit
des bioartifiziellen Implantats ist so gewählt, dass die Zell-Lebensfähigkeit
durch passive Diffusion von Nährstoffen
aufrechterhalten werden kann, und vorzugsweise so, dass die passive
Diffusion von sekretierten Zellprodukten eine rasche Reaktion auf Änderungen
der physiologischen Bedingungen ermöglicht. Gleichzeitig verhindert
die Durchlässigkeit
der Membran die Diffusion von Antikörpern und Komplementen in ausreichendem
Ausmaß,
um eine Lyse der implantierten Zellen zu verhindern, auch wenn es
sich bei dem Gewebe um ein Xenotransplantat handelt. Das bioartifizielle
Implantat ist biokompatibel, was bedeutet, dass es keine Fremdkörperreaktion
auslöst.
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Die
Abmessungen des bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration
eines dünnen
Blatts sind so gewählt,
dass die Oberfläche
einer Seite eines Blatts zumindest 30 mm2,
vorzugsweise zumindest 2,5 cm2, noch bevorzugter
10 cm2, aufweist, was durch entweder (a)
den Durchmesser (wenn das Blatt kreisförmig ist) oder (b) die Fläche, die
durch das Konvergieren von Polygonen bestimmt wird, definiert ist.
Obwohl die maximalen Abmessungen den Maßen entsprechen können, die
vom Patienten vertragen werden, dem das Implantat eingepflanzt wird,
kann die maximale Oberfläche
einer Seite des Blattimplantats der vorliegenden Erfindung im Hinblick
auf eine einfachere Herstellung und Wirtschaftlichkeit von implantierten
Zellen 400 cm2, noch bevorzugter 300 cm3, insbesondere 250 cm2 (bei
einem menschlichen Patienten) betragen.
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Beim
vorliegenden bioartifiziellen Implantat ist die Zelldichte jene
Dichte, die in einer dünnen
Alginatgelhülle
enthalten sein kann: Vorzugsweise beträgt die Zelldichte zumindest
10 Vol.-%, noch bevorzugter 20 Vol.-% und insbesondere zumindest
35 Vol.-%.
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Die
Oberfläche
des bioartifiziellen Implantats ist biokompatibel. Die Erfinder
haben herausgefunden, dass Versuche, mithilfe von synthetischen
Polymeren60,3 Neovaskularisierung auf der
Oberfläche
des Implantats zu induzieren, für
eine langfristige Lebensfähigkeit
von Implantaten suboptimal sind. Sie haben herausgefunden, dass Implantate,
die neutral sind (also weder Fibrose noch Neovaskularisierung verursachen), über ein
Jahr mit nur minimalem Funktionsrückgang halten12.
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Das
bioartifizielle Implantat wird mithilfe der Begriffe "Kern", "Hülle" und "Deckschicht" beschrieben. Der Kern umfasst das lebende
Gewebe, Nährfaktoren
und Nährzellen,
ein mit einem mehrwertigen Kation, wie z.B. Calcium, vernetztes
Alginatpolymer und ein Fasernetz zur Stärkung. Die Hülle umfasst
ein mit einem mehrwertigen Kation vernetztes Alginatpolymer, das
zur Regelung der Durchlässigkeit
dient. Die Deckschicht umfasst ein mit einem mehrwertigen Kation
vernetztes Alginatpolymer, das dazu dient, das bioartifizielle Implantat
biokompatibel zu machen.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ihre Gestalt oder Konfiguration.
Frühere
Erfindungen haben auf inhärente
Einschränkungen
in Bezug auf die Diffusion von Sauerstoff mit einer Verringerung
der Zelldichten innerhalb des bioartifiziellen Implantats reagiert.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass ein wirksames Implantat
mittlere bis hohe Gewebedichten aufweisen muss, um das Volumen des
gesamten bioartifiziellen Implantat zu verringern, und dass die
Dicke eines Blatts oder einer Platte sehr gering sein muss, um eine effektive
Sauerstoffdiffusion zu ermöglichen.
Die Summe aus der Dicke des Kerns, der Hülle und der Deckschicht sollte
weniger als 400 μm,
vorzugsweise 350 μm
oder weniger und noch bevorzugter nicht mehr als 300 μm betragen.
Die Dicke der Hülle
und der Deckschicht sollten minimiert werden, sodass die Gewebemenge
maximiert werden kann. Die Erfinder haben herausgefunden, dass die
Dicke der Hülle
und Deckschicht 10 bis 100 μm,
vorzugsweise 10–80 μm, und insbesondere
10–50 μm, betragen
kann. Über
biokompatible Implantathüllen
mit einer Dicke von nur einigen Dutzend μm wurde noch nie berichtet.
Die Länge
und Breite des bioartifiziellen Implantat, andererseits, sollten
maximiert werden, damit das größtmögliche Volumen
an lebendem Gewebe im bioartifiziellen Implantat aufgenommen werden
kann und es leicht wiedergewinnbar ist.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das Material,
aus dem das bioartifizielle Implantat hergestellt wird. Biokompatible
gereinigte Alginate wurden schon beschrieben, bisher aber nur zur
Herstellung von umhüllten
und eingekapsel ten Implantaten verwendet. Ein bioartifizielles Implantat,
bei dem Alginat als dünnes
Blatt verwendet wird, wurde noch nicht beschrieben. Die Eigenschaften
eines Alginatgels können
kontrolliert werden, indem der G- und M-Gehalt, die Kettenlänge, die
Alginatkonzentration und die Gegenionen (z.B. Calcium, Zink, Barium
oder eine Kombination daraus) bestimmt werden. Alginat im Kern ist
mit lebendem Gewebe kompatibel. Die Herstellung von Alginathydrogelen
ist mit der Zell-Lebensfähigkeit
kompatibel. Natriumalginat, das zur Herstellung des Kerns verwendet
wird, kann vor dem Gelieren mit mehrwertigen Kationen zusammen mit
dem sekretierenden Gewebe mit Nährfaktoren
und Nährzellen
vermischt werden; um eine fördernde
Umgebung bereitzustellen. Alginat für die Hülle kann je nach Kettenlänge und
G- und M-Fraktionen
ausgewählt
werden und mit verschiedenen mehrwertigen Kationen geliert werden,
um die Durchlässigkeit
der Hülle
zu kontrollieren. Alginat für
die Deckschicht kann so gewählt
werden, dass die Biokompatibilität des
bioartifiziellen Implantats maximiert wird.
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Das
bioartifizielle Implantat wird mithilfe einer Reihe von Formen hergestellt,
die aus Frittenmaterialien, welche geformt oder gemahlen werden
können
und Membranen bestehen. Das ermöglicht
die Diffusion von Chelatbildnern (z.B. Natriumcitrat) oder mehrwertigen
Kation-Geliermitteln (z.B. Calcium-, Barium- oder Zinkchloriden),
um den Kern, die Hülle
und die Deckschicht zu verflüssigen
bzw. zu gelieren. Beim Herstellungsverfahren werden nur Ionen verwendet,
die bekannterweise mit den implantierten Zellen kompatibel sind.
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Obwohl
zahlreiche Variationen des Verfahrens existieren, ist die Grundlage
des Verfahrens einfach. Der Kern, die Hülle und die Deckschicht werden
geformt, wenn das Alginat flüssig
ist. Der Kern und die Hülle (und
später
die Hülle
und die Deckschicht) werden vernetzt, indem einfach flüssiges Alginat,
das eine kleine Menge eines Chelatbildners enthält, mit der gelierten Schicht
kontaktiert wird. Der Chelatbildner diffundiert in die gelierte
Schicht und verflüssigt
sie teilweise. Wenn dann ein kationischer Vernetzen zugesetzt wird,
wird eine starke Bindung zwischen den Schichten erzeugt. Die Außenfläche wird
sehr glatt gemacht, indem einfach die Form mit einer Vernetzerlösung befeuchtet
wird, bevor die Form mit der flüssigen
Hülle oder
Deckschicht kontaktiert wird. Die Erfinder haben herausgefunden,
dass der Kontakt mit der so befeuchteten Membran sofort eine sehr
glatte Oberfläche
erzeugt.
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Da
die Hülle
und Deckschicht aus Flüssigkeiten
hergestellt werden, können
sie sehr dünn,
sogar nur einige μm
dick, gehalten werden.
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Die
Erfinder haben ein bioartifizielles Implantat mit Abmessungen erfunden,
die nie vorher erzielt wurden, und das außerdem zahlreiche weitere Vorteile
mit sich bringt. Beispielsweise besteht ein Ziel der vorliegenden
Erfindung in der Bereitstellung eines bioartifiziellen Implantats,
das leicht aus dem Wirten wiedergewinnbar ist.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines dünnen Blatts,
das sowohl hohe Gewebedichten als auch die Diffusion in die Gewebezellen
von ausreichenden Mengen an Nährstoffen,
Sauerstoff und anderen Substanzen ermöglicht, die für die Gesundheit,
Langlebigkeit und effektive Wirkungsweise der Zelle nach der Einpflanzung
erforderlich sind.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines leicht
wiedergewinnbaren dünnen
Blatts, das sowohl hohe Gewebedichten als auch eine effektive Diffusion
von Nährstoffen
in und Zellprodukten aus dem Implantat ermöglicht.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines dünnen Blatts
aus lebensfähigen,
physiologisch aktiven Gewebezellen zur Einpflanzung, das für den Wirten
physiologisch annehmbar ist und nach der Einpflanzung effektiv einen
längeren Schutz
für Gewebezellen
vor Zerstörung
durch das Immunsystem des Wirten bereitstellt.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines effektiven Implantat-Hüllenmaterials
mit der Konfiguration eines dünnen
Blatts, das physiologisch annehmbar, nicht fibrinogen und für das Wirtsgewebe
nicht toxisch ist.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines bioartifiziellen Implantats, das trophische Substanzen, wie
z.B. Nährzellen,
Grundsubstanzen, Nährstoffe,
Hormone oder Sauerstoffträger
enthält,
um die Gesundheit, Langlebigkeit und effektive Wirkungsweise des
Implantats nach der Einpflanzung zu unterstützen.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines neuen Herstellungsverfahrens zur effektiven Umhüllung eines
Implantats (z.B. Zellen, Gewebe und/oder andere biologische Substanzen)
mit einer Sperrschicht oder Membran, die physiologisch annehmbar,
nicht fibrinogen und für
das Wirtsgewebe nicht toxisch ist, das eine komplette Sperrschicht
mit einer kontrollierten Dicke und einer kontrollierten Durchlässigkeit
für Proteine
mittlerer Größe bereitstellen
kann und leicht wiedergewinnbar ist.
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Zusammengefasst
kann die vorliegende Erfindung einen Implantatkern mit der Konfiguration
eines dünnen
Blatts umfassen, das lebensfähige,
physiologisch aktive Gewebezellen und ein vernetztes Alginatgel, und
gegebenenfalls Nährfaktoren
und Nährzellen,
und gegebenenfalls einen Fasernetz-Träger, aufweist. Die Alginate
sind vorzugsweise frei von fibrogenen Konzentrationen an Verunreinigungen.
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Das
bioartifizielle Implantat kann eine Hülle und eine Deckschicht zur
Regelung der Durchlässigkeit und
zur Förderung
der Biokompatibilität
aufweisen. Das Implantat-Blatt
ist dünn
und kann durchlässig
genug sein, um in der Mitte des Blatts eine physiologisch annehmbare
Sauerstoffspannung bereitzustellen, wenn es an einer geeigneten
Stelle in einem Menschen oder Tier implantiert wird. Die Dünnheit und
Durchlässigkeit
des Implantats ermöglicht
die Diffusion von Nährstoffen,
Sauerstoff, Abfallprodukten des Stoffwechsels und sekretierten Gewebeprodukten.
Das Implantat hemmt vorzugsweise die Diffusion von Antikörpern und
Komplementen.
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Vorzugsweise
ermöglicht
die Hülle
eine rasche Diffusion von Substanzen mit weniger als 50 kD und hemmt
die Diffusion von Substanzen über
100 kD deutlich. Außerdem
ist die Hülle
sehr dünn,
vorzugsweise etwa 10–50 μm dick. Die
Hülle kann
bei spielsweise kurzkettige Alginate mit hohem M-Gehalt, die mit
einem Gemisch aus Calcium- und Zinkionen geliert sind, umfassen
und somit aus diesen aufgebaut sein.
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Für das vorliegende
Implantat geeignete Zellen umfassen beispielsweise Langerhanssche
Inseln, Nierenrindenzellen, Nebenschilddrüsenzellen, Schilddrüsenzellen,
Nebennierenzellen, Leberzellen, Zellen unterschiedlichen Ursprungs,
die gentechnisch verändert
wurden, um nützliche
Substanzen zu sekretieren, Zellen unterschiedlichen Ursprungs, die
gentechnisch verändert
wurden, um schädliche
Substanzen zu metabolisieren, Gewebe und dergleichen.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines biokompatiblen
Implantats kann folgende Schritte umfassen:
- (a)
das Ausbilden eines Kerns, der lebensfähige, physiologisch aktive
Gewebedonorzellen enthält,
in einem Alginatgel, vorzugsweise in einer dünnen, blattförmigen Form,
und noch bevorzugter durch Vernetzen ein einer Alginatlösung, welche
die Zellen enthält;
- (b) das Kontaktieren des Kerns mit einer zweiten Alginatlösung, die
eine ausreichende Citratkonzentration aufweist, um zumindest eine
teilweise Verflüssigung
des Alginatgels im Kern zu induzieren;
- (c) das Vernetzen der zweiten Alginatlösung und des verflüssigten
Alginatgels im Kern, um eine Hüllenschicht,
die an den Kern gebunden ist, und somit das biokompatible Implantat
zu bilden, vorzugsweise durch Eindiffundieren eines Vernetzers in
die zweite Alginatlösung
und das verflüssigte
Alginatgel im Kern.
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Gegebenenfalls
kann der Vernetzungsschritt (c) das Kontaktieren der Innenfläche der
Form mit einer wässrigen
Calciumionenlösung
umfassen, um eine glatte Außenfläche auf
dem biokompatiblen Implantat zu schaffen. Dieser optionale Schritt
kann zusätzlich
zum Diffusionsschritt durchgeführt
werden. Eine weitere Option besteht darin, Schritt (b) mit einer
dritten Alginatlösung
zu wiederholen, die ausreichend Citrat enthält, um eine zumindest teilweise
Verflüssigung
des Alginatgels in der Hülle
zu induzieren, und Schritt (c) zu wiederholen, indem die dritte
Alginatlösung
und das verflüssigte
Alginatgel in der Hülle
vernetzt werden, um eine Deckschicht zu bilden, die an die Hülle gebunden
ist. Die Hülle
des biokompatiblen Implantats kann so ausgebildet werden, dass sie
die Durchlässigkeit
regelt, und die Deckschicht kann so ausgebildet werden, dass sie
die Biokompatibilität
fördert.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
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Die
folgende detaillierte Beschreibung, die anhand der beiliegenden
Abbildungen erläutert
wird, wird zu einem besseren Verständnis der Erfindung und vieler
ihrer Vorteile führen.
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1 ist
eine schematische Darstellung des bioartifiziellen Implantats mit
der Konfiguration eines dünnen
Blatts.
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2 ist
ein vergrößerter schematischer
Querschnitt durch das bioartifizielle Implantat mit der Konfiguration
eines dünnen
Blatts aus 1.
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3 ist
ein vergrößerter schematischer
Querschnitt durch den Kernrand und die Hülle des bioartifiziellen Implantats
mit der Konfiguration eines dünnen
Blatts in der Hüllenform.
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4 ist
ein vergrößerter schematischer
Querschnitt durch den Kern des bioartifiziellen Implantats mit der
Konfiguration eines dünnen
Blatts in der Kernform.
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5 ist
ein vergrößerter schematischer
Querschnitt durch das mit einer Hülle überzogene bioartifizielle Implantat
mit der Konfiguration eines dünnen
Blatts in der Hüllenform.
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6 ist
ein vergrößerter schematischer
Querschnitt durch das mit einer Deckschicht überzogene bioartifizielle Implantat
mit der Konfiguration eines dünnen
Blatts in der Deckschichtform.
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7 ist
ein vergrößerter schematischer
Querschnitt durch die Form, die zur Herstellung des Kerns, der Hülle und
der Deckschicht verwendet wird, dargestellt als separate Teile (A),
in Berührung
(B) und zusammengeklemmt (C).
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8 ist
ein vergrößerter schematischer
Querschnitt durch die Form, die zur Herstellung der Hüllenhälfte verwendet
wird, dargestellt als separate Teile (A) und in Berührung (B).
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9 ist
eine Mikroaufnahme des Kerns des bioartifiziellen Implantats, hergestellt
gemäß der vorliegenden
Erfindung unter Verwendung von Polymerkügelchen, die Inseln darstellen
sollen (~100×).
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10 ist
eine Mikroaufnahme eines Abschnitts des Kerns des bioartifiziellen
Implantats, hergestellt gemäß der vorliegenden
Erfindung unter Verwendung von Polymerkügelchen, die Inseln darstellen
sollen (~100×).
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11 ist
eine Mikroaufnahme eines Abschnitts des kompletten (mit Hülle, Deckschicht)
bioartifiziellen Implantats, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung
unter Verwendung von Polymerkügelchen,
die Inseln darstellen sollen (~100×).
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Arten der
Durchführung
der Erfindung
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Das
bioartifizielle Implantat der vorliegenden Erfindung ist zur Einpflanzung
in ein Wirtstier durch herkömmliche
chirurgische Verfahren oder unter Verwendung eines Bauchtrokars
und eines Laparoskops geeignet.
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Der
Begriff "Implantat" umfasst hierin alle
lebenden Gewebe, Zellen und biologisch aktiven Substanzen, die in
den Körper
eines Wirtstiers implantiert werden sollen, und "implantieren" bezieht sich auf den Vorgang des Einpflanzens
oder der Übertragung
dieser Gewebe und Zellen in einen Wirten. Diese Gewebe und Zellen
umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Gewebe und Zellen,
die von einem Spendertier entnommen wurden, Gewebe und Zellen, die
durch Inkubation oder Kultivierung von Spendergewebe und -zellen
erhalten wurden, Zellen, die aus lebensfähigen Zelllinien erhalten wurden,
Zellen, die durch gentechnische Veränderung erhalten wurden, biologisch
aktive Produkte von Zellen und Gewebe, Pharmazeutika, Arzneimittel, Enzyme,
eutrophe Elemente und dergleichen. Gewebe kann eine nützliche
biologische Funktion aufweisen, entweder indem es eine therapeutische
oder trophische Substanz sekretiert oder indem es eine toxische
oder schädliche
entfernt. Ein Beispiel für
Letzteres wäre
die Entfernung von unterschiedlichen Fettsubstanzen aus einem Serum,
um den Lipidblutspiegel zu senken.
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Jede
Gewebe- oder Zellenart, die eingepflanzt werden soll, kann zu einem
Blatt verarbeitet und gemäß der vorliegenden
Erfindung implantiert werden. Die am häufigsten implantierten Gewebearten
sind Sekretionsorgangewebe, wobei die Implantation eines Spenderorgans
in ein Empfänger-
oder Wirtstier erwünscht
ist, um die Funktion des Spenderorgans im Wirtssystem zumindest
teilweise zu replizieren. Bevorzugte Spendergewebearten sind Langerhanssche
Inseln, Nierenzellen, Nervenzellen, Nierenrindenzellen, Gefäßendothelzellen,
Schilddrüsenzellen,
Nebenschilddrüsenzellen,
Nebennierenzellen, Thymuszellen und Eierstockzellen.
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Nachstehend
wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung am Beispiel der Herstellung
und Implantation von Langerhansschen Inseln und Inselzellen veranschaulicht,
was aber nicht als Einschränkung
zu verstehen ist. Dieses Verfahren kann genauso gut für andere
Organgewebearten verwendet werden, was für Fachleute auf dem Gebiet
der Erfindung offensichtlich ist, wobei bei Bedarf oder Wunsch herkömmliche
und offensichtliche Modifikationen vorgenommen werden können, um
speziellen Anforderungen oder anderen Gewebearten Rechnung zu tragen.
Alle Anwendungen des Verfahrens für unterschiedlichste Gewebe-
und Zellarten, die zur Implantation geeignet sind, liegen innerhalb
des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
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Isolierte
Langerhanssche Inseln (oder andere zur Implantation geeignete Zellen
oder Gewebearten) werden durch herkömmliche Verfahren gewonnen,
wobei sie von um liegendem Gewebe und anderen Donorsubstanzen im
Wesentlichen getrennt werden.
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In
einem ersten Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden
isolierte Langerhanssche Inseln (oder andere Zellen oder Gewebearten)
mit einer isotonischen Kochsalzlösung
gewaschen und einer Lösung
von gereinigtem Natriumalginat suspendiert. Das Alginat wurde vorher
gereinigt, um es wie in früheren Publikationen34,33,35 beschrieben, vollständig biokompatibel
zu machen.
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Das
Alginat kann mit verschiedenen Molekulargewichten (Kettenlängen), reich
an Guluronatresten oder reich an Mannuronatresten hergestellt werden30,31,35. Diese Verfahren basieren auf der
differenziellen Bindung von homopolymeren M- und G-Blöcken an
verschiedene Kationen. Die Wahl (i) der Fraktion aus einheitlichen
G-Blöcken, einheitlichen
M-Blöcken
und alternierenden GM-Blöcken,
(ii) der mittleren Kettenlänge,
(iii) der Alginatkonzentration und (iv) des Gemischs aus Kationen,
das zur Gelierung des Alginats verwendet wird, kann zur Produktion
von Alginatgelen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften genutzt
werden. Im Folgenden steht "Alginat" für eine Lösung von
Alginat, das aufgrund gewünschter
Eigenschaften ausgewählt
wurde und gelierbar sein kann, und "mehrwertiges Kation" für
ein Gemisch aus mehrwertigen Kationen, wie z.B. Calcium, Barium
und Zink, das so gewählt
ist, dass gewünschte
Eigenschaften erzielt werden, wenn es in Kombination mit dem ausgewählten Alginat
verwendet wird.
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Das
gewählte
Kernalginat weist niedrige Viskosität im flüssigen Zustand (sodass die
Inseln während der
Kernbildung nicht beschädigt
werden), hohe Festigkeit im gelierten Zustand (um ein starkes Implantat
zu erhalten), Kompatibilität
mit Gewebe und Kompatibilität
mit Nährfaktoren
auf. Das Kernalginat besteht typischerweise aus Alginat (z.B. 80
bis 100 kD, vorzugsweise 100 bis 500 kD, noch bevorzugter 200 bis
400 kD) in einer niedrige Konzentration (vorzugsweise 0,5 bis 10%,
noch bevorzugter 1,0 bis 5%, insbesondere etwa 2,0%), das ein Gemisch
aus M- und G-Blöcken
ist, die mit Calcium vernetzt sind.
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Das
gewählte
Hüllenalginat
weist hohe Viskosität
im flüssigen
Zustand (insbesondere beim "Kautschukverfahren"), hohe Festigkeit
im gelierten Zustand (um ein starkes Implantat zu erhalten), hohe
Durchlässigkeit
für niedermolekulare
Spezies (es erlaubt beispielsweise die Diffusion von Molekülen und/oder
Komplexen mit einem Molekulargewicht unter 150 kD, vorzugsweise
unter 100 kD, noch bevorzugter unter 75 kD) und geringe Durchlässigkeit
für hochmolekulare
Spezies (es hemmt oder verhindert beispielsweise die Diffusion von
Molekülen
oder Komplexen mit einem Molekulargewicht über 200 kD, vorzugsweise über 150
kD, noch bevorzugter über
100 kD) auf. Typischerweise besteht das Kernalginat aus kurzkettigem
Alginat (z.B. 80 bis 800 kD, vorzugsweise 100 bis 600 kD, noch bevorzugter
100 bis 400 kD) in einer hohen Konzentration (z.B. 5–40%, vorzugsweise
10–30%,
noch bevorzugter 15–25%),
das mit Calcium vernetzt ist. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis zwischen M-Einheiten
und G-Einheiten im Hüllenalginat
0,2:1 bis 6:1, noch bevorzugter 0,4:1 bis 1,5:1.
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Es
versteht sich, dass sich das Molekulargewicht, die Konzentration
und das M:G-Verhältnis unabhängig voneinander
auf die Viskosität
und Durchlässigkeit
des Alginats auswirken. Die gewünschte
Viskosität
und Durchlässigkeit
werden durch gleichzeitige Optimierung aller drei Faktoren geregelt.
Im Allgemeinen weisen Alginate mit niedrigerer Konzentration die
gleiche Durchlässigkeit
auf, wenn sie ein höheres
M:G-Verhältnis aufweisen.
Eine 25%ige Lösung
mit einem M:G-Verhältnis
von 1:1 kann beispielsweise ähnliche
Eigenschaften aufweisen wie einen 12%ige Lösung mit einem M:G-Verhältnis von
2:1.
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Das
gewählte
Deckschichtalginat weist hohe Durchlässigkeit und hohe Biokompatibilität auf und
besteht typischerweise aus einer geringen Konzentration Alginat,
das mit Calcium vernetzt ist. Vorzugsweise ermöglicht das Deckschichtalginat
die Diffusion von Molekülen
und/oder Komplexen mit einem Molekulargewicht unter 800 kD, vorzugsweise
unter 400 kD und noch bevorzugter unter 200 kD. Typischerweise besteht
das Deckschichtalginat aus Alginat (10 bis 800 kD, vorzugsweise
20 bis 400 kD, noch bevorzugter 20 bis 400 kD) in einer niedrigen
Konzentration (z.B. 0,5–10%,
vorzugsweise 1–5%,
noch bevorzugter 1,5–3%),
das einen hohen Anteil an M-Ein heiten aufweist; die mit Calcium
vernetzt sind. Vorzugsweise beträgt
das Verhältnis
zwischen M-Einheiten und G-Einheiten im Deckschichtalginat 0,2:1
bis 6:1, noch bevorzugter 0,5:1 bis 2:1, insbesondere 0,6:1 bis
1,5:1.
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Das
Kernalginat wird so gewählt,
dass es eine geeignete Umgebung für die Langerhansschen Inseln (oder
andere Zellen oder Gewebearten) und für die erforderlichen Nährfaktoren
und Nährzellen
bereitstellt. Angesichts der Bedeutung der Sauerstoffdiffusion enthalten
die meisten Implantate beispielsweise Hämoglobin oder andere Sauerstoffträger im Alginat.
Viele Zellen sind in Gegenwart von Collagen gesünder. Andere Nährfaktoren
müssen
für bestimmte
Zellen und Gewebearten geeignet sein. Die optimale Kombination von
Bestandteilen für
den Implantatkern kann mithilfe bekannter Zellkulturverfahren bestimmt
werden.
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Sobald
die Komponenten des Implantatkerns ausgewählt sind, können sie kombiniert werden.
Natrium- (oder Kalium-) Alginat kann zusammen mit einer niedrigen
Konzentration an Citrat verwendet werden, um das Gemisch vollkommen
flüssig
zu halten. Citrat chelatiert Calcium und andere mehrwertige Kationen
stark, sodass sie das Alginat nicht vernetzen und gelieren können.
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7 ist
eine Darstellung einer typischen Form, die zur Herstellung des bioartifiziellen
Implantats verwendet wird. Die Formen sind annähernd kreisförmig, können aber
auch oval sein oder eine andere kompakte Gestalt aufweisen. Die
beiden Hälften
der Form, die in 7A separat dargestellt
sind, können
zusammengesetzt werden, indem ihre Außenringe (7B)
in Berührung
miteinander gebracht und in dieser Position mithilfe von Klemmen
fixiert (7C) werden. Der Hauptteil
der Form 11 ist eine Fritte aus gesintertem Edelstahl (Mott
Metalurgical, NO oder GT) mit einer Porosität zwischen 0,01 und 5 μm, vorzugsweise
etwa 0,4 μm.
Die Fritte 11 kann auch aus Sinterglas oder Keramiksinter
bestehen. Die Fritte 11 ist dick genug, um der gesamten Anordnung
in 7C mechanische Festigkeit zu verleihen.
Der Außenring 21, 22 kann
aus dem gleichen Material bestehen wie die Fritte 11 (wenn
diese nicht zerbrechlich ist, beispielsweise aus gesintertem Edelstahl), oder
aus einem nichtporösen,
starren Material, wie z.B. Edelstahl oder Keramik, wenn die Fritte 11 zerbrech lich ist.
Der Ring 21 der oberen Form ist mit der Fritte 11 bündig. Der
Ring 22 der unteren Form ragt um ein genaues Ausmaß im Bereich
von 10 μm
bis 500 μm über die
Fritte 11 hinaus.
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Die
Formen können
ein- bis dreimal zur Herstellung von Implantaten verwendet werden
und können je
nach Herstellungsstufe in unterschiedlichen Abmessungen bereitgestellt
werden. Ein Formensatz für
eine bestimmte Herstellungsfolge weist ähnliche Durchmesser auf, mit
der Ausnahme dass der Innendurchmesser des Rings 21 bei
einer Form, die für
einen späteren
Schritt bestimmt ist, etwas größer ist.
Die Steigerung des Innendurchmessers kann von 20 μm bis einige
hundert μm
variieren (z.B. 300–400 μm), beträgt aber
typischerweise etwa 50 μm.
In einem Formensatz für
eine bestimmte Herstellungsfolge weist die untere Form 22 zunehmende
Tiefen gemessen zwischen Fritte und Ring auf, um die Ausbildung
späterer
Schichten des Implantats zu ermöglichen.
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Die
Formen können
gegebenenfalls eine Membran 12 umfassen, die an ihre Oberflächen gebunden ist.
Die Membran (z.B. Track-etch/Poretics, Livermore, Kalifornien, USA)
kann eine Porengröße von 0,01 μm bis 0,2 μm aufweisen.
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Die
Formen können
entweder von dem 7 oder dem in 8 dargestellten
Typ sein. Die in 8 dargestellt Form kann verwendet
werden, um Hüllenhälften herzustellen.
Zwei vorgefertigte Hüllenhälften sind zur
Herstellung des Implantats erforderlich, wenn vorgefertigte Hüllenhälften verwendet
werden. Die in 8 dargestellte obere Formhälfte weist
eine hervortretende Scheibe auf, sodass der Hohlraum der Form ein
Blatt mit einem dickeren Ring ("Hüllenhälfte" genannt) definiert.
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Andere
Herstellungsschritte können
eventuell Formen wie sie in 7 dargestellt
sind erfordern. Die Oberflächen
beider Formhälften
sind vorzugsweise flach und können
Hohlräume
aufweisen, die vollständige Blätter definieren.
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Änderungen
der physikalischen Eigenschaften von Alginat in Gegenwart verschiedener
Ionen werden bei den Herstellungsverfahren genutzt. Alginat ist
ein Polymer von Zuckersäuren.
In Gegenwart von einwertigen Gegenionen, wie z.B. Natrium und Kalium,
sind Alginatlösungen
flüssig.
In Gegenwart von mehrwertigen Kationen, wie z.B. Calcium, Barium
und Zink, bildet das Alginat ein Gel. Der Geliermechanismus besteht
darin, dass die mehrwertigen Kationen ionisch an zwei Säuregruppen
im Alginatpolymer gebunden werden und diese vernetzen. Wenn andererseits
ein Chelatbildner, wie z.B. Citrat oder EDTA, mit einem Alginatgel
in Kontakt gebracht wird, lösen
sich die Vernetzungsionen vom Alginatgel und werden vom Chelatbildner
maskiert.
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Diese
Beziehungen sind in der folgenden Darstellung zusammengefasst:
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Diese
Eigenschaft von Alginat wird auf drei Arten genutzt.
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Erstens
wird flüssiges
Alginat, das in eine Form gefüllt
wird, geliert, indem Calcium (oder andere geeignete mehrwertige
Kationen) durch die Fritte diffundieren gelassen werden, indem die
Vorrichtung in eine Lösung
von Calciumchlorid (oder eines oder mehrerer Salze anderer geeigneter
mehrwertiger Kationen) getaucht wird.
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Zweitens
wird flüssiges
Alginat durch einen zweistufigen Prozess effektiv an ein geliertes
Alginat gebunden. Der erste Schritt umfasst das Kontaktieren des
gelierten Alginats mit einem Chelatbildner (z.B. Citrat, 1–100 mM,
vorzugsweise 5–50
mM, noch bevorzugter etwa 10 mM), der im flüssigen Alginat vorhanden ist. Wenn
das flüssige
Alginat, das eine geringe Konzentration an Chelatbildner enthält, mit
dem gelierten Alginat kontaktiert wird, verflüssigt das Citrat an der Grenzfläche die
Oberfläche
des Alginatgels, das sich dann mit dem flüssigen Alginat vermischt.
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Durch
die anschließende
Verwendung eines Geliermittels (in einem zweiten Schritt) wird die
flüssige Alginatschicht
und die verflüssigte
Oberfläche
des Alginatgels, die, zumindest teilweise, mit dem flüssigen Alginat
vermischt wurde, geliert, wodurch als Ergebnis der Bildung von neuen
Vernetzungen zwischen dem Alginatgel der vorher gelierten Schicht
(z.B. dem Kern) und dem neu gebildeten Alginatgel der darauf folgenden Schicht
(z.B. der Hüllenschicht)
eine starke Bindung zwischen den beiden Schichten erzeugt wird.
Auf ähnliche Weise
kann das Alginatgel der Hüllenschicht
an das Alginatgel der Deckschicht gebunden werden.
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Die
Schnelligkeit der Vernetzungsreaktion kann genutzt werden, um eine
glatte Oberfläche
auf dem Implantat zu erzeugen. Wenn die Membranoberfläche der
Form 12 beim Kontaktieren mit dem flüssigen Alginat mit einer Calciumlösung (oder
einer Lösung
eines anderen mehrwertigen Kations) benetzt wird, erzeugt die rasche
Gelierreaktion sofort eine glatte Oberfläche.
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Die
Herstellungsfolge beginnt mit der Ausbildung entweder des Kerns
oder der zwei Hüllenhälften, dann
folgt die Herstellung des mit einer Hülle überzogenen Kerns, und dann
gegebenenfalls die Ausbildung der Deckschicht.
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Eine
typische Herstellungsfolge ist in den 4, 5 und 6 dargestellt.
Die Fritte 11 und Membranen 12 der Formen sind
zu sehen. Die Herstellung des Kerns ist in 4 dargestellt.
Das optionale Kernnetz 2 ist von Alginat 3 und
Inseln 1 umgeben. Man beachte, dass einige Inseln die Membran 6 berühren. Der Kern
wird durch die Diffusion eines Vernetzers (z.B. Calciumionen) durch
die Fritte 11 geliert.
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Die
Herstellung des mit einer Hülle überzogenen
Kerns ist in 5 dargestellt. Der Kern (1–3)
ist nun von der Hülle 4 umgeben.
Das flüssige
Hüllenalginat 4,
das auf die obere und untere Fläche
des Kerns aufgetragen ist und eine geringe Konzentration Citrat
enthält,
vermischt sich mit der Oberfläche
des Kernalginats 3. Man beachte, dass dort, wo eine Insel
die Membran der Kernform 6 berührte, diese nun sicher innerhalb
der Hülle
liegt. Der mit einer Hülle überzogene
Kern wird durch Diffusion eines Vernetzers (z.B. Calciumionen) durch
die Fritte 11 geliert.
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Die
optionale Deckschicht 5 wird wie in 6 dargestellt
hinzugefügt.
Die letzte Schicht, egal ob es sich um die Hülle oder die Deckschicht handelt,
kann hergestellt werden, indem die Oberfläche einer geeigneten Form mit
einer Lösung
eines Vernetzers benetzt und die Lösung des Vernetzers mit dem
flüssigen
Alginat der Oberflächenschicht
in Kontakt gebracht wird, um eine glatte Oberfläche auf dem bioartifiziellen
Implantat bereitzustellen.
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Das
Kernnetz 2 kann gegebenenfalls hinzugefügt werden, um die Festigkeit
des Implantats zu erhöhen.
Bei höheren
Alginatkonzentrationen ist Alginatgel ausreichend widerstandsfähig, sodass
kein Netz erforderlich ist. Das Netz kann aus einem beliebigen natürlichen
oder synthetischen Monofilament- oder Multifilamentpolymer bestehen.
Das in 9, 10 und 11 dargestellte
Multifilamentgarnnetz bringt außerdem den
Vorteil mit sich, dass das Alginatgel die Netzfasern durchdringen
kann, was die Bindung des Kernalginats 3 an das Netz 2 erhöht.
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Die
Dicke des Implantats und seiner einzelnen Schichten wird durch die
Formabmessungen gesteuert. Um ein Implantat mit einer Dicke von
400 μm herzustellen,
kann die Kernform beispielsweise eine Hohlraumtiefe von 300 μm aufweisen.
Die Hüllenform
kann dann eine Hohlraumtiefe von 350 μm aufweisen und die Deckschichtform
eine Hohlraumtiefe von 400 μm.
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3 zeigt
ein alternatives Verfahren zur Herstellung des mit einer Hülle überzogenen
Kerns. Hier wurden die Hüllenhälften 4 vorher
in der in 8 dargestellten Form hergestellt.
Dann werden der flüssige Kern 1 und 3 und
das Netz 2 zugesetzt und die Formen zusammengepresst. Die
Bindung zwischen den gelierten Hüllenhälften 4 und
dem flüssigen
Kern 3 erfolgt wie oben beschrieben, wonach die Anordnung
in einen Vernetzer (z.B. Calciumionenlösung) getaucht wird, um eine
vollständige
Gelierung des gesamten mit einer Hülle überzogenen Kerns zu erreichen.
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3 zeigt
außerdem
die entscheidenden Bereiche nahe des Randes der Form, wo der Kern
und die beiden Formhälften
zusammenstoßen.
Die Abmessungen des Im plantats und seiner Schichten werden wie oben
beschrieben durch die Formabmessungen gesteuert.
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Eine ähnliche
Wirkung wie durch das Verflüssigungsmittel
kann erzielt werden, indem Barium in das Gel eindiffundiert wird,
bevor das flüssige
Alginat in Kontakt mit dem gelierten Alginat gebracht wird. Das
an die Alginsäure
gebundene Barium wird durch die einwertigen Kationen des flüssigen Alginats
verdrängt
und diffundiert dort, wo es mit Resten des flüssigen Alginats wechselwirkt,
aus dem Gel in die Flüssigkeit,
wodurch es das flüssige
Alginat teilweise vernetzt und das Alginatgel teilweise verflüssigt. Eine
darauf folgende Behandlung mit einem Chelatbildner vervollständigt die
Vernetzung der beiden Schichten.
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Eine
weitere Variante besteht in der Herstellung von Hüllenhälften durch
Auftragen von flüssigem
Alginat auf Membranen, die durch Benetzung mit einem Verflüssigungsmittel
vom frisch hergestellten, mit einer Hülle überzogenen Kern abgezogen werden
können.
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Es
gibt zahlreiche weitere Variationen des Gelier-, Vernetzungs- und
Diffusionsablaufs mithilfe von Gelier- und Verflüssigungsmitteln, von denen
einige in den Beispielen beschrieben werden.
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Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung anhand einiger spezifischer, nicht
einschränkender
Beispiele genauer erläutert.
Sofern nicht anders angegeben sind die Prozentsätze in Gewichtsprozent und
die Temperatur in Grad Celsius angegeben. Alle Lösungen sind wässrig, sofern
nicht anders angeführt.
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Beispiel 1
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Herstellung
einer Na-Alginatlösung
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Kurz
zusammengefasst wurde eine Lösung
eines Na-Alginats (LV Alginate/Kelco Division von Merck & Co.) durch Filtration
gereinigt und mit aktivierter Kohle (perchlo ratgebleicht) behandelt.
Die resultierende Lösung
wurde ausgefällt,
indem der pH mit HCl auf 2 eingestellt wurde. Der Niederschlag wurde
in einer 120-mM-NaCl-5-μM-EDTA-10-mM-HEPES-Lösung wieder
gelöst
und durch Zusatz von Ethanol erneut ausgefällt. Der Niederschlag wurde
teilweise in 1 M KCl wieder gelöst,
und der verbleibende unlösliche
Anteil wurde in einer 120-mM-NaCl-5-μM-EDTA-10-mM-HEPES-Lösung gelöst und durch Zusatz von Ethanol
erneut ausgefällt.
Der letzte Niederschlag wurde gründlich
mit Ethanol gewaschen und bei 80°C
im Vakuum getrocknet.
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Um
Alginatlösungen
mit einer Konzentration unter 5% herzustellen, wurde das resultierende
trockene Material wieder in 10 mM HEPES, 10 mM Na-Citrat, 110 mM
NaCl gelöst,
gegen 10 mM HEPES, 10 mM Na-Citrat, 110 mM NaCl dialysiert (10 kD)
und durch eine 0,1-μm-Membran
filtriert.
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Um
Alginatlösungen
mit einer Konzentration von über
5% herzustellen, wurde das resultierende trockene Material zu einer
1%igen Lösung
gelöst,
gegen H2O dialysiert (10 kD) und dann durch
eine 0,1-μm-Membran
filtriert. Das Alginat wurden steril gefriergetrocknet und dann
in sterilem 10 mM HEPES, 10 mM Na-Citrat, 110 mM NaCl wieder in
der gewünschten
Konzentration gelöst.
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Beispiel 2
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Herstellung
einer Inselsuspension
-
Der
Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
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Aus
Ratten isolierte Inseln wurden mit isotonischem NaCl gewaschen und
mit einer 2%igen Alginatlösung
(durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellt) zu
einer Konzentration von 150.000 Inseln pro Milliliter suspendiert.
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Beispiel 3
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Herstellung
eines bioartifiziellen Implantats durch ein Beschichtungsverfahren
für Gummiformteile
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Der
Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
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Unter
Verwendung der Hüllenform
wurden die beiden Hälften
der Hülle
wie folgt hergestellt. Ein dünner Kunststofffilm
wurde auf die obere Hüllenform
aufgetragen. Eine 20%ige Na-Alginatlösung wurde gemäß dem Verfahren
aus Beispiel 1 hergestellt, dann wurde ein Menge, die ausreicht,
um eine 20-μm-Alginat-Hüllenhälfte herzustellen,
auf die untere Form aufgetragen. Dieses Material wird als Gummi
bezeichnet, weil es, obwohl es flüssig ist, aufgrund der hohen
Alginatkonzentration viskos ist. Die beiden Formhälften wurden
zusammengepresst. Die obere Form wurde entfernt, und der dünne Kunststofffilm
wurde vorsichtig von der Hüllenhälfte abgezogen.
Die zweite Hüllenhälfte wurde
auf die gleiche Weise hergestellt.
-
Eine
Hälfte
der in Beispiel 2 beschriebenen Inselsuspension wurde auf die hergestellte
Hüllenhälfte aufgetragen,
die in der unteren Hüllenform
verblieben war. Ein Netz (Allied Silicone, Ventura, Kalifornien,
USA) wurde auf eine Größe zugeschnitten,
die etwas kleiner als der Innendurchmesser der Form war (sodass
es in die Vertiefung in der hergestellten Hüllenhälfte passt, die für den Kern
gedacht ist). Die verbleibende Hälfte
der Inselsuspension wurde auf das Netz in der unteren Hüllenform
gefüllt.
Das Gesamtvolumen des Netzes und der Suspension wurde so gewählt, dass
es den Hohlraum zwischen den Hüllenhälften exakt
ausfüllte.
Die andere untere Hüllenform
wurde umgedreht und vorsichtig auf die auf die erste Hüllenform
gepresst und festgeklemmt. Da sowohl der Kern als auch die Hüllenalginate
flüssig
sind, diffundierten sie sofort ineinander. Die Anordnung wurde 30
Minuten lang in eine 120-m-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und
der mit einer Hülle überzogene
Kern wurde entnommen.
-
Die
obere und untere Form wurden mit einer Lösung aus 120 mM CaCl2 und 10 mM HEPES benetzt. Eine 2%ige Lösung eines
Na-Alginats wurde durch das Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt,
und zwar ein Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht ausreicht.
Eine Hälfte
der Na-Alginatlösung
wurde in die Deckschichtform gefüllt.
Der mit einer Hülle überzogene
Kern wurde gründlich
mit wässrigem
120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen und vorsichtig in die Deckschichtform
eingebracht. Die zweite Hälfte
der Na-Alginatlösung
wurde in die Deckschichtform gefüllt.
Die obere Deckschichtform wurde auf die untere Deckschichtform gepresst
und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine wässrige 120-mM-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und
der mit einer Deckschicht und einer Hülle überzogene Kern (das komplette
bioartifizielle Implantat) wurde entnommen.
-
Beispiel 4
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Herstellung
eines bioartifiziellen Implantats durch teilweise Hüllenverflüssigung
-
Der
Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
-
Unter
Verwendung der Hüllenform
wurden die beiden Hälften
der Hülle
wie folgt hergestellt. Eine 20%ige Na-Alginatlösung wurde gemäß dem Verfahren
aus Beispiel 1 hergestellt, dann wurde ein Menge, die ausreicht,
um eine 20-μm-Alginat-Hüllenhälfte herzustellen,
auf jede der unteren Hüllenformen
aufgetragen. Die beiden oberen Formen wurden auf die unteren Formen
gesetzt, zusammengepresst und zusammengeklemmt. Die Anordnung wurde
30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen.
-
Die
obere Form wurde entfernt, und die Hüllen wurden an Ort und Stelle
gründlich
mit 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen. Eine Hälfte der in Beispiel 2 beschriebenen
Inselsuspension wurde auf die hergestellte Hüllenhälfte aufgetragen, die in der
unteren Hüllenform
verblieben war. Ein Netz (Allied Silicone, Ventura, Kalifor nien,
USA) wurde auf eine Größe zugeschnitten,
die etwas kleiner als der Innendurchmesser der Form war (sodass
es in die Vertiefung in der hergestellten Hüllenhälfte passt, die für den Kern
gedacht ist). Die verbleibende Hälfte
der Inselsuspension wurde auf das Netz in der unteren Hüllenform
aufgebracht. Das Gesamtvolumen des Netzes und der Suspension wurde
so gewählt,
dass es den Hohlraum zwischen den Hüllenhälften exakt ausfüllte. Die
andere untere Hüllenform
wurde umgedreht und vorsichtig auf die auf die erste Hüllenform
gepresst und festgeklemmt. Nach 5 Minuten Inkubation, um eine teilweise
Auflösung
des Hüllenalginatgels
durch Wechselwirkung mit Citrat in der Inselalginatsuspension zu
ermöglichen,
wurde die Anordnung 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und
der mit einer Hülle überzogene
Kern wurde entnommen.
-
Die
obere und untere Deckschichtform wurden mit einer Lösung von
120 mM CaCl2 und 10 mM HEPES benetzt. Eine
2%ige Lösung
eines Na-Alginats wurde durch das Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt,
und zwar ein Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht
ausreicht. Eine Hälfte
der Na-Alginatlösung wurde
in die Deckschichtform gefüllt.
Der mit einer Hülle überzogene
Kern wurde gründlich
mit wässrigem
120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen und vorsichtig in die Deckschichtform
eingebracht. Die zweite Hälfte
der Na-Alginatlösung
wurde in die Deckschichtform gefüllt.
Die obere Deckschichtform wurde auf die untere Deckschichtform gepresst
und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine wässrige 120-mM-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat
zu vernetzen. Die beiden Formhälften
wurden getrennt, und der mit einer Deckschicht und einer Hülle überzogene
Kern (das komplette bioartifizielle Implantat) wurde entnommen.
-
Beispiel 5
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Herstellung
eines bioartifiziellen Implantats durch teilweise Kern-Hüllen-Grenzflächenverflüssigung
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Der
Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
-
Unter
Verwendung der Hüllenform
wurden die beiden Hälften
der Hülle
wie folgt hergestellt. Eine 20%ige Na-Alginatlösung wurde gemäß dem Verfahren
aus Beispiel 1 hergestellt, dann wurde ein Menge die ausreicht,
um eine 20-μm-Alginat-Hüllenhälfte herzustellen,
auf jede der unteren Hüllenformen
aufgetragen. Die beiden oberen Formen wurden auf die unteren Formen
gegeben, zusammengepresst und zusammengeklemmt. Die Anordnung wurde
30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen.
-
Die
obere Form wurde entfernt, und die Hüllen wurden an Ort und Stelle
gründlich
mit 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen. Eine Hälfte der in Beispiel 2 beschriebenen
Inselsuspension wurde in die untere Hüllenform gefüllt. Ein
Netz (Allied Silicone, Ventura, Kalifornien, USA) wurde auf eine
Größe zugeschnitten, die
etwas kleiner als der Innendurchmesser der Form war (sodass es in
die Vertiefung in der hergestellten Hüllenhälfte passt, die für den Kern
gedacht ist). Die verbleibende Hälfte
der Inselsuspension wurde auf das Netz in der unteren Hüllenform
aufgebracht. Das Gesamtvolumen des Netzes und der Suspension wurde
so gewählt,
dass es den Hohlraum zwischen den Hüllenhälften exakt ausfüllte. Die
beiden Formen wurden zusammengepresst und festgeklemmt. Die Anordnung
wurde 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen.
-
Die
obere und untere Kernform wurden getrennt, und der Kern wurde herausgenommen.
Einige Tropfen 1,5%iges Na-Alginat-10-mM-Na-Citrat-10-mM-HEPES-110-mM-NaCl wurden in die
Mitte einer der Hüllenhälften in
der Hüllenformhälfte aufgebracht.
Der Kern wurde darauf aufgebracht, und einige Tropfen 1,5%iges Na-Alginat-10-mM-Na-Citrat-10-mM-HEPES-110-NaCl
wurden auf den Kern aufgetragen. Die andere Hüllenhälfte in ihrer Hüllenform
wurde daraufgepresst, und die gesamte Anord nung wurde zusammengeklemmt. Dann
wurde die Anordnung 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um den Alginatkern an die Hülle
zu binden. Die beiden Formhälften
wurden getrennt, und der mit einer Hülle überzogene Kern wurde entnommen.
-
Die
obere und untere Deckschichtform wurden mit einer Lösung von
120 mM CaCl2 und 10 mM HEPES benetzt. Eine
2%ige Lösung
eines Na-Alginats wurde durch das Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt,
und zwar ein Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht
ausreicht. Eine Hälfte
der Na-Alginatlösung wurde
in die Deckschichtform gefüllt.
Der mit einer Hülle überzogene
Kern wurde gründlich
mit 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen und vorsichtig in die Deckschichtform
eingebracht. Die zweite Hälfte
der Na-Alginatlösung
wurde in die Deckschichtform gefüllt.
Die obere Deckschichtform wurde auf die untere Deckschichtform gepresst
und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine wässrige 120-mM-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und
der mit einer Deckschicht und einer Hülle überzogene Kern (das komplette
bioartifizielle Implantat) wurde entnommen.
-
Beispiel 6
-
Herstellung
eines bioartifiziellen Implantats durch ein Diffusionsbeschichtungsverfahren
-
Der
Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
-
Eine
Hälfte
der in Beispiel 2 beschriebenen Inselsuspension wurde in die untere
Kernform gegeben. Ein Netz (Allied Silicone, Ventura, Kalifornien,
USA) wurde auf eine Größe zugeschnitten,
die etwas kleiner als der Innendurchmesser der Form war (sodass
es in die Vertiefung in der hergestellten Hüllenhälfte passt, die für den Kern
gedacht ist). Die verbleibende Hälfte
der Inselsuspension wurde auf das Netz in der unteren Kernform aufgebracht.
Das Gesamtvolumen des Netzes und der Suspension wurde so gewählt, dass
es den Hohlraum zwischen den Hüllenhälften exakt ausfüllte. Die
beiden Formen wurden zusammengepresst und festgeklemmt. Die Anordnung
wurde 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen.
-
Die
obere und untere Kernform wurden getrennt, und der Kern wurde entnommen
und 5 Minuten lang in 120 mM BaCl2, 10 mM
HEPES getaucht, um eine Austauschreaktion zwischen Ca- und Ba-Ionen
zu bewirken. Dann wurde. der Kern gründlich mit 120 mM NaCl gewaschen.
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Eine
Lösung
von 20% Na-Alginat, die gemäß dem Verfahren
aus Beispiel 1 hergestellt worden war, mit einem Volumen, das zur
Herstellung einer 20-μm-Deckschicht
ausreicht, wurde hergestellt, und die Hälfte des Volumens wurde auf
die untere Hüllenform
aufgetragen. Der Kern wurde daraufgegeben, mit der verbleibenden
Alginatlösung
bedeckt und 5 Minuten lang inkubiert, damit ein Austausch zwischen
dem Natrium in der Hüllenalginatlösung und
dem an das Kernalginat gebundenen Barium stattfinden kann und das
freigesetzte Barium in das Hüllenalginat
diffundieren und dieses vernetzen kann. Die Anordnung wurde dann
30 Minuten lang in eine 120-mM-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat
zu vernetzen. Die beiden Formhälften
wurden getrennt und der mit einer Hülle überzogene Kern wurde entnommen.
-
Die
obere und untere Deckschichtform wurden mit einer Lösung von
120 mM CaCl2 und 10 mM HEPES benetzt. Eine
2%ige Lösung
eines Na-Alginats wurde durch das Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt,
und zwar ein Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht
ausreicht. Eine Hälfte
der Na-Alginatlösung wurde
in die Deckschichtform gefüllt.
Der mit einer Hülle überzogene
Kern wurde gründlich
mit 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen und vorsichtig in die Deckschichtform
eingebracht. Die zweite Hälfte
der Na-Alginatlösung
wurde in die Deckschichtform gefüllt.
Die obere Deckschichtform wurde auf die untere Deckschichtform gepresst
und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine wässrige 120-mM-CaCl2-10-mM-HEPES-Lösung getaucht,
um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und
der mit einer Deckschicht und einer Hülle überzogene Kern (das komplette
bioartifizielle Implantat) wurde entnommen.
-
Beispiel 7
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Langerhanssche-Inseln-Implantat
in Mäusen
mit Diabetes (IP)
-
In
Balb/C-Wirtsmäusen
wurde durch eine IP-Injektion von 250 mg/kg Streptozotocin, und
zwar 50 mg/ml in 0,1 M Citratpuffer, pH = 4,5 einige Tage vor einer
Implantation, Diabetes hervorgerufen. Bioartifizielle Implantate,
die gemäß Beispiel
4 hergestellt worden waren und 2000–3000 Inseln enthielten, wurden
durch einen Bauchschnitt in die Cavitas peritonealis eingebracht,
und die Mäuse
wurden vernäht.