-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Extrakte von Zellen oder Gewebe oder
deren Überstände, die
eine Proliferation von Zellen oder Gewebe inhibieren können. Die
Erfindung stellt ebenso Zusammensetzungen bereit, die derartige
Extrakte ebenso umfasst wie eine pharmazeutische, kosmetische und
landwirtschaftliche Anwendungen der Zusammensetzungen und Extrakte.
-
Keimruhe
ist ein Phänomen,
das bei Vertretern des Pflanzenreiches ebenso wie im Tierreich aufgefunden
wird.
-
Die
Keimung verschiedener Körner
und Samen, die die notwendigen Proliferationsorgane umfassen, ist
unter bestimmten Umständen
verzögert,
wobei die Körner
oder Samen dennoch nach verschieden Zeiträumen keimen können. Der
Zeitraum in dem eine Keimung derartiger Samen verzögert werden
kann ist unterschiedlich und hängt
sowohl von den Samen innewohnenden Eigenschaften als auch von der
Beschaffenheit und Extremität
der Umweltbedingungen ab. Es wurde gezeigt, dass Samen für wenige
Tage, ein Jahr, mehrere Jahre und sogar mehr als einige Jahrhunderte
(wie im Fall von einigen Nympheaceae und Samen der Bäume der
Leguminos Familie (Shen-Miller, J., et al., American Journal of
Botany, 82 (1995) 1367–1380)
spät entdeckt wurde)
in Keimruhe verbleiben können.
-
In
einigen Fällen
beruht die Fähigkeit
zur Entwicklung der Keimruhe auf den Embryohüllen. In einem derartigen Fall
führt die
Trennung der Hüllen
von dem Embryo zu seiner sofortigen Keimung.
-
In
anderen Fällen
liegen chemische Wachstumsinhibitoren in dem Embryo selbst vor,
die eine Keimung verhindern können,
so dass sogar ein bloßer
Embryo ruhend bzw. in Keimruhe befindlich (wie im Fall der Rosacea
Pflanzen, wie beispielsweise Kenia, Pfirsich, usw.) verbleiben kann.
-
Bei
Pflanzen kann ein Zustand der Keimruhe in der gesamten Pflanze oder
in einem oder mehreren ihrer Teile vorgefunden werden. Ruhende Pflanzen
sind Pflanzen, die zwei metabolische Hauptzustände in ihren Wachstumszyklus
aufweisen. In ihrem ruhenden Zustand ist der pflanzliche Metabolismus äußerst gering und
der pflanzliche Wachstumsvorgang ist signifikant inhibiert, obgleich
eine Differenzierung gewisser Zellen auftreten kann. In ihrem aktiven
Zustand ist die pflanzliche Metabolismusrate höher, die Zellen teilen sich
und differenzieren und ein signifikantes Wachstum verschiedener
Pflanzenteile liegt vor. Dies trifft bei Narcissus Pflanzen zu,
in denen während
des Ruhezustands als das einzige verbleibende lebensfähige Teil
die Zwiebel verbleibt, die sich in ihrem ruhenden Zustand befindet.
Einige Teile der Pflanzen können
in anderen Fällen
aktiv sein, während
andere Teile in Keimruhe vorliegen können wie es beispielsweise
bei Apfelbäumen
zutrifft.
-
Von
Substanzen die eine Keimung inhibieren können wurde ebenso gezeigt,
das sie in dem Saft fleischiger Früchte oder in anderen Pflanzenorganen
vorliegen, die Saft erzeugen. Beispiele stellen Tomaten, Trauben,
Kiwi, Wassermelone und Pampelmuse dar, bei denen in der Frucht vorliegende
Kerne nicht keimen, obgleich ihre Umgebungen aufgrund des Wassers
in der Frucht zur Keimung geeignet sind.
-
Es
wurde von mehreren von Pflanzen abgeleiteten Substanzen berichtet,
die einen Effekt auf die Zellproliferation aufweisen. Die EP-A-0
381 514 beschreibt beispielsweise Zusammensetzungen, die sowohl
natürlich
abgeleitete als auch künstlich
erzeugte Sphingolipide umfassen, die eine wachstumsinhibierende
Aktivität
auf verschiedene Zellarten aufweisen. Eine andere gut bekannte von
einer Pflanze abgeleitete Substanz mit anti-mitotischem Effekt auf
verschiedene Arten menschlicher Zellen ist die Substanz Colchicin
(Samson, F. E., A. Rev. Pharmac. Toxic, 16 (1976) 143). Von dem
Narcissus Alkaloid, Pretazettin, wurde gezeigt, dass es einen cytotoxischen
Effekt auf Rausher Virusträger
Zellen ebenso wie eine gegen Leukämie gerichtete Aktivität in Leukämie-Mäusen aufweist,
obgleich die vorherrschende Aktivität der Substanz als eine antivirale
Aktivität (Furusawa,
E. et al., Chemotherapy, 26 (1980) 36–45 und Furusawa, E. et al.,
Proc. Soc. Exp. Biol. Med., (1976) 152186-191) gezeigt wurde. Von
Ulex europaeus Samenextrakten wurde gezeigt ein nicht-Glycoprotein Lectin
zu umfassen, das das Wachstum von bestimmten Lymphozyten ebenso
wie das Wachstum mehrerer reticulärer endothelier Tumorzelllinien
(Pirofsky, B., et al., Vox-Sang, 42 (1982) 295–303 und Pirofsky, B., et al., J:
Biol. Response Mod., 2 (1983) 175–185) reversibel inhibieren
kann. Von Wurzleextrakt von Panex ginseng wurde gezeigt die DNA
Synthese zu inhibieren, die durch [H3]-Thymidin
Aufnahme von V 79 Lungenzellen vom chinesischen Hamster bestimmt
wurde. Von einer anderen Substanz, Narciclasin, die aus Zwiebeln
verschiedener Narcissus Arten erhalten wurde, wurde neben anderen
ihrer Aktivitäten
gezeigt das Wachstum von Weizenkornwurzeln (wheat kernel radicals)(Ceriotti,
G., et al., Tumors 53 (1967) 359–371) zu inhibieren. Von Zwiebeln
der auf Hawaii gesammelten Pacratium littoral wurde gefunden ein
Pancratistatin genanntes Produkt zu enthalten, das das Wachstum
von verschiedenen neoplastischen Zelllinien in vitro (Pettit, G.
R., et al., J. Nat. Prod., 49 (1986) 995–1002) inhibieren kann.
-
Die
JP-A-55177865 (Kosugi Kikuo, am 16. Dezember 1980 eingereicht) berichtet über die
Verwendung einer aus Zwiebeln der Cluster-Amaryllis der Amaryllideous
Pflanze oder Narcissus extrahierten Lösung für die Herstellung einer kosmetischen
Zusammensetzung, um das Altern der Haut und das Auftreten der Flecken
zu verhindern, die durch den Einfluss des Sonnenlichts verursacht
werden, und einen verschönenden Einfluss
auszuüben.
-
Hiergegen
weisen viele Pflanzenextrakte einen entgegengesetzten Effekt auf
Zellen aus, d.h. die Befähigung
ihre Proliferation zu erhöhen
wurde ebenso beschrieben, wie beispielsweise für den methanolischen Extrakt
der Wurzel von Scutellaria baicalensis georgi gezeigt wurde die
zelluläre
Aktivität
von Fibroblasten (Chung, C. P., et al., Planta-Med, 61 (1995) 150–153) signifikant
zu erhöhen.
Gibberellin-ähnliche
Wachstumssubtanzen wurden in sechs verschiedenen Pflanzenspezies
mit Zwiebeln gefunden (Staby, G. L., Hort. Science, (1970) 399–400). Mehrere
Cytokine wurden in Wurzeln vorgefunden, die sich aus Narcissus Zwiebeln entwickelten,
und wiesen einen Effekt auf das Zwiebelwachstum der Pflanzen auf,
in denen sie nachgewiesen wurden (Vanstaden, J. V., Pflanzenphysiol.,
86 (1978) 323–30).
-
Das
Phänomen
der Keimruhe kann ebenso im Tierreich, beispielsweise bei dem kleinen
Krebstier Artemia salina (Finamore and Clegg, In:The Cell Cycle,
Academic Press Ed., (1969) 249–278)
vorgefunden werden. Die natürliche
Umgebung dieses marinen Krebstieres sind für gewöhnlich salzige Teiche. Nach
der Befruchtung beinhalten die frühen Entwicklungsstadien der
Artemia die Bildung einer Blastula, die schließlich zu einer Gastrula wird.
Unter harten Umweltbedingungen, wie beispielsweise Dehydrierung
(Trockenheit), kann die Gastrula eine Zyste bilden, in der der gesamte
Organismus in eine Keimruhephase eintritt. Die ruhende Artemia Gastrula
(im Allgemeinen fälschlich "Artemiaeier" genannt) können viele
Jahre in ihrem Ruhezustand verbleiben. Die verschiedenen metabolischen
Aktivitäten
der Artemia werden wieder aufgenommen und Proteinsynthese kann nach
ungefähr
10 Minuten beobachtet werden, wenn die in der Zyste befindliche
Gastrula rehydriert wird. DNA Synthese und Zellteilung liegen allerdings
bis nach ungefähr
60 Stunden (Le Gal, Y, In: Biochimie Marine, (Ed. Masson)(1988)
176) nicht vor.
-
Verschiedene
von Pflanzen abgeleitete Zusammensetzung (wie beispielsweise Retinolsäure (
US 5,438,073 ) und α-Hydroxy-Säuren (Ditre,
C. M., et al., J. Am. Acad. Dermatol., 34 (1996) 187–195)) ebenso wie
von Tieren abgeleitete Extrakte wurden zur Verwendung im kosmetischen
Gebiet zur Stimulation der Proliferation und Erneuerung der Epidermalzellen
vorgeschlagen. Derartige Zusammensetzung wurden im kosmetischen
Gebiet als nützlich
angesehen, wo es anerkannt wird, dass der natürliche Erneuerungsvorgang der Epidermis
bei der Alterung verlangsamt ist. Es wird angenommen, dass die Entfernung
der äußeren Oberfläche mit
gleichzeitiger Stimulation des Wachstums neuer Zellen in den inneren
Schichten der Epidermis, um sich zu teilen und zur äußeren Oberfläche zu wandern,
zur Erneuerung der Haut und zu einem jüngeren Erscheinungsbild der
Haut führen
wird. Es ist allerdings bekannt und wurde neuerdings gezeigt, dass
die Zunahme bei der Zellteilung eine wichtige Rolle bei der Umformung
gewöhnlicher
Zellen zu prämalignen
oder malignen Zellen (Ames, B. N. et al., Environ. Health Perspect,
01 (1993) 35–44)
einnimmt.
-
Es
wird weiterhin heutzutage angenommen, dass gewöhnliche menschliche und tierische
Zellen eine endliche Kapazität
zur Replikation aufweisen. Es wurde gezeigt, dass die Zahl mitotischer
Ereignisse, welche kultivierte gewöhnliche tierische Zellen durchlaufen
können,
umgekehrt in Beziehung auf das Alter des Donors, von dem sie erhalten
wurden (Hay flick, L., Clin. Geriatr. Med., 1 (1985) 15–27), erscheinen.
Es wurde ebenso gezeigt, dass von Patienten mit beschleunigten Alterungssyndromen
erhaltene Zellkulturen weniger Reproduktionen durchlaufen als Zellkulturen,
die von Alters-Abgeglichenen Kontrollindividuen erhalten wurden.
-
Im
Nachstehenden wird die Bedeutung einiger Ausdrücke erläutert, die im nachstehenden
Text verwendet werden.
-
Keimruhe
bzw. Ruhe bzw. Ruhezustand (dormancy) – ein Zustand in dem eine merkliche
Abnahme bei der metabolischen Rate der Zellen oder Gewebe vorliegt,
was zu der Inhibierung des Wachstums und Proliferation der Zellen
oder des Gewebes führt.
-
Keimruhesubstanzen
(Dormans) – Substanzen,
die für
gewöhnlich
in Zellen oder Gewebe gefunden werden und die Zellen oder Gewebe
induzieren können,
um in einen Ruhezustand einzutreten oder den Ruhezustand in Zellen
oder Geweben aufrechtzuerhalten, die bereits in diesen Zustand eingetreten
sind. Die Keimruhesubstanzen können
von einer Vielzahl von Teilen von Pflanzen erhalten werden, die
in der Lage sind in einen Ruhezustand einzutreten; von Saft oder
verschiedenen Früchten,
die Keimruhesubstanzen enthalten, die ein Keimen von Samen bzw.
Keim in der Frucht inhibieren können;
von Tieren, die in eine Ruhephase in ihrem Lebenszyklus, beispielsweise
die Gastrula von gewissen Krebstieren wie beispielsweise Artemia
oder Dafnia, usw., eintreten können.
In einigen Fällen
werden die Keimruhesubstanzen in einem ruhenden Gewebe, beispielsweise
in einem ruhenden Samen oder in der Gastrula von Artemia oder Dafnia,
gefunden; in anderen Fällen
werden die Keimruhesubstanzen in einem Gewebe gefunden, dass das
ruhende Gewebe oder Organ umgibt, beispielsweise in einem einen
ruhenden Samen umgebenden Fruchtsaft.
-
Extrakt – mindestens
eine Substanz, die durch irgendeine einer Vielzahl von im Stand
der Technik bekannten Extraktionsverfahren erhalten wird. Der Extrakt
kann beispielsweise ein wässriger
Extrakt sein, ein Glykol-Extrakt, ein alkoholischer Extrakt, ein Öl-Extrakt,
usw.. Der Extrakt wird erfindungsgemäß von Zellen oder Geweben aus
einem Teil einer Pflanze oder eines Tieres erhalten, die in einen
Ruhezustand eintreten können.
Die Zellen oder das Gewebe können
von der Pflanze oder dem Tier unmittelbar erhalten werden und der
Extrakt kann anschließend
daraus hergestellt werden. Zellkulturen können alternativ zuerst aus
den pflanzlichen oder tierischen Zellen oder Geweben hergestellt
werden und anschließend
können
die Zellkulturen für verschiedene
Zeitspannen wachsen gelassen werden. Die Zellen werden, um einen
Extrakt herzustellen, anschließend
von den Zellkulturen geerntet, die Zellen und ihr Wachstumsmedium
werden getrennt und ein Extrakt kann entweder von den Zellen selbst
oder von dem Wachstumsmedium (was als "Überstand" bezeichnet werden
wird) hergestellt werden, das die von den Zellen in ihr Wachstumsmedium
sekretierten Substanzen enthält.
Der "Extrakt" kann daher von pflanzlichem
oder tierischem Gewebe oder von einer tierischen oder pflanzlichen
Zelle oder Gewebekultur unmittelbar erhalten werden.
-
Keimruhesubstanz-Extrakt
(dorman-extract) – ein
Extrakt, der von einer pflanzlichen Zelle oder Gewebe, von einer
Frucht oder von einer tierischen Zelle oder Gewebe, die Keimruhesubstanzen
umfassen, erhalten wird.
-
Angereicherte
Keimruhesubstanz-Präparation
(EDP) – eine
Präparation,
die von einer natürlichen Quelle
abgeleitet ist, die Keimruhesubstanzen in einer höheren Konzentration
umfasst als der, die in einem natürlichen unverarbeiteten Extrakt
gefunden wird. Die EDP kann durch Aufreinigung eines natürlichen
Extraktes erhalten werden, um Fraktionen zu erhalten, die Keimruhesubstanzen
in der höheren
Konzentration enthalten, beispielsweise durch verschiedene Chromatographieverfahren,
durch Filtration, usw., ebenso wie durch biologische Mittel einschließlich das
Wachstum von Zellen oder Gewebe, die Keimruhesubstanzen unter Bedingungen
herstellen können,
bei denen sie Keimruhesubstanzen in vergleichsweise großen Mengen
herstellen und Sammeln ihrer sekretierten Produkte. Die Präparation
kann, um festzustellen, ob eine Präparation eine angereicherte
Keimruhesubstanz Präparation
ist, auf eine bestimmte biologische Aktivität untersucht werden, die, wie
nachstehend beschrieben, mit Keimruhesubstanzen zusammenhängt. Im
Vergleich zu der natürlichen
Präparation
enthält
EDP eine wesentlich höhere
Konzentration an Keimruhesubstanzen, beispielsweise mindestens das
1,5 fache, vorzugsweise das 2 fache und typischerweise mindestens
das 2,5 fache der Konzentration der Keimruhesubstanzen in der natürlichen
Präparation.
-
Erzeugerzellen
oder Erzeugergewebe – Zellen
oder Gewebe, die Keimruhesubstanzen herstellen können, die anschließend daraus
extrahiert werden können.
-
Zielzellen
oder Zielgewebe – Zellen
oder Gewebe, die mit Keimruhesubstanzen erfindungsgemäß zusammengebracht
werden und die dadurch in einen Inhibierungszustand ihres Wachstums
oder Proliferation eintreten oder einen derartigem Zustand als Ergebnis
des Kontakts mit den Keimruhesubstanzen beibehalten.
-
Keimruhesubstanzen
Analog – eine
Substanz, für
gewöhnlich
synthetisch, die eine Keimruhesubstanz ähnliche Aktivität aufweist,
derartig dass sie Keimruhe in den gleichen Zellen oder Gewebe induzieren
kann, die zur Keimruhe durch die Keimruhesubstanz induziert werden,
und die erfindungsgemäß ebenso
so in der Lage ist Wachsrum und Proliferation der Zielzellen oder
des Gewebes zu inhibieren.
-
Keimruhesubstanz
Zusammensetzung(DC) – ein
wasserlösliches
Extrakt umfassend als aktiven Bestandteil eine Menge an Keimruhesubstanz
(bspw. als ein Keimruheextrakt) oder Keimruhesubstanz Analog effektiv
bei der Inhibition von Wachstum und Proliferation von Zielzellen
oder Gewebe ("effektive
Menge"). Eine Keimruhesubstanz
Zusammensetzung kann ein natürlich
abgeleitetes EDP umfassen, eine Zusammensetzung die sowohl synthetische
Keimruhesubstanzen ebenso wie Keimruhesubstanzen Analoge umfasst.
-
Aktiver
Extrakt (AE)-Extrakte, die von Zellen oder Geweben als ein Teil
einer Pflanze oder eines Tieres erhalten werden, die in einen Keimruhezustand
während
des nicht ruhenden Zustandes eintreten können.
-
Erfindungsgemäß wird eine
Keimruhesubstanz Zusammensetzung verwendet. Die Zusammensetzungen
werden zur Inhibition der Proliferation von Zellen verwendet, insbesondere
von Zellen die xenogenetisch für
die Erzeugerzelle oder Gewebe sind. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die Zusammensetzungen in der Humanmedizin und
Kosmetik verwendet. Gemäß einer
anderen Ausführungsform werden
die Zusammensetzungen zur Steuerung des pflanzlichen Wachstums verwendet.
In einer noch anderen Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
bei der Konservierung von Nahrungsmitteln verwendet.
-
Durch
eine Ausführungsform
der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen
Extraktes bereitgestellt, der eine Proliferation von Zielzellen
oder Zielgewebe inhibiert, wobei das Verfahren umfasst:
- (I) Bereitstellen von Erzeugerzellen oder Erzeugergewebe, die
von einem Organismus abgeleitet sind, der xenogenetisch zu den Zielzellen
ist und der in einem ruhenden Zustand eintreten kann;
- (II) Bereitstellen von Bedingungen, die die Zellen oder das
Gewebe induzieren, um in einen ruhenden Zustand einzutreten oder,
wenn bereits in einem ruhenden Zustand, den ruhenden Zustand beizubehalten;
- (III) Wiederherstellen eines wasserlöslichen Extraktes von den Zellen
oder dem Gewebe oder aus dem Medium, in welchem die Zellen oder
das Gewebe inkubiert werden; wobei der wasserlösliche Extrakt eine Zellen-antiproliferative
Aktivität
aufweist.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst die Zusammensetzung eine angereicherte Keimruhesubstanzpräparation
(EDP), die, wie oben festgelegt, Keimruhesubstanzen in einer Konzentration
größer als
der, die in einem natürlichen
nicht-verarbeitenden Extrakt vorgefunden wird, umfasst.
-
Die
Erzeugerzellen oder Gewebe von welchem der Extrakt erhalten wird,
können
von dem gleichen Ursprung wie die Zielzellen oder Gewebe sein, weisen
aber vorzugsweise einen unterschiedlichen Ursprung auf. Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung sind die Zielzellen oder das Gewebe, menschliche Zellen oder
Gewebe und die Erzeugerzellen oder Gewebe sind pflanzliche oder
nicht – menschliche
tierische Zellen oder Gewebe. Gemäß zu einer anderen Ausführungsform
der Erfindung sind die Zielzellen oder Gewebe, pflanzliche Zellen
oder Gewebe.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Keimruhesubstanzzusammensetzung eine pharmazeutische
oder kosmetische Zusammensetzung zur Inhibierung von Zellenproliferation
innerhalb des Körpers.
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung wird die Zusammensetzung zur Inhibierung einer Keimung
von Samen (die entweder natürlich
oder künstlich
hergestellt werden) verwendet oder zum Wachstum von Setzlingen zu
dem Zweck eines Erhaltens von Setzlingen in einem ruhenden Zustand,
bspw. während
einer Lagerung. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird die Keimruhesubstanzzusammensetzung bei der Konservierung
von frischen Nahrungsmitteln verwendet.
-
In
einer Ausführungsform
werden die wasserlöslichen
Extrakte, die erfindungsgemäß verwendet
werden, von ruhenden Pflanzen erhalten.
-
Wasserlösliche Extrakte
werden gemäß zu der
Erfindung von Zwiebeln ruhender Pflanzen erhalten, wobei sie in
ihrem ruhenden Zustand das Wachstum von Setzlingen ebenso inhibieren
können
wie die Proliferation verschiedener Zielzellen einschließlich verschiedener
Säugerzellen
bspw. menschlicher Zellen zu einem wesentlich höheren Grad als Präparationen
die unter den gleichen Bedingungen von Zwiebeln der gleichen Pflanze
erhalten werden die in ihrem aktiven Zustand vorliegen. Es wurde
ebenso gefunden, dass Keimruhesubstanzzusammensetzung die von Zellkulturen
erhalten wurden, welche von verschiedenen Teilen von ruhenden Pflanzen
hergestellt wurden und in die Keimruhe induziert wurden, ebenso
das Wachstum von Setzlingen inhibieren können genauso wie die Proliferation
verschiedener Zellen einschließlich
verschiedener Säugerzellen
bspw. menschlicher Zellen. Diese DCs weisen in einem breiten Konzentrationsbereich
keinen nennenswerten toxischen Effekt auf die Zielzellen auf, wobei
dies im Gegensatz zu den meisten Substanzen steht, die einen antiproliferativen
Effekt aufweisen.
-
Erfindungsgemäß kann irgendeine
Pflanze, die in einen ruhenden Zustand eintreten kann, zum Erhalten
eines DCs verwendet werden. Einige nicht begrenzende Beispiele solcher
Pflanzen ebenso wie die Teile solcher Pflanzen, die in einen ruhenden
Zustand (bezeichnet "D-Teil") eintreten und von
denen das DC erhalten werden kann werden in den nachstehenden Tabellen
I und II gezeigt: Tabelle
I (Zwiebeln,
Körner,
Wurzeln, Rhizome)
Tabelle
II Laubbäume (deciduous),
Obstbäume,
Bodendecker, Samen)
-
Erfindungsgemäß wird die
DC vorzugsweise von Pflanzen erhalten, die in ihrem ruhenden Zustand entweder
als Ergebnis des natürlichen
Vorgangs einer Keimruhe oder als ein Ergebnis in Keimruhe durch
Aussetzung von außerhalb
induziert werden vorliegen die einen ruhenden Zustand beispielsweise
Bedingungen wie Inkubation bei einer Keimruhe induzierenden Temperatur
für einen
ausreichenden Zeitraum. Die Bedingungen zum induzieren einer Keimruhe
in verschiedenen ruhenden Pflanzen können variieren (bspw. die Inkubationstemperatur
und die Dauer der Inkubation) und sind dem Fachmann bekannt. Als
Beispiel gibt es da Pflanzen (wie bspw. Narzissus) die in eine Keimruhe
durch ihre Aussetzung gegenüber
relativ hohen Temperaturen induziert werden. Im Gegensatz dazu werden
andere Pflanzen (wie bspw. die Tulpe) in eine Keimruhe durch ihre
Aussetzung gegenüber
relativ geringen Temperaturen induziert werden. Andere Faktoren
wie bspw. Licht, Feuchtigkeit, Konzentration verschiedener Wachstumsfaktoren
usw. können
ebenso zum Induzieren einer Keimruhe verwendet werden.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die DC von einem Teil der Pflanze erhalten, der
in eine Keimruhe (D-Teil) eintreten kann, bspw. aus Zwiebeln. Zwiebeln
die in ihren Keimruhezustand induziert werden, können entweder sofort für die Herstellung
einer DC verwendet werden oder alternativ dazu unter Bedingungen
gelagert werden unter denen ein ruhender Zustand beibehalten wird,
bspw. im Falle von Narzissus beinhalten diese eine hohe Temperatur
und geringe Feuchtigkeit. Zusätzlich
zu Zwiebeln können
andere Teile von ruhenden Pflanzen wie bspw. Blätter, Wurzel, Samen usw. ebenso
in eine Keimruhe induziert wurden wie vorstehen ausgeführt und
anschließend
zum Erhalten einer DC davon verwendet wurden.
-
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung wird der Keimruhe Substanzextrakt von Zellkulturen
erhalten, die aus irgendeinem Teil einer ruhenden Pflanze (bspw.
Zwiebeln) hergestellt werden und in eine Keimruhe induziert werden.
Die Kultur kann durch Inokulieren von Zwiebeln von ruhenden Pflanzen
erhalten werden, die Strunkansätze
mit Blütenstand
(inflorescence stalk initials) aufweisen in ein geeignetes Medium
um Kallus kulturen der Zwiebelextrakte zu bilden. Die Zellkulturen
werden typischerweise zur Konfluität wachsen gelassen wobei sich
sehr kleine Zwiebelteile in der Zellkultur ("Brutzwiebeln" (bulblets) genannt) bilden. Induktion
eines ruhenden Zustands in den Zellkulturen oder Brutzwiebeln wird
durch ihre Aussetzung gegenüber
Bedingungen erreicht die Keimruhebedingung induzieren wie bspw.
Inkubation bei einer eine Keimruhe induzierenden Temperatur für einen
ausreichenden Zeitraum. Eine Keimruhe kann ebenso in vitro durch Aussetzen
der Zellkulturen oder Brutzwiebeln gegenüber verschiedenen Arten chemischer
Beanspruchungen (niedrige oder hohe Konzentrationen von Zucker,
Salz usw.) induziert werden.
-
Zusätzlich zu
den Brutzwiebeln können
Zellkulturen die von anderen Teilen ruhender Pflanzen wie bspw.
Blätter,
Wurzeln, Samen usw. abgeleitet werden und ebenso zum Erhalten von
Keimruhesubstanzextrakten verwendet werden die von Zellkulturen
abgeleitet sind.
-
In
einer anderen Ausführungsform
können
die Keimruhesubstanz Analoge der Erfindung durch irgendeines der
Verfahren des Standes der Technik wie bspw. durch rekombinante DNA
Verfahren, chemische Synthese, kombinatorische Chemie usw. synthetisch
hergestellt werden, wobei die Keimruhesubstanz Analoge im wesentlichen ähnliche
Eigenschaften hinsichtlich ihrer Befähigung eine Keimruhe zu induzieren
und Proliferation von Zielzellen der Keimruhesubstanzen auf denen
sie basieren zu inhibieren, beibehalten.
-
Eine
von einer Pflanze abgeleitete DC der Erfindung wird als ein wasserlöslicher
Extrakt des pflanzlichen Materials erhalten. Der wasserlösliche Extrakt
kann durch Homogenisieren des pflanzlichen Materials und anschließendes Suspendieren
des Homogenats in einer wässrigen
Lösung
hergestellt werden.
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden die EDPs von Fruchtsäften oder einem anderen Saft
erhalten der von pflanzlichen Organen produziert wird. Früchte enthalten
typischerweise Keimruhesubstanzen, die eine Keimung der Samen und
Kerne inhibieren, während
sich diese in der Frucht befinden. Beispiele von Säften von
denen Keimruhesubstanzen aufgereinigt werden können, sind Säfte von
Zitrusfrüchten,
Trauben, Tomate, Kiwi usw. Der Fruchtsaft kann als solcher verwendet
werden oder alternativ dazu können
die Keimruhesubstanzen von dem Fruchtsaft wie nachstehend erklärt aufgereinigt
werden.
-
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung werden die Keimruhesubstanzen von Erzeugerzellen extrahiert,
die von Tieren stammen, welche in eine Ruhephase während ihres
Lebenszyklus eintreten können.
Während
der Ruhephase ist die metabolische Rate der Tiere auf ein Minimum
verringert und es besteht ein Einhalt bei der Zellproliferation.
Beispiele von solchen Tieren sind verschiedene marine Krebstiere
wie bspw. Artemia, Dafnia und Cyclops.
-
Wie
vorstehend mit Bezug auf das von Pflanzen abgeleitete DC erklärt, kann
ein von einem Tier abgeleitetes DC ebenso von Tieren erhalten werden
die sich in ihrem ruhenden Zustand auf Grund des natürlichen
Vorgangs einer Keimruhe oder als Ergebnis einer von außen herrührenden
Induktion in eine Keimruhe durch Aussetzen zu Keimruhe induzierenden
Bedingungen wie bspw. Dehydrierung (Artemia salina) oder Anoxie
(Artemia franciscana) befinden. Die Keimruhesubstanzen können aus
dem tierischen Gewebe durch verschiedene, an sich bekannte Verfahren,
extrahiert werden.
-
Das
von Tieren abgeleitete DC kann von den Tieren oder ihren Organen
als solchen erhalten werden. Zellkulturen können alternativ zuerst aus
dem ruhenden Tier hergestellt werden und nachdem die Zellen in Kultur
für verschieden
Zeiträume
gehalten werden kann anschließend
eine DC entweder von dem Überstand
oder durch Ernten der Zellen und/oder Extrahieren des DCs davon
extrahiert werden.
-
Das
erfindungsgemäße DC kann
von den Erzeugerzellen durch eine Vielzahl von an sich bekannten Verfahren
aufgereinigt werden (bspw. durch TLC, HPLC, Ionenaustausch) durch
Größenfraktionierung
(bspw. Dialyse, Gelfiltration), usw.
-
Erfindungsgemäß wurde
zum ersten Mal herausgefunden, dass wenn an ein Individuum verabreicht, die
anti-proliferative Aktivität
der Keimruhesubstanzzusammensetzung die Zellteilungsrate der Zellen
verringern kann, die in den inneren Schichten der Epidermis vorliegen.
-
Eine
andere Ausführungsform
der Erfindung ist daher die Verwendung der Keimruhesubstanzzusammensetzungen
als eine kosmetische oder dermatologische Zusammensetzung, die für den Beibehalt
der jugendlichen Erscheinung einer Haut eines Individuums oder für die Behandlung
von altersbezogenen Hautänderungen
nützlich
ist.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer effektiven Menge
eines wasserlöslichen
Extraktes der von Erzeugerzellen oder Erzeugergewebe oder von dem
Medium in dem die Zellen oder das Gewebe inkubiert werden erhalten
sind worin
- (I) die Erzeugerzellen oder das
Erzeugergewebe von einem Organismus stammen, der xenogenetisch für das Individuum
ist;
- (II) die Erzeugerzellen oder das Erzeugergewebe von einem Organismus
stammen, der in einen Ruhezustand eintreten kann;
- (III) der wasserlösliche
Extrakt von einer Erzeugerzelle oder Gewebe erhalten wird, während es
sich in einem ruhenden Zustand befindet;
als eine kosmetische
Zusammensetzung mit einem anti-proliferativen Effekt auf Zielzellen
oder Gewebe eines Individuums.
-
Gemäß des letzten
Gesichtspunktes der vorliegenden Erfindung wird eine dermatologische
oder kosmetische Zusammensetzung bereitgestellt, die von ungefähr 0,0001%
vorzugsweise von ungefähr
0,001% typischerweise von ungefähr
0,01% bis zu ungefär
5%, vorzugsweise bis zu ungefähr
1 Gewichtsprozent des Keimruhesubstanzextraktes oder Keimruhesubstanz
Analogen zusammen mit einem dermatologisch oder kosmetisch akzeptablen
Träger
umfasst.
-
Die
dermatologischen oder kosmetischen Zusammensetzungen der Erfindung
können
in verschiedenen Formen wie bspw. in der Form eines Balsams, eines
emulgierten Gels, eines wässrig-alkoholischen
Gels, eines wasserfreien Gels, einer Emulsion des Öls in Wasser
(O/W) Typs, eines klaren Gels, einer Liposomen enthaltenen Creme,
usw. verabreicht werden.
-
Die
kosmetischen oder dermatologischen Zusammensetzungen werden für gewöhnlich topisch
verabreicht. Zeitweise kann es allerdings von Vorteil sein die Zusammensetzungen
mittels anderer Verabreichungsarten zu verabreichen wie bspw. durch
subkutane Injektionen, durch oral verabreichte Kapseln oder durch Iontophorese
(die die Verwendung von elektrischen Feldern einbezieht, um das
Eindringen von ionenaktiven Substanzen zu erhöhen).
-
Aufgrund
ihres signifikanten anti-proliferativen Effekts können die
Keimruhesubstanzzusammensetzungen ebenso für die Behandlung von verschieden
bösartigen
Tumoren verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft daher
die Verwendung einer effektiven Menge eines wasserlöslichen
Extraktes, der von Erzeugerzellen oder Erzeugergewebe oder von dem
Medium in dem die Zellen oder das Gewebe inkubiert werden erhalten
werden, worin
- (I) die Erzeugerzellen oder das
Erzeugergewebe von einem Organismus stammen, der xenogenetisch für das Individuum
ist;
- (II) die Erzeugerzellen oder das Erzeugergewebe von einem Organismus
stammen, der in einen Zustand einer Keimruhe eintreten kann; und,
- (III) der wasserlösliche
Extrakt von einer Erzeugerzelle oder Gewebe erhalten wird, während es
sich in einem ruhenden Zustand befindet,
für die Herstellung eines Medikamentes
mit einem anti-proliferativen Effekt auf Zielzellen oder Gewebe
eines Individuums.
-
Wie
vorstehend erwähnt
stellt die Zellteilungsrate einen signifikanten Faktor bei Bestimmung
der Wahrscheinlichkeit einer Zelle eine prämaligne oder maligne Zelle
zu werden dar. Die Bildung eines gutartigen oder bösartigen
Tumors hängt
darüber
hinaus, wie es bekannt ist, unter anderem von kontinuierlichem Teilen der
Zellen, die den Tumor bilden, ab. Eine Verabreichung der Keimruhesubstanzzusammensetzung
an ein Individuum vor der Bildung oder zu frühen Stadien der Bildung eines
gutartigen oder bösartigen
Tumors, kann in der Verzögerung
oder Verhinderung der Bildung eines voll ausgebildeten Tumors in
dem behandelnden Individuum führen.
Eine Verabreichung der Extrakte an ein Individuum das an einem voll
ausgebildeten gutartigen oder bösartigen
Tumor leidet kann zu einer Verringerung der Tumorlast in dem behandelnden
Individuum und in der Erleichterung der tumorbezogenen Symptome
führen.
Diese Keimruhesubstanzzusammensetzungen können bei der Behandlung sowohl
des primären
als auch sekundären
(metastasischen) Tumors effektiv sein.
-
Die
Extrakte können
ebenso in Kombination mit einem oder mehreren bekannten anti-Tumorbehandlungen
(bspw. chemotherapeutischen Agenzien, Bestrahlung, usw.) verabreicht
werden um einen synergistischen, gegen den Tumor gerichteten Effekt
zu erzielen. Die Dosis der an ein Individuum zu verabreichenden Extrakte
ebenso wie die Behandlungsmodalität werden von den Eigenschaften
des behandelnden Individuums (Alter, Gewicht, medizinische Vorgeschichte,
usw.) abhängen,
ebenso wie von den Eigenschaften des sich entwickelnden oder vorhandenen
Tumors (gutartig oder bösartig,
Größe, Ursprung,
primär
oder sekundär,
usw.). In Individuen mit einem hohen Risiko eines Entwickelns eines
primären
oder sekundären
Tumors können
die Keimruhesubstanzzusammensetzungen routinemäßig verabreicht werden, um
die Wahrscheinlichkeit einer Tumorbildung zu verringern.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft daher weiterhin die Verwendung einer
Zusammensetzung die einen Keimruhesubstanzextrakt umfasst, der die
Proliferation von Zellen inhibieren kann, für die Verabreichung an ein
Individuum mit einem gutartigen oder bösartigen Tumor oder mit einem
hohem Risiko eines sich zu entwickelnden Tumors.
-
In
noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung können
Keimruhesubstanzzusammensetzungen zur Erhöhung des therapeutischen Indexes
von chemotherapeutischen und Bestrahlungsbehandlungen verwendet
werden. In einem Individuum das derartige Behandlungen empfängt, werden
gewöhnlich
sich teilende Zellen wie bspw. Zellen der inneren Oberfläche des
Darms, Zellen von Haarfolikeln und blutbildende Zellen durch die
chemotherapeutischen Agenzien oder Bestrahlung ebenso geschädigt die
auf eine Zerstörung der
bösartigen
Zellen gerichtet sind von denen ein großer Prozentsatz sich teilende
Zellen darstellen. Durch Verabreichung von Keimruhesubstanzzusammensetzungen
an ein Individuum zuvor oder zusammen mit derartigen Behandlungen
kann es möglich
sein die Proliferation eines signifikanten Prozentsatzes der gewöhnlichen
Zellen zu inhibieren. Daher können
toxische Nebeneffekte auf Grund des Einflusses der Behandlungen auf
gewöhnliche
Zellen signifikant verringert werden und wenn von Vorteil können höhere Konzentrationen
der chemotherapeutischen oder Bestrahlungsbehandlungen angewendet
werden. Um den toxizitätsverringerten Effekt
der Keimruhesubstanzzusammensetzung zu erleichtern, kann sie zeitweise
unmittelbar auf eine bedürftige
Stelle, Gewebe oder Organ bspw. auf die Haut verabreicht werden.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt daher in einer weiteren Ausführungsform
eine Zusammensetzung bereit, die die Proliferation von Zellen inhibieren
kann zur Verabreichung an ein Individuum das chemotherapeutische
oder Bestrahlungsbehandlungen empfängt, umfassend eine effektive
Menge einer Keimruhesubstanz eines Keimruhesubstanzextraktes oder
eines Keimruhesubstanz Analogen.
-
Andere
therapeutische Anwendungen der Keimruhesubstanzzusammensetzung beinhalten
eine Inhibierung von Fibrose bspw. Hautfibrose, Zirrhose und andere.
Es sollte hierzu angemerkt werden, dass eine Fibrose die eine Überproliferation
von Fibroplasten darstellt, durch cytotoxische Arzneimittel behandelt
wurde allerdings mit einer begrenzten Anwendung auf Grund ihrer
allgemeinen nicht spezifischen Toxizität. Ein Inhibieren der Fibroplastenproliferation
durch die Verwendung der Keimruhesubstanzzusammensetzung der Erfindung
stellt eine brauchbare Alternative von geringerer Toxizität dar. Keimruhezusammensetzungen
der Erfindung können
in ähnlicher
Weise ebenso bei der Behandlung von Psoriasis nützlich sein, die aus einer Überproliferation
von Keratinozyten herrührt.
Seborohische Keratose, Papiloma und Warzen können ebenso mit den Keimruhesubstanzzusammensetzungen
behandelt werden.
-
Eine
andere mögliche
Anwendung der Keimruhesubstanzzusammensetzung der Erfindung besteht
in der Konservierung von Organen und Gewebe vor Ihrer Verwendung
vor einer Transplantation.
-
Andere
Anwendungen der Keimruhesubstanzzusammensetzungen können bspw.
bei Behandlungen von Haarlosigkeit auf dem Kopf (Alopecie) liegen
welche häufig
eines der Phänomene
darstellt, die mit dem Altern der Haut in einem Individuum zusammenhängt. In
Individuen die an Alopecie leiden, nimmt die Lebensdauer des Kopfhaares
wesentlich ab (bspw. von einer Lebensspanne von ungefähr 3 Jahren
in einem gewöhnlichen
Individuum bis zu einer Lebensspanne von ungefähr einem Jahr in einem Individuum,
das an Alopecie leidet). Eine Abnahme der Haarwachstumsrate in einem
Individuum weist daher eine hohe Wahrscheinlichkeit einer sich entwickelten
Alopecie auf oder in einem Individuum das bereits Zeichen eines
Kopfhaarverlustes aufweist wird das Ausmaß eines solchen Haarverlustes
reduziert werden. Eine Verabreichung der Keimruhesubstanzzusammensetzung
der Erfindung an ein derartiges Individuum kann in einer teilweisen
oder vollständigen
Abnahme des Harrverlustes führen.
Zu diesem Zweck können
die eine Keimruhesubstanzzusammensetzung entweder topisch an der
Stelle des Kopfhaarverlustes oder alternativ dazu in anderen Fällen systemisch
verabreicht werden.
-
Ein
zusätzliches
Phänomen
was durch die Verabreichung der eine Keimruhesubstanz enthaltenen Verbindungen
der Erfindung behandelt werden kann, hängt mit dem übermäßigen Wachstum
von Haar in verschiedenen Teilen eines Körpers eines Individuums wie
z. B. an Armen, Rücken
usw. (Hirsutismus) zusammen. Ein derartiges unerwünschtes
Wachstum von Haar tritt häufig
bei alternden Individuen auf und hängt manchmal mit einem Verlust
des Kopfhaares beim gleichen Individuum zusammen. Aufgrund ihrer
Befähigung ein
Zellwachstum zu verhindern können
erfindungsgemäße Zusammensetzungen
beim Reduzieren eines derartigen unerwünschten übermäßigen Wachstums von Haar von
Nutzen sein.
-
Die
Menge der eine Keimruhesubstanz enthaltenden Verbindungen die für die vorstehend
erwähnten zwei
Indikationen verabreicht werden, die Verabreichungsregimen ebenso
wie ihr Anwendungsmodus werden wiederum sowohl aufgrund der Eigenschaften
des behandelnden Individuums (Alter, Größe, Geschlecht, usw.) ebenso
wie aufgrund der Parameter, die mit dem zu behandelnden Phänomen (bspw.
zu dem Ausmaß des Kopfhaarverlustes
der spezifischen Körperteile
in denen ein übermäßiges Wachstum
von Haaren usw.) zusammenhängen.
-
Die
Keimruhesubstanzzusammensetzung kann zusätzlich als ein zusätzliches
Agens von Nutzen sein, das im Zusammenhang mit/oder den folgenden
Behandlungen zur Haarentfernung wie bspw. Rasieren (wo der Extrakt
in eine Aftershave Lösung
aufgenommen werden kann) oder Enthaarens (bspw. durch Wachs) verabreicht
werden kann.
-
Eine
andere Anwendung der Keimruhesubstanzzusammensetzung kann eine Verabreichung
an ein Individuum während
des Zeitraums einschließen
in dem sich eine Narbe bildet bspw. nach einer Operation um Narbenbildung
zu verringern. Durch eine Verringerung der Rate des Heilungsvorganges
in einem derartigen Individuum kann die letztendliche Narbe deutlich
weniger offensichtlich sein. Der anti-fibrotische Effekt der Keimruhesubstanzzusammensetzung
verringert zusätzlich
die Bildung von Cheloiden die im Allgemeinen nach einer Heilung
auftreten.
-
Die
Keimruhesubstanzzusammensetzung kann ebenso zum Verlängern der
Dauer einer Bräunung
in einem Individuum von Nutzen sein. Epidermale Zellen umfassen
eine hohe Konzentration an Melanin nach Aussetzung an der Sonne.
Während
der Hauterneuerung werden derartige Melanin umfassende Zellen abgelöst. Durch
ein Verlangsamen des Zellerneuerungsvorgangs in der Haut verursacht
die Keimruhesubstanzzusammensetzung die Melanin enthaltenen Zellen
und daher die Bräune
für einen
längeren
Zeitraum zu verbleiben.
-
Zusätzlich zu
einer Inhibierung einer Proliferation von verschiedenen Zellen können die
Keimruhesubstanzzusammensetzungen, Samenkeimung verringern und ein
Wachstum verschiedener Pflanzensetzlinge inhibieren. Folgend einer
Keimung von Samen, fängt
die Entwicklung von Wurzeln und Hypokotylen in dem Setzling an.
Ein Inkubieren des Pflanzensetzlings mit der Keimruhesubstanzzusammensetzung
führt zu
der Inhibierung der Verlängerung
der Wurzeln und Hypokotylen des Setzlings. Die Keimruhesubstanzzusammensetzungen
können
daher zur Kontrolle von Unkraut verwendet werden, wobei Ihre Verabreichung
in einer geeigneten Konzentration zu der Inhibierung des Wachstums
unerwünschten
Unkrauts führen
kann, während
das Wachstum der erwünschten
Pflanze nicht beeinträchtigt
wird. Hinsichtlich des natürlichen
Ursprungs der Keimruhesubstanzen weist ihre Verabreichung keinen
nennenswerten toxischen Effekt auf Zellen oder Gewebe auf, auf welche
sie für
eine Wirkung oder auf die Umgebung induziert werden. Manchmal kann
es zusätzlich
von Nutzen sein, derartige Zusammensetzungen zur Lagerung von Samen
und Setzlingen über
einen langen Zeitraum zu verwenden.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt daher eine Keimruhesubstanzzusammensetzung
bereit, die die Aktivität
eines Verringerns und Inhibierens des Wachstums von Pflanzensamen
und/oder Setzlingen aufweist und den Keimruhesubstanzextrakt umfasst
bereit.
-
Eine
weitere Verwendung der Keimruhesubstanz der Erfindung besteht in
der Konservierung frischer Güter
bspw. Gemüse,
frischen Fischeiern, der Fischhaut (fish shell), usw.
-
Die
Erfindung stellt ebenso ein Verfahren für die Herstellung einer anti-proliferativen
Zusammensetzung bereit, das ein Mischen von einer Keimruhesubstanz
oder DC mit einem Träger
umfasst um so eine anti-proliferative Zusammensetzung mit einer
anti-proliferativen effektiven Menge an Keimruhesubstanzen in der Zusammensetzung
zu ergeben. Eine derartig hergestellte Zusammensetzung kann in Abhängigkeit
von der Natur des Trägers
bei einer Therapie in Kosmetika, bei der Konservierung von Lebensmitteln
oder in der Landwirtschaft verwendet werden. Ein derartiges Verfahren
zur Herstellung einer pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammensetzung
umfasst typischerweise das Herstellen eines DCs und ihres Mischens
mit einem geeigneten pharmazeutisch oder kosmetisch akzeptierbaren
Träger
wobei die Menge an DC derartig ist, um so eine letztendliche therapeutische
oder kosmetische (wie es der Fall sein kann) effektive Menge an
Keimruhesubstanzen in der Zusammensetzung zu erzielen. Ebenso wird
Verwendung der Keimruhesubstanz oder eines DCs für die Präparation einer derartigen pharmazeutischen
oder kosmetischen Zusammensetzung bereitgestellt.
-
Wie
es klar sein wird, sind die verschiedenen Anwendungen der Keimruhesubstanzzusammensetzung der
Erfindung wie vorstehend angegeben, Beispiele einer Vielzahl von
möglichen
Anwendungen dieser Zusammensetzungen, wobei alle gemeinsam das Inhibieren
der Proliferation von Zielzellen aufweisen. Nachstehend wird die
Erfindung durch einige nicht beschränkende Beispiele mit gelegentlichem
Hinweis auf die Figuren gezeigt werden.
-
Die 1 stellt ein Histogramm dar, dass die
Zahl an Keratinozyten in der Vertiefung (well) einer Zellkultur
bei verschiedenen Zeitspannen nach Ihrer Inkubation mit verschiednen
Konzentrationen des DC IBR-1 (erhalten von einer ruhenden Pflanze
(1A) oder der AE IBR-3 (erhalten von einer aktiven
Pflanze)(1B) zeigt. Als eine Kontrolle
werden die Zellen mit Wachstumsmedium alleine (0μg/ml des getesteten DC oder
AE) inkubiert. Die Zahl an Zellen in jeder Vertiefung wurde durch
den Mikrokultur Methylenblauassay (beschrieben in Beispiel II) bestimmt
und die gefärbten
Kulturplatten wurden bei 620 nm gelesen.
-
Die 2 stellt ein Histogramm dar, das die Zahl
an Fibroplasten in einer Mikrokultur zu verschiedenen Zeitspannen
nach ihrer Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen des folgenden
zeigt:
-
2A – Zellen
wurden mit dem DC IBR-1 (ruhend) inkubiert;
-
2B – Zellen
wurden mit dem AE IBR-3 (aktiv) inkubiert;
-
3 stellt
ein Histogramm dar, in dem die Zahl an Keratinozyten in einer Mikrokultur
zu verschiedenen Zeitspannen nach ihrer Inkubation mit verschiedenen
Konzentrationen der von der Zellkultur abgeleiteten DC IBR-11 darstellt.
Die Zellen wurden als Kontrolle mit Wachstumsmedium ausschließlich (0 μ/ml DE IBR-11) inkubiert.
Die Zahl an Zellen in jeder Vertiefung wurde durch den Mikrokultur
Methylenblauassay (beschrieben in Beispiel II) bestimmt und die
gefärbten
Kulturplatten wurden bei 620 nm gelesen.
-
4 stellt
ein Histogramm dar, in dem die Zahl an Fibroplasten in einer Mikrokultur
zu verschiedenen Zeitspannen nach ihrer Inkubation mit verschiedenen
Konzentrationen der von Zellkulturen abgeleiteten DC IBR-11 zeigt.
-
5 ist eine graphische Darstellung in der
die Zahl an Karzinom Zellen (T24P) der Blase einer Maus in einer
Mikrokultur 72 Stunden nach ihrer Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen
eines von einer Pflanze abgeleiteten DC (IBR-1)(5A)
oder eines von einem Tier abgeleiteten DE (IBR-4)(5B)
zeigt. Die Zahl an Zellen in jeder Vertiefung wurde mittels des
Mikrokultur Methylenblauassays (beschrieben in Beispiel 2) bestimmt
und die gefärbten
Kulturplatten wurden bei 620 nm gelesen.
-
6 ist
eine graphische Darstellung in der die Zahl an Karzinom Zellen (T50)
der Blase einer Maus in einer Mikrokultur zu verschiedenen Zeitspannen
nach ihrer Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen an DE IBR-1
gezeigt wird. Die Keimruhesubstanzextrakte wurden an Tag 1 und Tag
3 der Zellkultur hinzugegeben und die Zahl an Zellen wurde am Tag
5 der Kultur wie vorstehend in 5 beschrieben
bestimmt. Die Zahl an Zellen in jeder getesteten Vertiefung wurde
mittels des Mikrokultur Mythelen blau assay wie in der Beschreibung
von 1 vorstehend erläutert und
durch Lesen der gefärbten Mikrokulturplatte
bei 620 nm bestimmt.
-
7 ist ein Histogramm in dem die DNA Gehaltsanalyse
an Keratinozyten inkubiert mit DC IBR-1 für 2 und 5 Tage (7A und
B, jeweils) AE IBR-3 (7C und D, jeweils) und DC IBR-4 (7E und
F, jeweils) gezeigt wird. Die Analyse wurde mit einem FACS, FPAR-Plus
(Becton-Dickinson, Inc.) unter Verwendung von Ethidiumbromid durchgeführt. Der
Prozentsatz an Zellen die sich in der G1 Phase, S Phase und G2 + M Phase befinden, wurde in jeder Zellkultur
bestimmt. Zusätzlich
wurde der Prozentsatz an Apoptose (A) in jeder Kultur ebenso bestimmt.
-
8 stellt ein Histogramm dar, in der die
DNA Gehaltsanalyse an Fibroplasten inkubiert mit DC IBR-1 für 2 und
5 Tage (8A und B), AE IBR-3 (8C und
D) und DC IBR-4 (8E und F) gezeigt wird. Die Analyse
wurde wie in 7 vorstehend beschrieben
durchgeführt.
-
9A–B stellen
eine graphische Darstellung dar, in denen die UV Spektren von Banden
dargestellt wird, die durch trennen mittels Dünnschicht Chromatographie (TLC)
erhalten werden, worin: 9A ein
UV Spektrum der mittels TLC getrennten "Bande 4" zeigt und 9B ein
UV Spektrum der mittels TLC getrennten "Bande 6" zeigt.
-
10 stellt
eine graphische Darstellung dar, in der der vergleichende Effekt
verschiedener Behandlungen auf die Bräunungsdauer 5 Tage und 17 Tage
nach Verabreichung der Creme auf den gebräunten Bereich zeigt worin:
A den Effekt einer Creme zeigt, die 5% IBR-1 enthält auf die
Verlängerung
der Dauer einer Bräunung
5 Tage nach Verabreichung der Cremes.
-
B
zeigt den gleichen Effekt wie A 17, Tage nach Verabreichung der
Cremes.
-
C
zeigt den Effekt auf die Dauer der Bräunung (Verkürzung) einer Creme die eine
Alpha Hydroxy Säure
(AHA) umfasst, im Vergleich zu der Bräune ohne Creme 5 Tage nach
Verabreichung der Cremes.
-
D
zeigt den gleichen Effekt wie C, 17 Tage nach Verabreichung der
Creme.
-
Beispiele
-
Beispiel 1: A: Effekt
einer Narzissus Zwiebel DC, hergestellt aus Narzissus Feldzwiebeln,
auf das Wachstum von Gurkensetzlingen
-
(a) Induzieren einer Keimruhe
in Narzissus Feldzwiebeln
-
Narzissus
Feldzwiebeln wurden erhalten und mit heißem Wasser einer Temperatur
von 45°C
für 2–4 Stunden
unterzogen. Die Zwiebeln wurden anschließend entweder unverzüglich für die Herstellung
eines wasserlöslichen
Extraktes verwendet oder alternativ in einem Trockenraum bei einer
Temperatur von 30°C
für eine maximale
Zeitdauer von 8 Monaten gehalten, nachdem sie für die Herstellung des Pflanzenextraktes
verwendet werden.
-
(b) Herstellung von Extrakten
von Narzissuszwiebeln
-
Aktive
oder ruhende Narzissus Feldzwiebeln (wie vorstehend beschrieben
in Keimruhe induziert) wurden in Seifenwasser für einen Zeitraum von 1 Stunde
desinfiziert. Die Zwiebeln wurden anschließend geschnitten und in destilliertem
Wasser (30 sek. × 3)
unter Verwendung eines Ultra-Turbo-turax homogenisiert. Die homogenisierte
Präparation
der Zwiebeln wurde anschließend
durch einen ersten 0,45 μm
Sterilfilter und anschließend
durch einen zweiten 0,22 μm
Filter filtriert und die Präparation
die nicht auf den Filtern verblieb wurde anschließend gesammelt.
Die Konzentration ist als Gewicht an einer ursprünglichen Zwiebel (g) pro Endextraktvolumen
(ml) festgelegt.
-
(c) Der Effekt der Narzissus
Feldzwiebelextrakte auf das Wachstum von Gurkensetzlingen
-
(i) Versuchsassay:
-
Gurkensamen
cv. "Delila", 1994–1995, 95%
Keimung, 99,9% Reinheit wurden in Leitungswasser gekeimt und anschließend in
der Dunkelheit bei 27°C
für ungefähr 20 Stunden
bis zum Beginn des Wurzelns (1–2 mm)
inkubiert. Jede Versuchsgruppe umfasst die Petrischalen, die jeweils
mit 2 ml DC (IBR-1) gefüllt
wurden das von ruhenden Narzissus Feldzwiebeln stammte und wie vorstehend
erklärt
in verschiedenen Konzentrationen erhalten wurde.
-
Eine
Schicht von Filterpapier wurde in jeder der Petrischalen platziert
und 10 Gurkensetzlinge, die wie vorstehend erklärt gekeimt wurden, wurden auf
dem Papier platziert. Die Petrischalen wurden für 24 bis 72 Stunden bei 26°C bis 28°C in der
Dunkelheit inkubiert.
-
Der
Effekt der getesteten Zwiebelextrakte in verschiedenen Konzentrationen
wurde auf zwei Parametern der Gurkensamen getestet:
- 1. Wurzelverlängerung
- 2. Hypocotyl Verlängerung
-
Diese
beiden Parameter wurden alle 24 Stunden nach der Inkubation der
Samen mit dem getesteten Extrakt und alle 24 Stunden danach getestet.
-
(II) Ergebnisse:
-
Wie
aus Tabelle 3 nachstehend ersichtlich, zeigt die DC IBR-1 ausreichende
inhibierende Aktivität
auf das Wachstum der Setzlinge wie durch die Länge der Wurzeln und Hypocotylen
der Samen bestimmt die mit DC IBR-1 inkubiert wurden im Vergleich
zu der Länge
der gleichen Organe, die mit sterilem Wasser inkubiert wurden. Die
inhibierende Aktivität
von DC IBR-1 war Dosis abhängig.
-
Tabelle
3 Wachstum von Samen mit und ohne Extrakt: Wachstum
von Samen mit und ohne Extrakt:
-
Inhibition
(%) des Samenwachstums durch Extrakte:
-
Beispiel I: B: Umkehrbarkeit
des Effekts von Narzissus DC auf das Wachstum von Gurkensetzlingen
-
(I) Versuchsassay:
-
- (a) Das Experiment wurde auf eine identische
Art zu den in I(A) vorstehend beschriebenen durchgeführt. Der
Effekt der DC auf das Wachstum der Wurzeln und Hypokotylen von Gurkensamen
wurde 24 und 72 Stunden nach Inkubation bestimmt. 72 Stunden nach
Inkubation wurden die Samen mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen
und mit sterilem destilliertem Wasser für zusätzliche 72 Stunden bei 27°C in der Dunkelheit
inkubiert. Die Länge
der Wurzeln und Hypocotylen der Samen wurde wiederum 144 Stunden nach
dem Inkubationsbeginn (72 Stunden nach dem Wegwaschen der DC) bestimmt.
-
(II) Ergebnisse:
-
Wie
aus Tabelle 4 nachstehend ersichtlich, fingen die Wurzeln und Hypocotylen
wiederum zu wachsen an, nachdem die von Narzissus abgeleiteten DC
weggewaschen wurde, welche einen inhibierenden Effekt auf das Wachstum
der Wurzeln und Hypocotylen von Gurkensamen aufwies. Der inhibierende
Effekt von DC war daher reversibel und nicht toxisch. Der gleiche
Effekt war bei niedrigeren Konzentrationen des DC offensichtlich,
die mit den Samen ebenso (Ergebnisse nicht gezeigt) inkubiert wurden.
-
-
Beispiel II: Effekt von
Narzissuszwiebel abgeleitetem DC auf die Proliferation von Kerationzyten
-
(a) Herstellung von Keratinozyten
Kulturen
-
Menschliche
Keratinozytenkulturen wurden wie in Ben Bassat H., et al., Plastic
and Reconstructive surgery, 89 (1992), 511 beschrieben. Keratinozytenkulturen
wurden im Allgemeinen von kleinen Biopsie Proben (ungefähr 1 cm2) von Haut geteilter Stärke iniziiert. Die Biopsie
Proben von gesunden Donoren wurden unter Lokalanesthetika mit 1%
Lidocain gehalten. Die Biopsie wurde in Trypsin-EDTA bei 4°C für 18 bis
20 Stunden inkubiert. Die Epidermis wurde danach abgetrennt und
das Ephitelium in Trypsin-EDTA desegregiert um eine Einzelzellsuspension
zu bilden. Trypsin 0.125%-EDTA 0,025% in Puck's Salin mit x10 Antibiotika 100 E/ml
Penizillin, 1000 μg/ml
Streptomycin, 0,0025 μg/ml
Amphotericin B und 0,4 mg/ml Gentamycin wurden für diese Vorgänge verwendet.
Trypsin Lösungen
wurden aus Trypsin, 1:250 Stärke,
hergestellt.
-
Die
wie vorstehend beschriebenen Zellsuspensionen wurden bei einer Konzentration
von 3–6 × 106 Zellen in 25 cm 2 Falcon
Behälter
inokuliert die vorpräpariert
waren um 2 × 105 letal bestrahlte 3T3 Mausfibroplasten als
eine Aufgabeschicht zu enthalten.
-
Die
Behälter
wurden bei 37°C
10% CO2 für ungefähr 8–10 Tage inkubiert, bis die
Kulturen ungefähr 80%
konfluent waren. Die Zellen in jedem Behälter wurden in diesem Stadium
durch Zugabe von Trypsin 0,25%-EDTA 0,05% (1:1) ohne Antibiotika
gelöst
und die gelösten
Zellen wurden, nachdem sie gewaschen wurden, in eine Mikroplatte
mit 96 Vertiefungen bei einer Konzentration von 3 × 104 Zellen pro Vertiefung ohne Aufgabeschichten
in Keratinozytenmedium (Kmed) gemäß Rheinwald und Green (Rheinwald
T. G. und Green H., Nature, 265 (1988) 423–424) zur Bildung einer Sekundärkultur
inkubiert.
-
(b) Effekt von Narzissuszwiebel
abgeleiteten DC auf die Proliferation von Keratinozyten
-
(I) Versuchsassay
-
Narzissuszwiebelextrakte
wurden wie vorstehend in Beispiel I (b) beschrieben von aktiven
und ruhenden Zwiebeln erhalten. Die sekundären Keratinozyten Zellkulturen
wurden wie vorstehend in Mikroplatten induziert und weiterhin in
Kmed in einem Zeitraum von 3–4
Tagen wachsen gelassen. Den Mikroplatten wurden anschließend in
die nachstehenden Hauptgruppen unterteilt:
- (1)
Keratinozyten, die kontinuierlich in Kmed wachsen gelassen wurden;
- (2) In Kmed wachsen gelassene Keratinozyten, die das AE IBR-3
enthalten, das von aktiven Narzissuszwiebeln in verschiedenen Konzentrationen
(von 0,5 μg/ml–10 μg/ml wobei
jede Konzentration eine getrennte Versuchsgruppe bildet) hergestellt
wird; und
- (3) in Kmed Medium wachsen gelassene Keratinozyten, die das
DC IBR-1 umfassen, das von ruhenden Narzissuszwiebeln bei verschiedenen
Konzentrationen (0,5 μg/ml–10 μg/ml wobei
jede Konzentration eine getrennte Versuchsgruppe bildet) erhalten
wurde.
-
Jede
Versuchsgruppe enthielt fünf
Vertiefungen. Das DC IBR-1 oder AE IBR-3 enthaltende Wachstums Medium
wurde alle 24 Stunden für
einen Zeitraum von 5 Tagen gewechselt und nachdem das Medium allen
den Vertiefungen entfernt worden war Kmed Medium ohne irgendein
pflanzliches Extrakt hinzu gegeben worden war wurden die Kulturen
darin für
zusätzliche
3 Tage wachsen gelassen.
-
Der
Effekt der getesteten DC oder AE auf die Proliferation der Keratinozyten
wurde durch die Zahl von nachgewiesenen Zellen in einer getesteten
behandelten Vertiefung bestimmt, im Vergleich zu der Zahl von Zellen
die in einer Vertiefung nachgewiesen wurden in der die Zellen in
Kmed Medium ohne irgendein DC oder AE wachsen gelassen wurden.
-
Die
Zahl an Zellen in jeder Vertiefung wurde mittels des Mikrokultur
Methylenblauassays wie nachstehen beschrieben bestimmt:
Mit
Extrakt behandelte Kulturen und Kontrollen wurden in Glutaraldehyd
0,05% Endkonzentration für
10 min. bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen wurden die
Mikroplatten mit Methylenblau 1% in 0,1 M Borat Puffer pH 8,5 für 60 min.
bei Raumtemperatur gefärbt.
Danach wurden die Platten umfassend und gründlich gewaschen um überschüssigen Farbstoff
zu entfernen und getrocknet. Der durch die Zellen aufgenommene Farbstoff
wird in 0,1 N HCl für
60 Minuten bei 37°C
eluiert und bei 620 nm gelesen.
-
In
vorläufigen
Titrationsversuchen wurden lineare Ablesungen für 1 × 103 bis
4 × 104 Zellen pro Vertiefung erhalten. Jeder Punkt
der Wachstumskurvenversuche stellt einen Durchschnitt der Ablesung
von 5 Vertiefungen dar, da Keratinozyten inselförmig wachsen und keine einheitlichen
Monoschichten bilden. Die Durchschnittszahl an Zellen in den Vertiefungen
wurde 2 Tage und 5 Tage nach Inkubation der Keratinozyten mit dem getesteten
DC oder AE ebenso wie 8 Tage nach Inkubation (folgend 3 Tage Wachstum
ohne den getesteten Extrakt) bestimmt.
-
(II) Ergebnisse
-
Wie
es aus 1A ersichtlich ist wies die
DC IBR-1 von Narzissuszwiebeln einen signifikanten inhibitorischen
Effekt auf die Proliferation von Keratinozyten auf. Die Inhibierung
war vom Tag 5 des Versuchs offensichtlich und war dosisabhängig. Inhibierung der
Keratinozytenproliferation war bei einer Konzentration so wenig
wie 0,5 μg/ml
offensichtlich und war allerdings bei einer Konzentration von 10 μg/ml der
DC am meisten signifikant. Der Effekt war dosisabhängig (anfangend
bei einer Konzentration von 1 g/ml der DC und am effektivsten bei
einer Konzentration von 10 μg/ml
der DC).
-
Im
Gegensatz hierzu wie aus der 1B ersichtlich,
zeigte AE IBR-3 keinen signifikanten inhibitorischen Effekt auf
die Proliferation von Keratinozyten.
-
Beispiel III. Effekt von
DC, von ruhenden und aktiven Narzissuszwiebeln erhalten, auf die
Fibroplastenproliferation in Kultur:
-
(a) Präparation von Fibroplast Zellkulturen
-
Primäre Fibroplast
Zellkulturen wurden von kleinen Proben menschlicher Haut iniziiert
und wie in Beispiel II vorstehend hinsichtlich Herstellung von Keratinozyten
Kulturen präpariert
mit Ausnahme dass das verwendete Wachstumsmedium DMEM + 20% fötales Kälberserum
war.
-
(b) Präparation von DC und AE
-
DC
IBR-1 und AE IBR-3 wurden von ruhenden und aktiven Narzissuszwiebeln
wie vorstehend beschrieben hergestellt.
-
(c) Effekt von DC und
AE auf Fibroplastenproliferation
-
(I) Versuchsassay:
-
Die
vorstehenden Extrakte wurden zu den Fibroplastenkulturen in verschiedenen
Konzentrationen (1 g–10
g/ml) hinzugegeben und die Zahl der Fibroplasten wurde 2 Tage, 5
Tage und 8 Tage nach der Zugabe dieser Extrakte zu den Zellen wie
vorstehend in Beispiel II (a) beschrieben bestimmt.
-
(II) Ergebnisse:
-
Wie
aus 2A ersichtlich, wies die DC IBR-1 den signifikantesten
inhibitorischen Effekt auf die Proliferation von Fibroplasten in
Kultur auf. Der Effekt war von Tag 5 des Versuchs offensichtlich
und auch gleich Dosisabhängig
bei Dosen so niedrig wie 0,5 μg/ml
beobachtet.
-
Wie
aus der 2B ersichtlich, wies AE IBR-3
kein inhibitorischen Effekt auf die Proliferation von Fibroplasten
auf.
-
Beispiel IV Präparation
von kosmetischen und dermatologischen Zusammensetzungen, die DC
umfassen
-
Im
Folgenden werden mehrere spezifische Beispiele von kosmetischen
und dermatologischen Zusammensetzungen aufgeführt die Erfindungsgemäß für Verabreichung
an ein Individuum verwendet werden können.
A.
Balsam (topische Route): | |
Ozokerit | 10
g |
Isopropylpalmitat | 9
g |
Weiße Vaseline | 14
g |
Konservierungsagens | 0,2
g |
Antioxidantien | 0,3
g |
Parfüm | 1
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 0,00001
g |
Flüssiges Paraffin
qs | 100
g |
B.
Balsam (topische Route): | |
Ozokerit | 19
g |
Flüssiges Purcellin Öl | 10
g |
Weiße Vaseline | 15
g |
Konservierungsagens | 0,2
g |
Antioxidans | 0,3
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 0,00002
g |
Flüssiges Paraffin
qs | 100
g |
C.
Emulgiertes Gel des O/W Typs (topische Route): | |
Carbopol® 981
(verkauft von Goodrich) | 0,6
g |
Flüchtiges
Siliconöl | 3
g |
Purcellin Öl | 7
g |
Konservierungsagens | 0,3
g |
Ethylalkohol | 15
g |
Parfüm | 0,4
g |
Triethanolamin | 0,2
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 0,04
g |
Demineralisiertes
Wasser qs | 100
g |
D.
Wässriges-alkoholisches
Gel (topische Route): | |
Carbopol® 981
(verkauft von Goodrich) | 1
g |
Triethanolamin | 1
g |
95%
Ethanol | 60
g |
Glycerol | 3
g |
Propylenglycol | 2
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 5
g |
Demineralisiertes
Wasser qs | 100
g |
E.
Wasserfreies Gel (topische Route): | |
Absolutes
Ethanol | 61,1992
g |
Hydroxyethylcellulose | 0,8
g |
Propylenglycol | 25
g |
Polyethylenglycol | 12
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 0,0008
g |
F.
Emulsion des O/W Typs (topische Route): | |
Flüchtiges
Siliconöl | 10
g |
Flüssiges Paraffin | 6
g |
Flüssiges Lanolin | 3
g |
Arlacel® 165
(verkauft von Atlas) | 6
g |
Tween® 60
(verkauft von Atlas) | 2
g |
Cetylalcohol | 1,2
g |
Stearinsäure | 2,5
g |
Triethanolamin | 0,1
g |
Konservierungsagens | 0,3
g |
Antioxidantien | 0,3
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 0,5
g |
Demineralisiertes
Wasser qs | 100
g |
G.
Emulsion des O/W Typs (topische Route): | |
Propylenglycol | 2
g |
PEG
400 | 3
g |
Konservierungsagens | 0,3
g |
Carbopol® 981
(verkauft von Goodrich) | 0,2
g |
Isopropylmyristat | 1
g |
Cetylalcohol | 3
g |
Stearinsäure | 3
g |
Glycerol | 3
g |
Meiskeimöl | 2
g |
Parfüm | 0,5
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 0,001
g |
Demineralisiertes
Wasser qs | 100
g |
H.
Klares Gel (topische Route) | |
Oxyethyleniertes
Nonylphenol | 5
g |
Carbopol® 981
(verkauft von Goodrich) | 1
g |
Ethylalkohol | 30
g |
Triethanolamin | 0,3
g |
Glycerin | 3
g |
Parfüm | 0,3
g |
Konservierungsagens | 0,3
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 1
g |
Demineralisiertes
Wasser qs | 100
g |
I.
Liposomen enthaltende Creme (topische Route): | |
Cetylalcohol | 4
g |
B-Sitosterol | 4
g |
Dicetylphosphat | 0,5
g |
Konservierungsagens | 0,3
g |
Sonnenblumenöl | 35
g |
Parfüm | 0,6
g |
Carbopol® 981
(verkauft von Goodrich) | 0,2
g |
Triethanolamin | 0,2
g |
Sphingosin | 0,05
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 0,2
g |
Demineralisiertes
Wasser qs | 100
g |
J.
Per os Zusammensetzung: | |
Talk | 5
mg |
Aerosil
200 | 5
mg |
Stearat
von Zn bzw. Zinkstearat | 5
mg |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 3
mg |
Lactose
qs | 400
mg |
K.
Flüssigkeit
für Iontophorese: | |
Natriumbenzoat | 2
mg |
Konservierungsagens | 0,15
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 1
g |
Wasser
qs | 100
g |
L.
Emulsion W/O: | |
Protegin
(verkauft von Goldschmidt) | 19
g |
Vaselin Öl | 8
g |
Glycerin | 3
g |
DC
hergestellt aus Zwiebelextrakt | 1
g |
Sulfat
von Mg bzw. Magnesiumsulfat | 0,5
g |
Parfüm | 0,8
g |
Konservierungsagens | 0,2
g |
Wasser
qs | 100
g |
-
Beispiel V Extrakte, die
aus Narzissus Brutzwiebeln (Zellkulturen) hergestellt wurden, auf
das Wachstum von Gurkensetzlingen
-
(a) Herstellung von Narzissuszwiebel
Zellkulturen
-
Aktive
Narzissuszwiebeln vom Feld mit Strunkansätzen mit Blütenstand wurden zur Herstellung
von Explantatsduptikaten inneren Maßstabs (duplicate inner scale)
verwendet. Die Explantate wurden anschließend in NR31 Medium (NAA/10 μM BA: 5:0,5 μM) inokuliert
um Kalluskulturen zu initiieren. 4–5 Wochen nach der Einleitung
der Kalluskulturen wurden die Kulturen in NR8 Medium (6% Sucrose) übertragen
um Brutzwiebelwachstumsexplanate zu bilden. Um die Biomasse heraufzusetzen
wurden halbe Brutzwiebeln in Brutzwiebelsäulenbioreaktoren mit flüssigem Basalmedium
N4 übertragen,
welches umfasst:
Murashige & Skoog (Sigma
M-5525) | 4.33
g/l |
Myoinositol | 100
mg/L |
Adeninsulfat | 150
mg/l |
NaH2PO4H20 | 345
mg/l |
NAA | 5 μM Agar Type
A 7 g/l |
BA | 5 μM pH = 5.7 |
Pyridoxine | 1
mg/l |
Glycine | 2
mg/l |
Nicotinsäure | 5
mg/l |
Thiamin
HCl | 0.5
mg/l |
Sucrose | 30
g/l |
-
Für einen
Zeitraum von 4 Wochen.
-
(b) Herstellung von einer
Zellkultur abgeleiteten DC
-
Das
Pflanzenmaterial das wie vorstehend in (a) hergestellt wurde, wurde
anschließend
für 7–10 Tage auf
einen Drehschüttler
bei ungefähr
30°C (das
Säulengewicht
pro Medium betrug 0,1 g/ml) geschüttelt. Die Hälfte der
Zellkulturen wurde durch ihre Inkubation bei einer hohen Temperatur
(ungefähr
35°C) in
Keimruhe induziert. Das von derartigen Kulturen hergestellte DC
wurde IBR-11 genannt. Die verbleibenden Zellkulturen würden in
ihrem aktiven Zustand durch wachsen lassen unter gewöhnlichen
Bedingungen beibehalten und das aus ihnen hergestellte AE wurde
IBR-10 genannt. AE IBR-10 oder DC IBR-11 wurden aus der mediumfreien Biomasse
hergestellt, die mit Wasser gewaschen wurde und in einem Ultra-Turbo-turax
gewogen und homogenisiert wurde. Das Homogenat wurde in sterilem,
destilliertem Wasser suspendiert und verdünnt.
-
(c)
Gurkensamen cv. „Delila", 1994–1995, 95%
Keimung, 99,9% Reinheit wurden in Leitungswasser bei 27°C in der
Dunkelheit für
ungefähr
20 Stunden bis zur Wurzelbildung (1–2 mm) gekeimt.
-
(d) Versuchsassay:
-
(I)
Der Effekt der vorstehenden DC und AE, die aus Narzissus Brutzwiebeln
hergestellt wurden, auf Wurzelverlängerung und Hypocotylverlängerung
der Gurkensetzlinge wurden wie folgt bestimmt: Jede Versuchsgruppe
bestand aus Petrischalen wobei jede 10 Samen enthielt und inkubiert
wurde mit:
- 1. DC IBR-11 (ruhend)
- 2. AE IBR-10 (aktiv)
-
Ein
oder zwei Schichten von Filterpapier wurden in jedem der Petrischalen
platziert und 10 Gurkensamen, die wie vorstehend erklärt gekeimt
wurden, wurden auf den Filtern platziert. Die Petrischalen wurden
für 72
Stunden bei 27°C
bis 30°C
inkubiert.
-
Der
Effekt der Extrakte wurde auf zwei Parameter der Gurkensamen getestet:
- 1. Wurzelverlängerung
- 2. Hypocotylverlängerung
-
Diese
beiden Parameter wurden nach 72 Stunden Inkubation der Samen mit
dem Extrakt getestet.
-
(II) Ergebnisse
-
Wie
aus Tabelle 5 nachstehend ersichtlich, wies DC IBR-11 72 Stunden
nach Inkubation eine signifikant höhere Inhibierungsaktivität auf sowohl
die Wurzellänge
als auch die Hypocotyllänge
der Setzlinge im Vergleich zu dem Effekt von AE auf das Wachstum
der Setzlinge auf.
-
-
Beispiel VI
Effekt aus Narzissuszwiebel Zellkulturen abgeleiteten DC auf die
Proliferation von Keratinozyten
-
(a) Herstellung von Keratinozytenkulturen
-
Menschliche
Keratinozytenkulturen wurden wie vorstehend in Beispiel II (a) beschrieben
hergestellt.
-
(b) Effekt von Narzissus
Brutzwiebel abgeleiteter DC auf die Proliferation von Keratinozyten
-
(I) Versuchsassay:
-
Narzissuszwiebel
abgeleitete Zellkulturen wurden wie vorstehend beschrieben erhalten
und DC IBr-11 wurde aus Brutzwiebeln hergestellt, die in Keimruhe
(die ebenso vorstehend beschrieben ist) induziert wurden
-
Die
sekundären
Keratinozyten Zellkulturen wurden wie vorstehend beschrieben in
Mikroplatten platziert und weiterhin in Kmed für einen Zeitraum von 3–4 Tagen
wachsen gelassen. Die Mikroplatten wurden anschließend in
die nachstehenden Hauptgruppen unterteilt:
- (1)
Keratinozyten die in Kmed kontinuierlich wachsen gelassen wurden;
- (2) Keratinozyten die Kmed wachsen gelassen wurden das DC IBR-11
in verschiedenen Konzentrationen (von 0,5 μg/ml–10 μg/ml, wobei jede Konzentration
eine getrennte Versuchsgruppe bildet) enthält.
-
Jede
Versuchsgruppe umfasste 5 Vertiefungen. Das DC enthaltende Wachstumsmedium
wurde alle 24 Stunden für
einen Zeitraum von 5 Tagen gewechselt, anschließend wurde das Medium aus allen
Vertiefungen entfernt und frisches Kmed Medium ohne irgendeinen
pflanzlichen Extrakt wurde hinzugefügt und die Kulturen wurden
darin für
zusätzliche
3 Tage wachsen gelassen.
-
Der
Effekt der getesteten DC auf die Proliferation der Keratinozyten
wurde mittels der Zellzahl bestimmt die in einer getesteten, behandelten
Vertiefung nachgewiesen wurden, im Vergleich zu der Zahl nachgewiesener
Zellen in einer Vertiefung in der die Zellen im Kmed Medium ohne
irgendein DC wuchsen.
-
Die
Zellzahl in jeder Vertiefung wurde durch den Mikrokultur Methylenblauassay
nachstehend bestimmt:
Die mit dem Extrakt behandelten Kulturen
und Kontrollen wurden in Glutaraldehyd 0,05% Endkonzentration für 10 min.
bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen wurden die Mikroplatten
mit Methylenblau 1% in 0,1 M Borat Buffer pH 8,5 für 60 min.
bei Raumtemperatur gefärbt.
Anschließend
wurden die Platten lange und gründlich
gewaschen um überschüssigen Farbstoff
zu entfernen und getrocknet. Der von den Zellen aufgenommene Farbstoff
wird in 0,1 N HCL für
60 min. bei 37°C
eluiert und bei 620 nm gelesen.
-
In
vorläufigen
Titrationsversuchen wurden lineare Ablesungen für 1 × 103 bis
4 × 104 Zellen pro Vertiefung erhalten. Jeder Punkt
der Wachstumskurven Versuche stellt einen Durchschnitt der Ablesungen
von 5 Vertiefungen dar, da Keratinozyten inselförmig wachsen und keine einheitlichen
Monoschichten bilden. Die Durchschnittszahl der Zellen in den Vertiefungen
wurde 2 Tage und 5 Tage nach Inkubation der Keratinozyten mit dem
getesteten DC ebenso wie 8 Tage nach Inkubation (folgend 3 Tagen
Wachstum ohne getesteten Extrakt) bestimmt.
-
(II) Ergebnisse:
-
Wie
es aus 3 ersichtlich ist, zeigt DC IBR-11 eine signifikante
inhibitorische Aktivität
auf die Proliferation der Keratinozyten in Kultur.
-
Beispiel VII Effekt von
DC, das von ruhenden Narzissusbrutzwiebeln erhalten wurde, auf die
Proliferation von Fibroplasten in Kultur
-
(a) Herstellung von Fibroplasten
Zellkultur:
-
Primäre Fibroplasten
Zellkulturen wurden aus kleinen Proben menschlicher Haut iniziiert
und wie vorstehend in Beispiel II beschrieben hinsichtlich der Herstellung
von Keratinozyten Kulturen hergestell, mit Ausnahme das das verwendete
Wachstumsmedium DMEM + 20% fötales
Kälberserum
war.
-
(b) Herstellung von Zellkultiviertem
DC:
-
IBR-11
wurde aus ruhenden Brutzwiebeln wie vorstehend in Beispiel V(b)
beschrieben hergestellt.
-
(c) Effekt von DC auf
die Fibroplastenproliferation:
-
(I) Versuchsassay:
-
Die
vorstehenden Extrakte wurden von den Fibroplasten bei verschiedenen
Konzentrationen (1 μg/–10 μg/ml) hinzugegeben
und die Zahl an Fibroplasten in den Kulturen wurde nach 2 Tagen,
5 Tagen und 8 Tagen nach der Zugabe der Extrakte zu den Zellen,
wie in Beispiel V(a) vorstehend beschrieben, bestimmt.
-
(II) Ergebnisse:
-
Wie
es aus 4 ersichtlich ist, zeigte die von Zellkulturen
abgeleitete DC IBR-11 eine inhibitorische Aktivität auf die
Proliferation von Fibroplasten.
-
Beispiel VIII Effekt von
Fruchtsaft auf das Wachstum von Gurkensamen
-
(a) Herstellung von Fruchtsaft:
-
Pampelmusensaft
wurde aus einer frischen Pampelmuse hergestellt und der hergestellte
Saft wurde durch Baumwollgewebe ausgedrückt und filtriert und anschließend bei
10000 Upm für
10 Min. bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wurde
der Überstand
für das
testen seines Effekts auf das Wachstum von Gurkensamen wie nachstehend
beschrieben verwendet.
-
(b) Der Effekt von Pampelmusensaft
auf das Wachstum von Gurkensetzlingen
-
(I) Versuchsassay:
-
Gurkensamen
wurden wie vorstehend in Beispiel 1 (c)(I) beschrieben hergestellt.
Jede Versuchsgruppe umfasste 10 Petrischalen die mit 1,8 ml des
folgenden befüllt
wurden:
- (1) dH2O
- (2) Fruchtsaft der wie in (a) vorstehend erhalten wurde.
-
Ein
oder zwei Schichten wurden in jeder der Petrischalen platziert und
10 Gurkensamen, die wie vorstehend erklärt gekeimt wurden, wurden auf
dem Filter platziert. Die Petrischalen wurden bei 25°C inkubiert und
die Parameter der Gurkensamen wurden nach 24 Stunden und 72 Stunden
nach Inkubationsbeginn bestimmt. Der Effekt des Fruchtsafts wurde
auf zwei Parametern der Gurkensamen getestet:
- (1)
Wurzelverlängerung
- (2) Hypocotylverlänerung
-
(II) Ergebnisse:
-
Wie
aus Tabelle 6 nachstehen ersichtlich ist, zeigt dieser Versuch an
das der Fruchtsaft eine inhibitorische Aktivität auf das Wachstum von Gurkensamen
umfasst.
-
-
Beispiel IX Effekt von
Keimruhesubstanzextrakt, der von dem Krebstier Artemia salina erhalten
wurde, auf das Wachstum von Gurkensamen
-
(a) Herstellung von Extrakten
von Artemia salina
-
Die
IBR-4 genannten Keimruhesubstanzextrakte wurden durch Herstellung
eines Extraktes aus Artemia salina erhalten. Die Artemia „Eier" können einer
Dehydration oder höheren
Salzkonzentration unterzogen werden, was in einer Öffnung ihrer
Hülle resultiert
auf welche anschließend
ihre Grundberührung
(grounding) folgt. Die Artemia Eier können alternativ in 10 ml Wasser
verteilt werden, was zur Weichmachung der Hülle führt. Der Grundierung oder Erweichung
der Hüllen
folgend, werden die Eier anschließend in einem von irgendeinem
an sich (bspw. Wasser) bekannten Lösungsmittel gelöst um ein
Extrakt von ihnen zu erhalten. Der Extrakt kann lyophilisiert werden
(wie in diesem Beispiel) oder alternativ wie erhalten verwendet
werden. Ein zusätzliches
Verfahren zum Erhalten des Artemia Extraktes kann in dem Lösen der
Artemia Eier in Wasser bis die Prenauplius Larven aus den Hüllen kriechen,
wonach die Larven grundiert (grounded) und ein Extrakt davon erhalten
wird.
-
(b) Der Effekt des DC
Extraktes von Artemia (IBR-4) auf das Wachstum von Gurkensetzlingen
-
(I) Versuchsassay:
-
Gurkensamen
wurden, wie vorstehend in Beispiel 1 erklärt, hergestellt und in Petrischalen platziert. Jede
Versuchsgruppe umfasste eine Petrischale die 10 Gurkensamen enthielt
und die nachstehenden Ergebnisse stellen einen Durchschnitt der
Parameter dar, die für
die 10 Samen bestimmt wurden. Die Petrischalen wurden bei 28°C in der
Dunkelheit wachsen gelassen und die Wurzellänge und die Hypocotyllänge der
Gurkensamen wurden 24 Stunden und 48 Stunden nach Inkubationsbeginn
mit 1,8 ml des folgenden bestimmt:
- (1) dH2O
- (2) DC IBR-4 bei einer Konzentration von 0,02 g/ml.
-
(II) Erlebnisse:
-
Wie
aus Tabelle 7 nachstehend ersichtlich ist, wies der Artemia Keimruhesubstanzextrakt
IBR-4 einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf das Wachstum
von Gurkensamen auf, der bereits 24 Stunden nach Inkubation der
Samen mit DC IBR-4 ersichtlich war, wobei allerdings 48 Stunden
nach Inkubation (66% Inhibition auf das Wurzelwachstum und 40% Inhibition
auf das Hypocotyl Wachstum) am signifikantesten.
-
-
Beispiel X Effekt eines
Keimruhesubstanzextraktes einer ruhenden Pflanze (von Narzissus
abgeleitetes IBR-1) und eines Keimruhesubstanzextraktes das von
Tieren (von Artemia abgeleitetes IBR-4) erhalten wurde auf die Proliferation
von Karzinom Zellen der Blase der Maus
-
(a) Herstellung der Keimruhesubstanzextrakte:
-
Der
von Narzissus abgeleitete pflanzliche Keimruhesubstanzextrakt IBR-1
und der von Artemia abgeleitete tierische Keimruhesubstanzextrakt
IBR-4 wurden wie vorstehend in den Beispielen erklärt hergestellt.
-
(b) Der Effekt von DC
IBR-1 und DC IBR-4 auf die Proliferation von Karzinom Zellen der
Blase der Maus:
-
(I) Versuchsassay:
-
Die
zwei Versuche wurden wie nachstehen beschrieben durchgeführt:
T24P
Zellen (Karzinom Zellen der Blase der Maus)(5)
wurden mit einer Konzentration von 5 × 104 Zellen pro
Vertiefung in eine Mikrokulturvertiefung platziert und T50 Zellen
(Karzinom Zellen der Blase der Maus)(6) wurden
bei einer Konzentration von 2 × 104 Zellen pro Vertiefung in einer Mikrokulturplatte
platziert und die Zellen wurden im Zellkulturmedium wachsen gelassen.
Die
DC IBR-1 und DC IBR-4 wurden zu den T24P Zellkulturen hinzugegeben
und IBR-1 wurde ebenso zu den T50 Zellen bei verschiedenen Konzentrationen
(0 g/ml–25
g/ml) 24 Stunden nach Platzieren der Zellen und 48 Stunden nach
Inkubationsbeginn der Zellen mit den Keimruhesubstanzextrakten hinzu
gegeben. Die Zellzahl pro Vertiefung wurde 48 Stunden nach Inkubationsbeginn
der Zellen mit den Extrakten unter Verwendung des Mikrokultur Methylenblauassays
(wie in Beispiel 2 vorstehend beschrieben) bestimmt, wobei die gefärbten Kulturplatten
bei 620 nm gelesen wurden.
-
(II) Ergebnisse:
-
Wie
aus den 5 und 6 ersichtlich
ist, wiesen sowohl der von Pflanzen abgeleitete Keimruhesubstanzextrakt
als auch der von Tieren abgeleitete Keimruhsubstanzextrakt einen
gewissen inhibitorischen Effekt auf die Proliferation von Karzinom
Zellen der Blase der Maus T24P (5)
und T50 (6) auf.
-
Beispiel XI
Inhibition des Wachstums von Gurkensamen durch Pampelmuse und Kiwisaft
-
(a) Herstellung des Fruchtsaftes
-
Pampelmuse
und Kiwi Fruchtsäfte
wurden aus der frischen Frucht hergestellt, indem die Frucht in
dem Mischbecher bei hoher Geschwindigkeit für 3 Min. vermischt wurde, Filtrieren
des Gemischs durch ein Kreuzspulengewebe (cheese cloth) und Zentrifugieren
bei 6500 Upm für
10 Min. bei Raumtemperatur. Der Überstand
wurde anschließend
für den
Versuch bei einer Konzentration von 1,2 g/ml des Pampelmusensaftes
und 1,26 g/ml des Kiwisaftes verwendet. Die Konzentration wurde
mittels des ursprünglichen
Früchtegewichts
(g) für
das Endvolumen (v) bestimmt. Mehrere Verdünnungen jeder Frucht wurden
hergestellt und zum Testen auf das Wachstum von Gurkensamen verwendet.
-
Die
Herstellung der Gurkensamen und der Versuchsassay erfolgten wie
in Beispiel I(c)(I) vorstehend beschrieben. Die Länge der
Wurzeln und Hypocotylen wurden 24 und 48 Stunden nach Inkubationsbeginn
der Samen mit jedem der getesteten Säfte oder Kontrollen bei 28°C bestimmt.
Wie aus Tabelle 8 nachstehend ersichtlich ist, zeigten sowohl der
Kiwisaft als auch der Pampelmusensaft einen sehr hohen Inhibitionsprozentsatz
sowohl auf das Wachstum der Gurkenwurzeln als auch der Hypocotylen.
Die deutlichste Inhibierung wurde 48 Stunden nach Inkubationsbeginn
beobachtet, wobei beide Säfte
das Wachstum der Gurkensamen inhibierten.
-
-
Beispiel XII Zellzyklusanalyse
der Zellen nach Inkubation mit DC
-
(I) Versuchsassay:
-
Zellkulturen
von Keratinozyten, die von gesunden menschlichen Erwachsenen erhalten
wurden, und Zellkulturen von Fibroplasten, die von gesunden menschlichen
Hautpräparationen
erhalten wurden, wurden mit von Narzissus abgeleiteter DC (IBR-1),
von Narzissus abgeleiteter AE (IBR-3) und von Artemia abgeleiteter DC
(IBR-4) bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Der DNA Gehalt
der Zellen wurde mittels FACS unter Verwendung von Ethidiumiodid
als der Fluoreszenzfarbstoff analysiert der an die DNA bindet (Parks
D. R, and Herzenberg, L. A., In: Methods in Cell Biology, Vol. 26,
(1982) Academic Press, p. 283). Die Analyse wurde am Tag 2 und 5
nach Inkubationsstart der Zellen mit den verschiedenen Extrakten
durchgeführt
und wurde mit einem FACS FPAR- Plus
(Becton-Dickinson, Inc.) durchgeführt.
-
Darüber hinaus
wurde die prozentuale Apoptose in jeder Zellkultur bestimmt, die
mit den verschiedenen DC Extrakten inkubiert wurden. Die Apoptose
beginn im Allgemeinen mit einer starken mitochondrialen Aktivierung,
gefolgt von einer Zersetzung des Zellnukleus. FACS Analyse der vorstehenden
Zellkulturen ermöglichte
ebenso die Berechnung der prozentualen Apoptose in jeder Zellkultur.
-
(III) Ergebnisse:
-
(a) Effekt von DC auf
den Zellzyklus von Keratinozyten
-
Wie
es aus 7A und B, und 7E und
F, ersichtlich ist, wiesen sowohl der von Narzissus abgeleitete
DC als auch von Artemia abgeleitete DC einen Effekt auf den DNA
Gehalt der Keratinozyten auf, die eine Abnahme des Prozentsatzes
von Zellen, die sich in der G1 Phase befinden, und eine Zunahme
an Zellen anzeigten, die sich in den S und G2 + M Phasen (der Effekt
ist bereits an Tag 2 der Inkubation offensichtlich und am Tag 5
der Inkubation mehr offensichtlich) befinden. Wie aus den 7C und
D ersichtlich, war im Gegensatz hierzu der Effekt der von Narzissus
abgeleiteten AE (IBR-3) deutlich weniger offensichtlich, wobei nur 5
Tage nach Inkubation eine geringe Offensichtlichkeit vorlag, wobei
eine Abnahme im Prozentsatz an Zellen in der G1 Phase ersichtlich
war mit einer Zunahme am Prozentsatz von Zellen die sich in der
S Phase befinden und einer nicht signifikanten Zunahme bei dem Prozentsatz
von Zellen die sich in der G2 + M Phase
befinden.
-
Die
Keratinozyten die mit den von Narzissus und Artemia abgeleiteten
DCs IBR-1 und IBR-4
inkubiert wurden, zeigten darüber
hinaus eine Zunahme bei der prozentualen Apoptose, wohingegen eine
solche Zunahme bei den Keratinozyten nicht ersichtlich war, die
mit von Narzissus abgeleitetem AE IBR-3 inkubiert wurden.
-
(b) Effekt von DC auf
den Zellzyklus von Fibroplasten
-
Wie
aus den 8A und B und den 8E und
F ersichtlich ist, steigerte von Narzissus abgeleitete DC (IBR-1)
und von Artemia abgeleitete DC (IBR-4) den Prozentsatz von Zellen,
die sich in den S und G2 + M Phasen befinden
(hauptsächlich
5 Tage nach Inkubationsbeginn beobachtet), im Vergleich zu denselben
Zellkulturen, die mit Wasser inkubiert wurden. Wie aus den 8C und
D ersichtlich ist, hatte im Gegensatz hierzu die Inkubation der
Zellen mit von Narzissus abgeleiteter AE (IBR-3) keinen Effekt.
Keiner der getesteten Extrakte steigerte den Prozentsatz an Apoptose
in den Fibroplasten Zellkulturen.
-
Der
Effekt der verschiedenen DCs auf die Keratinozyten und Fibroplastenkulturen
war zeit und dosisabhängig.
-
Beispiel XIII Der Effekt
von DC Präparationen,
die aus Zwiebeln verschiedener Pflanzen erhalten wurden, auf das
Wachstum gekeimter Gurkensamen
-
- (a) Extrakte wurden aus Zwiebeln verschiedener
Pflanzen wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die
extrahierten Zwiebeln befanden sich in ihrem Keimruhezustand, in
dem kein Hinweis auf Wachstum bzw. Wachstumsspitze visualisiert
werden konnte. Die Extraktkonzentration wird als ursprüngliches Gewicht
an Zwiebeln (g) pro Endextraktvolumen (ml) festgelegt.
- (b) Der Effekt von Extrakten auf das Wachstum von gekeimten
Gurkensamen:
Der Versuchsassay wurde wie vorstehend in Beispiel
1 beschrieben durchgeführt.
Der Effekt der getesteten Zwiebelextrakte auf das Wachstum der Gurkensamen
wurde 24 Stunden und 48 Stunden nach Inkubationsbeginn der Extrakte
mit den Samen getestet.
-
Der
inhibierende Effekt der getesteten Extrakte wurde wie in den Beispielen
zuvor beschrieben bestimmt.
-
Ergebnisse:
-
Wie
aus der Tabelle 9 nachstehend ersichtlich ist, zeigten die meisten
der Extrakte einen guten inhibitorischen Effekt auf das Wachstum
der gekeimten Gurkensamen (bis zu ungefähr 60% im Durchschnitt). Mehrere
der Pflanzen zeigten eine sehr gute Inhibierungsaktivität von ungefähr 90% Inhibition
(Beispielsweise Pancratium maritumum). Mehrere der Extrakte zeigten
einen geringen inhibitorischen Effekt der in manchen Fällen auf
der Tatsache beruhen kann, dass sich die Zwiebeln nicht vollständig in
der Keimruhe befanden.
-
Der
Effekt der Extrakte von Pancratium maritumum und Hyancinth carnegie
wurde weiterhin auf ihren Effekt auf das Wachstum von Gurkensamen
durch Zugabe verschiedener Konzentrationen der Extrakte zu den Samen
getestet. Die Ergebnisse (nicht gezeigt) zeigten einen Zusammenhang
zwischen der Konzentration des hinzugegebenen Extraktes und des
Inhibierungseffektes des Extrakts auf das Wachstum gekeimter Gurkensamen. Tabelle
9 Inhibition
(%) des Samenwachstums durch Extrakte:
- (-)
- zeigt eine Stimulierung
des Wachstums an
-
Beispiel XIV Effekte von
Extrakten von Narzissuszwiebeln auf das Wachstum von Gurkenpflanzen
-
- (a) Extrakte von ruhenden Narzissuszwiebeln
wurden wie in Beispiel 1 vorstehend erklärt hergestellt.
- (b) Gurkensamen wurden gekeimt und für 3 Tage wachsen gelassen bis
sie Wurzeln und das Hypocotyl von ungefähr 4 cm aufwiesen. Die Pflanzen
wurden anschließend
in Erde gepflanzt und bei 23°C
in Leitungswasser wachsen gelassen. Die Pflanzen wurden in die folgenden
drei Gruppen unterteilt wobei jede 18 Pflanzen umfasste:
- 1. Pflanzen die mit Leitungswasser bewässert wurden;
- 2. Pflanzen die mit Leitungswasser bewässert wurden und mit dem Narzissuszwiebelextrakt
durch Besprühen
mit Extrakt (5 mg/ml) auf die Blätter
und das Wachstumsmeristem behandelt wurden; und
- 3. Pflanzen die unmittelbar mit dem Narzissuszwiebelextrakt
(0,2 g/ml.) bewässert
wurden.
-
Die
Pflanzen wurden jeden Tag bewässert
und nach einer Woche Behandlung wurden die Pflanzen aus dem Boden
entnommen und der Effekt jeder Behandlung wurde durch Bestimmen
der Länge
der Wurzeln und Stängel
jeder Pflanze bestimmt.
-
Ergebnisse:
-
Wie
aus Tabelle 10 nachstehend ersichtlich ist, führte die Anwendung des ruhenden Narzissus
Zwiebelextraktes auf die Gurkenpflanzen sowohl durch Sprühen des
Extraktes auf die Blätter
und Wachstumsmeristem (Gruppe 2) ebenso wie das Bewässern der
Pflanzen mit dem Extrakt (Gruppe 3) zur Inhibierung des Wachstums
der Gurkenpflanzen im Vergleich zu deren Wachstum mit Leitungswasser.
-
Tabelle
10 Effekt
von ruhenden Narzissuszwiebelextrakt auf das Wachstum von Gurkenpflanzen
-
Beispiel XV Effekt von
Narzissuszwiebelextrakt auf das Wachstum verschiedener Arten von
Samen
-
- (a) Der ruhende Narzissuszwiebelextrakt wurde
wie vorstehend erklärt
hergestellt.
- (b) Verschieden Arten von Samen (Tomate, Kohl, Melone, Wassermelone,
Weizen, Gras, Gurke, Bohne, Gerste, Getreide und Erbse) wurden über Nacht
mit Wasser gewaschen und anschließend für 24 Stunden bei 30°C im Dunklen
auf mit Wasser getränktem
Filterpapier keimen gelassen. Nach 24 Stunden wurden die gekeimten
Samen (20 in jedem Versuchssatz) auf eine Petrischale mit Watman
Filterpapier aufgebracht, das mit dem Keimruhesubstanzextrakt getränkt ist.
-
Jede
Samengruppe wurde in die folgenden Gruppen unterteilt:
- 1. Samen die in Wasser (Kontrolle) wachsen gelassen wurden;
und
- 2. Samen die mit dem ruhenden Narzissuszwiebelextrakt wachsen
gelassen wurden.
-
Mehrere
Arten von Samen wurden mit dem Wasser oder Extrakt (bei verschiedenen
Konzentrationen) wie in Beispiel 1 vorstehend erklärt wachsen
gelassen und nach der Inkubation wurde die Länge der Wurzeln und Hypocotylen
eines jeden Samens alle 24 Stunden in Abhängigkeit von der Keimungs-
und Wachstumsrate bestimmt. Der Inhibierungseffekt des Extrakts
wurde wie vorstehend erklärt,
getestet und berechnet.
-
Wie
aus der Tabelle 11 nachstehend ersichtlich ist, inhibierte der ruhende
Narzissuszwiebelextrakt das Wachstum der vorstehenden Samen wirkungsvoll.
Die Inhibierung erreichte verschiedene Ausmaße.
-
Tabelle
11 Effekt von ruhendem Narzissus auf das Wachstum verschiedener
Arten von Samen
-
Beispiel XVI Isolierung
und Identifikation eines aktiven Bestandteils in dem Narzissuszwiebelextrakt
-
Mehrere
Gramm an Pulver, das von aktiven und ruhenden Narzissuszwiebeln
hergestellt wurde, wurde mit Aceton Methanol (90:10) extrahiert.
die Extrakte wurden unter Verwendung von Dünnschichtchromotographie (TLC)
Verfahren getrennt. Die Trennung wurde auf TLC Platten durchgeführt (Silica
Gel 60 F254 oder von Merck). Laufkonditionen waren Wasser : n-butanol
: Essigsäure
(5:4:1). das Detektionsverfahren war UV Licht bei 254 nm und 365
nm. Die von der Trennung herrührenden
Banden wurden mit dem Silika von der Platte abgekratzt, mit Methanol
gewaschen und bei 60°C
getrocknet. Die Banden, die in den Extrakten der aktiven Narzissuszwiebeln
auftraten, wurden, mit jeden verglichen die in den Extrakten der
ruhenden Narzissuszwiebeln auftraten.
-
Ergebnisse:
-
Vergleich
der Banden, die in den vorstehenden zwei Extrakten auftraten, zeigte,
dass es einen Unterschied bei der Expression von zwei Banden (genannt „Bande
4" und „Bande
6") gab, der bei
einer höheren Konzentration
in Extrakten der ruhenden Zwiebeln auftrat.
-
Das
UV Absorptionsspektrum der zwei Banden und ihre inhibitorische Aktivität auf gekeimte
Gurkensamen wurde wie vorstehend erklärt getestet.
-
Wie
aus den 9A–9B ersichtlich
ist, war der UV Absorptionspeak von Bande 4 bei 288 nm (9A)
und der von Bande 6 bei 252 nm (9B). Wie
es aus Tabelle 12 nachstehend ersichtlich ist, inhibierten die Banden
4 und 6 das Wachstum gekeimter Gurkensamen signifikant.
-
-
Beispiel XVII Testen auf
Toxizität
von DC, die von ruhenden Narzissuszwiebeln erhalten wurde
-
Die
Toxizität
der erfindungsgemäßen DC wurde
unter Verwendung der nachstehenden Verfahren getestet:
-
1. Akute orale Toxizitäts-(festgelegte
Dosis) Test in Ratten
-
Der
akute toxikologische Test basierte auf dem Protokoll, Code P/ACU/005,
das im Januar 1996 durch das Inveresk Research International (IRI),
Tranent, EH33 2NE, Schottland herausgegeben wurde.
-
2. Ames Test
-
Salmonella
typhimurium Säuger
Mikrosomen Plattenaufnahmeassay basierte auf Ames B. N., McCann,
J. and Yamasaki, E., Mutation Research, 31 (1975) 347–364.
-
3. Cytotoxizität
-
Cytotoxizität des Extraktes
(5%) von 0,2 g/ml Extrakt in einer kosmetischen Creme, bestimmt
durch das Agarose Diffusionsverfahren, wurde von EVIC-CEBA, Bordeaux,
Frankreich getestet.
-
4. Irritations Potenzial
-
Das
Irritations Potenzial des Produkts in der Creme (5%) von 0,2 g/ml
Extrakt wurde Mittels des HET-CAM Tests (Chorioallantois Membran
eines Hühnereis)
von EVIC-CEBA, Bordeaux, Frankreich bestimmt.
-
5. Hauttoleranz
-
Die
Hauttoleranz des Extraktes (5%) von 0,2 gr/ml Extrakt, in einer
kosmetischen Creme nach wiederholter Anwendung auf die Haut wurde
von ECIV-CEBA, Bordeaux, Frankreich festgestellt.
-
Ergebnisse:
-
Die
Ergebnisse der Toxizität
Tests unter Verwendung der vorstehenden Verfahren waren wie folgt:
- 1. Die akute orale Toxizität (festgelegte Dosis) Test
in Ratten oral LD 50 > 2000
mg/kg Körpergewicht
wies keine akuten schädigenden
Effekte sowohl auf junge weibliche und männliche Ratten auf.
- 2. Ames Test bis zu der Obergrenzendosis von 5000 μg/Platte
wies keinen Niederschlag und keine Toxizität auf und induzierte keine
mutagenen Effekte auf dem Ames Test.
- 3. Irriationspotenzial in Creme ((5%) von 0,2 g/ml. Extrakt).
Es wurde vorgefunden, dass das Produkt gewöhnlich irritierend für diese
Art von Produkt ist.
- 4. Cytotoxizität
Bestimmung durch das Agarose Diffusionsverfahren des Produkts in
Creme ((5%) von 0,2 g/ml Extrakt) scheinen niedrig zu sein und werden
als niedrig erachtet und werden als gewöhnlich für diese Art von Produkt erachtet.
- 5. Hauttoleranz Die klinische Beurteilung der Hauttoleranz des
Extrakts in einer kosmetischen Creme wurde getestet. Es wurde gefunden,
dass das Produkt sehr gut von der Haut toleriert wird.
-
Beispiel XVIII Der Effekt
von DC auf eine Verlängerung
einer Bräune
-
(a) Der Assay
-
Eine
5% Dihydroxyaceton (DHA) enthaltene Creme wurde auf die Vorderarme
eines Individuums verabreicht. DHA ist eine Verbindung, die die
oberen Hautschichten färben
kann und in Selbstbräunungsprodukten
verwendet werden kann. Die Creme wurde drei Mal verabreicht bis
eine Bräune
auf den Vorderarmen erschien.
-
Der
gebräunte
Bereich wurde anschließend
in die folgenden drei Teile unterteilt, wobei jeder durch Verabreichung
einer verschiedenen Creme zwei Mal am Tag während 17 Tagen behandelt wurde:
- (a) Behandlung mit einer Creme, die 5% des
DC IBR-1 umfasst;
- (b) Eine Creme die identisch zu der in (1) vorstehend verwendet
worden ist, die allerdings kein IBR-1 enthält;
- (c) Eine Creme die Alphahydroxysäure (AHA) umfasst (handelsüblich zur
Hautbehandlung verwendet); und
wobei die Menge an Farbe eines
jeden Hautbereichs unter Verwendung eines Spektrokolorimeters bestimmt
wurde.
-
Der%
Effekt auf die Verlängerung
der Bräune
wurde berechnet als:
Bräunungsfarbe
nach Behandlung a | Bräunungsfarbe
nach Behandlung b |
Bräunungsfarbe
ohne Behandlung | Bräunungsfarbe
ohne Behandlung × 100 |
-
Ergebnisse:
-
Die
Ergebnisse des vorstehenden Versuchs sind in 10 ersichtlich,
die den Zusammenhang zwischen dem Effekt auf die Bräunungsdauer
der vorstehenden in 1 verwendeten Creme zeigt, das IBR-1 DC enthält, im Vergleich
zum Effekt der Creme, die kein IBR-1 (10A und
B) enthielt, und der relative Effekt der vorstehenden in (3) verwendeten
Creme (AHA umfassend) im Vergleich zu einer Creme die überhaupt
kein AHA (10C und D) umfasste. Wie
es aus der 10A ersichtlich ist, war 5 Tage
nach Verabreichung der Creme der Effekt der IBR-1 enthaltenen Creme
auf eine Verlängerung
der Bräunungsdauer
signifikant höher, als
der Effekt der Creme die kein IBR-1 enthielt. Der Effekt war sogar
17 Tage nach Verabreichung der Creme, wie es aus 10B ersichtlich
ist, signifikanter.
-
Die 10C und D zeigen klar das die handelsüblich verwendete
Creme, die kein IBR-1 enthält,
einen nachteiligen Effekt auf die Bräunungsdauer aufwies, d. h.
ihre Verabreichung führte
zu einer kürzeren
Bräunungsdauer
im Vergleich zu überhaupt
keiner Behandlung. Wie es ebenso ersichtlich ist, verkürzte die
AHA umfassende Creme die Bräunungsdauer
(verglichen mit der Bräunungsdauer
ohne Behandlung) 5 Tage nach Ihrer Verabreichung (10C)
und 17 Tage nach ihrer Verabreichung (10D).
-
Die
vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass eine erfindungsgemäßes DC umfassende
Creme die Bräunungsdauer
verlängert,
höchstwahrscheinlich
auf Grund ihrer Inhibition einer Proliferation der Hautzellen. Im Gegensatz
hierzu verkürzt
eine Creme, die AHA umfasst, welches Allgemein für die Hautbehandlung verwendet
wird, die Bräunungsdauer
höchstwahrscheinlich
auf Grund ihrer Stimulierung der Zellteilung.