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Die
vorliegende Erfindung betrifft Polyketide sowie deren Synthese und
Verwendung. Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, betrifft sie Rapamycinvarianten.
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Rapamycin,
(siehe 2) ist ein lipophiles Makrolid mit einem Molekulargewicht
von 914 und einer mit einem Pipecolinsäurelactom verknüpften 1,2,3-Tricarbonylgruppierung.
Durch die Sequenzierung der putativen Biosynthesegene für Rapamycin
konnte das Vorhandensein dreier außergewöhnlich großer offener Leseraster, die
für die
modulare Polyketidsynthase codieren, gezeigt werden (Schwencke et
al., P.N.A.S 92 (17) 7839-7843 (1995)). Auf beiden Seiten dieser
sehr großen
Gene sind offene Leseraster angeordnet, die für Enzyme zu codieren scheinen,
die für
die Rapamycinbiosynthese benötigt
würden.
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Der
Cluster enthält
auch ein neues Gen (rapL), dessen Produkt nach einem Vorschlag die
Bildung des Rapamycinvorläufers
L-Pipecolat (2) über
die Cyclodesaminierung von L-Lysin (1) katalysiert (Molnar et al., Gene
169, 1-7 (1996)):
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Aus
DENOYA CD et al., J BACTERIOL, JUNI 1995, 177 (12) S. 3504-11 ist
eine Disruptionsmutante von Streptomyces bekannt, die in einem Medium,
dem sowohl S(+)-alpha-Methylbutyrat
als auch Isobyturat fehlt, die natürlichen Avermectine nicht herstellen
kann. Durch Supplementierung mit einer dieser Verbindungen wird
die Produktion der entsprechenden natürlichen Avermectine wiederhergestellt,
während
Supplementierung des Mediums mit alternativen Fettsäuren zur
Bildung neuartiger Avermectine führt.
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Aus
HAFNER EW et al., J ANTIBIOT (TOKYO), MÄRZ 1991, 44 (3) S. 349-56 sind
Streptomyces-Mutanten bekannt, die nicht in der Lage sind, mit Isoleucin,
Valin und Leucin als Kohlenstoffquellen zu wachsen. In einem Medium,
dem sowohl S(+)-2-Methylbuttersäure
als auch Isobuttersäure
fehlt, ist die Mutante ebenso nicht dazu in der Lage, die natürlichen
Avermectine herzustellen; durch Supplementierung mit einer dieser
Verbindungen wird die Produktion der entsprechenden vier natürlichen
Avermectine wiederhergestellt.
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Aus
DUTTON CJ et al., J ANTIBIOT (TOKYO), MÄRZ 1991, 44 (3) S. 357-65 sind
Streptomycin-Mutanten bekannt, denen die Fähigkeit fehlt, Isobuttersäure bzw.
S-2-Methylbuttersäure aus
deren 2-Oxosäure-Vorläufermolekülen zu bilden,
und die somit nicht dazu in der Lage sind, natürliche Avermectine zu produzieren,
außer
wenn ihnen diese Säuren
zugefügt
werden. Eine vollständige
Liste alternativer Vorläufermoleküle ist angegeben.
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Aus
LOMOVSKAYA, N. et al., MICROBIOLOGY, 143 1997 875-883 ist die Disruption
von Genen und deren Ersatz durch Phagen im rapamycinreduzierenden
Streptomyces hygroscopicus bekannt.
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Aus
EP0589703 sind Rapamycin-Prolinderivate
sowie Verfahren zu ihrer Produktion durch Streptomyces hygroscopicus
bekannt.
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Die
Biosynthese von Rapamycin erfordert eine modulare Polyketidsynthase,
die eine von Shikimat abgeleitete Ausgangseinheit verwendet und
insgesamt 14 aufeinanderfolgende Polyketid-Kettenverlängerungszyklen
durchführt,
die den Schritten der Fettsäurebiosynthese
gleichen. L-Pipicolinsäure
wird dann in die Kette eingebaut, wonach der Ringschluß des makrozyklischen
Rings erfolgt, wobei man annimmt, daß diese beiden Schritte von
einem Pipecolat einbauenden Enzym (PIE) dem Produkt des rapP-Gens,
katalysiert werden. Anschließend
werden zur Produktion von Rapamycin weitere stellenspezifische Oxidationen
sowie O-Methylierungsschritte
benötigt.
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Es
stellte sich nun heraus, daß es
uns möglich
ist, einen S. hygroscopicus-Organismus gentechnisch herzustellen,
bei dem das (rapL)- Gen inaktiviert ist. Der Organismus kann zwar
unter normalen Wachstumsbedingungen kein Rapamycin produzieren,
ist jedoch dazu in der Lage, wenn ihm Pipecolat zugeführt wird, weiterhin
führt das
Füttern
des mutanten Organismus mit unterschiedlichen Substraten zur Produktion
von Rapamycinvarianten. Das gleiche allgemeine Verfahren läßt sich
auf andere Systeme anwenden, bei denen eine von einem Genprodukt
produzierte Vorläuferverbindung
beteiligt ist, beispielsweise die sehr nahe verwandten FK506- und
Immunomycin-Systeme, an denen ebenso Pipecolat beteiligt ist.
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Somit
wird gemäß der vorliegenden
Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines
Polyketids bereitgestellt, bei dem man einen an der Biosynthese
eines Polyketids, ausgewählt
unter Rapamycin, FK506 und Immunomycin, beteiligten Gen-Cluster modifiziert,
wobei der Gen-Cluster ein für
die Produktion eines für
die Produktion von L-Pipecolat verantwortlichen Enzyms verantwortliches
Gen („das
Vorläufergen") (das in das Polyketid
eingebaut wird) enthält,
wobei man in dem Verfahren das Vorläufergen deletiert oder inaktiviert.
Geeigneterweise wird in dem Verfahren der Deletion oder Inaktivierung
des Vorläufergens
phagenvermittelter Genaustausch eingesetzt. In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen
handelt es sich bei dem Gen-Cluster um den Gen-Cluster zur Produktion
von Rapamycin in S. hygroscopicus und bei dem Vorläufergen
um das rapL-Gen, dessen Produkt für die Produktion von L-Pipecolat
verantwortlich ist.
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In
einem weiteren Schritt des Verfahrens zur Herstellung eines Polyketids
exprimiert man den modifizierten Gen-Cluster in Gegenwart einer
Vorläuferverbindungsvariante,
ausgewählt
unter L-Prolin, L-trans-4-Hydroxyprolin,
L-cis-4-Hydroxyprolin, L-cis-3-Hydroxyprolin und trans-3-Azabicyclo[3,1,0]hexan-2-carbonsäure, die
anstelle von L-Pipcolat unter Erhalt einer Polyketidvariante eingebaut
wird.
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In
weiteren Aspekten werden durch die Erfindung Polyketide, wie sie
mit der obigen Methode herstellbar sind, solche Polyketide umfassende
Pharmazeutika sowie die Verwendung solcher Polyketide bei der Herstellung
pharmazeutischer Zusammensetzungen, beispielsweise Rapamycinvarianten
enthaltender Immunsuppressiva, bereitgestellt.
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Einige
erfindungsgemäße Ausführungsformen
sollen nun ausführlicher
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen beschrieben werden, wobei
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1 einen
Teil des Rapamycingen-Clusters, Wildtyp und mutiert, sowie den zur
Durchführung
der Mutation verwendeten Phagenvektor zeigt;
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in 2 die
Strukturen von Rapamycin sowie einiger Varianten und
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in 3 und 4 die
Wirkungen von Rapamycin und Varianten auf menschliche Lymphoblastoidzellinien
dargestellt sind.
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Um
die Produktion von Rapamycinvarianten zu erleichtern, wurde eine
chromosomale Mutante von S. hygroscopicus durch einen von den Phagen ϕC31
vermittelten Genaustausch unter Verwendung der Methode nach Lomovskaya
et al. [Microbiology (UK) 1997, 143, 815-883] erzeugt. Bei Basenpaar
42 des rapL-Gens (Länge
1032bp) wurde eine nur einmal vorkommende BamHI-Stelle gefunden.
Diese BamHI-Stelle wurde entfernt, indem das Ende mit E-coli-DNA-Polymerase
I aufgefüllt
und somit eine Leserasterverschiebung im rapL-Gen erzeugt wurde.
Ein 3 kb großes
EcoRI-Fragment, das das vom rapK-Gen bzw. ein Teil des rapM-Gens flankierte
gesamte rapL-Gen umfaßt,
wurde in den Phagenvektor KC515 kloniert. Der rekombinante Phage wurde
zur Transfektion von S. hygroscopicus verwendet. Ein Doppelrekombinationsereignis
führte
zur Erzeugung einer chromosomalen Mutante von S. hygroscopicus mit
einer Leserasterverschiebung in rapL. Dies ist in 1 zusammengefaßt.
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Material und
Methoden
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Anmerkung:
Der Leser wird auch auf L.E. Khaw et al., J. Bacteriol., 180 (4)
809-814 (1998) verwiesen, und zwar sowohl hinsichtlich experimenteller
Einzelheiten als auch der Erläuterung
der Arbeit sowie des Hintergrunds dazu.
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Material.
Alle molekularbiologischen Enzyme und Reagenzien stammten aus kommerziellen
Quellen. Bei Viomycin handelte es sich um ein Geschenk von Pfizer,
und L-Pipecolinsäure,
L-Prolin, 3,4-Dehydroprolin, Picolinsäure, Pyrrol-2-carbonsäure, trans-4-Hydroxyprolin, cis-4-Hydroxyprolin,
cis-3-Hydroxyprolin und (±)-trans-3-Azabicyclo[3,1,0]hexan-2-carbonsäure wurden
von Aldrich Chemical Company bezogen.
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Bakterienstämme, Phagen
und Wachstumsbedingungen
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Escherichia
coli DH10B (GibcoBRL) wurde in 2×(trypton-Hefeextrakt)-Medium, wie von Sambrook
et al., („Molecular
Cloning", Cold Spring
Harbor (1989)) beschrieben kultiviert. Der Vektor pUC18 wurde von
New England Biolabs. oder Sigma Chemical Co. bezogen. E.coli-Transformanten
wurden mit 100 mg/ml Ampicillin selektioniert. Der Rapamycin-Produktionsstamm
Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 (von ATCC) und seine Derivate
wurden auf SY-Agar (lösliche
Stärke
1,5% ; Hefeextrakt 0,1% ; K2HPO4 0,1%
; MgSO4 × 7H2O, 0,1%;
NaCl 0,3%; TES (N-tri[Hydroxymethyl]methyl-2-aminoethansulfonsäure)-Puffer, 30 mM, pH 7,4
; Agar 1,5%) gehalten und in „Tryptic
Soy Broth" mit 1,0%
Glucose, 100 mM MES pH 6,0, falls erforderlich supplementiert mit
10 μg/ml
Viomycin, kultiviert. S.lividans J11326 (D A Hopwood et al.: „Genetic
Manipulation of Streptomyces: a laboratory manual", The John Innes
Foundation, Norwich, England (1985)) wurde in YEME (Hopwood et al.,
1985) oder „Tap
Water Medium" (0,5%
Glucose; 1% Saccharose; 0,5% Trypton; 0,25% Hefeextrakt; 36 mg EDTA;
pH 7,1) kultiviert.
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Flüssigkulturen
wurden bei 30°C
in Erlenmeyer-Kolben unter Schütteln
bei 200 bis 250 UpM angezogen. Die Infektion mit dem atr-Actinophagen
KC515 (Hopwood (1985) op. cit. und K. F. Chater in: „The Bacteria" IX (119-158), New
York 1986) und seinem Derivat ΦΔrapL (vorliegende
Arbeit) wurde auf festem DNA-Medium, supplementiert mit 10 mM MgSO4, 8 mM Ca(NO3) und
0,5% Glucose (Hopwood et al., 1985), durchgeführt.
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Isolierung
und in-vitro-Manipulation von DNA
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DNA-Manipulationen,
PCR und Elektroporationsverfahren wurden wie bei Sambrook et al.
(1989) beschrieben durchgeführt.
S. hygroscopicus-Gesamt-DNA wurde unter Verwendung des Kits zur
Isolierung genomischer DNA von Gibco isoliert. Southern-Hybridisierungen
wurden mit mit Digoxigenin unter Verwendung des DIG-DNA-Markierungskits (Boehringer
Mannheim) markierten Sonden durchgeführt. DNA-Fragmente für die Markierung
und Subklonierung wurden mit dem Gelextraktionskit Qiaex (Qiagen)
isoliert.
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Konstruktion von eine
Leserasterverschiebung im rapL-Gen
tragenden ΦΔrapL für die homologe
Rekombination in S. hygroscopicus
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Zur
Konstruktion von pUC3EcoRI wurde ein 3034bp großes Eco RI-Fragment (Nukleotide
93956 bis 96990 des rap-Clusters)
(T. Schwecke et al., P.N.A.S. 92, 7839-7843 (1995)), das das vom
rapK-Gen bzw. einem Teil des rapM-Gens flankierte gesamte rapL-Gen umfaßt, in einen
mit Eco RI geschnittenen modifizierten pUC18-Vektor, bei dem die
Bam HI-Stelle im Polylinkerbereich entfernt wurde, kloniert. Bei
Basenpaar 42 des rapL-Gens (Nukleotid 95078 bis 94047 des rap-Clusters;
Länge:
1032 bp) wurde eine nur einmal vorkommende Bam HI-Stelle (beginnend
mit Nukleotid 95036 des rap-Clusters) gefunden. Das Plasmid pUC3Eco
RI wurde mit Bam HI verdaut, und seine kohäsiven Enden wurden durch Behandlung
mit E.coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt. Die ligierte Plasmid-DNA
wurde nochmals mit Bam HI verdaut und zur Transformation von E.coli
verwendet. Ampicillinresistente Transformanten wurden selektioniert
und ihre Plasmid-DNA mittels Restriktionsenzymanalyse auf den Verlust
der Bam HI-Stelle überprüft. Dies
wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die 3 kb große Insertion
wurde aus dem Plasmid mit Eco RI ausgeschnitten, und die kohäsiven Enden
wurden durch Behandlung mit E.coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment)
stumpfendig gemacht. Die stumpfendige Insertion wurde in den mit
Pvu II geschnittenen Phagenvektor KC515 unter Erhalt von ΦΔrapL kloniert.
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Protoplasten
von S. lividans J11326 wurden mit dem Phagenkonstrukt, wie von Hopwood
et al. (1985) beschrieben, transfiziert. Rekombinanter Phage wurde
mittels PCR-Analyse identifiziert. Die Infektion von S. hygroscopicus
NRRL 5491 mit ΦΔrapL wurde
gemäß Lomovskaya
et al. (Microbiology, 143, 875-883 (1997)) auf mit Glukose, MgSO4 und Ca (NO3) supplementierten
DNA- Platten durchgeführt. Lysogene
wurden durch Überschichten
der Platten mit 50 μg
ml–1 (Endkonzentration)
Viomycin 24 h nach der Infektion selektioniert. Stämme, in
denen ein zweites, den integrierten Phagen zerstörendes Rekombinationsereignis
stattgefunden hatte, wurden identifiziert, indem Viomycin-sensitive
Isolate nach drei Runden nichtselektiven Wachstums und Sporulation
auf SY-Platten selektioniert wurden. Die Insertion sowie der anschließende Verlust
des Phagen wurden mittels genomischen Southern-Hybridisierungen bestätigt.
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Fütterung mit Vorläufermolekülen und
Fermentation von S. hygroscopicus ΔRapL
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Die
Fütterung
von S. hygroscopicus ΔRapL
mit Vorläufermolekülen wurde
routinemäßig in 500-ml-Kolben,
die 100 ml „Tryptic
Soy Broth" mit 1,0%
Glukose, 100 mM MES pH 6,0, supplementiert mit dem entsprechenden
Pipecolinsäureanalog,
mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml durchgeführt. S. hygroscopicus ΔRapL wurde
ebenso in 2-l-Kolben, die 400 ml chemisch definierte Medien, wie
von Cheng et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 1096-1098, (1995))
beschrieben, enthielten, kultiviert. Zur Fermentation im Großmaßstab wurden
10 μl Sporen
von S. hygroscopicus ΔRapL
zum Animpfen eines 100-ml-Kolbens, der 30 ml „Tryptic Soy Broth"-Medium enthielt,
verwendet. Der Kolben wurde auf einem Rundschüttler (300 UpM) 4 Tage bei 28°C inkubiert.
4 ml der ersten Animpfkultur wurden in einen 2-l-Kolben (zweite
Animpfkultur), der 400 ml des Mediums enthielt, überführt und auf einem Rundschüttler (300
UpM) 4 Tage bei 28°C
inkubiert. Die zweite Animpfkultur wurde in einen 20-l-Fermentor,
der 15 1 des Mediums enthielt, überführt. Das
Medium wurde aseptisch mit trans-4-Hydroxyprolin unter Erhalt einer Endkonzentration
von 1 mg/ml versetzt. Die Fermentation wurde 4 Tage bei 28°C bei einer
Schüttelgeschwindigkeit
von 500 UpM durchge führt.
Die Zellen wurden geerntet und über
Nacht mit dem doppelten Volumen an Methanol extrahiert.
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Reinigung
und Analyse von Rapamycin und seinen Derivaten
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Nach
3-4 Tagen Fermentation wurden die Myzele durch Filtration gesammelt
und mit zwei Volumen Methanol 1 h bei Raumtemperatur extrahiert.
Die Rohextrakte wurden mittels lc-ms unter Verwendung eines LCQ-Geräts von Finnigan
MAT (San Jose, CA) mit einer Hewlett-Packard-1100-HPLC analysiert. Die Fermentation
im Großmaßstab wurde
auf ähnliche
Weise aufgearbeitet. Der Rohextrakt wurde zur Trockne eingeengt und
danach mittels Flash-Chromatographie
(Merck Kieselgel 60, Nr. 9385) mit Aceton/Hexan 1:1 gereinigt. Die Rapamycine
enthaltenden Fraktionen wurden mit präparativer HPLC auf einer 250 × 20 mm
großen RP18-Säule (HPLC
Technology, Macclesfield, UK) unter Verwendung von Standardbedingungen
weiter gereinigt. Die 15-l-Fermentation ergab etwa 15 mg reines
Prolyl-Rapamycin sowie 3 mg 4-Hydroxyprolyl-26-demethoxy-rapamycin. Die NMR-Spektren
wurden auf einem DRX-500-Spektrometer von Bruker bestimmt.
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Biologische
Aktivität
von Rapamycinanalogen
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Rapamycin
induziert in der Zellinie 536, bei der es sich um eine durch Infektion
mit Epstein-Barr-Virus immortalisierte menschliche B-Lymphozytenlinie
handelt, einen spezifischen Zellcyclus-Arrest in G1. Die Wirksamkeit
(„Potency") der Analoge wurde
jeweils mit der von Rapamycin verglichen, wobei die 536-Zellen als Bioassay
verwendet wurden. Die 536-Zellen (erhalten von Human Genetic Mutant
Cell Repository, Camden, New Jersey, USA) wurden in Iscoves-Medium,
supplementiert mit 10% fötalem
Kälberserum,
kultiviert. Für
den Bioassay wurden 536-Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten ausgesät, und zwar
pro Loch jeweils 10 000 Zellen in 100 μl Wachstumsmedium. 1 mM-Stammlösungen der
Arznei stoffe in DMSO wurden hergestellt und weitere Verdünnungen
durchgeführt,
so daß eine
konstanten Endkonzentration von 0,1% DMSO im Wachstumsmedium erhalten
wurde. Kontrollkulturen wurden mit 0,1% DMSO in Wachstumsmedium
behandelt; die Versuchskulturen erhielten eine Endkonzentration
von 10–7 M,
108 M, 10–9 M
oder 10–10 M
Rapamycin oder Rapamycinanalog. Die Kulturen wurden jeweils in Dreifachbestimmung
angesetzt, und Replicatplatten wurden mit 1 μCi tritiertem Thymidin (Amersham
International, Spezifische Aktivität 70 Ci/mM) pro Loch 3 h markiert,
wobei entweder 0 h, 24 h oder 48 h mit den Arzneistoffen inkubiert
wurde. Zu den entsprechenden Zeitpunkten wurden die Kulturen auf
Glasfaserpapier geerntet, um die DNA nach Lyse mit Wasser einzufangen;
freie Nukleotide wurden weggewaschen. Die in die Filterscheibchen/gefangene
DNA eingebaute Radioaktivität
wurde unter Verwendung einer biologisch abbaubaren Szintillationsflüssigkeit
in einem Packard-Szintillationszähler
gezählt.
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Ergebnisse
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Charakterisierung
einer chromosomalen Leserasterverschiebungsmutation im rapL-Gen
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Zur
Bestätigung,
daß das
rapL-Genprodukt tatsächlich
an der Biosynthese von Rapamycin als Zufütterer von Vorläufermolekülen beteiligt
ist, wurde die chromosomale Leserasterverschiebungsmutante S. hygroscopicus ΔRapL wie
in Material und Methoden beschrieben isoliert. Diese Mutation wurde
mittels Southern-Blot-Hybridisierung
unter Verwendung des 3 kb großen
EcoRI-Fragments
(93956-96990) als Sonde für
mit Bgl II/Bam HI verdaute chromosomale DNA untersucht. Die Analyse
des S. hygroscopicus-Wildtyps zeigt die erwarteten Bam HI/Bg1 II-Fragmente
mit einer Länge
von 5,9 kb (die Nukleotide 89118-95036 repräsentierend) bzw. 2,7 kb (die
Nukleotide 95036-97710 repräsentierend)
nach der Hybridisierung. Bei einer ähnlichen Behandlung von chromosomaler
DNA von S. hygroscopicus ΔRapL
wurde lediglich ein 8,6 kb großes Bam
HI/Bg1 II-Fragment (die Nukleotide 89118-97710 repräsentierend)
nachgewiesen, was darauf hindeutet, daß die Bam HI-Stelle bei Position
95036 entfernt wurde. Dies wurde durch PCR-Analyse bestätigt. Die chromosomale DNA
wurde einer PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die
mit den Sequenzen von Nukleotid 93950 bis 93968 bzw. von 96990 bis
97010 identisch sind, unterzogen. Das erwartete 3 kb große DNA-Fragment
wurde von Wildtyp-DNA amplifiziert, und nach BamIII-Verdauung wurden
zwei Banden mit einer Größe von etwa
2 kb bzw. 1 kb nachgewiesen. Es stellte sich heraus, daß in Proben,
die chromosomale DNA von S. hygroscopicus ΔRapL enthielten, das amplifizierte
3 kb große
PCR-Produkt resistent gegenüber BamHI-Verdauung
war.
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Fütterung der chromosomalen Mutante
S. hygroscopicus ΔRapL
mit Vorläufermolekül
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Wachsende
Kulturen der Mutante S. hygroscopicus ΔRapL wurden mit unterschiedlichen
Aminosäurevorläufermolekülen (Tabelle
1) gefüttert.
Nach Beurteilung mittels LC-MS stellte sich heraus, daß nur die
drei Prolinderivate eingebaut waren. Das Haupt-Rapamycinderivat
in den Fermentationen außer
Prolyl-Rapamycin ist eine Verbindung mit m/z 908, die einem Hydroxy-Rapamycin,
dem eine Methoxygruppe fehlt, entsprechen könnte. Kleinere Mengen einer
Verbindung mit m/z 938 wurden ebenso nachgewiesen, die Hydroxy-Prolyl-Rapamycin
entsprechen würden.
Durch MS-Fragmentierungsexperimente wurde ebenso wie durch die charakteristischen
UV-Spektren eindeutig
gezeigt, daß es
sich bei diesen Verbindungen um Rapamycinderivate mit einem eingebauten
Hydroxyprolin handelt. Um genügend
Material für
die NMR-Charakterisierung zu erhalten, wurde Hydroxyprolin der Mutante
in großem
Maßstab
zugefüttert
(15 1 Brühe)
und 3 mg der Verbindung mit m/z 908 wie in Material und Methoden
beschrieben isoliert. Die NMR-Daten (Tabelle 2) zeigten die für das Hydroxyprolin-Spinsystem
erwarteten chemischen Verschiebungen und Kopplungen. Die veränderten
chemischen Verschiebungen für
die Positionen 26 und 27 sowie die unveränderten Verschiebungen für die Positionen
38-40 im Vergleich mit Rapamycin bewiesen, daß die Methoxygruppe in Position
26 fehlt. Diese Ergebnisse wurden durch MS-Fragmentierungsdaten
(Tabelle 3) bestätigt.
Dies läßt sich
aus dem Verlust des C15-C26-Fragments schließen, was bei beiden neuen Rapamycinderivaten
zu einem Fragment mit m/z 644 führt.
Weiterhin ist der Verlust des C28-C42-Fragments (322 amu) bei beiden Verbindungen
ebenso wie bei Rapamycin sichtbar, was darauf hindeutet, daß in diesem
Teil der Moleküle
keine Modifikation vorliegt. Die Ionen bei m/z 807 bzw. 777, die
gleichbedeutend mit dem Verlust der Aminosäure (131 amu) sind, bestätigen das
Vorhandensein von OH-Prolin. Dies bedeutet, daß es sich bei der Verbindung
mit m/z 938 um 4-Hydroxyprolylrapamycin handelt.
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Herstellung von trans-3-Aza-bicyclo[3.1.0]hexan-2-carbonsäure-rapamycin
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Eine
2-L-Fermentation von S. hygroscopicus ΔRapL, der (+/–)-trans-3-Aza-bicyclo[3.1.0]hexan-2-carbonsäure (0,
5 mg ml–1)
zugefüttert
wurde, wurde 5 Tage in TSBGM-Medium
(Khaw et al., (1998) J. Bacteriol. 180, 809-814) angezogen. Die
Zellen wurden durch Filtration gesammelt und über Nacht bei 4°C mit 1 1
Methanol extrahiert. HPLC-ESIMS-Analyse (High Pressure Liquid Chromatograph-Electrospray Ionization
Mass Spectrometry Analysis des Methanolrohextrakts wurde auf dieser
Stufe unter Verwendung eines mit einem Finnigan-Mat-LCQ-Massenspektrometer
verbundenen Hewlett-Packard-1100-LC durchgeführt. Trans-3-Aza-bicyclo[3.1.0]hexan-2-carbonsäurerapamycin
wurde in der Fermentationsbrühe
nachgewiesen.
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Die
Methanolextrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck auf
konzentriert. Der wäßrige Rückstand
wurde mit 500 ml destilliertem Wasser verdünnt und dreimal mit 500 ml
destilliertem Essigsäureethylester
extrahiert. Die vereinigten Essigsäureethylesterextrakte wurden
mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt.
Der erhaltene gelbe Rückstand
wurde mittels Flash-Säulenchromatographie
an einer 150 mm × 30
mm (Durchmesser) großen
Kieselgelsäule
[Merck 60], die mit einem Gemisch aus Aceton/Hexan (1:1, v/v) isokratisch
eluiert wurde, gereinigt.
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Die
Fraktionen wurden mittels Elektrospray-Massenspektrometrie analysiert. Zur
Bestimmung der Struktur des neuen Rapamycins in den Fraktionen von
der Flash-Siliziumdioxidsäule
wurden MS-MS und Msn verwendet.
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Die
trans-3-Aza-bicyclo[3.1.0]hexan-2-carbonsäurerapamycin enthaltenen Fraktionen
wurden weiter mittels präparativer
Reversed-Phase-HPLC an einer 250 × 20 mm (Durchmesser) großen Prodigy-ODS3-Säule (Phenomenex)
unter Verwendung einer mit Acetonitril/Wasser (70:30, v/v) beginnenden
und über
einen Zeitraum von 25 Minuten linear auf 100% Acetonitril ansteigenden
Gradientenelution gereinigt. Die 2-l-Fermentation ergab etwa 4 mg
reines trans-3-Aza-bicyclo[3.1.0]hexan-2-carbonsäurerapamycin.
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Hochauflösende MS
von trans-3-Aza-bicyclo[3.1.0]hexan-2-carbonsäure-rapamycin auf einem BioApex-FTICR-Massenspektrometer
von Bruker mit Elektrospray-Ionisierung
ergab ein Natrium-Molekülion-Addukt
bei m/z 934, 52776, wodurch C51H77NO13 als Molekülformel
bestätigt
wurde.
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Biologische
Aktivität
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Die
Dosiswirkung auf die menschlichen Lymphoblastoidzellinien 536 wurde
gemessen. In dem in 3 gezeigten Experiment zeigt
der cpm-Mittelwert des in die unbehandelten Kontrollen eingebauten
radioaktiv markierten Thymidins, daß eine 0-3stündige Inkubation
mit Arzneistoff, und zwar mit bis zu 100 nM Rapamycin, Prolylrapamycin
oder 4-Hydroxy-prolyl-26-demethoxyrapamycin, keine erkennbare Wirkung
auf die DNA-Synthese hatte. Dies läßt darauf schließen, daß keine
der Verbindungen toxisch für
die Zellinie 536 war. Nach 24 und 48 Stunden (4)
zeigten die 536-Zellen eine konzentrationsabhängige Hemmung der DNA-Synthese
mit einer ID 50% von 1 nM für
Rapamycin bzw. 3 nM für
Prolylrapamycin. 4-Hydroxy-prolyl-26-demethoxyrapamycin wies ebenso
eine Hemmwirkung auf, die jedoch bei 100 nM unterhalb von 50% lag.
Frühere
Experimente zeigten, daß Rapamycin
ein starker Inhibitor der G1-Progression in der Zellinie 536 ist
(Metcalfe et al., Oncogene 15, 1635-1642 (1997)). Die vorliegenden
Experimente lassen dies auch für
die Rapamycinanalogen vermuten, da zum Zeitpunkt 3 h keine signifikante
Wirkung festgestellt wurde, jedoch eine Hemmung beobachtet wurde,
sobald die Zellpopulation Zeit hatte, einen vollständigen Zellcyclus
zu durchlaufen (24 h) und den Arzneistoffarrestpunkt zu erreichen.
