DE69909462T2 - Mikrofabrizierte vorrichtung für analyse von zellen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Zellwachstum und auf zellenbasierte Untersuchungen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine mittels Mikrotechnik hergestellte Vorrichtung zum Ausführen des Zellwachstums und zellenbasierter Untersuchungen und auf Verfahren zur Durchführung dieser Untersuchungen.
  • Der momentane Schwerpunkt bei Prüfungsanwendungen mit hohem Durchsatz zur Prüfung erhöhter Anzahlen von Verbindungen wird durch die zwei Technologien der Kombinationschemie und der Genomik vorangebracht, um neue potenzielle Arzneimittelziele und neue Arzneimittelanwärter als potenzielle therapeutische Verbindungen herzustellen. Der primäre Prüfungsprozess wird durch die Entwicklung von Prüfungsuntersuchungsprozessen mit hohem Durchsatz und durch die Untersuchungsminiaturisierung unter Verwendung des Mikrotiter-Bohrungsplattenformats mit 384, 864, 1536 oder mehr miniaturisierten Bohrungen behandelt. Miniaturisierte Untersuchungen können Durchsatzniveaus von mehr als 100.000 Tests/Tag in der Primärprüfung ermöglichen. Bei diesem Durchsatzniveau könnte erwartet werden, dass eine Primärprüfung 100–1000 "Treffer" pro Tag liefert. Es wird gefordert, dass jedes dieser mutmaßlichen Arzneimittel einer weiter verfeinerten Prüfung und weiter verfeinerten Tests in einer Vielzahl von Untersuchungen ausgesetzt wird, um die biologische Verträglichkeit der Verbindung zu untersuchen. Diese Untersuchungen umfassen die biologische Verfügbarkeit, den Stoffwechsel und die Toxikologie und werden vorrangig unter Verwendung gezüchteter Zelllinien ausgeführt. Im Vergleich zu den Untersuchungen, die in dem Primärprüfungsprozess verwendet werden, besitzen die Sekundärprüfungsuntersuchungen ein wesentliches höheres Niveau an Komplexität und strengere Anforderungen sowohl hinsichtlich der Mechanik der Untersuchung als auch der erzeugten Informationen. Im Gebiet besteht ein Bedarf an Sekundärprüfungs-Untersuchungsmethodiken, die sowohl die steigende Rate mutmaßlicher Arzneimittelvorlauferzeugung als auch die Erzeugung biologischer Daten, die den Arzneimittelanwärter betreffen, behandeln können. Außerdem kann die Entwicklung von Untersuchungen, die einen höheren Informationsinhalt liefern, potenziell das Niveau der Kennzeichnung eines Vorlaufarzneimittels während der Prüfungsphase der Arzneimittelentwicklung erhöhen.
  • Mittels Mikrotechnik hergestellte Vorrichtungen, die zur Verwendung in der miniaturisierten biologischen Analyse geeignet sind, sind zuvor beschrieben worden. Beispielsweise offenbart WO 96/15450 eine Vorrichtung, die eine Ätzglasstruktur mit einer Zusammenstellung von Kammern umfasst, die durch einen Mikrokanal verbunden und durch eine Glasdeckplatte abgeschlossen sind. Von Wilding u. a. sind beispielsweise in WO 93/22058 Vorrichtungen beschrieben worden, die eine Vorrichtung mit mittleren Abmessungen zur Verstärkung von DNA durch PCR offenbart, wobei die Vorrichtung eine Anzahl von Kammern enthält, die durch einen Kanal verbunden sind. WO 93/22055 und WO 93 22053 beziehen sich auf Vorrichtungen zur Analyse einer zellenhaltigen Fluidprobe, die ein Flusssystem mit mittleren Abmessungen mit einer Einlassöffnung zur Erfassung und/oder Lyse von Zellen in biologischen Fluiden umfassen oder die einen Bindungspartner zur spezifischen Bindung einer Messprobe enthalten, die eine Intrazellularkomponente in einer Zelle in einer Probe oder eine Zellenpopulation in einer Probe sein kann.
  • Die obigen Vorrichtungen betreffen die Messung oder Erfassung von Zellen oder Zellenmessproben in Zellen, die unmittelbar vor der Analyse in die Vorrichtung eingeführt wurden. Sie werden weder zur Verwendung bei der Zellzüchtung oder beim Zellwachstum noch zur Verwendung bei der Untersuchung von Zellenreaktionen auf Agenzien in der Prüfung beschrieben. Außerdem beschreiben sie weder die Verwendung anhaftender gezüchteter Zellen noch lassen sie diese zu. Ähnliche Lehren sind ebenfalls zu finden in US 5.637.469, in US 5.593.838 und in WO 97/21090. US 5.637.469 schlägt in allgemeinen Worten die Überwachung der Zellzüchtung in Systemen mit mittleren Abmessungen und die Überwachung der Sperrung des Flusses als eine Angabe der Züchtung eines unspezifizierten Organismus in einer Struktur mit mittleren Abmessungen, die mit einem Züchtungsmedium und mit einer Probe (Beispiel 7) gefüllt und abgedichtet worden ist, vor.
  • WO 9614933 beschreibt Vorrichtungen mit mittleren Abmessungen (a) zur Kennzeichnung der Motilität von Zellen, primär Spermazellen, d. h. Zellen, die sich ohne die Notwendigkeit von Anhaftungsmitteln bewegen, (b) zum Trennen und Sammeln der interessierenden Motilitätszellen und (c) zur Invitro-Befruchtung.
  • FR 2657879 beschreibt eine Vorrichtung mit großen Abmessungen zur Zellzüchtung.
  • US 4.018.652 beschreibt eine Vorrichtung mit großen Abmessungen zur Bestimmung der Konzentration von Mikroorganismen.
  • Es gibt einen Bedarf an einer Vorrichtung, die eine Umgebung schaffen kann, die das Langzeitüberleben gezüchteter Zellen unterstützt und die mit Mitteln gekoppelt ist, die die in der Vorrichtung gezüchteten Zellen zur sekundären Arzneimittelprüfung oder zu anderen Untersuchungen verwenden.
  • In einem Aspekt schafft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung mit:
    • a) einer Grundplatte, die eine Vielzahl von Mikrokanalelementen trägt, von denen jedes eine Zellwachstumskammer, einen Einlasskanal zum Zuführen einer Flüssigkeitsprobe in diese und einen Auslasskanal zum Entfernen der Flüssigkeitsprobe aus dieser umfasst,
    • b) einer Deckplatte, die über der Grundplatte positioniert ist, und sich über die Elemente erstreckt, um die Kammern und Verbindungskanäle festzulegen, die Deckplatte ist mit Löchern versehen, um einen Zugang zu den Kanälen vorzusehen,
    • c) einer Suspension von zu züchtenden Zellen, und
    • d) Mitteln, die in den Zellwachstumskammern für Zellenanhaftung und Zellwachstum aufgenommen sind, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Komponenten der Vorrichtung aus einem Film oder einer Membran aufgebaut ist, sodass die eine oder mehreren Komponenten soweit gasdurchlässig ist, dass CO2 gepufferte Medien in der Zellwachstumskammer benutzt werden können und/oder soweit, dass Sauerstoff dadurch hindurch zu den Zellen für deren Stoffwechsel während des Wachstums treten kann.
  • In einem zweiten Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Wirkung einer Testsubstanz auf eine zellulare Aktivität oder physikalische Parameter unter Benutzung einer oben definierten Vorrichtung, mit:
    • a) Vorsehen einer oder mehrerer Proben von Testsubstanzen, deren Wirkung auf die Zellen unter solchen Bedingungen zu messen ist, dass die Zellen den Substanzen ausgesetzt sind, und
    • b) Bestimmung der Wirkung der Testsubstanzen auf die Zellen mittels optischer Erfassung.
  • Vorzugsweise umfasst das Verfahren zum Bestimmen der Wirkung einer Testsubstanz den Schritt des Züchtens von Zellen anhaftend an einer Oberfläche in der Vorrichtung vor der Einführung der Testsubstanzen. Vorzugsweise wird der folgende Schritt geschaffen, in dem: c) ein oder mehrere Untersuchungsreagenzien geliefert werden und die Reagenzien auf eine oder mehrere Reaktionskammern in der Vorrichtung verteilt werden.
  • In einem weiteren Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren zum Messen einer zellularen Messprobe unter Benutzung der oben definierten Vorrichtung, mit
    • a) Wachsenlassen der Zellen,
    • b) Liefern eines oder mehrerer Untersuchungsreagenzien und Verteilen der Reagenzien auf eine oder mehrere Kammern in der Vorrichtung,
    • c) Messen der zellularen Messprobe mit optischen Mitteln.
  • Damit die Erfindung besser verstanden werden kann, werden nun mehrere Ausführungsformen lediglich beispielhaft und mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung beschrieben, worin:
  • 1a eine graphische Darstellung in der Draufsicht eines einzelnen Mikrokanalelements der mittels Mikrotechnik hergestellten Vorrichtung zur Ausführung des Zellwachstums und zellenbasierter Untersuchungen ist;
  • 1b eine Schnittansicht einer mittels Mikrotechnik hergestellten Scheibe ist, die mehrere Untersuchungselemente zur Ausführung des Zellwachstums und zellenbasierter Untersuchungen gemäß der vorliegenden Erfindung enthält;
  • 2 eine alternative Konfiguration eines einzelnen Untersuchungselements der mittels Mikrotechnik hergestellten Vorrichtung zur Benutzung bei Zellen, die auf der Oberfläche von Mikroträgerkügelchen wachsen, darstellt; und
  • 3 eine weitere Konfiguration eines einzelnen Untersuchungselements der mittels Mikrotechnik hergestellten Vorrichtung darstellt, in der Mittel vorgesehen sind, um den Durchgang von Zellen in der Zellwachstumskammer zu verhindern oder aufzuhalten.
  • Wie in 1b gezeigt ist, umfasst die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eine drehbare Scheibe (18), die mittels Mikrotechnik hergestellt ist, um eine (nicht gezeigte) Probeneinführungsöffnung vorzusehen, die zur Mitte der Scheibe gelegen und mit einem ringförmigen Probenreservoir (9) verbunden ist, das seinerseits mit mehreren radial auf der Scheibe verteilten Mikrokanalelementen (6) verbunden ist, wobei jedes der Mikrokanalelemente eine Zellwachstumskammer enthält, einen Probeneinlasskanal und einen Auslasskanal zum Entfernen von Flüssigkeit daraus und eine Deckplatte, die auf der Scheibe positioniert ist, so dass sie geschlossene Kammern und Verbindungskanäle festlegt. Jedes Mikrokanalelement ist an einem Ende mit dem zentralen Probenreservoir (9) verbunden und an dem gegenüberliegenden Ende mit einem gemeinsamen Abfallkanal (10) verbunden.
  • Jedes der radial verteilten Mikrokanalelemente (6) der (in 1a) gezeigten mittels Mikrotechnik hergestellten Vorrichtung umfasst einen Probeneinlasskanal (1), der an seinem linken Ende mit dem Reservoir (9) verbunden ist, eine Zellwachstumskammer (2) zum Ausführen des Zellwachstums, die über einen Kanal (4) mit einer Untersuchungskammer (3) verbunden ist, und einen Auslasskanal (6), der an seinem rechten Ende mit dem Abfallkanal (10) verbunden ist.
  • In einem alternativen Format der vorliegenden Erfindung, wie es in 2 gezeigt ist, sind die Mikrokanalelemente (6) in der Weise modifiziert, dass sie die Verwendung der Vorrichtung mit Zellen ermöglichen, die auf der Oberfläche von Mikroträgerkügelchen (17) wachsen. Somit umfasst jedes Mikrokanalelement (6) einen Probeneinlasskanal (8), der an seinem linken Ende mit dem Probenreservoir (9) verbunden ist, eine Zellwachstumskammer (7), die über einen Kanal (16) mit einer Untersuchungskammer (11) verbunden ist, und einen Auslasskanal (12), der in den gemeinsamen Abfallkanal (10) führt.
  • Anhand von 3 kann die Zellwachstumskammer (2) in einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung mit erhöhten gegossenen oder geformten Strukturen versehen sein, die auf dem Basisabschnitt der Zellwachstumskammer angeordnet sind, um Pfosten (15) zu bilden, so dass sie eine Sperre für den Fluss oder Durchgang von Zellen bilden, die durch den Einlasskanal (1) in der Zellwachstumskammer (2) ankommen, während sie den Durchgang von Flüssigkeit ermöglichen. Die Abmessungen dieser Strukturen sind in der Weise gewählt, dass zwischen den Strukturen Zwischenräume geschaffen werden, die zu schmal sind, um den Durchgang von Zellen zu ermöglichen, die als eine Suspension in der Flüssigkeit geführt werden, die sich in der Vorrichtung bewegt, während sie aber ausreichend groß sind, um zu ermöglichen, dass Zellen, die auf der Oberfläche der Zellwachstumskammer (14) wachsen, durch Extension der Zellenprozesse zwischen der Sperre und der nachfolgenden Zytokinese durch die Sperre wandern. Geeignete Abmessungen für die Zwischenräume zwischen den in den Zellwachstumskammern ausgebildeten Pfosten (15) liegen je nach dem Zelltyp und der Zellengröße, die zur Erfassung ausgewählt sind, zwischen 5 und 50 μm.
  • Vorzugsweise enthält jedes in 3 gezeigte Mikrokanalelement (6) außerdem eine oder mehrere Untersuchungskammern zur Ausführung von Untersuchungen, die Zellenbestandteile umfassen, wobei die Untersuchungskammern zwischen der Zellwachstumskammer (2) und dem Auslasskanal (5) in Reihe verbunden sind.
  • Geeignet umfasst die Scheibe (18) eine ein- oder zweiteilige gegossene oder geformte Konstruktion, wobei sie mittels getrennter Formteile, die miteinander verbunden sind, um eine geschlossene Struktur mit Öffnungen an definierten Stellen zu schaffen, um das Beschicken der Vorrichtung mit Flüssigkeiten und das Entfernen von Abfallflüssigkeiten zu ermöglichen, aus einem optional durchsichtigen Kunststoff- oder Polymermaterial gebildet. In der einfachsten Form ist die Vorrichtung aus zwei komplementären Teilen hergestellt, von denen eines oder jedes geformte oder gegossene Strukturen trägt, die, wenn sie aneinander befestigt sind, eine Reihe miteinander verbundener Mikrokanalelemente in dem Körper einer festen Scheibe bilden. Alternativ können die Mikrokanalelemente mittels Mikro-Materialbearbeitungsverfahren geformt sein, in denen die Mikrokanäle und -kammern, die die Mikrokanalelemente bilden, in der Oberfläche einer Scheibe mittels Mikromaterialbearbeitung hergestellt sein, während an der Oberfläche eine Deckplatte, z. B. ein Kunststofffilm, angehaftet ist, der die Kanäle und Kammern umschließt.
  • Um gezüchtete Zellen mit Mitteln zum Erhalten von Sauerstoff für den Stoffwechsel zu versorgen und um die Verwendung von CO2-gepufferten Medien zu ermöglichen, sind eine oder mehrere Komponenten der Vorrichtung aus einem gasdurchlässigen Film oder aus einer gasdurchlässigen Membran aufgebaut. Geeignet ist der gasdurchlässige Film oder die gasdurchlässige Membran aus Silikonpolymeren wie etwa aus Polydimethylsiloxan oder aus Polyurethan, Polytetrafluorethylen oder aus anderen gasdurchlässigen Kunststoffmaterialien gebildet. Außerdem sind vorzugsweise (nicht gezeigte) Mittel zum Abdichten der Öffnungen in der geschlossenen Struktur vorgesehen, die die Verdampfung der Flüssigkeit während des Gebrauchs verhindern, wobei diese Mittel die Öffnungen abdichten, ohne den Gasaustausch mit dem Zellwachstumsmedium zu stören. Die Abdichtung kann unter Verwendung einer weiteren Schicht aus einem gasdurchlässigen Material über der gesamten Vorrichtung oder unter Verwendung eines undurchlässigen Materials, das lokal nur auf die Öffnungen aufgetragen ist, während der Rest des gasdurchlässigen Materials gegenüber der lokalen Atmosphäre freiliegt, ausgeführt werden.
  • Geeignete Kunststoff- oder Polymermaterialien zum Bilden der Zellwachstumskammer und der Mikrokanäle werden vorzugsweise in der Weise ausgewählt, dass sie wasserabstoßende Eigenschaften besitzen, wobei die Oberfläche des Kunststoffs oder des Polymers außerdem selektiv mit chemischen oder physikalischen Mitteln modifiziert sein kann, um die Oberflächeneigenschaften zu ändern, um ihr eine gewünschte Eigenschaft, z. B. die Verträglichkeit mit dem Zellwachstum, mit der Zellenanhaftung und mit der Anhaftung von Biomolekülen durch kovalente oder nicht kovalente Mittel, zu verleihen. Bevorzugte Kunststoffe sind aus Polystyrol und Polycarbonat ausgewählt.
  • Alternativ können die Zellwachstumskammer und die Mikrokanäle aus Kunststoff- oder Polymermaterialien aufgebaut sein, die in der Weise ausgewählt sind, dass sie wasseranziehende Eigenschaften besitzen. Außerdem kann die Oberfläche des Kunststoffs oder des Polymers selektiv mit chemischen oder physikalischen Mitteln modifiziert sein, um die Oberflächeneigenschaften in der Weise zu ändern, dass lokalisierte Gebiete der Wasserabstoßung in den Kammern und/oder in den Mikrokanälen erzeugt werden, um eine gewünschte Eigenschaft zu verleihen. Mit diesen Mitteln können z. B. wasserabstoßende Sperren oder Ventile vorgesehen sein, um den Flüssigkeitsfluss in der Vorrichtung zu steuern. Bevorzugte Kunststoffe sind aus Polymeren mit einer geladenen Oberfläche, geeignet chemisch oder mittels Ionenplasma behandeltem Polystyrol, Polycarbonat oder anderen starren durchsichtigen Polymeren ausgewählt.
  • Die Mikrokanalelemente (6) sind radial um die Scheibe (18) verteilt und mit einer gemeinsamen Mittelöffnung verbunden. Die Kanäle 1, 4, 5, 8, 12 und 16 besitzen eine Abmessung, die mit der Bewegung von Zellen entlang der Kanäle verträglich ist. Die Kanäle und Kammern können geeignet irgendeine Querschnittsform wie etwa quadratisch, rechteckig, kreisförmig, trapezförmig und dreieckig besitzen. Die Zellwachstumskammer (2) ist geeignet so bemessen, dass sie eine Bodenfläche zwischen 100 μm2 und 1.000.000 μm2, bevorzugt zwischen 1000 μm2 und 1.000.000 μm2 und am bevorzugtesten zwischen 10.000 μm2 und 1.000.000 μm2, ergibt. Die Kunststoff- oder Polymeroberfläche der Zellwachstumskammer kann selektiv geeignet behandelt oder modifiziert sein, um die Zellenanhaftung und/oder das Zellwachstum zu ermöglichen. Vorzugsweise umfasst die Behandlung das Belichten mit einem intensiven UV-Licht, um die Polymeroberfläche zu modifizieren, oder alternativ die Verwendung einer Hochspannungs-Plasmaentladung unter Verwendung bekannter Techniken (siehe Amstein, C. F., und Hartmann, P. A., J. Clin. Microbiol., 2, 1, 46–54 (1975)), um eine negativ geladene Oberfläche zu erzeugen, die für Zellwachstums- und Zellenanhaftungs- und (bei Bedarf) für Untersuchungszwecke geeignet ist. Die Zellenanhaftung kann durch den Auftrag zusätzlicher Beschichtungen auf die Oberfläche der Zellwachstumskammer, z. B. Polylysin, Collagen, Fibronectin, weiter verbessert sein.
  • Wie bereits erwähnt wurde, ist in dem bevorzugten Aspekt der Erfindung ferner jedes der Mikrokanalelemente (6) mit einer Untersuchungskammer (3) versehen, die in Serie zwischen der Zellwachstumskammer (2) und dem Auslasskanal (5) gelegen ist, um Untersuchungen auszuführen, die Zellenbestandteile betreffen. Die Untersuchungskammer ist proportional zum Volumen der Zellwachstumskammer (2) bemessen, um die Sammlung und/oder Erfassung löslicher Messproben zu ermöglichen, die von den gezüchteten Zellen in der Untersuchung abstammen können.
  • Das Volumen der Untersuchungskammer (3) liegt geeignet zwischen dem doppelten und einem Zehntel des Volumens der Zellwachstumskammer (2). Vorteilhaft ist der Kanal (4), der die Zellwachstumskammer und die Untersuchungskammer verbindet, dadurch gekennzeichnet, dass er wasserabstoßende Wände und eine Querschnittsfläche, die kleiner als der Kanal (1) stromaufwärts der Zellwachstumskammer ist besitzt. Geeignet besitzt der Kanal (4) eine Querschnittsfläche zwischen 0,99 und 0,01 mal der Querschnittsfläche des Einlasskanals (1). Geeignet ist der Auslasskanal (5) dadurch gekennzeichnet, dass er wasserabstoßende Wände und eine Querschnittsfläche zwischen 0,99 und 0,01 mal der Querschnittsfläche des Kanals (4) besitzt. Auf diese Weise kann der Flüssigkeitsfluss in den Mikrokanalelementen durch Anwendung einer definierten Zentrifugalkraft gesteuert werden, die bewirkt, dass die Flüssigkeit in einem Kanal mit einer definierten Querschnittsfläche fließt, wobei die gleiche Kraft nicht ausreichend ist, um zu bewirken, dass die Flüssigkeit in weiter verbundenen Kanälen mit kleinerer Querschnittsfläche fließt, wobei dies die Wirkung besitzt, den Flüssigkeitsfluss an einer gewünschten Stelle in dem Mikrokanalelement anzuhalten.
  • In einem alternativen Mittel zum Steuern des Flüssigkeitsflusses sind der Kanal (1) und der Kanal (4) mit der gleichen Querschnittsfläche aufgebaut, wobei aber die Oberfläche jedes der Kanäle selektiv mit chemischen oder physikalischen Mitteln modifiziert sein kann, um diesem Kanal einen anderen Grad an Wasserabstoßung zu verleihen. Beispielsweise kann der Kanal (4) stromabwärts der Zellwachstumskammer (2) in der Weise behandelt worden sein, dass er eine höhere Wasserabstoßung als der Kanal (1) stromaufwärts der Zellwachstumskammer besitzt. Mit diesem Mittel ist die Anwendung einer definierten Kraft auf die Flüssigkeit im Kanal (1), die ausreichend ist, um zu bewirken, dass sich die Flüssigkeit entlang dieses Kanals bewegt, nicht ausreichend, um zu bewirken, dass die Flüssigkeit in den zweiten Kanal (4) mit höherer Wasserabstoßung eintritt, was die Wirkung besitzt, den Flüssigkeitsfluss an einer gewünschten Stelle in dem Mikrokanalelement anzuhalten. Geeignete Mittel zum selektiven Modifizieren der Wasserabstoßung der Oberfläche der Kanäle umfassen das Aussetzen definierter Bereiche ionisierender oder elektromagnetischer Strahlung oder einem Ionenplasma durch eine Maske oder den Auftrag eines wasserabstoßenden Materials oder einer wasserabstoßenden Tinte mittels Siebdruck oder mit anderen Mitteln des lokalisierten Auftrags.
  • Die Mittel zum Steuern des Flüssigkeitsflusses in der Vorrichtung, wie sie oben beschrieben wurden, können allein oder bei Bedarf zusammen verwendet werden, um die gewünschte Steuerung des Flüssigkeitsflusses in den verbundenen Kammern und Kanälen in dem Mikrokanalelement zu verleihen. Wenn die Verfahren zusammen verwendet werden, können sie aufeinander folgend verwendet werden, wobei beispielsweise auf eine Änderung der Querschnittsfläche eine Änderung der Wasserabstoßung folgt, so dass zwei aufeinander folgende Punkte der Flüssigkeitsflusssteuerung gebildet werden. Alternativ können die Verfahren gleichzeitig verwendet werden, wobei eine Änderung der Querschnittsfläche eines Kanals von einer Änderung der Wasserabstoßung dieses Kanals begleitet ist, wobei die Kombination dazu verwendet wird, einen Grad der Steuerung des Flüssigkeitsflusses zu verleihen, der unter Verwendung eines einzelnen Mittels nicht erreicht werden kann.
  • Die innere Oberfläche der Untersuchungskammer kann mit einem oder mit mehreren Liganden beschichtet sein, die eine interessierende Messprobe spezifisch binden können, indem sie den Liganden kovalent oder nicht kovalent verbinden. Beispiele für Liganden, die für den Zweck geeignet sind, umfassen: Biotin, Streptavidin, Protein A, Antikörper, Lectine, Hormonrezeptoren, Nukleinsäuresonden und DNS-Bindungsproteine und dergleichen.
  • Die Vorrichtung und das Verfahren können für das Wachstum von Zellen und für die Erfassung und Messung der zellularen Aktivität, der Zellenparameter und biochemischer Prozesse, beispielsweise des Zellstoffwechsels, der Lebensfähigkeit der Zellen, der Reportergen-Expression unter Verwendung nicht invasiver Techniken, d. h. von Techniken, die die Integrität oder Lebensfähigkeit der Zellen nicht gefährden, verwendet werden. Alternativ kann die Vorrichtung bei der Erfassung und Messung von von Zellen abstammenden Produkten, die von den Zellen freigesetzt oder auf andere Weise abgesondert worden sind, wie etwa Peptidhormonen, zweiten Boten usw., verwendet werden. Unter Verwendung der in 3 gezeigten Vorrichtung ermöglicht die Vorrichtung Untersuchungen der Zellwanderung in Reaktion auf chemische oder physikalische Stimuli, beispielsweise die Chemotaxis, in der eine chemoattraktive Substanz auf einer Seite einer Sperre angeordnet wird, während beobachtet wird, wie Zellen, die auf der gegenüberliegenden Seite der Sperre angeordnet sind, die Sperre bei der Bewegung zu dem Chemoattraktor durchdringen.
  • Die Erfindung kann mit irgendeinem Zelltyp verwendet werden, der auf Standardgewebekultur-Plastikware gezüchtet werden kann. Diese Zelltypen umfassen alle normalen und umgewandelten Zellen, die von irgendeiner erkannten Quelle in Bezug auf die Arte (z. B. Mensch, Nagetier, Affe), auf die Gewebequelle (z. B. Gehirn, Leber, Lunge, Herz, Niere, Haut, Muskel) und auf den Zelltyp (z. B. epidermal, endothelial) abgeleitet werden können. Außerdem können unter Verwendung der Erfindung auch Zellen gezüchtet werden, die mit rekombinanten Genen transfiziert worden sind. Für die Züchtung verschiedener Zelltypen sind eingeführte Protokolle verfügbar. (Siehe z. B. Freshney, R. I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, Alan R. Liss Inc., 1987). Diese Protokolle können die Verwendung von Spezialbeschichtungen und selektiven Medien erfordern, um das Zellwachstum und den Ausdruck von Spezialzellenfunktionen zu ermöglichen. Keines dieser Protokolle ist von der Verwendung mit der Vorrichtung dieser Erfindung ausgeschlossen.
  • Das Ausmaß der Vorrichtung ist in gewissem Umfang durch seinen Gebrauch vorgeschrieben, d. h., die Vorrichtung besitzt eine Größe, die mit der Verwendung eukaryotischer Zellen verträglich ist. Dies setzt einen unteren Grenzwert an irgendeinen Kanal, der so beschaffen ist, dass er die Bewegung von Zellen zulässt, und bestimmt die Größe einer Zelleneinkapselung oder von Wachstumsbereichen gemäß der Anzahl der in jeder Untersuchung vorhandenen Zellen. Eine durchschnittliche Säugetierzelle, die als eine anhaftende Kultur wächst, besitzt eine Fläche von 300 μm2; nicht anhaftende Zellen und nicht nicht befestigte anhaftende Zellen besitzen einen Kugeldurchmesser von ~10 μm. Folglich besitzen die Kanäle für die Bewegung von Zellen in der Vorrichtung wahrscheinlich Durchmesser in der Größenordnung von 20–30 μm oder mehr. Die Größen der Zellenhaltebereiche hängen von der Anzahl der Zellen ab, die erforderlich sind, um eine Untersuchung auszuführen (wobei die Anzahl sowohl durch die Empfindlichkeit als auch durch statistische Anforderungen bestimmt ist). Es ist beabsichtigt, dass eine typische Untersuchung wenigstens 500–1000 Zellen erfordert, was für anhaftende Zellen Strukturen von 150.000–300.000 μm2, d. h. kreisförmige 'Bohrungen' mit einem Durchmesser von 400–600 μm, erfordert.
  • Die Konfiguration der Mikrokanäle ist in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in der Weise gewählt, dass sie die gleichzeitige Ansiedlung in der Zellwachstumskammer durch Zuführen einer Suspension von Zellen in einem fluiden Medium in das Probenreservoir mittels einer Probeneinlassöffnung, gefolgt von einer Drehung der Scheibe (18) mit geeigneten Mitteln mit einer Drehzahl, die ausreichend ist, die Bewegung der Zellsuspension nach außen zum Umfang der Scheibe durch Zentrifugalkraft zu bewirken, ermöglicht. Die Bewegung der Flüssigkeit verteilt die Zellsuspension entlang jedes der Einlassmikrokanäle (1, 8) in die Zellwachstumskammern (2, 7). Die Drehzahl der Scheibe wird in der Weise gewählt, dass sie ausreichend Zentrifugalkraft erzeugt, die ermöglicht, dass die Flüssigkeit fließt, um die Zellwachstumskammer (2, 7) zu füllen, während die Kraft nicht ausreicht, dass die Flüssigkeit in den beschränkten Kanal (4, 16) mit kleinerem Durchmesser an der gegenüberliegenden Seite der Zellwachstumskammer eintritt.
  • Nachdem die Drehung angehalten worden ist, können sich die Zellen in der Suspension unter der Schwerkraft auf dem Boden der Zellwachstumskammer (2, 7) absetzen und, falls sie vorhanden ist, an der behandelten Oberfläche anhaften. Zellen, die in dem Kanal verbleiben, können sich nicht an der unbehandelten wasserabstoßenden Oberfläche anhaften und bleiben in der Suspension. Somit kann die Vorrichtung nach einer geeigneten Zeitdauer, die so gewählt wird, dass eine Zellenanhaftung stattfinden kann, mit höherer Drehzahl als zuvor gedreht werden, so dass bewirkt wird, dass sich die gesamte Flüssigkeit und die nicht anhaftenden Zellen zum Umfang der Scheibe in den Abfallkanal (10) bewegen, der um den Rand der Scheibe angeordnet ist. Nachdem die Kanäle von nicht anhaftenden Zellen befreit wurden, wird die Drehung auf die gleiche Drehzahl verlangsamt, die anfangs zum Füllen der Mikrokanalelemente verwendet wurde, wobei dem Probenreservoir frische Zellkulturmedien zugeführt werden. Durch erneute Drehung der Scheibe fließen die Zellkulturmedien wie zuvor beschrieben unter der Zentrifugalkraft, um die Mikrokanäle und die Zellwachstumskanäle zu füllen. Diese Aktion lässt die angehafteten Zellen, die auf der Oberfläche der Zellwachstumskammern angesiedelt sind, mit Frischkulturmedien bedeckt, die für das Zellwachstum und für zellenbasierte Untersuchungen geeignet sind.
  • In der Vorrichtung aus 2 schaffen die Kügelchen (17) in einem verhältnismäßig kleinen Flüssigkeitsvolumen einen großen Oberflächeninhalt zur Zellenanhaftung und zum Zellwachstum. In der hier beschriebenen Vorrichtung führen die Kügelchen (17) zwei Funktionen aus; zunächst schaffen sie eine Oberfläche für die Anhaftung und für das Wachstum der Zellen und beseitigen somit die Notwendigkeit zur Bereitstellung einer mit dem Zellwachstum verträglichen Oberfläche in der Scheibe, was es ermöglicht, einen breiteren Bereich von Materialien für die Konstruktion zu verwenden, während sie zweitens einen größeren physikalischen Träger für die Zellen bereitstellen, was es ermöglicht, die Kanäle in der Vorrichtung leicht in der Weise aufzubauen, dass sie den Zugang der Zellen verhindern. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst jedes Element eine Zellwachstumskammer (2, 7), eine Analysekammer (3, 11) und eine Abfallkammer (10), die radial um die Mitte der Scheibe angeordnet und mit einer gemeinsamen Öffnung in der Mitte der Scheibe verbunden sind.
  • Nach dem Hinzufügen der Zellproben zu der Vorrichtung, ihrer Anhaftung und dem nachfolgenden Zellwachstum können durch die Probeneinlassöffnung Reagenzien und Proben zur Untersuchung in das Probenreservoir (9) eingeführt werden. Die allen Mikrokanalelementen zuzuführenden Reagenzien können wie zuvor oben für die Ansiedlung mit Zellen beschrieben wurde, d. h. durch Zuführen einer Lösung, die Reagenzien enthält, in die Mittelöffnung und durch Drehen der Scheibe, um so die Verteilung des Reagens in alle Mikrokanäle, Zellwachstumskammern und Untersuchungskammern zu bewirken, eingeführt werden. Die Zuführung spezifischer Proben zu spezifischen Bohrungen kann durch das Pipettieren kleiner Flüssigkeitsvolumina als diskrete Tropfen in die Mittelbohrung, die direkt an die Öffnung des Einlasskanals angrenzt, der zu der Zellwachstumskammer führt, die die Probe aufnehmen soll, erreicht werden. Dies kann beispielsweise unter Verwendung einer (nicht gezeigten) piezoelektrischen Abfüllvorrichtung erreicht werden, durch die das Abfüllen von Flüssigkeitstropfen aus der Vorrichtung mit der Drehzahl der Scheibe (18) in der Weise synchronisiert wird, dass bei einer geeigneten Kombination der Abfülltropfenfrequenz und der Drehzahl der Scheibe bewirkt werden kann, dass einzelne Flüssigkeitstropfen auf die Oberfläche der Scheibe auftreffen, und dass dabei bewirkt werden kann, dass sie durch die Zentrifugalkraft in einen angrenzenden Einlasskanal (1, 8) transportiert werden und sich mit der in der Zellwachstumskammer (2, 7) vorhandenen Flüssigkeit mischen.
  • Alternativ können Flüssigkeiten als diskrete Tropfen auf die wasserabstoßende Oberfläche einer feststehenden Scheibe (18) pipettiert werden, wobei die Drehung der Scheibe verwendet werden kann, um diese Flüssigkeitstropfen in den richtigen Einlasskanal und so in die richtige Zellwachstumskammer zu bewegen. Mit diesen Mitteln können alle Reagenzien und Proben der Zellenkammer in der gewünschten Reihenfolge und in den gewünschten Anteilen zugeführt werden, um die Untersuchung auszuführen.
  • Wenn die Flüssigkeitsmanipulationen der Untersuchung ausgeführt worden sind, muss eine Erfassungsprozedur ausgeführt werden, um, typischerweise durch Messen des von einem Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder anderen Markierungspartner ausgesendeten Signals, das Ergebnis der Untersuchung zu messen. Die wie in 1b gezeigte Vorrichtung ist so konfiguriert, dass sie zwei Erfassungsmittel des Untersuchungssignals zulässt. Zunächst kann das Untersuchungssignal in der Zellwachstumskammer in-situ gemessen werden. Ein solches Signal wird durch die Messung des Produkts eines Reportergens in den Zellen, z. B. der Fluoreszenz von GFP, verkörpert.
  • Alternativ kann es wünschenswert sein, beispielsweise durch immunchemische oder andere spezifische Bindungsuntersuchungsverfahren in Abwesenheit von in der Vorrichtung gezüchteten Zellen, um eine Störung bei der Messung zu vermeiden, von den Zellen abstammende Produkte oder Messproben zu messen. In diesem Fall ist die Vorrichtung mit einer zweiten Kammer versehen, d. h., ist die Untersuchungskammer (3, 11) näher am Umfang der Scheibe angeordnet und mit der Zellwachstumskammer (2, 7) verbunden. Die Untersuchungskammer ist mit dem Umfangsabfallkanal (10) durch einen schmalen Kanal (5, 12) verbunden, der einen kleineren Durchmesser als derjenige (4, 16) besitzt, der die Untersuchungskammer mit der Zellwachstumskammer verbindet. Die Differenz der Durchmesser zwischen den Kammern ermöglicht, Flüssigkeit unter gesteuerten Drehungs- und Zentrifugalkraftbedingungen wie oben diskutiert aus der Zellwachstumskammer in die Untersuchungskammer zu bewegen. Beispielsweise wird durch diesen Prozess eine Messprobe aus der Zellwachstumskammer in die Untersuchungskammer bewegt, wo die Messprobe der Affinitätserfassung durch einen Liganden ausgesetzt wird, der an der Wand der Untersuchungskammer angehaftet ist. Somit schafft dieser Prozess ein Mittel, um eine von Zellen abstammende Messprobe, die von den Zellen abgegeben oder auf andere Weise abgesondert worden ist, von der Zellenumgebung wegzubewegen, die Messprobe mittels eines spezifischen Bindungspartners zum Binden der Messprobe in der Untersuchungskammer festzusetzen und nachfolgend das Hinzufügungen von Reagenzien und die Verarbeitung zuzulassen, um die Erfassung der Messprobe zu ermöglichen.
  • Optional kann wenigstens eine der Reagenzien zur Verwendung in einem Untersuchungsverfahren, das die Vorrichtung verwendet, durch eine kovalente oder nicht kovalente Anhaftung mit einer erfassbaren Markierung markiert werden. Geeignete erfassbare Markierungen können unter Fluoreszenz-Markierungen, Chemolumineszenz-Markierungen, Biolumineszenz-Markierungen, Enzym-Markierungen und radioaktiven Markierungen ausgewählt werden. Geeignete Fluoreszenz-Markierungen zum Kennzeichnen von Reagenzien gemäß dem Verfahren der Erfindung können aus den allgemeinen Kategorien der Fluoreszenzfarbstoffe ausgewählt werden, die Fluoreszeine, Rhodamine, Cyaninfarbstoffe, Cumarine sowie BODIPY-Gruppen von Fluoreszenzfarbstoffen umfassen, aber nicht auf sie beschränkt sind. Beispiele von mittels Biolumineszenz erfassbaren Markierungen sind in den Fluoreszenz-Reporterproteinen wie etwa in dem grünem Fluoreszenzprotein (GFP) und in Aequorin zu finden. Alternative Markierungen zur Erzeugung eines erfassbaren Signals können Fluoreszenzenergieübertragungsmarkierungen sein.
  • Wenn die Untersuchung abgeschlossen ist, kann die Messung des Signals mit Mitteln erreicht werden, die für das in der Untersuchung verwendete Markierungsmolekül oder für den in der Untersuchung verwendeten Markierungspartner geeignet ist, wobei sie typischerweise mit optischen Mitteln erreicht wird. Beispielsweise kann die von Zellen oder von einem mittels Fluoreszenz markierten Untersuchungsreagens ausgesendete Lumineszenz in einer mittels Mikrotechnik hergestellten Vorrichtung unter Verwendung einer Abbildungsvorrichtung, die eine CCD-Kamera enthält, oder unter Verwendung eines Fluorometers erfasst werden. Die Erfassung der ausgesendeten Fluoreszenz kann dort, wo die Scheibe vollständig aus einem durchsichtigen Material aufgebaut ist, durch den Körper der Scheibe (18) oder alternativ durch Fenster aus durchsichtigem Material, die in dem Körper der Scheibe hergestellt sind, erreicht werden.
  • Als eine Alternative zur nicht radioaktiven Erfassung kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit der radioaktiven Erfassung unter Verwendung der Scintillation-Proximity-Technik verwendet werden. Beispielsweise können in die Vorrichtung Kügelchen eingeführt werden, die einen Szintillator enthalten. Alternativ kann in der mittels Mikrotechnik hergestellten Vorrichtung der Erfindung in oder auf eine innere Oberfläche der Zellwachstumskammer (2, 7) und/oder der Untersuchungskammer (3, 11) eine Schicht integriert sein, die einen Szintillator enthält. Vorzugsweise ist das Gebiet der Vorrichtung, das die Szintillator-Kügelchen oder die Szintillator-Oberfläche enthält, optisch durchsichtig, um zu ermöglichen, dass das Material Licht mit einer gegebenen Wellenlänge mit optimaler Effizienz überträgt. Das Gebiet, das den Szintillator enthält, kann irgendein durchsichtiges Material, das den Szintillator enthält, z. B. ein Szintillatorglas auf der Grundlage von Verbindungen, die ein Lanthaniden-Metall enthalten, oder ein Kunststoffmaterial wie etwa Polystyrol oder Polyvinyltoluol, in das die Szintillator-Substanz integriert ist, enthalten.
  • Geeignete Szintillator-Substanzen können aromatische Kohlenwasserstoffe wie etwa p-Terphenyl, p-Quaterphenyl und ihre Derivate sowie Derivate von Oxazolen und 1,3,4-Oxadiazolen, beispielsweise 2-(4-t-butylphenyl)-5-(4-Biphenylyl)-1,3,4-oxadiazol und 2,5-Diphenyloxazol, enthalten. Ein Wellenlängenschieber wie etwa 1,4-bis(5-phenyl-2-oxazolyl)benzol oder 9,10-Diphenylanthrazen kann ebenfalls enthalten sein.
  • Auf der Oberfläche des Kügelchens oder der Szintillator-Schicht kann ein Bindungspartner wie etwa ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars festgesetzt werden, um sich spezifisch mit der Messprobe zu binden, die von den in dem Untersuchungsprozess verwendeten Zellen abstammen kann. Geeignete spezifische Bindungspaarmitglieder, mit denen die Erfindung nutzbar ist, umfassen Biotin, Streptavidin, Protein A, Antikörper, Lectine, Hormonrezeptoren, Nukleinsäuresonden, DNS-Bindungsproteine und dergleichen. Selbstverständlich kann jedes Mitglied des spezifischen Bindungspaars angehaftet und festgesetzt werden, um sich mit einem komplementären Mitglied des spezifischen Bindungspaars zu binden.
  • Typische Radioisotope, die zum Markieren des Untersuchungsreagens verwendet werden können, enthalten jene, die üblicherweise in der Biochemie verwendet werden, wie etwa [3H], [126I], [36S] und [33P], wobei aber die Verwendung anderer Isotope nicht ausgeschlossen ist. Die Erfassungsmethodiken, die auf der Scintillation Proximity beruhen, sind wohlbekannt (siehe z. B. US-Patent Nr. 4568649, Bertoglio-Matte, J.). Die Erfassung kann eine Anzahl von Modalitäten verwenden, die zu kombinieren sind, um zu ermöglichen, dass alle Untersuchungen gleichzeitig oder in schneller Folge gemessen werden. Alternativ kann ein geeignetes Abbildungsformat unter Verwendung der Vorrichtung geeignete Erfassungsmittel sowohl für radioaktive als auch für nicht radioaktive Untersuchungen schaffen.
  • In einigen Anwendungen sind einige Untersuchungsbereiche redundant; d. h., nicht alle Elemente der Vorrichtung werden jedes Mal verwendet. Es ist beabsichtigt, dass der Anwender entscheidet, welche Untersuchungstypen er ausführen muss, und daraufhin die richtigen Steuermittel auswählt, um den Flüssigkeitsfluss in der Vorrichtung zu lenken. Folglich sind diese Strukturen verträglich mit einem Bereich von Untersuchungsprozeduren und -protokollen, die verschiedene Komplexitäten der Fluidbewegung erfordern. Beispielsweise erfordert die Erfassung eines GFP-verbundenen Reportergens eine einfache Bohrungsstruktur, um die Messung der Fluoreszenz zu ermöglichen. Demgegenüber erfordert die Messung einer von Zellen abgeschiedenen Messprobe, beispielsweise die Messung eines Cytokins durch Immuntest oder die Messung von Zellen-mRNA nach der Lyse, eine kompliziertere Struktur, um die Zellen vor der Analyse der abgeschiedenen Messprobe von dieser Messprobe zu trennen. Die Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele erläutert.
  • Beispiel 1
  • Eine Stammkultur von HeLa-Zellen wurde in einem Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM), das mit 10% Kalbsserum und L-Glutamin ergänzt war, unter Verwendung von Standardgewebekulturbedingungen in einem Kunststoffkolben wachsengelassen. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet und die resultierende Suspension durch Zentrifugieren konzentriert, um eine Zellenkonzentration von 107 Zellen/ml zu erhalten. Proben der Zellensuspension (1 μl) wurden Öffnungen in der Oberfläche einer mittels Miktrotechnik hergestellten Struktur von dem in 1 gezeigten Typ, der durch Druckguss hergestellt wurde, mit Innenkanälen mit einer Tiefe von 50 μm und mit einer Breite von 100 μm zugeführt.
  • Die Zellsuspension wurde entlang der Einlasskanäle in der Scheibe in kreisförmige Zellwachstumskammern mit einer Tiefe von 50 μm und mit einem Durchmesser von 500 μm bewegt, und die Zellen wurden anhaften- und wachsengelassen. Nach der 48-stündigen Inkubation in einem Gewebekulturbrutschrank (37°C/95% relative Feuchtigkeit) wurden die Zellen auf Zellendichte, Morphologie und Lebensfähigkeit untersucht. Sichtuntersuchungen durch Phasenkontrastmikroskopie zeigten, dass Zellenpopulationen, die in Mikrostrukturen wachsen, die gleiche Dichte und Morphologie besitzen wie Kontrollkulturen, die aus dem gleichen Elternstamm wachsen und in Standardgewebekultur-Plastikware aufbewahrt werden. Nachfolgend wurden die Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Analysekoffers (LIVE/DEAD Viability Kit, Molecular Probes, Oregon, L-3224) auf Lebensfähigkeit getestet, indem Wachstumsmedium von den Zellen in der Vorrichtung gespült wurde, die Zellen mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) gewaschen und eine Lösung des Fluoreszenzuntersuchungsreagens in die Zellwachstumskammern eingeführt wurde. Eine nachfolgende Untersuchung durch Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass Zellen, die in Mikrostrukturen gewachsen sind, im Vergleich zu Kontrollzellen, die unter Standardgewebekulturbedingungen gewachsen sind, eine Zellenlebensfähigkeit von >95% aufwiesen.
  • Beispiel 2
  • Eine mittels Mikrotechnik hergestellte Kunststoffscheibe von dem in 1 gezeigten Typ, die durch Druckguss hergestellt wurde und die eine Anzahl radialer Innenkanäle mit einer Tiefe von 50 μm und mit einer Breite von 100 μm enthielt, wurde durch Belichten mit einer 500 W-UV-Lampe in einem Abstand von 20 cm 30 Minuten durch eine Metallmaske selektiv oberflächenmodifiziert, so dass das UV-Licht lediglich in durch die Maske definierten Gebieten auf die Oberfläche auftraf.
  • Eine Stammkultur von HeLa-Zellen wurde in einem Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM), das mit 10% Kalbsserum und L-Glutamin ergänzt war, in einem Kunststoffkolben unter Verwendung von Standardgewebekulturbedingungen wachsengelassen. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, und die resultierende Suspension wurde durch Zentrifugieren konzentriert, um eine Zellenkonzentration von 107 Zellen/ml zu erhalten. Proben der Zellensuspension (1 μl) wurden Öffnungen in der Oberfläche der Vorrichtung zugeführt und die Zellen durch Drehung um die Scheibenachse (30 Sekunden mit 1000 U/min) entlang der Kanäle bewegt. Nach der 18-stündigen Inkubation in einem Gewebekulturbrutschrank (37°C/95% relative Feuchte) wurden die Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie untersucht. Es wurde ermittelt, dass Zellen vorzugsweise in Gebieten der Scheibe wachsen, die zuvor mit UV-Licht belichtet wurden, während beobachtet wurde, dass Zellen in anderen Gebieten seltener sind und weniger gut anhaften. Daraufhin wurde die Scheibe 30 Sekunden mit 1000 U/min gedreht, und die Zellen wurden erneut untersucht. Nach dem Drehen wurde beobachtet, dass die Zellen in den UV-belichteten Bereichen an der Kunststoffoberfläche angehaftet geblieben sind und morphologisch völlig gleich den Kontrollzellen geblieben sind; im Gegensatz dazu wurden Zellen auf nicht belichteten Oberflächen durch die von der drehenden Scheibe erzeugte Zentrifugalkraft vollständig entfernt.
  • Beispiel 3
  • HeLa-Zellen, die wie oben beschrieben wachsengelassen und geerntet wurden, wurden in der Vorrichtung aus Beispiel 2 in Mikrokanäle eingeführt, die gegossene oder geformte Pfosten mit verschiedenen Abmessungen enthielten, die in den Kanälen verteilt waren, so dass sie als Sperren für die Zellbewegung in den Kanälen wirkten. Eine Suspension der Zellen wurde in die Kanäle eingeführt und die Struktur einer 18-stündigen Inkubation ausgesetzt, um zu ermöglichen, dass sich die Zellen absetzen und wachsen. Die nachfolgende Untersuchung offenbarte, dass in Kanälen, in denen die Zwischenräume zwischen den Pfosten 10 × 60 μm oder größer waren, beobachtet wurde, dass sich die Zellen frei durch die Sperren bewegten. Im Gegensatz dazu wurde dort, wo die Zwischenräume zwischen den Pfosten 10 × 20 μm oder weniger betrugen, verhindert, dass die Zellen die Sperre durchdringen, wenn sie durch den Flüssigkeitsfluss in der Suspension transportiert wurden. Allerdings wurde beobachtet, dass Zellen bei der nachfolgenden Inkubation und beim nachfolgenden Wachstum durch langsame Verformung durch die Sperren wandern. Diese Sperrenstrukturen können sich für die Untersuchung der Zellenbewegung oder der Wanderung in Reaktion auf chemische oder physikalische Reize als nützlich erweisen.
  • Beispiel 4
  • HeLa-Zellen, die transfiziert wurden, um eine stabile Expression eines Calreticulin-GFP-Fusionsproteins zu liefern, wurden in eine gegossene oder geformte Vorrichtung von dem in 1 gezeigten Typ mit Hilfskanälen mit einer Breite von 100 μm und mit einer Tiefe von 100 μm, die durch kreisförmige Kammern mit einem Durchmesser von 600 μm und 1000 μm und mit einer Tiefe von 100 μm verbunden waren, eingeführt. Die Zellen wurden 18 Stunden in einem Gewebekulturbrutkasten einer Inkubation ausgesetzt und durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Zellen, die in den mittels Mikrotechnik hergestellten Strukturen gewachsen sind, zeigten das gleiche Niveau der GFP-Expression wie Kontrollzellen, die unter herkömmlichen Gewebekulturbedingungen gewachsen sind.
  • Beispiel 5
  • HeLa-Zellen wurden wachsengelassen und in eine wie in Beispiel 1 beschriebene mittels Mikrotechnik hergestellte Scheibe eingeführt. Nach der 18-stündigen Inkubation wurde das Wachstumsmedium von den Zellen entfernt und durch Medien ersetzt, die verschiedene Konzentrationen des Membranpermeabilisierungsmittels Digitonin im Bereich von 0–0,2 mg/ml (G/V) enthielten, und die Zellen in Anwesenheit des Digitonin 10 Minuten einer Inkubation ausgesetzt. Anschließend wurde wie in Beispiel 1 beschrieben die Lebensfähigkeit der Zellen gemessen. Es wurde festgestellt, dass die Ergebnisse gleichwertig Zellen sind, die dem gleichen Dosisbereich Digitonin in einer mikrotiterplattenbasierten Untersuchung ausgesetzt wurden.

Claims (26)

  1. Vorrichtung mit: a) einer Grundplatte, die eine Vielzahl von Mikrokanalelementen trägt, von denen jedes eine Zellwachstumskammer, einen Einlasskanal zum Zuführen einer Flüssigkeitsprobe in diese und einen Auslasskanal zum Entfernen der Flüssigkeitsprobe aus dieser umfasst, b) einer Deckplatte, die über der Grundplatte positioniert ist, und sich über die Elemente erstreckt, um die Kammern und Verbindungskanäle festzulegen, die Deckplatte ist mit Löchern versehen, um einen Zugang zu den Kanälen vorzusehen, c) einer Suspension von zu züchtenden Zellen, und d) Mitteln, die in den Zellwachstumskammern für Zellenanhaftung und Zellwachstum aufgenommen sind, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Komponenten der Vorrichtung aus einem Film oder einer Membran aufgebaut ist, sodass die eine oder mehreren Komponenten soweit gasdurchlässig ist, dass CO2 gepufferte Medien in der Zellwachstumskammer benutzt werden können und/oder soweit, dass Sauerstoff dadurch hindurch zu den Zellen für deren Stoffwechsel während des Wachstums treten kann.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Grundplatte eine drehbare Scheibe umfasst, die mittels Mikrotechnik hergestellt ist, um eine Probeneinführöffnung vorzusehen, die zur Mitte der Scheibe gelegen und mit einem ringförmigen Probenreservoir verbunden ist, und wobei die Mikrokanalelemente radial auf der Scheibe verteilt sind, wobei ihre jeweiligen Eingangskanäle verbunden sind, um Proben aus dem Reservoir zu empfangen.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Deckplatte aus gasdurchlässigem Kunststoffmaterial hergestellt ist.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das Kunststoffmaterial ein Silikonpolymer, Polyurethan oder Polytetrafluorethylen ist.
  5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Mittel für Zellenanhaftung und Zellwachstum durch chemische oder physikalische Modifika tion zumindest eines Teils der Oberfläche der Zellwachstumskammer eingeführt ist, um eine Zellanhaftung und Zellwachstum zu gestatten.
  6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Mittel für Zellenanhaftung und Zellwachstum eine negativ geladene Oberfläche umfasst.
  7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Mittel für Zellenanhaftung und Zellwachstum eine Oberflächenbeschichtung aus Polylysin, Collagen und/oder Fibronectin umfasst.
  8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Mittel für Zellenanhaftung und Zellwachstum Mikroträgerkügelchen umfasst, die in der Zellwachstumskammer gelegen sind, wobei jedes der Mikroträgerkügelchen für Zellenanhaftung und Zellenwachstum vorgesehen ist.
  9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zellwachstumskammer ferner im Basisabschnitt der Zellwachstumskammer erhöhte, gegossene oder geformte Mittel einschließt, um Pfosten zu bilden.
  10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Querschnittsfläche des Einlasskanals gröber ist als die des Auslasskanals.
  11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Querschnittsfläche des Auslasskanals zwischen 0,99 und 0,01 mal der des Einlasskanals ist.
  12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei zumindest einige der Mikrokanalelemente jeweils eine oder mehrere Untersuchungskammern, die in Reihe zwischen der Zellwachstumskammer und dem Auslasskanal verbunden sind, zum Ausführen von Untersuchungen, die Zellbestandteile einbeziehen, umfassen.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Untersuchungskammer oder -kammern miteinander und mit der Zellwachstumskammer durch einen Zwischenkanal oder -kanäle in der folgenden Reihenfolge: Einlasskanal, Zellwachstumskammer, Zwischenkanal 1, Untersuchungskammer 1, Zwischenkanal 2 (wenn vorhanden), Untersuchungskammer 2 (wenn vorhanden) ..., Auslasskanal verbunden sind, und wobei die Querschnittsfläche der jeweiligen Kanäle vom Einlasskanal zum Auslasskanal hin fortschreitend abnimmt.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei die Querschnittsfläche des oder jedes Zwischenkanals und des Auslasskanals zwischen 0,99 und 0,01 mal der Querschnittsfläche des unmittelbar vorhergehenden (stromaufwärtigen) Kanals ist.
  15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei in oder an einer inneren Oberfläche von einer oder mehreren der Untersuchungskammern eine Schicht vorgesehen ist, die eine szintillierende Substanz umfasst.
  16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die Schicht mit einer szintillierenden Substanz einen daran gebundenen Bindungspartner einschließt, wobei der Bindungspartner ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ausgewählt aus Biotin, Streptavidin, Protein A, Antikörper, Lectinen, Hormonrezeptoren, Nucleinsäuresonden und DNS-Bindungsproteinen ausgewählt ist.
  17. Verfahren zum Bestimmen der Wirkung einer Testsubstanz auf eine zellulare Aktivität oder physikalische Parameter unter Benutzung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, mit: a) Vorsehen einer oder mehrerer Proben von Testsubstanzen deren Wirkung auf die Zellen unter solchen Bedingungen zu messen ist, dass die Zellen den Substanzen ausgesetzt sind, und b) Bestimmung der Wirkung Testsubstanzen auf die Zellen mittels optischer Erfassung.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Zellen anhaftend sind.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Zellen anhaftend an einer Oberfläche in der Vorrichtung vor der Einführung der Testsubstanzen gezüchtet werden.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei nach Schritt c) ein oder mehrere Untersuchungsreagentien geliefert werden, und Verteilen der Reagenzien auf eine oder mehrere Reaktionskammern in der Vorrichtung.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei zumindest eines der Untersuchungsreagenzien mit einer feststellbaren Markierung markiert ist, die ausgewählt wurde aus: Fluoreszenz-Markierungen, Chemolumineszenz-Markierungen, Biolumineszenz-Markierungen, Enzym-Markierungen und radioaktiven Markierungen.
  22. Verfahren zum Messen einer zellularen Messprobe unter Benutzung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, mit a) Wachsenlassen der Zellen, b) Liefern eines oder mehrerer Untersuchungsreagenzien und Verteilen der Reagenzien auf eine oder mehrere Kammern in der Vorrichtung, c) Messen der zellularen Messprobe mit optischen Mitteln.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei zumindest eines der Untersuchungsreagenzien mit einer feststellbaren Markierung markiert ist, die ausgewählt wurde aus: Fluoreszenz-Markierungen, Chemolumineszenz-Markierungen, Biolumineszenz-Markierungen, Enzym-Markierungen und radioaktiven Markierungen.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 23, wobei die Zellen anhaftend sind.
  25. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, zum Züchten von Zellen in Verbindung mit einer zellenbasierten Untersuchung.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Zellen anhaftende Zellen sind.
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