-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Unterscheidung von kernhaltigen
roten Blutzellen. Zusätzlich
stellt das Verfahren eine gleichzeitige Unterscheidung von Leukozyten
in einer Blutzellprobe durch geeignete elektronische und optische
Messungen bereit.
-
Normales
peripheres Blut enthält
rote Blutzellen, die frei von Kern und Retikulum sind. Kernhaltige
rote Blutzellen (engl.: nucleated red blood cells – NRBCs)
oder Erythroblasten sind unreife rote Blutzellen. Sie treten normalerweise
im Knochenmark aber nicht im peripheren Blut auf. In manchen Krankheiten
jedoch, wie Annämie
und Leukämie,
treten NRBCs auch im peripheren Blut auf. Deshalb ist es von klinischer
Wichtigkeit, NRBC zu messen. Traditionell werden die Unterscheidung
und Zählung
von NRBC manuell durchgeführt.
Das Verfahren schließt das
Ausstreichen einer Blutprobe auf einem Mikroskopobjektträger und
Färben
des Objektträgers,
gefolgt von manueller visueller Analyse des einzelnen Objektträgers ein.
Die NRBC-Konzentration wird als Zahl von NRBCs pro 100 weißen Blutzellen
berichtet. Für
gewöhnlich
werden 200 weiße
Blutzellen und die Zahl der NRBCs, die in derselben Region auf einen Blutabstrich
anwesend sind, gezählt,
und die Zahlen werden durch zwei geteilt, um die NRBC-Konzentration
als die Zahl von NRBCs/100 weißen
Blutzellen auszudrücken.
Dieser Ansatz ist extrem zeitaufwändig, ebenso wie er der Interpretation
der Person, die den Objektträger
untersucht, unterworfen ist.
-
In
den vergangenen Jahren wurden einige Fluoreszenzflusszytometrieverfahren
zum Unterscheiden von NRBCs entwickelt. Diese Verfahren verwenden
spezifische Kernfärbungstechniken,
um NRBCs von anderen Zellpopulationen zu unterscheiden, weil es
nicht einfach ist, NRBCs aufgrund ihrer elektronischen oder optischen
Eigenschaften zu unterscheiden.
-
Das
US Patent Nr. 5,298,426 (an Inami et al.) offenbart ein Fluoreszenzverfahren
zum Unterscheiden vom NRBCs. Das Verfahren verwendet eine Zwei-Schritt-Färbung unter Verwendung einer
ersten Flüssigkeit,
die eine saure hypotensive Fluoreszenzfarbstofflösung ist, und einer zweiten
Flüssigkeit,
welche die Osmolalität
und den pH der ersten Flüssigkeit ändert. Inami
et al. lehren, dass die erste Flüssigkeit einen
erythroblast-färbenden
Farbstoff enthält,
der in kernhaltige rote Blutzellen diffundiert, um ihre Kerne spezifisch
zu färben,
und anschließendem
Trennen einer Gruppe von NRBCs von anderen Zellgruppen auf einem
zweidimensionalen Plot, wobei die Ergebnisse der NRBC-Unterscheidung
aufgenommen werden. Um gleichzeitig Leukozyten-Subpopulationen zu
unterscheiden, enthält
die erste Flüssigkeit
auch zwei zusätzliche
Fluoreszenzfarbstoffe, d.h. einen eosinophil/basophil-färbenden
Farbstoff und einen Leukozyten-färbenden
Farbstoff für
das spezifische Färben
dieser Zelltypen.
-
Das
US Patent Nr. 5,559,037 (an Kim et al.) offenbart ein Verfahren
zur Flusszytometrieanalyse von NRBCs und Leukozyten. Das Verfahren
umfasst die Lyse von roten Blutzellen und NRBC Zytoplasma aus einer
Gesamt-Blutprobe, um die NRBC-Kerne gegenüber einer vitalen Kernfärbung auszusetzen und
um die Permeation der vitalen Kernfärbung in die Leukozyten zu
minimieren und Analysieren der Probe durch Messen der Fluoreszenz
und zwei Winkeln von Lichtstreuung, wobei ein Winkel der Lichtstreuung
von 3° bis
10° reicht.
Dieses Verfahren betrifft ein dreifaches Auslösungsverfahren, das die Signale
von Zellrückständen (fluoreszierend
und nicht-fluoreszierend) blockiert, und die Signale identifiziert,
die unter den ALL Auslöser,
aber über
den Fluoreszenzauslöser
(FL3) als NRBCs fallen. ALL ist der axiale Lichtverlust oder die
Lichtstreuungssignale, die bei 0° des einfallenden
Lichts nachgewiesen werden. Deshalb wird eine Vortastung der Signale
in mehr als einer Dimension in diesem Verfahren für die Identifizierung einer
NRBC-Population
benötigt.
Weil Leukozyten auch kernhaltige Zellen sind, muss die Färbung dieser
Zellen verhindert werden, um eine Interferenz mit der Fluoreszenzmessung
zu vermeiden. Die Erhaltung der Leukozytenmembran und die Minimierung der
Permeation der Kernfärbung
in die Leukozyten werden durch gleichzeiti ge Fixierung der Leukozyten mit
einem aliphatischen Aldehyd während
der Lyse der roten Blutzellen erreicht. Die Aldehydfixiermittel sind
als gefährliche
Chemikalien bekannt. Zusätzlich benötigt das
Verfahren das Erhitzen des Reagenz auf 42°C, um die NRBC und Leukozytenunterscheidungen
zu erhalten.
-
Das
US Patent Nr. 5,631,165 (an Chupp et al.) offenbart ein automatisiertes
Verfahren zum Zählen
und Unterscheiden kernhaltiger roter Blutzellen oder Retikulozyten
und Zelloberflächenantigenen
in einer lysierten Blutprobe. Das Verfahren weist multiwinklige
Lichtstreuung und Fluoreszenzsignale aus der lysierten Blutprobe
in einer Flusszelle nach. Ähnlich
zu US Patent Nr. 5,559,037 (an Kim et al.) benötigt dieses Verfahren den Nachweis
von Fluoreszenzsignalen von kernhaltigen roten Blutzellen oder Retikulozyten,
die durch Kernfärbung
mit einem Fluoreszenzfarbstoff hervorgerufen werden.
-
Die
oben beschriebenen Verfahren sind in der Lage, NRBCs und Leukozyten
durch Fluoreszenzflusszytometrie zu unterscheiden und zu zählen. Jedoch
ist die Fluoreszenzmessung ein komplexes und teueres Nachweisverfahren.
-
Die
gegenwärtigen
automatisierten Hämatologieanalysiergeräte wie Abbott
Cell-Dyn® 3500, COULTER®STKS,
Technicon H*1® und
TOA SysmexTM NE-8000 sind nur in der Lage,
eine NRBC-Markierung für
die mögliche
Anwesenheit von NRBCs in einer analysierten Blutprobe bereitzustellen,
wenn die Instrumente eine gesteigerte Signalmenge in der Nähe des Zellrückstandsbereich
der roten Blutzellen eines Histogramms messen. Jedoch bilden solche
Techniken eine falsch positive Markierung, weil viele andere Blutabnormalitäten gesteigerte
Signale in demselben Bereich verursachen können, wie Plättchen,
Klumpen und Sichelzellen, ebenso wie Zellrückstände von roten Zellen aus unzureichend
lysierten Blutproben. In diesen Verfahren werden NRBCs nicht identifiziert.
Anstelle dessen wird nur ein gewöhnliches
NRBC-Probenverteilungsmuster in einem Histogramm oder einem Dotplot
durch das Instrument erkannt, das leicht mit einem ähnlichen
Muster verwechselt werden kann, das durch die oben erwähnten anderen
Ursachen gebildet wird. Für die
markierten Proben, einschließlich
falsch positiver Markierungen, ist die erneute Untersuchung der
Probe mit einem manuellen Verfahren in klinischen Laboratorien notwendig.
Ein anderes Problem mit den NRBC enthaltenden Proben liegt darin,
dass die Zählung
der weißen
Blutzellen (engl.: white blood cell count (WBC)), die von Hämatologieanalysiergeräten berichtet
wird, für
diese Proben nicht genau ist, weil NRBCs die WBC erhöhen könnten, in
dem sie als weiße
Zellen falsch identifiziert werden. Andererseits ist die Analyse
von Leukozytenpopulationen aus Gesamt-Blutproben ein integraler
Bestandteil von diagnostischen Verfahren hinsichtlich einer Vielzahl
von Pathologien. Die Fähigkeit,
die Hauptsubpopulation von Leukozyten in einer automatisierten Weise
zu analysieren, ist essentiell für
eine schnelle Diagnose einer einzelnen Blutprobe und für die schnelle
Verarbeitung von vielen Proben auf einmal.
-
Das
US Patent Nr. 5,155,044 (an Ledis et al.) offenbart ein Verfahren
zur Isolierung und Analyse von Leukozyten aus einer Gesamt-Blutprobe,
was die Unterscheidung von Leukozyten in fünf Subpopulationen in einer
Ein-Schritt-Messung in einem automatischen Hämatologieanalysiergerät erlaubt.
Die Nachweistechnik schließt
eine gleichzeitige Lichtstreuungsmessung und Impedanzmessungen in
sowohl Gleichstrom (direkter Strom) und RF (Radiofrequenz) ein.
Dieses Verfahren ist einfach und schnell, aber es stellt keine Unterscheidung
von NRBCs bereit.
-
Das
US Patent Nr. 5,384,549 (an Hamaguchi et al.) beschreibt ein lytisches
Reagenzsystem und ein Verfahren zum Unterscheiden von Leukozyten
in fünf
Subpopulationen durch eine komplexe Prozedur. Das Verfahren benötigt drei
lytische Reagenzien, drei getrennte Probenpräparationen und Messungen hinsichtlich
der Identität
von eosinophilen, neutrophilen und basophilen Populationen zusätzlich zu
den Lymphozyten und Monozyten Populationen. Hamaguchi et al. beschreiben
nur die Beobachtung von abnormalen Leukozyten Populationen und kernhaltigen
roten Blutzellen unter Verwendung des Lysisreagenzsystems und Gleichstrom-
vs. RF-Nachweisverfahren. Jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf
das reine Beobachten der Anwesenheit von einigen abnormalen Zelltypen,
aber es ist nicht in der Lage, die NRBCs zu unterscheiden und zu
zählen.
-
Das
US Patent Nr. 5,686,308 (an Li et al.) beschreibt ein Lysereagenzsystem
und ein Verfahren zum Unterscheiden von Leukozyten in fünf Subpopulationen
in einer Ein-Schritt-Messung in einem automatischen Hämatologieanalysiergerät. Das lytische Reagenzsystem
umfasst ein lytisches Reagenz umfassend eine ethoxylierte langkettige
Aminverbindung und Säure,
um den pH des lytischen Reagenz innerhalb des Bereichs von 2,0 bis
3,6 zu halten; und ein hypertonisches, alkalisches stabilisierendes
Reagenz. Dieses Patent lehrt ein Reagenz und ein Verfahren zum Unterscheiden
von Leukozyten-Subpopulationen, aber es lehrt nicht das Unterscheiden
von kernhaltigen roten Blutzellen.
-
Basierend
auf dem zuvor Gesagten, besteht eine Notwendigkeit für ein einfaches
und weniger teures Analyseverfahren zum Unterscheiden und Zählen von
NRBCs.
-
Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen,
welches das Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen in einem
automatischen Hämatologieanalisiergerät ohne die
Verwendung von Fluoreszenz- oder Kernfärbung erlaubt. Das Verfahren
ist in Anspruch 1 definiert und umfasst das Bereitstellen einer
Blutprobe für
die Analyse; das Lysieren von reifen roten Blutzellen aus der Blutprobe;
das Analysieren der Blutprobe durch zwei Winkel von Streuungslichtmessung,
um kernhaltige rote Blutzellen zu unterscheiden; wobei das zweite Lichtstreuungssignal
ein Mittelwinkel-Lichtstreuungssignal oder ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal
ist; und das Berichten von kernhaltigen roten Blutzellen in der
Blutprobe.
-
Ein
anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereitzustellen,
das ein gleichzeitiges Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen
und Leukozyten erlaubt. Das Verfahren ist in Anspruch 7 definiert
und umfasst das Bereitstellen einer Blutprobe für die Analyse; das Lysieren
von reifen roten Blutzellen aus der Blutprobe; das Analysieren der Blutprobe
durch Gleichstrom und Lichtstreuungsmessungen um kernhaltige rote
Blutzellen und Leukozyten-Subpopulationen
zu unterscheiden, wobei die Lichtstreuungsmessung, die für das Unterscheiden
kernhaltiger roter Blutzellen verwendet wird, unter Verwendung von zwei
Winkeln von Lichtstreuungssignalen durchgeführt wird, und wobei das zweite
Lichtstreuungssignal zum Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen
ein Mittelwinkel-Lichtstreuungssignal oder ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal
ist; und das Berichten von kernhaltigen roten Blutzellen und Leukozyten-Subpopulationen
in der Blutprobe.
-
Wie
aus der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
besser verstanden werden wird, ist die Erfindung insbesondere vorteilhaft
im Vergleich zu dem Stand der Technik, weil sie das Unterscheiden
von kernhaltigen roten Blutzellen unter Verwendung von Lichtstreuungen
ohne Kernfärbung
und der Verwendung eines komplexen Fluoreszenznachweisverfahrens
erlaubt. Ein zusätzliches
Merkmal der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie kein Erhitzen
zur Probenpräparation benötigt und
optimal bei Raumtemperatur arbeitet. Die Erfindung wird besser von
der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform verstanden.
-
Die 1–7 sind
Streuungsdiagramme, die in Übereinstimmung
mit der Durchführung
der vorliegenden Erfindung, wie in Beispielen I bis IV beschrieben,
erhalten wurden.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Unterscheiden von
NRBCs. Zusätzlich
liefert das Verfahren eine gleichzeitige Unterscheidung von Leukozyten
in einer Blutzellprobe.
-
In
einer ersten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
das Aussetzen einer Blutzellprobe gegenüber einem lytischen Reagenzsystem,
um reife rote Blutzellen zu lysieren; anschließend das Analysieren der Probenmischung
in einer Flusszelle unter Verwendung von Lichtstreuungsmessung,
um NRBCs zu unterscheiden; und das Belichten von NRBCs in der Blutzellprobe.
-
Ein
Reagenzsystem, das für
die vorliegende Erfindung geeignet ist, umfasst ein lytisches Reagenz
umfassend eine ethoxylierte langkettige Aminverbindung, dargestellt
durch die allgemeine Formel
wobei R eine Alkyl-, Alkenyl-
oder Alkinylgruppe mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen, m und n je 1
oder mehr und m + n zwischen 20 und 40 ist, und eine Säure, um
den pH des lytischen Reagenz innerhalb des Bereichs von 2,0 bis
3,6 zu halten; und ein hypertonisches, alkalisches Stabilisierungsreagenz.
-
Gegebenenfalls
kann einer oder mehrere Lösungsvermittler
in das lytische Reagenz in einer wirksamen Menge, um den Rückstand
der roten Blutzellen zu reduzieren, eingeschlossen werden. Typischerweise
sind die Lösungsvermittler
Polyoxyethylen und Polyoxypropylen Kopolymere, und die ethoxylierten
Alkohole haben einen HLB von 16 oder größer. Geeignete Kopolymere schließen ein,
aber sind nicht beschränkt
auf Pluronic Kopolymer (BASF Corporation, Parsippany, New Jersey),
wie Pluronic F38 und Pluronic 25R8 und geeignete ethoxylierte Alkohole
schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf Plurafac A38 (BASF) und Hetoxol STA 30 (Heterene, Inc. Paterson,
New Jersey).
-
Zusätzliche
wahlweise Zusatzstoffe können auch
in das lytische Reagenz in Konzentrationen eingeschlossen werden,
dass ihre Anwesenheit verträglich
ist mit den primären
funktionellen Bestandteilen der lytischen Reagenzzusammensetzung.
Unter diesen Zusatzstoffen sind Konservierungsmittel, die antioxidative
Eigenschaften aufweisen, um die Lagerungszeit der Zusammensetzung
zu steigern, und die anti-mikrobielle Eigenschaften aufweisen. Konservierungsmittel,
die anti- oxidierende
Eigenschaften aufweisen, schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf EDTA und Butylmethylphenol. Konservierungsmittel mit anti-mikrobieller
Aktivität
schließen
ein, aber nicht beschränkt
auf Dimethyloldimethylhydantoin, Iodpropynylbutylcarbamat und Isothiozolonderivate.
-
Andere
Reagenzsysteme, die für
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden können, sind
in dem US Patent Nr. 5,155,044 offenbart. Dieses Reagenzsystem verwendet
eine hypotonische Säurelyse,
um selektiv rote Blutzellen zu lysieren und ein anschließendes Hinzufügen einer
Quenchinglösung
um die lysierende Aktivität
zu verzögern
und Leukozyten für
die unterscheidende Analyse zu schützen.
-
Die
unterscheidende Analyse von NRBCs wird in einer Flusszelle mit einer
Schutzflüssigkeit
unter Verwendung von Lichtstreuungsmessung durchgeführt. Wenn
ein Partikel wie eine Blutzelle durch die Apparatur einer Flusszelle
wandert, streut sie das einfallende Licht von einem Laserstrahl
in alle Richtungen. Die Lichtstreuungssignale können durch einen Lichtdetektor
bei verschiedenen Winkeln relativ zu dem einfallenden Lichtstrahl
zwischen 0° und
180° gemessen
werden. Es wurde gefunden, dass jede Zellpopulation verschiedene
Lichtstreuungseigenschaften aufweist, die entweder signifikant oder
geringer sind, die für
die Unterscheidung von verschiedenen Zellpopulationen verwendet
werden könnten. Die
Lichtstreuungssignale, die in weniger als 10° von dem einfallenden Licht
nachgewiesen werden, werden für
gewöhnlich
als Kleinwinkel-Lichtstreuung bezeichnet. Die Lichtstreuungssignale,
die von ungefähr
10° bis
ungefähr
70° von
dem einfallenden Licht nachgewiesen werden, werden als Mittelwinkel-Lichtstreuung
bezeichnet, und die Lichtstreuungssignale, die bei ungefähr 90° des einfallenden Lichts
nachgewiesen werden, werden als Rechtwinkel-Lichtstreuungen bezeichnet.
Die Merkmale von Lichtstreuungssignalen werden durch die Größe einer
Zelle, dem Inhalt einer Zelle und den Oberflächeneigenschaften einer Zelle
beeinflusst.
-
Lichtstreuungssignale
von einem Partikel oder einer Zelle, der/die durch die Flusszelle
wandert, werden für
die Zwecke dieser Erfindung verwendet. Zwei Winkel von Lichtstreuungssignalen
werden für
die Unterscheidung von NRBCs verwendet. Vorzugsweise ist einer der
Lichtstreuungswinkel an Kleinwinkel-Lichtstreuungssignal, das weniger als 10° ist. Der
bevorzugte Bereich des Kleinwinkel-Bestreuungssignals ist von ungefähr 0° bis ungefähr 4°. Der zweite
Lichtstreuungswinkel ist ein Mittel- oder Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal.
-
Die 1 bis 4 zeigen
eine Reihe von Streuungsdiagrammen einer klinischen Gesamt-Blutprobe,
die 11 NRBC/100 WBC enthält,
die verarbeitet und dem Verfahren folgend, das im Beispiel I beschrieben
ist, analysiert wurde. In diesen Streuungsdiagrammen LS1 (ungefähr 1° bis ungefähr 3°) vs. LS2
(ungefähr
4° bis ungefähr 6°) in 1,
LS1 vs. LS4 (ungefähr
6° bis ungefähr 8°) in 2,
LS1 vs. LS5 (ungefähr
9° bis ungefähr 11°) in 3 und
LS1 vs. LS3 (ungefähr
24° bis
ungefähr
35°) in 4,
bilden NRBCs ein Cluster, das sich eindeutig von dem Zellrückstand
roter Blutzellen unterscheidet, der unter den NRBCs angegeben ist,
und das sich eindeutig von Leukozyten unterscheidet (die außerhalb
des Bereichs dieser Streuungsdiagramme sind). In einem Gleichstrommaßstab sind
die NRBC-Populationen, die in 1 bis 4 beschrieben
sind unter Lymphozyten in einer Region, die für gewöhnlich als eine Zellrückstandregion
erachtet wird, wie in 5 gezeigt ist.
-
Die
Unterscheidung von NRBCs durch Lichtstreuungsmessung ist einfach
und geradeheraus. Sie verwendet einen herkömmlichen zwei-dimensionalen
Dotplot, oder Streuungsdiagramm, um NRBCs von anderen Zelltypen
zu unterscheiden. Die Zellpopulationen über dem NRBC-Cluster in LS1
werden als Gesamt-Leukozyten
(WBC) gezählt.
Zusätzlich kann
ein anderes Verfahren verwendet werden, um die Gesamt-Leukozyten
(WBC) zu bestimmen. Wenn eine Gleichstromnachweisvorrichtung ebenfalls
verwendet wird, können
die Zellpopulationen über
dem minimalen Gleichstromvolumen der Leukozyten als Gesamt-Leukozyten
gezählt
werden. Die WBC, die in beiden dieser Verfahren erhalten wird, ist
frei von NRBCs-Interferenz, und sie ist gleich zu der korrigierten
WBC, die gebildet wird durch Abziehen einer NRBC-Zählung von
einer Gesamt-Leukozyten-Zählung,
die einen Beitrag von NRBC enthält.
-
Die
NRBC-Konzentration der analysierten Probe kann berechnet werden
durch Teile der gezählten
Zellzahl im identifizierten NRBC-Cluster (1 bis 4)
durch die gezählten
Gesamtleukozyten (WBC) und Multiplizieren des Quotienten mit 100.
Die NRBC-Konzentration kann als die Zahl von NRBC/100 WBC berichtet
werden, die gleich ist zu der manuellen Berichtseinheit, oder sie
kann als ein absoluter NRBC pro μl
eines Gesamtblutes berichtet werden.
-
In
einer zweiten Ausführungsform
der Erfindung kann eine unterscheidende Analyse von Leukozyten zusammen
mit der Unterscheidung von NRBCs durchgeführt werden. Die unterscheidende Analyse
kann unter Verwendung desselben Reagenzsystems und einer Probenpräparation
in einer Ein-Schritt-Messung unter Verwendung von elektronischer
und optischer Analyse durchgeführt
werden. Die elektronische und optische Analyse schließt Lichtstreuungs-
und Impedanzmessungen ein. Die Vorrichtung zur Gleichstrom-Impedanzmessung,
die für
die Leukozytenanalyse durch ein automatisches Hämatologieanalysiergerät verwendet
wird, ist dem Fachmann bekannt und ist allgemein beschrieben in dem
US Patent Nr. 5,125,737, an Rodriguez et al. Für die unterscheidende Analyse
von NRBC und Leukozyten wird ein Lichtstreuungsdetektor verwendet,
der in der Lage ist vielwinklige Lichtstreuungssignale von einem
Partikel oder einer Zelle, der/die durch die Flusszelle wandert,
nachzuweisen.
-
In 1 bis 4 liegen
die Leukozyten außerhalb
des Bereichs der dargestellten Streuungsdiagramme, und sie sind
nicht in diesen Figuren gezeigt. Jedoch kann die Probenanalyse für Leukozytenunterscheidung
und NRBC in einer Ein-Schritt-Messung
durchgeführt
werden. Die Datenanalyse für
beide Unterscheidungen kann gleichzeitig unter Verwendung verschiedener
Parameter, die von der Ein-Schritt-Messung erhalten werden, durchgeführt werden.
-
5 ist
ein Gleichstrom vs. LS3 (Mittelwinkel-Lichtstreuung, von ungefähr 24° bis ungefähr 35°) Streuungsdiagramm,
das von einer frischen normalen Gesamt-Blutprobe erhalten wurde, die gemäß Beispiel
II (die gleichen Reagenzien und Verfahren die in Beispiel I verwendet
wurden) verarbeitet wurden. 5 zeigt
vier verschiedene Cluster von Leukozyten-Subpopulationen, Lymphozyten,
Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen. Die Probe wurde in einer
Probenpräparation
verarbeitet und gleichzeitig mit der NRBC-Unterscheidung analysiert.
In dem Gleichstrom vs. LS3 Streuungsdiagramm werden alle Zellpopulationen über dem
minimalen Gleichstromvolumen der Lymphozyten Population als Gesamt-Leukozyten (WBC)
gezählt,
die gleich ist zu den Populationen über dem NRBC-Cluster in dem LS1 vs.
LS2 Streuungsdiagramm.
-
Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung berichtet zum ersten Mal über das
Unterscheiden und Zählen
von kernhaltigen roten Blutzellen ohne die Verwendung von Kernfärbung und
Fluoreszenz. Die Eliminierung von Kernfärbung liefert Vorteile hinsichtlich
der Verringerung der Instrumenten- und Flüssigsystempflege aufgrund von
Farbstoffkontamination, der Verringerung der Systemsensitivität gegenüber einer
Reagenzüberladung
und der Verringerung der Reagenzkosten aufgrund von teuren Fluoreszenzfarbstoffen.
Das erfindungsgemäße Verfahren
ist schnell, zuverlässig
und für
die automatisierte Blutanalyse geeignet. Zusätzlich ist die Nachweistechnik
weniger komplex und nicht teuer im Vergleich zum Fluoreszenzverfahren.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
liefert einen Vorteil da es vollständig bei Raumtemperatur, 18 bis
28°C, arbeitet.
Verfahren des Standes der Technik arbeiten bei erhöhter Temperatur
zum Unterscheiden von Leukozyten-Subpopulation oder dem Unterscheiden
von NRBCs. Diese Notwendigkeit der erhöhten Temperatur erfordert Analyseinstrumente, die
wesentlich komplexer und teuerer sind. Es ruft auch stressigere
Bedingungen für
die zu analysierenden biologischen Zellen hervor.
-
Ein
anderes vorteilhaftes Merkmal dieser Erfindung ist seine Nützlichkeit
für die
unterscheidende Analyse von anderen Flüssigkeitsproben, wie Knochenmark,
und Blutproben von nicht-menschlichen Spezies.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann ferner durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden
werden. Jedoch wird verstanden, dass die Erfindung nicht auf die
beschriebenen Beispiele beschränkt
ist.
-
Beispiel I
-
Zu
28 μl einer
EDTA-antikoagulierten klinischen Gesamt-Blutprobe wurden 417 μl eines lytischen
Reagenz umfassend 0,18% Ameisensäure, 2%
eines ethoxylierten langkettigen Amins, dargestellt durch die Formel:
wobei R ein Stearyl und m
+ n gleich 27 ist, 1,4% Plurafac A38 als ein Lösungsvermittler und Konservierungsmittel
hinzugefügt
und in einer Mischkammer in einem experimentellen Hämatologieanalysiergerät für ungefähr 4 Sekunden
gemischt. Anschließend wurden
180 μl eines
stabilisierenden Reagenz umfassend 1,4% NaCl, 3,2% Na
2SO
4 und 0,66% Na
2CO
3, mit einem pH von 11,0, hinzugefügt und gemischt,
um die lytische Reaktion zu verzögern.
-
10
Sekunden nach dem Hinzufügen
des stabilisierenden Reagenz wurde die Probenmischung in eine Flusszelle
mit einer Schutzflüssigkeit,
ISOTON® III
Verdünnung
(Produkt von Coulter Corporation, Miami, Florida) für NRBC und
Leukozyten unterscheidende Analysen in einem experimentellen Hämatologieanalysiergerät gegeben,
das mit Gleichstrom- und Lichtstreuungsdetektoren ausgestattet war.
-
Der
Lichtstreuungsdetektor detektiert Lichtstreuungssignale von einer
Zelle, die durch die Flusszelle wandert, in verschiedenen Bereichen
von Winkeln, d.h. von ungefähr
1° bis ungefähr 3° (LS1), von ungefähr 4° bis ungefähr 6° (LS2), von
ungefähr
6° bis ungefähr 8° (LS4), von
ungefähr
9° bis ungefähr 11° (LS5), von
ungefähr
24° bis
ungefähr
35° (LS3) und
größeren Winkeln.
-
Die
resultierenden Streuungsdiagramme sind in 1 bis 4 dargestellt.
Diese Figuren zeigen ein Cluster von NRBCs, das von Zellrückstand roter
Blutzellen (unten) und Leukozyten (oben, aber außerhalb des Bereichs der Streuungsdiagramme)
in den LS1 vs. LS2, LS1 vs. LS4, LS1 vs. LS5 und LS1 vs. LS3 Streuungsdiagrammen
unterschieden wird.
-
Die
NRBC-Konzentration der analysierten Probe wird berechnet durch Teilen
der gezählten
Zahl in dem identifizierten NRBC-Cluster (1 bis 4)
durch die gezählten
Gesamt-Leukozyten (WBC) und Multiplizieren des Quotienten mit 100.
Die NRBC-Konzentration wird als Zahl von NRBC/100 WBC berichtet,
welche dieselbe ist wie die manuelle Berichtseinheit. Für diese
Probe berichtete das manuelle Referenzverfahren 11 NRBC/100 WBC,
und das oben beschriebene Verfahren berichtete ungefähr 12 NRBC/100
WBC.
-
Beispiel II
-
Eine
frische normale Gesamt-Blutprobe wurde unter Verwendung der gleichen
Reagenzien und Verfahren, die im Beispiel I beschrieben sind, analysiert.
Die Probenmischung wurde gleichzeitig in einer Flusszelle auf demselben
Hämatologieanalysiergerät, das in
Beispiel I für
die Leukozytenunterscheidung und NRBC-Unterscheidung verwendet wurde, analysiert. 5 ist
ein erhaltenes Gleichstrom- vs. LS3-Streuungsdiagramm, das vier
verschiedene Cluster von Leukozyten-Subpopulationen, Lymphozyten,
Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen zeigt.
-
Beispiel III
-
Zu
28 μl einer
EDTA-antikoagulierten klinischen Gesamt-Blutprobe wurden 449 μl eines lytischen
Reagenz, das aus 0,12% Ameisensäure
und 0,07% Saponin zusammengesetzt ist, hinzugefügt und in einer Mischkammer
in einem Hämatologieanalysiergerät für ungefähr 5 Sekunden
gemischt. Danach wurden 177 μl
desselben stabilisierenden Reagenz, das in Beispiel I beschrieben
ist, hinzugefügt und
gemischt, um die lytische Reaktion zu inhibieren.
-
Ungefähr 8 Sekunden
nach dem Hinzufügen des
stabilisierenden Reagenz wurde die Probenmischung in eine Flusszelle
mit einer Schutzflüssigkeit, ISOTON® III
Verdünner,
für die
NRBC und Leukozyten unterscheidende Analyse auf demselben Hämatologieanalysiergerät das in
Beispiel I beschrieben ist, gegeben. 6 ist das
resultierende LS1 vs. LS2 Streuungsdiagramm (im selben Maßstab wie
in 1), das ein NRBC-Cluster getrennt von anderen Zelltypen
zeigt.
-
Beispiel IV
-
4 μl Alligatorblut
wurden mit 4,15 ml des lytischen Reagenz vom Beispiel I in einem
Testgefäß manuell
für ungefähr 4 Sekunden
gemischt. 1,8 ml des stabilisierenden Reagenz aus Beispiel I wurden hinzugefügt, und
die Probenmischung wurde manuell gemischt und in das Hämatologieanalysiergerät, das in
Beispiel I beschrieben ist, eingeführt. 7 ist das erhaltene
LS1 vs. LS5 Streuungsdiagramm. Wie gezeigt ist, bildeten die NRBCs
ein abgegrenztes Cluster.