DE69924968T2 - Verfahren zum unterscheiden von kernhaltigen roten blutzellen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Unterscheidung von kernhaltigen roten Blutzellen. Zusätzlich stellt das Verfahren eine gleichzeitige Unterscheidung von Leukozyten in einer Blutzellprobe durch geeignete elektronische und optische Messungen bereit.
  • Normales peripheres Blut enthält rote Blutzellen, die frei von Kern und Retikulum sind. Kernhaltige rote Blutzellen (engl.: nucleated red blood cells – NRBCs) oder Erythroblasten sind unreife rote Blutzellen. Sie treten normalerweise im Knochenmark aber nicht im peripheren Blut auf. In manchen Krankheiten jedoch, wie Annämie und Leukämie, treten NRBCs auch im peripheren Blut auf. Deshalb ist es von klinischer Wichtigkeit, NRBC zu messen. Traditionell werden die Unterscheidung und Zählung von NRBC manuell durchgeführt. Das Verfahren schließt das Ausstreichen einer Blutprobe auf einem Mikroskopobjektträger und Färben des Objektträgers, gefolgt von manueller visueller Analyse des einzelnen Objektträgers ein. Die NRBC-Konzentration wird als Zahl von NRBCs pro 100 weißen Blutzellen berichtet. Für gewöhnlich werden 200 weiße Blutzellen und die Zahl der NRBCs, die in derselben Region auf einen Blutabstrich anwesend sind, gezählt, und die Zahlen werden durch zwei geteilt, um die NRBC-Konzentration als die Zahl von NRBCs/100 weißen Blutzellen auszudrücken. Dieser Ansatz ist extrem zeitaufwändig, ebenso wie er der Interpretation der Person, die den Objektträger untersucht, unterworfen ist.
  • In den vergangenen Jahren wurden einige Fluoreszenzflusszytometrieverfahren zum Unterscheiden von NRBCs entwickelt. Diese Verfahren verwenden spezifische Kernfärbungstechniken, um NRBCs von anderen Zellpopulationen zu unterscheiden, weil es nicht einfach ist, NRBCs aufgrund ihrer elektronischen oder optischen Eigenschaften zu unterscheiden.
  • Das US Patent Nr. 5,298,426 (an Inami et al.) offenbart ein Fluoreszenzverfahren zum Unterscheiden vom NRBCs. Das Verfahren verwendet eine Zwei-Schritt-Färbung unter Verwendung einer ersten Flüssigkeit, die eine saure hypotensive Fluoreszenzfarbstofflösung ist, und einer zweiten Flüssigkeit, welche die Osmolalität und den pH der ersten Flüssigkeit ändert. Inami et al. lehren, dass die erste Flüssigkeit einen erythroblast-färbenden Farbstoff enthält, der in kernhaltige rote Blutzellen diffundiert, um ihre Kerne spezifisch zu färben, und anschließendem Trennen einer Gruppe von NRBCs von anderen Zellgruppen auf einem zweidimensionalen Plot, wobei die Ergebnisse der NRBC-Unterscheidung aufgenommen werden. Um gleichzeitig Leukozyten-Subpopulationen zu unterscheiden, enthält die erste Flüssigkeit auch zwei zusätzliche Fluoreszenzfarbstoffe, d.h. einen eosinophil/basophil-färbenden Farbstoff und einen Leukozyten-färbenden Farbstoff für das spezifische Färben dieser Zelltypen.
  • Das US Patent Nr. 5,559,037 (an Kim et al.) offenbart ein Verfahren zur Flusszytometrieanalyse von NRBCs und Leukozyten. Das Verfahren umfasst die Lyse von roten Blutzellen und NRBC Zytoplasma aus einer Gesamt-Blutprobe, um die NRBC-Kerne gegenüber einer vitalen Kernfärbung auszusetzen und um die Permeation der vitalen Kernfärbung in die Leukozyten zu minimieren und Analysieren der Probe durch Messen der Fluoreszenz und zwei Winkeln von Lichtstreuung, wobei ein Winkel der Lichtstreuung von 3° bis 10° reicht. Dieses Verfahren betrifft ein dreifaches Auslösungsverfahren, das die Signale von Zellrückständen (fluoreszierend und nicht-fluoreszierend) blockiert, und die Signale identifiziert, die unter den ALL Auslöser, aber über den Fluoreszenzauslöser (FL3) als NRBCs fallen. ALL ist der axiale Lichtverlust oder die Lichtstreuungssignale, die bei 0° des einfallenden Lichts nachgewiesen werden. Deshalb wird eine Vortastung der Signale in mehr als einer Dimension in diesem Verfahren für die Identifizierung einer NRBC-Population benötigt. Weil Leukozyten auch kernhaltige Zellen sind, muss die Färbung dieser Zellen verhindert werden, um eine Interferenz mit der Fluoreszenzmessung zu vermeiden. Die Erhaltung der Leukozytenmembran und die Minimierung der Permeation der Kernfärbung in die Leukozyten werden durch gleichzeiti ge Fixierung der Leukozyten mit einem aliphatischen Aldehyd während der Lyse der roten Blutzellen erreicht. Die Aldehydfixiermittel sind als gefährliche Chemikalien bekannt. Zusätzlich benötigt das Verfahren das Erhitzen des Reagenz auf 42°C, um die NRBC und Leukozytenunterscheidungen zu erhalten.
  • Das US Patent Nr. 5,631,165 (an Chupp et al.) offenbart ein automatisiertes Verfahren zum Zählen und Unterscheiden kernhaltiger roter Blutzellen oder Retikulozyten und Zelloberflächenantigenen in einer lysierten Blutprobe. Das Verfahren weist multiwinklige Lichtstreuung und Fluoreszenzsignale aus der lysierten Blutprobe in einer Flusszelle nach. Ähnlich zu US Patent Nr. 5,559,037 (an Kim et al.) benötigt dieses Verfahren den Nachweis von Fluoreszenzsignalen von kernhaltigen roten Blutzellen oder Retikulozyten, die durch Kernfärbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff hervorgerufen werden.
  • Die oben beschriebenen Verfahren sind in der Lage, NRBCs und Leukozyten durch Fluoreszenzflusszytometrie zu unterscheiden und zu zählen. Jedoch ist die Fluoreszenzmessung ein komplexes und teueres Nachweisverfahren.
  • Die gegenwärtigen automatisierten Hämatologieanalysiergeräte wie Abbott Cell-Dyn® 3500, COULTER®STKS, Technicon H*1® und TOA SysmexTM NE-8000 sind nur in der Lage, eine NRBC-Markierung für die mögliche Anwesenheit von NRBCs in einer analysierten Blutprobe bereitzustellen, wenn die Instrumente eine gesteigerte Signalmenge in der Nähe des Zellrückstandsbereich der roten Blutzellen eines Histogramms messen. Jedoch bilden solche Techniken eine falsch positive Markierung, weil viele andere Blutabnormalitäten gesteigerte Signale in demselben Bereich verursachen können, wie Plättchen, Klumpen und Sichelzellen, ebenso wie Zellrückstände von roten Zellen aus unzureichend lysierten Blutproben. In diesen Verfahren werden NRBCs nicht identifiziert. Anstelle dessen wird nur ein gewöhnliches NRBC-Probenverteilungsmuster in einem Histogramm oder einem Dotplot durch das Instrument erkannt, das leicht mit einem ähnlichen Muster verwechselt werden kann, das durch die oben erwähnten anderen Ursachen gebildet wird. Für die markierten Proben, einschließlich falsch positiver Markierungen, ist die erneute Untersuchung der Probe mit einem manuellen Verfahren in klinischen Laboratorien notwendig. Ein anderes Problem mit den NRBC enthaltenden Proben liegt darin, dass die Zählung der weißen Blutzellen (engl.: white blood cell count (WBC)), die von Hämatologieanalysiergeräten berichtet wird, für diese Proben nicht genau ist, weil NRBCs die WBC erhöhen könnten, in dem sie als weiße Zellen falsch identifiziert werden. Andererseits ist die Analyse von Leukozytenpopulationen aus Gesamt-Blutproben ein integraler Bestandteil von diagnostischen Verfahren hinsichtlich einer Vielzahl von Pathologien. Die Fähigkeit, die Hauptsubpopulation von Leukozyten in einer automatisierten Weise zu analysieren, ist essentiell für eine schnelle Diagnose einer einzelnen Blutprobe und für die schnelle Verarbeitung von vielen Proben auf einmal.
  • Das US Patent Nr. 5,155,044 (an Ledis et al.) offenbart ein Verfahren zur Isolierung und Analyse von Leukozyten aus einer Gesamt-Blutprobe, was die Unterscheidung von Leukozyten in fünf Subpopulationen in einer Ein-Schritt-Messung in einem automatischen Hämatologieanalysiergerät erlaubt. Die Nachweistechnik schließt eine gleichzeitige Lichtstreuungsmessung und Impedanzmessungen in sowohl Gleichstrom (direkter Strom) und RF (Radiofrequenz) ein. Dieses Verfahren ist einfach und schnell, aber es stellt keine Unterscheidung von NRBCs bereit.
  • Das US Patent Nr. 5,384,549 (an Hamaguchi et al.) beschreibt ein lytisches Reagenzsystem und ein Verfahren zum Unterscheiden von Leukozyten in fünf Subpopulationen durch eine komplexe Prozedur. Das Verfahren benötigt drei lytische Reagenzien, drei getrennte Probenpräparationen und Messungen hinsichtlich der Identität von eosinophilen, neutrophilen und basophilen Populationen zusätzlich zu den Lymphozyten und Monozyten Populationen. Hamaguchi et al. beschreiben nur die Beobachtung von abnormalen Leukozyten Populationen und kernhaltigen roten Blutzellen unter Verwendung des Lysisreagenzsystems und Gleichstrom- vs. RF-Nachweisverfahren. Jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf das reine Beobachten der Anwesenheit von einigen abnormalen Zelltypen, aber es ist nicht in der Lage, die NRBCs zu unterscheiden und zu zählen.
  • Das US Patent Nr. 5,686,308 (an Li et al.) beschreibt ein Lysereagenzsystem und ein Verfahren zum Unterscheiden von Leukozyten in fünf Subpopulationen in einer Ein-Schritt-Messung in einem automatischen Hämatologieanalysiergerät. Das lytische Reagenzsystem umfasst ein lytisches Reagenz umfassend eine ethoxylierte langkettige Aminverbindung und Säure, um den pH des lytischen Reagenz innerhalb des Bereichs von 2,0 bis 3,6 zu halten; und ein hypertonisches, alkalisches stabilisierendes Reagenz. Dieses Patent lehrt ein Reagenz und ein Verfahren zum Unterscheiden von Leukozyten-Subpopulationen, aber es lehrt nicht das Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen.
  • Basierend auf dem zuvor Gesagten, besteht eine Notwendigkeit für ein einfaches und weniger teures Analyseverfahren zum Unterscheiden und Zählen von NRBCs.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches das Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen in einem automatischen Hämatologieanalisiergerät ohne die Verwendung von Fluoreszenz- oder Kernfärbung erlaubt. Das Verfahren ist in Anspruch 1 definiert und umfasst das Bereitstellen einer Blutprobe für die Analyse; das Lysieren von reifen roten Blutzellen aus der Blutprobe; das Analysieren der Blutprobe durch zwei Winkel von Streuungslichtmessung, um kernhaltige rote Blutzellen zu unterscheiden; wobei das zweite Lichtstreuungssignal ein Mittelwinkel-Lichtstreuungssignal oder ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal ist; und das Berichten von kernhaltigen roten Blutzellen in der Blutprobe.
  • Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereitzustellen, das ein gleichzeitiges Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen und Leukozyten erlaubt. Das Verfahren ist in Anspruch 7 definiert und umfasst das Bereitstellen einer Blutprobe für die Analyse; das Lysieren von reifen roten Blutzellen aus der Blutprobe; das Analysieren der Blutprobe durch Gleichstrom und Lichtstreuungsmessungen um kernhaltige rote Blutzellen und Leukozyten-Subpopulationen zu unterscheiden, wobei die Lichtstreuungsmessung, die für das Unterscheiden kernhaltiger roter Blutzellen verwendet wird, unter Verwendung von zwei Winkeln von Lichtstreuungssignalen durchgeführt wird, und wobei das zweite Lichtstreuungssignal zum Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen ein Mittelwinkel-Lichtstreuungssignal oder ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal ist; und das Berichten von kernhaltigen roten Blutzellen und Leukozyten-Subpopulationen in der Blutprobe.
  • Wie aus der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen besser verstanden werden wird, ist die Erfindung insbesondere vorteilhaft im Vergleich zu dem Stand der Technik, weil sie das Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen unter Verwendung von Lichtstreuungen ohne Kernfärbung und der Verwendung eines komplexen Fluoreszenznachweisverfahrens erlaubt. Ein zusätzliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie kein Erhitzen zur Probenpräparation benötigt und optimal bei Raumtemperatur arbeitet. Die Erfindung wird besser von der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform verstanden.
  • Die 17 sind Streuungsdiagramme, die in Übereinstimmung mit der Durchführung der vorliegenden Erfindung, wie in Beispielen I bis IV beschrieben, erhalten wurden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Unterscheiden von NRBCs. Zusätzlich liefert das Verfahren eine gleichzeitige Unterscheidung von Leukozyten in einer Blutzellprobe.
  • In einer ersten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Aussetzen einer Blutzellprobe gegenüber einem lytischen Reagenzsystem, um reife rote Blutzellen zu lysieren; anschließend das Analysieren der Probenmischung in einer Flusszelle unter Verwendung von Lichtstreuungsmessung, um NRBCs zu unterscheiden; und das Belichten von NRBCs in der Blutzellprobe.
  • Ein Reagenzsystem, das für die vorliegende Erfindung geeignet ist, umfasst ein lytisches Reagenz umfassend eine ethoxylierte langkettige Aminverbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel
    Figure 00070001
    wobei R eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen, m und n je 1 oder mehr und m + n zwischen 20 und 40 ist, und eine Säure, um den pH des lytischen Reagenz innerhalb des Bereichs von 2,0 bis 3,6 zu halten; und ein hypertonisches, alkalisches Stabilisierungsreagenz.
  • Gegebenenfalls kann einer oder mehrere Lösungsvermittler in das lytische Reagenz in einer wirksamen Menge, um den Rückstand der roten Blutzellen zu reduzieren, eingeschlossen werden. Typischerweise sind die Lösungsvermittler Polyoxyethylen und Polyoxypropylen Kopolymere, und die ethoxylierten Alkohole haben einen HLB von 16 oder größer. Geeignete Kopolymere schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Pluronic Kopolymer (BASF Corporation, Parsippany, New Jersey), wie Pluronic F38 und Pluronic 25R8 und geeignete ethoxylierte Alkohole schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Plurafac A38 (BASF) und Hetoxol STA 30 (Heterene, Inc. Paterson, New Jersey).
  • Zusätzliche wahlweise Zusatzstoffe können auch in das lytische Reagenz in Konzentrationen eingeschlossen werden, dass ihre Anwesenheit verträglich ist mit den primären funktionellen Bestandteilen der lytischen Reagenzzusammensetzung. Unter diesen Zusatzstoffen sind Konservierungsmittel, die antioxidative Eigenschaften aufweisen, um die Lagerungszeit der Zusammensetzung zu steigern, und die anti-mikrobielle Eigenschaften aufweisen. Konservierungsmittel, die anti- oxidierende Eigenschaften aufweisen, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf EDTA und Butylmethylphenol. Konservierungsmittel mit anti-mikrobieller Aktivität schließen ein, aber nicht beschränkt auf Dimethyloldimethylhydantoin, Iodpropynylbutylcarbamat und Isothiozolonderivate.
  • Andere Reagenzsysteme, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, sind in dem US Patent Nr. 5,155,044 offenbart. Dieses Reagenzsystem verwendet eine hypotonische Säurelyse, um selektiv rote Blutzellen zu lysieren und ein anschließendes Hinzufügen einer Quenchinglösung um die lysierende Aktivität zu verzögern und Leukozyten für die unterscheidende Analyse zu schützen.
  • Die unterscheidende Analyse von NRBCs wird in einer Flusszelle mit einer Schutzflüssigkeit unter Verwendung von Lichtstreuungsmessung durchgeführt. Wenn ein Partikel wie eine Blutzelle durch die Apparatur einer Flusszelle wandert, streut sie das einfallende Licht von einem Laserstrahl in alle Richtungen. Die Lichtstreuungssignale können durch einen Lichtdetektor bei verschiedenen Winkeln relativ zu dem einfallenden Lichtstrahl zwischen 0° und 180° gemessen werden. Es wurde gefunden, dass jede Zellpopulation verschiedene Lichtstreuungseigenschaften aufweist, die entweder signifikant oder geringer sind, die für die Unterscheidung von verschiedenen Zellpopulationen verwendet werden könnten. Die Lichtstreuungssignale, die in weniger als 10° von dem einfallenden Licht nachgewiesen werden, werden für gewöhnlich als Kleinwinkel-Lichtstreuung bezeichnet. Die Lichtstreuungssignale, die von ungefähr 10° bis ungefähr 70° von dem einfallenden Licht nachgewiesen werden, werden als Mittelwinkel-Lichtstreuung bezeichnet, und die Lichtstreuungssignale, die bei ungefähr 90° des einfallenden Lichts nachgewiesen werden, werden als Rechtwinkel-Lichtstreuungen bezeichnet. Die Merkmale von Lichtstreuungssignalen werden durch die Größe einer Zelle, dem Inhalt einer Zelle und den Oberflächeneigenschaften einer Zelle beeinflusst.
  • Lichtstreuungssignale von einem Partikel oder einer Zelle, der/die durch die Flusszelle wandert, werden für die Zwecke dieser Erfindung verwendet. Zwei Winkel von Lichtstreuungssignalen werden für die Unterscheidung von NRBCs verwendet. Vorzugsweise ist einer der Lichtstreuungswinkel an Kleinwinkel-Lichtstreuungssignal, das weniger als 10° ist. Der bevorzugte Bereich des Kleinwinkel-Bestreuungssignals ist von ungefähr 0° bis ungefähr 4°. Der zweite Lichtstreuungswinkel ist ein Mittel- oder Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal.
  • Die 1 bis 4 zeigen eine Reihe von Streuungsdiagrammen einer klinischen Gesamt-Blutprobe, die 11 NRBC/100 WBC enthält, die verarbeitet und dem Verfahren folgend, das im Beispiel I beschrieben ist, analysiert wurde. In diesen Streuungsdiagrammen LS1 (ungefähr 1° bis ungefähr 3°) vs. LS2 (ungefähr 4° bis ungefähr 6°) in 1, LS1 vs. LS4 (ungefähr 6° bis ungefähr 8°) in 2, LS1 vs. LS5 (ungefähr 9° bis ungefähr 11°) in 3 und LS1 vs. LS3 (ungefähr 24° bis ungefähr 35°) in 4, bilden NRBCs ein Cluster, das sich eindeutig von dem Zellrückstand roter Blutzellen unterscheidet, der unter den NRBCs angegeben ist, und das sich eindeutig von Leukozyten unterscheidet (die außerhalb des Bereichs dieser Streuungsdiagramme sind). In einem Gleichstrommaßstab sind die NRBC-Populationen, die in 1 bis 4 beschrieben sind unter Lymphozyten in einer Region, die für gewöhnlich als eine Zellrückstandregion erachtet wird, wie in 5 gezeigt ist.
  • Die Unterscheidung von NRBCs durch Lichtstreuungsmessung ist einfach und geradeheraus. Sie verwendet einen herkömmlichen zwei-dimensionalen Dotplot, oder Streuungsdiagramm, um NRBCs von anderen Zelltypen zu unterscheiden. Die Zellpopulationen über dem NRBC-Cluster in LS1 werden als Gesamt-Leukozyten (WBC) gezählt. Zusätzlich kann ein anderes Verfahren verwendet werden, um die Gesamt-Leukozyten (WBC) zu bestimmen. Wenn eine Gleichstromnachweisvorrichtung ebenfalls verwendet wird, können die Zellpopulationen über dem minimalen Gleichstromvolumen der Leukozyten als Gesamt-Leukozyten gezählt werden. Die WBC, die in beiden dieser Verfahren erhalten wird, ist frei von NRBCs-Interferenz, und sie ist gleich zu der korrigierten WBC, die gebildet wird durch Abziehen einer NRBC-Zählung von einer Gesamt-Leukozyten-Zählung, die einen Beitrag von NRBC enthält.
  • Die NRBC-Konzentration der analysierten Probe kann berechnet werden durch Teile der gezählten Zellzahl im identifizierten NRBC-Cluster (1 bis 4) durch die gezählten Gesamtleukozyten (WBC) und Multiplizieren des Quotienten mit 100. Die NRBC-Konzentration kann als die Zahl von NRBC/100 WBC berichtet werden, die gleich ist zu der manuellen Berichtseinheit, oder sie kann als ein absoluter NRBC pro μl eines Gesamtblutes berichtet werden.
  • In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung kann eine unterscheidende Analyse von Leukozyten zusammen mit der Unterscheidung von NRBCs durchgeführt werden. Die unterscheidende Analyse kann unter Verwendung desselben Reagenzsystems und einer Probenpräparation in einer Ein-Schritt-Messung unter Verwendung von elektronischer und optischer Analyse durchgeführt werden. Die elektronische und optische Analyse schließt Lichtstreuungs- und Impedanzmessungen ein. Die Vorrichtung zur Gleichstrom-Impedanzmessung, die für die Leukozytenanalyse durch ein automatisches Hämatologieanalysiergerät verwendet wird, ist dem Fachmann bekannt und ist allgemein beschrieben in dem US Patent Nr. 5,125,737, an Rodriguez et al. Für die unterscheidende Analyse von NRBC und Leukozyten wird ein Lichtstreuungsdetektor verwendet, der in der Lage ist vielwinklige Lichtstreuungssignale von einem Partikel oder einer Zelle, der/die durch die Flusszelle wandert, nachzuweisen.
  • In 1 bis 4 liegen die Leukozyten außerhalb des Bereichs der dargestellten Streuungsdiagramme, und sie sind nicht in diesen Figuren gezeigt. Jedoch kann die Probenanalyse für Leukozytenunterscheidung und NRBC in einer Ein-Schritt-Messung durchgeführt werden. Die Datenanalyse für beide Unterscheidungen kann gleichzeitig unter Verwendung verschiedener Parameter, die von der Ein-Schritt-Messung erhalten werden, durchgeführt werden.
  • 5 ist ein Gleichstrom vs. LS3 (Mittelwinkel-Lichtstreuung, von ungefähr 24° bis ungefähr 35°) Streuungsdiagramm, das von einer frischen normalen Gesamt-Blutprobe erhalten wurde, die gemäß Beispiel II (die gleichen Reagenzien und Verfahren die in Beispiel I verwendet wurden) verarbeitet wurden. 5 zeigt vier verschiedene Cluster von Leukozyten-Subpopulationen, Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen. Die Probe wurde in einer Probenpräparation verarbeitet und gleichzeitig mit der NRBC-Unterscheidung analysiert. In dem Gleichstrom vs. LS3 Streuungsdiagramm werden alle Zellpopulationen über dem minimalen Gleichstromvolumen der Lymphozyten Population als Gesamt-Leukozyten (WBC) gezählt, die gleich ist zu den Populationen über dem NRBC-Cluster in dem LS1 vs. LS2 Streuungsdiagramm.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung berichtet zum ersten Mal über das Unterscheiden und Zählen von kernhaltigen roten Blutzellen ohne die Verwendung von Kernfärbung und Fluoreszenz. Die Eliminierung von Kernfärbung liefert Vorteile hinsichtlich der Verringerung der Instrumenten- und Flüssigsystempflege aufgrund von Farbstoffkontamination, der Verringerung der Systemsensitivität gegenüber einer Reagenzüberladung und der Verringerung der Reagenzkosten aufgrund von teuren Fluoreszenzfarbstoffen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist schnell, zuverlässig und für die automatisierte Blutanalyse geeignet. Zusätzlich ist die Nachweistechnik weniger komplex und nicht teuer im Vergleich zum Fluoreszenzverfahren.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren liefert einen Vorteil da es vollständig bei Raumtemperatur, 18 bis 28°C, arbeitet. Verfahren des Standes der Technik arbeiten bei erhöhter Temperatur zum Unterscheiden von Leukozyten-Subpopulation oder dem Unterscheiden von NRBCs. Diese Notwendigkeit der erhöhten Temperatur erfordert Analyseinstrumente, die wesentlich komplexer und teuerer sind. Es ruft auch stressigere Bedingungen für die zu analysierenden biologischen Zellen hervor.
  • Ein anderes vorteilhaftes Merkmal dieser Erfindung ist seine Nützlichkeit für die unterscheidende Analyse von anderen Flüssigkeitsproben, wie Knochenmark, und Blutproben von nicht-menschlichen Spezies.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden werden. Jedoch wird verstanden, dass die Erfindung nicht auf die beschriebenen Beispiele beschränkt ist.
  • Beispiel I
  • Zu 28 μl einer EDTA-antikoagulierten klinischen Gesamt-Blutprobe wurden 417 μl eines lytischen Reagenz umfassend 0,18% Ameisensäure, 2% eines ethoxylierten langkettigen Amins, dargestellt durch die Formel:
    Figure 00120001
    wobei R ein Stearyl und m + n gleich 27 ist, 1,4% Plurafac A38 als ein Lösungsvermittler und Konservierungsmittel hinzugefügt und in einer Mischkammer in einem experimentellen Hämatologieanalysiergerät für ungefähr 4 Sekunden gemischt. Anschließend wurden 180 μl eines stabilisierenden Reagenz umfassend 1,4% NaCl, 3,2% Na2SO4 und 0,66% Na2CO3, mit einem pH von 11,0, hinzugefügt und gemischt, um die lytische Reaktion zu verzögern.
  • 10 Sekunden nach dem Hinzufügen des stabilisierenden Reagenz wurde die Probenmischung in eine Flusszelle mit einer Schutzflüssigkeit, ISOTON® III Verdünnung (Produkt von Coulter Corporation, Miami, Florida) für NRBC und Leukozyten unterscheidende Analysen in einem experimentellen Hämatologieanalysiergerät gegeben, das mit Gleichstrom- und Lichtstreuungsdetektoren ausgestattet war.
  • Der Lichtstreuungsdetektor detektiert Lichtstreuungssignale von einer Zelle, die durch die Flusszelle wandert, in verschiedenen Bereichen von Winkeln, d.h. von ungefähr 1° bis ungefähr 3° (LS1), von ungefähr 4° bis ungefähr 6° (LS2), von ungefähr 6° bis ungefähr 8° (LS4), von ungefähr 9° bis ungefähr 11° (LS5), von ungefähr 24° bis ungefähr 35° (LS3) und größeren Winkeln.
  • Die resultierenden Streuungsdiagramme sind in 1 bis 4 dargestellt. Diese Figuren zeigen ein Cluster von NRBCs, das von Zellrückstand roter Blutzellen (unten) und Leukozyten (oben, aber außerhalb des Bereichs der Streuungsdiagramme) in den LS1 vs. LS2, LS1 vs. LS4, LS1 vs. LS5 und LS1 vs. LS3 Streuungsdiagrammen unterschieden wird.
  • Die NRBC-Konzentration der analysierten Probe wird berechnet durch Teilen der gezählten Zahl in dem identifizierten NRBC-Cluster (1 bis 4) durch die gezählten Gesamt-Leukozyten (WBC) und Multiplizieren des Quotienten mit 100. Die NRBC-Konzentration wird als Zahl von NRBC/100 WBC berichtet, welche dieselbe ist wie die manuelle Berichtseinheit. Für diese Probe berichtete das manuelle Referenzverfahren 11 NRBC/100 WBC, und das oben beschriebene Verfahren berichtete ungefähr 12 NRBC/100 WBC.
  • Beispiel II
  • Eine frische normale Gesamt-Blutprobe wurde unter Verwendung der gleichen Reagenzien und Verfahren, die im Beispiel I beschrieben sind, analysiert. Die Probenmischung wurde gleichzeitig in einer Flusszelle auf demselben Hämatologieanalysiergerät, das in Beispiel I für die Leukozytenunterscheidung und NRBC-Unterscheidung verwendet wurde, analysiert. 5 ist ein erhaltenes Gleichstrom- vs. LS3-Streuungsdiagramm, das vier verschiedene Cluster von Leukozyten-Subpopulationen, Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen zeigt.
  • Beispiel III
  • Zu 28 μl einer EDTA-antikoagulierten klinischen Gesamt-Blutprobe wurden 449 μl eines lytischen Reagenz, das aus 0,12% Ameisensäure und 0,07% Saponin zusammengesetzt ist, hinzugefügt und in einer Mischkammer in einem Hämatologieanalysiergerät für ungefähr 5 Sekunden gemischt. Danach wurden 177 μl desselben stabilisierenden Reagenz, das in Beispiel I beschrieben ist, hinzugefügt und gemischt, um die lytische Reaktion zu inhibieren.
  • Ungefähr 8 Sekunden nach dem Hinzufügen des stabilisierenden Reagenz wurde die Probenmischung in eine Flusszelle mit einer Schutzflüssigkeit, ISOTON® III Verdünner, für die NRBC und Leukozyten unterscheidende Analyse auf demselben Hämatologieanalysiergerät das in Beispiel I beschrieben ist, gegeben. 6 ist das resultierende LS1 vs. LS2 Streuungsdiagramm (im selben Maßstab wie in 1), das ein NRBC-Cluster getrennt von anderen Zelltypen zeigt.
  • Beispiel IV
  • 4 μl Alligatorblut wurden mit 4,15 ml des lytischen Reagenz vom Beispiel I in einem Testgefäß manuell für ungefähr 4 Sekunden gemischt. 1,8 ml des stabilisierenden Reagenz aus Beispiel I wurden hinzugefügt, und die Probenmischung wurde manuell gemischt und in das Hämatologieanalysiergerät, das in Beispiel I beschrieben ist, eingeführt. 7 ist das erhaltene LS1 vs. LS5 Streuungsdiagramm. Wie gezeigt ist, bildeten die NRBCs ein abgegrenztes Cluster.

Claims (15)

  1. Verfahren zum Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen in einer Blutprobe, welches (a) das Bereitstellen einer Blutprobe für die Analyse, (b) das Lysieren von reifen roten Blutzellen aus der Blutprobe, (c) das Analysieren der Blutprobe durch das Nachweisen von zwei Lichtstreuungssignalen bei zwei Winkeln, um die kernhaltigen roten Blutzellen von anderen Zelltypen zu unterscheiden, wobei das zweite Lichtstreuungssignal eines ist, ausgewählt aus einem Mittelwinkel-Lichtstreuungssignal, nachgewiesen bei einem Winkel größer als 10° bis etwa 70° des einfallenden Lichts, und einem Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal, nachgewiesen bei einem Winkel von etwa 90° des einfallenden Lichts, und (d) das Berichten von kernhaltigen roten Blutzellen in der Blutprobe umfaßt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Lichtstreuungssignal ein Kleinwinkel-Lichtstreuungssignal ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das erste Lichtstreuungssignal in einem Bereich von 0° bis 4° ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das zweite Lichtstreuungssignal ein Mittel-Lichtstreuungssignal ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das zweite Lichtstreuungssignal ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Berichten der kernhaltigen roten Blutzellen eine absolute Anzahl von kernhaltigen roten Blutzellen pro Volumeneinheit einer Blutprobe ist.
  7. Verfahren zum Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen und Leukozyten in einer Blutprobe, welches (a) das Bereitstellen einer Blutprobe für die Analyse, (b) das Lysieren von reifen roten Blutzellen aus der Blutprobe, (c) das Analysieren der Blutprobe durch Gleichstrom-Impedanz und Lichtstreuungsmessungen, um kernhaltige rote Blutzellen von anderen Zelltypen zu unterscheiden und um Leukozyten-Subpopulationen zu unterscheiden, wobei die Lichtstreuungsmessung, die für das Unterscheiden kernhaltiger roter Blutzellen verwendet wird, unter Verwendung von zwei Winkeln von Lichtstreuungssignalen durchgeführt wird und wobei das zweite Lichtstreuungssignal zum Unterscheiden von kernhaltigen roten Blutzellen eines ist, ausgewählt aus einem Mittelwinkel-Lichtstreuungssignal, nachgewiesen bei einem Winkel größer als 10° bis etwa 70° des einfallenden Lichts, und ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal, nachgewiesen bei einem Winkel von etwa 90° des einfallenden Lichts, und (d) das Berichten von kernhaltigen roten Blutzellen und Leukozyten-Subpopulationen in der Blutprobe umfaßt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das erste Lichtstreuungssignal ein Kleinwinkel-Lichtstreuungssignal ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das erste Lichtstreuungssignal in einem Bereich von 0° bis 4° ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das zweite Lichtstreuungssignal ein Mittel-Lichtstreuungssignal ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das zweite Lichtstreuungssignal ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei die Leukozyten-Subpopulationen aus Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen ausgewählt sind.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei das Berichten der Leukozyten-Subpopulation in absoluter Anzahl pro Volumeneinheit der Blutprobe oder in einem Prozentsatz der Gesamt-Leukozyten in der Blutprobe stattfindet.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei das Berichten der kernhaltigen roten Blutzellen in der Anzahl von kernhaltigen roten Blutzellen pro hundert Leukozyten oder einer absoluten Anzahl von kernhaltigen roten Blutzellen pro Volumeneinheit einer Blutprobe ist.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Blutprobe aus peripherem Blut eines Menschen, peripherem Blut eines Nicht-Menschen, Knochenmark eines Menschen, Knochenmark eines Nicht-Menschen ausgewählt ist.
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