DE69926407T2

DE69926407T2 - Behandlung von krebs mit tetraethylthiuramdisulfid

Info

Publication number: DE69926407T2
Application number: DE69926407T
Authority: DE
Inventors: Preston Thomas KENNEDY
Original assignee: Charlotte Mecklenburg Hospital
Current assignee: Charlotte Mecklenburg Hospital
Priority date: 1999-09-08
Filing date: 1999-11-15
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2019-11-16
Also published as: WO2001017522A1; DE69926407D1; CA2384059C; US6589987B2; EP1214063A1; AU2025500A; JP2003514769A; US20030065026A1; CA2384059A1; ES2244237T3; ATE300291T1; AU782029B2; EP1214063B1

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Diese Erfindung betrifft allgemein Verwendungen zur Behandlung von Krebs und insbesondere Verwendungen zur Behandlung von Krebs unter Verwendung von Dithiocarbamat.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs, das unkontrollierte Wachstum bösartiger Zellen, ist ein sehr grobes Gesundheitsproblem der modernen medizinischen Ära und rangiert in den USA auf dem zweiten Platz nur nach Herzerkrankung als einer Todesursache. Während einige Malignitäten, wie etwa Adenokarzinom der Brust und Lymphoma, wie etwa Hodgkins-Krankheit, relativ gut auf gegenwärtige chemotherapeutische antineoplastische Wirkstoff-Behandlung reagieren, reagieren andere Krebsarten schlecht auf Chemotherapie, insbesondere nicht-kleinzelliger Lungenkrebs und Bauchspeicheldrüsen-, Prostata- und Darmkrebsarten. Selbst der kleinzellige Krebs der Lunge, der anfänglich Chemotherapie gegenüber empfindlich ist, tendiert dazu, nach Remission mit weit verbreiteter Metastasenverteilung zurückzukehren, was zum Tod des Patienten führt. Daher sind für diese Krankheit bessere Behandlungsansätze notwendig. Da auch alle gegenwärtig erhältlichen antineoplastischen Mittel signifikante Toxizität aufweisen, wie etwa Knochenmarkssuppression, Nierendysfunktion, Stomatitis, Enteritis und Haarverlust, wäre es ein sehr großer Vorteil, ein relativ weniger toxisches Mittel zur Verfügung zu haben, zur Verwendung allein oder in Kombination mit gegenwärtigen Wirkstoffen, um den Patienten besser zu behandeln, ohne Schaden durch die Therapie selbst zu riskieren.
In jüngerer Zeit ist gezeigt worden, dass Dithiocarbamate, welche eine reduzierte Sulfhydryl-Gruppe enthalten, z.B. Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC), die Proliferation von kultivierten, vaskulären, glatten Muskelzellen sowie kultivierter, kolorektaler Krebszellen inhibieren. Siehe z.B. Tsai et al., J. Biol. Chem. 271:3667–3670 (1996); Chinery et al., Nature Med. 11:1233–1241 (1997); Chinery et al., Cancer Res. 58:2323–2327 (1998). Es ist vorgeschlagen worden, dass Antioxidantien mit einer reduzierten Sulfhydryl-Gruppe zur Behandlung von kolorektalem Krebs verwendet werden können.
Dithiocarbamate, wie etwa Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC) und Diethyldithiocarbamat (DEDC) inhibieren laut Berichten Apoptose in verschiedenen Zelltypen, z.B. in Rattenthymocyten und Jurkat T-Lymphocyten, bei Kurzzeit-Inkubationen. Siehe z.B. Nobel et al., Chem. Res. Toxicol. 10(6):636–643 (1997). In diesem Artikel wird offenbart, dass Kupfer bei der Inhibierung von Apoptose durch PDTC und DEDC erforderlich ist. Es wird auch offenbart, dass Thiuramdisulfide, wie etwa Disulfiram (oxidiertes Disulfid von Diethyldithiocarbamat, welches keine reduzierte Sulfhydryl-Gruppe enthält) viel potentere Apoptose- Inhibitoren sind als PDTC oder DEDC. Darüber hinaus ist, verglichen mit den reduzierten Molekülen, Disulfiram-Inhibierung von Thymocyten-Apoptose nicht abhängig von Kupfer.
In einem anderen Bericht wird jedoch berichtet, dass bei Langzeit-Inkubierung mit Ratten-Thymocyten sowohl die reduzierten Dithiocarbamate als auch ihre Disulfide fähig sind, Apoptose zu induzieren. Siehe Burkitt et al., Arch. Biochem. Biophysics 353(1):73–84 (1998). Reduzierte Dithiocarbamate erfordern jedoch Kupfer, während die Thiuramdisulfid-Induktion von Apoptose durch das Entfernen von Kupferionen im Wesentlichen nicht beeinflusst wird. Es wird vorgeschlagen, dass Kupferionen zur Oxidation von Dithiocarbamaten zu Thiuramdisulfiden erforderlich sind, aber nicht erforderlich sind für die Apoptose induzierende Wirkung von Thiuramdisulfiden. Siehe Nobel et al., J. Biol. Chem. 270:26202–26208 (1995); Burkitt et al., Arch. Biochem. Biophysics 353(1):73–84 (1998).
Der antioxidierende Effekt von Disulfiram ist im Fachbereich ebenfalls untersucht worden. Rao et al., Jpn. J. Cancer Res. 80(12)1171–5 (1989) untersucht die Wirkung von Disulfiram auf transmammäre Karzinogese-Induktion in Mäusen durch Anthracen. Es wird offenbart, dass mit Anthracen assoziiertes Tumor-Auftreten bei säugenden Müttermäusen, welche mit Disulfiram vorbehandelt wurden, geringer ist als bei den unbehandelten. Es wird vorgeschlagen, dass Disulfiram der Wirkung des karzinogenen Anthracens entgegenwirken kann, und damit transmammäre Karzinogese in Mäusen inhibieren kann.
Mashiba et al., Toxicol. Lett. 61(1):75–80 (1992) offenbart, dass die kombinierte Verwendung von Disulfiram mit dem antioxidierenden Enzym Katalase Inhibierung von Zellproliferation induziert. Es wird vorgeschlagen, dass die Antiproliferationswirkung auf die Bildung von Verbindungen oder Metaboliten mit zytostatischer Aktivität als ein Ergebnis der Reaktion von Disulfiram mit Katalase zurückzuführen ist.
Mashiba et al., Jpn. J. Exp. Med. 60(4):209–14 (1990) untersucht die Rollen von freien Sauerstoff-Radikalen bei der Inhibierung von Tumorzellen-Proliferation. Disulfiram wird als ein Metallchelator zum Inaktivieren von Superoxid-Dismutase verwendet. Ascorbinsäure wird verwendet, um Katalase zu inhibieren. Es wird offenbart, dass Meth A-Tumorzellen-Proliferation bei simultaner Zugabe von Disulfiram und Ascorbinsäure inhibiert wird. Es wird vorgeschlagen, dass die kombinierte Verwendung von Disulfiram und Ascorbinsäure die intrazellulären freien Sauerstoff-Radikale innerhalb der Tumorzellen erhöht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer bei einem Säugetier festgestellten Krebserkrankung bereitgestellt.
Es ist entdeckt worden, dass Thiuramdisulfid in Abwesenheit von Katalase oder Ascorbinsäure allein potente inhibitorische Wirkung auf festgestellte Tumorzellen aufweist. Disulfiram ist sogar wirksam bei der Inhibierung des Wachstums von festgestellten Melanomzellen und nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen, von denen bekannt ist, dass sie schlecht auf gegenwärtig erhältliche antineoplastische Mittel reagieren.
Zusätzlich ist, im Gegensatz zu den oben diskutierten Lehren des Standes der Technik, weiter überraschend entdeckt worden, dass die antiproliferative und antineoplastische Wirkung von Disulfiram auf festgestellte Tumorzellen Schwermetallionen-abhängig ist. Ferner kann die Inhibierungswirkung von Disulfiram auf Tumorzellwachstum signifikant erhöht werden durch die Zugabe von Schwermetallionen, wie etwa Kupfer-, Zink-, Gold- und Silberionen, oder eines Schwermetallionen-Stimulanz, z.B. Ceruloplasmin oder einem Cytokinen, welches eine Akute-Phase-Reaktion in den Tumorzellen induzieren kann.
Diese Erfindung stellt auch Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von bei einem Patienten festgestellten Krebs bereit. Vorteilhaft wird ein Tetralkylthiuramdisulfid, wie etwa Tetraethylthiuramdisulfid, besser bekannt als Disulfiram, verwendet.
Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von bei einem Patienten festgestellten Krebs, vorzugsweise Disulfiram, und eines Schwermetallions bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Schwermetallion als ein Komplex oder Chelat mit dem Thiuramdisulfid verabreicht. Geeignete Schwermetallionen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Ionen von Arsen, Wismut, Kobalt, Kupfer, Chrom, Gallium, Gold, Eisen, Mangan, Nickel, Silber, Titan, Vanadium, Selen und Zink. In einer weiteren bevorzugen Ausführungsform werden das Thiuramdisulfid und das Schwermetallion in Kombination mit einem weiteren Anti-Krebs-Mittel verabreicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids, vorzugsweise Disulfiram, und Ceruloplasmin für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von bei einem Patienten festgestellten Krebs bereitgestellt.
Die aktiven Verbindungen dieser Erfindung können über vielfältige Verabreichungsrouten verabreicht werden. Beispielsweise können sie oral, intravenös, intradermal, subkutan oder topisch verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung ist wirksam zur Behandlung verschiedener Typen von Krebs, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Melanome, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Nierenkrebs, kolorektalem Krebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Magenkrebs, Blasenkrebs, Ovarienkrebs, Uteruskrebs, Lymphomen- und Prostatakrebs. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung besonders wirksam bei der Behandlung von Melanomen, Lungenkrebs, Brustkrebs und Prostata-Karzinomen.
Thiuramdisulfide, wie etwa Disulfiram, sind klinisch über viele Jahre bei der Behandlung verschiedener anderer Krankheiten, wie etwa Alkoholmissbrauch, verwendet worden und haben sich als relativ nicht-toxisch und sicher herausgestellt. (Disulfiram ist als eine orale Formulierung in den USA als Antabuse^® von Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA erhältlich.) Damit stellt die erfindungsgemäße Verwendung von Thiuramdisulfiden eine leicht erhältliche und leicht verwendete Behandlung für Krebsarten in Menschen und anderen Säugern bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt, dass Disulfiram Proliferation von M1619 menschlichen Melanom-Zelllinien inhibiert;
1B zeigt, dass der zell-undurchlässige Cu²⁺-Chelator Bathocuproindisulfonsäure Wachstumsinhibierung durch Disulfiram verhindert.
1C ist ein schematisches Diagramm, welches zeigt, dass Ergänzung von Wachstumsmedium mit Kupfer die antiproliferative Aktivität von Disulfiram verstärkt.
1D zeigt, dass Ceruloplasmin als eine Quelle für Kupfer zur Verstärkung der antiproliferativen Aktivität von Disulfiram dienen kann.
2A zeigt das Ergebnis eines Vergleichsexperiments, in welchem M1619-Melanom-Zellen mit DMSO-Vehikel behandelt wurden.
2B zeigt, dass Apoptose in M1619-Melanom-Zellen, welche mit 5 μM Disulfiram behandelt wurden, induziert wurde.
3A zeigt die flusszytometrische Analyse des Wachstums von unsynchronisierten M1619-Melanom-Zellen in der Gegenwart von DMSO-Vehikel.
3B zeigt die flusszytometrische Analyse von Zellen, welche mit 5 μM Disulfiram behandelt wurden, welche zeigt, dass Disulfiram die Anzahl von Zellen in G₀-G₁ verringert und den Anteil des Zellzyklus in S-Phase in M1619-Melanom-Zellen erhöht.
3C zeigt die flusszytometrische Analyse von Zellen, welche mit 5 μM Disulfiram plus 250 μg/ml Ceruloplasmin (Cerulo) behandelt wurden, welche G₂-Zell-Zyklus-Arrest und Apoptose in M1619-Melanom-Zellen induzieren.
4 zeigt, dass antiproliferative Aktivität von Disulfiram nicht durch Stickoxid vermittelt wird.
5A ist eine Fotografie einer Western Blot Analyse von Cyclin A Expression in M1619-Zellen, welche mit DMSO oder Disulfiram behandelt wurden. 5A zeigt, dass Disulfiram plus Kupfer Expression des Zell-Zyklus-Proteins Cyclin A verringert.
5B ist eine Fotografie eines Gel-Shift-Assays, welches zeigt, dass Disulfiram und Kupfer Transkriptions-Faktor-Bindung an das cAMP responsive Element (CRE) inhibieren.
5C ist eine Fotografie eines Gel-Shift-Assays, in welchem Disulfiram oder Disulfiram plus Kupfer direkt zu der Bindungsreaktion zugefügt wurden.
6A zeigt, dass Zink die antiproliferative Aktivität von Disulfiram potenziert.
6B zeigt, dass die antiproliferative Aktivität von Disulfiram durch Ergänzung des Mediums mit anderen Schwermetallen verstärkt wird.
6C zeigt, dass Komplexe von Disulfiram mit Gold erhöhte antiproliferative Aktivität zeigen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nun hiernach vollständiger unter Bezugnahme auf die begleitenden Beispiele beschrieben, in welchen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gezeigt sind. Diese Erfindung kann jedoch in vielen verschiedenen Formen ausgeführt werden und sollte nicht als auf die hierin aufgeführten Ausführungsformen beschränkt angesehen werden; diese Ausführungsformen sind vielmehr bereitgestellt, damit diese Offenbarung gründlich und vollständig ist und den Fachleuten auf diesem Gebiet den Umfang der Erfindung vollständig vermittelt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Thiuramdisulfide" auf Verbindungen mit der Formel:
wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, und unsubstituierte oder substituierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Alkoxy- und Heteroaryl-Gruppen bedeuten. Es wird angemerkt, dass die Alkyl-Gruppen Cycloalkyl- und Heterocycloalkyl-Gruppen umfassen können. R₁, R₂ und das N-Atom in der Formel können zusammen einen N-heterocyklischen Ring ausbilden, welcher zum Beispiel Heterocycloalkyl oder Heterocycloaryl ist. Ähnlich können R₃, R₄ und das N-Atom in der Formel zusammen einen N-heterocyclischen Ring bilden, welcher zum Beispiel Heterocycloalkyl oder Heterocycloaryl ist. Typischerweise sind R₁ und R₂ nicht beide Wasserstoff, und sind R₃ und R₄ nicht beide Wasserstoff. Damit ist Thiuramdisulfid eine Disulfid-Form von Dithiocarbamaten, welche eine reduzierte Sulfhydryl-Gruppe haben. Viele Dithiocarbamate sind bekannt und im Fachbereich synthetisiert worden. Nicht einschränkende Beispiele für Dithiocarbamate umfassen Diethyldithiocarbamat, Pyrrolidindithiocarbamat, N-Methyl-, N-Ethyldithiocarbamate, Hexamethylendithiocarbamat, Imadazolindithiocarbamate, Dibenzyldithiocarbamat, Dimethylendithiocarbamat, Dipropyldithiocarbamat, Dibutyldithiocarbamat, Diamyldithiocarbamat, N-Methyl-, N-Cyclopropylmethyldithiocarbamat, Cyclohexylamyldithiocarbamat, Pentamethylendithiocarbamat, Dihydroxyethyldithiocarbamat, N-Methylglucosamindithiocarbamat und Salze und Derivate davon. Typischerweise kann ein Sulfhydryl-enthaltendes Dithiocarbamat oxidiert werden, um ein Thiuramdisulfid zu bilden.
Es kann eine jegliche pharmazeutisch akzeptable Form von Thiuramdisulfiden wie oben definiert verwendet werden. Beispielsweise wird Tetraalkylthiuramdisulfid, vorzugsweise Tetraethylthiuramdisulfid, welches als Disulfiram bekannt ist, in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Disulfiram hat die folgende Formel:
wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ alle Ethyl sind. Disulfiram ist klinisch bei der Behandlung von Alkoholmissbrauch verwendet worden, wobei Disulfiram hepatische Aldehyd-Dehydrogenase inhibiert. Verfahren zum Herstellen von Thiuramdisulfiden sind allgemein im Fachbereich bekannt. Beispielhafte Verfahren sind beispielsweise offenbart in Thorn, et al., The Dithiocarbamates and Related Compounds, Elsevier, New York, 1962 und US-Patenten Nr. 5,166,387, 4,144,272, 4,066,697, 1,782,111 und 1,796,977.
Der Begriff "Krebs behandeln", wie hierin verwendet, bezieht sich spezifisch auf Verabreichen von therapeutischen Mitteln an einen Patienten, bei welchem Krebs diagnostiziert wurde, d.h. Krebs bei einem Patienten festgestellt wurde, um weiteres Wachstum oder Verbreitung der bösartigen Zellen in dem Krebsgewebe zu inhibieren und/oder den Tod der bösartigen Zellen zu verursachen.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Behandeln von Krebs bei einem Patienten bereit. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist entdeckt worden, dass Thiuramdisulfide, wie etwa Disulfiram, das Wachstum von Tumorzellen in einer Schwermetallionen-abhängigen Weise inhibieren können. Insbesondere verstärken Schwermetallionen, wie etwa Kupfer, Zink-, Gold- und Silberionen die inhibierende Wirkung der Thiuramdisulfide auf Tumorzellen signifikant, während die Verarmung an solchen Schwermetallionen Wachstumsinhibierung durch Disulfiram verhindert.
Dementsprechend wird gemäß einem Aspekt dieser Erfindung eine Verwendung zum Behandeln eines festgestellten Krebses bei einem Patienten bereitgestellt. Einem Patienten, bei dem Krebs festgestellt wurde, kann Thiuramdisulfid verabreicht werden, um den Krebs zu behandeln. Vorzugsweise ist das verabreichte Thiuramdisulfid ein Tetraalkylthiuramdisulfid, wie etwa Tetraethylthiuramdisulfid, d.h. Disulfiram.
Unter einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von Krebs in einem Patienten bereitgestellt.
Nicht einschränkende Beispiele für Schwermetallionen umfassen Ionen von Arsen, Wismut, Kobalt, Kupfer, Chrom, Gallium, Gold, Eisen, Mangan, Nickel, Silber, Titan, Vanadium, Selen und Zink. Vorzugsweise werden Gold-, Silber-, Zink-, Selen- und Kupferionen verwendet. Quellen für solche Schwermetallionen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Beispielsweise können solche Ionen in einer Sulfatsalz- oder Chloridsalzform bereitgestellt werden, oder jeglichen anderen pharmazeutisch geeigneten Formen.
Es können einem Patienten eine oder mehrere Thiuramdisulfid-Verbindungen und ein oder mehr Schwermetallionen verabreicht werden. Die Thiuramdisulfid-Verbindung und das Schwermetallion können in Kombination oder getrennt voneinander verabreicht werden. Vorzugsweise werden sie als ein Chelat-Komplex verabreicht. Wie im Fachbereich bekannt ist, sind Thiuramdisulfid-Verbindungen exzellente Chelatbildner und können Schwermetallionen als Chelat komplexieren, um Chelate zu bilden. Herstellung von Chelaten von Thiuramdisulfid-Verbindungen und Schwermetallionen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Beispielsweise können Chelate von Disulfiram und Kupfer-, Zink-, Silber- oder Goldionen ohne Weiteres synthetisiert werden durch Mischen von Disulfiram mit z.B. CuSO₄, ZnCl₂, C₃H₅AgO₃ oder HAuCl₄·3H₂O in einem geeigneten Lösungsmittel, um zu ermöglichen, dass Chelate gebildet werden. Andere Thiuramdisulfid-Verbindungs-Schwermetallionen-Chelate sind beispielsweise offenbart in Burns et al., Adv. Inorg. Chem. Radiochem. 23:211–280 (1980).
Gemäß einem anderen Aspekt dieser Erfindung wird Verwendung einer wirksamen Menge einer Disulfid-Verbindung und eines intrazellulären Schwermetallionen-Stimulanz bereitgestellt, welches den intrazellulären Gehalt an den oben beschriebenen Schwermetallionen in dem Patienten erhöhen kann.
Es sind intrazelluläre Schwermetallionen-Träger bekannt. Beispielsweise kann dem Patienten Ceruloplasmin verabreicht werden, um den intrazellulären Kupfergehalt zu erhöhen. Andere Schwermetallionen-Träger, welche im Fachbereich bekannt sind, können gemäß diesem Aspekt der Erfindung ebenfalls verabreicht werden. Die Schwermetallionen-Träger und die Thiuramdisulfid-Verbindung können zusammen oder getrennt und vorzugsweise in getrennten Zusammensetzungen verabreicht werden.
Ceruloplasmin ist ein Protein, welches natürlicherweise von dem menschlichen Körper produziert wird und aus menschlichem Serum gereinigt werden kann. Dieses 132-kD-Glycoprotein, welches 7 Kupferatome trägt, welche über drei 42–45 kD-Domänen komplexiert sind, ist ein Akute-Phase-Reaktant und das Haupt-Kupfer-tragende Protein in menschlichem Plasma. Siehe Halliwell, et al., Methods Enzymol 186:1–85 (1990). Nach Transport in Zellen können wenigstens einige der gebundenen Kupferionen für Komplexierung mit der Thiuramdisulfid-Verbindung, welche dem Patienten verabreicht wurde, zugänglich sein. Percival, et al., Am. J. Physiol. 258:3140–3146 (1990).
Ceruloplasmin kann aus tierischem oder menschlichem Serum isoliert werden. Alternativ kann genmanipuliertes Ceruloplasmin auch in vitro in, z.B., Bakterien, Hefe, Pflanzen-, Tier- oder menschlichen Zellen exprimiert und daraus gereinigt werden. Ceruloplasmin und Thiuramdisulfid werden typischerweise in unterschiedlichen Zusammensetzungen verabreicht. Thiuramdisulfid und Ceruloplasmin können zu etwa der gleichen Zeit oder in einigem zeitlichen Abstand verabreicht werden. Zum Beispiel kann Ceruloplasmin dem Patienten von etwa fünf Minuten bis etwa 12 Stunden vor oder nach Thiuramdisulfid-Verabreichung verabreicht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung kann das Verfahren dieser Erfindung in Kombination mit einer herkömmlichen Anti-Krebs-Therapie verwendet werden. Zum Beispiel kann das Verfahren gemäß dieser Erfindung durch eine herkömmliche Strahlentherapie oder Chemotherapie ergänzt werden. In einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst es das erfindungsgemäße Verfahren damit, einem Patienten eine Thiuramdisulfid-Verbindung und Schwermetalle und ein weiteres Anti-Krebs-Mittel zu verabreichen.
Behandlung durch Ceruplasmin und eine Thiuramdisulfid-Verbindung kann auch zusammen mit der Behandlung mit einem anderen Anti-Krebs-Mittel durchgeführt werden.
Jegliche Anti-Krebs-Mittel, welche im Fachbereich bekannt sind, können in dieser Erfindung verwendet werden, solange sie pharmazeutisch kompatibel sind mit den Thiuramdisulfid-Verbindungen, Schwermetallionen und/oder Ceruloplasmin, welche verwendet werden. Mit "pharmazeutisch kompatibel" ist gemeint, dass das andere Anti-Krebs-Mittel mit der obigen Zusammensetzung nicht direkt oder indirekt derart wechselwirken oder reagieren wird, dass die Wirkung der Krebsbehandlung negativ beeinflusst wird oder irgendeine signifikante, beeinträchtigende Nebenreaktion bei dem Patienten verursacht.
Beispiele für Anti-Krebs-Mittel, welche im Fachbereich bekannt sind, umfassen Cisplatin, Carmustin, Herceptin, Carboplatin, Cyclophosphamid, Nitrosoharnstoffe, Fotemustin, Vindesin, Etoposid, Daunorubicin, Adriamycin, Taxol, Taxoter, Fluorouracil, Methotrexat, Melphalan, Bleomycin, Salicylate, Aspirin, Piroxicam, Ibuprofen, Indomethacin, Maprosyn, Diclofenac, Tolmetin, Ketoprofen, Nabumeton, Oxaprozin, Doxirubicin, nicht-selektive Cyclooxygenase-Inhibitoren, wie etwa nicht-steroidale Anti-Entzündungs-Mittel (nonsteroidal anti-inflammatory agents NSAIDS) und selektive Cyclooxygenase-2 (COX-2) Inhibitoren.
Das verwendete Anti-Krebs-Mittel kann simultan in der gleichen pharmazeutischen Präparation mit der Thiuramdisulfid-Verbindung, Schwermetallionen und/oder Ceruloplasmin wie oben beschrieben verabreicht werden. Das Anti-Krebs-Mittel kann auch zu etwa der gleichen Zeit, aber durch eine getrennte Verabreichung verabreicht werden. Alternativ kann das Anti-Krebs-Mittel zu einer unterschiedlichen Zeit wie die der Verabreichung von Thiuramdisulfid-Verbindung, Schwermetallionen, und/oder Ceruloplasmin verabreicht werden. Es kann ein geringer Grad an Experimentierarbeit von Nöten sein, um die beste Art und Weise der Verabreichung zu bestimmen, wobei dies sehr wohl innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns liegt, welcher die vorliegende Offenbarung kennt.
Die Verfahren gemäß dieser Erfindung sind geeignet zur Behandlung von Krebsarten in Tieren, insbesondere Säugetieren, wie etwa Hunden, Rindern, Schweinen und anderen Tieren. Vorteilhaft werden die Verfahren zur Behandlung von menschlichen Patienten verwendet. Die Verfahren sind nützlich zur Behandlung verschiedener Krebstypen, einschließlich Melanomen, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Nierenkrebs, kolorektalem Krebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Magen-Krebs, Blasen-Krebs, Eierstock-Krebs, Uterus-Krebs, Lymphomen und Prostata-Krebs, jedoch nicht auf diese beschränkt. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung besonders wirksam bei der Behandlung von Melanomen, Lungenkrebs, Brustkrebs und Prostata-Krebs.
Die aktiven Verbindungen gemäß dieser Erfindung werden typischerweise in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger über jegliche geeignete Routen, wie etwa parenteral, intravenös, oral, intradermal, subkutan oder topisch verabreicht. Die erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen werden in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht, um den erwünschten therapeutischen Effekt zu erzielen, ohne ernsthafte Nebenwirkungen bei dem behandelten Patienten zu verursachen.
Die Thiuramdisulfid-Verbindung Disulfiram kann wirksam sein, wenn sie in einer Menge verabreicht wird, welche innerhalb der herkömmlichen klinischen Bereiche liegt, welche im Fachbereich bestimmt wurden. Typischerweise kann sie in einer Menge von etwa 125 bis etwa 1000 mg pro Tag wirksam sein, bevorzugt von etwa 250 bis etwa 500 mg pro Tag. Die Menge kann jedoch in Abhängigkeit von dem Körpergewicht des behandelten Patienten veränderlich sein. Der aktive Inhaltsstoff kann auf einmal verabreicht werden, oder kann in eine Anzahl von kleineren Dosen aufgeteilt werden, die zu vorbestimmten Zeitintervallen verabreicht werden. Die geeignete Dosierungseinheit für jede Verabreichung von Disulfiram kann beispielsweise von etwa 50 bis etwa 1000 mg, vorzugsweise von etwa 250 bis etwa 500 mg sein. Die erwünschte Spitzen-Plasmakonzentration an Disulfiram ist im Allgemeinen etwa 0,05 bis etwa 10 μM, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 5 μM, um eine detektierbare therapeutische Wirkung zu erreichen. Eine Plasmakonzentration außerhalb solcher Bereiche kann jedoch ebenfalls funktionieren.
Disulfiram ist bei der Behandlung von Alkoholmissbrauch klinisch eingesetzt worden. Eine Dosierungsform von Disulfiram, welche von der U.S. Food und Drug Administration genehmigt wurde (Antabuse^®), kann in 250 mg und 500 mg Tabletten zur oralen Verabreichung von Wyeth-Ayerst Laboratories (P.O. Box 8299, Philadelphia, Pa 19101, Telefon 610-688-4400) erworben werden.
Es wurde auch gezeigt, dass Disulfiram, welches subkutan zur verzögerten Freisetzung implantiert wurde, in einer Menge von 800 bis 1600 mg wirksam ist, um eine geeignete Plasmakonzentration zu erreichen. Dies kann durch Verwendung von aseptischen Techniken zum chirurgischen Implantieren von Disulfiram in den subkutanen Raum der anterioren Abdominalwand bewerkstelligt werden. Siehe z.B. Wilson et al., J. Clin. Psych. 45:242–247 (1984).
Eine Formulierung einer Dosierung zur verzögerten Freisetzung, welche aus 80 % Poly(Glycol-co-L-Milchsäure) und 20 % Disulfiram besteht, wurde auch in Phillips et al., J. Pharmaceut. Sci., 73:1718–1720 (1984) beschrieben.
Die Pharmakologie und Toxikologie von Antabuse^® sind detailliert beschrieben in Physicians Desk Reference, 50. Ausgabe, Medical Economics, Montvale, NJ, Seiten 2695–2696. Stabile Serumgehalte von etwa 1,3 μM sind in Menschen gemessen worden, welche täglich wiederholt Dosen von 250 mg Disulfiram einnahmen. Siehe, z.B., Fairman et al., Clin. Pharmacol. Ther. 36:520–526 (1984); und Johansson, Acta Psychiatr. Scand., Suppl. 369:15–26 (1992). Disulfiram ist relativ nicht-toxisch, mit einer LD₅₀ bei Nagetieren von 8,6 g/kg. Siehe z.B. Der Merck Index, 10. Ausgabe, Referenz 3382, Merck & Co., Rahway, NJ, 1983, Seite 491.
Disulfiram kann in der vorliegenden Erfindung in einer ähnlichen Dosierung verwendet werden. Die therapeutisch wirksame Menge für andere Thiuramdisulfid-Verbindungen kann auch geschätzt oder auf Basis der obigen Dosierungsbereiche von Disulfiram und den Molekulargewichten von Disulfiram und den anderen Thiuramdisulfid-Verbindungen berechnet werden, oder mittels anderer im Fachbereich bekannter Verfahren.
Schwermetallionen können separat als eine wässrige Lösung in einer pharmazeutisch geeigneten Salzform verabreicht werden. Sie werden jedoch vorzugsweise in einer Chelat-Form verabreicht, in welcher die Ionen mit Thiuramdisulfid-Verbindungen komplexiert sind. Damit ist die zu verwendende Menge an Schwermetallionen in vorteilhafter Weise proportional zu der Menge an Thiuramdisulfid-Verbindung, welche auf der Basis des molaren Verhältnisses zwischen einem Schwermetallion und der Thiuramdisulfid-Verbindung in dem Chelat verabreicht werden soll. Verfahren zum Herstellen solcher Chelate oder Komplexe sind bekannt, und die bevorzugten Verfahren sind oben und in den Beispielen unten beschrieben.
Die therapeutisch wirksame Menge für IL-6 kann von etwa 1 bis zu etwa 100 μg/kg pro Tag, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50 μg/kg pro Tag betragen. Interferon a kann von etwa 0,1 × 10⁶ bis etwa 10 × 10⁶ internationalen Einheiten pro Tag verabreicht werden, vorzugsweise von etwa 3 bis etwa 8 × 10⁶ internationalen Einheiten pro Tag, und die Verabreichungshäufigkeit kann von etwa 3 Malen pro Woche bis etwa einmal pro Tag sein. Eine geeignete Dosierung für Interferon β kann von etwa 1 bis etwa 200 μg pro Tag reichen, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 100 μg pro Tag, einmal pro Woche bis einmal pro Tag verabreicht. Interferon γ kann in einer Dosierung von etwa 1 bis etwa 1000 μg pro Tag verabreicht werden, vorzugsweise von etwa 50 bis etwa 250 μg pro Tag. Ceruloplasmin kann in einer Menge von etwa 1 bis etwa 100 mg pro Tag verabreicht werden, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 30 mg pro Tag.
Es ist zu verstehen, dass die oben aufgeführten Dosierungsbereiche lediglich beispielhaft sind und den Umfang dieser Erfindung nicht einschränken sollen. Die therapeutisch wirksame Menge für jede aktive Komponente kann mit Faktoren variieren, welche die Aktivität der verwendeten Verbindung, Stabilität der aktiven Verbindung in dem Körper des Patienten, die Ernsthaftigkeit der zu lindernden Zustände, das Gesamtgewicht des behandelten Patienten, die Verabreichungsroute, die Leichtigkeit der Absorption, Verteilung und Exkretion der aktiven Verbindung durch den Körper, das Alter und die Empfindlichkeit des behandelten Patienten und dergleichen umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, wie es Fachleuten auf diesem Gebiet offensichtlich sein wird. Die Verabreichungsmenge kann auch angepasst werden, wenn die verschiedenen Faktoren sich über die Zeit verändern.
Die aktiven Verbindungen gemäß dieser Erfindung können einem zu behandelnden Patienten über jegliche geeignete Verabreichungswege verabreicht werden.
Vorteilhaft werden die aktiven Verbindungen dem Patienten parenteral, d.h. intravenös oder intramuskulär zugeführt. Für parenterale Verabreichung können die aktiven Verbindungen in Lösungen oder Suspensionen oder in lyophilisierten Formen zur Umwandlung in Lösungen oder Suspensionen vor Verwendung formuliert werden. Steriles Wasser, physiologische Salzlösung, z.B. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) können bequem als die pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel verwendet werden. Herkömmliche Lösungsmittel, oberflächenaktive Substanzen, Stabilisatoren, pH-ausgleichende Puffer, antibakterielle Mittel und Antioxidanzien können alle in den parenteralen Formulierungen verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Acetate, Citrate oder Phosphate-Puffer, Natriumchlorid, Dextrose, fette Öle, Glycerin, Polyethylenglykol, Propylenglykol, Benzylalkohol, Methylparabene, Ascorbinsäure, Natriumbisulfit und dergleichen. Die parenterale Formulierung kann in jeglichen herkömmlichen Behältnissen, wie etwa Röhrchen, Ampullen und Spritzen aufbewahrt werden.
Die aktiven Verbindungen können auch oral in verschlossenen Gelatinekapseln oder komprimierten Tabletten zugeführt werden. Kapseln und Tabletten können mittels jeglicher herkömmlicher Techniken hergestellt werden. Beispielsweise können die aktiven Verbindungen in eine Formulierung eingefügt werden, welche pharmazeutisch akzeptable Träger, wie etwa Exzipienten (z.B. Stärke, Lactose), Bindemittel (z.B. Gelatine, Cellulose, Gummitragacanth), auflösende Mittel (z.B. Alginat, Primogel und Maisstärke), Schmiermittel (z.B. Magnesiumstearat, Siliciumdioxid) und Süßungs- oder Geschmacks-Mittel (z.B. Glukose, Sucrose, Saccharin, Methylsalicylat und Pfefferminz) umfassen. Es können auch verschiedene Beschichtungen für die Kapseln und Tabletten hergestellt werden, um den Geschmack, die Geschmacksrichtungen, Farben und Formen der Kapseln und Tabletten zu modifizieren. Zusätzlich können flüssige Träger, wie etwa Fettöl, in den Kapseln umfasst sein.
Es können auch andere Formen oraler Formulierungen hergestellt werden, wie etwa Kaugummi, Suspension, Sirup, Waffel, Elixier und dergleichen, welche die in dieser Erfindung verwendeten aktiven Verbindungen enthalten. Verschiedene Modifizierungsmittel für Geschmack, Geschmacksrichtungen, Farben und Formen können ebenfalls umfasst sein. Zusätzlich können zur bequemen Verabreichung mittels enteraler Zuführröhre bei Patienten, welche nicht fähig sind, zu schlucken, die aktiven Verbindungen in einem akzeptablen lipophilen Pflanzenöl-Vehikel, wie etwa Olivenöl, Maisöl und Distelöl aufgelöst werden.
Die aktiven Komponenten können auch topisch über rektale, vaginale, nasale oder mukosale Anwendungen verabreicht werden. Topische Formulierungen sind im Fachbereich allgemein bekannt und umfassen Cremes, Gele, Salben, Lotionen, Pulver, Pasten, Suspensionen, Sprays und Aerosole. Typischerweise umfassen topische Formulierungen ein oder mehr Verdickungsmittel, Feuchthaltemittel und/oder Emollienzien, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Xanthan-Gummi, Petrolatum, Bienenwachs oder Polyethylenglycol, Sorbitol, Mineralöl, Lanolin, Squalen und dergleichen. Eine spezielle Form topischer Verabreichung ist die Zufuhr mittels eines transdermalen Pflasters. Verfahren zum Herstellen transdermaler Pflaster sind beispielsweise offenbart in Brown et al., Annual Review of Medicine, 39:221–229 (1988), welches durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist.
Die aktiven Verbindungen können auch durch subkutane Implantation zur verzögerten Freisetzung zugeführt werden. Dies kann erreicht werden durch Verwendung aseptischer Techniken zum chirurgischen Implantieren der aktiven Verbindungen in einer jeglichen geeigneten Formulierung in den subkutanen Raum der anterioren Abdominalwand. Siehe, z.B., Wilson et al., J. Clin. Psych. 45:242–247 (1984). Langzeitfreisetzung kann erreicht werden durch Einfügung der aktiven Inhaltsstoffe in einen speziellen Träger, wie etwa ein Hydrogel. Typischerweise ist ein Hydrogel ein Netzwerk biokompatibler Polymere hohen Molekulargewichts, welche in Wasser quellen können, um ein gelähnliches Material zu bilden. Hydrogele sind allgemein im Fachbereich bekannt. Beispielsweise sind Hydrogele aus Polyethylenglykolen oder Collagen oder Poly(Glykol-co-L-Milchsäure) für diese Erfindung geeignet. Siehe, z.B. Phillips et al., J. Pharmaceut. Sci. 73:1718–1720 (1984).
Die aktiven Verbindungen können auch verbunden, d.h. kovalent verknüpft werden mit einem wasserlöslichen, nicht immunogenen Polymer hohen Molekulargewichts, um ein Polymer-Konjugat zu bilden. Vorteilhafter Weise können solche Polymere, z.B. Polyethylenglykol, den aktiven Verbindungen Löslichkeit, Stabilität und verminderte Immunogenizität verleihen. Als Ergebnis davon kann die aktive Verbindung in dem Konjugat, wenn sie einem Patienten verabreicht wird, eine längere Halbwertszeit in dem Körper aufweisen und bessere Effizienz zeigen. PEGylierte Proteine werden gegenwärtig in Protein-Ersatz-Therapien und für andere therapeutische Verwendungen eingesetzt.
Beispielsweise wird PEGylierte Adenosin-Deaminase (ADAGEN^®) verwendet, um schwerwiegende kombinierte Immunodefizienz-Krankheit (SCIDS) zu behandeln. PEGylierte L-Asparaginase (ONCAPSPAR^®) wird verwendet, um akute lymphoblastische Leukämie (ALL) zu behandeln. Für einen allgemeinen Überblick über PEG-Protein-Konjugate mit klinischer Effizienz, siehe z.B. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm. 15:210–218 (1994). Vorzugsweise ist die kovalente Bindung zwischen dem Polymer und der aktiven Verbindung hydrolytisch abbaubar und gegenüber Hydrolyse unter physiologischen Bedingungen empfindlich. Solche Konjugate sind als "Pro-Wirkstoffe" bekannt, und das Polymer in dem Konjugat kann im Körper leicht unter Freisetzung der freien aktiven Verbindungen abgespalten werden.
Alternativ sind andere Formen gesteuerter Freisetzung oder Schutz, einschließlich Mikrokapseln und Nanokapseln, im Fachbereich allgemein bekannt, und alle oben beschriebene Hydrogele können bei oraler, parenteraler, topischer- und subkutaner Verabreichung der aktiven Verbindungen verwendet werden.
Eine andere bevorzugte Zufuhrform besteht in der Verwendung von Liposomen als Träger. Liposome sind Mizellen, welche von verschiedenen Lipiden, wie etwa Cholesterin, Phospholipiden; Fettsäuren und Derivaten davon gebildet werden. Aktive Verbindungen können im Inneren solcher Mizellen eingeschlossen werden. Verfahren zum Herstellen liposomaler Suspensionen, welche darin aktive Inhaltsstoffe enthalten, sind allgemein im Fachbereich bekannt und beispielsweise in US-Patent Nr. 4,522,811 beschrieben. Verschiedene Anti-Krebs-Wirkstoffe, welche in der Form von Liposomen verabreicht werden, sind im Fachbereich bekannt und kommerziell von Liposome Inc. of Priceton, New Jersey, USA erhältlich. Es ist gezeigt worden, dass liposomale Verabreichung die Toxizität der aktiven Verbindungen verringern und ihre Stabilität erhöhen kann.
Die aktiven Verbindungen können in Kombination mit anderen aktiven Mitteln verabreicht werden, welche eine andere Krankheit oder ein anderes Symptom in dem behandelten Patienten behandeln oder dieser/diesem vorbeugen. Es ist jedoch zu verstehen, dass solche anderen aktiven Mittel nicht mit den Wirkungen der aktiven Verbindungen gemäß dieser Erfindung auf den behandelten Krebs interferieren oder diese negativ beeinflussen sollten. Solche anderen aktiven Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Antivirenmittel, Antibiotika, Antipilzmittel, entzündungshemmende Mittel, antithrombotische Mittel, kardiovaskuläre Wirkstoffe, Cholesterin-senkende Mittel, Hypertensions-Wirkstoffe und dergleichen.
Es ist zu verstehen, dass Individuen, welche aufgrund ihres Krebses Disulfiram-Therapie unterzogen werden, vor Alkohol-Exponierung in jeglicher Form gewarnt werden müssen, um das Auftreten von Schwindel und Erbrechen aufgrund des Anstiegs von Acetaldehyd im Blutstrom zu vermeiden. Die Betreffenden müssen daher nicht nur von der Aufnahme von Alkohol-enthaltenden Getränken Abstand nehmen, sondern sollten Alkohol auch nicht über die frei erhältlichen Formulierungen, wie etwa Hustensirupe, welche Alkohol enthalten, oder sogar Verwendung von Alkohol zum topischen Abreichen aufnehmen.
EXPERIMENTELLER TEIL VERFAHREN
Kultur von bösartigen Zelllinien. Menschliche bösartige Zelllinien wurden von der American Type Tissue Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Melanom-Zelllinien CRL 1585 und 1619 wurden in RPMI 1640 (GIBCO-BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) mit 10 % FBS kultiviert und mit nicht-enzymatischer Zell-Dissoziierungs-Lösung 7 abgelöst (Sigma). Die Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie CRL 1435 (PC-3) wurde ebenfalls in RPMI 1640 mit 10 % FBS kultiviert, aber mit 0,05 % Trypsin und 0,53 mM EDTA abgelöst. Die Pflasterlungenkarzinom(squamöses Lungenkarzinom)-NCI-H520- und die Adeno-Pflaster-Lungenkarzinom-NCI-H596-Zelllinien wurden in RPMI 1640 wachsen gelassen, welches mit 10 % FBS, 10 mM HEPES und 1,0 mM Natriumpyruvat ergänzt war, und mit Trypsin/EDTA abgelöst. Das kleinzellige Lungenkarzinom NCI-H82 wurde als eine Suspension in RPMI 1640 mit 10 % FBS kultiviert. Alle Obigen ließ man in einer angefeuchteten Atmosphäre von 37°C wachsen, welche 5 % CO₂/Luft enthielt. Die Brustkarzinom-Zelllinie MDA-MB-453 wurde in einer 37°C warmen, angefeuchteten Umgebung bei freiem Gasaustausch mit atmosphärischer Luft unter Verwendung von Leibovitz's L-15-Medium mit 2 mM L-Glutamin und 10 % FBS wachsen gelassen und mit Trypsin/EDTA abgelöst.
Messung von Proliferation in Zellkulturen. Proliferation von kultivierten Zellen wurde unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten colorimetrischen Verfahrens quantifiziert, auf der Basis von metabolischer Reduzierung des löslichen, gelben Tetrazoliumfarbstoffs 3-[4,5-Dimethylthiazol]-2yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) in sein unlösliches, violettes Formazan durch die Wirkung mitochondrialer Succinyldehydrogenase. Siehe Hirst et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:574–581 (1992) Dashtaki, et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 285:876–219 (1998). Dieses Assay unterscheidet empirisch zwischen toten und lebenden Zellen. Für Proliferationsstudien wurden Zellen auf unbeschichteten 24-Well-Plastikplatten (Costar) zu 50.000 Zellen pro Well gesät und mit jeweiligen Medien und Mitogenen kultiviert. Nach 24–96 Stunden wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden zweimal mit 1 ml steriler Dulbecco's modifizierter Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺ (DPBS) gewaschen, das Medium durch 1 ml/Weil frisches Medium, welches 100 μg/ml MTT enthielt, ersetzt, und die Platten eine weitere Stunde lang inkubiert. MTT enthaltendes Medium wurde entfernt, jedem Well 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zugesetzt, und die Extinktion des gelösten, violetten Formazan-Farbstoffs bei 540 nm gemessen. Insgesamt 4 – 6 Wells wurden bei jedem Behandlungszustand studiert. Vorläufige Studien wurden ausgeführt mit 50–200 μg/ml MTT, welches über 15 min, bis 3 Stunden lang inkubiert wurde, um die optimale Konzentration und die optimale Inkubationszeit zu bestimmen, bei welcher die Konversionsrate linear und der Anzahl der gegenwärtigen Zellen proportional war. Die Extinktion des MTT-Formazan-Reduktionsprodukts (A₅₄₀) korrelierte mit Zellanzahlen, welche mittels Hämozytometer mit einem R² = 0,99 gezählt wurden. In einigen Experimenten wurde das MTT-Assay und Reaktionen auf FBS und Inhibitoren auch durch Ausführen von Zellzählungen an 10 zufälligen Feldern/Well von Giemsa-modifizierten Wright-gefärbten Monolagen bestätigt, welche bei 40facher Vergrößerung unter Verwendung eines 0,01-cm² Okularrasters betrachtet wurden.
Zellkulturbehandlungen. Die Wirkung von Disulfiram (0,15 bis 5,0 μM) und PDTC (0,625 bis 5,0 μM) (beide von Sigma Chemicals, St. Louis, MO) auf Proliferation von bösartigen Zelllinien wurde in Kulturen studiert, welche mit 10 % FBS stimuliert wurden. Disulfiram wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) solubilisiert, so dass die endgültige Konzentration von DMSO weniger als 0,3–0,5 % betrug. Gleiche Volumina von DMSO wurden zu Vergleichsexperimenten zugefügt. Zellanzahlen wurden mit dem MTT-Assay 24–72 Stunden später quantifiziert. In einigen Experimenten wurde Disulfiram oder PDTC unmittelbar nach Aufbringen der Zellen auf die Platten zugegeben. In anderen Experimenten wurden die Zellen auf die Platten gegeben und 24–72 Stunden lang wachsen gelassen, bevor frische Medien mit Disulfiram oder PDTC zugefügt wurden, und die Zellanzahlen mittels des MTT-Assays 24 – 72 Stunden später studiert. Synergie zwischen Disulfiram und N,N'-Bis(2-chlorethyl)-N-nitrosoharnstoff (Carmustin oder BCNU, 1,0 bis 1.000 μM) oder Cisplatin (0,1 bis 100 μg/ml), welche dem Medium zugegeben wurden, wurde studiert. Die Wirkung von Metallen auf Disulfiram wurde mit 0,2 bis 10 μM Kupfer (bereitgestellt als CuSO₄), Zink (als ZnCl₂), Silber (als Silberlaktat) oder Gold (als HAuCl₄·3H₂O)-Ionen studiert, welche dem Wachstumsmedium zugegeben wurden. Bei Zugabe von Metallsalzen zu Kulturmedium traten keine pH-Änderungen auf. Um eine biologisch relevante Kupferquelle bereitzustellen, wurde in einigen Experimenten menschliches Ceruloplasmin (Sigma) in Dosen zugefügt, welche niedrigen und hohen normalen Erwachsenen-Serumkonzentrationen (250 und 500 μg/ml) entsprechen.
Potentielle Redox-Effekte von Disulfiram wurden in drei Sätzen von Experimenten studiert. Die Wichtigkeit von zellulärem Glutathion (GSH) bei der Vermittlung oder Modulierung von Dithiocarbamat-Toxizität wurde durch Messung von Gehalten von intrazellulärem GSH nach Behandlung mit Disulfiram studiert. Disulfiram (5 μM), mit oder ohne 1,6 μM CuSO₄, wurde zu Zellen zugegeben, welche bis zur Konfluenz auf 100 × 15 mm Plastik-Schalen wachsen gelassen wurden, und die Zellen wurden 24 Stunden später geerntet, zur Messung von GSH wie unten stehend beschrieben. Um zu beurteilen, ob ein nicht-spezifischer Antioxidationsmittel-Effekt von Disulfiram oder PDTC Inhibierung zellulären Wachstums erklären könnte, haben wir auch die Wirkung des potenten lipophilen Antioxidationsmittels Probucol (1,0 bis 1.000 μM) auf die Proliferation bösartiger Zelllinien studiert. Schließlich wurde die Erzeugung intrazellulärer Oxidationsmittel als Reaktion auf Disulfiram (0,625 bis 5 μM), Kupfer (0,2 bis 1,6 μM CuSO₄) oder 1,25 μM Disulfiram plus verschiedene Konzentrationen an Kupfer direkt gemessen, wie unten beschrieben.
Um die Rolle von Cyclooxygenase-Inhibierung bei Thiocarbamat-Toxizität zu erforschen, wurden Zellen mit oder ohne Disulfiram in der Anwesenheit oder Abwesenheit der COX1- und COX2-Inhibitoren Indomethacin (5 μg/ml) oder Natriumsalicylat (1 mM) kultiviert. Um zu sondieren, ob Disulfiram Wachstumsverzögerung durch Unterbrechung oder Stimulierung von Stickoxid (NO)-Produktion induzieren könnte, wurde Proliferation mit und ohne Disulfiram in der Gegenwart und Abwesenheit des Stickoxid-Synthase-Inhibitors Nω-Nitro-L-arginin studiert, welcher zu Wachstumsmedium (100 μM) zugegeben wurde.
Um die Rolle von Kupfer bei der Vermittlung von Cytotoxizität von Disulfiram weiter zu testen, wurden Zellen mit oder ohne Zugabe des impermeaten Cu²⁺-Chelators Bathocuproindisulfonsäure (BCPS, 100 μM) kultiviert, welcher dem Medium zugesetzt wurde, um Cu²⁺ in dem extrazellulären Raum zu sequestrieren. Zellen wurden auch 12 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen von Disulfiram (0,625 bis 5,0 μM) behandelt und intrazelluläre Kupfer-Gehalte wie unten stehend beschrieben gemessen.
In zusätzlichen Experimenten wurden Zellen bis zur Konfluenz auf 60 × 15 mm Plastik-Petri-Schalen wachsen gelassen und mit 5 μM Disulfiram oder 5 μM Disulfiram plus 1,6 μM CuSO₄ 2 bis 48 Stunden lang behandelt. Zellen wurden lysiert und Gehalte des pro-apoptotischen Proteins p53, des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2, des Cyclin-Inhibitors p21^WAF1/Cip1, und der Cycline A und B1 wie unten beschrieben mittels Immunoblot-Assay gemessen.
Um die Wirkung von Disulfiram auf für zelluläre Proliferation wichtige, ausgewählte Gene zu erforschen, wurden schließlich Zellen bis zur Konfluenz auf 100 × 15 mm Petri-Schalen aus Plastik wachsen gelassen und mit 5 μM Disulfiram oder 5 μM Disulfiram plus 1,6 μM CuSO₄ behandelt. Nukleares Protein wurde geerntet, und es wurden elektrophoretische Mobilitäts-Gel-Shift-Assays durchgeführt, um DNA-Konsens-Bindungssequenz für das cyclische AMP responsive Element (CRE) wie unten beschrieben zu verwenden. Um zu bestimmen, ob Disulfiram und Metalle Transkriptionsfaktor-Bindung direkt beeinflussen könnten, wurden in einigen Experimenten 5 μM Disulfiram und/oder CuSO₄ 1,6 μM CuSO₄ (endgültige Konzentrationen) zu der Bindungsreaktion von nuklearem Protein zugegeben, welches von Vergleichszellen erhalten wurde, welche in der Abwesenheit von Wirkstoffen oder Metallen lediglich mit 10 % FBS stimuliert wurden. In vitro-Zugabe von Disulfiram und CuSO₄ zu der Bindungsreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von entweder 2,5 mM Dithiothreitol (DTT) oder 3,0 mM GSH als ein Reduktionsmittel in dem Bindungspuffer.
Messung von Cytotoxizität und Apoptose. Um Cytotoxizität zu untersuchen, wurden Zellen in einer Dichte von 50.000 pro Well auf 24-Well-Platten aufgebracht und 24 Stunden lang wachsen lassen. Dann wurde Disulfiram zugegeben. Nach weiteren 36 Stunden wurde das Medium entfernt und durch 0,1 % Trypanblau enthaltende DPBS ersetzt. Zelltod wurde untersucht durch Zählen der durchschnittlichen Anzahl von Trypanblau-positiven Zellen pro 10X Feld in 5 zufälligen Feldern für 4 getrennte Wells. Um zu bestimmen, ob Disulfiram Apoptose induzierte, wurden Zellen, welche auf 35 mm Petri-Schalen oder auf Glas-Plättchen bis zur Konfluenz wachsen gelassen wurden, mit Disulfiram oder DMSO als Vehikel behandelt. Apoptose wurde studiert mittels Terminus-Deoxynucleotidyl-Transferase (TdT)-abhängiger 3'-OH-Fluoreszin-Endlabelmarkierung von DNA-Fragmenten unter Verwendung eines Fluoreszin-FragEL^TM DNA-Fragmentierungs-Detektions-Baukastens (Oncogene Research Products, Cambridge, MA). Apoptose wurde auch untersucht mittels visueller Untersuchung von Endonuclease-abhängiger DNA-Fragmentierung auf mit Ethidiumbromid gefärbten Agarose-Gelen, wie zuvor berichtet. Siehe Dashtaki, et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 285:876–219 (1998).
DNA-Zell-Zyklus-Messungen. Um die Wirkung von Disulfiram auf den DNA-Zell-Zyklus zu untersuchen, wurden Zellen bis zur Konfluenz in 25 cm² Plastikkolben wachsen gelassen und behandelt mit 10 % FBS plus DMSO-Vehikel, FBS und DMSO-Vehikel plus 1,6 μM CuSO₄, FBS plus 5 μM Disulfiram oder FBS plus 5 μM Disulfiram und 1,6 μM CuSO₄. Nach 24 Stunden wurden die Zellen trypsiniert, zweimal in kalter DPBS mit 1 mM EDTA und 1 % BSA gewaschen, 30 Minuten lang in eiskaltem 70 % Ethanol fixiert, und durch Inkubation 30 Minuten lang bei 37°C in einer 10 μg/ml-Lösung von Propidiumiodid in DPBS und 1 mg/ml RNase A gefärbt. DNA- Zell-Zyklus-Messungen wurden durchgeführt unter Verwendung eines FACStar^PLUS Flusszytometers (Becton-Dickenson, San Jose, CA).
Messung intrazellulären Kupfers. Zellen wurden in 12-Well-Plastik-Zellkultur-Schalen bei einer anfänglichen Plattierungsdichte von 50.000 Zellen/Well kultiviert, bis zur Konfluenz wachsen gelassen und mit Disulfiram oder Vehikel-DMSO wie oben beschrieben behandelt. Die Medien wurden entfernt und die Zellen zweimal mit DPBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 1,0 ml 3N HCl/10,0 Trichloressigsäure geschabt und bei 70°C 16 Stunden lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde bei 600 g 10 Minuten lang zentrifugiert, um Abfall zu entfernen, und Kupfer wurde in dem Überstand unter Verwendung von ICP-Emissionsspektroskopie (Modell P30, Perkin Elmer, Norwalk, CT) bei Wellenlängen von 325,754 und 224,700 nm gemessen. Um Metallkontamination zu minimieren, wurde statt Glasware in diesen Experimenten Plastikware und doppelt destilliertes, deionisiertes Wasser für alle wässrigen Medien verwendet. Die Ergebnisse sind als ng-Kupfer/ml Hydrolysat angezeigt.
Messung der intrazellulären Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies. Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies als Reaktion auf Disulfiram mit oder ohne CuSO₄ wurde unter Verwendung von 2',7'-Dichlorfluoreszindiacetat (DCF-DA, Molecular Probes, Eugene, OR) und einer Modifikation von zuvor berichteten Verfahren untersucht. Siehe Royall, et al., Archiv. Biochem. Biophys. 302:348–355 (1993).
Dieses Verfahren basiert auf der Oxidation von Dichlorfluoreszin zu 2',7'-Dichlorfluoreszin durch H₂O₂ in der Gegenwart zellulärer Peroxidasen. Zellen wurden auf 24-Well-Plastik-Schalen zu 50.000 Zellen pro Well plattiert und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Medien wurden aus den Wells abgesaugt und durch 100 μl 10 μM DCF-DA enthaltendes Medium ersetzt, und die Platten wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die DCF-DA-enthaltenden Medien wurden abgesaugt, die Zellen zweimal mit Medien allein gewaschen und den Wells 100 μl frische Medien zugegeben. Während die Platte auf dem Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät (HTS 7000) platziert war, wurden Zellen mit 25 μl Medien stimuliert, welche 5 × Konzentrationen an Disulfiram und/oder CuSO₄ enthielten, um endgültige Konzentrationen von jeweils 0–5,0 μM und/oder 0–1,6 μM CuSO₄ bereitzustellen. Die relative Konzentration an Dichlorfluoreszin wurde sofort durch Verfolgen der Fluoreszenz bei 37°C unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 485 nm und Emissionswellenlänge von 535 nm gemessen.
Messung intrazellulären Glutathions. Disulfiram (5 μM), mit oder ohne 1,6 μM CuSO₄, wurde zu Zellen zugegeben, welche auf 100 × 15 mm Plastik-Schalen bis zur Konfluenz wachsen gelassen worden waren, und Zellen wurden 24 Stunden später zur Messung von GSH unter Verwendung des 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)-glutathion-Reduktase-Recycling-Assays geerntet. Siehe Anderson, M.E. Methods Enzymol. 113:548–555 (1985).
Immunoassay für Proteine. Zellen wurden lysiert und Proteine isoliert und mit Immunoassay wie zuvor im Detail beschrieben (7,10) quantifiziert, unter Verwendung von 2 μg/ml primärer polyklonaler Antikörper von Hasen gegen menschliches Bcl-2 (ΔC21), p53 (FL-393), p21^WAF1/Clip1 (H-164), Cyclin A und Cyclin B1 von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) und mit Peroxidase-Label markiertem polyklonalem Anti-Hasen IgG vom Esel von Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, England). Zellen wurden auf Eis gelegt, zweimal mit kalter DPBS gewaschen, in 0,5 ml kochenden Puffer (10 % [Vol/Vol] Glycerin und 2 % [Gew/Vol] Natriumdadecylsulfat [SDS] in 83 mM Tris, pH 6,8) geschabt und durch vier Durchgänge durch eine Pipette geschert. Aliquots wurden zur Proteinbestimmung unter Verwendung des BCA-Protein-Assays (Pierce) entfernt. Nach Zugabe von 10 β-Mercaptoethanol und 0,05 % Bromphenolblau wurden die Lysate 5 Minuten lang gekocht und bei –80°C aufbewahrt, bevor der Immunoblot durchgeführt wurde. Proteine in aufgetauten Proben wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese auf 12 % Polyacrylamidgelen getrennt (15 μg Protein/Bahn) und auf 0,45 μm Hybond ECL Nitrozellulose-Membranen (Amersham Life Sciences) unter Verwendung der Nass-Transblot-Methode in Transfer-Puffer (0,025 M Tris, 0,192 M Glycin, 2,6 mM SDS und 20 % [Vol/Vol] Methanol; pH 8,8) bei 100 Volt 1 Stunde lang elektrotransferiert. Die Blots wurden über Nacht bei 4°C mit Blockierungs-Puffer (PBS mit 0,1 % Tween 20) blockiert, welcher 5 % fettfreies Milchpulver (Carnation, Glendale, CA) enthielt. Nach 5maligem Spülen für jeweils 5 Minuten in 0,1 % Tween 20 enthaltendem PBS wurden die Blots 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 2,0 μg/ml primärem Antikörper inkubiert. Nach nochmaligem Spülen wie oben wurden die Blots 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Meerrettich-Peroxidase(HRP)-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert, welcher 1:5.000 in Blockierungs-Puffer verdünnt war. Die Immunoblots wurden erneut wie oben beschrieben gespült und mittels eines Verfahrens mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL Western-Blotting-Detektions-System, Amersham Life Science, Buckinghamshire, England) detektiert. Autoradiografischer Film (X-OMAT AR, Eastman Kodak, Rochester, NY) wurde den Immunoblots 10, 30 oder 60 Sekunden lang ausgesetzt, um zufriedenstellende Bilder zu erhalten.
Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSAs). Nukleares Protein wurde isoliert und DNA-Bindungsreaktionen durchgeführt wie zuvor detailliert beschrieben. Siehe Dashtaki, et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 285:876–219 (1998); Kennedy, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:366–378 (1998).
Monolagen wurden zweimal in kalter DPBS gewaschen und 10 Minuten lang auf Eis ins Gleichgewicht gebracht mit 0,7 ml kaltem, zytoplasmischem Extraktionspuffer, CEB (10 mM Tris, pH 7,9, 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) mit Protease-Inhibitoren, PI (1 mM Pefabloc, 50 μg/ml Antipain, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin, 40 μg/ml Bestatin, 3 μg/ml E-64 und 100 μg/ml Chymostatin). Das oberflächenaktive Mittel Nonidet P-40 (NP-40) wurde zu einer endgültigen Konzentration von 0,1 % zugefügt, und Zellen wurden mit einem Zellschaber entfernt. Die Nuklei wurden mittels Zentrifugierung zu Pellets geformt und mit CEB/PI gewaschen. Die Nuklei wurden dann 20 Minuten lang auf Eis in nuklearem Extraktionspuffer, NEB (20 mM Tris, pH 8,0, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1,5 mM EDTA, 1 mM DTT und 25 Glycerin) mit PI inkubiert, kurz geschleudert, um Abfall zu entfernen und bis zur Durchführung der elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays bei –80°C aufbewahrt. Die EMSAs wurden ausgeführt unter Verwendung von Konsens-Oligonukleotiden (5'-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3' und 3'-TCTCTAACGGACTGCAGTCTCTCGATC-5') für das cyclische AMP responsive Element CRE (ProMega, Madison, WI), durch Phosphorylierung mit [γ³²P]-ATP und T4-Polynukleotid-Kinase endständig markiert. DNA-Protein-Bindungsreaktionen wurden durchgeführt mit 2 μg nuklearen Proteins (wie nach der Pierce-Methode bestimmt) und 30 – 80.000 cpm an ³²P-endständig-markierter, doppelsträngiger DNA-Sonde in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTT (außer wo angegeben), 1 mM MgCl₂, 50 μg/ml poly dI-dC, und 4 % Glycerin. Alle Komponenten der Bindungsreaktion, mit Ausnahme der mit Label markierten Sonde, wurden kombiniert und vor Zugabe der mit Label markierten Sonde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert, und weitere 20 Minuten lang inkubiert. Konkurrenz-Experimente wurden ausgeführt mit 10X nicht markierten Wild-Typ Oligonukleotid-Sequenzen für CRE oder NF-κB (p50, 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3' und 3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5'), zugefügt vor der mit Label markierten Sonde. Die Proben wurden auf einem 5 % nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel in Tris-glycin-EDTA (TGE, 120 mM Glycin und 1 mM EDTA in 25 mM Tris, pH 8,5)-Puffer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden getrocknet und mittels Autoradiografie bei –80°C unter Verwendung eines Bildintensivierschirms analysiert.
Synthese von Disulfiram-Metall-Chelaten. Chelate von Disulfiram und einer Anzahl von Metallen wurden durch kräftiges Mischen von 150 mg Disulfiram in Chloroform (2,5 mg/ml) mit 30 ml eines 5x molaren Überschusses an CuSO₄, ZnCl₂, C₃H₅AgO₃ (Silberlactat) oder HAuCl₄·3H₂O in doppelt Glas-destilliertem, deionisierten Wasser synthetisiert. Das Gemisch wurde bei 1.000 g 10 Minuten lang zentrifugiert und die obere wässrige Phase verworfen. Während die untere Chloroform-Phase verdampfte, fielen die resultierenden Disulfiram-Metall-Chelate aus.
Statistische Analyse. Daten sind ausgedrückt als Mittelwerte ± Standardfehler. Die minimale Anzahl an Wiederholungen für alle Messungen war vier, wenn nicht anders angegeben. Unterschiede zwischen multiplen Gruppen wurden verglichen unter Verwendung von Einweganalyse der Varianz. Der verwendete post-hoc-Test war der Newman-Keuls -Test multipler Vergleiche. Es wurden Two-Tail-Tests von der Signifikanz verwendet. Signifikanz wurde angenommen als p < 0,05.
Beispiel 1: Disulfiram ist gegen bösartige menschliche Zelllinien antiproliferativ.
M1619 menschliche Melanom-Zelllinien wurden verwendet, um die antiproliferativen Charakteristika von Disulfiram zu testen. Mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) stimulierte Zellen wurden bei einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well plattiert. Den Wells wurde DMSO-Vehikel (5 μl pro ml) oder Disulfiram (DS) in verschiedenen Konzentrationen zugefügt. Nach 48 Stunden wurde Proliferation durch Untersuchen der Zellanzahl-abhängigen Reduktion des löslichen, gelben Tetrazolium-Farbstoffs 3-[4,5-Dimethylthiazol]-2yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu seinem unlöslichen Formazan quantifiziert, gemessen als die Extinktion bei 540 nm (A₅₄₀). *p < 0,01 verglichen mit FBS + DMSO-Vehikel-Vergleich. Wie in 1A gezeigt, war Disulfiram in Konzentrationen, welche in Menschen bei üblichen klinischen Dosen ohne Weiteres erreichbar sind (siehe, z.B., Faiman, et al., Clin. Pharmacol. Ther. 36:520–526 (1984)), ein potenter Inhibitor von in vitro Wachstum für M1619 Melanome.
Eine Vielfalt anderer bösartiger menschlicher Zelllinien, einschließlich M1585 Melanome, prostatischer Adenokarzinome, nicht-kleinzelligem und kleinzelligem Lungenkrebs und Brustadenokarzinome, wurde mit dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben getestet. Zellen, welche mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) stimuliert wurden, wurden in einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well plattiert. In einigen Studien (Behandlung anfänglich) wurde den Wells DMSO-Vehikel (5 μl pro ml) oder Disulfiram (DS) in den angegebenen Konzentrationen zugefügt. Nach 48 Stunden wurde Proliferation wie oben beschrieben quantifiziert. In anderen Studien (Behandlung nach 24 Stunden) wurden Zellen 24 (M1619, M1585 und H596 Lunge) oder 48 Stunden (Brust) lang wachsen gelassen. DMSO-Vehikel (5 μl pro ml) oder Disulfiram (DS) wurde den Wells in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Nach weiteren 24 (Lunge) oder 48 Stunden (Brust) wurde Proliferation wie oben beschrieben quantifiziert. Prozent Wachstumsinhibierung wurde berechnet als 100 × (1,0–A₅₄₀ von MTT Formazan in Disulfirambehandelten Zellen/mittlere A₅₄₀ von MTT Formazan in mit DMSO-Vehikel behandelten Zellen). In einigen Zelllinien wurde eine bescheidene (< 10 %), aber statistisch signifikante inhibierende Wirkung mit DMSO-Vehikel allein beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Jeder Wert bedeutet einen Mittelwert von wenigstens 4 Experimenten. ^Ap < 0,01 verglichen mit FBS + DMSO-Vehikel-Vergleich.
Wie in Tabelle 1 dargestellt war Disulfiram wirksam darin, das Wachstum vieler verschiedener bösartiger Zellen zu inhibieren. Dies traf zu, ob Disulfiram zu den Kulturmedien zugegeben wurde, wenn die Zellen plattiert wurden oder später, nachdem die Zellen 24–48 Stunden lang gewachsen waren.
TABELLE 1 DISULFIRAM IST FÜR BÖSARTIGE ZELLEN ANTIPROLIFERATIV
Beispiel 2: Antiproliferative Aktivität von Disulfiram hängt von Komplexierung mit Kupfer ab.
M1619 Melanom-Zellen wurden stimuliert und plattiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. 1,25 μM Disulfiram (DS) oder DMSO-Vehikel (5 μl pro ml) wurden den Wells in der Abwesenheit oder Gegenwart von 50 oder 100 μM Bathocuproindisulfonsäure (BPS) zugefügt. Nach 48 Stunden wurde Proliferation wie oben beschrieben quantifiziert. *p < 0,001 verglichen mit FBS + DMSO; +p < 0,001 verglichen mit FBS + DS. Wie in 1B gezeigt, verhindert der Zellen-impermeate Cu²⁺-Chelator Bathocuproindisulfonsäure Wachstumsinhibierung durch Disulfiram.
Beispiel 3: Kupfer verstärkt die antiproliferative Aktivität von Disulfiram.
M1619 Melanom-Zellen, welche wie in Beispiel 1 plattiert und stimuliert wurden, wurden 24 Stunden lang wachsen gelassen und ergänzt mit CuSO₄ oder CuSO₄ plus 0,625 μM Disulfiram. Nach weiteren 24 Stunden wurde Proliferation quantifiziert. Wie in 1C gezeigt, verstärkt Ergänzung des Wachstumsmediums mit Kupfer die antiproliferative Aktivität von Disulfiram. Die Zugabe selbst von 0,2 μM CuSO₄ zu dem Medium wandelt 0,625 μM Disulfiram von einer 50 % inhibierenden (IC₅₀) Konzentration in eine 100 inhibierende (IC₁₀₀) Konzentration an Wirkstoff um. *p < 0,001 verglichen mit keinem CuSO₄.
M1619 Melanom-Zellen wurden plattiert, stimuliert und 24 Stunden lang wachsen gelassen in der Gegenwart oder Abwesenheit von 0,625 μM Disulfiram oder 5 μl/ml DMSO-Vehikel in der Gegenwart oder Abwesenheit von menschlichem Ceruloplasmin (Cerulo) bei einer Konzentration, welche den oberen Gehalt in normalem menschlichem Serum wiederspiegelt (500 μg/ml). Nach 24 Stunden wurde Proliferation quantifiziert. *p < 0,001 verglichen mit FBS + DMSO; +p < 0,001 verglichen mit FBS + DS. Wie in 1D gezeigt, kann Ceruloplasmin als eine Kupferquelle zum Verstärken der antiproliferativen Aktivität von Disulfiram dienen.
Beispiel 4: Disulfiram induziert Apoptose.
M1619 Melanom-Zellen wurden bis zur Konfluenz auf 35 mm Petri-Schalen oder auf Glasträgern wachsen gelassen und 15 Stunden lang mit Disulfiram oder DMSO als Vehikel behandelt.
Apoptose wurde untersucht mittels terminaler Deoxynukleotidyltransferase (TdT)-abhängiger 3'-OH Fluoreszin-End-Markierung von DNA-Fragmenten, unter Verwendung eines Fluoreszin-FragEL^TM DNA-Fragmentierungs-Detektions-Baukastens (Oncogene Research Products, Cambridge, MA). Wie in 2A und 2B gezeigt, wurde Apoptose in M1619 Melanom-Zellen induziert, welche mit 5 μM Disulfiram behandelt waren. Disulfiram erhöhte 3'-OH Fluoreszin-End-Markierung von DNA-Fragmenten merklich. Behandlung von Monolagen selbst mit geringen Dosen von Disulfiram erhöhte die Aufnahme von Trypanblau merklich. 6 ± 2, 8 ± 3,6 und 94 ± 18 Trypanblau-positive Zellen pro Well wurden jeweils für unbehandelte, mit DMSO-Vehikel behandelte oder H520 Lungenadenosquamöse Karzinomzellen, welche mit 0,625 μM Disulfiram behandelt waren, beobachtet.
12 ± 0,9, 16,5 ± 2,1 bzw. 93 ± 12 Trypanblau-positive Zellen pro Well wurden für unbehandelte, mit DMSO behandelte oder H82 kleinzellige Lungenkrebszellen, welche mit 0,625 μM Disulfiram behandelt waren, beobachtet. p < 0,001 verglichen mit unbehandeltem oder mit DMSO-Vehikel behandelten Vergleichen. Zusätzlich erhöhte Disulfiram auch DNA-Laddering auf mit Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegelen (Daten nicht dargestellt).
Beispiel 5: Disulfiram und Kupfer induzieren G₂-Zellzyklus-Arrest und Apoptose.
Unsynchronisierte M1619 Melanom-Zellen wurden mit DMSO (3A), 5 μM Disulfiram (3B), oder 5 μM Disulfiram plus 250 μg/ml Ceruloplasmin (3C) inkubiert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen geerntet und flusszytometrischer Analyse zugeführt. Der Anteil an Nuklei in jeder Phase des Zellzyklus (in Klammern) wurde mit MODFIT DNA Analysesoftware bestimmt.
Disulfiram erhöht den Anteil von Zellen in S-Phase. Die Kombination von Disulfiram und Ceruloplasmin erhöht ferner die Anzahl von Zellen in S-Phase, induziert G₂-Zellzyklus-Arrest und Apoptose. 3A zeigt den Wachstum von unsynchronisierten M1619 Melanom-Zellen in der Gegenwart von DMSO-Vehikel. 3B zeigt, dass 5 μM Disulfiram die Anzahl von Zellen in G₀-G₁ induziert und den Anteil in S-Phase des Zellzyklus in M1619 Melanom-Zellen erhöht. 3C zeigt, dass 5 μM Disulfiram plus 250 μg/ml Ceruloplasmin (Cerulo) G₂-Zellzyklus-Arrest und Apoptose in M1619 Melanom-Zellen induziert.
Beispiel 6: Disulfiram verringert Proliferation durch Redox-Mechanismen nicht.
M1619 Melanom-Zellen, welche mit 10 % FBS stimuliert wurden, wurden in einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well plattiert, 24 Stunden wachsen gelassen und mit 5 μM Disulfiram oder 5 μl/ml DMSO-Vehikel behandelt, in der Gegenwart oder Abwesenheit des Stickoxidsynthase-Inhibitors Nω-Nitro-L-arginin (LNAME, 100 μM). Nach weiteren 24 Stunden wurde Proliferation wie in Beispiel 1 beschrieben, quantifiziert. *p < 0,01 verglichen mit DMSO; +P < 0,001 verglichen mit DMSO.
4 zeigt, dass die antiproliferative Aktivität von Disulfiram nicht durch Stickoxid vermittelt wird. Während der Stickoxidsynthase-Inhibitor Nω-Nitro-L-arginin (LNAME) alleine zellulären Wachstum leicht erhöht, verringerte LNAME die antiproliferative Wirkung von Disulfiram nicht. Daher scheint Disulfiram Wachstum durch negatives Beeinflussen des zellulären Redox-Zustandes nicht zu inhibieren.
Zusätzlich wurden in M1619 Zellen, welche mit Disulfiram, Kupfer oder beidem behandelt waren, reaktive Sauerstoffspezies unter Verwendung der H₂O₂-sensitiven intrazellulären Sonde 2',7'-Dichlorfluoreszin gemessen, wie offenbart in Royall, et al., Archiv. Biochem. Biophys. 302:348–355 (1993).
Weder Disulfiram (0,625 bis 5 μM), CuSO₄ (0,2–1,6 μM), noch die Kombination von 1,25 μM Disulfiram und 0,2 bis 1,6 μM CuSO₄ rief messbare Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies in M1619 Zellen hervor. Die Basislinien- Fluoreszenz von 1,431 ± 23 Einheiten wurde durch keine der Behandlungen erhöht. Gleichfalls gelang es Disulfiram nicht, GSH in M1619 Zellen abzureichern (228 ± 18 für FBS alleine; 254 ± 7 für DMSO-Vehikel-Vergleich; 273 ± 11 μM GSH/μg Zellprotein für 5 μM Disulfiram), und die Kombination von 5,0 μM Disulfiram und 1,6 μM CuSO₄ erhöhte sogar intrazelluläres GSH (293 ± 16 μM GSH/μg Zellprotein; p < 0,05 verglichen mit FBS alleine). Zusätzlich inhibierte das potente Antioxidationsmittel Probucol Wachstum einer jeglichen unserer Tumorzelllinien nicht signifikant.
Beispiel 7: Disulfiram plus Kupfer verringern Expression des Zellzyklusproteins Cyclin A und inhibieren DNA-Bindung von Transkriptionsfaktoren an DNA-Regulierungselemente, welche für Cyclin A-Expression wichtig sind.
M1619 Melanom-Zellen wurden in gleichen Dichten in 60 × 15 mm Plastik-Schalen plattiert, zu 80 % Konfluenz gewachsen und mit DMSO-Vehikel (5 μl/ml), Disulfiram (5 μM) oder der Kombination von Disulfiram und CuSO₄ (1,6 μM) behandelt. Nach den angegebenen Zeiten wurden die Zellen lysiert und Proteinextrakte SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) unterzogen, gefolgt von Western Blotting unter Verwendung von polyklonalem Antikörper vom Hasen. Typische Experimente sind für 2, 4, 8, 12, 24 und 48 Stunden Behandlung gezeigt. 5A zeigt, dass Disulfiram plus Kupfer Expression des Zellzyklusproteins Cyclin A verringert, was eine potentielle, näherungsweise Erklärung für die antiproliferativen Wirkungen dieser Wirkstoff-Metall-Kombination bereitstellt. Im Gegensatz dazu blieben Gehalte an Cyclin B1 unverändert, und in den von uns untersuchten Zelllinien hatte Disulfiram keine konsistente Wirkung auf die Expression des Zellzyklusinhibitors p21^WAF1/CIPI (Daten nicht dargestellt).
Cyclin A-Expression wird teilweise durch Bindung von c-Fos und CREB-1 Protein-Heterodimeren an ein cAMP responsives Element (CRE) in dem Cyclin A-Promotor reguliert. Siehe Sylvester et al., J. Clin. Invest. 101:940–948 (1998). M1619 Melanom-Zellen wurden bis zu 80 % Konfluenz auf 100 × 15 mm Plastik-Petri-Schalen wachsen gelassen, behandelt, nukleares Protein wurde geerntet und elektrophoretische Mobilität-Gel-Shift-Assays wurden durchgeführt. CRE-Komplexe (I und II) sind mit Label versehen. Behandlung von Zellen über 6, 12 oder 24 Stunden mit der Kombination von 5 μM Disulfiram und 1,6 μM Kupfersulfat unterbricht Transkriptionsfaktorbindung an CRE wesentlich. 5B zeigt, dass die Kombination von Disulfiram und Kupfer Transkriptionsfaktorbindung an CRE nach 6 Stunden Behandlung im Wesentlichen auslöscht, wobei eine verringerte Transkription des Cyclin A-Gens eine erwartete Folge davon wäre. EMSAs für 2, 6, 12 oder 24 Stunden Behandlung: Fötales Rinderserum (FBS) allein, Bahnen 1, 5, 9 und 13; FBS + DMSO-Vehikel, Bahnen 2, 6, 10, 14; FBS + Disulfiram, Bahnen 3, 7, 11, 15; FBS + Disulfiram + CuSO₄, Bahnen 4, 8, 12, 16. Konkurrenzexperimente sind in Bahnen 17–19 gezeigt: Bahn 17, FBS alleine; Bahn 18, FBS mit 10x nicht mit Label versehener CRE-Sonde, zur Bindungsreaktion hinzugefügt; Bahn 19, FBS mit 10x nicht mit Label versehener NF-κB-Sonde, zur Bindungsreaktion hinzugefügt.
Zugabe von Disulfiram und Kupfer direkt zu der Bindungsreaktion verringerte auch DNA-Bindung an CRE (Figur 5C, Bahn 5). Diese Verringerung war sogar noch ausgeprägter, wenn die Bindungsreaktion mit GSH anstelle von DTT als dem Reduktionsmittel durchgeführt wurde (5C, Bahn 9), und Inhibierung von CRE-Bindung durch Disulfiram und Kupfer in der Gegenwart von GSH wurde partiell umgekehrt durch simultane Zugabe von DTT (5C, Bahn 10). Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSAs) wurden mit den gleichen Verfahren wie beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 5C gezeigt. In Bahn 1, fötales Rinderserum (FBS) alleine; Bahn 2, FBS + DMSO-Vehikel; Bahn 3, FBS + Disulfiram (5 μM); Bahn 4, FBS + 1,6 μM CuSO₄; Bahn 5, FBS + Disulfiram + CuSO₄; Bahn 6, FBS alleine; Bahn 7, FBS + Disulfiram; Bahn 8, FBS + CuSO₄; Bahn 9, FBS + Disulfiram + CuSO₄; Bahn 10, FBS + Disulfiram + CuSO₄. In Bahnen 1–5 wurde DTT (2,5 mM) als ein Reduktionsmittel der Bindungsreaktion hinzugefügt, wohingegen in Bahn 6–9 GSH (3,0 mM) verwendet wurde. Disulfiram und Kupfer verringerten Transkriptionsfaktorbindung an CRE, aber die Wirkung war ausgeprägter, wenn die Bindungsreaktion mit GSH (Bahn 9) anstelle von DTT (Bahn 5) als einem Reduktionsmittel durchgeführt wurde. Inhibierung von Bindung an CRE durch Disulfiram und Kupfer in der Gegenwart von GSH wurde teilweise durch simultane Zugabe von DTT umgekehrt.
Beispiel 8: Andere Metalle als Kupfer können die antiproliferative Aktivität von Disulfiram erhöhen.
Die Absorption von Kupfer sowohl auf dem intestinalen als auch dem zellulären Niveau wird durch Zinkkationen blockiert, was zu der Verwendung von Zinkacetat als der bevorzugten Behandlung für Wilson's Krankheit führt, der vererbten Störung von Kupferüberbelastung. Siehe Brewer, et al., J. Am. Coll. Nutr. 9:487–491 (1990); Reeves, et al., J. Nutr. 126:1701–1712 (1996). Wir haben daher bestimmt, ob Zink-Zusatz zum Medium die antiproliferative Aktivität von Disulfiram inhibieren könnte, welche Kupfer-abhängig zu sein scheint.
M1619 Zellen wurden stimuliert und plattiert wie in Beispiel 1. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit den angegebenen Konzentrationen von Zinkchlorid (ZnCl₂) in der Gegenwart oder Abwesenheit von 0,625 μM Disulfiram behandelt. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Zellanzahl quantifiziert. Die Ergebnisse sind in 6A gezeigt. *p < 0,01 verglichen mit keinem ZnCl₂; +p < 0,001 verglichen mit keinem ZnCl₂. Überraschend erhöhte auch Zinkchlorid das antiproliferative Potential von Disulfiram wesentlich.
M1619 Zellen, wie oben plattiert und stimuliert, wurden mit FBS alleine, DMSO-Vehikel (5 μl/ml), Disulfiram (DS, 0,15 μM), 5 μM Konzentrationen von Metallsalzen (Kupfersulfat, CuSO₄; Silberlactat, C₃H₅AgO₃; Goldchlorid, HAuCl₄·3H₂O) oder der Kombination von DS plus Metallsalzen behandelt. Nach 48 Stunden wurde die Zellanzahl quantifiziert. *p < 0,05 verglichen mit DMSO; +p < 0,001 verglichen mit DS alleine. 6B zeigt, dass nicht nur Kupfer und Zink, sondern auch Salze von Gold und Silber die antiproliferative Aktivität von Disulfiram synergistisch verstärken können.
Vor dem Hintergrund dieser Ergebnisse haben wir Chelate von Disulfiram mit einer Anzahl von Metallionen, einschließlich Cu²⁺, Zn²⁺, Ag¹⁺, oder Au³⁺ synthetisiert. Während der Erzeugung der Disulfiram-Metall-Komplexe wurde Chelierung der Metallionen aus der wässrigen Phase nahegelegt durch eine Farbänderung in der Disulfiram-enthaltenden Chloroformphase (von blassgelb zu brilliantem goldenen Orange mit Komplexierung von Goldionen). M1619 Zellen, plattiert und stimuliert wie oben, wurden mit FBS alleine, DMSO-Vehikel (5 μl/ml), Disulfiram (DS, 160 nM) oder Konzentrationen von Gold-Disulfiram (AuDS) wie angegeben behandelt. Nach 48 Stunden wurde die Zellanzahl quantifiziert. *p < 0,001 verglichen mit DMSO; +p < 0,001 verglichen mit DS. 6C zeigt, dass Komplexe von Disulfiram mit Gold erhöhte antiproliferative Aktivität zeigen. Alle Metallkomplexe zeigten erhöhte antiproliferative Aktivität verglichen mit Disulfiram, aber die aktivste Verbindung wurde gebildet durch den Komplex von Gold mit Disulfiram (6C), welcher in nM-Konzentrationen antiproliferativ war.
Beispiel 9: Disulfiram potenziert die antineoplastische Wirkung von Cisplatin und Carmustin.
M1619 Melanom-Zellen wurden in 10 % FBS und RPMI 1640 bei einer Dichte von 50.000 Zellen/Well in 24-Well-Platten kultiviert. Nach 48 Stunden wurden dem Medium Cisplatin und 2,5 μM Disulfiram oder DMSO (5 μl pro ml) zugegeben. Nach weiteren 24 Stunden wurde Proliferation quantifiziert. Jede Säule stellt mittlere MTT-Formazan-Extinktion bei einem Minimum von 4 Experimenten dar.
M1619 Zellen wurden wie oben kultiviert unter Zugabe von Carmustin und 0, 6 μM Disulfiram oder DMSO (5 μl pro ml) zu dem Medium. Nach 24 Stunden wurde Proliferation quantifiziert.
Tabelle 2 zeigt, dass die Kombination von Disulfiram und Cisplatin oder Disulfiram und Carmustin signifikant stärker antiproliferativ gegen M1619 Zellen ist als Cisplatin oder Carmustin alleine. Jede Zahl stellt die mittlere MTT-Formazan-Extinktion bei einem Minimum von 4 Experimenten dar. ^Ap < 0,05 verglichen mit DMSO-Vehikel; ^Bp < 0,01 verglichen mit DMSO-Vehikel; ^Cp < 0,001 verglichen mit DMSO-Vehikel.
Disulfiram war als ein Wachstumsinhibitor von neoplastischen Zelllinien potenter als sein Sulfhydrylenthaltender Verwandter PDTC. Als ein Beispiel war die 50 Inhibitor-Konzentration (IC₅₀) gegen M1585 Melanom-Zellen etwa 1,25 μM für PDTC, jedoch nur 0,3 μM für Disulfiram. Dies legt nahe, dass das aktive antiproliferative Konstrukt von Thiocarbamaten das oxidierte dimere Disulfid ist, statt der reduziertes Thiol enthaltenden monomeren Form, welche häufig als ein Antioxidationsmittel verwendet wird.
TABELLE 2 DISULFIRAM POTENZIERT DIE ANTIPROLIFERATIVE AKTIVITÄT VON CHEMOTHERAPEUTISCHEN MITTELN
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Claims

Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer in einem Säugetier festgestellten Krebserkrankung.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Thiuramdisulfid ein Tetraalkylthiuramdisulfid ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramderivat-Disulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 2, wobei das Tetraalkylthiuramdisulfid Tetraetkylthiuramdisulfid ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Schwermetallion als ein Komplex mit dem Thiuramdisulfid verabreicht wird.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Schwermetallion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ionen von Arsen, Wismut, Kobalt, Kupfer, Chrom, Gallium, Gold, Eisen, Mangan, Nickel, Silber, Titan, Vanadium, Selen und Zink.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Schwermetallion aus der Gruppe bestehend aus Ionen von Gold, Silber und Zink ausgewählt ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Schwermetallion ein Kupferion ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Thiuramdisulfid und das Schwermetallion oral verabreicht werden.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Thiuramdisulfid und das Schwermetallion intravenös verabreicht werden.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Thiuramdisulfid in einer Dosis von 125 bis 1000 mg pro Tag verabreicht wird.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei die Krebserkrankung ein Melanom, eine Lungenkrebserkrankung, eine Brustkrebserkrankung oder ein Prostatakarzinom ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 1, wobei das Thiuramdisulfid und das Schwermetallion in Kombination mit einem anderen Antikrebsmittel verabreicht werden.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 12, wobei das andere Antikrebsmittel aus der Gruppe bestehend aus Cisplatin, Carboplatin, Cyclophosphamid, Nitrosoharnstoffen, Fotemustin, Herceptin, Carmustin, Vindesin, Etoposid, Daunorubicin, Adriamycin, Taxol, Taxoter, Fluoruracil, Methotrexat, Melphalan, Bleomycin, Salicylaten, Aspirin, Piroxicam, Ibuprofen, Indomethacin, Maprosyn, Diclofenac, Tolmetin, Ketoprofen, Nabumeton, Oxaprozin und Doxirubicin ausgewählt ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und eines Schwermetallions gemäß Anspruch 12, wobei das andere Antikrebsmittel Cisplatin oder Carmustin ist.
Verwendung eines Komplexes von Tetraethylthiuramdisulfid und Kupferion in einer Dosis von 125 bis 1000 mg pro Tag für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer in einem Menschen festgestellten Krebserkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Melanom, einer Lungenkrebserkrankung, Brustkrebserkrankung und ein Prostatakarzinom.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer in einem Säugetier festgestellten Krebserkrankung.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 16, wobei das Thiuramdisulfid ein Tetraalkylthiuramdisulfid ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 16, wobei das Tetraalkylthiuramdisulfid Tetraethylthiuramdisulfid ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 16, wobei das Thiuramdisulfid oral verabreicht wird.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 16, wobei das Thiuramdisulfid und das Ceruloplasmin intravenös verabreicht werden.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 16, wobei das Thiuramdisulfid in einer Dosis von 125 bis 1000 mg pro Tag verabreicht wird.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 16, wobei das Ceruloplasmin in einer Dosierung von 5 bis 30 mg pro Tag verabreicht wird.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 16, wobei die festgestellte Krebserkrankung ein Melanom, eine Lungenkrebserkrankung, eine Brustkrebserkrankung oder ein Prostatakarzinom ist.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 16, des Weiteren umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines anderen Antikrebsmittels an das Säugetier.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Thiuramdisulfids und von Ceruloplasmin gemäß Anspruch 24, wobei das andere Antikrebsmittel Cisplatin oder Carmustin ist.
Verwendung von Tetraethylthiuramdisulfid in einer Dosierung von 125 bis 1000 mg pro Tag und Ceruloplasmin in einer Menge von 5 bis 30 mg pro Tag für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer festgestellten Krebserkrankung, eines Melanoms, einer Lungenkrebserkrankung, einer Brustkrebserkrankung oder eines Prostatakarzinoms in einem Menschen.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und einen Komplex zwischen einem Thiuramdisulfid und einem Schwermetallion.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 27, wobei das Thiuramdisulfid Tetraethylthiuramdisulfid ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 27, wobei das Schwermetallion aus der Gruppe bestehend aus Gold-, Silber-, Selen- und Zinkionen ausgewählt ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 27, wobei das Schwermetallion ein Kupferion ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 27, des Weiteren umfassend ein anderes Antikrebsmittel.