DE69932845T2

DE69932845T2 - Methoden zur quantifizierung von hla-dr und cd11b

Info

Publication number: DE69932845T2
Application number: DE69932845T
Authority: DE
Inventors: A. Kenneth Mountain View DAVIS
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-12-02
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2019-12-03
Also published as: US20020076734A1; EP1135685B1; DE69932845D1; EP1135685A2; EP1605263A3; JP2002531832A; EP1605263A2; WO2000033082A3; US6423505B1; US6951727B2; WO2000033082A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf verbesserte Verfahren, Reagenzien und Kits zum Quantifizieren der Expression von HLA-DR und/oder CD11b auf der Oberfläche von humanen peripheren Blutzellen, besonders auf der Oberfläche von peripheren Blutmonozyten. Die Erfindung bezieht sich weiter auf Verfahren zur Bewertung der Immunkompetenz und zum Lenken und Überwachen von immunstimulierenden Therapien, basierend auf den so gemessenen Spiegeln der Monozyten-HLA-DR-Expression.
Hintergrund der Erfindung
Sepsis ist eine der häufigsten Ursachen von Tod in entwickelten Ländern. Die Häufigkeit ist steigend und die Mortalität bleibt hoch.
Frühe Anstrengungen, Sepsis zu verstehen und in das fortschreitende Multiorganversagen von septischem Schock einzugreifen, fokussierte sich auf leicht beobachtbare physikalische, physiologische und anatomische Symptome. Bis zum heutigen Tage bleibt die akute Behandlung von Fieber, Infektion, Koagulationsdysfunktion, Gefäßkollaps und Endorganversagen Therapiestandard.
Jüngere Anstrengungen, Sepsis zu verstehen und zu behandeln, fokussierten jedoch auf immunologischen Mediatoren, von denen gedacht wird, dass sie diesen systemischen Prozessen zugrunde liegen.
Tiermodelle der Sepsis implizierten zum Beispiel eine Anzahl von Zytokinen als Mediatoren der systemischen inflammatorischen Antwort, die beim septischen Patienten früh gesehen wird. Bei diesen Modellen führt die akute parenterale Herausforderung mit Endotoxin oder mit gramnegativen Bakterien zur Produktion von Tumornekrosefaktor α (TNFα), Interleukin-1 (IL-1) und Gamma-Interferon (IFNγ). Von Gamma-Interferon wurde gezeigt, dass es mit TNFα beim Induzieren von Schock in diesen Tieren synergistisch wirkt.
Dennoch stellten sich jüngere Anstrengungen, Sepsis durch Immunmodulation zu behandeln, als enttäuschend heraus. Versuche, die Wirkungen von proinflammatorischen Zytokinen, besonders TNFα und IL-1, zu reduzieren oder auszuschalten, schlugen nicht nur fehl den Ausgang zu verbessern, sondern steigerten in etlichen Fällen die Mortalität. Fisher et al., JAMA 271: 1836-43 (1994); Fisher et al., N. Engl. J. Med. 334: 1697-1702 (1996); Fisher et al., Crit. Care Med. 21: 318-327 (1993); zusammenfassend berichtet in Bone, JAMA 276: 565 (1996). Es existiert folglich ein Bedarf für immunmodulierende Therapien, die die klinischen Ergebnisse bei Sepsis verbessern.
Kürzlich motivierten etliche Beobachtungen einen alternativen, scheinbar konträren immunmodulierenden Ansatz.
Akute bakterielle Invasion ist in der Tat eine atypische klinische Präsentation humaner Sepsis. Bei den meisten Patienten ist Sepsis eine späte Komplikation von Trauma, Verbrennung oder großer Operation. Infektion bei diesen Patienten – wobei sie spät kommt, wie eine sekundäre Antwort auf eine vorangegangene Verletzung, eher als sie früh kommt, wie die primäre und tatsächliche Ursache von septischem Schock – zeugt eher von einer möglichen systemischen Immunsuppression oder Immunparalyse als von einem Zustand der Hyperimmunität, wie er durch die akuten Tiermodelle vorhergesagt worden ist.
Studien zeigten, dass die HLA-DR-Expression durch Monozyten nach Trauma stark reduziert ist und dass solch reduzierten Spiegel klinisch mit einer gesteigerten Empfänglichkeit von Traumapatienten für Infektion und septische Komplikationen korrelieren. Polk et al., Ann. Surg. 204: 282 (1986); Hersham et al., Clin. Exp. Immunol. 77: 67-70 (1989); Ditschkowski et al.; Ann. Surgery 229: 246-254 (1999); Giannoudis et al., Am. J. Surgery 177: 454-459 (1999).
Von der Reduktion der Monozyten-HLA-DR-Expression wurde auch gezeigt, dass sie infektiöse Komplikationen bei Patienten vorhersagt, die eine gewählte oder Notneurochirurgie durchmachen, Asadullah et al., Crit. Care. Med. 23: 1976-1983 (1995), dass sie die Entwicklung von Sepsis nach Lebenransplantation vorhersagt, van den Berk et al., Transplantation 63 (12): 1846-1848 (1997); Denzel et al., Intensive Care Med. 24: 1343-1346 (1998), und dass sie die Entwicklung von Sepsis nach Verbrennungen vorhersagt, Sachse et al., Clin. Chem. Lab. Med. 37 (3): 193-198 (1999).
Die Reduktion der Monozyten-HLA-DR-Expression – berichtet entweder als ein reduzierter Prozentsatz an HLA-DR⁺-Monozyten oder als eine Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität bei Monozyten-HLA-DR – wurde folglich bei Sepsispatienten mit einer großen Auswahl plötzlicher Erkrankungen beobachtet (im Überblick berichteten Haveman et al., Netherlands J. Med. 55: 132-141 (1999)).
Mit der Demonstration, dass gesteigerte Spiegel der HLA-DR-Expression mit einer reduzierten Monozytenfunktion in solchen Patienten in Beziehung gesetzt werden können, Volk et al., Behring Inst. Mitt. 88: 209-215 (1991); Döcke et al., in Reinhart et al. (Hrsg.), Sepsis: Current Perspectives in Pathophysiology and Therapy, New York: Springer Verlag S. 473-500 (1994), und mit der jüngeren Demonstration, dass sowohl Monozyten-HLA-DR-Expressionsspiegel als auch Zytokinsekretionsfähigkeit umgekehrt mit der Tumorlast in Glioblastom in Beziehung stehen, Woiciechowsky et al., J. Neuroimmunol. 84: 164-171 (1998), würde es nun scheinen, dass Monozyten-HLA-DR-Spiegel nicht nur als ein Marker der Monozytenfunktion verwendet werden können, sondern allgemeiner als ein Indikator der globalen Immunfunktion bei einer Reihe von menschlichen Störungen.
Und unter der Annahme der zentralen immunologischen Rolle, die von Monozyten gespielt wird, könnte von der Umkehr der Monozytendeaktivierung mit einer gleichzeitigen Steigerung der HLA-DR-Expression erwartet werden, dass die Immunfunktion bei einer oder mehreren menschlichen Störungen verbessert wird.
Gammainterferon (IFNγ) ist ein Hauptaktivator von Monozyten. Es reguliert die Oberflächenexpression von co-stimulierenden und HLA-Molekülen herauf, wodurch die Antigenpräsentierungsfähigkeit von Monozyten gesteigert wird, und bereitet die LPS-induzierte Produktion von proinflammatorischen Zytokinen vor. Young et al., J. Leukocyt. Biol. 58: 373-381 (1995).
Ein klinischer Versuch der Gammainterferonbehandlung von Sepsis in spätem Stadium wurde berichtet. Spiegel von peripheren Blutmonozyten-HLA-DR wurden in Patienten überwacht, welche den Einschlusskriterien für schwere Sepsis entsprachen.
Gammainterferon wurde diesen Patienten verabreicht, bei welchen über zwei aufeinanderfolgende Tage hinweg weniger als 30 % der peripheren Blutmonozyten für HLA-DR-Expression positiv gemessen wurden. Die Behandlung wurde fortgesetzt, bis der Prozentsatz an Monozyten mit einer demonstrierbaren HLA-DR-Expression über 50 % für drei Tage blieb. Von den 10 Patienten zeigten 8 eine Steigerung der Monozyten-HLA-DR-Expression innerhalb eines Behandlungstages; die anderen 2 sprachen innerhalb von 2 bis 3 Tagen an. Die Wiederherstellung der Monozyten-HLA-DR-Expression war verbunden mit der Restitution der Monozytenfunktion in vivo, wie belegt durch eine signifikante Steigerung von TNFα- und IL-6-Plasmaspiegeln während der Behandlung und ein günstigeres klinisches Ergebnis. Kox et al., Arch. Intern. Med. 157: 389-393 (1997); Döcke et al., Nature Med. 3: 678-680 (1997).
In einer kürzlich berichteten Studie eines einzelnen Lebertransplantationspatienten steigerte die IFN-γ-Behandlung signifikant den Prozentsatz an peripheren Blut-HLA-DR⁺-Monozyten, ohne Transplantatabstoßung zu induzieren. Denzel et al., Intens. Care Med. 24: 1343-1346 (1998).
Da die Applikation eines proinflammatorischen Zytokins jedoch in der frühen, hyperimmunen Phase der Sepsis oder während einem Vorfall der Transplantatabstoßung kontraindiziert wäre, besteht ein Bedarf für ein schnelles, zuverlässiges Verfahren, die HLA-DR-Expression auf peripheren Blutmonozyten zu messen. Es existiert weiter ein Bedarf für ein Verfahren, das Werte für eine gegebene periphere Blutprobe anzeigen würde, die zuverlässig und im Wesentlichen unabhängig von dem einzelnen Testlabor wären.
Typischerweise, wie in den berichteten klinischen Studien, wird die Monozyten-HLA-DR-Expression durchflusszytometrisch beurteilt. Monozyten werden von anderen peripheren Blutzellen durch entweder Oberflächenimmunphänotyp, physikalische Eigenschaften (Seitenstreuung und/oder Vorwärtsstreuung) oder gewisse Kombinationen davon bewertet; HLA-DR-Spiegel werden auf den so unterschiedenen Monozyten durch die Verwendung eines mit Fluorophor konjugierten Anti-HLA-DR-Antikörpers bewertet.
Monozyten können zum Beispiel unter Verwendung eines für CD14-spezifischen Antikörpers unterschieden werden. CD14, ein Rezeptor für Lipopolysaccharid, wird vorwiegend auf Zellen der Myelomonozytenlinie exprimiert; in peripherem Blut wird CD14 hauptsächlich durch Monozyten exprimiert. Granulozyten in dem Blut reagieren aber auch mit Anti-CD14-Antikörpern, obgleich schwach, und können mit vorhandenen Anti-CD14-Konjugaten nicht vollständig von Monozyten unterschieden werden. Das Ausblenden von CD14^dim-Zellen, als ein Mittel der Entfernung von Granulozyten aus der Analyse, entfernt CD14^dim-Monozyten ebenso, wodurch die HLA-DR-Analyse vereitelt wird. Folglich existiert ein Bedarf für ein Fluorophor, das, wenn es mit einem Anti-CD14-Antikörper konjugiert ist, die immunozytochemische Unterscheidung von Monozyten und Granulozyten erlauben würde.
HLA-DR kann auf der Oberfläche peripherer Blutzellen, einschließlich Monozyten, unter Verwendung eines Fluorophor-konjugierten Anti-HLA-DR-Antikörpers leicht markiert werden. Aber die Oberflächenexpression von HLA-DR auf der Oberfläche von Monozyten ist nicht ein einfacher, statischer und stabiler Phänotyp. Der durch periphere Blutmonozyten angezeigte Spiegel an HLA-DR-spezifischer Fluoreszenz hängt von der Inkubationsdauer mit Anti-HLA-DR-Antikörpern ab, was ein Anzeichen der dynamischen Natur der HLA-DR-Expression ist. Diese Zeitabhängigkeit macht zuverlässige, absolute Messungen der HLA-DR-Expression schwierig.
In der US 5,426,028 wird ein Verfahren vorgeschlagen, das chronische Müdigkeitssyndrom durch die Analyse von Unterpopulationen von peripheren mononukleären Blutzellen und Aktivierungsmarkern zu testen. In einem Beispiel wird ein positiver Test aus einer Zunahme in CD38 oder HLA-DR oder einer Abnahme in CD11b-Marker, in CD8+-Zellen, detektiert unter Verwendung von mit Fluorochrom markiertem monoklonalem Antikörper, geschlossen.
Mane et al. beschreiben in Arch. Biochem. Biophys., Band 268, S. 360-378, 1989, die Verwendung des lysomotropem Amins Methylamin-HCl, um die Oberflächenexpression gewisser Membranproteine zu steigern.
Minchinton et al., Clin. lab. Haemat., Band 11, S. 349-359, 1989, behandeln Neutrophile für die Entfernung von HLA mit Chloroquin vor der Analyse von für Neutrophile spezifischen Antigenen.
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren, eine Zusammensetzung und einen Kit bereitzustellen, welche die Stabilisierung der Zelloberflächenmolekülexpression für eine exakte Messung erlauben.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1, 35, 36, 44 bzw. 56 definiert.
Besondere Ausführungen sind in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst diese und andere Probleme der Technik durch Bereitstellung von verbesserten Verfahren, Reagenzien und Kits zum Quantifizieren der Expression von HLA-DR und/oder CD11b auf der Oberfläche von menschlichen peripheren Blutzellen, besonders auf der Oberfläche von peripheren Blutmonozyten.
Die Erfindung wird zum Teil auf dem neuen Befund basiert, dass Chloroquin das von CD14⁺-Monozyten erhaltene, HLA-DR-spezifische Fluoreszenzsignal stabilisiert; einschließlich dessen, dass Chloroquin während der Färbung die zeitabhängige Steigerung der HLA-DR-spezifischen Fluoreszenz, die in früheren Verfahren beobachtet wird, eliminiert. Dies ist überraschend: Von Chloroquin wurde berichtet, dass es nicht in der Lage ist, das zelluläre Recycling von MHC-Glykoproteinen zu hemmen, und von anderen Mitteln, welche die Verarbeitung von Proteinen beeinflussen, wie zum Beispiel Brefeldin A und Monensin, wurde gezeigt, dass sie beim Stabilisieren der HLA-DR-Expression unwirksam sind. Gleich überraschend ist das neue Ergebnis, dass die Wirkung nicht auf die Stabilisierung der HLA-DR-Expression beschränkt ist: Einschließlich dessen, dass Chloroquin während der Färbung von unfraktioniertem peripherem Blut mit Anti-CD11b-Antikörper das CD11b-spezifische Signal ebenso stabilisiert.
Die Erfindung ist zum Teil auch auf dem Befund basiert, dass die Konjugation eines Anti-CD14-Antikörpers mit einem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Tandem-Fluorophor, PerCP/CY5.5, ein hoch hochintensives, höchst einheitliches und gebündeltes Signal aus peripheren Blutmonozyten bereitstellt, wodurch die leichte Unterscheidung von Monozyten und Granulozyten erlaubt wird. Der Einschluss dieser Verbesserungen stellt einen für die klinische Verwendung gut angepassten Test bereit, wodurch die schnelle und zuverlässige quantitative Messung von peripheren Monozyten-HLA-DR-Spiegeln für die klinische Diagnose erlaubt wird, und um immunstimulierende Therapien zu motivieren, titrieren, individualisieren und zu überwachen.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung deshalb ein Verfahren zum Messen der HLA-DR-Expression auf der Oberfläche menschlicher Blutzellen bereit, umfassend das Kontaktieren einer menschliche Blutzellen umfassenden Probe mit einem lysosomotropen Amin und einem für HLA-DR spezifischen Antikörper und dann das Detektieren der Bindung des Anti-HLA-DR-Antikörpers an die Zellen. In bevorzugten Ausführungen ist das lysosomotrope Amin Chloroquin. In bevorzugten Ausführungen ist der Anti-HLA-DR-Antikörper mit einem Fluorophor konjugiert, vorzugsweise in einem definierten molaren Verhältnis; insbesondere bevorzugt ist die Konjugation an PE in einem definierten molaren Verhältnis und besonders bevorzugt ist die Konjugation an PE in einem molaren Verhältnis von 1:1.
Die Erfindung sorgt auch für die Messung von HLA-DR auf der Oberfläche von peripheren Blutmonozyten. In bevorzugten Ausführungen ist ein Monozyten unterscheidender Antikörper, typischerweise anti-CD14, in den Färbeschritt eingeschlossen. In besonders bevorzugten Ausführungen ist der Anti-CD14-Antikörper mit der PerCP-Einheit eines PerCP/CY5.5-Tandemfluorophormoleküls konjugiert, wodurch die Einzellaser-Vielfarb-Durchflusszytometrie-Analyse erlaubt wird.
In bevorzugten Ausführungen wird eine Gesamtblutprobe genutzt, obwohl die Verfahren und Reagenzien mit geeigneten Blutfraktionen, wie zum Beispiel mit peripheren blutmononukleären Zellen angereicherte Fraktionen, ebenso verwendet werden können. Bei den Gesamtblutausführungen liegt ein weiterer Schritt des Lysierens der Erythrozyten in der Blutprobe, bevorzugt zwischen dem Färbeschritt und dem Detektionsschritt. Das Verfahren kann noch einen weiteren Schritt des Entfernens von Lysetrümmern nach dem Lyseschritt, aber vor der Detektion, einschließen.
Ergebnisse aus dem verbesserten HLA-DR-Test der vorliegenden Erfindung korrelieren mit Ergebnissen aus früheren, aber problematischen Tests gut. Dieser hohe Korrelationsgad erlaubt die direkte Übertragung etablierter klinischer Kriterien auf durch den vorliegenden Test berichtete Messungen.
Folglich stellt in einem anderen Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bewertung des Immunzustands eines menschlichen Patienten bereit, umfassend die Schritte des Kontaktierens einer Probe, die Blutzellen des Patienten enthält, mit einem lysosomotropen Amin und einem für HLA-DR spezifischen Antikörper; des Detektierens der Bindung des Anti-HLA-DR-Antikörpers an die Monozyten in der Probe; und dann des Vergleichens des so detektierten Bindungsspiegels mit einem empirisch bestimmten Kontrollwert. In bevorzugten Ausführungen dieses Verfahrens ist das lysosomotrope Amin Chloroquin, der Anti-HLA-DR-Antikörper ist an PE konjugiert und ein Monozyten-Unterscheidungs-Antikörper wie anti-CD14, vorzugsweise anti-CD14-PerCP/CY5.5, ist in den Färbeschritt eingeschlossen.
Die Erfindung stellt auch in einem verwandten Aspekt Verfahren zum Bestimmen der Eignung immunstimulierender Therapie in einem Patienten mit einer reduzierten Monozytenfunktion und genauer in einem Patienten mit einer reduzierten Monozyten-HLA-DR-Expression bereit.
In einer Ausführung dieses Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren das Kontaktieren einer Probe, die Blutzellen des Patienten enthält, mit einem lysosomotropen Amin und einem für HLA-DR spezifischen Antikörper; das Detektieren der Bindung des Anti-HLA-DR-Antikörpers an die Monozyten in der Probe; und dann das Vergleichen des so detektierten Bindungsmaßes mit einer empirisch bestimmten Behandlungsschwelle. Patienten mit einer niedrigeren Bindung als der empirisch bestimmten Behandlungsschwelle werden als für immunstimulierende Behandlung geeignet bestimmt.
In einem Patienten mit Sepsisrisiko oder in einem Patienten mit Sepsis mit einem Risiko des Fortschreitens zu septischem Schock stellt dieser Aspekt der Erfindung Verfahren zum Bestimmen der Geeignetheit von immunstimulatorischer Therapie bereit, umfassend das Kontaktieren einer Probe, die die Blutzellen des Patienten enthält, mit einem lysosomotropen Amin und einem für HLA-DR spezifischen Antikörper; Detektieren der Bindung des Anti-HLA-DR-Antikörpers an die Monozyten in der Probe; und dann Vergleichen des so detektierten Bindungsmaßes mit einer empirisch bestimmten Behandlungsschwelle. Patienten mit einem Bindungsmaß, das niedriger ist als Schwellenwerte, werden als für immunstimulatorische Behandlung geeignet bestimmt. Unter Anwendung von gegenwärtigen klinischen Kriterien werden Sepsispatienten mit durchschnittlich weniger als 5000 Anti-HLA-DR-Antikörpern pro Monozyte als für immunstimulatorische Behandlung geeignet bestimmt, wobei Patienten mit durchschnittlich weniger als 3000 Anti-HLA-DR-Antikörpern pro Monozyte als insbesondere geeignet bestimmt werden und Patienten mit durchschnittlich weniger als 3000 Anti-HLA-DR-Antikörper pro Monozyte an zwei aufeinanderfolgenden Tagen als besonders geeignet für immunstimulatorische Behandlung bestimmt werden.
In besonders bevorzugten Ausführungen des Verfahrens zum Bestimmen der Geeignetheit der Behandlung wird eine periphere Blutprobe im ersten Schritt mit einem Anti-HLA-DR-PE-Antikörper, einem Anti-CD14-PerCP/CY5.5-Antikörper und Chloroquin kontaktiert.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die nützlich sind zum Durchführen der gegenständlichen Verfahren. Die Zusammensetzungen für die durchflusszytometrische Messung von HLA-DR auf humanen peripheren Blutzellen umfassen einen Fluorophor-konjugierten Anti-HLA-DR-Antikörper und ein lysosomotropes Amin, z. B. Chloroquin. Der Anti-HLA-DR-Antikörper kann an PE konjugiert sein, vorzugsweise in einem definierten molaren Verhältnis, und in besonders bevorzugten Ausführungen in einem molaren Verhältnis von 1:1.
Für die durchflusszytometrische Messung von HLA-DR auf peripheren Blutmonozyten umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weiter einen Monozyten unterscheidenden Antikörper, vorzugsweise einen Anti-CD14-Antikörper, bevorzugter einen Anti-CD14-Antikörper, der mit einem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Tandemfluorophor konjugiert ist, am bevorzugtesten konjugiert mit der PerCP-Einheit von PerCP/CY5.5.
Die vorliegenden Verfahren sind besonders nützlich in klinischen Situationen und werden folglich wahrscheinlich unter anderem durch Kliniklaboratorien durchgeführt werden. Ein beliebiges klinisches Labor mag jedoch nur sporadischen Bedarf haben, solche Verfahren durchzuführen. Die Erfindung stellt folglich in einem anderen Aspekt Kits bereit, welche es erlauben, dass der Test leicht auf einer bedarfsabhängigen Basis durchgeführt wird.
In bevorzugten Ausführungen umfasst ein Kit der gegenwärtigen Erfindung eine oder mehrere Färbezusammensetzungen und eine Zusammensetzung zum Lysieren von Erythrozyten. Wenigstens eine Färbezusammensetzung umfasst einen Anti-HLA-DR-Antikörper und ein lysosomotropes Amin, vorzugsweise Chloroquin. In bevorzugten Ausführungen ist der Anti-HLA-DR-Antikörper an PE konjugiert, vorzugsweise in einem definierten molaren Verhältnis, am bevorzugtesten in einem Verhältnis von 1:1. In Ausführungen, die zum Quantifizieren von HLA-DR auf der Oberfläche von peripheren Blutmonozyten nützlich sind, umfasst wenigstens eine Färbezusammensetzung des Kits einen Monozyten unterscheidenden Antikörper, vorzugsweise anti-CD14. In bevorzugten Ausführungen ist der Anti-CD14-Antikörper mit einem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Tandemfluorophor, am bevorzugtesten PerCP/CY5.5, konjugiert. In besonders bevorzugten Ausführungen enthält das Kit eine Färbezusammensetzung, die einen Anti-HLA-DR-PE-Antikörper, einen Anti-CD14-PerCP/CY5.5-Antikörper und Chloroquin umfasst.
In anderen Ausführungen umfasst das Kit eine oder mehrere Färbezusammensetzungen, eine Zusammensetzung zum Lysieren von Erythrozyten und umfasst weiter pelletierte Perlen, die mit definierten PE-Spiegeln konjugiert sind. Bei diesen Ausführungen ist der Anti-HLA-DR-Antikörper an PE konjugiert, und die pelletierten Perlen erlauben die Kalibrierung des Durchflusszytometers, um Quantifizierung aus der gemessenen PE-Fluoreszenz der Menge an pro Zelle gebundenem HLA-DR-Antikörper zu erlauben.
In einem anderen Aspekt, der keinen Teil der beanspruchten Erfindung bildet, wird ein neues monozytenspezifisches Immunkonjugat bereitgestellt, umfassend einen Anti-CD14-Antikörper, der an die PerCP-Einheit eines PerCP/CY5.5-Tandemfarbstoffinoleküls konjugiert ist. Die Spezifität der CY5.5-Einheit für CD64, gekoppelt mit der Spezifität des Antikörpers für CD14, stellt ein hochintensives monozytenspezifisches Signal für Einzellaser-Vielfarben-Durchflusszytometrie-Anwendungen bereit.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Messen der CD11b-Expression auf der Oberfläche menschlicher Blutzellen bereit, umfassend das Kontaktieren einer humane Blutzellen enthaltenden Probe mit einem lysosomotropen Amin und einem für CD11b spezifischen Antikörper; und dann Testen der Bindung des CD11b-Antikörpers an die Zellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die obigen und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Berücksichtigung der folgenden detaillierten Beschreibung, in Zusammenschau mit den begleitenden Zeichnungen, ersichtlich werden, in welchen:
1 eine Grafik ist, welche die Zeitabhängigkeit des HLA-DR-spezifischen Fluoreszenzsignals, angezeigt durch CD14⁺-Monozyten, inkubiert für verlängerte Zeiten mit einem Anti-HLA-DR-PE-Antikörper gemäß früherer Methodik, zeigt;
2 Grafiken präsentiert, welche die Fähigkeit von Chloroquin – aber nicht von Azid, Brefeldin A oder Monensin – zeigen, das HLA-DR-spezifische Fluoreszenzsignal zu stabilisieren, das durchflusszytometrisch von Monozyten aus verschiedenen Individuen gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen wird, wobei die 2D und 2E die Ergebnisse von Chloroquintitrationsexperimenten zeigen;
3 Dot-Plots von peripheren Blutzellen aus zwei Patienten zeigt, die einen großen Bereich an CD14-spezifischer FITC-Fluoreszenz in der CD86⁺-Population gemäß früherer Methodik zeigen;
4 Dot-Plots von peripheren Blutzellen zeigt, die aus denselben beiden Individuen wie in 3 entnommen worden sind, welche die starke Ansammlung von CD14⁺-Monozyten (eingekreist) unter Verwendung eines an die PerCP-Einheit eines PerCP/CY5.5-Tandemfluorophors, der keinen Teil der Erfindung bildet, konjugierten Anti-CD14-Antikörpers zeigt;
5 Daten zeigt, die aus einer Probe mit peripherem Blut eines Patienten unter Verwendung der Reagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnen worden sind;
6 Monozyten-HLA-DR-Expressionsdaten, die unter Verwendung der Reagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind, gegen Daten aus denselben Proben, die unter Verwendung eines früheren Ansatzes erhalten worden sind, aufträgt; und
7 Stabilisation durch Chloroquin von CD11b-spezifischem Fluoreszenzsignal zeigt, das durchflusszytometrisch in einer Gesamtblutprobe gemessen worden ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In der Beschreibung bezieht sich „Monozyten unterscheidende Antikörper" auf jeden Antikörper, der alleine, in Kombination mit den physikalischen Eigenschaften einer Zelle, wie zum Beispiel Lichtstreueigenschaften, oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen Antikörpern verwendet werden kann, um Monozyten in einer peripheren Blutprobe zu unterscheiden. Der Begriff schließt folglich unter anderem einen Anti-CD14-Antikörper ein.
Vorangegangene klinische Studien legen nahe, dass proinflammatorische Zytokine erfolgreich verwendet werden können, um Patienten mit einer erniedrigten Monozytenfunktion zu behandeln. Die Studien schlugen besonders vor, dass immunstimulierende Therapie erfolgreich verwendet werden kann, um jene septischen Patienten zu behandeln, in denen die frühe proinflammatorische Antwort den Weg freimachte für eine systemische Immunsuppression oder „Immunparalyse", gekennzeichnet durch eine reduzierte Monozytenfunktion. Weitere Anzeichen legen nahe, dass eine fortwährende Reduktion der HLA-DR-Expression bei peripheren Blutmonozyten ein nützlicher Marker dieses immunsuprimierten Zustandes ist und dass therapeutische Entscheidungen auf solchen Messungen erfolgreich basiert werden können.
Obwohl Reagenzien und Verfahren gegenwärtig existieren, welche die Messung von HLA-DR auf der Oberfläche von Monozyten erlauben, sind zwei Probleme leicht mit Versuchen verbunden, einen verbesserten durchflusszytometrischen Test zu entwickeln, der gleichzeitig schnell, reproduzierbar und quantitativ ist.
Das erste bezieht sich auf die dynamische Natur der HLA-DR-Expression auf der Oberfläche von kompetenten APCs wie Monozyten. Wie weiter im Beispiel unten beschrieben, wurden periphere Blutproben von normalen Donoren mit einem im Handel erhältlichen PE-konjugierten Anti-HLA-DR-Antikörper inkubiert. In der Inkubation ebenfalls vorhanden war ein Monozyten unterscheidender Antikörper, anti-CD14.
1 zeigt, dass die Inkubation von peripheren Blutproben mit einem Anti-HLA-DR-Antikörper eine zeitabhängige Zunahme in der HLA-DR-spezifischen Fluoreszenz, die durchflusszytometrisch auf den CD14⁺-Monozyten gemessen wird, veranlasst. Weiterhin hängt die Steigung der Zunahme von dem einzelnen Donor ab; als ein Ergebnis kann sie nicht leicht durch eine einfache und universelle mathematische Anpassung kontrolliert werden.
Die Basis für diese Zeitabhängigkeit des HLA-DR-Fluoreszenzsignals ist unsicher.
Teil der mechanistischen Unsicherheit stammt ohne Zweifel von der Fähigkeit des Durchflusszytometers, Fluoreszenz leicht von verinnerlichtem, ebenso wie zelloberflächengebundenem Antikörper zu detektieren. Picker et al., Blood 86 (4): 1408-1419 (1995); Suni et al., J. Immunol. 212: 89-98 (1998). Von MHC-Klasse-II-Antigenen ist bekannt, dass sie verinnerlicht und dann recycelt werden. Der Vorgang ist schnell, mit einer Halbwertszeit der Endzytose der Oberflächen-Klasse-II-Population von 33 Minuten; der Recyclingverkehr kann in der Tat den biosynthetischen HLA-DR-Verkehr um etwa das 60fache übertreffen. Reid et al., Nature 346: 655-57 (1990). Während man nicht wünscht, durch Theorie gebunden zu sein, ist es möglich, dass die Zunahme im HLA-DR-Signal, die beobachtet wird, durch die fortschreitende innere Ansammlung des Proteins, das während seiner Passage auf der Zelloberfläche markiert worden ist, verursacht wird.
Unsicherheit stammt auch aus der hohen Komplexität der Verkehrswege. MHC-Restriktion stellt konfligierende Anforderungen an die Proteinverarbeitungsmaschinerie der APC: Auf der einen Seite gibt es ein Erfordernis für ein proteolytisch-verarbeitetes Peptidantigen; auf der anderen Seite gibt es ein Erfordernis für ein intaktes MHC-Klasse-II-Protein. Diesen gleichzeitigen Erfordernissen wird durch eine fein choreographierte und bis jetzt unvollständig verstandene koordinierte Bewegung von endozytosiertem Antigen und neu synthetisierten MHC-Klasse-II-Molekülen durch verschiedene interne Kompartimente der Zelle hindurch entsprochen. Cresswell, Annu. Rev. Immunol. 12: 259-93 (1994). Schnelles Recycling von Klasse-II-Molekülen von der Oberfläche durch Kompartimente hindurch, die zum Teil von jenen deutlich verschieden sind, welche von neu synthetisierten MHC durchquert werden, und dann zurück zu der Oberfläche, bezieht noch andere, wahrscheinlich überschneidende intrazelluläre Wege ein, Reid et al., Nature 346: 655-657 (1990); Roche et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8581-85 (1993); Watts, Annu. Rev. Immunol. 15: 821-50 (1997).
Die vorliegende Erfindung ist zum Teil auf dem überraschenden Befund basiert, dass Chloroquin, wenn es in die Inkubation mit Anti-HLA-DR-Antikörper eingeschlossen wird, das aus CD14⁺-Monozyten gewonnene HLA-DR-spezifische Signal stabilisiert. Diese Entdeckung ist besonders übereaschend in Anbetracht der von Chloroquin berichteten Unfähigkeit, das Recycling von MHC-Glycoproteinen zu hemmen, Reid et al., Nature 346: 655-57 (1990).
2 zeigt, dass die Zugabe von Chloroquin in einer Endkonzentration von 3 mM das HLA-DR-Fluoreszenzsignal stabilisiert. Azid (2A), Brefeldin A (2C) und Monensin (2C), wobei von den letzteren beiden bekannt ist, dass sie mit Proteinverarbeitungsschritten im Zusammenhang mit Golgi in Wechselwirkung treten, stellen keine signifikante Stabilisierung bereit.
Folglich macht der Einschluss von Chloroquin während der Inkubation mit Anti-HLA-DR-Antikörper das Ergebnis im Wesentlichen unabhängig von der Dauer der Inkubation, von annähernd 15 Minuten bis zu dem maximal getesteten Zeitraum von 60 Minuten. Dies steigert wesentlich die Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit und Nützlichkeit dieses Tests für die klinische Verwendung.
Obwohl sich die in 2 gezeigte Inkubation von ungefähr 15 Minuten bis ungefähr 60 Minuten erstreckt, beträgt die Inkubation vorzugsweise 20 bis 50 Minuten, bevorzugter 25 bis 45 Minuten, am bevorzugtesten 25 bis 35 Minuten. Und obwohl Chloroquin beispielhaft angeführt und gegenwärtig bevorzugt wird, können andere lysosomotrope Amine, welche das HLA-DR-spezifische Fluoreszenzsignal stabilisieren, ebenfalls verwendet werden. Lysosomotrope Amine schließen zum Beispiel Chloroquin, Hydroxychloroquin, Primaquin und Methylamin ein.
Die 2D und 2E präsentieren Chloroquintitrationsexperimente, womit gezeigt wird, dass eine Minimalkonzentration von 2 mM Chloroquin benötigt wird, um HLA-DR-Stabilisation in dem Test zu bewirken. Chloroquin ist folglich in der Inkubation in einer Endkonzentration von 2,0 bis 50 mM, vorzugsweise 2 bis 5 mM, bevorzugter in einer Endkonzentration von 2 bis 3 mM, am bevorzugtesten in einer Endkonzentration von ungefähr 3 mM, eingeschlossen. Die Bestimmung der Konzentration von Chloroquin oder anderem lysosomotropem Amin, das am besten für die stabile Messung von HLA-DR geeignet ist, ist leicht unter Verwendung von Standardtitrierungsexperimenten bestimmt, wie zum Beispiel in Beispiel 2 unten berichtet.
In bevorzugten Ausführungen des Verfahrens und der Reagenzien der vorliegenden Erfindung ist der Anti-HLA-DR-Antikörper spezifisch für nichtpolymorphe Klasse-II-Determinanten und kann folglich für die Messung von HLA-DR in mehreren Individuen, vorzugsweise sämtlichen menschlichen Individuen, verwendet werden. Es wird auch bevorzugt, dass der Antikörper nicht mit HLA-DQ- oder HLA-DP-Molekülen kreuzreagiert. Die hierin berichteten Experimente verwendeten Anti-HLA-DR-Antikörper vom Klon L243.
Zusätzlich, obwohl die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Reihe von Anti-HLA-DR-Antikörpern, konjugiert mit einer Reihe von Fluorophoren, verwenden können, nutzt die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise HLA-DR-Antikörper, welche die Quantifizierung der HLA-DR-Oberflächendichte erlauben.
Eine Anzahl von früheren Berichten beschreibt die Vorteile des Messens der Menge oder Dichte von Antigenexpression auf Zellpopulationen im Vergleich mit dem einfachen Testen der Häufigkeit von Zellen, die das Antigen exprimieren.
Poncelet et al., Eur. J. Histochem. 1: 15-32 (1996); Lavabre-Bertrand, Eur. J. Histochem. 1: 33-38 (1996); Liu et al., Cytometry 26: 1-7 (1996); Moore, Science 276: 51-52 (1997); Rehse et al., Cytometry 22: 317-322 (1995); Patel et al., Anal. Biochem. 229: 229-235 (1995). Quantitative Methodik ist besonders wichtig beim Charakterisieren von Zellpopulationen, welche heterogene Antigenspiegel exprimieren, und beim Charakterisieren der Expression von Antigenen, deren Spiegel sich dynamisch ändern. Die Monozytenexpression von HLA-DR erfüllt beide dieser Kriterien.
Im Zusammenhang mit der immunstimulierenden Behandlung der reduzierten Monozytenfunktion, wie bei Sepsis, sollte eine feinere Unterscheidung von Monozyten-HLA-DR-Oberflächenspiegeln zu einer genaueren und verbesserten Unterscheidung der Patientenpopulationen führen, die wahrscheinlich von der Therapie einen Nutzen ziehen, wobei die Immunstimulation von klinisch ungeeigneten Patienten vermieden wird. Für jene Patienten, die für die Behandlung mit IFN-γ, G-CSF oder anderen Immunstimulanzien ausgewählt worden sind, sollte eine feinere Unterscheidung von Monozyten-HLA-DR-Spiegeln eine Dosisindividualisierung, basierend auf der Dichteverteilung von HLA-DR auf den Monozyten des peripheren Bluts jedes Patienten, erlauben; in der berichteten Pilotstudie wurde sämtlichen Patienten, welche die Einschlusskriterien erfüllten, eine einheitliche Dosis Interferon gegeben.
Noch ein weiterer Vorteil der quantitativen Analyse ist, dass solch eine Quantifizierung den Test im Wesentlichen unabhängig von Variationen von Labor zu Labor machen. Im Gegensatz dazu ist die qualitative Klassifikation, wie zum Beispiel das Definieren von positiv färbenden Populationen, als Hell (engl.: bright) oder Dunkel (engl.: dim), sowohl subjektiv als auch höchst abhängig von dem Messinstrument und seinen Einstellungen. Zum Beispiel war, in dem von sowohl von Kox et al., Arch. Intern. Med. 157:389-393 (1997) als auch von Döcke et al., Nature Med. 3:678-681 (1997) berichteten klinischen Versuch die PE-Fluoreszenzintensitätsgrenze, die verwendet worden ist, um HLA-DR^-- von HLA-DR⁺-Populationen zu unterscheiden, sowohl idiosynkratisch als auch maschinenabhängig. Zusätzlich stellt die Verwendung solch eines Kriteriums, um zwei Populationen zu definieren – eine positive, eine negative – nur ein grobes Maß der Verteilung von HLA-DR-Dichten in der Monozytenpopulation bereit.
Folglich nutzt eine bevorzugte Ausführung der Zusammensetzungen, Verfahren und Kits der vorliegenden Erfindung HLA-DR-Antikörper, welche die Quantifizierung der HLA-DR-Oberflächendichte erlauben. Vorzugsweise sind solche Antikörper an Phycoerythrin (PE), bevorzugter in einem definierten molaren PE:Ab-Verhältnis, am bevorzugtesten in einem molaren Verhältnis von 1:1 konjugiert.
PE ist besonders gut geeignet für solch eine quantitative Analyse: Es ist hell und es hat keine Selbstauslöschung. Fluorophore wie Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), CY3 und CYS können sich aufgrund von Überlappung ihrer Exzitations- und Emissionsspektren selbst auslöschen. Von Auslöschung von FITC wurde gezeigt, dass sie sowohl durch die Nähe von FITC-Molekülen zu einem einzelnen Antikörper als auch durch die Nähe von FITC-Molekülen zu benachbarten Antikörpern, die auf ein hoch dichtes zelluläres Epitop gerichtet sind, geschieht. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6. Aufl., Molecular Probes Inc., Eugene, OR (1996); Deka et al., Cytometry 25: 271-279 (1996). Peridiniumchlorophyllprotein (PerCP), das unter anderem beschrieben ist im US-Patent Nr. 4,876,190, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, photolysiert während seines Übergangs durch den Laser des Durchflusszytometers, was eine exakte Quantifizierung ausschließt. Andere Vorteile von PE für die Antigen-Dichtequantifizierung werden im US-Patent Nr. 5,620,842 beschrieben, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Ein weiterer Vorteil von PE als ein Fluorophor ist die kommerzielle Verfügbarkeit von Anti-HLA-DR-Antikörpern, die in definierten molaren Verhältnissen an PE konjugiert sind (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) und die kommerzielle Verfügbarkeit von pelletierten Perlenstandards (QuantiBRITE^TM, BDIS), wobei die Perlen definierte PE-Fluoreszenzspiegel bereitstellen.
Das zweite Problem im Zusammenhang mit Versuchen, einen verbesserten Durchflusszytometrietest für HLA-DR-Expression auf peripheren Blutmonozyten zu entwickeln, ist, dass mit FITC und mit anderen üblichen, PE-unterscheidbaren Fluorophoren markierte Anti-CD14-Antikörper die unzweideutige Diskriminierung von Monozyten und Granulozyten nicht erlauben. Ein ausreichender Prozentsatz an Monozyten färbt so blass mit anti-CD14, dass die schwach gefärbte Granulozytenpopulation überlappt wird. Dies ist in 3 gezeigt, Dot-Plots aus zwei gesonderten Patienten zeigen in jedem Fall den breiten Bereich von Anti-CD14-FITC-Fluoreszenz in der CD86⁺-Population in peripherem Blut.
Die vorliegende Erfindung ist weiter zum Teil auf der neuen Entdeckung basiert, dass Konjugieren eines Anti-CD14-Antikörpers mit der PerCP-Einheit eines PerCP/CY5.5-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Tandemfluorophors ein hochspezifisches, hochuniformes, hochintensives gebündeltes Signal von peripheren Blutmonozyten bereitstellt, wodurch die leichte Unterscheidung von Monozyten und Granulozyten erlaubt wird.
Cyanin-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Tandemfluorophore („Tandemfluorophore", „Tandemfarbstoffe", „Trikolorfarbstoffe") haben kürzlich die Auswahl an Fluorophoren erweitert, die für die Einzellaser-Vielfarb-Durchflusszytometrie-Analyse erhältlich sind. Die PE-CYS-Tandemfärbung erwies sich als besonders gut geeignet für die Dreifarbanalyse: Die R-PE-Einheit, angeregt durch das Licht mit 488 nm eines Argonionenlasers, dient als ein Energiedonor, und CYS, wirkend als ein Energieakzeptor, fluoresziert bei 670 nm, was leicht unterscheidbar ist von der Emission von FITC und PE. Cyaninfluorophore sind beschrieben in den US-Patenten mit den Nummern 5,268,486; 4,337,063; 4,404,289; 4,405,711; und in Mujumdar et al., Bioconj. Chem. 4: 105-111 (1993); Southwick et al., Cytometry 11: 418-430 (1990); Ernst et al., Cytometry 10: 3-10 (1989); und Mujumdar et al., Cytometry 10: 11-19 (1989), und Cyanin-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Tandemfluorophore sind beschrieben unter anderem in den US-Patenten mit den Nummern 5,714, 386 und in Waggoner et al., Ann. NY Acad. Sci. 677: 185-193 (1993), und Landsdorp et al., Cytometry 12: 723-30 (1991), deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Von der CYS-Einheit dieser Tandemfluorophore wurde jedoch gezeigt, dass sie direkt an CD64 (FcγRI) bindet, was falsche, antikörperunabhängige Signale auf CD64⁺-Zellen ergibt. Van Vugt et al., Blood 88: 2358-2360 (1996). Diese antikörperunabhängige Bindung hat merkliche Anstrengungen in der Technik motiviert, die CYS-Einheit zu maskieren, um die Scheinbindung an auf der Oberfläche von peripheren Blutzellen präsentierten CD64-Molekülen zu reduzieren; etliche dieser Anstrengungen sind unter anderem beschrieben in der zusammen zu eigenen und ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 08/943,491, angemeldet am 3. Oktober 1997, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist.
Aber da CD64 konstitutiv auf Monozyten und Makrophagen exprimiert wird und durch IFN-γ stark heraufreguliert wird, kann es als ein nützlicher Monozyten unterscheidender Marker dienen. Folglich wurde in einem Ansatz, im Gegensatz zu jenem, der früher genutzt worden ist, um farbstoffvermittelte Bindung zu reduzieren, ein neues Anti-CD14-Konjugat zubereitet, in welchem die CY5.5-Einheit eines Tandem-PerCP/CY5.5-Fluorophors gezielt orientiert worden ist, um seine Wechselwirkung mit CD64 zu erleichtern. Bei diesem neuen Konjugat wurde der Anti-CD14-Antikörper mit der PerCP-Einheit eines PerCP/CY5.5-Tandemfarbstoffs konjugiert, wodurch folglich die CY5.5-Einheit in einer gewissen Distanz vom Antikörper gezeigt wird.
4 zeigt die starke Bündelung von CD14⁺-Monozyten, beobachtet unter Verwendung dieses neuen CD14-PerCP/CY5.5-Konjugates. Die Proben wurden aus denselben Patienten entnommen, wie jenen, deren Daten in 3 gezeigt sind. Obwohl PerCP/CY5.5 beispielhaft veranschaulicht ist, kann das Tandemfluorophor PE/CYS ebenfalls verwendet werden. PerCP/CYS wurde in den gegenwärtigen Verfahren als ineffektiv befunden.
In einem Aspekt stellt die gegenwärtige Erfindung dann ein Verfahren zum Messen der HLA-DR-Oberflächenexpression auf menschlichen peripheren Blutmonozyten bereit, welches beide dieser Verbesserungen einschließt. In bevorzugten Ausführungen wird eine periphere Blutprobe in der Anwesenheit von Chloroquin mit einem ersten Antikörper in Kontakt gebracht, wobei der erste Antikörper für HLA-DR spezifisch ist und an PE konjugiert ist, und wird auch mit einem zweiten Antikörper in Kontakt gebracht, wobei der zweite Antikörper für CD14 spezifisch ist und an die PerCP-Einheit eines PerCP/CY5.5-Tandemfluorophors konjugiert ist; die Bindung des Anti-HLA-DR-Antikörpers an die CD14⁺-Zellen wird dann gemessen, vorzugsweise durch Durchflusszytometrie.
Die Antikörperinkubation wird vorzugsweise auf einer unfraktionierten – das heißt Gesamtblut – peripheren Blutprobe durchgeführt. Obwohl die Verfahren, Reagenzien und Kits der vorliegenden Erfindung ebenso verwendet werden können, um die HLA-DR-Expression auf Monozyten enthaltenden peripheren Blutfraktionen zu bewerten, bewirkt die Elimination vorhergehender Fraktionierungsschritte eine Vereinfachung gegenüber dem Protokoll, welches in dem berichteten klinischen Versuch, Kox et al., Arch. Intern. Med. 157: 389-393 (1997), Döcke et al., Nature Med. 3: 678-681 (1997); Döcke et al., in Schmitz et al. (Hrsg.), Durchflusszytometrie in der Klinischen Zelldiagnostik, Schattauer: Stuttgart und New York (1994), S. 163-177 (hiernach zusammen „Döcke-Test"), verwendet worden ist. Die Eliminierung von Fraktionierungsschritten reduziert die Testzeit, reduziert den möglichen Probenverlust und reduziert Quellen der Testvarianz, wichtige Vorteile in einem Test, der zum Teil für die klinische Verwendung vorgesehen ist. Weitere Vorteile von Gesamtbluttests sind berichtet in Picker et al., Blood 86 (4): 1408-1419 (1995); Suni et al., J. Immunol. 212: 89-98 (1998); und Kahan, „Application Note 2: Detecting Intracellular Cytokines in Activated Monocytes", Becton Dickinson Immunocytometry Systems (San Jose) (1997), deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Wie jedoch verstanden werden wird, mag das Weiterbestehen von Erythrozyten in der Gesamtblutprobe über den Färbeschritt hinaus spätere Anstrengungen verkomplizieren Fluoreszenz zu messen, die spezifisch an die kernhaltigen Zellen in der Probe gebunden ist. Folglich können unter solchen Umständen die Verfahren der vorliegenden Erfindung nach dem Antikörperinkubationsschritt und vor dem durchflusszytometrischen Datenerwerb einen weiteren Schritt des Lysierens der Erythrozyten in der Probe einschließen.
Eine Anzahl von Mitteln, die gleichzeitig dazu dienen, rote Blutzellen zu lysieren und kernhaltige Zellen in einer Gesamtblutprobe zu fixieren, ohne die Bindung von Antikörpern an die kernhaltigen Zellen zu beeinflussen, sind in der Technik bekannt. Diese Mittel sind unter anderem beschrieben in den US-Patenten mit den Nummern 4,654,312; 4,902,613; 5,510,267; 5,516,695; 5,648,225 und im Europäischen Patent Nr. EP 161770 B1 , deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Etlicher solcher Mittel sind im Handel erhältlich, einschließlich FACS^TMLysing Solution (FACS^TM-Lysierungslösung; Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, Katalognummer 349202) und Whole Blood Lysing Solution (Gesamtblutlysierungslösung; Caltag Laboratories, Inc., Burlingame CA, Katalognummer GAS-10).
Die Minimaldauer der Inkubation mit Lysereagenz hängt davon ab, ob nach der Lyse Trümmer durch Zentrifugation entfernt werden.
Beim einfachsten Testprotokoll wird die durchflusszytometrische Bestimmung der HLA-DR-Expression direkt in der lysierten Probe gemessen, ohne Entfernen von Lysetrümmern. Bei diesem Ansatz kann die Inkubation mit Lysereagenz sich von ungefähr 1 bis 60 Minuten erstrecken, vorzugsweise von ungefähr 2 bis 30 Minuten, bevorzugter ungefähr 10 Minuten.
In einem alternativen Protokoll, bei welchem Lysetrümmer durch Zentrifugation entfernt werden, gefolgt wahlweise von Waschen des mononuklearen Zellpellets, wird die Inkubation mit Lysereagenz vorzugsweise für mindestens ungefähr 8 bis 10 Minuten vor der Zentrifugation durchgeführt. Bei diesem alternativen Protokoll erstreckt sich die Inkubation von ungefähr 8 bis 60 Minuten, vorzugsweise ungefähr 8 bis 30 Minuten, am meisten zu bevorzugen ungefähr 8 bis 15 Minuten, wobei eine Inkubation von 8 bis 10 Minuten am meisten bevorzugt ist.
Inkubation mit Lysereagenz wird in jedem Fall vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt, in Übereinstimmung mit den Instruktionen, die mit dem Lysereagenz verpackt sind.
Folglich ist, wie in Beispiel 1 unten dargelegt, ein bevorzugtes Protokoll zum Messen von HLA-DR-Expression auf der Oberfläche von peripheren Blutmonozyten wie folgt:

1) Zu 50 μl Gesamtblut füge 10 μl Färbereagenz hinzu. Das Färbereagenz enthält 500 ng HLA-DR-PE (Ab:PE-Verhältnis 1:1) 63 ng CD14-PerCP/CY5.5 18 mM Chloroquin in gepufferter Salzlösung, enthaltend Gelatine und 0,1 % Natriumazid (wobei sich in Übereinstimmung mit Konvention HLA-DR-PE und CD14-PerCP/CY5.5 auf Antikörper mit Spezifität für HLA-DR bzw. CD14 beziehen, indem sie mit den angegebenen Fluorophoren konjugiert sind).
2. Inkubiere für 25 bis 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
3. Füge 1 ml 1 × FACS^TM Lysing Solution (erhalten als 10X-Stammlösung, BDIS Katalognummer 349202) hinzu und inkubiere annähernd 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
4. Analysiere direkt unter Verwendung eines FACS^TM-Markendurchflusszytometers (BDIS, San Jose, CA). Nimm 2000 Monozytenereignisse auf und bewerte die Bindung des Anti-HLA-DR-Antikörpers daran.

Wie für den Fachmann ersichtlich sein würde, können das Verfahren zum Kalibrieren und Laufen lassen des Durchflusszytometers ebenso wie die Verfahren zum Analysieren der so aufgenommenen Daten variiert werden, und solche Variationen liegen gut im Fachwissen.
Wie weiter verstanden werden würde, können Durchflusszytometer und fluoreszenzaktivierte Zellsortiergeräte von anderen Herstellern ebenfalls verwendet werden, wie es andere Vorrichtungen können, die sich beim Messen von Fluoreszenz aus mit Antikörper markierten Zellen als nützlich erweisen, wie zum Beispiel Mikrovolumenfluorimeter (volumetrische Kapillarzytometer) – wie zum Beispiel beschrieben in den US-Patenten mit den Nummern 5,547,849; 5,556,764; 5,932,428 und 5,912,134, hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen – und mikrofabrizierte fluoreszenzaktivierte Zellsortiergeräte, wie sie zum Beispiel beschrieben sind in Fu et al., Nature Biotechnology 17: 1109-1111 (1999), dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Wie in den Beispielen unten weiter beschrieben wird, können weitere Schritte durchgeführt werden, wie zum Beispiel das Entfernen von Lysetrümmern durch Absaugen des Überstands nach Sammeln der Zellen durch Zentrifugation, wobei wahlweise eine weitere Waschung des mononuklearen Zellpellets eingeschlossen wird.
Es wird auch ersichtlich sein, dass Monozyten nicht nur durch das CD14⁺-Fluoreszenzsignal unterschieden werden können und vorzugsweise werden, sondern auch durch gezeigte physikalische Eigenschaften, zum Beispiel durch den Grad an Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung. Monozyten können sogar allein auf der Basis solcher physikalischer Eigenschaften unterschieden werden.
Schließlich sollte festgestellt werden, dass Proben nicht zu lange bei dem letzten Schritt vor der Datenaufnahme verdünnt stehen gelassen werden sollten; ungefähr 6 % des Signals gehen in der ersten Stunde verloren.
Wo der Anti-HLA-DR-Antikörper an Fluorophor in einem definierten molaren Verhältnis konjugiert ist, ist es bei dem oben beschriebenen Test möglich, die Dichteverteilung der HLA-DR-Expression auf der CD14⁺-Monozytenpopulation abzuschätzen und dieselbe als pro Zelle gebundene Antikörper anzuzeigen.
Die vorliegende Erfindung stellt folglich verbesserte Verfahren zum Messen der HLA-DR-Expression auf der Oberfläche von menschlichen Blutzellen bereit und besonders auf der Oberfläche von peripheren Blutmonozyten, welche signifikante Vorteile gegenüber früheren Verfahren haben.
Beispiel 2 zeigt weiter, dass Ergebnisse aus dem verbesserten HLA-DR-Test der vorliegenden Erfindung gut mit Ergebnissen aus früheren, aber problematischen Tests, korrelieren. Dieser hohe Korrelationsgrad erlaubt die direkte Übertragung der etablierten klinischen Kriterien auf durch den vorliegenden Test angezeigte Messungen.
Wie in Beispiel 2 dargelegt, wurden periphere Blutproben von Patienten gewonnen und die Dichte an HLA-DR wurde auf Monozyten unter Verwendung von Chloroquininkubation und einem Anti-CD14-PerCP/CY5.5-Konjugat untersucht. Wie weiter in dem Beispiel beschrieben, schloss das Protokoll, im Gegensatz zu dem oben präsentierten, das Entfernen von Lysetrümmern durch Zentrifugation ein. Proben wurden auch nach dem früheren Döcke-Verfahren untersucht. Ergebnisse sind in den 5 und 6 gezeigt.
Die 5A trägt Seitenstreuung (SSC) gegen Fluoreszenzkanal 3 (CD14-PerCP/CY5.5) für zwei Aliquoten einer Probe eines einzelnen Patienten auf, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verarbeitet worden ist. Die eng gebündelte CD14⁺-Monozytenpopulation ist jeweils eingekreist. 5B zeigt direkt unterhalb jedem Dot-Plot ein Histogramm, das die aus den Zellen in der abgegrenzten Monozytenpopulation gemessene PE-Fluoreszenzintensität (HLA-DR) grafisch darstellt. Histogrammstatistiken sind ebenfalls wiedergegeben.
6 vergleicht die unter Verwendung von Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse mit Ergebnissen, die unter Verwendung des früheren Döcke-Tests erhalten worden sind. Die Y-Achse zeigt die Anzahl an Phycoerythrinmolekülen (anti-HLA-DR-PE), die im Durchschnitt pro Monozyte unter Verwendung der vorliegenden Verfahren gebunden ist; die X-Achse gibt den Prozentsatz an Monozyten an, der für HLA-DR positiv ist, unter Verwendung der früheren Verfahren. Die Korrelation ist hoch, mit einem Korrelationskoeffizienten (r²) von 0,908.
Um zuverlässige Prozentsätze an HLA-DR⁺-Monozyten gemäß dem Döcke-Verfahren zu gewinnen, war es notwendig, Zellen unter Verwendung von Anti-HLA-DR-PE-Antikörper-Subsättigungsspiegeln (annähernd 20 % Sättigung) zu färben und die Inkubationszeit sorgfältig zu überwachen, beides pro publiziertem Protokoll. Der geringe Grad an Antikörpersättigung bedeutet jedoch, dass kleine Variationen in der Antikörperkonzentration zu großen Änderungen in der Antikörperbindung und folglich der gemessenen Fluoreszenz führen. Die Sorgfalt, mit welcher Antikörper titriert werden muss, und der Grad, mit welchem die Inkubationszeit eingehalten werden muss, entfernen den Döcke-Test aus dem Gebiet des klinischen Routiniers.
Die hohe Korrelation zwischen dem Prozentsatz an HLA-DR⁺-Monozyten, wie gemessen durch das Döcke-Verfahren, und die Anzahl an pro Monozyte gebundenen Anti-HLA-DR-PE-Molekülen, wie gemessen durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung, erlaubt die direkte Übertragung der etablierten klinischen Kriterien auf durch den vorliegenden Test angezeigte Messungen. Folglich, wie in 6 gesehen werden kann, übersetzt sich das zuvor etablierte Behandlungskriterium von 30 % HLA-DR⁺-Monozyten auf ungefähr 3000 Moleküle PE (anti-HLA-DR), die pro Monozyte gebunden sind; ähnlich übersetzt sich das Kriterium für die Beendigung der Behandlung, 50 % HLA-DR⁺-Monozyten, auf ungefähr 4750 Moleküle pro Zelle gebundenem PE (anti-HLA-DR).
Unter Verwendung der zuvor etablierten klinischen Behandlungsparameter werden Patienten mit einem Risiko für Sepsis, die durchschnittlich weniger als 3000 Anti-HLA-DR-Antikörper pro Monozyte für zwei aufeinanderfolgende Tage zeigen, als geeignet für den Beginn von immunstimulierender Behandlung bestimmt, wie zum Beispiel Behandlung mit IFN-γ, und die Behandlung wird so lange fortgesetzt, bis die Durchschnittsdichte auf ungefähr 4700 bis 5000, vorzugsweise 5000 oder mehr Anti-HLA-DR-Moleküle pro periphere Blutmonozyte steigt, vorzugsweise an zwei bis drei aufeinanderfolgenden Tagen.
Die vorliegende Erfindung stellt folglich Verfahren zum Bewerten des Immunzustands eines menschlichen Patienten und zum Bestimmen der Geeignetheit von immunstimulatorischer Therapie in einem Patienten mit einer reduzierten Monozytenfunktion und genauer in einem Patienten mit reduzierter Monozyten-HLA-DR-Expression bereit, worin die Dichte der HLA-DR-Expression auf der Oberfläche von peripheren Blutmonozyten ein Maß der Immundysfunktion in dem kompetenten APC-Kompartiment des Patienten anzeigt, geeignet für die Behandlung durch immunstimulierende Agenzien und Verfahren.
Es wird selbstverständlich verstanden werden, dass sich durch die Anhäufung von noch mehr klinischen Daten, welche Daten nun vermehrt aufkommen werden, in Anbetracht der Einfachheit und Zuverlässigkeit der Verfahren der vorliegenden Erfindung die Kriterien für die immunstimulierende Behandlung von Patienten mit Monozytendysfunktion – zum Beispiel bei Patienten mit einem Risiko für Sepsis oder septischen Schock – wahrscheinlich ändern werden.
Es wird auch verstanden werden, dass IFN-γ, während es das gegenwärtig bevorzugte immunstimulatorische Mittel ist, wahrscheinlich in der Zukunft durch andere Mittel ergänzt oder sogar ersetzt wird, welche die Dysfunktion der Monozyten des Patienten umkehren. Unter solchen Verfahren befindet sich die Behandlung mit G-CSF, GM-CSF, Dialyse und Leptin, Santos-Alvarez et al., Cellular Immunol. 194: 6-11 (1999).
Wie festgestellt, sind die hierin präsentierten Verfahren von besonderem Nutzen bei klinischem Hintergrund. Durchflusszytometrie wurde nun zu einem Routineteil des klinischen Labors, Riley et al., Clinical Applications of Flow Cytometry, Igaku-Shoin Medical Publ. (1993); Coon et al. (Hrsg.), Diagnostic Flow Cytometry (Techniques in Diagnostic Pathology, Nr. 2), Williams & Wilkins (1991); Keren et al., Flow Cytometry and Clinical Diagnosis, Amer. Soc'y of Clinical Pathol. (ISBN 0891893466, 1994), und die hierin präsentierten Verfahren sind gut innerhalb des Fachwissens des klinischen Pathologielabors.
Jedes klinische Labor mag jedoch nur sporadischen Bedarf haben, den Test durchzuführen, und es gibt folglich einen Bedarf für Zusammensetzungen und Kits, welche es erlauben, dass der Test auf einer bedarfsgerechten Basis leicht durchgeführt wird.
Folglich stellt in einem anderen Aspekt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die hiernach „Färbezusammensetzungen" genannt werden, die jeweils an Fluorophor konjugierten Antikörper und ein lysosomotropes Amin umfassen. In einer Ausführung umfasst die Färbezusammensetzung einen Anti-HLA-DR-Antikörper und ein lysosomotropes Amin. Bevorzugter umfasst die Färbezusammensetzung weiter einen Anti-CD14-Antikörper; bei den am meisten bevorzugten Ausführungen umfasst die Zusammensetzung anti-HLA-DR-PE, anti-CD14-PerCP/CY5.5 und Chloroquin. Für die Messung der Dichte auf HLA-DR-Molekülen auf der Oberfläche von Monozyten kann der Anti-HLA-DR-Antikörper an PE in einem definierten molaren Verhältnis konjugiert sein, am bevorzugten in einem molaren Verhältnis von 1:1.
Es wird verstanden werden, dass diese Färbezusammensetzungen weiter zahlreiche Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel und Stabilisatoren einschließen können, die in der Technik Standard sind, wie zum Beispiel gepufferte Gelatine und Natriumazid.
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Kits für die Messung von HLA-DR auf der Oberfläche von peripheren Blutzellen bereit, und in bevorzugten Ausführungen auf der Oberfläche von peripheren Blutmonozyten.
In einer Ausführung umfasst das Kit einen Anti-HLA-DR-Antikörper und ein lysosomotropes Amin wie Chloroquin, wobei der Antikörper und das Amin gesondert verpackt sind. Typischer schließt das Kit eine Färbezusammensetzung ein, in welcher Antikörper und Amin in einer einzigen Zusammensetzung kombiniert sind, typischerweise mit einer zusätzlichen, gesondert verpackten Erythrozytenlysierungszusammensetzung. Die Färbezusammensetzung umfasst vorzugsweise, wie oben beschrieben, einen Anti-HLA-DR-Antikörper und ein lysosomotropes Amin. Bevorzugter umfasst die Färbezusammensetzung einen Anti-CD14-Antikörper; in den am meisten bevorzugten Ausführungen umfasst die Zusammensetzung anti-HLA-DR-PE, anti-CD14-PerCP/CY5.5 und Chloroquin. Für Anwendungen, in welchen die Dichte von HLA-DR gemessen werden soll, ist der Anti-HLA-Antikörper der Färbezusammensetzung des Kits an PE in einem definierten molaren Verhältnis, am bevorzugtesten in einem molaren Verhältnis von 1:1 konjugiert, und das Kit umfasst weiter pelletierte Perlen, die mit definierten PE-Spiegeln konjugiert sind, um die Kalibrierung des Durchflusszytometers zu erlauben.
Wie oben festgestellt, ist die Basis für die Zeitabhängigkeit des HLA-DR-Fluoreszenzsignals während der Anti-HLA-DR-Antikörperfärbung unbekannt, wie es der Mechanismus ist, durch welchen Chloroquin das Signal über die Zeit stabilisiert. Aber unabhängig vom Mechanismus wird deutlich, dass er von anderen Zelloberflächenmolekülen geteilt wird. Folglich zeigt 7, dass das Fluoreszenzsignal, das während der Antikörperfärbung von CD11b in Gesamtblutproben erzeugt wird, auch mit der Färbezeit steigt und dass das Fluoreszenzsignal ähnlich durch die Zugabe von Chloroquin in einer Endkonzentration von 3 mM stabilisiert werden kann. 7 zeigt weiter, dass diese Phänomene, wie bei HLA-DR, in dem Blut von Donoren mit ziemlich unterschiedlichen Durchschnittsexpressionsspiegeln beobachtet werden können.
Folglich stellt die Erfindung in einem anderen Aspekt verbesserte Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zur Messung von CD11b-Expression auf der Oberfläche von humanen Blutzellen bereit. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren einer humane Blutzellen enthaltenden Probe mit einem lysosomotropen Amin und einem für CD11b spezifischen Antikörper und dann das Detektieren der Bindung des CD11b-Antikörpers an die Zellen. Die Zusammensetzungen umfassen einen CD11b-spezifischen Antikörper, typischerweise an ein Fluorophor konjugiert, und ein lysosomotropes Amin, typischerweise Chloroquin. In einer Ausführung umfasst das Kit eine Färbezusanmensetzung und eine Erythtrozytenlysierungszusammensetzung. Die Färbezusammensetzung umfasst, wie oben beschrieben, vorzugsweise einen Anti-CD11b-Antikörper und ein lysosomotropes Amin. Die Färbezusammensetzung kann weiter einen Anti-CD45-Antikörper umfassen; in den am meisten bevorzugten Ausführungen umfasst die Zusammensetzung anti-CD11b-PE, anti-CD45-PerCP und Chloroquin. Andere an Fluorophor konjugierte Antikörper, welche die Unterscheidung von Neutrophilen erleichtern, können verwendet werden, um die Messung von CD11b auf der Oberfläche von peripheren Blutneutrophilen zu erlauben.
Die folgenden Beispiele werden im Wege der Erläuterung und nicht im Wege der Beschränkung angeboten.
BEISPIELE
Allgemein und solange nicht anderweitig festgestellt, sind die bei den folgenden Beispielen verwendeten durchflusszytometrischen Verfahren in der Technik wohlbekannt. Detaillierte Protokolle sind in etlichen jüngeren Kompendien, einschließlich Flow Cytometry: A Practical Approach, 2. Aufl., M. G. Ormerod (Hrsg.), Oxford University Press, 1997; Handbook of Flow Cytometry Methods, J. Paul Robinson (Hrsg.), John Wiley & Sons (1993); Current Protocols in Cytometry, J. Paul Robinson (Hrsg.), John Wiley & Sons (Oktober 1997, mit periodischen Aktualisierungen); Becton Dickinson Cytometry Source Book, Becton Dickinson Immunocytometry Systems (1998, mit periodischen Aktualisierungen) (San Jose, CA), deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind, zusammengestellt.
Für die Bequemlichkeit werden Antikörperbezeichnungen abgekürzt durch Angaben der Antigenspezifität, gefolgt vom Fluorophor. Fluorophorabkürzungen sind Phycoerythrin (PE), Peridininchlorophyllprotein (PerCP), Allophycocyanin (APC), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Cyanin 5 (CYS) und Cyanin 5.5 (CY5.5). Folglich wird ein Antikörper, der mit Phycoerythrin (PE) markiert ist, der spezifisch ist für HLA-DR, „HLA-DR-PE" genannt. Becton Dickinson Immunocytometry Systems (San Jose, CA) als die Reagenzienquelle wird abgekürzt mit „BDIS".
Beispiel 1
Chloroquininhibition von zeitabhängiger Variation bei HLA-DR-spezifischer Fluoreszenzantikörperfärbung
Periphere Blutproben wurden normalen Freiwilligen entnommen.
Die Zeitabhängigkeit des HLA-DR-spezifischen Signals, detektierbar durch Durchflusszytometrie, von Antikörper gefärbten peripheren Blutmonozyten wurde durch Variieren der Dauer der Antikörperfärbung beurteilt.
Für die in 1 berichteten Experimente wurden zu 50 μl mit EDTA-antikoaguliertem Gesamtblut 10 μl Färbereagenz, enthaltend entweder (a) CD14-PerCP/CY5.5 (63 ng) und HLA-DR-PE (250 ng) (Donoren #160 und #325) oder (b) CD14-PerCP/CY5.5 (63 ng) und HLA-DR-PE (500 ng) (Donor #790) hinzugefügt.
Proben wurden mit Färbereagenz bei Raumtemperatur für die angegebenen Zeiten inkubiert, wonach 1 ml 1X FACS^TM Lysing Solution (10X-Stammlösung von BDIS, Katalognummer 349202) hinzugefügt wurde und die Inkubation dauerte für 10 Minuten weiter an.
Bei Donor #160 wurden die Proben dann bei 250 × g für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, das Pellet wurde in 2 ml PBS + 5,0 % BSA resuspendiert und erneut zentrifugiert. Das Endpellet wurde in 0,5 ml PBS + BSA suspendiert und wurde durch Durchflusszytometrie analysiert. Bei den Donoren #790 und #325 wurde die Postlysewaschung weggelassen: Nach der Inkubation mit Lysing Solution wurden die Proben bei 250 × g für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde direkt in 0,5 ml PBS + BSA für die Analyse durch Durchflusszytometrie resuspendiert.
Die durchflusszytometrische Aufnahme von wenigstens 2000 Monozytenereignissen wurde für jede Probe unter Verwendung eines FACS^TM-Markendurchflusszytometers (BDIS), kalibriert unter Verwendung von CaliBRITE^TM-(BDIS Katalognummer 349502) oder QuantiBRITE^TM-Perlen (BDIS Katalognummer 340495), gemäß den Instruktionen des Herstellers, durchgeführt. Die PE-Fluoreszenzintensität für monozytenspezifische Ereignisse wurde, wie in Figur gezeigt, aufgetragen.
Die Wirkung von zahlreichen Additiven auf die Stabilität der HLA-DR-spezifischen Fluoreszenzintensität wurde durch Einschließen dieser Reagenzien während des Färbeschrittes gestestet.
In einem ersten Experiment, dessen Ergebnisse in 2A angezeigt sind, wurden periphere Blutproben (50 μl mit EDTA antikoaguliertes Gesamtblut) mit entweder (a) 10 μl Färberreagenz, enthaltend 500 ng HLA-DR-PE und 63 ng CD14-PerCP/CY5.5 (angezeigt in der Figur als „Kontrolle"); (b) 10 μl Färbereagenz, enthaltend 500 ng HLA-DR-PE, 63 ng CD14-PerCP/CY5.5 und 0,6 % Natriumazid (Azidendkonzentration 0,1 %; angezeigt in 2A als „Azid"); oder (c) 10 μl Färbereagenz, enthaltend 500 ng HLA-DR-PE, 63 ng CD14-PerCP/CY5.5 und 18 mM Chloroquin (Chloroquinendkonzentration 3 mM; angezeigt in 2A als „Chloroquin"), gefärbt. Inkubation geschah bei Raumtemperatur für die angegebenen Zeiten, wonach 1 ml 1X FACS^TM Lysing Solution hinzugefügt wurde und die Inkubation für 10 Minuten fortgesetzt wurde.
Nach Erythrozytenlyse wurden die Proben bei 250 × g für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, das Pellet wurde in 1 ml PBS + 0,5 % BSA resuspendiert und erneut zentrifugiert. Das Endpellet wurde in 0,5 ml PBS + BSA suspendiert und durch Durchflusszytometrie analysiert, wie oben. Ergebnisse sind in 2A aufgetragen.
Ein zweites Experiment, angezeigt in 2B, wurde ähnlich durchgeführt, jedoch unter Weglassen des Postlysewaschschrittes: Nach Erythrozytenlyse wurden die Proben bei 250 × g für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand, enthaltend Lysetrümmer, wurde entfernt, und das Pellet wurde direkt in 0,5 ml PBS + 0,5 % BSA resuspendiert. Wiederum wurde durchflusszytometrische Aufnahme von wenigstens 2000 Monozytenereignissen durchgeführt und die PE-Fluoreszenzintensität der Monozytenpopulation wurde aufgetragen.
Um zu testen, ob Brefeldin A und Monensin ähnlich die HLA-DR-Expression in dem durchflusszytometrischen Test stabilisieren würden, wurde eine zusätzliche Experimentenreihe durchgeführt.
Zu 50 μl mit EDTA antikoaguliertem Gesamtblut wurden 10 μl Färbereagenz (500 ng HLA-DR-PE und 63 ng CD14-PerCP/CY5.5 in gepufferter Salzlösung, enthaltend Gelatine und 0,1 % Natriumazid) hinzugefügt; das Färbereagenz schloss weiter die unten vermerkten Additive ein. Proben wurden mit Färbereagenz für die angegebenen Zeiten inkubiert, wobei 1 ml 1X FACS^TM Lysing Solution hinzugefügt wurde. Nach Inkubation mit der Lysierungslösung für 9,5 bis 11,5 Minuten wurden die Proben direkt unter Verwendung eines FACSCalibur^TM-Markendurchflusszytometers (BDIS, San Jose, CA) analysiert.
Additive zu der Färbezusammensetzung für diese letzteren Experimentenreihen, angezeigt in 2C, waren: (A) nichts (Kontrolle); (B) 18 mM Chloroquin; (C) 0,2 mM Brefeldin A; und (D) 0,013 mM Monensin. Endkonzentrationen der Additive nach einer 1:6-Verdünnung durch Färbung waren: (B) 3 mM Chloroquin; (C) 0,034 mM Brefeldin A; und (D) 0,0022 mM Monensin. Endkonzentrationen von Brefeldin A und Monensin sind jene, welche als ausreichend befunden worden sind, Verarbeitung und Sekretion von Zytokinen zu hemmen, durch Picker et al., Blood 86 (4): 1408-1419 (1995); Suni et al., J. Immunol. 212: 89-98 (1998).
Die in 2C präsentierten Daten wurden unmittelbar nach Lyse aufgenommen; im Gegensatz zu Experimenten, deren Ergebnisse in 1 präsentiert sind, wurde die Entfernung von Lysetrümmern (durch Zentrifugation und Absaugen, wahlweise gefolgt von einer Waschung) weggelassen. Unabhängige Experimente (nicht gezeigt) zeigten, dass die Ergebnisse miteinander vergleichbar sind, ob Trümmer entfernt werden oder nicht. Wenn Trümmerentfernung nicht durchgeführt wird, kann die Dauer des Lyseschrittes verkürzt werden: Proben können so kurz wie ungefähr 60 Sekunden nach Färbung analysiert werden. Proben können bis zu ungefähr 60 Minuten nach Färbung getestet werden (mit Verlust über die 60 Minuten von ungefähr 5 bis 10 % HLA-DR-PE-Fluoreszenz).
Wie in den 2A bis 2C gezeigt, stabilisierte Chloroquin – aber nicht Azid, Brefeldin A oder Monensin – zuverlässig HLA-DR-Fluoreszenz, wobei die Signale nach 60-minütiger Inkubation im Wesentlichen identisch waren mit jenen nach 10 bis 15 Minuten Inkubation. In nicht gezeigten Experimenten wurde von Hydroxychloroquin gezeigt, dass es gleich wirksam beim Stabilisieren des HLA-DR-Signals war wie Chloroquin.
Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt, um die Minimalkonzentration an Chloroquin zu bestimmen, die gebraucht wird, um eine Stabilisierung der HLA-DR-Expression auf der Oberfläche von Monozyten zu bewirken.
Eine Aliquote aus 50 μl peripherem Blut wurde von einem gesunden Freiwilligen entnommen und mit 10 μl HLA-DR-Quantifizierungsreagenz (50 μg/ml HLA-DR-PE, 6,3 μg/ml CD14-PerCP-CY5.5, in 10 mM Natriumpyrophosphat, 0,15 M NaCl, pH 8) vermischt. Das HLA-DR-Quantifizierungsreagenz enthielt weiter Chloroquin mit 0 mM (Kontrolle), 6 mM, 12 mM oder 18 mM.
Bei jedem Experiment wurden 4 Blutproben für jede Chloroquinkonzentration gefärbt, wobei jede der Proben für 20; 40, 60 oder 80 Minuten gefärbt wurde.
Am Ende der Färbezeitdauer wurden die Proben mit 1X FACS^TM Lysing Solution (BDIS) lysiert und auf einem FACSCalibur^TM-Durchflusszytometer analysiert.
500 Monozytenereignisse wurden gesammelt. Der HLA-DR-PE-Medianwert (FL2) wurde aus einem Histogramm bestimmt, das auf der Monozytenpopulation in einer FL3/Seitenstreuung eingeblendet wurde. Ergebnisse, gezeigt in den 2D und 2E, zeigen, dass HLA-DR-Stabilisierung mit Chloroquin bei 2 mM oder darüber erhalten werden kann, aber dass 1 mM Chloroquin nicht ausreichend war, um eine Stabilisierung zu bewirken.
Beispiel 2
Messung von HLA-DR auf peripheren Blutmonozyten von Patienten
Periphere Blutproben wurden durch Venenpunktion aus Patienten gewonnen, die zur ICU zugelassen worden sind. Eine Aliquote jeder Probe wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls untersucht.
Zu 50 μl Gesamtblut wurden 10 μl Färbereagenz, enthaltend 50 μg/ml HLA-DR-PE (Klon L243), 6,3 μg/ml CD14-PerCP/CY5.5 und 18 mM Chloroquindiphosphat, hinzugefügt. HLA-DR-PE (BDIS Katalognummer 347367, erneut gereinigt, um Antikörper: PE-Konjugat in einem Verhältnis von 1:1 bereitzustellen) ist ein IgG_2a/κ-Mausantikörper, der mit einem nichtpolymorphen HLA-DR-Epitop reagiert und nicht mit HLA-DQ- oder HLA-DP-Molekülen kreuzreagiert. CD14-PerCP/CY5.5 (BDIS übliches Konjugat des Antikörpers LeuM3, unkonjugiert erhältlich unter BDIS Katalognummer 347490) ist ein IgG_2b/κ-Mausantikörper, der für CD14 spezifisch ist.
Die Aliquote wurde für 25 bis 35 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurde 1 ml 1 × FACS^TM Lysing Solution (erhältlich als 10X-Stammlösung, BDIS Katalognummer 349202) hinzugefügt und die Inkubation wurde für 8 bis 10 Minuten fortgesetzt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 300 × g (1200 RPM in einer Sorvall-6000-Zentrifuge) gesammelt und die Lysetrümmer in dem Überstand wurden abgesaugt. Das Zellpellet wurde in 0,5 ml PBS, enthaltend 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), resuspendiert.
Die Probe wurde unter Verwendung eines FACS^TM-Markendurchflusszytometers analysiert. Kalibrierung wurde durchgeführt unter Verwendung des QuantiBRITE^TM-Quantifizierungskits (BDIS Katalognummer 340495). Ein Minimum aus 2000 Monozytenereignissen (CD14⁺ und weiter basierend auf der Seitenstreuung eingegrenzt) wurde aufgenommen und die PE-Fluoreszenz dieser Zellen wurde grafisch dargestellt. 5 zeigt die bei einer solchen Patientenprobe gesammelten Daten.
Eine zweite Aliquote jeder Probe wurde über Ficoll-Hypaque fraktioniert, und die PBMC wurden gemäß Kox et al., Arch. Intern. Med. 157: 389-393 (1997); Döcke et al., Nature Med. 3: 678-681 (1997); und Döcke et al., in Schmitz et al. (Hrsg.), Durchflusszytometrie in der Klinischen Zelldiagnostic, Schattauer: Stuttgart und New York (1994), S. 163-177, untersucht.
Ergebnisse jeder Probe durch beide Verfahren sind in 6 als ausgefüllte Dreiecke aufgetragen. Die am besten passende lineare Regressionslinie durch die Punkte ist gezeigt.
Beispiel 3
Stabilisierung des CD11b-spezifischen Fluoreszenzsignals durch Chloroquin
Blut aus drei normalen adulten Donoren wurde in Standard-EDTA-Vacutainerfl-Röhrchen gesammelt und direkt auf Eis gestellt. Fünfzig (50) μl Gesamtblut wurden in ein Röhrchen, enthaltend 20 μl eines Cocktails aus CD11b-PE- und CD45-PerCP-Antikörpern mit oder ohne Chloroquin, übertragen, wobei die Chloroquin enthaltenden Röhrchen eine Chloroquin-Endkonzentration von 3 mM hatten. Blut wurde für die angegebene Zeit bei Raumtemperatur vor der Zugabe von 1,0 ml FACS-Lysierungsreagenz (1X) gefärbt. Durchflusszytometrieanalyse wurde durchgeführt, im Wesentlichen wie beschrieben in den Beispielen 1 und 2. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
Während bevorzugte erläuternde Ausführungen der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, wird es einem Fachmann ersichtlich sein, dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen daran gemacht werden können, ohne von der Erfindung, wie sie durch die Ansprüche definiert ist, abzuweichen.

Claims

Verfahren zum Messen eines Zelloberflächenmoleküls, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus HLA-DR und CD11b, auf der Oberfläche von menschlichen Blutzellen, umfassend: Kontaktieren einer menschliche Blutzellen enthaltenden Probe mit einem lysosomotropen Amin und einem Antikörper, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus einem für HLA-DR spezifischen Antikörper und einem für CD11b spezifischen Antikörper; und dann Detektieren der Bindung dieses Antikörpers an diese Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin dieses Zelloberflächenmolekül HLA-DR ist und dieser Antikörper spezifisch für HLA-DR ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin dieses lysosomotrope Amin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chloroquin, Hydroxychloroquin, Primaquin und Methylamin.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieses lysosomotrope Amin Chloroquin ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieses lysosomotrope Amin Hydroxychloroquin ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin dieser Anti-HLA-DR-Antikörper mit einem Fluorophor markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin dieses Fluorophor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus PE, APC, FITC und PerCP.
Verfahren nach Anspruch 7, worin dieses Fluorophor PE ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin dieses Fluorophor an diesen Anti-HLA-DR-Antikörper in einem definierten molaren Verhältnis konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin dieses Verhältnis 1:1 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin diese Antikörperbindung durchflusszytometrisch detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, worin dieses lysosomotrope Amin Chloroquin ist und dieser Anti-HLA-DR-Antikörper an PE konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin dieser Anti-HLA-DR-Antikörper an PE in einem molaren Verhältnis von 1:1 konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin dieses Detektieren weiter das Detektieren der Bindung dieses Anti-HLA-DR-Antikörpers an Monozyten in dieser Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin dieses Kontaktieren weiter das Kontaktieren mit einem Monozyten unterscheidenden Antikörper umfasst und dieses Detektieren die Bindung dieses Anti-HLA-DR-Antikörpers an Zellen misst, welche diesen Monozyten unterscheidenden Antikörper binden.
Verfahren nach Anspruch 15, worin dieser Monozyten unterscheidende Antikörper für CD14 spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin dieser Anti-CD14-Antikörper an die PerCP-Einheit eines PerCP/CY5.5-Tandemfluorophors konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin dieser Anti-HLA-DR-Antikörper an ein Fluorophor konjugiert ist, dessen Emissionsspektrum durchflusszytometrisch von PerCP/CY5.5 unterscheidbar ist.
Verfahren nach Anspruch 18, worin dieser Anti-HLA-DR-Antikörper an PE konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin dieser Anti-HLA-DR-Antikörper an PE in einem definierten molaren Verhältnis konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin dieses Verhältnis 1:1 ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin dieses lysosomotrope Amin Chloroquin ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin dieses lysosomotrope Amin Hydroxychloroquin ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin diese Antikörperbindung durchflusszytometrisch detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, weiter umfassend nach diesem Kontaktieren und vor diesem Detektieren das Lysieren der Erythrozyten in dieser peripheren Blutprobe.
Verfahren nach Anspruch 24, weiter umfassend nach diesem Kontaktieren und vor diesem Detektieren das Lysieren der Erythrozyten in dieser peripheren Blutprobe.
Verfahren nach Anspruch 25, weiter umfassend nach diesem Lysieren und vor diesem Detektieren das Entfernen von Lysetrümmern.
Verfahren nach Anspruch 26, weiter umfassend nach diesem Lysieren und vor diesem Detektieren das Entfernen von Lysetrümmern.
Verfahren nach Anspruch 2, worin diese Probe unfraktioniertes peripheres Blut ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin dieses Zelloberflächenmolekül CD11b ist und dieser Antikörper für CD11b spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 30, worin diese Probe unfraktioniertes peripheres Blut ist.
Verfahren nach Anspruch 30, worin dieses lysosomotrope Amin Chloroquin ist.
Verfahren nach Anspruch 30, worin dieser Antikörper mit PE markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 31, weiter umfassend das Lysieren von Erythrozyten in diesem unfraktionierten peripheren Blut vor diesen Kontaktierungs- und Detektierungsschritten.
Verfahren zum Messen von HLA-DR-Oberflächenexpression auf menschlichen peripheren Blutmonozyten, umfassend: Kontaktieren dieser Monozyten in vitro mit Chloroquin vor oder gleichzeitig mit dem Kontaktieren dieser Zellen mit einem Anti-HLA-DR-Antikörper.
Verfahren zur Bewertung des Immunzustandes eines menschlichen Patienten, umfassend: Kontaktieren einer Probe, die Blutzellen dieses Patienten enthält, mit einem lysosomotropen Amin und einem für HLA-DR spezifischen Antikörper; Detektieren der Bindung dieses Anti-HLA-DR-Antikörpers an die Monozyten in dieser Probe; und dann Vergleichen des so detektierten Bindungsgrades mit einem empirisch bestimmten Kontrollwert.
Verfahren nach Anspruch 36, worin dieses lysosomotrope Amin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chloroquin und Hydroxychloroquin.
Verfahren nach Anspruch 37, worin dieser Kontaktierungsschritt weiter das Kontaktieren dieser Probe mit einem Monozyten unterscheidenden Antikörper umfasst und worin dieser Detektierschritt die Bindung dieses Anti-HLA-DR-Antikörpers an Zellen, die diesen Monozyten unterscheidenden Antikörper binden, misst.
Verfahren nach Anspruch 38, worin dieser Monozyten unterscheidende Antikörper Anti-CD14-PerCP/CY5.5 ist.
Verfahren nach Anspruch 36 zum Bestimmen der Geeignetheit einer immunstimulierenden Therapie in einem Patienten mit Sepsis, worin dieser Schritt des Vergleichens folgendes umfasst: Vergleichen des so detektierten Bindungsgrades mit einer empirisch bestimmten Behandlungsschwelle, wobei Patienten mit einer niedrigeren Bindung als dieser empirisch bestimmten Behandlungsschwelle als für diese Behandlung geeignet bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 40, worin der Schritt des Detektierens und Vergleichens folgendes umfasst: Quantifizieren der Bindung dieses Anti-HLA-DR-Antikörpers an die Monozyten in dieser Probe; wobei Patienten mit im Durchschnitt weniger als 5000 Anti-HLA-DR-Antikörpern pro Monozyte als für diese Behandlung geeignet bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 41, worin Patienten mit im Durchschnitt weniger als 3000 Anti-HLA-DR-Antikörpern pro Monozyte als für diese Behandlung geeignet bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 41, worin Patienten mit im Durchschnitt weniger als 3000 Anti-HLA-DR-Antikörpern pro Monozyte über zwei aufeinander folgende Tage als für diese Behandlung geeignet bestimmt werden.
Zusammensetzung für die durchflusszytometrische Messung von HLA-DR auf menschlichen peripheren Blutzellen, umfassend: einen fluorophor-konjugierten Anti-HLA-DR-Antikörper, und ein lysosomotropes Amin.
Zusammensetzung nach Anspruch 44, worin dieses lysosomotrope Amin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chloroquin, Hydroxychloroquin, Primaquin und Methylamin.
Zusammensetzung nach Anspruch 45, worin dieses lysosomotrope Amin Chloroquin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 45, worin dieses lysosomotrope Amin Hydroxychloroquin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 44, worin dieses Fluorophor PE ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 48, worin dieses PE-Fluorophor und dieser Antikörper in einem definierten molaren Verhältnis konjugiert sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 49, worin dieses Verhältnis 1:1 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 44, weiter umfassend: einen Monozyten unterscheidenden Antikörper, der an ein Fluorophor konjugiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 51, worin dieser Monozyten unterscheidende Antikörper für CD14 spezifisch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 52, worin das an diesen CD14-Antikörper konjugierte Fluorophor durchflusszytometrisch von dem an diesen Anti-HLA-DR-Antikörper konjugierten Fluorophor unterscheidbar ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 53, worin dieser Anti-HLA-DR-Antikörper an PE konjugiert ist und dieser Anti-CD14-Antikörper an die Perca-Einheit des PerCP/CY5.5-Tandemmoleküls konjugiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 54, worin dieses lysosomotrope Amin Chloroquin ist.
Kit für die durchflusszytometrische Messung von HLA-DR auf der Oberfläche von peripheren Blutzellen, umfassend: eine Zusammensetzung nach Anspruch 44, 52 oder 55, und eine Erythrozyten lysierende Zusammensetzung.
Kit nach Anspruch 56, weiter umfassend mit definierten PE-Spiegeln konjugierte pelletierte Perlen.