DE69933588T2 - Mikrofabrizierte Vorrichtung zur Analyse von Zellen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft auf Zellen beruhende Analyseverfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine mikrogefertigte Vorrichtung zur Durchführung von Zellwachstum und auf Zellen basierenden Analyseverfahren und Verfahren zur Durchführung solcher Analyseverfahren.
  • Der gegenwärtige Mittelpunkt bei Screeninganwendungen mit hohem Durchsatz zum Zweck des Screenings von einer ansteigenden Anzahl an Verbindungen wird durch die doppelten Technologien von kombinatorischer Chemie und Genetik angetrieben, um neue potenzielle Medikamentenziele und neue Anwärtermedikamente als potenzielle therapeutische Verbindungen herzustellen. Die Entwicklung von Screnninganalyseprozessen mit hohem Durchsatz und Analyseminiaturisierung unter Verwendung des Mikrotitervertiefungsplattenformats mit 384, 864, 1536 oder größer miniaturisierten Vertiefungen hat sich an den primären Screeningprozess gerichtet. Miniaturisierte Analyseverfahren sind in der Lage, Durchsatzniveaus von über 100.000 Tests/Tag beim primären Screening zu erlauben. Bei diesem Durchsatzniveau kann erwartet werden, dass ein primärer Screen 100-1000 ,Hits' pro Tag liefert. Es ist erforderlich, dass jedes dieser mutmaßlichen Medikamente einem weiterhin verfeinerten Screening und Test in einer Vielfalt an Analyseverfahren unterzogen wird, um die biologische Verträglichkeit der Verbindung zu untersuchen. Solche Analyseverfahren schließen Bioverfügbarkeit, Metabolismus und Toxikologie ein, und sie werden vorwiegend unter Verwendung von kultivierten Zelllinien durchgeführt. Im Vergleich mit Analyseverfahren, die in den primären Screeningprozessen verwendet werden, weisen sekundäre Screeninganalyseverfahren ein höheres Komplexitätsniveau und stringentere Bedürfnisse, sowohl in der Mechanik des Analyseverfahrens als auch in der erzeugten Information, auf. Es gibt ein Bedürfnis in dem Fachgebiet an Methodologien für sekundäre Screeninganalyseverfahren, die in der Lage sind, sowohl die ansteigende Rate einer mutmaßlichen Medikamentenhaupterzeugung als auch die Erzeugung von biologischen Daten zu handhaben, die den Medikamentenanwärter betreffen. Zudem weist die Entwicklung von Analyseverfahren, die einen höheren Informationsgehalt liefern, das Potenzial zur Erhöhung des Charakterisierungsniveaus eines Hauptmedikaments während der Screeningphase der Medikamentenentwicklung auf.
  • Früher sind mikrogefertigte Einrichtungen beschrieben worden, die zur Verwendung in miniaturisierten biologischen Analysen geeignet sind. Zum Beispiel offenbart WO 96/15450 eine Einrichtung, die eine geätzte Glasstruktur mit einer Ansammlung von Kammern umfasst, die durch einen Mikrokanal verbunden und von einer Glasplatte eingeschlossen sind. Es sind Einrichtungen von Wilding et al., zum Beispiel in der WO 93/22058, beschrieben worden, die eine mesoskalige Einrichtung zur Amplifikation von DNA durch PCR offenbart, wobei die Einrichtung aus einer Anzahl an Kammern besteht, die durch einen Kanal verbunden sind. WO 93/22055 und WO 93/22053 betreffen Einrichtungen zur Analyse einer fluiden, Zellen enthaltenden Probe, die ein mesoskaliges Flusssystem mit einem Eintrittsanschluss zur Aufnahme und/oder Lyse von Zellen in biologischen Fluiden umfasst oder eine Bindungseinheit zur spezifischen Bindung eines Analyten enthält, wobei der Analyt eine intrazelluläre Komponente in einer Zelle in einer Probe oder eine Zellpopulation in einer Probe sein kann. Die vorstehenden Einrichtungen betreffen die Messung oder Detektion von Zellen oder zellulären Analyten in Zelten, die in die Vorrichtung unmittelbar vor der Analyse eingeführt werden. Sie sind weder zur Verwendung in einer Zellkultur oder -wachstum noch zur Verwendung bei der Untersuchung von zellulären Antworten auf Mittel in dem Test beschrieben. Zudem beschreiben oder ermöglichen sie nicht die Verwendung von haftenden kultivierten Zellen.
  • Ähnliche Lehren können ebenfalls in US 5,637,469 , US 5,593,838 und WO 97/21090 gefunden werden. US 5,637,469 schlägt in allgemeiner Ausdrucksweise vor, das Zellwachstum in mesoskaligen Systemen zu überwachen und eine Flussinhibition als eine Anzeige vom Wachstum eines unspezifizierten Organismus in einer mesoskaligen Struktur zu überwachen, die mit einem Wachstumsmedium und einer Probe (Beispiel 7) gefüllt und verschlossen worden ist.
  • US 5,593,838 beschreibt ein mikrogefertigtes Substrat, das eine Gruppierung von miniaturisierten Vertiefungen einschließt und Mikrokanäle auf der Oberfläche verbindet, um Sythese-, Screeening- und chemische Diagnose-Analyseverfahren durchzuführen.
  • WO 97/21090 beschreibt eine mikrogefertigte Vorrichtung zum Zellen-Zählen, Sortieren, zellbiologischen Analyse und Testen.
  • WO 96/14933 beschreibt mesoskalige Einrichtungen zum (a) Charakterisieren des selbständigen Bewegungsvermögens von Zellen, hautsächlich Spermienzellen, d.h. Zellen, die sich ohne Anhaftmittel bewegen, (b) Trennen und Sammeln von frei beweglichen Zellen von Interesse und (c) in vitro Fertilisisation.
  • FR 2657879 beschreibt eine makroskalige Einrichtung zum Kultivieren von Zellen.
  • US 4,018,652 beschreibt eine makroskalige Einrichtung für die Bestimmung der Konzentration von Mikroorganismen.
  • US 4,077,845 beschreibt eine Einrichtung zum Detektieren, Identifizieren und Gruppieren von Pathogenen aus dem Harnweg.
  • US 4,318,994 beschreibt eine Einrichtung zum Detektieren von Mikroben in Vertiefungen, die verschiedene Medien enthalten.
  • Es gibt ein Bedürfnis an einer Einrichtung, die in der Lage ist, eine Umgebung bereitzustellen, die ein Langzeitüberleben von kultivierten Zellen unterstützt, die mit Mitteln gekoppelt ist, um Zellen, die innerhalb der Einrichtung kultiviert werden, zum sekundären Medikamentenscreening oder anderen Untersuchungen auszunutzen.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung bereit, welche zur Durchführung von Zellwachstum und/oder auf Zellen beruhenden Analyseverfahren in einem flüssigen Medium mikrogefertigt ist, wobei die Vorrichtung umfasst:
    • (a) eine Basisplatte, welche eine Vielzahl von Mikrokanalelementen trägt, jeweils umfassend eine Zellwachstumskammer, einen Einlasskanal und einen Auslasskanal;
    • (b) eine Deckplatte, welche über der Basisplatte positioniert ist, wobei die Deckplatte über diese Elemente ragt, sodass die Kammern und Kanäle definiert werden; und
    • (c) ein hydrophobes Ventil in mindestens einer der Kammern oder der Kanäle, wobei das Ventil mittels eines lokalisierten Bereichs an Hydrophobizität innerhalb der Kammer oder des Kanals vorgesehen ist; und
    • (d) Mittel, welche in den Zellwachstumskammern eingebaut sind, für das Zellwachstum.
  • In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung einer Testsubstanz auf eine zelluläre Aktivität oder einen physikalischen Parameter bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) Bereitstellen einer Vorrichtung der Erfindung;
    • (b) Einführen von Zellen in die Vorrichtung und Verursachen, dass die Zellen zu einer oder mehreren Zellwachstumskammern in der Vorrichtung transportiert werden;
    • (c) Kultivieren der Zellen in einer oder mehreren Zellwachstumskammern;
    • (d) Bereitstellen von einer oder mehreren Proben von Testsubstanzen, deren Wirkung auf die Zellen gemessen werden soll, unter Bedingungen, sodass bewirkt wird, dass die Zellen den Substanzen ausgesetzt werden; und
    • (e) Bestimmen der Wirkung der Testsubstanzen auf die Zellen mittels optischer Detektion.
  • Bevorzugt schließt das Verfahren zum Untersuchen der Wirkung einer Testsubstanz den Schritt des Kultivierens von Zellen, die an einer Oberfläche innerhalb der Vorrichtung anhaften, vor der Einführung von Testsubstanzen ein. Bevorzugt werden im Anschluss an Schritt c) ein oder mehrere Analysereagenzien und ein Verteilen der Reagenzien in eine oder mehrere Reaktionskammern in der Vorrichtung bereitgestellt.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Messen eines zellulären Analyten bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) Bereitstellen einer Vorrichtung der Erfindung;
    • (b) Einführen von Zellen in die Vorrichtung und Bewirken, dass die Zellen zu einer oder mehreren Zellwachstumskammern in der Vorrichtung transportiert werden;
    • (c) Kultivieren der Zellen in einer oder mehreren Zellwachstumskammern;
    • (d) Bereitstellen von einem oder mehreren Analysereagenzien und Verteilen der Reagenzien in einer oder mehreren Kammern in der Vorrichtung; und
    • (e) Messen des zellulären Analyten durch optische Mittel.
  • Damit die Erfindung besser verstanden werden kann, werden nun einige Ausführungsformen nur beispielhaft und unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben werden, in denen:
  • 1a eine schematische Darstellung in Ebene eines individuellen Mikrokanalelements der mikrogefertigten Vorrichtung zur Durchführung von Zellwachstum und auf Zellen beruhenden Analyseverfahren ist;
  • 1b eine Teilansicht einer mikrogefertigten Scheibe ist, die eine Vielzahl von Analyseelementen zur Durchführung von Zellwachstum und auf Zellen beruhenden Analyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung einschließt;
  • 2 eine alternative Konfiguration eines individuellen Analyseelements der mikrogefertigten Vorrichtung zur Verwendung mit Zellen darstellt, die auf der Oberfläche von Mikrobeads wachsen; und
  • 3 eine weitere Konfiguration eines individuellen Analyseelements der mikrogefertigten Vorrichtung darstellt, in dem Mittel zur Vorbeugung oder Verhinderung des Durchgangs von Zellen in die Zellwachstumskammer bereitgestellt bzw. vorgesehen sind.
  • Unter Bezugnahme auf 1b umfasst die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eine rotierbare Schreibe (18), die mikrogefertigt ist, um einen Probeneinführungsanschluss (nicht gezeigt) bereitzustellen, der in Richtung zu der Mitte der Scheibe angeordnet und mit einem ringförmigen Probenhalter (9) verbunden ist, der wiederum mit einer Vielzahl von radial verteilten Mikrokanalanalyseelementen (6) verbunden ist, wobei jeder der Mikrokanalelemente eine Zellwachstumskammer, einen Probeneinlasskanal und einen Auslasskanal zur Entfernung von Flüssigkeit davon und eine Deckplatte umfasst, die auf der Scheibe positioniert ist, sodass geschlossene Kammern und Verbindungskanäle definiert werden. Jedes Mikrokanalelement ist an einem Ende mit dem zentralen Probenbehälter (9) und an dem gegenüberliegenden Ende mit einem gemeinsamen Abfallkanal (10) verbunden.
  • Jedes der radial verteilten Mikrokanalelemente (6) der mikrogefertigten Vorrichtung (die in 1a gezeigt ist) umfasst einen Probeneinlasskanal (1), der an seinem linken Ende mit dem Behälter (9), einer Zellwachstumskammer (2) zur Durchführung von Zellwachstum verbunden ist und durch einen Kanal (4) mit einer Analysekammer (3) und einem Auslasskanal (5) verbunden ist, der an seinem rechten Ende mit den Abfallkanal (10) verbunden ist.
  • In einem alternativen Format der vorliegenden Erfindung, wie in 2 gezeigt, sind die Mikrokanalelemente (6) modifiziert, um die Verwendung der Vorrichtung mit Zellen zu ermöglichen, die auf der Oberfläche von Mikroträgerbeads (17) wachsen. Jedes Mikrokanalelement (6) umfasst folglich einen Probeneinlasskanal (8), der an seinem linken Ende mit dem Probenbehälter (9) verbunden ist, eine Zellwachstumskammer (7), die durch einen Kanal (16) mit einer Analysekammer (11) verbunden ist, und einen Auslasskanal (12), der zu dem gemeinsamen Abfallkanal (10) führt.
  • Unter Bezugnahme auf 3 kann in einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung die Zellwachstumskammer (2) mit erhöhten geformten Strukturen bereitgestellt werden, die auf dem Basisteil der Zellwachstumskammer angeordnet sind, um Stützen (15) zu bilden, sodass sie eine Barriere zu dem Fluss oder Durchgang von Zellen bilden, die in der Zellwachstumskammer (2) durch einen Einlasskanal (1) ankommen, während der Durchgang von Flüssigkeit erlaubt ist. Diese Strukturen weisen Abmessungen auf, die gewählt sind, um Lücken zwischen den Strukturen bereitzustellen, die zu eng sind, um einen Durchgang von Zellen zu erlauben, die als Suspension in Flüssigkeit getragen werden, die sich in der Vorrichtung bewegt, aber die ausreichend groß sind, um Zellen zu erlauben, auf der Oberfläche der Zellwachstumskammer (14) zu wachsen, um durch die Barriere durch Ausweitung von Zellprozessen zwischen der Barriere und anschließender Cytokinese zu wandern. Geeignete Abmessungen für die Lücken zwischen den erhöhten Stützen (15), die in den Zellwachstumskammern gebildet sind, liegen zwischen 5 und 50 μm in Abhängigkeit von dem Zelltyp und der Zellgröße, die zur Erfassung ausgewählt sind.
  • Bevorzugt schließt jedes Mikrokanalelement (6), das in 3 gezeigt ist, zusätzlich ein oder mehrere Analysekammern zur Durchführung von Analyseverfahren ein, die zelluläre Bestandteile involvieren und zwischen besagter Zellwachstumskammer (2) und besagtem Auslasskanal (5) in Linie verbunden sind.
  • Geeigneterweise ist die Scheibe (18) eine ein- oder zweistückig geformte Konstruktion und ist aus einem optional transparenten Plastik- oder Polymermaterial mittels getrennter Formstücken gebildet, die zusammengesetzt werden, um eine geschlossene Struktur mit Öffnungen an definierten Positionen bereitzustellen, um eine Beladung der Einrichtung mit Flüssigkeiten und Entfernung von Abfallflüssigkeiten zu erlauben. In der einfachsten Form ist die Einrichtung als zwei komplementäre Teile hergestellt, wobei eines oder jedes geformte Strukturen trägt, die, wenn zusammen befestigt, eine Reihe von miteinander verbundenen Mikrokanalelementen innerhalb des Körpers einer festen Scheibe bilden. Alternativ können die Mikrokanalelemente durch Mikrobearbeitungsverfahren gebildet werden, bei denen die Mikrokanäle und Kammern, die die Mikrokanalelemente bilden, in der Oberfläche einer Scheibe mikrobearbeitet werden, und eine Deckplatte, zum Beispiel, eine Plastikfolie, an die Oberfläche angeheftet wird, sodass die Kanäle und Kammern eingeschlossen werden.
  • Um kultivierte Zellen mit Mitteln zum Erhalten von Sauerstoff für den Metabolismus und zum Ermöglichen der Verwendung von CO2-gepufferten Medien bereitzustellen, können eine oder mehrere Komponenten der Einrichtung aus einem gasdurchlässigen Plastik, Folie, Polymer oder Membran konstruiert sein. Geeigneterweise ist das gasdurchlässige Plastik, Folie, Polymer oder Membran aus Siliconpolymeren, wie beispielsweise Polydimethylsiloxan, oder aus Polyurethan, Polytetrafluorethylen oder anderen gasdurchlässigen Plastikmaterialien gebildet. Zudem werden bevorzugt Mittel (nicht gezeigt) zum Verschließen der Öffnungen in der geschlossenen Struktur bereitgestellt, um einer Verdampfung von Flüssigkeit während der Verwendung vorzubeugen, wodurch solche Mittel die Öffnungen ohne Stören des Gasaustauschs mit dem Zellwachstumsmedium verschließen. Das Verschließen kann durch Verwendung einer weiteren Schicht aus gasdurchlässigem Material über die ganze Einrichtung oder durch Verwendung eines nicht-durchlässigen Materials ausgeführt werden, das nur lokal auf die Öffnungen angewendet wird, wobei der Rest des gasdurchlässigen Materials zu der lokalen Atmosphäre ausgesetzt gelassen wird.
  • Geeignete Plastik- oder Polymermaterialien zum Bilden der Zellwachstumskammer und Mikrokanäle sind bevorzugt ausgewählt, um hydrophobe Eigenschaften aufzuweisen, wobei die Oberfläche des Plastiks oder Polymers zusätzlich durch chemische oder physikalische Mittel selektiv modifiziert sein kann, um die Oberflächeneigenschaften zur Verleihung einer gewünschten Eigenschaft, zum Beispiel, Verträglichkeit mit Zellwachstum, Zellanhaften und die Anhaften von Biomolekülen durch kovalente oder nicht kovalente Mittel zu ändern. Bevorzugte Plastiks sind aus Polystyrol und Polycarbonat ausgewählt.
  • Alternativ können die Zellwachstumskammer und Mikrokanäle aus Plastik- oder Polymermaterialien aufgebaut sein, die ausgewählt sind, um hydrophile Eigenschaften aufzuweisen. Die Oberfläche des Plastiks oder Polymers kann durch chemische oder physikalische Mittel zusätzlich selektiv modifiziert sein, um die Oberflächeneigenschaften zu ändern, sodass lokalisierte Bereiche an Hydrophobizität innerhalb der Kammern und/oder Mikrokanäle zum Verleihen einer gewünschten Eigenschaft hergestellt werden. Durch dieses Mittel können, zum Beispiel, hydrophobe Barrieren oder Ventile bereitgestellt werden, um einen Flüssigkeitsfluss innerhalb der Vorrichtung zu kontrollieren. Bevorzugte Plastiks sind aus Polymeren mit einer geladenen Oberfläche, geeigneterweise chemisch oder mit Ionenplasma behandeltes Polystyrol, Polycarbonat oder anderen starren transparenten Polymeren, ausgewählt.
  • Die Mikrokanalelemente (6) sind um die Scheibe (18) radial verteilt und mit einem gemeinsamen mittigen Anschluss verbunden. Die Kanäle 1, 4, 5, 8, 12 und 16 weisen eine Abmessung auf, die mit der Bewegung von Zellen entlang der Kanäle kompatibel ist. Geeigneterweise können die Kanäle und Kammern irgendeine Querschnittsform, wie beispielsweise Quadrat, Rechteck, Kreis, Trapez und Dreieck, aufweisen. Geeigneterweise ist die Zellwachstumskammer (2) dimensioniert, um eine Bodenfläche zwischen 100 μm2 und 1.000.000 μm2, bevorzugt zwischen 1000 μm2 und 1.000.000 μm2 und am meisten bevorzugt zwischen 10.000 μm2 und 1.000.000 μm2 aufzuweisen. Die Plastik- oder Polymeroberfläche der Zellwachstumskammer kann selektiv behandelt oder modifiziert sein, um ein Zellanhaften und/oder -wachstum zu ermöglichen. Eine Behandlung involviert bevorzugt ein Aussetzen zu intensivem UV-Licht, um die Polymeroberfläche zu modifizieren, oder alternativ die Verwendung von Hochspannungsplasmaentladung unter Verwendung bekannter Techniken (siehe Amstein, C.F. und Hartmann, P.A., J. Clin. Microbiol., 2, 1, 46-54 (1975)), um eine negativ geladene Oberfläche zu erzeugen, die zum Zellwachstum und -anhaften und (wenn erforderlich) für Analyseverfahrenzwecke geeignet ist. Ein Zellanhaften kann durch die Anwendung von zusätzlichen Beschichtungen auf die Oberfläche der Zellwachstumskammer, z.B. Polylysin, Kollagen, Fibronectin, weiterhin verbessert werden.
  • Wie bereits erwähnt, ist in einem bevorzugten Aspekt der Erfindung jedes der Mikrokanalelemente (6) weiterhin mit einer Analysekammer (3) bereitgestellt, die zwischen der Zellwachstumskammer (2) und dem Auslasskanal (5) zum Durchführen von Analyseverfahren, die zelluläre Bestandteile involvieren, in Linie angeordnet ist. Die Analysekammer ist proportional zu dem Volumen der Zellwachstumskammer (2) dimensioniert, um eine Sammlung und/oder Erfassung von löslichen Analyten zu erlauben, die von den kultivierten Zellen in Untersuchung abgeleitet werden können. Geeigneterweise liegt das Volumen der Analysekammer (3) zwischen zwei und einem Zehntel des Volumens der Zellwachstumskammer (2). Vorteilhafterweise ist der Kanal (4), der die Zellwachstumskammer mit der Analysekammer verbindet, durch das Aufweisen von hydrophoben Wänden und einer Querschnittsfläche charakterisiert, die kleiner als der Kanal (1) stromaufwärts der Zellwachstumskammer ist. Geeigneterweise weist der Kanal (4) eine Querschnittsfläche von zwischen 0,99 und 0,01 Mal der des Einlasskanals (1) auf. Geeigneterweise ist der Auslasskanal (5) durch das Aufweisen von hydrophoben Wänden und einer Querschnittsfläche von zwischen 0,99 und 0,01 Mal der des Einlasskanals (4) charakterisiert. Auf diese Weise kann der Flüssigkeitsfluss in den Mikrokanalelementen durch Anwendung einer definierten Zentrifugalkraft kontrolliert werden, um die Flüssigkeit zu veranlassen, in einen Kanal mit einer definierten Querschnittsfläche zu fließen, wobei die gleiche Kraft unausreichend ist, um die Flüssigkeit zu veranlassen, in weiterhin verknüpfte Kanäle mit geringerer Querschnittsfläche zu fließen, wobei dies die Wirkung aufweist, den Flüssigkeitsfluss bei einer gewünschten Position in dem Mikrokanalelement anzuhalten.
  • Bei einem alternativen Mittel zur Kontrolle des Flüssigkeitsflusses sind der Kanal (1) und der Kanal (4) mit der gleichen Querschnittsfläche konstruiert, aber die Oberfläche von jedem der Kanäle kann durch chemische oder physikalische Mittel selektiv modifiziert sein, um dem Kanal einen unterschiedlichen Grad an Hydrophobizität zu verleihen. Zum Beispiel kann der Kanal (4) stromabwärts der Zellwachstumskammer (2) behandelt sein, um eine höhere Hydrophobizität als der Kanal (1) stromaufwärts der Zellwachstumskammer aufzuweisen. Durch dieses Mittel wird eine Anwendung einer definierten Kraft auf Flüssigkeit in dem Kanal (1), die ausreichend ist, um die Flüssigkeit zu veranlassen, sich in diesem Kanal nach unten zu bewegen, unausreichend sein, um zu veranlassen, dass die Flüssigkeit in den zweiten Kanal (4) mit höherer Hydrophobizität eintritt, wobei dies die Wirkung aufweist, dass der Flüssigkeitsfluss bei einer gewünschten Position in dem Mikrokanalelement angehalten wird. Geeignete Mittel zum selektiven Modifizieren der Hydrophobizität der Oberfläche der Kanäle schließt ein Aussetzen von definierten Flächen zu Ionisierung oder elektromagnetischer Strahlung oder Ionenplasma durch eine Maske oder durch Anwendung eines hydrophoben Materials oder Tinte durch Siebdruck oder andere Mittel von lokalisierter Anwendung ein.
  • Die Mittel zur Kontrolle des Flüssigkeitsflusses innerhalb der Vorrichtung, wie vorstehend beschrieben, können alleine oder in Kombination verwendet werden, wie erforderlich, um die gewünschte Kontrolle des Flüssigkeitsflusses in verbundene Kammern und Kanäle innerhalb des Mikrokanalelements zu verleihen. Wenn in Kombination verwendet, können die Verfahren nacheinander verwendet werden, zum Beispiel, wenn eine Änderung in der Querschnittsfläche von einer Änderung in der Hydrophobizität gefolgt wird, wobei zwei nacheinander folgende Punkte der Flüssigkeitsflusskontrolle gebildet werden. Alternativ können die Verfahren, bei denen eine Änderung in der Querschnittsfläche eines Kanals von einer Änderung in der Hydrophobizität des Kanals begleitet wird, gleichzeitig verwendet werden, wobei die Kombination verwendet wird, um einen Kontrollgrad über den Flüssigkeitsfluss zu verleihen, der unter Verwendung eines einzigen Mittels nicht erreichbar ist.
  • Die innere Oberfläche der Analysekammer kann mit einem oder mehreren Liganden beschichtet sein, die in der Lage sind, einen Analyten von Interesse durch kovalentes oder nicht kovalentes Verknüpfen des Liganden mit der Oberfläche spezifisch zu binden. Beispiele von Liganden, die für diesen Zweck geeignet sind, schließen ein: Biotin, Streptavidin, Protein A, Antikörper, Lectine, Hormonrezeptoren, Nukleinsäuremarker, DNA-bindende Proteine und dergleichen.
  • Die Vorrichtung und das Verfahren können für das Wachstum von Zellen und die Detektion und Messung von zellulärer Aktivität, zellulären Parametern und biochemischen Prozessen, zum Beispiel zellulären Metabolismus, Zelllebensfähigkeit, Reportergenexpression, unter Verwendung von nicht invasiven Techniken, d.h. Techniken, die nicht die Unversehrtheit oder Lebensfähigkeit von Zellen gefährden, verwendet werden. Alternativ kann die Vorrichtung bei der Detektion und Messung von Zell-abgeleiteten Produkten verwendet werden, die freigegeben oder anderweitig von Zellen ausgeschieden worden sind, wie beispielsweise Peptidhormone oder zweite Messenger usw. Durch Verwendung der Vorrichtung, die in 3 gezeigt ist, ermöglich die Vorrichtung Untersuchungen der Zellmigration in Antwort auf chemische oder physikalische Stimulanzien, zum Beispiel, Chemotaxis, wobei eine Chemoattraktant-Substanz auf einer Seite einer Barriere platziert ist, und beobachtet wird, ob Zellen, die auf der gegenüberliegenden Seite der Barriere platziert sind, die Barriere beim Bewegen in Richtung zu dem Chemoattractant durchdringen.
  • Die Erfindung kann mit irgendeinem Zelltyp verwendet werden, der auf Standardgewebekulturplastikware kultiviert werden kann. Solche Zelltypen schließen alle normalen und transformierten Zellen ein, die von irgendeiner anerkannten Quelle in Bezug auf die Art (z.B. Mensch, Nagetier, Affe), Gewebequelle (z. B. Gehirn, Leber, Lunge, Herz, Nierenhaut, Muskel) und Zelltyp (z. B. epithelial, endothelial) abgeleitet sind. Zudem können Zellen, die mit rekombinanten Genen transfektiert worden sind, ebenfalls unter Verwendung dieser Erfindung kultiviert werden. Es gibt etablierte Protokolle, die für die Kultur verschiedener Zelltypen erhältlich sind. (Siehe zum Beispiel, Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Edition, Alan R.Liss Inc. 1987). Solche Protokolle können die Verwendung von besonders entwickelten Beschichtungen und selektiven Medien benötigen, um Zellwachstum und die Expression von zellulären Spezialistenfunktionen zu ermöglichen. Keines solcher Protokolle ist von der Verwendung mit der Vorrichtung dieser Erfindung ausgeschlossen.
  • Der Maßstab der Einrichtung wird zu einem gewissen Ausmaß durch ihre Verwendung diktiert, das heißt, die Einrichtung wird eine Größe aufweisen, die mit der Verwendung von eukaryotischen Zellen kompatibel ist. Dies wird eine untere Grenze auf irgendeinen Kanal auferlegen, der ausgelegt ist, um eine Bewegung von Zellen zu erlauben, und wird die Größe von Zelleindämmung oder Wachstumsflächen entsprechend der Anzahl an Zellen bestimmen, die in jedem Analyseverfahren vorhanden sind. Eine durchschnittliche Säugetierzelle, die als eine haftende Kultur wächst, weist eine Fläche von ~300 μm2 auf; nicht haftende Zellen und nicht anhaftende Zellen weisen einen Kugeldurchmesser von ~10 μm auf. Es ist folglich wahrscheinlich, dass Kanäle für die Bewegung von Zellen innerhalb der Einrichtung Abmessungen in der Ordnung von 20-30 μm oder größer haben werden. Größen von Zellenhalteflächen werden von der Anzahl an Zellen abhängen, die erforderlich sind, um ein Analyseverfahren durchzuführen (wobei die Anzahl sowohl durch Sensitivität als auch statistische Bedürfnisse bestimmt wird). Es wird sich vorgestellt, dass ein typisches Analyseverfahren ein Minimum von 500-1000 Zellen benötigen wird, das für haftende Zellen Strukturen von 150.000-300.000 μm2, d.h. kreisförmige ,Vertiefungen' mit einem Durchmesser von 400-600 μm, benötigen wird.
  • Die Konfiguration der Mikrokanäle in der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt gewählt, um gleichzeitiges Besäen der Zellwachstumskammer durch Anwendung einer Suspension von Zellen in einem fluiden Medium auf den Probenbehälter mittels des Probeneinlassanschlusses, gefolgt durch Rotieren der Scheibe (18) durch geeignete Mittel bei einer Geschwindigkeit, zu erlauben, die ausreichend ist, um eine Bewegung der Zellsuspension nach außen in Richtung zu dem Umfang der Schreibe durch Zentrifugalkraft zu veranlassen. Die Bewegung der Flüssigkeit verteilt die Zellsuspension entlang jedem der Einlassmikrokanäle (1, 8) in Richtung zu den Zellwachstumskammern (2, 7). Die Drehgeschwindigkeit der Scheibe ist gewählt, um eine ausreichende Zentrifugalkraft bereitzustellen, um Flüssigkeit zu erlauben, zum Füllen der Zellwachstumskammer (2, 7) zu fließen, aber mit unausreichender Kraft für die Flüssigkeit, um in die begrenzten Kanäle (4, 16) mit kleinerem Durchmesser auf der gegenüber liegenden Seite der Zellwachstumskammer einzutreten.
  • Wenn die Rotation angehalten wird, können sich Zellen in der Suspension unter Gravität auf den Boden der Zellwachstumskammer (2, 7) setzen und an der behandelten Oberfläche anhaften, wenn vorhanden. Zellen, die in dem Kanal verbleiben, sind nicht fähig, sich an der unbehandelten hydrophoben Oberfläche anzuhaften und werden in Suspension verbleiben. Im Anschluss an eine angemessene Zeitdauer, die gewählt ist, um der Zellanhaftung zu erlauben, stattzufinden, kann die Einrichtung folglich bei einer höheren Geschwindigkeit als vorher gedreht werden, sodass alle Flüssigkeit und nicht anhaftende Zellen veranlasst werden, sich in Richtung zu dem Umfang der Scheibe in den Abfallkanal (10) zu bewegen, der um den Rand der Scheibe angeordnet ist. Im Anschluss an die Reinigung von Kanälen von nicht anhaftenden Zellen wird die Rotation auf die gleiche Geschwindigkeit verlangsamt, die anfänglich verwendet wurde, um die Mikrokanalelemente zu füllen, und frische Kulturmedien werden auf den Probenbehälter angewendet. Durch nochmalige Rotation der Scheibe fließen die Kulturmedien unter Zentrifugalkraft, um die Mikrokanäle und die Zellwachstumskammern zu füllen, wie vorher beschrieben. Die Tätigkeit lässt die anhaftenden Zellen auf der Oberfläche der Zellwachstumskammern ausgesät, mit frischen Kulturmedien bedeckt, die zum Zellwachstum und für auf Zellen beruhende Analyseverfahren geeignet sind.
  • In der Vorrichtung von 2 stellen die Beads (17) eine große Oberfläche für das Zellanhaften und -wachstum in einem relativ kleinen Flüssigkeitsvolumen bereit. In der hier beschriebenen Einrichtung führen die Beads (17) zwei Funktionen durch; zuerst stellen sie eine Oberfläche für das Anhaften und das Wachstum von Zellen bereit, wobei so das Bedürfnis zur Bereitstellung einer Zellwachstumkompatiblen Oberfläche innerhalb der Scheibe entfernt wird, was erlaubt, dass ein breiterer Bereich an Materialien für die Konstruktion verwendet werden kann, und zweitens stellen sie einen größeren physikalischen Träger für Zellen bereit, der erlaubt, dass Kanäle innerhalb der Einrichtung leicht ausgelegt werden, um einem Zugang von Zellen vorzubeugen. In der bevorzugten Ausführungsform umfasst jedes Element eine Zellwachstumskammer (2, 17), eine Analysekammer (3, 11) und eine Abfallkammer (10), die radial um die Mitte der Scheibe angeordnet sind und mit einem gemeinsamen Anschluss in der Mitte der Scheibe verbunden sind.
  • Im Anschluss an die Zugabe von Zellproben zu der Vorrichtung, ihrem Anhaften und anschließendem Zellwachstum können Reagenzien und Proben für das Analyseverfahren in den Probenbehälter (9) durch den Probeneinlassanschluss eingeführt werden. Reagenzien, die zu allen Mikrokanalelementen zuzuführen sind, können, wie hierin vorstehend zum Besäen mit Zellen beschrieben, eingeführt werden, das heißt, durch Anwendung einer Lösung, die Reagenzien enthält, auf den zentralen Anschluss und Rotieren der Scheibe, sodass eine Verteilung des Reagenzes zu allen Mikrokanälen, Zellwachstumskammern und Analysekammern veranlasst wird. Die Anwendung von spezifischen Proben auf spezifische Vertiefungen kann durch Pipettieren von kleinen Flüssigkeitsvolumen wie einzelne Tropfen in die zentrale Vertiefung direkt benachbart zu der Öffnung des Einlasskanals erreicht werden, der zu der Zellwachstumskammer führt, die die Probe empfangen muss. Dies kann, zum Beispiel, durch die Verwendung einer piezo-elektrischen Verteilvorrichtung (nicht gezeigt) erreicht werden, wodurch ein Verteilen von Flüssigkeitströpfchen aus der Einrichtung mit der Rotationsgeschwindigkeit der Scheibe (18) derart synchronisiert wird, dass bei einer angemessenen Kombination der Verteiltropfenfrequenz und Rotationsgeschwindigkeit der Scheibe individuelle Flüssigkeitströpfchen veranlasst werden können, auf die Oberfläche der Scheibe zu treffen und veranlasst werden können, durch Zentrifugalkraft in einen benachbarten Einlasskanal (1, 8) transportiert zu werden und sich mit Flüssigkeit zu mischen, die in der Zellwachstumskammer (2, 7) vorhanden ist.
  • Alternativ können Flüssigkeiten als einzelne Tropfen auf die hydrophobe Oberfläche einer stationären Scheibe (18) pipettiert werden, wobei eine Rotation der Scheibe verwendet wird, um diese Flüssigkeitstropfen in einen angemessenen Einlasskanal und so zu der Zellwachstumskammer zu bewegen. Durch diese Mittel können alle Reagenzien und Proben der Zellkammer in der gewünschten Reihenfolge und Verhältnissen bereitgestellt werden, um das Analyseverfahren durchzuführen.
  • Wenn einmal die Flüssigkeitsmanipulationen des Analyseverfahren durchgeführt worden sind, ist es notwendig, eine Detektionsprozedur durchzuführen, um das Ergebnis des Analyseverfahrens, typischerweise durch Messen des Signals, das durch ein Fluoreszenzmittel, ein Chemilumineszenzmittel oder andere Markereinheit ausgesendet wird, zu messen. Die Einrichtung, wie in 1b gezeigt, ist konfiguriert, um zwei Mittel zur Detektion des Analysesignals zu erlauben. Zuerst kann das Analysensignal in-situ in der Zellwachstumskammer gemessen werden. Solch ein Signal wird durch die Messung des Produkts eines Reportergens innerhalb der Zellen, z. B. Fluoreszenz von GFP, verkörpert werden.
  • Alternativ kann es wünschenswert sein, Zell-abgeleitete Produkte oder Analyten, zum Beispiel durch immunochemische oder andere spezifische Analyseverfahren, in der Abwesenheit von in der Vorrichtung kultivierten Zellen zu messen, sodass eine Störung bei der Messung vermieden wird. In diesem Fall wird die Vorrichtung mit einer zweiten Kammer bereitgestellt, d.h. der Analysekammer (3, 11), die naher an dem Umfang der Scheibe angeordnet und mit der Zellwachstumskammer (2, 7) verbunden ist. Die Analysekammer ist mit dem Umfangsabfallkanal (10) durch einen engen Kanal (5, 12) verbunden, wobei dieser Kanal einen kleineren Durchmesser als der (4, 16) aufweist, der die Analysekammer mit der Zellwachstumskammer verbindet. Die Differenz bei den Durchmessern zwischen den Kammern erlaubt unter kontrollierten Rotations- und Zentrifugalkraftbedingungen, wie vorstehend diskutiert, der Flüssigkeit, von der Zellwachstumskammer zu der Analysekammer bewegt zu werden. Zum Beispiel wird durch diesen Prozess ein Analyt von der Zellwachstumskammer in die Analysekammer bewegt, wo der Analyt einer Affinitätserfassung durch einen Liganden unterworfen wird, der an der Wand der Analysekammer anhaftet. Dieser Prozess stellt deshalb ein Mittel zur Bewegung eines Zell-abgeleiteten Analyten bereit, der freigegeben oder anderweitig von Zellen ausgeschieden worden ist, weg von der zellulären Umgebung, wobei der Analyt innerhalb der Analysekammer mittels eines spezifischen Bindungspartners zum Binden des Analyten immbobilisiert wird und wobei anschließende Zugaben von Reagenzien und Verarbeitung erlaubt werden, um die Detektion des Analyten zu ermöglichen.
  • Optional kann mindestens eines der Reagenzien zur Verwendung in einem Analyseverfahren unter Verwendung der Vorrichtung mit einem detektierbaren Marker durch kovalentes oder nicht kovalentes Anhaften markiert werden. Geeignete detektierbare Marker können aus fluoreszierenden Markern, chemilumineszierenden Markern, biolumineszierenden Markern, Enzymmarkern und radioaktiven Markern ausgewählt werden. Geeignete fluoreszierende Marker zum Markieren von Reagenzien entsprechend dem Verfahren der Erfindung können aus den allgemeinen Kategorien von fluoreszierenden Farbstoffen ausgewählt werden, die Fluoresceine, Rhodamine, Cyaninfarbstoffe, Cumarine und die BODIPY-Gruppen von fluoreszierenden Farbstoffen einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Beispiele von biolumineszierenden detektierbaren Markern sind in den fluoreszierenden Reporterproteinen, wie beispielsweise Green Fluorescent Protein (GFP) und Aequorin, zu finden. Alternative Marker zum Bereitstellen eines detektierbaren Signals können Fluoreszenzenergieübertragungsmarker sein.
  • Wenn das Analyseverfahren einmal vollendet worden ist, kann eine Messung des Signals durch Mittel erreicht werden, die für das markierende Molekül oder Einheit angemessen sind, das bzw. die in dem Analyseverfahren verwendet wird, und wird typischerweise durch optische Mittel erreicht. Zum Beispiel kann eine Lumineszenz, die von Zellen oder von einem fluoreszierenden markierten Analysereagens ausgesendet wird, in der mikrogefertigten Vorrichtung durch die Verwendung einer Abbildungsvorrichtung, die eine CCD Kamera enthält, oder durch die Verwendung eines Fluorimeters detektiert werden. Die Detektion von ausgesendeter Fluoreszenz kann durch den Körper der Scheibe (18) erreicht werden, wobei die Scheibe vollständig aus einem transparenten Material oder alternativ durch Fenster aus transparentem Material konstruiert ist, die in dem Körper der Scheibe gefertigt worden sind.
  • Als eine Alternative zu der nicht-radioaktiven Detektion kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit radioaktiver Detektion unter Ausnutzung der Szintillationsnäherungstechnik verwendet werden. Zum Beispiel können Szintillationsmittel enthaltende Beads in die Vorrichtung eingebaut werden. Alternativ kann die mikrogefertigte Vorrichtung der Erfindung eine Szintillationsmittel enthaltende Schicht in oder auf einer inneren Oberfläche der Zellwachstumskammer (2, 7) und/oder der Analysekammer (3, 11) eingebaut haben. Der Bereich der Vorrichtung, der die Szintillationsmittelbeads oder Szintillationsmitteloberfläche enthält, ist bevorzugt optisch transparent, sodass dem Material ermöglicht wird, Licht bei einer gegebenen Wellenlänge mit optimaler Effizienz zu senden. Der Szintillationsmittel enthaltende Bereich kann aus irgendeinem transparenten Material, das ein Szintillationsmittel, z. B. ein Szintillationsmittelglas auf Basis von Lanthanidmetall enthaltenden Verbindungen, oder ein Plastikmaterial, wie beispielsweise Polystyrol oder Polyvinyltoluol zusammengesetzt sein, in das eine Szintillationssubstanz eingebaut ist.
  • Geeignete Szintillationssubstanzen können aromatische Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise p-Terphenyl, p-Quaterphenyl und ihre Derivate, und Derivate von Oxazolen und 1,3,4-Oxadiazolen, zum Beispiel, 2-(4-t-Butylphenyl)-5-(4-biphenylyl)-1,3,4-oxadiazol und 2,5-Diphenyloxazol, sein. Ein Wellenlängenverschieber, wie beispielsweise 1,4-Bis(5-phenyl-2-oxazolyl)benzol oder 9,10-Diphenylanthracen, können ebenfalls eingeschlossen sein.
  • Eine Bindungseinheit, wie beispielsweise ein Element eines spezifischen Bindungspaars kann auf der Oberfläche der Bead oder Szintillationsschicht immobilisiert werden, um mit einem Analyten spezifisch zu binden, der aus Zellen abgeleitet werden kann, die in dem Analyseprozess verwendet werden. Geeignete spezifische Bindungspaarelemente, mit denen die Erfindung nützlich ist, schließen Biotin, Streptavidin, Protein A, Antikörper, Lectine, Hormonrezeptoren, Nukleinsäuremarker, DNA-bindende Proteine und dergleichen ein. Es sollte klar sein, dass jedes Element des spezifischen Bindungspaars zum Binden an ein komplementäres Element des spezifischen Bindungspaars angehaftet und immobilisiert werden kann.
  • Typische Radioisotope, die verwendet werden können, um das Analysereagens zu markieren, schließen jene ein, die üblicherweise in der Biochemie verwendet werden, wie beispielsweise [3H], [125I], [36S] und [33P], aber schließen nicht die Verwendung von anderen Isotopen aus. Detektionsmethodologien auf Basis von Szintillationsnäherung sind wohl bekannt (siehe zum Beispiel US Patent Nr. 4568649, Bertoglio-Matte, J.). Eine Detektion kann eine Anzahl an Modalitäten ausnutzen, die zu kombinieren sind, um zu erlauben, dass alle Analyseverfahren gleichzeitig oder in schneller Folge gemessen werden. Alternativ kann ein angemessenes Abbildungsformat geeignete Detektionsmittel für sowohl radioaktive als auch nicht radioaktive Analyseverfahren unter Ausnutzung der Vorrichtung bereitstellen.
  • In einigen Verwendungen werden einige Analyseflächen überschüssig sein; das heißt, nicht alle Elemente der Vorrichtung werden zu jeder Zeit verwendet werden. Es wird sich vorgestellt, dass der Benutzer entscheiden wird, welchen Typ an Analyseverfahren erforderlich ist, durchzuführen, und dann angemessene Kontrollmittel zum Richten des Flüssigkeitsflusses innerhalb der Vorrichtung auswählen wird. Solche Strukturen werden folglich mit einem Bereich an Analyseprozeduren und -protokollen kompatibel werden, die unterschiedliche Komplexitäten an Fluidbewegung benötigen. Zum Beispiel wird eine Detektion eines GFP-verknüpften Reportergens eine einfache Vertiefungsstruktur benötigen, um eine Fluoreszenzmessung zu erlauben. Im Gegensatz dazu wird eine Messung eines von Zellen ausgeschiedenen Analyten, zum Beispiel die Messung eines Cytonkins durch ein Immunoanalyseverfahren oder eine Messung von zellulärer mRNA im Anschluss an Lyse eine kompliziertere Struktur benötigen, um die Zellen von dem ausgeschiedenen Analyten vor der Analyse des Analyten zu trennen.
  • Die Erfindung wird weiterhin unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiel 1
  • Eine Stammkultur aus HeLa-Zellen wurde in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), das mit 10% Kalbsserum und L-Glutamin ergänzt war, in einer Plastikflasche unter Verwendung von Standardgewebekulturbedingungen wachsen gelassen. Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, und die sich ergebende Suspension wurde durch Zentrifugation konzentriert, um eine Zellkonzentration von 107 Zellen/ml zu ergeben. Aliquote der Zellsuspension (1 μl) wurden auf Öffnungen in der Oberfläche einer mikrogefertigten Struktur des in 1 gezeigten Typs, die durch Spritzgießen hergestellt war, mit inneren Kanälen mit einer Tiefe von 50 μm und einer Breite von 100 μm angewendet.
  • Die Zellensuspension wurde entlang der Einlasskanäle innerhalb der Scheibe zu kreisförmigen Zellwachstumskammern mit einer Tiefe von 50 μm und einem Durchmesser von 500 μm bewegt, und die Zellen wurden anhaften und wachsen gelassen. Im Anschluss an eine Inkubation über 48 Stunden in einem Gewebekulturinkubator (37°C/95% RF) wurden die Zellen auf Zelldichte, Morphologie und Lebensfähigkeit untersucht. Sichtbare Untersuchungen durch Phasenkontrastmikroskopie zeigten Zellpopulationen, die in Mikrostrukturen wuchsen, um die gleiche Dichte und Morphologie wie Kontrollkulturen aufzuweisen, die von dem gleichen Elternstamm wuchsen und in Standardgewebeplastikware gehalten wurden. Zellen wurden anschließend auf Lebensfähigkeit unter Verwendung eines kommerziellen Testkits (LIVE/DEAD Viability Kit, Molecular Probes, Oregon, L-3224) durch Spülen mit Wachstumsmedium aus den Zellen innerhalb der Einrichtung, Waschen der Zellen mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) und Einführen einer Lösung aus den fluoreszierenden Analysereagenzien in die Zellwachstumskammern getestet. Eine anschließende Untersuchung durch Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass Zellen, die in Mikrostrukturen wuchsen, eine Zelllebensfähigkeit von >95% beibehielten, vergleichbar mit Kontrollzellen, die unter Standardgewebekulturbedingungen wuchsen.
  • Beispiel 2
  • Eine mikrogefertigte Plastikscheibe des in 1 gezeigten Typs, die durch Spritzgießen hergestellt war, die eine Anzahl an radialen inneren Kanälen mit einer Tiefe von 50 μm und einer Breite von 100 μm enthielt, wurde durch Aussetzen zu einer 500 W UV-Lampe bei einem Abstand von 20 cm über 30 Minuten durch eine Metallmaske selektiv oberflächenmodifiziert, sodass UV-Licht auf die Oberfläche nur auf Bereiche auftraf, die durch die Maske definiert wurden.
  • Eine Stammkultur aus HeLa-Zellen wurde in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), das mit 10% Kalbsserum und L-Glutamin ergänzt war, in einer Plastikflasche unter Verwendung von Standardgewebekulturbedingungen wachsen gelassen. Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, und die sich ergebende Suspension wurde durch Zentrifugation konzentriert, um eine Zellkonzentration von 107 Zellen/ml zu ergeben. Aliquote der Zellsuspension (1 μl) wurden auf Öffnungen in der Oberfläche der Einrichtung angewendet, und Zellen bewegten sich entlang der Kanäle durch Rotation um die Scheibenachse (1000 Upm über 30 Sekunden). Im Anschluss an eine Inkubation über 48 Stunden in einem Gewebekulturinkubator (37°C/95% RF) wurden die Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie untersucht. Es wurde gefunden, dass Zellen bevorzugt in Bereichen der Scheibe wuchsen, die vorher UV-Licht ausgesetzt waren, es wurde beobachtet, dass Zellen in anderen Bereichen, dünner und weniger gut angehaftet waren. Die Scheibe wurde dann bei 1000 Upm über 30 Sekunden gedreht, und die Zellen wurden wieder untersucht. Es wurde beobachtet, dass im Anschluss an das Drehen Zellen in UV-ausgesetzten Flächen an die Plastikoberfläche angehaftet geblieben waren und zu Kontrollzellen morphologisch identisch geblieben waren; im Gegensatz dazu waren Zellen auf nicht ausgesetzten Oberflächen durch die Zentrifugalkraft vollständig entfernt worden, die durch die sich drehende Scheibe erzeugt wurde.
  • Beispiel 3
  • HeLa Zellen, die wie vorstehende beschrieben, wachsen gelassen und geerntet wurden, wurden in die Einrichtung von Beispiel 2 in Mikrokanäle eingeführt, die geformte Stützen mit verschiedenen Abmessungen enthielten, die in den Kanälen verteilt waren, um als Barrieren gegen Zellbewegung in die Kanäle zu wirken. Eine Zellensuspension wurde in die Kanäle eingeführt, und die Struktur wurde über 18 Stunden inkubiert, um die Zellen abzusetzen und wachsen zu lassen. Eine anschließende Untersuchung zeigte, dass beobachtet wurde, dass in Kanälen, in denen die Lücken zwischen Stützen 10 × 60 μm oder größer betrugen, Zellen sich frei an den Barrieren vorbei bewegt haben. Im Gegensatz dazu wurde, wo Lücken zwischen den Stützen 10 × 20 μm oder weniger betrugen, vorhindert, dass Zellen die Barriere passierten, wenn durch Flüssigkeitsfluss in Suspension transportiert. Es wurde jedoch beobachtet, dass bei anschließender Inkubation und Wachstum Zellen durch langsame Verformung an solchen Barrieren vorbei wanderten. Solche Barrierenstrukturen können sich zur Untersuchung von Zellbewegung oder -wanderung in Antwort auf chemische oder physikalische Stimulanzien als nützlich erweisen.
  • Beispiel 4
  • HeLa Zellen, die transfektiert waren, um eine stabile Expression eines Calreticulin-GFP-Fusionproteins zu ergeben, wurden in eine geformte Vorrichtung des in 1 gezeigten Typs eingeführt, die Kanäle mit einer Breite von 100 μm und einer Tiefe von 100 μm trug, die mit kreisförmigen Kammern mit einem Durchmesser von 600 μm und 1000 μm und einer Tiefe von 100 μm verbunden waren. Zellen wurden 18 Stunden lang in einem Gewebekulturinkubator inkubiert und durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Zellen, die in mikrogefertigten Strukturen wuchsen, zeigten das gleiche Niveau an GFP-Expression wie Kontrollzellen, die unter herkömmlichen Gewebekulturbedingungen wuchsen.
  • Beispiel 5
  • HeLa Zellen wurden wachsen gelassen und in eine mikrogefertigte Scheibe eingeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Im Anschluss an eine Inkubation über 18 Stunden wurde das Wachstumsmedium von den Zellen entfernt und mit Medien ersetzt, die verschiedene Konzentrationen der Membran enthielten, die das Mittel Digitonin in dem Bereich von 0-0,2mg/ml (w/v) durchdringen, und die Zellen wurden in der Gegenwart von Digitonin über 10 Minuten inkubiert. Danach wurde die Lebensfähigkeit der Zellen gemessen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wurde gefunden, dass die Ergebnisse äquivalent zu Zellen sind, die dem gleichen Dosisbereich an Digitonin in einem auf einem Mikrotiter beruhenden Analyseverfahren ausgesetzt waren.

Claims (24)

  1. Vorrichtung, welche zur Durchführung von Zellwachstum und/oder auf Zellen beruhenden Analyseverfahren in einem flüssigen Medium mikrogefertigt ist, wobei die Vorrichtung umfasst: a) eine Basisplatte, welche eine Vielzahl von Mikrokanalelementen trägt, jeweils umfassend eine Zellwachstumskammer, einen Einlasskanal und einen Auslasskanal; und b) eine Deckplatte, welche über der Basisplatte positioniert ist, wobei die Deckplatte über diese Elemente ragt, sodass die Kammern und Kanäle definiert werden; und c) ein hydrophobes Ventil in mindestens einer der Kammern oder der Kanäle, wobei das Ventil mittels eines lokalisierten Bereiches an Hydrophobizität innerhalb der Kammer oder des Kanals vorgesehen ist, und d) Mittel, welche in den Zellwachstumskammern eingebaut sind, für das Zellwachstum.
  2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend eine Zellsuspension, wobei die Zellen nicht menschliche Embryonalzellen sind, welche in den jeweiligen Zellwachstumskammern wachsen gelassen werden sollen.
  3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellen ein Anhaften an die Zellwachstumskammern zum Wachstum benötigen.
  4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei eine oder mehrere Komponenten der Vorrichtung aus einer gasdurchlässigen Folie oder Membran konstruiert sind, sodass CO2-gepufferte Medien in der Zellwachstumskammer verwendet werden können und Sauerstoff zu den Zellen für deren Metabolismus während des Wachstums durchdringen kann.
  5. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Basisplatte eine rotierbare Scheibe umfasst, welche mikrogefertigt ist, um einen Probeneinführungsanschluss, angeordnet in Richtung der Mitte der Scheibe und verbunden mit einem ringförmigen Probenbehälter, vorzusehen und wobei die Mikrokanalelemente radial auf der Scheibe verteilt sind, verbunden mit ihren entsprechenden Einlasskanälen, um Proben aus dem Behälter aufzunehmen.
  6. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, wobei das Plastikmaterial ein Polydimethylsiloxan- oder anderes Siliconpolymer, Polyurethan oder Polytetrafluorethylen oder ein anderes gasdurchlässiges Plastikmaterial ist.
  7. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mittel zum Zellwachstum umfassen: mindestens einen Teil einer Oberfläche der Zellwachstumskammer, welche behandelt ist, um das Anhaften von Zellen zu erlauben; oder eine oder mehrere Mikroträgerbeads, angeordnet in der Zellwachstumskammer, wobei jede der Mikroträgerbeads ein Anhaften von Zellen ermöglicht.
  8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei die Oberfläche eine negativ geladene Oberfläche ist.
  9. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei die Oberfläche eine Beschichtung aus Polylysin, Kollagen oder Fibronectin umfasst.
  10. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zellwachstumskammer erhöhte geformte Merkmale aufweist, welche auf dem Basisteil der Zellwachstumskammer abgelagert sind, um Stützen zu bilden.
  11. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Querschnittsfläche des Einlasskanals größer ist als die des Auslasskanals.
  12. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, wobei die Querschnittsfläche des Auslasskanals zwischen 0,99 und 0,01 Mal der des Einlasskanals ist.
  13. Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei mindestens einige der Mikrokanalelemente jeweils eine oder mehrere Analysekammern umfassen zum Durchführen von Untersuchungen, welche zelluläre Bestandteile einschließen und in Linie verbunden sind zwischen der Zellwachstumskammer und dem Auslasskanal.
  14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, wobei jede Analysekammer mit jeder anderen und der Zellwachstumskammer über einen Zwischenkanal verbunden ist, in der folgenden Reihenfolge: Einlasskanal, Zellwachstumskammer, Zwischenkanal, Analysekammer, Auslasskanal, und wobei die Querschnittsflächen der entsprechenden Kanäle sich fortschreitend vom Einlasskanal zum Auslasskanal verringern.
  15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, wobei die Querschnittsfläche von jedem Zwischenkanal und dem Auslasskanal zwischen 0,99 und 0,01 Mal derjenigen des unmittelbar stromaufwärts vorangehenden Kanales ist.
  16. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, wobei in oder an einer inneren Oberfläche von einer oder mehreren der Kammern eine Schicht bereitgestellt ist, welche eine Szintillationssubstanz umfasst.
  17. Vorrichtung gemäß Anspruch 16, wobei die Schicht eine Szintillationssubstanz umfasst, welche eine daran gebundene Bindungseinheit einschließt, wobei die Bindungseinheit ein Teil eines spezifischen Bindungspaares ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Streptavidin, Protein A, Antikörpern, Lectinen, Hormonrezeptoren, Nucleinsäuremarkern und DNA-bindenden Proteinen.
  18. Verfahren zur Bestimmung der Wirkung einer Testsubstanz auf eine zelluläre Aktivität oder einen physikalischen Parameter, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche; b) Einführen von Zellen, welche nicht menschliche Embryonalzellen sind, in die Vorrichtung und Verursachen, dass die Zellen zu einer oder mehreren Zellwachstumskammern in der Vorrichtung transportiert werden; c) Kultivieren der Zellen in einer oder mehreren Zellwachstumskammern; d) Bereitstellen von einer oder mehreren Proben von Testsubstanzen, deren Effekt auf die Zellen gemessen werden soll, unter Bedingungen, sodass bewirkt wird, dass die Zellen den Substanzen ausgesetzt werden; und e) Bestimmen der Wirkung der Testsubstanzen auf die Zellen mittels optischer Detektion.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Zellen innerhalb der Vorrichtung vor dem Einführen von Testsubstanzen kultiviert werden.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei nach Schritt d) ein oder mehrere Testreagenzien vorgesehen werden und diese Reagenzien in einer oder mehreren Reaktionskammern in der Vorrichtung verteilt werden.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 18, 19 oder 20, wobei die Zellen an einer oder mehreren Zellwachstumskammern anhaften.
  22. Verfahren zum Messen eines zellulären Analyten, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 b) Einführen von Zellen, welche nicht menschliche Embryonalzellen sind, in die Vorrichtung und Bewirken, dass die Zellen zu einer oder mehreren Zellwachstumskammern in der Vorrichtung transportiert werden; c) Kultivieren der Zellen in einer oder mehreren Zellwachstumskammern; d) Bereitstellen von einem oder mehreren Testreagenzien und Verteilen der Reagenzien in einer oder mehreren Kammern in der Vorrichtung; und e) Messen des zellulären Analyten durch optische Mittel.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 22, wobei mindestens eines der Testreagenzien mit einem detektierbaren Marker gekennzeichnet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fluoreszenzmarkern, Chemolumineszenzmarkern, Biolumineszenzmarkern, Enzymmarkern und radioaktiven Markern.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, wobei die Zellen von einer Art abgeleitet sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mensch, Nagetieren und Affen.
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