-
Gebiet der Erfindung
-
Diese
Erfindung bezieht sich auf die Hemmung von mikrobiellen und parasitischen
Agentien, und insbesondere bezieht sie sich auf die Verwendung von
Dendrimeren als Inhibitoren der Infektion von menschlichen und nichtmenschlich-tierischen
Patienten durch Pathogene, wie Bakterien, Pilze oder Parasiten.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Dendrimere
sind dreidimensionale polymere Materialien mit niedriger Polydispersität, die durch
eine große
Zahl von oberflächlichen
terminalen Gruppen gekennzeichnet sind. Außerdem ermöglicht die Art und Weise, in
der diese Materialien hergestellt werden, eine strenge Kontrolle
der Größe, Form
und Anzahl sowie Art der Oberflächengruppen.
Dendritische Materialien weisen mehrere Merkmale auf, die für die Verwendung als
therapeutische Materialien nützlich
sind: feste Form, die eine große
und definierte Oberfläche
bietet, mit der sie mit biologischen Oberflächen und Rezeptoren Wechselwirken
können;
und die große
Zahl von terminalen Gruppen ermöglicht
mehrfache Wechselwirkungen mit den biologischen Targets.
-
Die
Internationalen Patentanmeldungen Nr. PCT/AU95/00350 (
WO 95/34595 ) und PCT/AU97/00447 (
WO 98/03573 ) offenbaren
Dendrimere, wie Polyamidoamin- oder Polylysin-Dendrimere, mit einer
Menge von terminalen Gruppen, wobei an wenigstens eine der terminalen
Gruppen eine anionische oder kationische Struktureinheit gebunden
oder damit verknüpft
ist.
-
Die
vorliegende Erfindung gibt die Verwendung von dendritischen Polymeren
bei der Hemmung von mikrobiellen Agentien einschließlich bakterieller
und pilzlicher Pathogene sowie von parasitischen Agentien an.
-
Kurzbeschreibung der Erfindung
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Hemmung
eines mikrobiellen oder parasitischen Agens bei einem menschlichen
oder nichtmenschlich-tierischen Patienten angegeben, das die Verabreichung
einer wirksamen Menge eines Dendrimers mit einer Menge von terminalen
Gruppen, wobei an wenigstens eine der terminalen Gruppen eine anionische
oder kationische Struktureinheit gebunden oder damit verknüpft ist,
an den Patienten umfasst.
-
Besonders
bevorzugte Verbindungen zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung sind Dendrimere mit sulfonsäurehaltigen Struktureinheiten,
carbonsäurehaltigen
Struktureinheiten, phosphor- oder phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten,
boronsäurehaltigen
Struktureinheiten, neuramin- oder sialinsäurehaltigen Struktureinheiten
oder Struktureinheiten, die Neuramin- oder Sialinsäure enthalten,
primäres, sekundäres, tertiäres oder
quartäres
Amino enthaltenden Struktureinheiten, pyridiniumhaltigen Struktureinheiten,
guanidiniumhaltigen Struktureinheiten, amidiniumhaltigen Struktureinheiten,
phenolhaltigen Struktureinheiten, Heterocyclen, die saure oder basische
Wasserstoffatome aufweisen, zwitterionischen Struktureinheiten oder
Gemischen der obigen Struktureinheiten, welche mit terminalen Gruppen
des Dendrimers verknüpft sind.
-
Die
im Verfahren dieser Erfindung verwendeten Verbindungen werden hier
als polyionische Dendrimere bezeichnet, und dieser Ausdruck wird
in der gesamten Beschreibung so verwendet, dass er nicht nur die Dendrimere
an sich, sondern auch ihre pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch
annehmbaren Salze umfasst, zum Beispiel die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze,
wie die Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze, sowie pharmazeutisch
annehmbare Anionen, wie Fluorid, Chlorid, Bromid, Iodid, Citrat,
Acetat, p-Toluolsulfonat und dergleichen.
-
Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
-
Zu
den bevorzugten Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, gehören
polyionische Dendrimere der allgemeinen Formel I:
wobei:
I
ein Initiatorkern ist;
Z eine innere Verzweigungseinheit ist;
n
eine ganze Zahl ist, die die Zahl der Generationen des Dendrimers
darstellt; und
A eine anionische oder kationische Struktureinheit
ist, die über
eine fakultative Verknüpfungsgruppe
X mit der inneren Verzweigungseinheit Z verknüpft sein kann.
-
Dendrimere
sind makromolekulare, hochgradig verzweigte Verbindungen, die durch
wiederholte Reaktionssequenzen ausgehend von einem anfänglichen
Kernmolekül
gebildet werden, wobei aufeinanderfolgende Schichten oder Stufen
in aufeinanderfolgenden "Generationen" hinzugefügt werden,
so dass eine dreidimensionale, hochgeordnete polymere Verbindung
aufgebaut wird. Dendrimere sind durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet:
(i) einen Starterkern (I), der eine oder mehrere reaktive Stellen
aufweisen und punktartig oder von erheblicher Größe sein kann, so dass er die
endgültige
Topologie des Dendrimers beeinflusst; (ii) Schichten von verzweigten
Repetiereinheiten (Z), die an den Starterkern gebunden sind; (iii)
funktionelle terminale Gruppen (wie die Struktureinheiten A), die
an die Oberfläche
des Dendrimers gebunden sind, gegebenenfalls über Verknüpfungsgruppen (wie die Verknüpfungsgruppen
X). Die vorliegende Erfindung verwendet dendritische Strukturen
als Gerüste
für die
Bindung von ionischen Struktureinheiten; die Erfindung ist nicht
auf die sphärischen
Dendrimere beschränkt,
die hier im Einzelnen beschrieben sind, sondern kann auf jeder dendritischen
Struktur beruhen. Die Variabilität
von Dendrimeren in Bezug sowohl auf Form als auch Konstitution ist
dem Fachmann wohlbekannt.
-
Die
Herstellung von Dendrimeren ist wohlbekannt und ist zum Beispiel
in den
US-Patenten Nr. 4,289,872 und
4,410,688 (die Dendrimere
auf der Basis von Schichten von Lysineinheiten beschreiben) sowie in
den
US-Patenten Nr. 4,507,466 ,
4,558,120 ,
4,568,737 und
4,587,329 (die Dendrimere auf der
Basis von anderen Einheiten beschreiben, einschließlich Polyamidoamin-
oder PAMAM-Dendrimeren)
beschrieben. Die in diesen US-Patenten offenbarten Dendrimere sind
als geeignet für
Verwendungen wie als Oberflächenmodifizierungsmittel,
als Metallchelatoren, als Demulgatoren oder Öl/Wasser-Emulsionen, Nassfestigkeitsmittel
bei der Herstellung von Papier und als Mittel zum Modifizieren der
Viskosität
in wässrigen
Zubereitungen, wie Lacken, beschrieben. In den
US-Patenten
Nr. 4,289,872 und
4,410,688 wird
auch vorgeschlagen, dass die Dendrimere auf der Basis von Lysineinheiten
als Substrate für
die Herstellung von pharmazeutischen Darreichungsformen verwendet
werden können.
-
Die
internationalen Patentschriften Nr.
WO
88/01178 ,
WO 88/01179 und
WO 88/01180 offenbaren Konjugate,
bei denen ein Dendrimer mit einem anderen Material, wie einem pharmazeutischen
oder agrikulturellen Material auf einem Träger, konjugiert oder assoziiert
ist. Außerdem
offenbart das Internationale Patent Veröffentlichungs-Nr.
WO 95/24221 dendritische Polymerkonjugate,
die aus wenigstens einem Dendrimer in Verbindung mit einem Trägermaterial,
bei dem es sich um einen biologischen Reaktionsmodifikator handeln kann,
und gegebenenfalls einem Ziellenker bestehen. Diese Patentschriften
zusammen mit den oben genannten US-Patenten enthalten eine breite
Offenbarung von verschiedenen Dendrimeren und Verfahren zu deren Herstellung.
-
Der
hier verwendete Ausdruck "Dendrimer" ist in seinem weitesten
Sinn zu verstehen und umfasst alle Formen und Zusammensetzungen
dieser Dendrimere, wie in den Patentschriften Nr.
WO 88/01178 ,
WO 88/01179 und
WO 88/01180 offenbart ist. Der Ausdruck
umfasst auch miteinander verknüpfte
oder verbrückte Dendrimere,
wie in diesen Patentschriften offenbart ist.
-
Die
bevorzugten Dendrimere der vorliegenden Erfindung umfassen einen
mehrwertigen Kern, der kovalent an wenigstens zwei dendritische
Zweige gebunden ist und sich vorzugsweise über wenigstens zwei Generationen
erstreckt. Besonders bevorzugte Dendrimere sind Polyamidoamin(PAMAM)-Dendrimere,
PAMAM(EDA)-Dendrimere, Polypropylenimin(PPI)-Dendrimere und Polylysin-Dendrimere.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist an wenigstens eine und vorzugsweise an eine erhebliche
Zahl der Endgruppen auf der Oberfläche des Dendrimers eine anionische
oder kationische Struktureinheit kovalent gebunden. Die Zweige des
Dendrimers können
in Aminogruppen oder anderen funktionellen reaktiven Gruppen, wie
OH, SH oder dergleichen, enden, die anschließend mit den anionischen oder
kationischen Struktureinheiten umgesetzt werden können.
-
Wenn
die Endgruppen des Dendrimers Amingruppen sind, kann die anionische
oder kationische Struktureinheit über eine Vielzahl von funktionellen
Gruppen einschließlich
Amid- und Thioharnstoff-Bindungen an das Dendrimer gebunden sein.
Bevorzugte anionische oder kationische Struktureinheiten, die an
die Endgruppen des Dendrimers gebunden sein können, sind sulfonsäurehaltige
Struktureinheiten, carbonsäurehaltige
Struktureinheiten (einschließlich
neuramin- und sialinsäurehaltigen
Struktureinheiten und modifizierten neuramin- und sialinsäurehaltigen
Struktureinheiten), boronsäurehaltige
Struktureinheiten, phosphor- und phosphonsäurehaltige Struktureinheiten
(einschließlich
veresterten phosphor- und phosphonsäurehaltigen Struktureinheiten)
sowie primäres,
sekundäres,
tertiäres
oder quartäres
Amino enthaltende Struktureinheiten, pyridiniumhaltige Struktureinheiten,
guanidiniumhaltige Struktureinheiten, amidiniumhaltige Struktureinheiten, phenolhaltige
Struktureinheiten, Heterocyclen, die saure oder basische Wasserstoffatome
aufweisen, zwitterionische Struktureinheiten oder Gemische der obigen
Struktureinheiten.
-
Geeignete
anionische und kationische Struktureinheiten, die an die Amino-
oder anderen Endgruppen gebunden sein können, sind zum Beispiel die
folgenden Gruppen (wobei n = 0 oder eine positive ganze Zahl ist
und n besonders bevorzugt = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 20
ist):
-
Außer den
obigen können
auch verschiedene neuramin- oder sialinsäurehaltige Struktureinheiten oder
modifizierte neuramin- oder sialinsäurehaltige Struktureinheiten
an die Dendrimere gemäß dieser
Erfindung gebunden oder damit verknüpft sein. Zu diesen Struktureinheiten
gehören
die verschiedenen N- und O-substituierten Derivate von Neuraminsäure, insbesondere
N- und O-Acyl-Derivate,
wie N-Acetyl-, O-Acetyl- und N-Glycolyl-Derivate, sowie Struktureinheiten,
bei denen die Neuraminsäuregruppe
modifiziert ist. Zu den geeigneten modifizierten Neuraminsäuregruppen
gehören
Gruppen, die in der 4-Position mit einer Amino-, Amido-, Cyano-,
Azido- oder Guanidinogruppe substituiert sind, sowie ungesättigte Neuraminsäuregruppen. Diese
Struktureinheiten können über die
2-, 7-, 9- oder 5-NAc-Position mit den Dendrimeren verknüpft sein.
-
Vorzugsweise
ist n in den polyionischen Dendrimeren der allgemeinen Formel I
eine ganze Zahl von 1 bis 20 oder mehr, besonders bevorzugt 1 bis
10. Ebenfalls vorzugsweise enthalten die Dendrimere wenigstens drei
oder mehr terminale Gruppen.
-
Die
fakultative Verknüpfungsgruppe
X kann auch als Spacer zwischen dem Dendrimer und der Struktureinheit
A wirken und kann aus einer Alkylkette (gegebenenfalls substituiert
oder verzweigt), einer Alkoxy-, Polyalkoxy-, Alkylthio- oder Polyalkylthiokette
(gegebenenfalls substituiert) oder einer Alkenyl-, multiplen Alkenyl-,
Alkinyl- oder multiplen Alkinylkette (gegebenenfalls substituiert)
bestehen. Zu den geeigneten Spacerketten gehören Gruppen der Formel -(CH2)m-Z-(CH2)m-, wobei Z = -CH2-, -CH=CH-, -C=C-, -O- oder -S- ist und
m eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist.
-
Die
anionischen oder kationischen Dendrimere dieser Erfindung können nach
chemischen Standardverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann
wohlbekannt sind. Geeignete Verfahren sind beispielhaft in den folgenden
Beispielen beschrieben.
-
Wie
bereits beschrieben, hat sich gezeigt, dass die anionischen oder
kationischen Dendrimere der vorliegenden Erfindung mikrobielle und
parasitische Agentien hemmen. Der hier verwendete Ausdruck "mikrobielles Agens" soll sich sowohl
auf bakterielle als auch auf Hefe- oder Pilzagentien, insbesondere
bakterielle und Hefe- oder Pilzpathogene, beziehen. Der Ausdruck
beinhaltet also unter anderem Gram-positive und Gram-negative Bakterien,
wie Escherichia coli, Salmonella typhimurium und Streptococcus-,
Staphylococcus-, Shigella-, Pseudomonas-, Clostridium-, Neisseria-
und Pneumococcus-Spezies. Außerdem
beinhaltet dieser Ausdruck Hefepathogene, wie Candida, und Pilzpathogene,
wie Aspergillus fumigatus.
-
Der
Ausdruck "parasitisches
Agens" wird hier
so verwendet, dass er sich insbesondere auf parasitische Pathogene
bezieht, einschließlich
unter anderem parasitischen Agentien wie Plasmodium-, Trypanosoma-
und Leishmania-Spezies, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii
und Cryptosporidium parvum.
-
Der
Ausdruck "Hemmung" wird hier in seinem
weitesten Sinn verwendet, so dass er die entweder vollständige oder
partielle Hemmung oder Unterdrückung
einer Infektion eines menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen
Patienten durch ein mikrobielles oder parasitisches Pathogen oder
die vollständige
oder partielle Hemmung oder Unterdrückung der pathogenen Wirkungen
der Infektion eines solchen Patienten durch ein mikrobielles oder
parasitisches Pathogen umfasst. Der Ausdruck wird auch so verwendet,
dass er sowohl eine prophylaktische als auch eine therapeutische
Behandlung umfasst.
-
In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung also eine
pharmazeutische oder veterinärmedizinische
Zusammensetzungen zur prophylaktischen oder therapeutischen Hemmung
eines mikrobiellen oder parasitischen Agens bei einem menschlichen
oder nichtmenschlich-tierischen Patienten bereit, die ein Dendrimer,
wie es oben allgemein beschrieben ist, in Verbindung mit wenigstens
einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder
Verdünnungsmittel
umfassen.
-
Die
Zubereitung solcher Zusammensetzungen ist dem Fachmann auf diesem
Gebiet wohlbekannt. Zu den geeigneten pharmazeutisch annehmbaren
Trägern
und/oder Verdünnungsmitteln
gehören
beliebige und alle herkömmlichen
Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Füllstoffe,
festen Träger,
wässrigen
Lösungen,
Beschichtungen, antibakteriellen und fungiziden Mittel, isotonischen
und resorptionsverzögernden
Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel
für pharmazeutisch
aktive Substanzen ist in der Technik wohlbekannt und ist zum Beispiel
in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA,
beschrieben. Die Verwendung von jedem herkömmlichen Medium oder Mittel in
den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
wird in Betracht gezogen, solange es mit dem Wirkstoff verträglich ist.
Ergänzende
Wirkstoffe können
ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
-
Zur
leichteren Verabreichung und gleichmäßigen Dosierung ist es besonders
vorteilhaft, Zusammensetzungen in Form von Darreichungsformen zuzubereiten. "Darreichungsform" bezieht sich hier
auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Dosiseinheiten für die zu
behandelnden menschlichen Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit
eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, die so berechnet ist, dass
die gewünschte
therapeutische Wirkung erzielt wird, in Verbindung mit dem erforderlichen
pharmazeutischen Träger
und/oder Verdünnungsmittel
enthält.
Die genauen Eigenschaften der neuen Darreichungsformen der Erfindung
werden bestimmt und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen
Merkmalen des Wirkstoffs und der besonderen therapeutischen Wirkung,
die erzielt werden soll, und (b) den Einschränkungen, die der Technik des
Compoundierens eines solchen Wirkstoffs für die besondere Behandlung
inhärent
sind.
-
In
noch einem anderen Aspekt gibt diese Erfindung die Verwendung einer
wirksamen Menge eines Dendrimers, wie es oben allgemein beschrieben
ist, bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung oder
bei der Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder
therapeutischen Behandlung eines menschlichen oder nichtmenschlich-tierischen
Patienten durch Hemmung eines mikrobiellen oder parasitischen Agens
an.
-
Eine
Vielzahl von Verabreichungswegen steht zur Verfügung. Die besondere gewählte Methode
wird selbstverständlich
von dem besonderen behandelten Zustand und der für therapeutische Wirksamkeit
erforderlichen Dosierung abhängen.
Die Verfahren dieser Erfindung können
allgemein gesagt unter Verwendung einer beliebigen medizinisch annehmbaren
Verabreichungsmethode angewendet werden, was jede Methode bedeutet,
die therapeutische Konzentrationen der aktiven Komponente der Erfindung
erzeugt, ohne klinisch unannehmbare nachteilige Wirkungen zu verursachen.
Zu diesen Verabreichungsmethoden gehören die orale, rektale, topische,
nasale, inhalatorische, transdermale oder parenterale (z.B. subkutane,
intramuskuläre und
intravenöse)
Verabreichung. Zu den Zubereitungen für die orale Verabreichung gehören diskrete
Einheiten, wie Kapseln, Tabletten, Pastillen und dergleichen. Andere
Wege sind die intrathekale Verabreichung direkt in den Liquor, die
direkte Einführung,
wie etwa durch verschiedene Katheter- und Ballon-Angioplastie-Vorrichtungen,
die dem Fachmann wohlbekannt sind, und die intraparenchymale Injektion
in die Zielbereiche.
-
Die
Zusammensetzungen können
zweckmäßigerweise
in einer Einheits-Darreichungsform
präsentiert und
nach einem der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren
hergestellt werden. Zu diesen Verfahren gehören der Schritt des Verbindens
der aktiven Komponente mit einem Träger, der einen oder mehrere
Hilfsbestandteile bildet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen
hergestellt, indem man die aktive Komponente gleichmäßig und
innig mit einem flüssigen
Träger,
einem feinteiligen festen Träger
oder beiden in Verbindung bringt und dann gegebenenfalls das Produkt
formt.
-
Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung, die für die orale Verabreichung geeignet
sind, können
als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten oder
Pastillen, die jeweils eine vorbestimmte Menge der aktiven Komponente
enthalten, in Liposomen oder als Suspension in einer wässrigen
Flüssigkeit oder
einer nichtwässrigen
Flüssigkeit,
wie einem Sirup, einem Elixier oder einer Emulsion, präsentiert
werden.
-
Zusammensetzungen,
die für
die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen zweckmäßigerweise
ein steriles wässriges
Präparat
der aktiven Komponente, das vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch
ist. Dieses wässrige
Präparat
kann nach bekannten Verfahren unter Verwendung solcher geeigneten
Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel zubereitet werden.
Das sterile injizierbare Präparat kann
auch eine sterile injizierbare Lösung
oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel
oder Lösungsmittel,
zum Beispiel eine Lösung
in Polyethylenglycol, sein. Zu den annehmbaren Trägern und
Lösungsmitteln,
die eingesetzt werden können,
gehören
Wasser, Ringer-Lösung
und isotonische Natriumchloridlösung.
Außerdem
werden herkömmlicherweise
sterile fette Öle
als Lösungsmittel
oder Suspendiermedium eingesetzt. Zu diesem Zweck kann jedes milde
fette Öl
einschließlich
synthetischer Mono- oder Diglyceride eingesetzt werden. Außerdem finden
Fettsäuren,
wie Ölsäure, in
dem injizierbaren Präparat Verwendung.
-
Die
aktive Komponente kann auch für
die Abgabe in einem System zubereitet sein, das so gestaltet ist,
dass die aktive Komponente intranasal oder durch Inhalation verabreicht
wird, zum Beispiel als fein dispergiertes Aerosolspray, das die
aktive Komponente enthält.
-
Andere
Abgabesysteme können
Abgabesysteme mit nachhaltiger Freisetzung umfassen. Bevorzugte Abgabesysteme
mit nachhaltiger Freisetzung sind solche, die für die Freisetzung der aktiven
Komponente der Erfindung in Pellets oder Kapseln mit nachhaltiger
Freisetzung sorgen können.
Viele Arten von Abgabesystemen mit nachhaltiger Freisetzung sind
verfügbar.
Dazu gehören
unter anderem: (a) Erosionssysteme, bei denen die aktive Komponente
innerhalb einer Matrix enthalten ist, und (b) Diffusionssysteme,
bei denen die aktive Komponente mit einer kontrollierten Geschwindigkeit
durch ein Polymer dringt. Außerdem
kann ein Abgabegerät
auf Pumpenbasis verwendet werden, von denen einige für die Implantation
geeignet sind.
-
Die
aktive Komponente wird in prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen
Mengen verabreicht. Eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame
Menge bedeutet eine Menge, die notwendig ist, um wenigstens teilweise
die gewünschte
Wirkung zu erreichen oder das Einsetzen des besonderen behandelten
Zustands zu verzögern,
dessen Fortschreiten zu hemmen oder dessen Einsetzen oder Fortschreiten
ganz zu unterbinden. Diese Menge wird selbstverständlich von
dem besonderen behandelten Zustand, der Schwere des Zustands und
den individuellen Patientenparametern einschließlich des Alters, der körperlichen
Verfassung, der Größe, des
Gewichts und der sonstigen Behandlung abhängen. Diese Faktoren sind dem
Fachmann wohlbekannt und können
mit bloßen
Routineversuchen angegangen werden. Im Allgemeinen wird vorzugsweise eine
maximale Dosis verwendet, d.h. die höchste, nach zuverlässigem medizinischen
Urteil noch unbedenkliche Dosis. Der Fachmann wird sich jedoch darüber im Klaren
sein, dass aus medizinischen Gründen,
psychologischen Gründen
oder aus praktisch beliebigen anderen Gründen auch eine niedrigere Dosis
oder tolerierbare Dosis verabreicht werden kann.
-
Im
Allgemeinen betragen die täglichen
oralen Dosen der aktiven Komponente etwa 0,01 mg/kg pro Tag bis
1000 mg/kg pro Tag. Anfangs können
kleine Dosen (0,01–1
mg) verabreicht werden, gefolgt von steigenden Dosen bis zu etwa
1000 mg/kg pro Tag. Falls ein Patient auf solche Dosen ungenügend anspricht,
können noch
höhere
Dosen (oder effektiv höhere
Dosen über
einen anderen, besser lokalisierten Verabreichungsweg) eingesetzt
werden, soweit der Patient sie verträgt. Mehrere Dosen pro Tag werden
in Betracht gezogen, um geeignete systemische Konzentrationen von
Verbindungen zu erreichen.
-
Die
aktive Komponente gemäß der Erfindung
kann auch zur Verwendung in Form von veterinärmedizinischen Zusammensetzungen
vorgestellt werden, die zum Beispiel nach in der Technik herkömmlichen
Verfahren hergestellt werden können.
Beispiele für
solche veterinärmedizinischen
Zusammensetzungen sind solche, die geeignet sind für:
- (a) orale Verabreichung, externe Verabreichung,
zum Beispiel Arzneitränke
(z.B. wässrige
oder nichtwässrige
Lösungen
oder Suspensionen); Tabletten oder Boli; Pulver, Granulate oder
Pellets zum Beimischen ins Futter; Pasten zum Auftragen auf die
Zunge;
- (b) parenterale Verabreichung, zum Beispiel durch subkutane,
intramuskuläre
oder intravenöse
Injektion, z.B. als sterile Lösung
oder Suspension; oder (gegebenenfalls) durch intramammäre Injektion,
wobei eine Suspension oder Lösung über die
Zitze in den Euter eingeführt
wird;
- (c) topische Verabreichung, z.B. als Creme, Salbe oder Spray,
die bzw. das auf die Haut aufgetragen wird; oder
- (d) intravaginal, z.B. als Pessar, Creme oder Schaum.
-
In
der gesamten Beschreibung und den folgenden Ansprüchen impliziert
das Wort "umfassen" oder Variationen
davon, wie "umfasst" oder "umfassend", wenn der Kontext
nichts anderes verlangt, den Einschluss einer angegebenen ganzen
Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen, aber nicht den Ausschluss irgendeiner
anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen.
-
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
-
In
den Begleitzeichnungen zeigen:
-
1 die
Wirkung von BRI 2999 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen
roten Blutkörperchen
in vitro.
-
2 die
Wirkung von BRI 6741 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen
roten Blutkörperchen
in vitro.
-
3 die
Wirkung von BRI 2998 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen
roten Blutkörperchen
in vitro.
-
4 die
Wirkung von BRI 7011 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen
roten Blutkörperchen
in vitro.
-
5 die
Wirkung von BRI 6181 auf das Wachstum von P. falciparum in humanen
roten Blutkörperchen
in vitro.
-
Weitere
Merkmale der vorliegenden Erfindung gehen aus den folgenden Beispielen
hervor, die zur Veranschaulichung, aber nicht zur Einschränkung der
Erfindung aufgenommen sind. In den folgenden Beispielen bezieht
sich "PAMAM-Dendrimere" auf Polyamidoamin-Dendrimere
auf der Basis eines Ammoniackerns, wie es ausführlich in den
US-Patenten Nr. 4,507,466 ,
4,558,120 ,
4,568,737 und
4,587,329 wiedergegeben ist; "PAMAM(EDA)-Dendrimere" bezieht sich auf
Polyamidoamin-Dendrimere auf der Basis eines Ethylendiamin-Kerns; und "BHAlys
xlys
ylys
z-Dendrimere" bezieht sich auf
unsymmetrische Polylysin-Dendrimere auf der Basis eines Benzhydrylamin-Kerns
und Lysin-Verzweigungseinheiten,
wie es in den
US-Patenten Nr. 4,289,872 und
4,410,688 beschrieben ist.
Die Polyamidoamin-Dendrimere PAMAM 1.0, PAMAM 2.0, PAMAM 3.0, PAMAM
4.0, PAMAM 5.0 oder höhere
Generationen, PAMAM 4.0 (EDA) und die Polylysin-Dendrimere BHAlyslys
2, BHAlyslys
2lys
4, BHAlyslys
2lys
4lys
8 und BHAlyslys
2lys
4lys
8lys
16, BHAlyslys
2lys
4lys
8lys
16lys
32, BHAlyslys
2lys
4lys
8lys
16lys
32lys
64 oder höhere Generationen
werden so hergestellt, wie es in den
US-Patenten Nr.
4,289,872 ,
4,410,688 ,
4,507,466 ,
4,558,120 ,
4,568,737 und
4,578,239 und in den internationalen
Patentschriften
WO 88/01178 ,
WO 88/01179 ,
WO 88/01180 und
WO 95/24221 , auf die oben Bezug genommen
wurde, beschrieben ist.
-
Beispiel 1
-
Reaktion von dendritischen Polymeren mit
2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure unter Bildung von Dendrimeren
mit Sulfonsäure-Endgruppen
-
A. PAMAM 1.0
-
Festes
Natriumcarbonat (0,13 g; 1,0 mmol) wurde langsam unter Rühren zu
einer Lösung
von 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (0,41 g; 2,0 mmol) in Wasser
(3 ml) gegeben. Nachdem die Gasentwicklung aufgehört hatte,
betrug der pH-Wert der Lösung
8,0. Dann wurde eine Lösung
von PAMAM 1.0 (0,12 g; 0,33 mmol) in Wasser (1 ml) zu der Lösung gegeben,
und dann wurden vier Tropfen einer 40%igen wässrigen Lösung von Benzyltrimethylammoniumhydroxid
hinzugefügt.
Dann wurde die Lösung
drei Tage lang unter Stickstoff auf 60 °C erhitzt und dann konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt und dann
gefriergetrocknet, was das sulfonierte PAMAM-1.0-Dendrimer als schmutzigweißen Feststoff
(0.51 g) ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren
zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-1.0-Dendrimer
(ca. 70:30). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1,
37,1, 37,7, 41,3, 48,6, 51,5, 53,1, 53,4, 55,6, 56,2, 61,2, 61,5,
178,3, 179,0, 179,8.
-
B. PAMAM 2.0
-
PAMAM
2.0 wurde gemäß der obigen
Beschreibung mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt.
Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser)
gereinigt und dann gefriergetrocknet, was einen schmutzigweißen Feststoff
ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren
zeigten ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-2.0-Dendrimer
(ca. 65:35). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1,
37,1, 37,7, 41,3, 48,7, 51,5, 53,4, 55,6, 56,2, 61,2, 61,5, 178,4,
179,0, 179,1, 179,6. Als die obige Reaktion unter Weglassen des
Benzyltrimethylammoniumhydroxids wiederholt wurde, wurde ein ähnliches
Ergebnis erhalten.
-
C. PAMAM 3.0; BRI2783
-
PAMAM
3.0 wurde wie oben mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt,
außer
dass ein leichter Überschuss
an Natriumcarbonat verwendet wurde und das Benzyltrimethylammoniumhydroxid
weggelassen wurde. 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten
ein Gemisch von dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-3.0-Dendrimer
(ca. 50:50). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1,
36,9, 37,4, 41,1, 48,6, 51,5, 53,4, 55,7, 56,2, 61,1, 61,5, 178,2,
178,9, 179,0, 179,8.
-
D. PAMAM 4.0; BRI2784
-
PAMAM
4.0 wurde so mit 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure umgesetzt,
wie es für
PAMAM 3.0 beschrieben wurde. 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten ein Gemisch von
dialkyliertem und monoalkyliertem PAMAM-4.0-Dendrimer (ca. 35:65). 13C-NMR (D2O): δ 31,0, 31,1,
36,9, 37,3, 41,1, 48,5, 51,5, 53,5, 55,7, 56,2, 61,1, 61,5, 178,1,
178,9, 179,0, 179,8.
-
Beispiel 2
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natriumsulfoacetamid-Endgruppen
-
A. PAMAM 1.0
-
Eine
Lösung
von 4-Nitrophenylbromacetat (0,40 g; 1,5 mmol) in trockenem DMF
(1 ml) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 1.0 (0,18 g; 0,5 mmol) in DMF (3 ml) gegeben. Die resultierende
gelbe Lösung
wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test
negativ verlief. Die Lösung wurde
konzentriert (30 °C/0,1
mm Hg), was ein gelbes Öl
ergab. Dieses Öl
wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt, und die wässrige Schicht
wurde abgetrennt und mit Chloroform (2x) und schließlich mit
Ethylacetat gewaschen. Die wässrige
Lösung
wurde konzentriert (35 °C/25
mm Hg), was das bromacetylierte PAMAM-1.0-Dendrimer als gelbes Öl ergab
(0,36 g; 100%). 13C-NMR (D2O): δ 32,8, 33,3,
43,0, 43,5, 54,4, 174,5, 176,4.
-
Eine
Lösung
von Natriumsulfit (0,2 g; 1,6 mmol) in Wasser (1 ml) wurde zu einer
Lösung
des oben beschriebenen bromacetylierten PAMAM-1.0-Dendrimers (0,36
g; 0,5 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben, und die Lösung wurde elf Tage lang bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Die gelbe Lösung wurde konzentriert, was einen
gelblichen Feststoff ergab (0,60 g). 13C-NMR
(D2O): δ 34,4,
43,1, 43,4, 54,0, 61,7, 171,3, 177,2.
-
Die
obige Reaktionssequenz konnte durchgeführt werden, ohne das bromacetylierte
Dendrimer zu isolieren, indem man einfach die Natriumsulfitlösung zu
dem aus der ersten Reaktion erhaltenen rohen wässrigen Extrakt gibt.
-
B. PAMAM 2.0
-
Verfahren 1:
-
Eine
Lösung
von 4-Nitrophenylbromacetat (0,18 g; 0,7 mmol) in trockenem DMF
(1 ml) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 2.0 (0,10 g; 0,1 mmol) in DMF (3 ml) gegeben. Die resultierende
gelbe Lösung
wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test
negativ verlief. Die Lösung wurde
dann unter Schwenken in Wasser (150 ml) gegeben, und das Gemisch
wurde mit Chloroform (3x) und Ethylacetat extrahiert. Eine Lösung von
Natriumsulfit (0,1 g; 0,8 mmol) in Wasser (1 ml) wurde zu der rohen bromacetylierten
Dendrimerlösung
gegeben, und das Gemisch wurde drei Tage lang bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Dann wurde die gelbliche Lösung konzentriert, was einen
gelben festen Rückstand
ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt
wurde, was das PAMAM-2.0-Dendrimer mit Natriumsulfoacetamid-Endgruppen
ergab (103 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,0, 35,7,
36,0, 37,7, 40,3, 43,0, 43,2, 53,4, 53,7, 56,0, 61,6, 171,2, 174,6,
178,5.
-
Verfahren 2:
-
Festes
Succinimidylacetylthioacetat (67 mg; 0,33 mmol) wurde zu einer Lösung von
PAMAM 2.0 (52 mg; 0,05 mmol) in trockenem DMF (2 ml) gegeben, und
die resultierende Lösung
wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Gemisch
konzentriert (30 °C/10-3 mm Hg), was einen öligen Rückstand ergab. Der Rückstand
wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt, und die wässrige Schicht
wurde abgetrennt und konzentriert, was ein viskoses Öl ergab
(117 mg). 1H- und 13C-NMR-Spektren
zeigten, dass das Öl
ein Gemisch des acylierten Dendrimers mit N-Hydroxysuccinimid war.
Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) ergab eine reine Probe des
PAMAM-2.0-Dendrimers mit Acetylthioacetamid-Endgruppen (29 mg). 13C-NMR (D2O): δ 34,0, 34,2,
37,3, 43,0, 43,1, 43,3, 53,5, 54,0, 56,3, 175,4, 177,2, 177,5.
-
Dann
wurde eine Lösung
des obigen funktionalisierten Dendrimers in 40%iger wässriger
Ameisensäure
(7 ml) zu einer eiskalten, frisch hergestellten Lösung von
Perameisensäure
(1,6 mmol) in Ameisensäure
(2 ml) gegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 0 °C und dann
20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde eine kleine
Menge Aktivkohle hinzugefügt,
um überschüssige Persäure zu zersetzen,
das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, dann filtriert und konzentriert,
was ein viskoses Öl
ergab.
-
Das
Rohprodukt wurde in Wasser gelöst,
der pH-Wert wurde mit wässrigen
Natriumhydrogencarbonat auf 9,0 eingestellt, und das Material wurde
entsalzt, indem man es durch eine Säule mit Sephadex G10 leitete. Nach
der Lyophilisierung wurde ein weißer Feststoff (20 mg) erhalten,
der spektroskopisch im Wesentlichen dasselbe war wie das durch Verfahren
1 erhaltene Material. 13C-NMR (D2O): δ 33,0, 38,7,
42,9, 43,0, 43,1, 53,9, 54,3, 56,5, 61,6, 171,2, 176,4, 177,0.
-
Beispiel 3
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
-
A. PAMAM 1.0
-
Festes
Maleinsäureanhydrid
(0,11 g; 1,1 mmol) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 1.0 (0,12 g; 0,33 mmol) in trockenem DMF (3 ml) gegeben.
Das Gemisch wurde etwas warm und bräunlich, als sich das Anhydrid
auflöste,
und die resultierende Lösung
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde die Lösung
konzentriert (30 °C/10-4 mm Hg), was ein viskoses Öl ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren (D2O) zeigten eine vollständige Umsetzung des PAMAM 1.0
zum Trisamid zusammen mit etwas Maleinsäure. 13C-NMR
(D2O): δ 33,1,
42,8, 43,1, 54,3, 135,0, 137,1, 169,1, 171,9, 173,3.
-
Dann
wurde das rohe Trisamid in Wasser (4 ml) gelöst, und festes Natriumsulfit
(0,20 g; 1,6 mmol) wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde
vier Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann konzentriert. 1H- und 13C-NMR-Spektren
(D2O) zeigten ein 1:1-Gemisch der regioisomeren
PAMAM-1.0-Dendrimere
mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
zusammen mit etwas Sulfobernsteinsäure. Das Rohprodukt wurde durch
Gelfiltration (Sephadex G10; Wasser) gereinigt, was eine Probe der
PAMAM-1.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen ergab (107 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,3, 39,6,
40,0, 42,9, 43,1, 54,0, 67,9, 69,4, 173,8, 176,3, 177,6, 181,8.
-
B. PAMAM 2.0
-
Ein
Gemisch der regioisomeren PAMAM-2.0-Dendrimere mit Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
wurde gemäß der obigen
Beschreibung hergestellt. 13C-NMR des PAMAM-2.0-Maleamsäure-Derivats (D2O): δ 32,8,
33,0, 38,7, 42,9, 53,8, 54,3, 56,5, 135,2, 136,8, 169,2, 171,9,
173,5, 174,6. 13C-NMR der PAMAM-2.0-Natriumsulfosuccinamsäure-Derivate
(D2O): δ 37,0,
40,1, 41,1, 43,0, 43,2, 43,9, 53,0, 53,3, 55,5, 68,0, 69,4, 173,8,
177,6, 179,1, 179,5, 179,8, 182,3.
-
C. PAMAM 4.0; BRI6038
-
Festes
Maleinsäureanhydrid
(60 mg; 0,6 mmol) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in trockenem DMF (2 ml) gegeben.
Das Gemisch wurde anfangs trübe,
ergab jedoch bald eine klare Lösung,
die über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt
wurde. Dann wurde die Lösung
konzentriert (35 °C/10-4 mm Hg), was ein viskoses Öl ergab. 1H- und 13C-NMR-Spektren (D2O) zeigten eine vollständige Umsetzung des PAMAM 4.0
zum Polyamid zusammen mit etwas Maleinsäure. Dann wurde das rohe Polyamid in
Wasser (2 ml) gelöst,
und eine Lösung
von Natriumsulfit (126 mg; 1,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde hinzugefügt. Die
resultierende Lösung
wurde zwei Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann
konzentriert. 1H- und 13CNMR-Spektren
(D2O) zeigten ein Gemisch der regioisomeren
PAMAM-4.0-Dendrimere mit
Natriumsulfosuccinamsäure-Endgruppen
zusammen mit etwas Sulfobernsteinsäure. Das Rohprodukt wurde durch
Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was eine Probe
von PAMAM 4.0 mit 24 regioisomeren Sulfosuccinamsäure-Endgruppen
ergab (90 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,4-2,6;
2,7-3,1; 3,2-3,4;
3,9-4,0. 13C-NMR (D2O): δ 36,2; 39,8;
40,5; 43,0; 43,2; 53,5; 55,8; 68,1; 69,5; 173,8; 177,4; 177,6; 178,7;
182,3.
-
Beispiel 4
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
-
a. Herstellung von Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure
-
Festes
Bernsteinsäureanhydrid
(0,50 g; 5,0 mmol) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von Tetrabutylammonium-2-aminoethylsulfonsäure (1,83 g; 5,0 mmol) in trockenem
Dichlormethan (30 ml) gegeben. Das Bernsteinsäureanhydrid löste sich
langsam auf, und die resultierende trübe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Gemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert,
was ein viskoses Öl ergab
(2,41 g). Das 13C-NMR-Spektrum zeigte eine
vollständige
Umsetzung des gewünschten
Monoamids zusammen mit einer kleinen Menge Bernsteinsäure. Wiederholte
Fällung
des Produkts durch tropfenweise erfolgende Zugabe einer Dichlormethan-Lösung zu
einem großen Überschuss
von Diethylether ergab Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure als
weißen
Feststoff (1,762 g; 76%), Schmp. 125–127 °C. 1H-NMR (CDCl3): δ 0,86
(t, 12H, 4 × CH3), 1,28 (m, 8H, 4 × CH2),
1,50 (m, 8H, 4 × CH2), 2,33 (m, 2H, CH2COOH),
2,44 (m, 2H, CH2CONH), 2,76 (m, 2H, CH2NHCO), 3,12 (m, 8H, 4 × CH2N),
3,50 (m, 2H, CH2SO3 -), 7,53 (br t, 1H, NH). 13C-NMR
(CDCl3): δ 13,5,
19,5, 23,8, 30,1, 30,9, 35,6, 50,0, 58,5, 172,0, 174,1.
-
b. Herstellung von Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamat
-
Eine
Lösung
von Dicyclohexylcarbodiimid (45 mg; 0,22 mmol) in trockenem Dichlormethan
(1 ml) wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von Tetrabutylammonium-N-(2-sulfoethyl)succinamsäure (94 mg; 0,20 mmol) in Dichlormethan
(2 ml) gegeben, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Die resultierende Suspension wurde filtriert, und das Filtrat wurde
konzentriert, was den rohen aktiven Ester ergab, der ohne weitere
Reinigung verwendet wurde.
-
A. Herstellung von PAMAM-Dendrimeren mit
Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI2786
-
Eine
Lösung
des rohen Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamats
(0,30 mmol) in trockenem DMF (1 ml) wurde unter Rühren zu
einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51,5 mg; 0,01 mmol) in 50%igem wässrigem DMF (3 ml) gegeben,
und die resultierende gelbe Lösung
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde das Gemisch konzentriert (35 °C/10-5 mm
Hg), und der gelbe Rückstand
wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht
wurde abgetrennt, mit Chloroform (2x) und Ethylacetat gewaschen
und dann konzentriert, was ein gelbes 61 (134 mg) ergab. Das Rohprodukt
wurde in das Natriumsalz umgewandelt, indem man es durch eine Säule mit
Amberlite IR-120(Na) leitete, was 85 mg Material ergab. Dieses Material
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter gereinigt,
was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
ergab (45 mg). 13C-NMR (D2O): δ 33,2, 33,6,
35,5, 39,0, 39,5, 42,8, 43,2, 53,8, 54,1, 54,4, 56,6, 176,5, 176,9,
177,2, 178,9, 179,4.
-
Die
entsprechenden PAMAM-1.0- und PAMAM-3.0(BRI2785)-Dendrimere mit
Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen wurden in ähnlicher
Weise hergestellt.
13C-NMR PAMAM-3.0-Derivat
(D2O): δ 33,4,
35,5, 39,0, 39,5, 42,9, 43,2, 53,8, 54,1, 54,3, 56,5, 176,4, 176,9, 177,4,
178,9, 179,4. 13C-NMR PAMAM-1.0-Derivat (D2O): δ 34,9,
35,5, 39,5, 42,9, 43,1, 53,7, 54,1, 179,0, 179,1, 179,3.
-
B. Herstellung von Polylysin-Dendrimeren
mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
-
BHAlyslys2lys4lys8lys16;
BRI2789
-
Trifluoressigsäure (1 ml)
wurde zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (36,5
mg; 5,0 μmol) in
trockenem Dichlormethan (1 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde
zwei Stunden lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt und
dann konzentriert. Der Rückstand
wurde in trockenem DMSO (2 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit
Triethylamin auf 8,5 eingestellt. Dann wurde eine Lösung des
rohen Tetrabutylammonium-4-nitrophenyl-N-(2-sulfoethyl)succinamats
(ca. 0,2 mmol) in DMSO (1 ml) hinzugetropft, und das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde die gelbe Lösung
konzentriert (50 °C/10-5 mm Hg), und der gelbe Rückstand
wurde mit Wasser und Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Schicht
wurde abgetrennt, mit Chloroform (3x) und Ethylacetat gewaschen
und dann konzentriert, was ein Öl (99
mg) ergab. Das Rohprodukt wurde in das Natriumsalz umgewandelt,
indem man es durch eine Säule
mit Amberlite IR-120(Na) leitete, was 81 mg Material ergab. Dieses
Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) weiter
gereinigt, was das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer
mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen ergab (39 mg). 13C-NMR (D2O): δ 27,0, 32,3,
35,2, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 131,5, 132,0, 133,3,
145,1, 177,8, 178,0, 178,4, 178,8, 178,9, 179,2, 179,7, 179,8.
-
Die
entsprechenden BHAlyslys2-, BHAlyslys2lys4-(BRI2787) und
BHAlyslys2lys4lys8(BRI2788)-Dendrimere mit Natrium-N-(2-sulfoethyl)succinamid-Endgruppen
wurden in ähnlicher
Weise hergestellt.
13C-NMR BHAlyslys2lys4lys8-Derivat
(D2O): δ 26,9,
32,3, 35,1, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 131,6, 131,9,
132,2, 132,3, 133,2, 133,3, 145,0, 145,2, 177,2, 177,8, 177,9, 178,0,
178,2, 178,3, 178,6, 178,7, 178,8, 178,9, 179,2, 179,3, 179,7, 179,8.
13C-NMR BHAlyslys2lys4-Derivat (D2O): δ 26,9, 32,3,
35,1, 35,4, 35,7, 35,8, 39,5, 43,5, 54,1, 58,5, 61,8, 131,7, 132,0,
132,2, 132,3, 133,2, 133,3, 145,0, 145,1, 177,3, 178,0, 178,3, 178,4,
178,7, 178,9, 179,0, 179,3, 179,7, 179,8.
13C-NMR
BHAlyslys2-Derivat (D2O): δ 26,9, 27,1,
32,2, 32,3, 34,7, 34,8, 35,1, 35,3, 35,6, 35,7, 39,5, 43,4, 54,1, 58,6,
61,8, 131,7, 131,9, 132,2, 132,3, 133,3, 144,9, 145,0, 177,7, 178,4,
178,8, 179,0, 179,3, 180,0.
-
Beispiel 5
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
-
A. PAMAM 4.0; BRI2791
-
Festes
Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (500 mg; 1,96 mmol)
wurde zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (300 mg; 0,0582 mmol) in Wasser (10 ml) gegeben, und die
resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der gelbe feste Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden
vereinigt und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit
Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff
ergab (370 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,28; 2,52;
2,69; 3,15; 3,27; 3,60; 7,32 (d, J=9 Hz); 7,72 (d, J=9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,9; 41,1;
43,1; 48,3; 53,6; 55,8; 129,0; 131,1; 144,4; 178,5; 179,1; 184,4.
-
Die
entsprechenden PAMAM-1.0- und PAMAM-2.0-(BRI2790), PAMAM-3.0- und
PAMAM-5.0(BRI2991)-Dendrimere mit 3, 6, 12 bzw. 48 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
wurden in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
B. PAMAM 4.0 (EDA); BRI6045
-
Festes
Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat (130 mg; 0,5 mmol)
wurde zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben, und
die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der feste Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden
vereinigt und gefriergetrocknet, was PAMAM 4.0 mit 32 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als
flockigen weißen
Feststoff ergab (136 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30;
2,50; 2,70; 3,18; 3,62; 7,35 (d, J=9 Hz); 7,72 (d, J=9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,8; 41,0;
43,1; 48,4; 53,6; 55,7; 128,9; 131,0; 144,3; 178,5; 179,0; 184,5.
-
C. BHAlyslys2lys4lys8lys16;
BRI2792
-
Trifluoressigsäure (4 ml)
wurde unter Stickstoff zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (0,73 g; 0,1 mmol) in trockenem Dichlormethan
(4 ml) gegeben. Eine heftige Gasentwicklung wurde während einer kurzen
Zeit beobachtet, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtempe ratur gerührt und
dann konzentriert. Der zurückbleibende
Sirup wurde in Wasser (5 ml) gelöst,
die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert,
was BHAlyslys2lys4lys8lys16 als viskoses Öl ergab
(0,49 g). Das Öl
wurde in Wasser (5 ml) wieder aufgelöst, und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer
(pH 9,5; 3 ml) wurde hinzugefügt.
Dann wurde festes Natrium-4-sulfophenylisothiocyanat-Monohydrat
(1,30 g; 5,1 mmol) hinzugefügt,
und die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der bräunliche
feste Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt, durch eine Säule mit Amberlite IR 120(Na)
geleitet und gefriergetrocknet, was das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer
mit Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen
weißen
Feststoff ergab (374 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,40;
1,72; 3,08; 3,42; 4,24; 4,60; 7,30; 7,40 (d, J=9 Hz); 7,78 (d, J=9
Hz). 13C-NMR (D2O): δ 27,3; 32,5;
35,9; 43,7; 48,9; 58,6; 63,3; 128,8; 131,0; 143,7; 144,7; 145,1;
177,7; 178,1; 183,8; 185,2.
-
Die
entsprechenden BHAlyslys2lys4lys8-, BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32(BRI2992)- und BHAlyslys2lys4lys3lys16lys32lys64(BRI2993)-Dendrimere
mit 16, 64 bzw. 128 Natrium-4-sulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
wurden in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
Beispiel 6
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
-
A. PAMAM 4.0; BRI2923
-
Festes
Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (160 mg; 0,41 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben, und die
resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der braune feste Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden
vereinigt und konzentriert, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
als bräunlichen
Feststoff ergab (73 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30;
2,60; 2,74; 3,20; 3,57; 7,75; 7,86; 8,28. 13C-NMR
(D2O): δ 35,0;
39,9; 43,1; 48,1; 53,8; 56,1; 128,4; 128,6; 129,3; 131,0; 131,3;
136,0; 136,8; 138,2; 145,5; 146,0; 177,2; 177,8; 185,5.
-
Das
entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen wurde
in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
B. PAMAM 4.0 (EDA); BRI6046
-
Festes
Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (220 mg; 0,57 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (EDA) (74 mg; 0,01 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben,
und die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der bräunliche
feste Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was PAMAM 4.0
mit 32 Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als lohfarbenen
Feststoff ergab (148 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,30;
2,80; 3,20; 3,54; 7,74; 7,85; 8,25. 13C-NMR (D2O): δ 36,0;
40,8; 43,1; 48,3; 53,6; 55,9; 128,5; 129,4; 131,0; 131,3; 136,0;
136,8; 138,3; 145,5; 146,0; 178,2; 185,6.
-
C. BHAlyslys2lys4lys8lys16;
BRI2999
-
Trifluoressigsäure (2 ml)
wurde unter Stickstoff zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (73 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan
(2 ml) gegeben. Eine heftige Gasentwicklung wurde während einer
kurzen Zeit beobachtet, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur gerührt
und dann konzentriert. Der zurückbleibende
Sirup wurde in Wasser (5 ml) gelöst,
die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert,
was BHAlyslys2lys4lys8lys16 als viskoses Öl ergab.
Das Öl
wurde in Wasser (5 ml) wieder aufgelöst, und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5;
3 ml) wurde hinzugefügt.
Dann wurde festes Natrium-3,6-disulfonaphthylisothiocyanat (234
mg; 0,60 mmol) hinzugefügt,
und die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der bräunliche
feste Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt, durch eine Säule mit Amberlite IR 120(Na)
geleitet und gefriergetrocknet, was BHAlyslys2lys4lys8lys16 mit
32 Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen
schmutzigweißen
Feststoff ergab (119 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,0-2,0;
3,18; 3,43; 4,31; 7,22; 7,80; 7,89; 8,25. 13C-NMR
(D2O): δ 27,2;
32,4; 35,3; 43,7; 49,0; 58,5; 63,6; 128,4; 129,1; 131,4; 136,1;
136,6; 138,6; 139,0; 145,1; 145,6; 178,4; 184,8; 186,7.
-
Beispiel 7
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI2997
-
Festes
Natrium-4-sulfonaphthylisothiocyanat (180 mg; 0,5 mmol) wurde zu
einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben, und das
Gemisch wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt
und dann abgekühlt.
Das Wasser wurde unter reduziertem Druck von der resultierenden
Suspension abdestilliert, und der schmutzigweiße feste Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden
vereinigt und gefriergetrocknet, was das PAMAM-4.0-Dendrimer mit
Natrium-4-sulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen als flockigen weißen Feststoff
ergab (60 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,20; 2,60;
3,14; 3,48; 7,23; 7,47; 7,56; 7,77; 7,93 (d, J=6 Hz); 8,56 (d, J=6
Hz). 13C-NMR (D2O): δ 35,8; 40,5;
43,1; 48,4; 53,6; 55,9; 127,6; 128,6; 130,3; 131,9; 132,5; 133,5;
134,7; 140,5; 142,7; 177,8; 178,0; 185,4.
-
Beispiel 8
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI6039
-
Festes
Natrium-3,5-disulfophenylisothiocyanat (110 mg; 0,32 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (63 mg; 0,012 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben, und
die resultierende Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Die
Lösung
wurde konzentriert, und der bräunliche feste
Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was PAMAM 4.0
mit 24 Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen als schmutzigweißen Feststoff
ergab (110 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,53; 3,08;
3,36; 3,66; 7,90; 7,95. 13C-NMR (D2O): δ 34,8; 41,0;
43,1; 48,0; 53,7; 56,2; 124,1; 128,6; 143,5; 148,8; 177,6; 185,0.
-
Beispiel 9
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI2998
-
Festes
Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylisothiocyanat (250 mg; 0,5 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) und N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer
(pH 9,5; 1 ml) in Wasser (2 ml) gegeben, und das Gemisch wurde zwei
Stunden lang unter Stickstoff bei 53 °C erhitzt und dann abgekühlt. Das
Gemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, was einen orangefarbenen
Feststoff ergab. Der feste Rückstand wurde
in Wasser (2 ml) gelöst
und durch eine kurze Säule
mit Amberlite IR-120(Na) geleitet. Dann wurde das Filtrat konzentriert,
und der Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex 11-120; Wasser) gereinigt. Die
reinen Fraktionen wurden vereinigt und gefrierge trocknet, was das
PAMAM-4.0-Dendrimer mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
als schmutzigweißen
Feststoff ergab (102 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,65; 3,02;
3,30; 3,66; 8,05; 8,42; 8,59; 8,67. 13C-NMR
(D2O): δ 33,2;
38,7; 43,2; 43,7; 47,8; 54,0; 54,3; 56,7; 131,0; 131,3; 131,9; 135,9;
138,0; 139,6; 143,8; 144,1; 145,6; 176,2; 176,5; 186,0.
-
Das
entsprechende Dendrimer mit Natrium-3,6,8-trisulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen, BHAlyslys2lys4lys8lys16 BRI 7011, wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
-
Beispiel 10
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-(sulfomethyl)benzamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI6040
-
Festes
4-Nitrophenyl-4-(chlormethyl)benzoat (200 mg; 0,68 mmol) wurde unter
Rühren
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (70 mg; 0,014 mmol) in trockenem DMSO (4 ml) gegeben,
und die resultierende gelbe Lösung
wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung konzentriert
(10-4 mm Hg; 40 °C), und der Rückstand
wurde mit einem Gemisch von Wasser und Dichlormethan (1:1) extrahiert.
Der feste Rückstand
wurde in DMSO (5 ml) gelöst,
und eine Lösung
von Natriumsulfit (130 mg; 1 mmol) in Wasser (3 ml) wurde hinzugefügt. Das
resultierende leicht trübe
Gemisch wurde vier Tage lang stehen gelassen, und danach führte die
Zugabe von weiterem Wasser (2 ml) zur Bildung einer klaren homogenen
gelben Lösung. Dann
wurde die Lösung
konzentriert, zuerst bei 25 mm Hg und 40 °C und dann bei 10-4 mm
Hg und 50 °C,
was das Rohprodukt ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration
(Sephadex G25; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-4-(sulfomethyl)benzamid-Endgruppen
ergab (24 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,25; 2,66; 3,08;
3,20; 3,33; 3,38; 4,01; 7,40 (br d); 7,62 (br d). 13C-NMR
(D2O): δ 36,7;
40,9; 43,0; 43,6; 53,5; 55,5; 61,0; 131,6; 135,0; 137,2; 140,4;
174,5; 178,6; 179,2.
-
Beispiel 11
-
Herstellung von Dendrimeren mit 4-Sulfobenzamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA); BRI6116
-
Festes
Kalium-N-hydroxysuccinimidyl-4-sulfobenzoat (100 mg; 0,3 mmol) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (EDA) (35 mg; 0,005 mmol) in 0,1 M Boratpuffer (5
ml) mit pH 8,5 gegeben, und die Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur gerührt.
Die resultierende milchige Lösung
hatte in diesem Stadium einen pH-Wert von 4,5. Dann wurde 1 M Natriumcarbonatlösung (1
ml) hinzugefügt,
was eine klare Lösung ergab,
die konzentriert wurde, was das Rohprodukt als weißen Feststoff
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser)
gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium-4-sulfobenzamid-Endgruppen ergab (47 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,25; 2,42;
2,63; 3,05; 3,18; 3,31; 3,38; 7,72 (d, J=8 Hz); 7,78 (d, J=8 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 36,0; 40,4;
43,0; 43,7; 53,7; 55,8; 130,2; 132,2; 140,4; 150,1; 173,6; 178,0;
178,5.
-
Beispiel 12
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-N-(4-sulfophenyl)propanamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA); BRI6117
-
Festes
Natrium-N-(4-sulfophenyl)acrylamid (250 mg; 1 mmol) und festes Natriumcarbonat
(106 mg; 1 mmol) wurden nacheinander unter Rühren zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (EDA) (78 mg; 0,011 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben. Die
resultierende Lösung
wurde vier Tage lang unter Stickstoff gerührt und dann gefriergetrocknet,
was einen flockigen weißen
Feststoff ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex
LH20; Wasser) gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 64 Natrium-N-(4-sulfophenyl)propanamid-Endgruppen
ergab (206 mg). Das 13C-NMR-Spektrum zeigte
eine schwache Spur von vermutlich monoalkylierten terminalen Aminogruppen. 1H-NMR (D2O): δ 2,10; 2,48;
2,58; 2,79; 3,20; 7,42 (d, J=7 Hz); 7,65 (d, J=7 Hz). 13C-NMR
(D2O): δ 36,5;
37,9; 41,1; 53,4; 55,6; 124,8; 130,9; 143,0; 144,2; 177,4; 178,5.
-
Beispiel 13
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-sulfophenylharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA); BRI6115
-
Eine
Lösung
von Natriumsulfanilsäure
(195 mg; 1 mmol) in trockenem DMSO (3 ml) wurde tropfenweise zu
einer Lösung
von N,N'-Disuccinimidylcarbonat
(530 mg; 2 mmol) in trockenem DMSO (4 ml) gegeben, und die resultierende
bräunliche
Lösung
wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (75
mg; 0,011 mmol) in trockenem DMSO (1 ml) wurde hinzugefügt, und
die Lösung wurde
weitere 18 Stunden lang gerührt.
Dann wurde die Lösung
unter Hochvakuum (10-5 mm Hg; 35 °C) konzentriert,
was einen gelblichen halbfesten Stoff ergab. Das Rohprodukt wurde
in DMSO (4 ml) gelöst,
und die Lösung
wurde unter kräftigem
Rühren
zu 200 ml Ethylacetat gegeben. Der ausfallende weiße Feststoff
wurde durch Filtration aufgefangen und mit Ethylacetat (2x) und
Ether (2x) gewaschen und dann getrocknet, was ein weißes Pulver
ergab (275 mg). Dieses Material wurde durch Gelfiltration (Sephadex
LH20; Wasser) weiter gereinigt, was PAMAM 4.0 (EDA) mit 32 Natrium-4-sulfophenylharnstoff-Endgruppen
ergab (106 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,31; 2,55;
2,75; 3,19; 7,32 (d, J=9 Hz); 7,63 (d, J=9 Hz). 13C-NMR
(D2O): δ 36,3;
40,7; 43,3; 43,8; 53,7; 55,7; 123,3; 130,9; 140,9; 146,0; 161,4;
178,2; 178,6.
-
Beispiel 14
-
Herstellung von Dendrimeren mit N,N,N-Trimethylglycinamidchlorid-Endgruppen
-
BHAlyslys2lys4lys8lys16;
BRI2922
-
Trifluoressigsäure (4 ml)
wurde zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8DBL16 (220
mg; 30 μmol) in
trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde
zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und
dann konzentriert. Der Rückstand
wurde in trockenem DMSO (5 ml) gelöst, und der pH-Wert wurde mit
Triethylamin auf 8,5 eingestellt. Dann wurde festes 4-Nitrophenyl-N,N,N-trimethylglycinatchlorid
(0,50 g; 1,8 mmol) hinzugefügt,
und das Gemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurde die trübe
Lösung
konzentriert (50 °C/10-5 mm Hg), und der Rückstand wurde mit Wasser und
Dichlormethan ausgeschüttelt.
Die wässrige
Schicht wurde abgetrennt, mit Dichlormethan (3x) und Ethylacetat
gewaschen und dann konzentriert, was ein Öl (1,128 g) ergab. Das Rohprodukt
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was
das BHAlyslys2lys4lys8lys16-Dendrimer
mit N,N,N-Trimethylglycinamid-Endgruppen ergab (116 mg). 13C-NMR (D2O): δ 25,5, 30,5,
30,8, 33,4, 42,1, 56,5, 57,1, 67,5, 68,1, 166,7, 167,0, 167,1, 176,0,
176,2.
-
Beispiel 15
-
Herstellung von Dendrimeren mit 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI6043
-
1,1'-Carbonyldiimidazol
(85 mg; 0,52 mmol) wurde zu einer Lösung von 4-Trimethylammoniumbenzoesäureiodid
(154 mg; 0,5 mmol) in trockenem DMF (4 ml) gegeben, und das Gemisch
wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Während dieser
Zeit schied sich ein weißer
Feststoff aus der Lösung
ab. Dann wurde eine Lösung
von PAMAM 4.0 (58 mg; 0,011 mmol) in trockenem DMF (2 ml) hinzugefügt, und
das Gemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Danach hatte sich der größte Teil
des Niederschlags aufgelöst,
und ein Ninhydrin-Test der Lösung
war negativ. Das Gemisch wurde konzentriert (10-4 mm
Hg; 30 °C),
was einen weißen
festen Rückstand
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20;
10% AcOH) gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen
als Essigsäuresalz
ergab (89 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,96; 2,65-2,85;
3,25-3,55; 3,64; 7,92. 13C-NMR (D2O): δ 25,8; 33,1;
33,5; 38,7; 43,1; 43,5; 53,5; 54,1; 56,4; 61,2; 124,8; 133,6; 139,9;
153,2; 173,2; 176,3; 176,8; 182,6.
-
Das
entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit sechs 4-Trimethylammoniumbenzamid-Endgruppen wurde
in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
Beispiel 16
-
Herstellung von Dendrimeren mit 4-(Trimethylammoniumethyl)benzamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI6044
-
Festes
4-Nitrophenyl-4-(chlormethyl)benzoat (150 mg; 0,5 mmol) wurde unter
Rühren
zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (52 mg; 0,01 mmol) in trockenem DMSO (3 ml) gegeben. Die
resultierende gelbe Lösung
wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, als ein Ninhydrin-Test
negativ verlief (pH ca. 8,5). Dann wurde die Lösung konzentriert (10-5 mm Hg; 40 °C), und der Rückstand
wurde mit einem Gemisch von Wasser und Dichlormethan (1:1) ausgeschüttelt. Das
unlösliche
gelartige Material wurde durch Filtration aufgefangen, mit Wasser
(2x) und Dichlormethan (2x) gewaschen und dann an der Luft getrocknet.
Das rohe Dendrimer mit 4-(Chlormethyl)benzamid-Endgruppen wurde
in 25%igem wässrigem
Trimethylamin (20 ml) gelöst,
und die gelbe Lösung
wurde über
Nacht stehen gelassen. Dann wurde die Lösung konzentriert, der Rückstand
wurde in Wasser (5 ml) gelöst,
und die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IRA-401(OH) geleitet. Das farblose Filtrat wurde konzentriert,
was ein viskoses Öl
ergab, das durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt wurde,
was PAMAM 4.0 mit 24 4-(Trimethylammoniumethyl)benzamid-Endgruppen
ergab (90 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,88; 2,65-2,80;
2,98; 3,10-3,60; 7,52 (br d, J=9 Hz); 7,72 (br d, J=9 Hz). 13C-NMR (D2O): δ 26,6; 33,4;
38,8; 43,2; 43,5; 53,6; 53,6; 54,1; 56,8; 62,8; 73,0; 132,1; 135,3;
137,5; 140,0; 176,4; 176,9; 183,6.
-
Beispiel 17
-
Herstellung von Dendrimeren mit N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0
-
Festes
1,1'-Carbonyldiimidazol
(85 mg; 0,52 mmol) wurde zu einer Lösung von N-(2-Acetoxyethyl)-N-(carboxymethyl)-N,N-dimethylammoniumbromid
(135 mg; 0,5 mmol) in trockenem DMF (3 ml) gegeben, und die resultierende
Lösung
wurde zwei Stunden lang unter Stickstoff gerührt. Dann wurde eine Lösung von
PAMAM 4.0 (60 mg; 0,012 mmol) in DMF (2 ml) hinzugefügt, was
die sofortige Bildung eines flockigen Niederschlags bewirkte, der
sich langsam wieder auflöste.
Das Gemisch wurde zwei Tage lang gerührt und dann konzentriert (10-4 mm Hg; 40 °C), was ein viskoses Öl ergab.
Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH)
gereinigt, was PAMAM 4.0 mit 24 N-(2-Acetoxyethyl)-N,N-(dimethylammonium)methylcarboxamid-Endgruppen
ergab (64 mg). 1H-NMR (D2O): δ 1,93; 2,05;
2,70; 3,10-3,60; 3,28; 3,93 (m); 4,14; 4,48 (m). 13C-NMR
(D2O): δ 24,6;
26,2; 33,2; 38,7; 42,8; 42,9; 53,9; 57,4; 62,6; 67,3; 67,5; 168,9;
176,4; 176,8; 177,3; 183,2.
-
Beispiel 18
-
Herstellung von Dendrimeren mit Guanidino-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI6042
-
Eine
Lösung
von PAMAM 4.0 (63 mg; 0,012 mmol) und Methylthiopseudoharnstoffsulfat
(170 mg; 0,61 mmol) in Wasser (5 ml) (pH 10,5) wurde zwei Stunden
lang bei 80 °C
unter Stickstoff erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, und der
Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex G10; 10% AcOH) gereinigt, was PAMAM
4.0 mit 24 Guanidino-Endgruppen als Acetatsalz ergab (107 mg). 1H-NMR (D2O): δ 2,00; 2,80
(br t); 3,09 (br t); 3,32; 3,45 (br t); 3,60 (br t). 13C-NMR
(D2O): δ 25,2;
33,2; 33,4; 38,7; 41,2; 42,6; 43,4; 44,7; 53,5; 54,0; 56,3; 176,5;
176,7; 176,9; 181,6.
-
Das
entsprechende PAMAM-2.0-Dendrimer mit sechs Guanidino-Endgruppen
wurde in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
Beispiel 19
-
Herstellung von Dendrimeren mit 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methy)benzamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0; BRI6041
-
Eine
Lösung
von 1-(4-Carboxyphenyl)methyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-Tetrahydrochlorid
(120 mg; 0,25 mmol), N-Hydroxysuccinimid (60 mg; 0,52 mmol) und
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (250 mg;
1,3 mmol) in Phosphatpuffer von pH 7 (10 ml) wurde eine Stunde lang
bei Raumtemperatur stehen gelassen, und dann wurde eine Lösung von
PAMAM 4.0 (32 mg; 0,006 mmol) in Phosphatpuffer von pH 7 (10 ml)
hinzugefügt.
Das Gemisch wurde zwei Tage lang stehen gelassen und dann konzentriert.
Der Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; 10% AcOH) gereinigt, was
PAMAM 4.0 mit ca. 12 4-([1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan]methyl)benzamid- Endgruppen ergab,
wie durch 1H- und 13C-NMR
bestimmt wurde (80 mg). Dann wurde das Produkt in Wasser gelöst und durch
eine Säule
mit Amberlite-IRA-401(Cl)-Harz
geleitet und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser (1
ml) gelöst,
konzentrierte HCl (1 ml) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde
mit Ethanol (30 ml) verdünnt,
so dass ein weißer
Feststoff ausfiel. Der Feststoff wurde durch Filtration aufgefangen
(68 mg). Erneut zeigten 1H- und 13C-NMR ca. 50% Funktionalisierung der terminalen
Aminogruppen. 1H-NMR (D2O): δ 2,17; 2,36;
2,50; 2,78; 2,85; 3,25; 3,40; 3,50; 3,60; 3,62; 4,49; 7,63 (br d);
7,78 (br d). 13C-NMR (D2O): δ 22,7; 23,1;
33,2; 38,8; 39,9; 40,2; 40,3; 41,0; 41,2; 42,0; 42,9; 43,2; 43,6;
45,5; 46,1; 49,1; 52,2; 53,9; 54,3; 56,6; 62,7; 132,5; 135,7; 137,1;
139,7; 174,3; 176,2; 176,3; 176,7; 177,0; 178,2; 178,5.
-
Beispiel 20
-
Herstellung von Dendrimeren mit 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA); BRI6119
-
Natriumcyanoborhydrid
(32 mg; 0,5 mmol) wurde zu einem Gemisch von PAMAM 4.0 (EDA) (69
mg; 0,01 mmol), 4-Formyl-2-hydroxybenzoesäure (83 mg; 0,5 mmol) und Natriumhydrogencarbonat
(42 mg; 0,5 mmol) in Wasser (4 ml) gegeben. Das inhomogene orangefarbene
Gemisch wurde vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, und
während
dieser Zeit wurde es homogen. Dann wurde die orangefarbene Lösung konzentriert,
und der Rückstand
wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was
PAMAM 4.0 (EDA) mit ca. 32 4-Carboxy-3-hydroxybenzylamin-Endgruppen
ergab (91 mg). 1H- und 13C-NMR
(D2O) zeigten größtenteils Monoalkylierung,
aber mit einigen Anzeichen der Dialkylierung der terminalen Aminogruppen,
und beide Spektren zeigten breite Signale. 13C-NMR
(D2O): δ 37,0;
41,1; 50,9; 53,4; 55,5; 55,8; 61,5; 120,9; 122,2; 122,4; 132,3;
132,7; 135,0; 135,8; 163,5; 163,7; 169,0; 178,6; 179,3. 1H-NMR (D2O): δ 2,20; 2,35; 2,60;
3,15; 3,30; 3,55; 4,25; 6,68; 7,12; 7,55.
-
Beispiel 21
-
Herstellung von Dendrimeren mit 4-Carboxyphenylamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA)
-
Festes
4-Carboxyphenylisothiocyanat (86 mg; 0,48 mmol) wurde zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (20 ml) gegeben. Der
pH-Wert der resultierenden trüben
Lösung
wurde mit gesättigter
NaHCO3-Lösung auf
9 eingestellt, und die Lösung
wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren gelassen. Dann wurde das
Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert,
was einen weißen
festen Rückstand
ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt
und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als weißen flockigen
Feststoff ergab (68 mg).
-
Beispiel 22
-
Herstellung von Dendrimeren mit 3,5-Dicarboxyphenylamid-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA)
-
Festes
3,5-Dicarboxyphenylisothiocyanat (112 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer
Lösung
von PAMAM 4.0 (EDA) (70 mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben.
Der pH-Wert der resultierenden trüben Lösung wurde mit 1 M Na2CO3-Lösung auf
10 eingestellt, und die Lösung
wurde 2 Stunden lang bei 53 °C
unter Stickstoff erhitzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch filtriert,
und das Filtrat wurde konzentriert, was einen bräunlichen festen Rückstand
ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt
und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als blassbraunen
Feststoff ergab (112 mg).
-
Beispiel 23
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonooxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA)
-
Festes
Natrium-4-phosphonooxyphenylisothiocyanat (251 mg) wurde zu einer
Lösung
von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (20 ml) gegeben.
Die resultierende Lösung
(pH 9) wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff
gerührt.
Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, was einen weißen festen
Rückstand
ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt
und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen
weißen
Feststoff ergab (86 mg).
-
Beispiel 24
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA)
-
Festes
Natrium-4-(phosphonomethyl)phenylisothiocyanat (97 mg) wurde zu
einer Lösung
von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in Wasser (30 ml) gegeben.
Die resultierende Lösung
wurde 3 Tage lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, wobei
der pH-Wert durch regelmäßige Zugabe
von gesättigter NaHCO3-Lösung
auf 8 gehalten wurde. Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert,
was einen weißen festen
Rückstand
ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt
und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen
weißen
Feststoff ergab (102 mg).
-
Beispiel 25
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natriumethyl-4-(phosphonomethyl)phenylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA)
-
Festes
Natriumethyl-4-(phosphonomethyl)phenylisothiocyanat (109 mg) wurde
zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0,01 mmol) in DMF (30 ml) gegeben. Die
resultierende Lösung
wurde 17 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, wobei
der pH-Wert durch regelmäßige Zugabe
von gesättigter
NaHCO3-Lösung
auf 8 gehalten wurde. Dann wurde das Reaktionsgemisch konzentriert,
was einen weißen
festen Rückstand
ergab, der durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt
und dann gefriergetrocknet wurde, was das Produkt als flockigen
weißen
Feststoff ergab (30 mg).
-
Beispiel 26
-
Herstellung von Dendrimeren mit Cn-Alkyl-verknüpften 2-Thiosialosid-Endgruppen
-
Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat
wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
-
Zu
einer Lösung
von Methyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-2-S-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat
(Hasegawa et al., 1986) (100 mg) in trockenem Dimethylformamid (1 ml)
wurden 8-Bromoctansäure
(41 mg) und Diethylamin (280 mg) gegeben, und die Lösung wurde
17 Stunden lang bei 20 °C
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat
und eiskalter 5%iger Salzsäure
ausgeschüttelt.
Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und eingedampft, was einen Rückstand ergab (130 mg). Dieser
wurde in Ethylacetat (5 ml) gelöst,
und N-Hydroxysuccinimid (26 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (46
mg) wurden hinzugefügt.
Das Gemisch wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde der weiße Niederschlag abfiltriert.
Das Filtrat wurde konzentriert und durch Flash-Chromatographie auf
Silicagel gereinigt, wobei mit Ethylacetat eluiert wurde. Fraktionen,
die Produkt enthielten, wurden miteinander kombiniert und eingedampft, was
einen weißen
Schaum ergab (97 mg, 71%).
-
In ähnlicher
Weise wurden hergestellt:
Methyl[(11-undecansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
Methyl[(essigsäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
Methyl[(4-butansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
Methyl[(4-methylbenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat.
-
A. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6112
-
Zu
einer Lösung
des PAMAM [EDA] 4.0 (50 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (4 ml)
unter einer inerten Atmosphäre
wurde Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat
(300 mg) gegeben, und die Lösung
wurde 60 Stunden lang bei 20 °C
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol (2
ml) gelöst. Diese
Lösung
wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen,
wobei mit Methanol eluiert wurde. Nach Verdampfung des Lösungsmittels
wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]32 als weißes Pulver erhalten (182 mg;
93%).
-
Dieses
wurde nach dem folgenden Verfahren in das freie Sialosid umgewandelt:
Zu
einer Lösung
von PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]32 (182 mg) in trockenem Methanol (3 ml)
unter Argon bei 20 °C
wurde eine frisch hergestellte 0,19 M Lösung von Natriummethoxid in
Methanol (7 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 2,5 Stunden lang
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde verdampft, und der Rückstand wurde
in Wasser (10 ml) gelöst,
und es wurde 3 Stunden lang gerührt.
Diese Lösung
wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen,
wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das
Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 als blass zitronengelbes Pulver erhalten
(110 mg; 77%).
-
Nach
einem ähnlichen
Verfahren wurden hergestellt:
PAMAM [EDA] 4.0 [(11-Undecanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6147
PAMAM [EDA] 4.0 [(Acetamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6121
PAMAM [EDA] 4.0 [(4-Methylbenzamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6120
-
B. BHAlyslys2lys4lys8lys16 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6169
-
Eine
Lösung
von BHAlyslys2lys4lys8lys16(t-Boc)32 (20,3 mg) in einem Gemisch von Trifluoressigsäure (2 ml)
und Dichlormethan (2 ml) wurde 2 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und
dann wurde das Lösungsmittel im
Vakuum entfernt. Der Rückstand
wurde in trockenem Dimethylsulfoxid (1 ml) gelöst, und Diisopropylethylamin
(25 mg) und Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat
(78 mg) wurden hinzugefügt.
Das Gemisch wurde 60 Stunden lang bei 20 °C unter Argon gerührt, und
dann wurde das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Der Rückstand
wurde in einer frisch hergestellten 0,1 M Lösung von Natriummethoxid in
Methanol (2,5 ml) gelöst,
und das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 20 °C unter Argon gerührt. Das
Lösungsmittel
wurde verdampft, und der Rückstand wurde
in Wasser (1 ml) gelöst
und 17 Stunden lang gerührt.
Diese Lösung
wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen,
wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt
BHAlyslys2lys4lys8lys16 [(8-Octanamido)-5-acetamido-3,5-didesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 als weißes Pulver erhalten (44 mg;
86%).
-
Beispiel 27
-
Herstellung von dendritischen Sialosiden,
die in der 4-Position von Sialinsäure modifiziert sind.
-
Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-S-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat
wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Zu einer Lösung von
Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-chlor-3,4,5-tridesoxy-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosonat
(Sabesan, 1994) (5 g) in trockenem Dichlormethan (150 ml) wurde
fein gepulvertes Kaliumthiolacetat (5,8 g) gegeben, und die Suspension
wurde 48 Stunden lang bei 20 °C
kräftig
gerührt.
Das Gemisch wurde filtriert und eingedampft, was einen hellbraunen
Schaum ergab (5,2 g). Das erforderliche Produkt wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC
[C18, 30% Acetonitril/Wasser] als weißer Schaum
isoliert (3,9 g; 72%).
-
Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat
wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
-
Zu
einer Lösung
von Methyl-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-2-S-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosonat
(300 mg) in trockenem Dimethylformamid (3,5 ml) wurden 8-Bromoctansäure (155
mg) und Diethylamin (1,26 ml) gegeben, und die Lösung wurde 17 Stunden lang bei
20 °C gerührt. Das
Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat
und eiskalter 10%iger Salzsäure
ausgeschüttelt.
Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und eingedampft, was einen gelben Schaum ergab (385 mg).
Dieser wurde in Ethylacetat (20 ml) gelöst, und N-Hydroxysuccinimid
(95 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (175 mg) wurden hinzugefügt. Das
Gemisch wurde 17 Stunden lang bei 20 °C gerührt, und dann wurde der weiße Niederschlag abfiltriert.
Das Filtrat wurde konzentriert und durch präparative Umkehrphasen-HPLC
[C18, 30% Acetonitril/Wasser] gereinigt,
was einen weißen
Schaum ergab (340 mg; 83%).
-
A. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6146
-
Zu
einer Lösung
des PAMAM [EDA] 4.0 (72 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (5 ml)
wurde unter einer inerten Atmosphäre Methyl[(8-octansäure-N-hydroxysuccinimidester)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat
(318 mg) gegeben, und die Lösung
wurde 60 Stunden lang bei 20 °C
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol (2
ml) gelöst.
Diese Lösung
wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen,
wobei mit Methanol eluiert wurde. Nach Verdampfung des Lösungsmittels
wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]32 als weißer Schaum erhalten (225 mg;
81%).
-
Das
freie Sialosid wurde nach dem folgenden Verfahren erhalten:
Zu
einer Lösung
von PAMAM [EDA] 4.0 [Methyl[(8-octanamido)-4-azido-5-acetamido-7,8,9-tri-O-acetyl-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid]onat]32 (215 mg) in trockenem Methanol (1 ml)
unter Argon bei 20 °C
wurde eine frisch hergestellte 1 M Lösung von Natriummethoxid in
Methanol (1 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 3 Stunden lang gerührt. Das
Lösungsmittel
wurde verdampft, und der Rückstand
wurde in Wasser (2 ml) gelöst,
und es wurde 17 Stunden lang gerührt.
Diese Lösung
wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen,
wobei mit Wasser eluiert wurde. Nach der Lyophilisierung wurde das
Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 als flockiges weißes Pulver erhalten (160 mg;
90%).
-
B. PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32; BRI6149
-
Ein
langsamer Strom von Schwefelwasserstoffgas wurde 5 Tage lang bei
20 °C in
eine Lösung
von PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-azido-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 (25 mg) in einem Gemisch von Pyridin (40
ml) und Wasser (20 ml) geleitet. Dann wurde 2 Tage lang Stickstoff
durch die Lösung
perlen gelassen, um überschüssigen Schwefelwasserstoff
zu entfernen. Die Lösung
wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in Wasser (5
ml) aufgenommen und durch einen 0,45-μm-Membranfilter filtriert, um
Schwefel zu entfernen. Nach der Lyophilisierung wurde das Produkt
PAMAM [EDA] 4.0 [(8-Octanamido)-4-amino-5-acetamido-3,4,5-tridesoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidsäure]32 als flockiges weißes Pulver erhalten (23 mg;
96%).
-
Beispiel 28
-
Herstellung von Dendrimeren mit Boronsäure-Endgruppen
-
4-Carboxyphenylboronsäure-N-hydroxysuccinimidester
-
Zu
einer Lösung
von 4-Carboxyphenylboronsäure
(500 mg) in trockenem Dimethylformamid (5 ml) wurden N-Hydroxysuccinimid
(380 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (680 mg) gegeben. Das Gemisch
wurde 64 Stunden lang bei 20 °C
gerührt,
und dann wurde der weiße
Niederschlag abfiltriert. Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat
(100 ml) gelöst.
Diese Lösung
wurde mit Wasser gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, was einen weißen Feststoff
ergab, der aus Acetonitril/Wasser in Form von feinen Nadeln kristallisiert
wurde (730 mg; 92%).
-
PAMAM [EDA] 4.0 [4-Benzamidoboronsäure]32; BRI6160
-
Zu
einer Lösung
des PAMAM [EDA] 4.0 (69 mg) in trockenem Dimethylsulfoxid (5 ml)
unter einer inerten Atmosphäre
wurde 4-Carboxyphenylboronsäure-N-hydroxysuccinimidester
(130 mg) gegeben, und die Lösung
wurde 65 Stunden lang bei 20 °C
gerührt.
Zu der dicken Aufschlämmung
wurde 1 M Natriumcarbonatlösung
(1 ml) gegeben, und die klare Lösung
wurde noch weitere 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum
entfernt, und der Rückstand
wurde in 10% Ammoniaklösung
(5 ml) gelöst.
Diese Lösung
wurde einer Ausschlusschromatographie auf Sephadex LH20 unterzogen,
wobei mit einer 10%igen Ammoniaklösung eluiert wurde. Nach Verdampfung
des Lösungsmittels
wurde das Produkt PAMAM [EDA] 4.0 [4-Benzamidoboronsäure]32 als flockiger weißer Feststoff erhalten (110
mg; 94%).
-
Beispiel 29
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,6-disulfonaphthylthioharnstoff-Endgruppen
-
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
-
Trifluoressigsäure (2 ml)
wurde unter Rühren
zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (147 mg) in trockenem Dichlormethan (2
ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang bei
Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert.
Der Rückstand
wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer
(pH 9,5; 5 ml) gelöst,
und dann wurde festes 3,6-Disulfonaphthylisothiocyanat (400 mg) hinzugefügt. Dann
wurde der pH-Wert des Gemischs durch Zugabe von 1 M Natriumcarbonat
auf 9,5 eingestellt, und die Lösung
wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Das Reaktionsgemisch
wurde konzentriert, und der Rückstand
wurde in Wasser wieder aufgelöst,
und die Lösung
wurde durch eine Säule mit
Amberlite IR-120(Na) geleitet. Das Filtrat wurde konzentriert, was
das Rohprodukt ergab, das durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser)
gereinigt wurde, was BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 mit 64 Natrium-3,6-disulfonaphthylharnstoff-Gruppen
als weißen
flockigen Feststoff ergab (175 mg).
-
Beispiel 30
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-disulfophenylthioharnstoff-Endgruppen
-
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
-
Trifluoressigsäure (3 ml)
wurde unter Rühren
zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (300 mg; 0,02 mmol) in trockenem Dichlormethan
(3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert.
Der Rückstand
wurde in Wasser gelöst,
und die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IR 401 (OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert,
was ein viskoses Öl
ergab (187 mg). Das Öl
wurde in einem 1:1-Gemisch von Pyridin/Wasser (8 ml) gelöst, und
festes Natrium-3,5-disulfophenylisothiocyanat (680 mg; 2 mmol) wurde
hinzugefügt.
Die resultierende Lösung
wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert,
was einen weißen
festen Rückstand
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser)
gereinigt, was BHAlyslys2lys4lys8lys15lys32 mit 64 Natrium-3,6-disulfophenylharnstoff-Gruppen
als weißen
flockigen Feststoff ergab.
-
Beispiel 31
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-3,5-dicarboxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
-
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32; BRI6741
-
Trifluoressigsäure (3 ml)
wurde unter Rühren
zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (300 mg; 0,02 mmol) in trockenem Dichlormethan
(3 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert.
Der Rückstand
wurde in Wasser gelöst,
und die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IR 401 (OH) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert,
was ein viskoses Öl
ergab (186 mg). Das Öl
wurde in einem 1:1-Gemisch von Pyridin/Wasser (8 ml) gelöst, und
Natrium-3,5-dicarboxyphenylisothiocyanat (450 mg; 2 mmol) wurde
hinzugefügt.
Die resultierende Lösung
wurde 13 Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert, was
einen weißen
festen Rückstand
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20;
Wasser) gereinigt, was BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 mit 64 Natrium-3,6-dicarboxyphenylharnstoff-Gruppen
als weißen
flockigen Feststoff ergab.
-
Das
entsprechende Dendrimer PAMAM 4.0 (EDA) mit Natrium-3,5-dicarboxyphenylthioharnstoff-Endgruppen,
BRI6195, wurde in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
Beispiel 32
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonooxyphenylthioharnstoff-Endgruppen
-
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32; BRI6181
-
Trifluoressigsäure (2 ml)
wurde unter Rühren
zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (147 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan
(2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert,
was ein viskoses Öl
ergab. Das Öl
wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 5 ml) gelöst, und
festes 4-Phosphonooxyphenylisothiocyanat (250 mg) wurde hinzugefügt. Der
pH-Wert der resultierenden Lösung
wurde mit 1 M Natriumcarbonat auf 10 eingestellt, und das Gemisch
wurde drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt. Dann wurde die Lösung konzentriert,
was einen weißen
festen Rückstand
ergab. Der Rückstand
wurde in Wasser wieder aufgelöst,
und die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IR 120 (Na) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert.
Dann wurde der Rückstand
durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 mit 64 Natrium-4-phosphonooxyphenylharnstoff-Gruppen
als weißen
flockigen Feststoff ergab (150 mg).
-
Beispiel 33
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4-phosphonophenylthioharnstoff-Endgruppen
-
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32
-
Trifluoressigsäure (2 ml)
wurde unter Rühren
zu einer Suspension von BHAlyslys2lys4lys8lys16DBL32 (147 mg; 0,01 mmol) in trockenem Dichlormethan
(2 ml) gegeben, und die resultierende Lösung wurde zwei Stunden lang
bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann konzentriert,
was ein viskoses Öl
ergab. Das Öl
wurde in N,N-Dimethyl-N-allylamin-Puffer (pH 9,5; 5 ml) gelöst, und
festes 4-Phosphonophenylisothiocyanat (250 mg) wurde hinzugefügt. Der
pH-Wert der resultierenden Lösung
wurde mit gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
auf 9 eingestellt, und das Gemisch wurde drei Stunden lang unter
Stickstoff auf 53 °C erhitzt.
Dann wurde die Lösung
konzentriert, was einen weißen
festen Rückstand
ergab. Der Rückstand
wurde in Wasser wieder aufgelöst,
und die Lösung
wurde durch eine Säule
mit Amberlite IR 120 (Na) geleitet, und das Filtrat wurde konzentriert.
Dann wurde der Rückstand
durch Gelfiltration (Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was nach
dem Gefriertrocknen BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32 mit 64 Natrium-4-phosphonophenylharnstoff-Gruppen
(BRI6196) als weißen
flockigen Feststoff ergab (152 mg).
-
Beispiel 34
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium-4,6-diphosphononaphthylthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0
-
Eine
Lösung
von Natrium-4,6-diphosphononaphthylisothiocyanat (165 mg) in Wasser
(2 ml) wurde zu einer Lösung
von PAMAM 4.0 (51 mg; 0,01 mmol) in Wasser (2 ml) gegeben. Der pH-Wert
des Gemischs wurde mit gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung
auf 9,5 eingestellt, und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei
Raumtemperatur kräftig
gerührt
und dann drei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt.
Dann wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert,
was einen braunen festen Rückstand
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G25; Wasser)
gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen PAMAM 4.0 mit 24 Natrium-4,6-diphosphononaphthylthioharnstoff-Endgruppen
als braunen Feststoff ergab (81 mg).
-
Beispiel 35
-
Herstellung von Dendrimeren mit Fluoresceinthioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA)
-
Festes
Fluoresceinisothiocyanat (188 mg) wurde zu einer Lösung von
PAMAM 4.0 (EDA) (74 mg; 0,01 mmol) in Wasser (3 ml) gegeben. Gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung wurde
hinzugefügt,
um den pH-Wert auf 9 einzustellen, und die resultierende homogene
Lösung
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt
und dann konzentriert. Der orangefarbene Rückstand wurde durch Gelfiltration
(Sephadex LH20; Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen
PAMAM 4.0 (EDA) mit 21 Fluoresceinthioharnstoff-Endgruppen als flockigen
orangefarbenen Feststoff ergab (193 mg).
-
Beispiel 36
-
Herstellung von Dendrimeren mit Natrium(phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-Endgruppen
-
PAMAM 4.0 (EDA)
-
Festes
(Phenyl-3-boronsäure)isothiocyanat
(100 mg; 0,5 mmol) wurde zu einer Lösung von PAMAM 4.0 (EDA) (69
mg; 0,01 mmol) in Wasser (5 ml) gegeben. Zu dem gelösten Isothiocyanat
wurde 1 M Natriumcarbonat gegeben (pH ca. 10). Dann wurde das Gemisch
zwei Stunden lang unter Stickstoff auf 53 °C erhitzt und dann filtriert,
und das Filtrat wurde konzentriert, was einen bräunlichen festen Rückstand
ergab. Das Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex LH20;
Wasser) gereinigt, was nach dem Gefriertrocknen PAMAM 4.0 (EDA)
mit 32 Natrium(phenyl-3-boronsäure)thioharnstoff-Endgruppen
als weißen
flockigen Feststoff ergab (87 mg).
-
Beispiel 37
-
Herstellung von Dendrimeren mit Pyridiniumdodecylcarboxamido-Endgruppen
-
PAMAM-2.0-Dendrimer; BRI-6807
-
Ein
PAMAM-Generation-2.0-Kern (0,0479 mmol; 50 mg) wurde durch Eindampfen
aus 0,5 ml einer Lösung
in MeOH erhalten und dann in 10 ml Wasser wieder aufgelöst. Zu der
Lösung
wurden 1-N-Pyridinium-12-dodecansäurebromid (0,14 g; 0,384 mmol),
N-Hydroxybenzotriazolhydrat [HOBT] (52 mg; 0,384 mmol), Triethylamin
(53 μl;
0,384 mmol) und 1-(3-Diethylaminopropyl-3-ethyl)carbodiimid·HCl [EDC] (74 mg; 0,384 mmol)
gegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Volumen wurde unter reduziertem Druck auf ein Drittel reduziert,
und die Lösung
wurde an einer LH20-Säule
unter Verwendung von Wasser als Eluent chromatographiert. Fraktionen,
die das Produkt enthielten, wurden aufgefangen, und Pyridiniumdodecylcarboxamid-PAMAM-2.0-bromid
wurde durch Gefriertrocknen als weißer flockiger Feststoff isoliert.
1H-NMR (D2O): δ 1,15, 1,45,
1,9, 2,15, 2,75, 2,8, 3,15, 3,35, 3,5, 4,55, 8,05, 8,5, 8,8.
-
PAMAM-4.0-Dendrimer; BRI-6809
-
Ein
PAMAM-Generation-4.0-Kern (0,05 mmol; 69 mg) wurde durch Eindampfen
aus 1,0 ml einer Lösung
in MeOH erhalten und dann in 15 ml Wasser wieder aufgelöst. Zu der
Lösung
wurden 1-N-Pyridinium-12-dodecansäurebromid (0,143 g; 0,4 mmol),
N-Hydroxybenzotriazolhydrat [HOBT] (77 mg; 0,4 mmol), Triethylamin
(56 μl;
0,4 mmol) und 1-(3-Diethylaminopropyl-3-ethyl)carbodiimid·HCl [EDC]
(77 mg; 0,4 mmol) gegeben.
-
Dieses
Reaktionsgemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Das Volumen wurde unter reduziertem Druck auf ein Drittel reduziert,
und die Lösung
wurde an einer LH20-Säule
unter Verwendung von 1% Triethylamin in Wasser als Eluent chromatographiert.
Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden aufgefangen, und
Pyridiniumdodecylcarboxamid-PAMAM-4.0-bromid wurde durch Gefriertrocknen
als weißer
flockiger Feststoff isoliert.
-
Eine
kleine Menge des Produkts wurde mit Essigsäureanhydrid umgesetzt, um die
vollständige
Verkappung der NH2-Endgruppen des Dendrimerkerns
zu bestätigen.
1H-NMR (D2O): δ 1,10, 1,45,
1,9, 2,1, 2,30, 2,5, 2,7, 3,2, 4,5, 8,00, 8,45, 8,80.
-
Beispiel 38
-
Herstellung von Dendrimeren mit Saccharin-Endgruppen
-
PAMAM-4.0-Dendrimer; BRI-6157
-
Zu
einer Lösung
von Ethylendiamin-Kern-PAMAM-4.0-Dendrimerkern (275 mg; 39,8 μM) in trockenem Dimethylformamid
(25 ml) wurde 6-(Benzosulfimido)isothiocyanat (400 mg; 1,67 mM)
gegeben, und das Gemisch wurde 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die
trübe Lösung wurde
aufgeklärt,
indem man den pH-Wert mit Natriumcarbonatlösung auf pH 10–10,5 einstellte.
Diese Lösung
wurde weitere 24 h gerührt,
und flüchtige
Substanzen wurden auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Die Lösung wurde
auf einer großen
Sephadex-LH20-Säule chromatographiert,
und die Vorlauffraktion wurde aufgefangen. Die übrigen Fraktionen wurden aufgefangen
und auf einer kleineren Säule
erneut chromatographiert. Die kombinierten Vorlauffraktionen wurden
eingedampft und gefriergetrocknet, was das Dendrimerprodukt mit
Saccharin-Endgruppen (450 mg; 78%) als weißen flockigen Feststoff ergab.
1H-NMR (D2O): δ 2,20, 2,50,
3,23, 3,46, 3,63, 7,52, 7,87.
-
Das
entsprechende BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32-Dendrimer mit Saccharin-Endgruppen BRI-6189
wurde in ähnlicher
Weise hergestellt.
-
Beispiel 39
-
Antiparasitische in-vitro-Assays
-
- I: Der folgende Assay wurde als in-vitro-Assay
durchgeführt,
um auf Hemmung von Trypanosomen zu testen.
-
A.
Materialien und Verfahren
Medium: | "Balz-MEM" plus 10% hitzeinaktiviertes
Pferdeserum |
Trypanosoma-Stämme: | STIB
900 (T. brucei rhodesiense, kloniert aus STIB 704)
STIB 920
(T. b. brucei, kloniert aus STIB 348)
STIB 930 (T. b. gambiense,
kloniert aus STIB 754) |
Standardwirkstoffe: | Melarsoprol
(Arsobal, Specia, Frankreich), Pentamidin (Pentacarinat, Rhone-Poulenc),
Suramin (Germanin, Bayer, Deutschland) |
Inkubationsbedingungen: | 72
Stunden bei 37 °C
und 5% CO2 in einer feuchten Atmosphäre |
Testsystem: | 96-Napf-Mikrotiterplatte,
100 μl pro
Napf, 200–1000 Trypanosomen
pro Napf (je nach Stamm) und Auswertung mit zwei Endpunktablesungen |
Bewertung: | a.
durch mikroskopische Bestimmung des MIC
b. Fluoreszenzablesung
nach BCECF/AM-Zugabe oder Zählen
der Zellen mit Counter Counter oder CASY |
Wirkstoffpräparat: | Stammlösung von
10 mM in 10% Lösungsmittel
(DMSO, Ethanol usw.), höchste
Wirkstoffkonzentration beträgt
50 μM |
Ausführliches
Testverfahren: | Der
Test beruht auf LILIT: Low Inoculum Long Incubation Test (Brun und
Lun, Vet. Par. 52 (1994), 37–46) |
- 1. Man gibt 50 μl vollständiges Medium
in Näpfe
der Reihen B-H, Spalten Nr. 2–10,
einer 96-Napf-Platte (markierte Näpfe).
- 2. Man gibt 75 μl
Medium, das das Doppelte der höchsten
zu testenden Wirkstoffkonzentration enthält, in die Näpfe B-D
(D1) und F-H (D2), Spalte Nr. 11.
- 3. Man stellt mit Hilfe einer Multipipette eine Verdünnungsreihe
her, indem man 25 μl
aus den Näpfen
Nr. 11 in die Näpfe
Nr. 10 überträgt und durch
mindestens zehnmaliges Ansaugen und Ausspülen von Medium mischt.
- 4. Man fahre mit der Verdünnung
von rechts nach links fort, bis 25 μl aus Napf Nr. 5 in Napf Nr.
4 gegeben werden. Nach dem Mischen werden die übrigen 25 μl verworfen. Die Näpfe Nr.
2 und 3 in jeder Reihe dienen als Kontrollnäpfe ohne Wirkstoff.
- 5. Man gibt 50 μl
Trypanosomensuspension in die Näpfe
B, C und F, G, Nr. 2 bis 11 der Platte mit einer Aussaatdichte von
4 × 103/ml (ergibt 200/Napf). Man gibt 50 μl Baltz-Medium
ohne Trypanosomen in die Näpfe
2-11 der Reihen D und E als Hintergrundkontrollen für den Fluoreszenzassay.
- 6. Man inkubiert die Platte 72 Stunden lang bei 37 °C, 5% CO2.
- 7. Man beobachtet die Platte unter einem inversen Mikroskop,
um mikroskopisch die MIC (minimale inhibitorische Konzentration)
zu bestimmen: die niedrigste Wirkstoffkonzentration, bei der keine
Trypanosomen mit nor maler Morphologie und Beweglichkeit im Vergleich
zu den Kontrollnäpfen
beobachtet werden können,
oder die Konzentration, bei der keine Trypanosomen überlebten.
- 8. Der Test kann werter nach der Zugabe von BCECF/AM durch Fluoreszenzablesung
oder durch Bewertung der Wachstumshemmung mit einem Coulter Counter
bewertet werden.
-
B. Ergebnisse
-
Die
folgenden Dendrimere wurden getestet.
BRI-Nr. | MOL-Name | Art
der Verbindung |
BRI
2923 | PAMAM
4.0(NHCSNHNaphth[SO3Na]2)24 | Dendrimer |
BRI
2998 | PAMAM
4.0(NHCSNHNapth-3,6,8-triSO3Na)24 | Dendrimer |
BRI
6039 | PAMAM
4.0(NHCSNH-1-Ph-3,5-[SO3Na]2)24 | Dendrimer |
BRI
6041 | PAMAM 4.0(NHCOPhCH2cyclam·4HCl)32 | Dendrimer |
BRI
6042 | PAMAM
4.0(NHC=NHNH2·HOAc)24 | Dendrimer |
- (i) In-vitro-Aktivität von 4
getesteten Verbindungen gegen T. b. rhodesiense (STIB 900) in einem
72-h-Fluoreszenzassay. Alle Verbindungen wurden in einer Konzentration
von 4 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst und dann in vollständigem Kulturmedium
auf die gewünschte
Konzentration verdünnt.
Verbindung | MTC
(μg/ml) | MIC
(μg/ml) | EC50
(μg/ml) |
BRI
2998 | > 100
333 | 3,7
4,1 | 7
6,3 |
- MIC = minimale inhibitorische Konzentration
(keine Trypanosomen am Leben)
- MTC = maximale tolerierte Konzentration (Wirkstoff zeigt keine
Wirkung)
- (ii) In-vitro-Aktivität von 5
getesteten Verbindungen gegen T. b. rhodesiense (STIB 900) in einem
72-h-Fluoreszenzassay. Alle Verbindungen wurden in einer Konzentration
von 20 μg/ml
in destilliertem Wasser gelöst
und dann in vollständigem
Kulturmedium (BMEM plus 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum) 1:10
verdünnt.
Verbindung | MTC | MIC | EC50 |
μg/ml | μM | μg/ml | μM | μg/ml | μM |
BRI
6042 | 666 | 87,7 | 74 | 9,7 | 120 | 15,8 |
BRI
6041 | 666 | 62,3 | 74 | 6,9 | 190 | |
BRI
6039 | 1000 | 75,2 | 12,3 | 0,9 | 22 | 1,65 |
BRI
2923 | > 1000 | > 70 | 37 | 2,5 | 170 | |
- II Die folgenden Assayergebnisse
wurden in einem in-vitro-Assay erhalten, um auf Hemmung von Trypanosoma(T)-
und Plasmodium(P)-Spezies zu testen.
-
Die
folgenden Verbindungen wurden getestet.
BRI-Nr. | MOL-Name | |
BRI
6157 | PAMAM
4.0 EDA(NHCSNHSaccharinNa)32 | Saccharin-substituiertes
Dendrimer mit Polyamidaminkern. |
BRI
6181 | BHAlys31lys32(NHCSNHPhOP[O][ONa]2)64 | Phenylphosphat-substituiertes Dendrimer
mit Lysinkern |
BRI
6195 | PAMAM
4.0 EDA(NHCSNH-3,5 Ph[COOH]2)32 | Phenylcarboxylat-substituiertes Dendrimer
mit Polyamidaminkern |
-
Die
Tests wurden unter Verwendung der folgenden Stämme durchgeführt:
Parasit | Stamm | Stadium | Standard |
T.
b. rhodesiense | STIB
900 | trypomastigote
Form | Melarsoprol |
P.
falciparum | NF54 | alle | Chlorochin |
Ergebnisse: (alle Werte in μg/ml)
Verbindung | T. b. rhodensis | P.
falciparum | Cytotoxizität |
MIC | IC-50 | IC-50 | MIC |
BRI6157 | 33 | 5 | 22 | > 100 |
BRI6181 | > 100 | > 100 | 24 | > 100 |
BRI6195 | > 100 | > 100 | 20 | > 100 |
-
Beispiel 40
-
Bestimmung der antibakteriellen Aktivität
-
Die
in diesem Assay verwendeten Bakterien waren:
- Staphylococcus
aureus (ATCC 29213)
- Enterococcus faecalis (ATCC 29212)
- Escherichia coli (ATCC 25922)
-
Die
minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) und die minimalen
bakteriziden Konzentrationen (MBC) wurden durch Mikrobrühenverdünnung (NCCLS – M7A3 1993)
in Cation Adjusted Mueller-Hinton Broth (pH 7) unter Verwendung
von 2–5 × 10
4 cfu (log-Phase) als Inokulum und 24 sowie
48 h aerobe Inkubation bei 35 °C
bestimmt. MBC wird als Titer genommen, der eine Reduktion des Inokulums
um drei Zehnerpotenzen zeigt. Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle dargestellt (alle Einheiten in μg/ml).
Testverbindung | S.
aureus | E.
faecalis | E.
coli |
BRI-6807 | 32
(128) | > 256 | 128 |
BRI-6809 | 8
(8) | 128
(128) | > 256 |
- MIC = minimale inhibitorische Konzentration
- (MBC) = minimale bakterizide Konzentration
-
Beispiel 41
-
Quantifizierung der Wirkung von Dendrimeren
auf die Invasion und das Wachstum des humanen Malariaparasiten Plasmodium
faiciparum in humanen roten Blutkörperchen in vitro
-
Verfahren
-
Malaria-Parasiten.
3D7 ist eine wohlcharakterisierte in-vitro-Kultur-adaptierte Linie
von P. falciparum. Der Parasit durchläuft mehrere Zyklen von Wachstum
und Replikation innerhalb von humanen roten Blutkörperchen.
Die Dauer jedes Zyklus beträgt
48 Stunden, beginnend mit jungen Parasiten im Ringstadium, die über pigmentierte
Trophozoiten (während
der ersten 24 Stunden des Zyklus) zu segmentierten Schizonten reifen, die
aufbrechen und dabei infektiöse
Merozoiten freisetzen, die schnell frische rote Blutkörperchen
befallen. Frisch eingefallene Merozoiten werden zu Ringformen, und
der Zyklus beginnt von neuem.
-
Parasitenkultur
und Wachstumsassays. P.-falciparum(Linie 3D7)-Parasiten wurden in
synchroner in-vitro-Kultur in frisch gesammelten humanen roten Blutkörperchen
gehalten, wobei gut etablierte Techniken verwendet wurden. Für Invasionsassays
wurden rote Blutkörperchen,
die reife, pigmentierte Trophozoiten enthielten, durch Gelatineflotation
gereinigt, dann in frischen humanen roten Blutkörperchen resuspendiert, so dass
ungefähr
eines pro 200 rote Blutkörperchen
parasitiert war (0,5% Parasitämie).
Dann wurde frisches Kulturmedium hinzugefügt, was eine endgültige Konzentration
an roten Blutkörperchen
von 2 × 108 roten Blutkörperchen/ml ergibt.
-
Aliquote
der Suspension der roten Blutkörperchen
(jeweils 95 μl)
wurden in doppelten Ansätzen
in 96-Napf-Platten eingebracht. 5 μl Parasitenkulturmedium, das
entweder die Testverbindung (BRI 2999, BRI 6741, BRI 2998, BRI 7011,
BRI 6181) oder PBS (Kontrolle) enthielt, wurden zu geeigneten Näpfen gegeben, und
die Platten wurden bei 37 °C
und 1% 02 inkubiert. Dünne Abstriche von jedem der
Näpfe wurden
sofort (Zeit = 0) und dann nach 24, 48 und 72 Stunden Kultur durchgeführt. Von
jedem Abstrich wurden die Parasitämie und das Stadium der Parasitenreifung
durch mikroskopische Untersuchung der Abstriche nach Anfärbung mit
Giemsa bei pH 7,2 quantifiziert. Dies ermöglichte eine Quantifizierung
der Invasion, der Parasitenentwicklung und der anschließenden Reinvasion.
Bei jedem Probenahmezeitpunkt wurde das Kulturmedium (entweder mit
oder ohne Verbindung) in den übrigen
Näpfen
vollständig
ersetzt.
-
Die
Testverbindungen wurden zuerst mit 20 mg/ml in steriler isotonischer
phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(pH 7,2) gelöst,
dann weiter verdünnt,
um konzentrierte Stammlösungen
im Bereich zwischen 1 mg/ml und 200 μg/ml herzustellen. Die Stammlösungen wurden
während
der gesamten Dauer des Assays bei 4 °C aufbewahrt und gegebenenfalls
in geeigneter Weise in Parasitenkulturmedium verdünnt.
-
Ergebnisse
-
Getrennte
Invasions-/Wachstumsexperimente wurden für jede Verbindung durchgeführt, und
die Ergebnisse sind in den 1 bis 5 graphisch
dargestellt. Die Wirkung jeder Verbindung wurde bei Endkonzentrationen
von 10, 25 und 50 μg/ml
getestet. Jede der fünf
Verbindungen zeigte für
jede gegebene Konzentration eine konzentrationsabhängige hemmende
Wirkung auf die Invasion, das Wachstum und die Replikation des Parasiten,
wobei das absolute Niveau der Hemmung zwischen den verschiedenen
Verbindungen variierte. Bei allen getesteten Konzentrationen (bis
zu einschließlich
50 μg/ml)
hatte keine der fünf
Testverbindungen irgendeine erkennbare ungünstige Wirkung auf die Morphologie
de roten Blutkörperchen.
In Experimenten, bei denen BRI 7011 und BRI 6181 getestet wurden
(4 und 5), war das Niveau der Reinvasion
von Parasiten in Kontrollnäpfen
nach 72 Stunden niedriger, als man es normalerweise beobachtet.
Dies war auf eine sichtbare Verzögerung
des Parasitenwachstums irgendwann nach 48 Stunden Kultur zurückzuführen, so
dass nach 72 Stunden ein großer
Anteil der Schizonten noch nicht aufgebrochen war und invasive Merozoiten
freisetzte.