DE69937964T2

DE69937964T2 - Transportreagentien

Info

Publication number: DE69937964T2
Application number: DE69937964T
Authority: DE
Inventors: Yongliang Rockville CHU; Malek Gaithersburg MASOUD; Gulilat Potomac GEBEYEHU
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 1998-11-12
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2009-01-02
Anticipated expiration: 2019-11-13
Also published as: EP1129064B1; US20050164971A1; CA2350882C; DE69937964D1; PT1129064E; US20150190522A1; US20100159593A1; US8785200B2; US20070202598A1; EP1129064A1; ES2296419T3; JP2002529439A; NZ512244A; US7470817B2; JP2011121966A; US8158827B2; US7166745B1; EP2298728A1; EP1829856A3; US20120238747A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf kationische Lipide und Zusammensetzungen von kationischen Lipiden, die bei Lipid-Aggregaten für den Transport von Makromolekülen und weiteren Verbindungen in Zellen von Nutzen sind.
Stand der Technik
Lipid-Aggregate wie etwa Liposome haben sich als Transport-Agenzien, um Makromoleküle wie etwa DNA, RNA, Protein und kleine chemische Verbindungen wie etwa Pharmazeutika in Zellen einzubringen, als zweckmäßig erwiesen. Im Besonderen haben sich Lipid-Aggregate, die kationische Lipid-Komponenten umfassen, beim Transport von anionischen Molekülen zu Zellen als besonders wirksam erwiesen. Teilweise wird angenommen, dass die Wirksamkeit kationischer Lipide aus verstärkter Affinität für Zellen, von denen einige eine negative Nettoladung tragen, resultiert. Ebenfalls ermöglicht die positive Nettoladung auf Lipid-Aggregaten, die ein kationisches Lipid umfassen, dass das Aggregat an Polyanionen wie etwa Nukleinsäuren binden kann. Von Lipid-Aggregaten, die DNA enthalten, ist bekannt, dass es sich um wirksame Agenzien für effiziente Transfektion von Zielzellen handelt.
Die Struktur zahlreicher Arten von Lipid-Aggregaten variiert in Abhängigkeit von Zusammensetzung und Verfahren für das Bilden des Aggregats. Solche Aggregate schließen Liposome, unilamellare Vesikel, multilamellare Vesikel, Mizellen und dergleichen ein, deren jeweilige Größen im Nanometer- bis Mikrometerbereich liegen. Verfahren für das Herstellen von Lipid-Aggregaten sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Der vordergründige Schwachpunkt bei dem Verwenden von herkömmlichen Phospholipid enthaltenden Liposomen für das Transportieren besteht darin, dass das abzugebende Material eingekapselt werden muss und dass die Liposom-Zusammensetzung eine negative Nettoladung aufweist, die von der negativ geladenen Zelloberfläche nicht angezogen wird. Durch das Kombinieren von kationischen Lipid-Verbindungen mit einem Phospholipid können positiv geladene Vesikel und weitere Arten von Lipid-Aggregaten DNA, die negativ geladen ist, binden, von Zielzellen aufgenommen werden und Zielzellen transfizieren. (Felgner, P. L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417; Eppstein, D. et al., US Pat. Nr. 4,897,355 .).
Bei einem hinreichend bekannten kationischen Lipid handelt es sich um N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA). Bei der Struktur von DOTMA handelt es sich um folgende:
DOTMA an sich oder in einer 1:1 Kombination mit Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) wird unter Verwendung von standardmäßigen Techniken in Liposome formuliert. Felgner, et al. oben demonstrierten, dass solche Liposome effizientes Transportieren von Nukleinsäuren zu manchen Arten von Zellen bereitstellten. Eine Formulierung von DOTMA:DOPE (1:1) wird unter dem Markennamen LIPOFECTIN (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) verkauft. Bei einem weiteren, im Handel erhältlichen kationischen Lipid handelt es sich um 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP), das sich von DOTMA lediglich dahingehend unterscheidet, dass die Oleoyl-Gruppen mittels Ester- und nicht mittels Etherbindungen an das Propylamin gebunden sind. Eine damit in Zusammenhang stehende Gruppe von Verbindungen unterscheidet sich von DOTMA und DOTAP dahingehend, dass eine der Methylgruppen der Trimethylammoniumgruppe durch eine Hydroxyethylgruppe ersetzt wurde. Verbindungen dieser Art ähneln dem Rosenthal Inhibitor (RI) von Phospholipase A (Rosenthal, A. F. und Geyer, R. P. (1960) J. Biol. Chem. 235: 2202–2206), der an den Propylamin-Kern gebundene Stearoylester aufweist. Die Dioleoylanaloga von RI werden üblicherweise als DORI-Ether und DORI-Ester abgekürzt, in Abhängigkeit der Bindung der Fettsäuregruppen an den Propylamin-Kern. Die Hydroxygruppe kann als eine Stelle für weiteres Funktionalisieren verwendet werden.
Das Dimyristyloxy-Analogum von RI ist als DMRIE bekannt. Eine Formulierung von 1:1 (M/M) DMRIE:Cholesterin wird unter dem Markennamen DMRIE-C (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) verkauft. Bei der Struktur von DMRIE handelt es sich um folgende:
Eine weitere Klasse von Verbindungen wurde von Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982–6986; EPO Veröffentlichung 0 394 111 (24. Okt. 1990) offenbart, wobei Carboxyspermin an zwei Arten von Lipiden konjugiert wurde. Bei der Struktur von 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) handelt es sich um folgende:
Bei der Struktur von Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES) handelt es sich um folgende:
Sowohl DOGS als auch DPPES wurden für das Beschichten von Plasmiden verwendet, wobei ein Komplex aus Lipid-Aggregat gebildet wurde, der effiziente Transfektion bereitstellt. Die Verbindungen gelten bei der Transfektion einiger Zelllinien als effizienter und weniger toxisch als DOTMA. DOGS ist im Handel als TRANSFECTAM^TM (Promega, Madison, Wis.) erhältlich.
Eine weitere Klasse von Verbindungen wurde ebenfalls beschrieben, bei denen Carboxyspermin mittels einer Amidbindung an Lipide konjugiert war (Gebeyehu, G. et al., US Patent Nr. 5,334,761 ). Diese Verbindungen sind für ein effizientes Transportieren von Nukleinsäuren in zahlreiche Zellen zweckmäßig und es handelt sich bei denselben ebenfalls um Zwischenprodukte für das Herstellen weiterer solcher Lipide. 2,3-Di-oleyloxy-N-[2(spermin-carboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propan-aminium (DOSPA) ist als eine 3:1 (w/w) Formulierung mit DOPE unter dem Markennamen LipofectAMINE (erhältlich von Life Technologies, Inc., Rockville, MD) erhältlich. Bei der Struktur von DOSPA handelt es sich um folgende:
Lipid-Verbindungen mit einer Spermin-Kopfgruppe wurden ebenfalls beschrieben (Haces, A., et al., US Patent Nr. 5,674,908 ). Diese Verbindungen sind speziell für das Transportieren von Nukleinsäuren in Insektenzellen zweckmäßig. Eine 1:15 (M/M) Formulierung von Tetramethyltetrapalmitylspermin (TM-TPS) mit DOPE ist im Handel unter dem Markennamen CellFECTIN (Life-Technologies, Inc., Rockville, MD) erhältlich. Die Struktur von TM-TPS wird untenstehend gezeigt:
Ein kationisches Cholesterin-Derivat (DC-Chol) wurde synthetisiert und in Kombination mit DOPE in Liposome formuliert. (Gao. X. und Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Res. Comm. 179: 280–285). Bei der Struktur der Verbindung handelt es sich um folgende:
Von mit DC-Chol formulierten Liposomen wird angenommen, dass sie für einige Zelllinien effizientere Transfektion und geringere Toxizität als DOTMA-enthaltende Liposome bereitstellen.
Von Lipopolylysin, das durch das Konjugieren von Polylysin an DOPE gebildet wird, wurde berichtet, dass es beim Transfizieren in Gegenwart von Serum besonders wirksam ist, wobei es sich hier um eine Bedingung handelt, die wahrscheinlich in vivo vorgefunden wird (Zhou, X. et al. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065: 8–14).
WO 97/42819 beschreibt weitere Arten von kationischen Lipiden für das Transfizieren von Nukleinsäuren in Zellen.
US 5,744,335 beschreibt ein Verfahren für das Transfizieren einer Zelle mit einem Polynukleotid, das mit einer oder mehr als einer amphiphatischen Verbindung und einem DNA-bindenden Protein wie etwa H1, H2A oder H2B vermischt ist. Die beschriebenen amphiphatischen Verbindungen schließen kationische amphiphatische Verbindungen ein, die eine nicht natürliche Polyamingruppe und eine hydrophobe Gruppe umfassen.
McCluskie et al, Antisense & Nucleic Acid Drug Development (1998), 8(5), Seiten 401–414, beschreibt den direkten Transfer von DNA in das Atemsystem von Mäusen unter Verwendung nackter und Lipid-formulierter DNA. Die beschriebenen Lipide schließen Tetramethyltetraalkylspermin-Analoga und DMRIE/Cholesterin-Formulierungen ein.
EP 0846680 beschreibt weitere kationische Lipide für das Transportieren von Nukleinsäuren in Zellen, im Besonderen Guanidino-Lipide.
US 5,830,430 beschreibt kationische Lipide für das Transportieren von bioaktiven Materialien wie etwa Nukleinsäuren und Pharmazeutika in Zellen, im Besonderen Lipide, die zumindest zwei kationische Gruppen umfassen.
WO 98/40502 beschreibt Zusammensetzungen, die Peptide und Transfektionsagenzien wie etwa kationische Lipide und dendrimere Polymere für das Transfizieren von eukaryotischen Zellen umfassen. Die Peptide können an die Transfektionsagenzien gekoppelt sein.
WO 98/40499 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen für das Transfizieren von murinem Schleimhautepithel mit Komplexen aus Nukleinsäure/kationischem Lipid.
WO 98/02190 beschreibt kationische Amphiphile, die den Transport von biologisch aktiven Molekülen, einschließlich Polynukleotiden, in Zellen ermöglichen. Die kationischen Amphiphile enthalten lipophile Gruppen, die aus Steroiden, Mono- oder Dialkylaminen, Alkyl- oder Acylgruppen stammen und kationische Gruppen, die aus Aminen, Alkylaminen oder Polyalkylaminen stammen.
FR 1567214 beschreibt ein Reinigungsmittel für das Verwenden bei Waschmaschinen, das kationische Moleküle umfasst.
Trotz Fortschritten auf dem Gebiet besteht weiterhin ein Bedarf an einer Vielzahl von verbesserten kationischen Lipid-Verbindungen. Im Besonderen wurde bisher kein einzelnes kationisches Lipid gefunden, dass bei allen Zellarten funktioniert. Angesichts dessen, dass sich unterschiedliche Zellarten hinsichtlich Membranzusammensetzung unterscheiden, ist es nicht erstaunlich, dass unterschiedliche Zusammensetzungen und Arten von Lipid-Aggregaten bei unterschiedlichen Zellarten wirksam sind, entweder aufgrund ihrer Fähigkeit zu Kontakt und Fusion mit Zielzellmembranen oder aufgrund von Aspekten des Transferprozesses an sich. Derzeit werden diese Prozesse nicht gut verstanden, infolgedessen ist das Design von wirksamen liposomalen Vorläufern weitgehend empirisch. Neben Inhalt und Transfer sind weitere Faktoren von Bedeutung, zum Beispiel die Fähigkeit, für den vorgesehenen Zweck geeignete Lipid-Aggregate zu bilden, die Möglichkeit, Zellen in Gegenwart von Serum zu transfizieren, Toxizität gegenüber den Zielzellen, Stabilität als ein Träger für die abzugebende Verbindung und die Fähigkeit, in einer in vivo Umgebung zu funktionieren. Zusätzlich können Lipid-Aggregate durch Ausweiten der Palette an Substanzen, die zu Zellen transportiert werden können, verbessert werden. Die kationischen Lipid-Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen verbesserte Funktion hinsichtlich mehrerer der vorangehenden Attribute auf.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Verbindung mit der folgenden Formel:
worin
es sich bei Q um N handelt;
es sich bei L um ein bivalentes, organisches Radikal handelt, das in der Lage ist, jedes Q zu binden;
R₁, R₃, R₄ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus H und C₈-C₂₄ Alkenyl, C₈-C₂₄ Aryl und C₈-C₂₄ Alkyl, optional substituiert mit einem oder mehr als einem Element ausgewählt aus einem Alkohol, einem Amin, einem Amid, einem Ether, einem Polyether, einem Polyamid, einem Ester, einem Mercaptan, einem Harnstoff, einem Thioharnstoff, einem Guanidyl oder einer Carbamoylgruppe;
und worin es sich bei zumindest einem Element aus R₁, R₃, R₄ und R₆ um eine geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder eine Arylgruppe handelt;
es sich bei X^– um ein physiologisch verträgliches Anion handelt;
es sich bei a um eine Zahl positiver Ladung, dividiert durch die Valenz von X, handelt;
es sich bei r, s, u und y um 0 oder 1 handelt, vorausgesetzt, die Valenzanforderungen von Stickstoff sind erfüllt; und
es sich bei R₇ und R₈ um H handelt.
Die Verbindungen der Erfindung sind, entweder allein oder in Kombination mit weiteren Lipid-Aggregat bildenden Komponenten (z. B. DOPE, DOPC oder Cholesterin) für das Formulieren in Liposome oder weitere Lipid-Aggregate zweckmäßig. Solche Aggregate sind polykationisch und in der Lage, mit anionischen Makromolekülen wie etwa Nukleinsäuren stabile Komplexe zu bilden. Der Komplex aus Lipid-Aggregat und Makromolekül interagiert mit Zellen, wodurch das polyanionische Makromolekül für Absorption und Aufnahme durch die Zelle zugänglich wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Lipid-Aggregat bereit, das eine oder mehr als eine Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst. Bevorzugt umfasst das Lipid-Aggregat zumindest eine Lipid-Aggregat bildende Verbindung. Bevorzugt wird die Lipid-Aggregat bildende Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DOPE, DOPC und Cholesterin.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls konjugiert sein an oder gemischt sein mit oder verwendet werden in Verbindung mit einer Vielzahl von zweckmäßigen Molekülen und Substanzen wie etwa Proteinen, Peptiden, Wachstumsfaktoren und dergleichen, um Zell-Targeting, Aufnahme, Internalisierung, Kern-Targeting und Expression zu verstärken.
Diese Erfindung schließt ebenfalls Lipid-Aggregate, die eine oder mehr als eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oder Mischungen davon umfassen, ein. Solche Lipid-Aggregate können mit einer oder mehr als einer Aggregat-bildenden Komponente und/oder Transfektionsverstärkern kombiniert werden.
Die hierin offenbarten Verfahren für das Transfizieren, welche die Verbindungen oder Zusammensetzungen (wie etwa die oben beschriebenen) der vorliegenden Erfindung und Mischungen davon einsetzen, können bei in vitro Transfektion von Zellen verwendet werden, im Besonderen bei Transfektion eukaryotischer Zellen oder Geweben einschließlich Tierzellen, Menschenzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, Vogelzellen, Fischzellen, Säugetierzellen und dergleichen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für das Einbringen eines Polyanions in eine Zelle oder Zellen bereit, wobei das Verfahren das Bilden eines Liposoms aus einer positiv geladenen Verbindung gemäß der Erfindung, das Kontaktieren des Liposoms mit Polyanion für das Bilden eines positiv geladenen Komplexes aus Polyanion und Liposom und Inkubieren des Komplexes mit einer Zelle oder Zellen umfasst.
Die hierin offenbarten Verfahren können für das Erzeugen von transfizierten Zellen oder Geweben, die zweckmäßige Genprodukte exprimieren, verwendet werden. Die hierin offenbarten Verfahren können ebenfalls als ein Schritt bei der Züchtung von transgenen Tieren verwendet werden. Die hierin offenbarten Verfahren sind bei jedem beliebigen therapeutischen Verfahren zweckmäßig, welche das Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen oder Gewebe erfordern. Im Besonderen sind diese Verfahren bei der Behandlung von Krebs, bei ex vivo Gentherapie und bei diagnostischen Verfahren zweckmäßig. Siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5,589,466 von Felgner, et al.
Die Transfektionsverbindungen oder -zusammensetzungen dieser Erfindung können als Forschungsreagenzien bei jeder beliebigen Transfektion von Zellen oder Geweben, die zu Forschungszwecken erfolgt, eingesetzt werden. Nukleinsäuren, welche durch die Verfahren dieser Erfindung transfiziert werden können, schließen DNA und RNA aus jeder beliebigen Quelle, einschließlich natürlicher Basen oder nicht-natürlicher Basen, ein und schließen jene, die codieren, und in der Lage sind, therapeutische oder anderswie zweckmäßige Proteine in Zellen oder Geweben zu exprimieren, jene, die Expression von Nukleinsäuren in Zellen oder Geweben hemmen, jene, die enzymatische Aktivität hemmen oder Enzyme aktivieren, jene, die Reaktionen katalysieren (Ribozyme) und jene, die in diagnostischen Assays funktionieren, ein.
Die hierin bereitgestellten Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren können ebenfalls ohne weiteres mit Blick auf die Offenbarung hierin für das Einbringen von biologisch aktiven Makromolekülen oder Substanzen, bei denen es sich um andere als um Nukleinsäuren, einschließlich, unter anderem, Polyaminen, Polyaminsäuren, Polypeptiden, Proteinen, Biotin und Polysacchariden, handelt, in Zellen angepasst werden. Weitere zweckmäßige Materialien, zum Beispiel therapeutischen Agenzien, diagnostische Materialien und Forschungsreagenzien, können durch die Verfahren dieser Offenbarung in Zellen eingebracht werden. Gemäß einem bevorzugten Aspekt kann durch die vorliegende Erfindung jeder beliebige Nukleinsäurevektor zu einer oder in eine Zelle transportiert werden.
Dementsprechend wird ein Verfahren für das Einbringen einer biologisch aktiven Substanz in eine Zelle offenbart, wobei das Verfahren das Bilden eines Liposoms aus einer Verbindung gemäß der Erfindung und einer biologisch aktiven Substanz und Inkubieren des Liposoms mit einer Zelle oder Zellkultur umfasst.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Zusammensetzungen, die eine oder mehr als eine Verbindung der Erfindung umfassen.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Zusammensetzungen, die eine oder mehr als eine Verbindung der Erfindung und eine oder mehr als eine zusätzliche Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, einer Zelle, einer Zellkultur, Zellen, Puffern, Kulturmedien, biologisch aktiver Substanz, neutralen Lipiden und Transfektionsverstärkern, bevorzugt eine Nukleinsäure, umfassen.
Diese Erfindung schließt ebenfalls Transfektions-Kits ein, welche eine oder mehr als eine Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung oder Mischungen davon einschließen. Im Besonderen stellt die Erfindung ein Kit, das eine oder mehr als eine Verbindung der vorliegenden Erfindung und zumindest eine zusätzliche Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Zelle, Zellen, einem Zellkulturmedium, einer Nukleinsäure, einem Transfektionsverstärker und Instruktionen für das Transfizieren einer Zelle oder von Zellen umfasst.
Die Offenbarung bezieht sich ebenfalls auf Zwischenprodukte und Verfahren für das Verwenden solcher Zwischenprodukte für das Herstellen der Verbindungen oder Zusammensetzungen der Erfindung. Die Offenbarung bezieht sich ebenfalls auf die Zusammensetzungen, Verbindungen oder Komponenten, die durch die Interaktion von bei den Synthese-Verfahren der Erfindung verwendeten Materialien (Zwischenprodukte, Verbindungen, Lipide, etc.) erhalten werden.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Zeichnungen und die Beschreibung der Erfindung ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, der die Transfektion von HEK-293 Zellen mit kationischen Transfektionsreagenzien zeigt.
2 ist ein Graph, der die Transfektion von COS-7 Zellen mit kationischen Transfektionsreagenzien zeigt.
3 ist ein Graph, der die Transfektion von CHO-K1 Zellen mit kationischen Transfektionsreagenzien zeigt.
4 ist ein Graph, der die Transfektion von HeLa-Zellen mit kationischen Transfektionsreagenzien zeigt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf kationische Lipide und Zusammensetzungen von kationischen Lipiden, die bei Lipid-Aggregaten für das Transportieren von Makromolekülen und weiteren Verbindungen in Zellen von Nutzen sind. Die Verbindungen können allein oder in Kombination mit weiteren Verbindungen verwendet werden, um Liposome und weitere Lipid-Aggregate, die für das Transfizieren oder Transportieren von Verbindungen zu Zielzellen geeignet sind, in vitro herzustellen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt polykationisch und bilden somit bevorzugt hochstabile Komplexe mit zahlreichen anionischen Makromolekülen, im Besonderen Polyanionen wie etwa Nukleinsäuren. Diese Verbindungen weisen die Eigenschaft auf, wenn sie in Wasser dispergiert sind, Lipid-Aggregate zu bilden, die sich stark, über ihren kationischen Anteil, mit Polyanionen assoziieren. Durch Verwenden eines Überschusses kationischer Ladungen bezüglich der anionischen Verbindung können die Komplexe Polyanion-Lipid auf Zellmembranen absorbiert werden, wodurch die Aufnahme der erwünschten Verbindung durch die Zellen ermöglicht wird.
Die Offenbarung bezieht sich ebenfalls auf Zwischenprodukte für das Herstellen der Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung.
Spezifischer gesehen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein kationisches Lipid für das Transfizieren, das eine größere Transfektionswirksamkeit bei den drei häufigsten Zellarten, die in Expressionsforschung (CHO-K1, COS-7 und HEK293) verwendet werden, aufweist als im Handel erhältliche Produkte, was es für Anwendungen mit höheren Durchsätzen zweckmäßig macht; und das ein einfach zu verwendendes Protokoll aufweist, wie durch die Tatsache definiert, dass keine zusätzlichen Reagenzien (z. B. etwa LipofectAMINE PLUS Reagens erhältlich von Life Technologies, Inc., Rockville, MD), kein Entfernen von Serum und daher keine Änderungen hinsichtlich Medium erforderlich sind und der Komplex DNA/Lipid vor dem Assay nicht von den Zellen entfernt werden muss.
Gemäß einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verbindungen, welche die folgende Formel aufweisen:
worin
es sich bei Q um N handelt;
es sich bei L um ein bivalentes, organisches Radikal handelt, das in der Lage ist, jedes Q zu binden;
R₁, R₃, R₄ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus H und C₈-C₂₄ Alkenyl, C₈-C₂₄ Aryl oder C₈-C₂₄ Alkyl, optional substituiert mit einem oder mehr als einem Element ausgewählt aus einem Alkohol, einem Amin, einem Amid, einem Ether, einem Polyether, einem Polyamid, einem Ester, einem Mercaptan, einem Harnstoff, einem Thioharnstoff, einem Guanidyl oder einer Carbamoylgruppe;
und worin es sich bei zumindest einem Element aus R₁, R₃, R₄ und R₆ um eine geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder eine Arylgruppe handelt;
es sich bei r, s, u und y um 0 oder 1 handelt, vorausgesetzt, die Valenzanforderungen von Stickstoff sind erfüllt und die Verbindung ist polykationisch;
es sich bei R₇ und R₈ um H handelt,
es sich bei X^– um ein physiologisch verträgliches Anion handelt; und
es sich bei a um die Zahl von positiver Ladung dividiert durch die Valenz von X handelt.
Bei einer Ausführungsform stellt die Erfindung Verbindungen der folgenden Formel bereit:
worin es sich bei I um eine ganze Zahl von 1 bis 4 handelt und alle weiteren Symbole wie oben definiert sind.
Bei einer in Zusammenhang stehenden Ausführungsform stellt die Erfindung Verbindungen der folgenden Formel bereit:
worin es sich bei R₇ und R₈ um Wasserstoff handelt und alle weiteren Symbole wie oben definiert sind.
Spezifische Verbindungen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung schließen die nachfolgenden Beispiele ein. Bei R⁷ und R⁸ handelt es in der Formel um H.
Manche der Verbindungen der Erfindung können in physiologischen Medien nicht ausreichend löslich sein, um für Verfahren für das Transportieren und Transfizieren eingesetzt zu werden. Der Durchschnittsfachmann wird schätzen, dass es eine Vielzahl von im Stand der Technik erhältlichen Techniken gibt, um die Löslichkeit solcher Verbindungen in wässrigen Medien zu verstärken. Solche Verfahren können ohne weiteres und ohne unangemessene Versuche bei den hierin beschriebenen Verbindungen verwendet werden.
Definitionen
Bei zweckmäßigen Arylgruppen handelt es sich um C_6-24 Aryl. Typische Arylgruppen schließen Phenyl, Naphthyl, Phenanthryl, Anthracyl, Indenyl, Azulenyl, Biphenyl, Biphenylenyl, Fluorenyl, Pyrenyl, Aceanthrenyl, Cholanthrenyl und Acephenanthrenyl ein.
Bei zweckmäßigen Alkylgruppen handelt es sich um geradkettiges oder verzweigtes C_8-24 Alkyl. Typische Alkylgruppen schließen Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Octadecyl, Eicosyl und Docosyl ein.
Bei zweckmäßigen Alkenylgruppen handelt es sich um geradkettiges oder verzweigtes C_8-24 Alkenyl. Typische Alkenylgruppen schließen Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, Butenyl, sec.-Butenyl, Hexenyl, Octenyl, Decenyl, Dodecenyl, im Speziellen 9-Dodecenyl, Tetradecenyl, im Speziellen 9-Tetradecenyl, Hexadecenyl, im Speziellen 9-Hexadecenyl, Octadecenyl, im Speziellen 9-Octadecenyl, Eicosenyl und Docosenyl ein.
Bei zweckmäßigen Alkynylgruppen handelt es sich um geradkettiges oder verzweigtes C_8-24 Alkynyl. Typische Alkynylgruppen schließen Ethynyl, Propynyl, Butynyl, Hexynyl, Octynyl, Decynyl, Dodecynyl, Tetradecynyl, Hexadecynyl, Octadecynyl, Eicosynyl und Docosynyl ein.
Typische Alkylethergruppen schließen jede beliebige der oben genannten C_2-100 Alkylgruppen mit einer Ethergruppe ein.
Bei einer Ethergruppe handelt es sich um -O-.
Typische Polyethergruppen schließen die Gruppe (CHR¹⁴-CH₂-O)_t- ein, worin es sich bei R¹⁴ um H oder eine C_1-4 Alkylgruppe handelt und es sich bei t um eine ganze Zahl wie oben definiert handelt, bevorzugt handelt es sich bei t um 2 bis 5.
Für die Zwecke der Erfindung handelt es sich bei einer Amidgruppe um ein organisches Radikal, das -NHC(O)- als eine funktionale Gruppe aufweist. Typische Amidgruppen schließen Alkylamide, Alkenylamide, Alkynylamide und Arylamide ein, wobei Alkyl, Alkenyl, Alkynyl und Aryl wie oben definiert sind.
Typischerweise schließen Polyamidgruppen organische Radikale ein, die zwei oder mehr als zwei Amidgruppen wie oben definiert aufweisen.
Typischerweise handelt es sich bei einer Estergruppe um ein organisches Radikal, das -C(O)-O- als eine funktionale Gruppe aufweist. Typische Estergruppen schließen R¹⁴-C(O)-O-R¹⁵ ein, worin es sich bei R¹⁴ und R¹⁵ um Alkylen-, Alkenylen-, Alkynylen- und Arylengruppen wie oben definiert handelt.
Typischerweise handelt es sich bei Harnstoffgruppen um organische Radikale, die -NH-C(O)-NH- als eine funktionale Gruppe aufweisen. Typische Harnstoffgruppen schließen R¹⁴NH-C(O)-NHR¹⁴, R¹⁴NH-C(O)-NHR¹⁵, R¹⁴R¹⁵N-C(O)-NR¹⁴R¹⁵ ein, worin es sich bei R¹⁴ und R¹⁵ um Alkylen-, Alkenylen-, Alkynylen- und Arylengruppen wie oben definiert handelt.
Typischerweise handelt es sich bei Thioharnstoffgruppen um organische Radikale, die eine Harnstoffgruppe wie oben definiert aufweisen, wobei der Sauerstoff in der Harnstoffgruppe durch Schwefel substituiert wird.
Typischerweise handelt es sich bei Guanidylgruppen um organische Radikale, die -NH-C(NH)-NH- als eine funktionale Gruppe aufweisen. Typische Guanidylgruppen schließen R¹⁴NH-C(NH)-NHR¹⁴, R¹⁴H-C(NH)-NHR¹⁵ und R¹⁴R¹⁵N-C-(NH)-NR¹⁴R¹⁵ ein, worin es sich bei R¹⁴ und R¹⁵ um Alkylen-, Alkenylen-, Alkynylen- und Arylengruppen wie oben definiert handelt.
Bei einer Carbamoylgruppe handelt es sich um -NH-C(O)-O-.
Typische Carbonatgruppen schließen organische Radikale ein, die ein CO₃ ^2– Radikal, d. h. -O-C(O)O, enthalten.
Bei einer Phosphatgruppe handelt es sich um ein PO₄ ^3– Radikal.
Bei einer Sulfatgruppe handelt es sich um SO₄ ^2– Radikal.
Bei einer Sulfoxidgruppe handelt es sich um -S(O)-.
Bei einer Imingruppe handelt es sich um -C-(N)-.
Bei einer Carbonylgruppe handelt es sich um -C(O)-.
Bei einer sekundären Aminogruppe handelt es sich um -NH-.
Typischerweise handelt es sich bei Aminoalkoholgruppen um organische Radikale, die sowohl eine wie oben definierte sekundäre Aminogruppe als auch eine Hydroxygruppe aufweisen. Typische Aminoalkohole schließen Aminoethanol, Aminopropanol und Aminobutanol ein.
Die Definition „bei D handelt es sich um eine Bindung" bedeutet, dass, wenn es sich bei D nicht um Q handelt, eine Einfachbindung zwischen (CH₂)_p und Z vorliegt.
Biologische aktive Substanz bezieht sich auf jedes beliebige Molekül oder jede beliebige Mischung oder jeden beliebigen Komplex aus Molekülen, das/die/der eine biologische Wirkung in vitro und/oder in vivo ausübt, einschließlich Pharmazeutika, Medikamente, Proteine, Peptide, Polypeptide, Hormone, Vitamine, Steroide, Polyanionen, Nukleoside, Nukleotide, Nukleinsäuren (z. B. DNA oder RNA), Polynukleotide, etc.
Kationische Lipide bezieht sich auf jedes beliebige kationische Lipid, das für Transfektion verwendet werden kann, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, DOSPA, DOTMA, DMRIE, DOTAP, DOGS und TM-TPS.
Zelle bezieht sich auf eukaryotische Zellen jeder beliebigen Art und aus jeder beliebigen Quelle. Arten von eukaryotischen Zellen schließen epitheliale, fibroblastische, neuronale, hämatopoietische Zellen und dergleichen aus primären Zellen, Tumorzellen oder immortalisierten Zelllinien ein. Quellen von solchen Zellen schließen jedes beliebige Lebewesen wie etwa Mensch, Hund, Maus, Hamster, Katze, Rind, Schwein, Affe, Menschenaffe, Schaf, Fisch, Insekt, Pilz und jede beliebige Pflanze einschließlich Getreidepflanzen, Zierpflanzen und Bäume ein.
Transportieren wird verwendet, um einen Prozess zu bezeichnen, durch welchen eine erwünschte Verbindung an eine Zielzelle übertragen wird, sodass die erwünschte Verbindung schlussendlich innerhalb der Zielzelle oder in oder auf der Membran der Zielzelle vorliegt. Bei einigen Verwendungen der Verbindungen der Erfindung wird die erwünschte Verbindung nicht ohne weiteres durch die Zielzelle aufgenommen und das Transportieren über Lipid-Aggregate ist ein Mittel, um die erwünschte Verbindung in die Zelle zu bringen. Bei gewissen Verwendungen wird das Transportieren zu einer spezifischen Art von Zielzellen bevorzugt und kann durch Verbindungen der Erfindung ermöglicht werden.
Medikamente bezieht sich auf jedes beliebige therapeutische oder prophylaktische Agens, bei dem es sich nicht um Nahrungsmittel handelt, das bei Vorbeugung, Diagnose, Linderung, Behandlung oder Heilung von Krankheit bei Mensch oder Tier verwendet wird.
Kit bezieht sich auf Transfektions- oder Proteinexpressions-Kits, die eine oder mehr als eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oder Mischungen davon einschließen. Solche Kits können ein Trägermittel umfassen, das zwecks Aufnahme von einem oder mehr als einem Behältnis wie etwa Phiolen, Teströhrchen und dergleichen in engem Einschluss kompartimentiert ist. Jedes dieser Behältnisse umfasst Komponenten oder eine Mischung von Komponenten, die für das Durchführen von Transfektion benötigt werden. Solche Kits können eine oder mehr als eine Komponente ausgewählt aus Nukleinsäuren (bevorzugt ein oder mehr als ein Vektor), Zellen, eine oder mehr als eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, Lipid-Aggregat bildende Verbindungen, Transfektionsverstärker, biologisch aktive Substanzen, etc. einschließen.
Lipid-Aggregat ist ein gattungsgemäßer Begriff, der Liposome aller Arten, sowohl unilamellar als auch multilamellar sowie Mizellen und stärker amorphe Aggregate kationischer Lipide oder mit amphiphatischen Lipiden vermischte Lipide wie etwa Phospholipide und Steroide, einschließt.
Lipid-Aggregat bildende Verbindungen bezieht sich auf neutrale Verbindungen oder Lipide wie etwa DOPE, DOPC und Cholesterin, etc.
Zielzelle bezieht sich auf jede beliebige Zelle, zu der eine erwünschte Verbindung transportiert wird, wobei ein Lipid-Aggregat als Träger für die erwünsche Verbindung verwendet wird.
Transfektion wird hierin verwendet, um das Transportieren von Nukleinsäure, Protein oder eines weiteren Makromoleküls zu einer Zielzelle zu bedeuten, sodass die Nukleinsäure, das Protein oder das weitere Makromolekül exprimiert wird oder eine biologische Funktion in der Zelle aufweist. Der Begriff „exprimierbare Nukleinsäure" schließt sowohl DNA als auch RNA unabhängig vom molekularen Gewicht ein und der Begriff „Expression" bedeutet jede beliebige Manifestation der funktionalen Gegenwart der Nukleinsäure innerhalb der Zelle, einschließlich, ohne Einschränkung, sowohl transienter Expression als auch stabiler Expression. Funktionale Aspekte schließen das Hemmen von Expression durch Transportieren von Oligonukleotiden oder Protein ein.
Transfektionsverstärker bezieht sich im Allgemeinen auf Moleküle und Substanzen wie etwa Proteine, Peptide, Wachstumsfaktoren und dergleichen, die Zell-Targeting, Aufnahme, Internalisierung, Kern-Targeting und Expression verstärken. Solche Moleküle und Substanzen schließen Liganden wie etwa Insulin, Transferrin, Fibronektin, die auf die Zelloberfläche abzielen; Peptide, die auf zelluläre Integrinrezeptoren abzielen; und weitere Verbindungen wie etwa Plus Reagent (von Life Technologies, Inc., Rockville, Maryland erhältlich) ein. Beispiele von Transfektionsverstärkern finden sich im US Patent Nr. 5,736,392 und der US Anmeldung mit der Nummer 09/039,780 die am 16. März 1998 eingereicht wurde.
Die Erfindung wird ferner durch die nachfolgenden Beispiele verdeutlicht, die sich bezüglich der Erfindung als ausschließlich exemplarisch verstehen. Die polykationischen Lipide wurden durch Befolgen der allgemeinen unten beschriebenen Reaktionsschemen hergestellt.
Beispiel 1
Synthese von N¹,N⁴-Dioleoyl-diaminobutan (I)
Eine Lösung aus 1,4-Diaminobutan (4,28 g, 48,6 mmol) und Triethylamin (20,4 ml, 146 mmol) in 10 ml trockenem Methylenchlorid wurde langsam zu einer Lösung aus Oleoylchlorid (30,0 g, 99,7 mmol) in 300 ml anhydrischem Methylenchlorid in einem Eisbad bei 0°C hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde stark mit einem mechanischen Rührer gerührt. Nach vollständigem Hinzufügen wurde das Eisbad entfernt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2,5 Tage lang gerührt. Die TLC-Analyse bestätigte, dass die Reaktion vollständig war und das Produkt ausgefällt worden war. Das überschüssige Oleoylchlorid wurde durch Filtrieren entfernt. Der Niederschlag wurde zwei Mal mit 50 ml Methylenchlorid gewaschen. Die Mutterlauge wurde konzentriert und mehr Produkt wurde ausgefällt. Dieser Niederschlag wurde filtriert und mit dem vorherigen Niederschlag vereinigt. Der resultierende Feststoff wurde 4 Stunden lang vakuumgetrocknet. Insgesamt wurden 27,0 g eines weißen Feststoffs des erwünschten Produkts, N¹,N⁴-Dioleoyl-diaminobutan, erhalten.
Synthese von N¹,N⁴-Dioleyl-diaminobutan (II)
Lithiumaluminiumhydrid (8,62 g, 95%, 216 mmol) wurde vorsichtig zu einer Suspension von N¹,N⁴-Dioleyl-diaminobutan (27,0 g, 43,8 mmol) in 400 ml anhydrischem Diethylether bei 0°C hinzugefügt. Nach dem Hinzufügen wurde das Eisbad entfernt. Die Reaktionsmischung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und dann unter Rückfluss mit einer passenden Kondensationsvorrichtung vorsichtig erhitzt und 16 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann gekühlt und sorgfältig bei 0°C mit 70 ml einer 1 N Natriumhydroxidlösung gelöscht. Weitere 500 ml Diethylether wurden hinzugefügt und die Mischung wurde weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die obere Etherschicht wurde schrittweise klar und dann getrennt. Die wässrige Schicht wurde drei Mal jeweils mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigte Etherlösung wurde konzentriert und über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Insgesamt wurden 17,0 g von öligem, farblosem N¹,N⁴-Dioleyl-diaminobutan erhalten.
Synthese von N¹,N⁴-Dioleyl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-phthalamido)propyl]-diamino-butan (III)
Diisopropylethylamin (11,1 ml, 63,7 mmol) wurde zu einer Suspension aus N¹,N⁴-Dioleyl-diaminobutan (15,5 g, 26,3 mmol) und N-(2,3-Epoxypropyl)-phthalimid (15,6 g, 76,8 mmol) in 110 ml trockenem N,N-Dimethylformamid hinzugefügt. Nach dem Spülen mit Stickstoff wurde die Reaktionsmischung in einem Rundkolben versiegelt und 24 Stunden lang auf ungefähr 90°C erhitzt. N,N-Dimethylformamid und Diisopropylethylamin wurden entfernt und ein gelbes Öl wurde erhalten. Dieses Rohmaterial wurde aus Ethanol rekistrallisiert. Insgesamt wurden 18,6 g eines weißen Feststoffs, N¹,N⁴-Dioleyl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-phthalamido)propyl]-diamino-butan, erhalten.
Synthese von N¹,N⁴-Dioleyl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminobutan (IV) (nachstehend als DHDOS bezeichnet)
Hydrazin (4,0 ml, 80% wässrig, 103 mmol) wurde zu einer Suspension aus N¹,N⁴-Dioleyl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-phthalamido)propyl]-diaminobutan (17,0 g, 17,1 mmol) in 250 ml trockenem Ethanol bei Raumtemperatur hinzugefügt. Mit einer geeigneten Kondensationsvorrichtung wurde die Reaktionsmischung unter Rückfluss erhitzt, zu welchem Punkt die Suspension zu einer klaren Lösung wurde. Das Ölbad wurde bei 85°C eingestellt. Nach 45 Minuten wurde ein weißer Feststoff aus der Lösung ausgefällt. Die Reaktionsmischung wurde unter Rückfluss 4 Stunden lang gerührt, ehe sie auf –20°C abgekühlt wurde. Der weiße Feststoff setzte sich auf dem Boden ab. Die obere klare Ethanollösung wurde dekantiert. Der Rest wurde zwei Mal mit kaltem Ethanol gewaschen. Die vereinigte Etherlösung wurde konzentriert und über Nacht über Vakuum getrocknet. 12,4 g von öligem N¹,N⁴-Dioleyl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminobutan wurden erhalten.
Die nachfolgenden Verbindungen wurden durch das obige Verfahren unter Verwendung des entsprechenden Diamins und eines langkettigen Acylchlorids synthetisiert:
N¹,N⁴-Dimyristyl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminobutan;
N¹,N⁴-Dipalmityl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminobutan;
N¹,N⁴-Dipalmitolyl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminobutan;
N¹,N⁴-Distearyl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminobutan;
N¹,N⁴-Dilauryl-N¹,N⁴-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminobutan;
N¹,N²-Dimyristyl-N¹,N²-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminoethan;
N¹,N²-Dipalmityl-N¹,N²-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)-diaminoethan;
N¹,N²-Dipalmitolyl-N¹,N²-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminoethan;
N¹,N²-Distearyl-N¹,N²-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminoethan;
N¹,N²-Dilauryl-N¹,N²-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminoethan;
N¹,N²-Dioleyl-N¹,N²-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-diaminoethan;
N¹,N⁹-Dimyristyl-N¹,N⁹-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-Jeffamin;
N¹,N⁹-Dipalmityl-N¹,N⁹-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-Jeffamin;
N¹,N⁹-Dipalmitolyl-N¹,N⁹-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-Jeffamin;
N¹,N⁹-Distearyl-N¹,N⁹-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-Jeffamin;
N¹,N⁹-Dilauryl-N¹,N⁹-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-Jeffamin;
N¹,N⁹-Dioleyl-N¹,N⁹-di-[2-hydroxy-3-(N-aminopropyl)]-Jeffamin. Synthese von Dihydroxy-dioleyol-dispermincarboxamidospermin und Analoga (Schema 1)
Beispiel 2
Synthese von polymeren Analoga
Polymere Analoga der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung polymerer Amine wie etwa PEI als Ausgangsmaterial oder dendrimerer Polyamine synthetisiert werden. Zum Beispiel kann PEI mit Alkyloylchlorid acyliert werden (z. B. Oleoylchlorid) und das acylierte PEI kann dann mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert werden, um Verbindungen der Erfindung zu erhalten.
Obgleich die obigen Verfahren die Synthese von spezifischen Verbindungen exemplifiziert, stellen die Reaktionsschemen ein allgemeines Verfahren für das Herstellen einer Vielzahl von Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung bereit. Der Durchschnittsfachmann wird schätzen, dass alternative Verfahren und Reagenzien, bei denen es sich um andere handelt, als um jene, die hierin spezifisch detailliert dargestellt werden, eingesetzt oder ohne weiteres angepasst werden können, um Verbindungen der Erfindung zu produzieren.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auf dieselbe Art und Weise wie Verbindungen im Stand der Technik wie etwa DOTMA, DOTAP, DOGS, DOSPA und dergleichen verwendet werden. Verfahren für das Inkorporieren solcher kationischer Lipide in Lipid-Aggregate sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Repräsentative Verfahren werden von Felgner, et al., oben; Eppstein et al. oben; Behr et al. oben; Bangham, A. et al. (1965) M. Mol. Biol. 23: 238–252; Olson, F. et al. (1979) Biochim. Biophys. Acta 557: 9–23; Szoka, F. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194–4198; Mayhew, E. et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta 775: 169–175; Kim, S. et al. (1983) Biochim. Biophys. Acta 728: 339–348; und Fukunaga, M. et al. (1984) Endocrinol. 115: 757–761, offenbart. Techniken für das Herstellen von Lipid-Aggregaten geeigneter Größe für das Verwenden als Transportvehikel schließen Beschallung und Einfrieren und Auftauen sowie Extrusion, was möglicherweise am häufigsten verwendet wird, ein. Siehe z. B. Mayer, L. et al. (1986) Biochim. Biophys. Acta 858: 161–168. Mikrofluidisierung wird verwendet, wenn konsistent kleine (50–200 nm) und relativ einheitliche Aggregate erwünscht werden (Mayhew, E., oben). Aggregate im Bereich von ungefähr 50 nm bis ungefähr 200 nm im Durchmesser werden bevorzugt; allerdings sind sowohl größer als auch kleiner dimensionierte Aggregate funktional.
Verfahren für das Transfizieren und Transportieren weiterer Verbindungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen ergeben Lipid-Aggregate, die in denselben Prozessen, die für weitere bekannte Transfektionsagenzien verwendet werden, verwendet werden.
Dem Durchschnittsfachmann ist ohne weiteres ersichtlich, dass eine Anzahl von allgemeinen Parametern für die optimale Wirksamkeit von Transfektion oder Transport wichtig ist. Diese Parameter schließen zum Beispiel die Konzentration von kationischem Lipid, die Konzentration von der abzugebenden Verbindung, die Anzahl an transfizierten Zellen, das für das Transportieren eingesetzte Medium, die Länge der Zeit, während derer die Zellen mit dem Komplex Polyanion-Lipid inkubiert werden und die relative Mengen von kationischem und nicht-kationischem Lipid ein. Es kann von Nöten sein, diese Parameter für jede besondere Zellart zu optimieren. Solche Optimierung ist Routine, welche die hierin bereitgestellte Anleitung und dem im Allgemeinen im Stand der Technik zugänglichen Wissensstand einsetzt.
Das Verwenden von repräsentativen Verbindungen der Erfindung wird durch Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele weiter detailliert. Alle hierin verwendeten Abkürzungen sind standardmäßige Abkürzungen im Stand der Technik. Spezifische, nicht im Detail beschriebene Vorgänge werden entweder als Bezugnahme oder im Stand der Technik hinreichend bekannt angesehen.
Beispiel 3
Dieses Beispiel vergleicht Transfektion von HEK-293 (Zelllinie aus menschlichen embryonalen Nierenzellen), COS-7 (SV40 transformierte Affenzelllinie), CHO-K1 (Zelllinie vom Chinese Hamster Ovary) und HeLa (menschliche Zelllinie aus Zervixkarzinom) Zellen mit der β-Galaktosidase-Reporter-Plasmid DNA pCMV-SPORT-β-gal (LifeTechnologies, Rockville, MD) unter Verwendung von im Handel erhältlichen kationischen Lipid-Transfektionsreagenzien und der Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
Die Zellen wurden am Tag vor der Transfektion in 24-Well-Gewebekulturplatten in einem Gesamtvolumen von 0,4 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Life Technologies, Rockville, MD) Kulturmedium, das eine 1%ige nicht-essentielle Aminosäure (NEAA) Lösung (LifeTechnologies) und 10% FBS enthält, plattiert. Bei den HEK-293 und den COS-7 Zellen wurden die Gewebekulturplatten erneut mit Poly-L-Lysin beschichtet, um Zellbindung zu verstärken.
Am nächsten Tag wurden die Komplexe DNA-Transfektionsreagens wie folgt hergestellt:
Die kationischen Lipid-Reagenzien und DNA wurden separat in 25 μl Aliquoten serumfreies DMEM, das 1%ige NEAA enthält, verdünnt. Bei LipofectAMINE PLUS wurden 7–14 μl PLUS Reagent zu der DNA hinzugefügt, vermischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die verdünnte DNA wurde mit dem verdünnten Lipid vereinigt und bei Raumtemperatur zumindest 15 Minuten lang inkubiert, damit die DNA und das Lipid Komplexe bilden können. Nach dieser Inkubation wurden die Komplexe tröpfchenweise direkt zu dem Kulturmedium hinzugefügt und durch Vor- und Rückschwingen der Kulturplatte gemischt. Die Zellen wurden weiter beí 37°C insgesamt 24 Stunden lang inkubiert, um Expression des durch das Reporterplasmid pCMV-SPORT-β-gal codierten lacZ Transgens zu ermöglichen. 24 Stunden nach der Transfektion wurden Wachstumsmedium und Transfektionskomplexe von den Wells entfernt und die Zellen in jedem Well wurden kurz mit 1 ml D-PBS (Dulbecco's PBS, Life Technologies, Rockville, MD) gespült. Die Zellen in jedem Well wurden durch das Hinzufügen von 0,15 bis 2,0 ml 0,1% Tris, pH 8,0, das 0,1 M Triton X-100 enthält, lysiert. Die Platten wurden bei –80°C für mindestens 2 Stunden eingefroren und bei Raumtemperatur oder 37°C aufgetaut. Die aufgetauten Zelllysate wurden durch Zentrifugieren geklärt und die Überstände wurden auf β-gal Aktivität hin unter Verwendung des enzymatischen Substrats ONPG untersucht. Die Konzentration des gesamten Proteins in Zelllysaten wurde ebenfalls unter Verwendung eines Bradford-Assays (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) bestimmt. Die β-gal Aktivität in transfizierten Zellextrakten wurde gegen eine Standardkurve berechnet und als ng β-gal pro Oberfläche von Gewebekulturplatte (ng/cm²), um die Gesamtaktivität pro Transfektion zu reflektieren, oder als ng β-gal pro μg gesamtes Protein (ng/μg), um spezifische Aktivität zu reflektieren, ausgedrückt.
HEK-293 (1), COS-7 (2), CHO-K1 (3) und HeLa (4) Zellen wurden mit 0,4 oder 0,8 μg pCMV-SPORT-β-gal DNA und 0,2 bis 4,0 μl Transfektionsreagens transfiziert. Bei den untersuchten Transfektionsreagenzien handelte es sich um die folgenden: DHDOS (IV), formuliert bei 2 mg/ml mit dem neutralen Co-Lipid Cholesterin (bei einem Verhältnis von 1:15 (M/M) DHDOS zu Cholesterin); DHDOS, formuliert bei 2 mg/ml mit dem neutralen Co-Lipid DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) (bei einem Verhältnis von 1:1 (M/M) DHDOS zu DOPE); LipofectAMINE PLUS (Life Technologies, Rockville MD); und FuGENE^TM-6 (Boehringer Mannheim, Deutschland). DHDOS Formulierungen wurden in dem Bereich von 0,2 bis 1,5 μl untersucht, LipofectAMINE PLUS und FuGENE-6 wurden in dem Bereich von 0,2 bis 4,0 μl untersucht. FuGENE-6 wurde gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll verwendet. DHDOS und LipofectAMINE PLUS wurden gemäß dem obigen Protokoll verwendet. Die in den Figuren angeführten Daten wurden als Gesamtaktivität (ng/cm²) ausgedrückt, um die Gesamtexpression der transfizierten DNA besser zu vergleichen. Lediglich die Daten mit 0,8 μg DNA werden gezeigt, da mit 0,4 und 0,8 μg DNA ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.
Sämtliche in dieser Beschreibung angeführten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen sind indikativ für den Wissensstand des Fachmanns auf dem Gebiet der Technik, zu dem die Erfindung gehört.

Claims

Eine Verbindung mit der folgenden Formel:
worin es sich bei Q um N handelt; es sich bei L um ein bivalentes, organisches Radikal handelt, das in der Lage ist, jedes Q zu binden; R₁, R₃, R₄ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus H und C₈-C₂₄ Alkenyl, C₈-C₂₄ Aryl und C₈-C₂₄ Alkyl, optional substituiert mit einem oder mehr als einem Element ausgewählt aus einem Alkohol, einem Amin, einem Amid, einem Ether, einem Polyether, einem Polyamid, einem Ester, einem Mercaptan, einem Harnstoff, einem Thioharnstoff, einem Guanidyl oder einer Carbamoylgruppe; und worin es sich bei zumindest einem Element aus R₁, R₃, R₄ und R₆ um eine geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder eine Arylgruppe handelt; es sich bei X^– um ein physiologisch annehmbares Anion handelt; es sich bei a um eine Zahl positiver Ladung, dividiert durch die Valenz von X, handelt; es sich bei r, s, u und y um 0 oder 1 handelt, vorausgesetzt, die Valenzanforderungen von Stickstoff sind erfüllt; und es sich bei R₇ und R₈ um H handelt.
Die Verbindung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei diese Verbindung die folgende Formal aufweist:
worin es sich bei I um eine ganze Zahl von 1 bis 4 handelt.
Die Verbindung wie in Anspruch 2 beansprucht, bei der es sich um folgende handelt:
Eine Verbindung der folgenden Formel:
worin R₁, R₄, R₇ und R₈ definiert sind wie in Anspruch 1 und es sich bei I um eine ganze Zahl von 1 bis 4 handelt.
Die Verbindung wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 4 beansprucht, wobei R₁, R₃, R₄ und R₆ ausgewählt aus diesen optional substituierten Alkylgruppen werden.
Die Verbindung wie in Anspruch 4 beansprucht, bei der es sich um folgende handelt:
Die Verbindung wie in Anspruch 4 beansprucht, bei der es sich um folgende handelt:
Die Verbindung wie in Anspruch 4 beansprucht, bei der es sich um folgende handelt:
Die Verbindung wie in Anspruch 4 beansprucht, bei der es sich um folgende handelt:
Eine Verbindung mit der folgenden Formel
worin es sich bei R₇ und R₈ um H handelt.
Die Verbindung wie in Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 4 beansprucht, wobei R₁, R₃, R₄ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus H, C₈-C₂₄ Alkenyl und C₈-C₂₄ Alkyl.
Eine Zusammensetzung, die eine oder mehr als eine Verbindung aus einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst.
Eine Zusammensetzung aus Anspruch 12, die ferner zumindest eine zusätzliche Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Zelle, Zellen, einer Zellkultur, einem Zellkulturmedium, einem neutralen Lipid, einer Nukleinsäure und einem Transfektionsverstärker umfasst.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 13, die eine Nukleinsäure umfasst.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei es sich bei der zumindest einen zusätzlichen Komponente um ein neutrales Lipid handelt.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 15, wobei es sich bei dem neutralen Lipid um DOPE, DOPC oder Cholesterin handelt.
Ein Lipid-Aggregat, das eine oder mehr als eine Verbindung aus einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst.
Das Lipid-Aggregat aus Anspruch 17, das zumindest ein neutrales Lipid umfasst.
Das Lipid-Aggregat aus Anspruch 18, wobei diese das Lipid-Aggregat bildende Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus DOPE, DOPC und Cholesterin.
Ein Kit, das eine oder mehr als eine Verbindung aus einem der Ansprüche 1 bis 10 und zumindest eine zusätzliche Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Zelle, Zellen, einem Zellkulturmedium, einer Nukleinsäure, einem Transfektionsverstärker und Instruktionen für das Transfizieren einer Zelle oder von Zellen umfasst.
Ein Verfahren für das in vitro Einbringen eines Polyanions in eine Zelle oder in Zellen, wobei dieses Verfahren das Bilden eines Lipid-Aggregats aus einer positiv geladenen Verbindung aus einem der Ansprüche 1 bis 10, das Kontaktieren des Lipid-Aggregats mit einem Polyanion für das Bilden eines positiv geladenen Komplexes aus Polyanion und Liposom und das Inkubieren des Komplexes mit einer Zelle oder Zellen umfasst.
Das Verfahren aus Anspruch 21, wobei es sich bei dem Polyanion um eine Nukleinsäure handelt.
Das Verfahren aus Anspruch 21 oder Anspruch 22, wobei es sich bei dem Lipid-Aggregat um ein Liposom handelt.
Eine Zusammensetzung für das Verwenden in Transfektionsverfahren, die folgendes umfasst: ein physiologisches Medium; eine polykationische Verbindung; und ein physiologisch annehmbares Anion in einer Anzahl, die geeignet ist, um die kationischen Ladungen dieser Verbindung auszugleichen, wobei die polykationische Verbindung die folgende Formel aufweist:
worin es sich bei Q um N handelt; es sich bei L um ein bivalentes, organisches Radikal handelt, das in der Lage ist, jedes Q zu binden; R₁, R₃, R₄ und R₆ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus H und C₈-C₂₄ Alkenyl, C₈-C₂₄ Aryl oder C₈-C₂₄ Alkyl, optional mit einem oder mehr als einem Element ausgewählt aus einem Alkohol, einem Amin, einem Amid, einem Ether, einem Polyether, einem Polyamid, einem Ester, einem Mercaptan, einem Harnstoff, einem Thioharnstoff, einem Guanidyl oder einer Carbamoylgruppe; und worin es sich bei zumindest einem Element aus R₁, R₃, R₄ und R₆ um eine geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Alkenylgruppe oder eine Arylgruppe handelt; es sich bei r, s, u und y um 0 oder 1 handelt, vorausgesetzt, die Valenzanforderungen von Stickstoff sind erfüllt und die Verbindung ist polykationisch; es sich bei R₇ und R₈ um H handelt.
Die Zusammensetzung wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei diese Verbindung die folgende Formel aufweist:
worin es sich bei I um eine ganze Zahl von 1 bis 4 handelt.
Die Zusammensetzung wie in Anspruch 25 beansprucht, wobei es sich bei der Verbindung um folgende handelt:
Eine Zusammensetzung für das Verwenden in Transfektionsverfahren, die ein physiologisches Medium und eine Verbindung der folgenden Formel umfasst:
worin R₁, R₄, R₇ und R₈ definiert sind wie in Anspruch 24 und es sich bei I um eine ganze Zahl von 1 bis 4 handelt.
Die Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 24, 25 und 27 beansprucht, wobei R₁, R₃, R₄ und R₆ ausgewählt werden aus diesen optional substituierten Alkylgruppen.
Die Zusammensetzung wie in Anspruch 27 beansprucht, wobei es sich bei dieser Verbindung um folgende handelt:
Die Zusammensetzung wie in Anspruch 27 beansprucht, wobei es sich bei dieser Verbindung um folgende handelt:
Die Zusammensetzung wie in Anspruch 27 beansprucht, wobei es sich bei dieser Verbindung um folgende handelt:
Die Zusammensetzung wie in Anspruch 27 beansprucht, wobei es sich bei dieser Verbindung um folgendes handelt:
Eine Zusammensetzung für das Verwenden in Transfektionsverfahren, die ein physiologisches Medium und eine Verbindung der folgenden Formel umfasst:
worin es sich bei R₇ und R₈ um H handelt.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 24 oder Anspruch 25, wobei R₁, R₃, R₄ und R₆ ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus H, C₈-C₂₄ Alkenyl, C₈-C₂₄ Aryl und C₈-C₂₄ Alkyl.
Die Verwendung einer Zusammensetzung aus einem der Ansprüche 24 bis 34 für das in vitro Transfizieren einer Nukleinsäure in eine Zelle oder in Zellen.